JP2005511039A - 自動パッチクランプ記録用液体界面形態 - Google Patents
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Abstract
パッチクランプ試験を自動で実行する方法であり、液体界面を利用している。液体界面は、異なる密度の層間の液体懸濁液中に構成されており、液体界面に導入された細胞は、界面に向かって浮く。したがって、細胞は、界面に対して設置可能である。
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、2001年11月30日に出願された米国仮出願番号60/338,715の優先権を主張するものである。
本願は、2001年11月30日に出願された米国仮出願番号60/338,715の優先権を主張するものである。
(発明の分野)
本発明は、概ね、試験のために、1つ以上の細胞に対して器具を繰り返し位置付けるための技術、に関するものであり、特に、イオンチャネル電流、膜電位、トランスポータフラックス、及び細胞容量を含む、細胞電気特性、を計測するために、ピペット又はピペットアレイを位置付けるための自動化技術、に関するものである。
本発明は、概ね、試験のために、1つ以上の細胞に対して器具を繰り返し位置付けるための技術、に関するものであり、特に、イオンチャネル電流、膜電位、トランスポータフラックス、及び細胞容量を含む、細胞電気特性、を計測するために、ピペット又はピペットアレイを位置付けるための自動化技術、に関するものである。
(発明の背景)
イオンチャネル計測は、細胞レベルでの化合物等の効果を求めるのに、重要な役割を果たす。イオンチャネルは、細胞膜に孔を形成する膜貫通タンパクであり、細胞膜の一方の側から他方の側へイオンを順に通過させる。これらのチャネルの活性は、細胞膜電位に影響し、全細胞興奮性を変化させる原因となる。
イオンチャネル計測は、細胞レベルでの化合物等の効果を求めるのに、重要な役割を果たす。イオンチャネルは、細胞膜に孔を形成する膜貫通タンパクであり、細胞膜の一方の側から他方の側へイオンを順に通過させる。これらのチャネルの活性は、細胞膜電位に影響し、全細胞興奮性を変化させる原因となる。
パッチクランプ技術は、イオンチャネル計測を実行するのに普通に使用される。あるパッチクランプ技術が、Sakmann and Neher, "Single-Channel Recording," Plenum, 1995に記載されている。一般に、そのような技術は、細胞に接触し及び理想的には付着するための、ガラスピペット又はマイクロピペット、を使用することを含んでいる。マイクロピペットは、研磨された丸い先端とそれを通る孔とを有する中空ガラス管である。マイクロピペットを形成する方法は、Brown and Flaming, "Advanced Micropipette Techniques for Cell Physiology", 1989に示されており、従来のマイクロピペットの丸い先端の断面が図1に示されている。
マイクロピペットを細胞に接触させ付着させるために、標準的な細胞位置及びピペット配置の技術を使用できる。或いは、細胞を、例えば、開口付近に配置した電極による電界を操作することによって、マイクロピペットの開口に配置できる。パッチクランプ記録方法における重要な工程は、マイクロピペットの丸い先端の外表面と、付着した細胞と、の間に、許容可能なシールを形成することである。許容可能なシールは、概して、ギガオーム単位で計測できる電気抵抗を示すので、よく「ギガオームシール」と呼ばれる。(ここで、「シール」を形成するとは、計測されるのに十分な電気抵抗を有する電気的に許容可能なシールを形成することを意味し、その電気抵抗は、1ギガオーム以上であることが好ましいが、それ以下でもよい。)。シールを形成するための従来技術が知られている。
シール形成の後、「全細胞」アクセスを得ることが、よく望まれる。それは、電気せん孔法、追加の吸引、化学的浸透化、又はこれらの組み合わせによって、達成される。(マイクロピペットを細胞に単に付着させることは、シール状態における場合でも、制限された「オン細胞」という形態を提供し、その形態は、電極下で膜の小さなパッチから個々のイオンチャネル特性を計測するのに、使用できる。)。Sakmann & Neher。そして、試験化合物等が細胞に加えられ、その電気特性(例えば、電流、電位、伝導性、及び容量)の変化がその後に計測される。これらの計測は、それぞれ、イオンチャネル活性、トランスポータ活性、又は、細胞膜の特性の変化、を評価するのに、使用できる。細胞膜の特性の変化は、細胞間相互作用、細胞間融合、ウィルス汚染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜サイクリング、及び、膜・リガンド相互作用によって、引き起こされる。
丸い先端のマイクロピペットを用いる種々のパッチクランプ技術が、米国特許番号第6,063,260号、PCT公開番号WO98/50791、WO99/66329、WO00/34776に、開示されている。
図1は、従来技術で見られるような、丸い先端のピペット1の断面を示している。ピペット1は、通常は、その先端3に位置する開口2を有している。そのようなピペットは、通常は、ガラスでできている。パッチクランプ法を実行するために、開口3は、対象細胞に接触するよう配置される。従来技術においては、マイクロピペットの先端を配置する動作は、単調であり、最初に細胞設置(例えば、皿の上に、細胞浴中に)を必要とし、設置された細胞に対してマイクロピペットを適当に位置付けるものである。従来技術では、細胞設置とマイクロピペット位置付けの方法は、通常は、マイクロピペットの先端の位置を制御するために、高品質顕微鏡及び高品質三軸極微操作装置(各軸毎のサブミクロン解像度と、高度安定性と、を有している)を用いて手動で達成される。容易にわかるように、操作者の技量がパッチクランプ法を実行できるスピード及び能率を決定する。それ故、既存技術を用いてパッチクランプ技術を実行するのに、高度な熟練が必要とされる。したがって、従来技術の幾つかの問題に容易に対応できる新たな技術が必要とされる。
マイクロピペットの先端に弱い電界を導入するような技術が、細胞接触を容易にするために開発されている。更に、自動化によって、細胞設置と適正なマイクロピペット位置付けとの繰り返しを可能とする技術が、開発されている。その技術は、例えば、国際公開番号WO00/34776に示されている。この技術は、液体媒体を、又は、逆さのピペットの先端に構成された液体/空気の界面を、当てにする。細胞は、界面に又は液体媒体の表面近くに、そこの表面張力及び設置可能性に因って、懸濁される。そして、細胞は、微細構造電極に接近可能である。細胞接触の際に、シール形成が公知の技術を用いて実現され、細胞の電気生理学的特性が、電極によって、計測される。しかしながら、この技術には、幾つかの欠点がある。第1に、残骸が界面に集まり、シール形成の能力を妨げたり損なわせたりする。第2に、界面のメニスカスがシール形成の成長を困難にする。
「盲目的」パッチクランプ法に関する従来技術において、次のような技術が開発されてきた。それは、ピペットを体組織に無作為に押し込むことによって、個々の細胞から、記録を行うものである。この方法は、は虫類及びほ乳類の大脳皮質の薄片におけるニューロンの全細胞記録によって、使用されてきた。これらの組織では、細胞が、十分に且つ密に詰まっている。
(発明の開示)
本発明は、細胞抵抗、容量、膜透過電位、及び伝導性を含む、細胞の電気生理学的特性、を試験するための、パッチクランプ技術を自動化する方法である。その技術は、イオンチャネルや起電性トランスポータのような、上述した電気生理学的特性に影響を与える細胞特徴を評価するのに使用できる。本発明は、マイクロピペットの先端を細胞の1つに接触させるために、マイクロピペットの先端に対して細胞を正確に且つ繰り返し位置付けることができる。その方法は、ピペットに対する細胞の付着及び細胞との許容可能なシールの形成を容易にし、全細胞及びオン細胞の形態で、使用可能である。(ここで、使用され技術的に概ね理解されるように、「全細胞」という言葉は、ある試験形態を示しており、その形態では、ピペットに形成された開口が孔に連通しており、その孔が1つの細胞の脂質二層(すなわち膜)を通って延びており、その結果、試験中に得られる電気生理学的データが細胞の全原形質膜及びその成分であるイオンチャネル及び/又は起電性トランスポータ、したがって、「全」細胞から、生じるものである。ここで、使用され技術的に概ね理解されるように、「オン細胞」という言葉は、ある試験形態を示しており、その形態では、ピペットに形成された開口が細胞の内部に連通していない(すなわち、ピペットは部分的に又は全体的に無傷な膜に接触している))。
本発明は、細胞抵抗、容量、膜透過電位、及び伝導性を含む、細胞の電気生理学的特性、を試験するための、パッチクランプ技術を自動化する方法である。その技術は、イオンチャネルや起電性トランスポータのような、上述した電気生理学的特性に影響を与える細胞特徴を評価するのに使用できる。本発明は、マイクロピペットの先端を細胞の1つに接触させるために、マイクロピペットの先端に対して細胞を正確に且つ繰り返し位置付けることができる。その方法は、ピペットに対する細胞の付着及び細胞との許容可能なシールの形成を容易にし、全細胞及びオン細胞の形態で、使用可能である。(ここで、使用され技術的に概ね理解されるように、「全細胞」という言葉は、ある試験形態を示しており、その形態では、ピペットに形成された開口が孔に連通しており、その孔が1つの細胞の脂質二層(すなわち膜)を通って延びており、その結果、試験中に得られる電気生理学的データが細胞の全原形質膜及びその成分であるイオンチャネル及び/又は起電性トランスポータ、したがって、「全」細胞から、生じるものである。ここで、使用され技術的に概ね理解されるように、「オン細胞」という言葉は、ある試験形態を示しており、その形態では、ピペットに形成された開口が細胞の内部に連通していない(すなわち、ピペットは部分的に又は全体的に無傷な膜に接触している))。
本発明の1つの態様では、少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液が利用される。両層は、両層間に界面を構成するために、異なった密度を有している。液体懸濁液では、細胞の層は、両層の間の界面に又はその近傍に、位置付けする。このように、細胞集団を、既知の面に分散できる。
本発明の第2の態様では、マイクロピペットの先端を、懸濁された細胞の層に又はその近傍に位置付けすることが望まれる。マイクロピペットの先端は、目視観測を用いて位置付けできるが、自動化技術を使用するのが好ましい。例えば、1つの望ましい方法では、記録ピペットと参照電極との間のオフセット電位(接合部電位とも言う)がモニターされる。オフセット電位は、異なるイオン組成の溶液の間では異なっている(或いは、異なるように、人為的に操作できる。)。オフセット電位をモニターすることによって、液体懸濁液の界面は、手動介入無しに設置できる。好ましくは、参照電極(接地電極とも言う)は、ピペット内に位置する導出電極に非常に近接している。このように、2つの電極は、概ね同じ面内に位置し、両者間のオフセット電位の変化は、液体懸濁液の界面に対するピペットの先端を正確に位置付けできる。参照電極にとって特に望ましい位置は、保護ピペット内である。或いは、参照電極は、マイクロピペットから離れた液体懸濁液の層の1つの中に設けられる。計測可能な電位差が、懸濁液の異なる層の中にある参照電極と導出電極との間に生成する。したがって、2つの電極の間で計測されるところの電位の変化は、液体界面に対するマイクロピペットの先端の位置決めを示す。ある形態では、界面の上方に位置している参照電極により、電位が、界面を破るマイクロピペットの先端で生成する。逆に、界面の下方に位置している参照電極により、電位が、最初に生成し、それは界面を破るマイクロピペットの先端によって影響を受ける。
界面に対してマイクロピペットの先端を位置付けるための他の技術としては、目視でモニターすること、及びピペットの抵抗(それは界面に達して細胞に接触すると変わる)をモニターすること、がある。また、目視でモニターすることは、当業者が知っている技術を用いて自動化できる。
更に、細胞は、レーザーピンセットのような当業者が知っている技術を用いて、界面に対して位置付け(界面の周囲に位置付けしたり、及び/又は、界面に対して移動させたりできる)できる。
本発明の方法を実施するにおいては、液体懸濁液の第1層が製造される。その第1層は、試験される細胞の密度より概ね大きな密度範囲を有している。細胞の集団が第1層に混合され、小さな密度の液体(細胞の密度より概ね小さな密度範囲を有する)第2層が混合物の上に配置される。液体は、その中に構成される界面を有する層状の液体懸濁液を概ね形成するために安定させられる。細胞の密度は、それらを界面の中に又はその近傍に、浮かせる。マイクロピペットが導入され、その先端は、マイクロピペットが細胞に接触できるように、界面又はその近傍に位置付けされている。マイクロピペットの導入中、マイクロピペットが適正に位置付けされるまで細胞がマイクロピペットに接触しないように、軽い正圧がマイクロピペットの内部に加えられるのが、好ましい。マイクロピペットの先端が界面に対して適正に位置付けされると、マイクロピペット内の正圧が負圧に換えられ、マイクロピペットの電気抵抗が従来公知の電圧クランプ法によってモニターされる。細胞がマイクロピペットに接触する際、先端への付着が、マイクロピペットの内部に負圧を加えることによって、促進される。許容可能シールが自然にできない場合は、細胞の付着を改善し且つシール品質を改善するために、電位が生成される。シールができ、全細胞形態が達成されると、クランプされた細胞は、イオンチャネル、起電性トランスポータ、化合物の細胞電気特性に影響する他の活性、についての効果を求めるために、スクリーニング検定化合物中で使用できる。
本発明では、シール形成中に細胞をイメージする必要性が解消され、したがって、本発明は、顕微鏡、熟練作業者、極微操作装置が無くても、実行できる。しかも、本発明は、既知の自動化方法と両立できる。更に、本発明は、溶液中での細胞の使用を可能にし、伝統文化及びめっき処理を非常に簡素化する。
本発明のこれら及び他の特徴は、以下の詳細な説明及び添付図面を検討することにより、より理解される。
(発明の詳細な説明)
図には、細胞抵抗、容量、膜透過電位、及び、伝導性を含む、細胞の電気生理学的特性、を試験するための、パッチクランプ法を、自動化する方法が、示されている。更に、この方法は、イオンチャネル及び起電性トランスポータのような細胞の特徴を評価するのに使用できる。
図には、細胞抵抗、容量、膜透過電位、及び、伝導性を含む、細胞の電気生理学的特性、を試験するための、パッチクランプ法を、自動化する方法が、示されている。更に、この方法は、イオンチャネル及び起電性トランスポータのような細胞の特徴を評価するのに使用できる。
図2には、少なくとも第1及び第2の層10A、10Bからなる液体懸濁液10が、両者間に構成されている界面12と共に、示されている。液体懸濁液10は、マルチウェルプレートのウェルのように当業者が知っているどんな容器Vにも、収容できる。第1及び第2の層10A、10Bの密度は、両層が両層間に構成されている界面12と概ね層状であるように、望ましくは異なっている。層10A、10Bの密度は、重なることなく、異なっているのが、好ましいが、密度は、各層の全てに渡って概ね一定であり、又は、各層にとっての密度の範囲(例えば、勾配が設けられた)内にある。第1及び第2の層10A、10Bのイオン組成物は、オフセット電位が層10A、10Bの間で生じるように、十分に異なっているのが、好ましい。
多数の細胞14が、液体懸濁液10に懸濁される。細胞14の密度は第2の(下の)層10Bの密度より概ね小さく、第1の(上の)層10Aの密度より概ね大きいことが、好ましい。非限定例として、細胞14が1.04〜1.13g/mlの範囲の密度を有する場合において、大きな密度の第2層10Bは1.10〜1.3g/mlの範囲の密度を有してよく、小さな密度の第1層10Aは1.01〜1.10g/mlの範囲の密度を有してよい。(ここで、「大きな密度」の液体又は懸濁液とは、細胞の密度の範囲(すなわち、1.04〜1.13g/ml)より概ね大きな(重なる部分を有してもよい)密度又は密度範囲を有する液体又は懸濁液のことである。「小さな密度」の液体又は懸濁液とは、細胞の密度の範囲より概ね小さな(重なる部分を有してもよい)密度又は密度範囲を有する液体又は懸濁液のことである。)したがって、密度の違いにより、細胞14は、界面12中に又は界面12近傍に、位置しやすい。そのようにして、細胞14の設置可能面を構成できる。
図4A〜4Cには、細胞14を中に有する液体懸濁液10を製造する方法が示されている。図4Aに示すように、細胞14は、層10Bの大きな密度の液体中に混合される。その後、図4Bに示されるように、層10Aの小さな密度の液体が、層10Bの上に配置される。懸濁液10が落ち着かされると、液体が、分かれて、両層間にある界面12と共に層10A、10Bを構成する。そして、細胞14が、界面12中に又は界面12近傍に、浮かぶ。液体懸濁液10が十分に層状となっていることを十分に目視確認するために、ファストグリーンやフェノールレッドのような光マーカーを、層10A、10Bの一方又は両方に設けてもよい。別の方法として、細胞14が、大きな密度の層10Bの上に配置されている混合溶液と共に、層10Aの低い密度の液体中に初めに混合される。更なる変形及び最も好ましい方法として、層10Aの低い密度の液体が容器内に初めに設けられる。その後、層10Bの大きな密度の液体が、その中に混合されている細胞と共に、層10Aの小さな密度の液体に連通しているポート(図示せず)を通して導入される。好ましくは、ポートは、容器の底に位置している。層10Bの大きな密度の液体が、層10Aの小さな密度の液体の概ね下方に、重力供給法によって導入されたり、強制注入(例えば、注射器による注入)されたりする。
本発明の典型例のように、Amersham Pharmica Biotechによって商標「PERCOLL」として販売されている、ポリビニルピロリドン(PVP)で被覆された極小のシリカ粒子のような、密度勾配媒体が、適当な液体(例えば、細胞外生理食塩水)と混合されて大きな密度の層を作る。小さな密度の層は、規定密度の細胞外生理食塩水(規定密度=1.011g/ml)(すなわち、密度勾配媒体なしで)からなっている。液体懸濁液10中での細胞を健全に維持するため、生理学的イオン強度及び酸度(pH)を維持することに注意が必要である。商標「FICOLL」、「OPTIPREP」、「NYCODENZ」として販売されているような、公知の他の密度勾配媒体を、使用でき、又は、上記の「PERCOLL」粒子と換えることができる。
密度の違いのため、概ね健全な(「無傷の」)細胞が、界面12に集まる。(異なった密度を有している)細胞の残骸や死んだ細胞は、界面12から離れる傾向にあり、したがって、健全な細胞との細胞接触及びシール形成を邪魔しない。
ここでは、2つの層10A、10Bを用いることが示されているが、多数の界面や連続した勾配を構成するために、多数の層(又は勾配)を使用できる。更に、異なる密度の細胞を含む細胞集団を、そのような多界面液体懸濁液中で使用でき、そこでは、細胞の異なるグループが、異なる界面に浮かび、異なる界面に対して位置付けされる。
製造された液体懸濁液10では、パッチクランプ試験や他の技術のような細胞14の試験を行うことができる。以下の記載はパッチクランプ試験に焦点を当てているが、他の試験技術を利用できることは当然である。
再び図2に示すように、ピペット16は、細胞14の1つについてパッチクランプ法を実行するために導入される。(「ピペット」及び「マイクロピペット」という言葉は、ここでは代替可能に用いられる。)。ピペット16は、ここの発明者及び譲受人に対して同時係属の米国特許出願番号60/338,538(BMS参照番号D0130PSP)に開示されている独特の拡大先端(「バブル」)ピペットと同様の従来のピペットデザインを含む、当業者が知っているどんなタイプのものでもよい。典型的代表例として、ピペット16は管状本体18を有しており、それは、末端20と、先端24で終結する傾斜基端22と、を有している。開口26は、管状本体18の内腔に連通している先端24を通って延びている。パッチクランプ試験及びシール形成中の電気特性の計測を容易にするために、導出電極28が、開口26中に又は開口26近傍に延びて設けられている。更に、図3に示されるように、保護ピペット32を、先端24を覆うために、ピペット16の周囲に配置できる。
有益なことに、本発明の方法は、界面12に対してピペット16の先端24を適正に配置するための自動化を期待できる。先端24を界面12に又はその近傍に位置付けすることにより、先端24は、細胞14の1つと接触できる。界面12が、必ずしも、その中に懸濁された細胞14と共に明瞭に構成された層ではないことに、留意する必要がある。むしろ、細胞14の幾つかは、層10A、10B中に位置する。細胞集団における細胞14の数を増すことによって、先端24が細胞14の1つと接触する可能性が、増す。しかしながら、ピペット16の試験の完全性が維持されることを保証するために、ピペット16が多数の細胞と不用意に接触することは、避ける必要がある。したがって、細胞集団は過剰であるべきでない。
ピペット16の先端24を位置付けするための好ましい自動化方法では、参照電極30が、導出電極28に対するオフセット電位を計測するために利用される。好ましくは、図3に示されるように、参照電極30は、先端24したがって導出電極28の近傍にあるために、保護ピペット32に設けられる。更に、参照電極30及び導出電極28は、ピペット16に対して概ね同じ高さに配置でき、したがって、概ね同一平面上にある。或いは、電極28、30は、例えば、導出電極28を越えて延びている参照電極30によって、オフセットできる。この配置では、界面12は、先端24が界面12に関わることなく、定まる。
2つの電極28、30の間のオフセット電位計測は、界面12に対する先端24の位置を正確に示す。参照電極30は、ポリテトラフルオロエチレンで被覆された銀ワイヤであり、それは、露出した先端を有しており、該先端は、(銀/銀塩化物電極を生成するために)塩化物で被覆されている。オフセット電位の変化を検知することは、電極28、30に対する異なったイオン溶液の暴露を示す。したがって、界面12は、予め決定された、界面に対するオフセット電位変化(又は小さな密度の層10Aを放置することからのオフセット電位の変化)によって、正確に位置決めできる。予めの決定は、試験を繰り返すことによって、又は、層10A、10Bにおけるイオンの大きさ、電荷、移動性に基づいた理論的計算を利用することによって、達成できる(例えば、Axon Instrumentsにより商標「JPCalc」の下で販売されているコンピュータプログラムを利用できる)。接合電位の大きさを増大させるために、液体懸濁液10における対イオンの量を(2価アニオンを用いることによって)低減することが、好ましい。オフセット電位は、15mVの高さである。
非限定例として、アスパラギン2ナトリウムを、塩化ナトリウムの代わりに使用でき、層10Bの大きな密度の液体中のアニオンの絶対数を減少させてオフセット電位を生成させることができる。層10Aの小さな密度の液体が規定密度の細胞外生理食塩水である場合、層10Bの大きな密度の液体は、以下のように形成できる。
或いは、参照電極30は、層10A、10Bの一方の中にピペット16から離れて配置してもよい。したがって、参照電極30と導出電極28との間のオフセット電位をモニターすることによって、界面12に対する先端24の位置を求めることができる。例えば、図2に示されるように、好ましい配置においては、参照電極30は、導出電極28と、(特に電子オフセットコレクションの後に)検知されている参照電極30と、の間の、無いか又は極僅かなオフセット電位の差をもって、層10A内に設けられている。しかしながら、界面24と接触するピペットの先端24すなわち導出電極28により、電極28、30の間の電位の変化が検知される。同様に、参照電極30が層10B内に沈められた場合、初期のオフセット電位の差は、電極28と30との間で検知され、それは、先端24と界面12との相互作用によって影響される。いずれに関しても、先端24は、界面12に対して正確に位置付けできる。
目視観測やピペット16の抵抗(それは、界面12に達する際、及び、細胞14の1つに接触する際に、変化する)をモニターすることのような他の位置付け技術を、使用できる。レーザーピンセットは、界面12及び/又はピペット16に対して細胞14を位置付けするのに用いることもできる。
図5は、本発明を実施する典型的実施形態を示す。第1工程100では、ピペット16が、設けられ、電極ホルダーに取り付けられている。軽い正圧がピペット内で生成され(工程102)、電流クランプモードが、ピペット電圧をモニターするために、導出電極28内で作動する(工程104)。そして、ピペット16は、ピペット16で生成されており且つ開口26から追い出される、軽い又はゼロの、正圧の下で、工程106において、液体懸濁液10に向けて沈められる。このように、細胞14を含む、液体懸濁液10中の対象物(例えば、細胞の残骸、死んだ細胞)は、先端24から追い出される。ピペットが液体懸濁液を検出する(すなわち関わる)時を求めるために、ピペット電圧がモニターされる(ボックス108)。
ピペットが、液体懸濁液を検出し、その中に部分的に沈められていると、ピペットは、液体懸濁液中に更にゆっくりと沈めさせられ、界面に接近させられる(工程110)。工程112では、上述した技術のいずれかを使用して、ピペット16の先端24が界面12に又はその近傍に位置付けされる(上述したように)。適正に位置付けされると、導出電極28は、ピペット抵抗をモニターするために、電圧クランプモードに切り替えられる。(工程114)。その後、工程116に示されるように、ピペット16の正圧が負圧に換わり、軽い吸引効果が開口26を通して生成する。この点で、先端24を細胞14の1つに接触させることが望ましい。細胞14の1つは、無作為に先端24に接触し、先端24に対してシールされる。細胞14の接触及びシール形成は、導出電極28によって計測されたピペット16の電気抵抗の変化によって、モニターされる。その代わりとして、細胞14の1つを先端26に引き付けるために、電界を先端に生成させてもよく、それは、「焦点電気泳動」として当業者に知られている技術である。シール形成は、導出電極28の抵抗を用いてモニターされる(工程118)。シール形成が生じない場合には(ボックス120)、保持電位(60mVまで)がピペット16に加えられる(工程122)。それでも、シール形成が生じない場合は、更なる負圧が加えられる(工程116)。
細胞接触及びシール形成を達成するための技術は、従来から知られており、そのような技術を本発明と関連して使用できる。
シール形成では、オン細胞又は全細胞のアクセスが、細胞14によって達成でき、電気生理学的特性が、公知の技術を用いて試験できる。
バイオアッセイで使用可能な高スループットスクリーニング(HTS)を可能にするために、液体懸濁液10は、マルチウェルプレートの多数のウェル内で同時に製造できる。自動化で使用されるための本発明の助けの故に、多数の細胞が、ピペット16のアレイ(マルチウェルプレートのウェルに相当する)に対して同時にクランプでき、化合物をスクリーニングするための細胞浴に移動できる。クランプされた細胞に化合物を暴露する効果は、細胞イオンチャネルの電気生理学的活性、起電性トランスポータ、又は、細胞の電気特性に影響する他の活性の観点から、評価できる。有益なことに、human ether-a-go-go(HERG)gene productに対する化合物の効果を求めるために、化合物を評価したりスクリーニングしたりする技術を使用できる。クランプされた細胞は、必要に応じて提供されている細胞洗剤と共に、1つの浴中の種々の化合物に導入でき、及び/又は、1つ以上の化合物の種々の浴に連続して導入できる。このように、本発明の技術は、パッチクランプ法を実現できるスピード及び正確性に少なくとも部分的に起因している検定方法、を実行する時間(及びコスト)を減少させる。例えば、図6に示すように、クランプされた細胞14は、薬浴DB1から薬浴DB2へ移動できる。好ましくは、シールの完全性を向上させるために、保護ピペット32が、先端24及びクランプされた細胞14を覆うために、利用できる。(生理食塩水のような)多量の液体34を、保護ピペット32内に設けることができる。シールされた細胞14は、シールの完全性を維持するために、多量の液体34内に、好ましくは全体的に沈められる。メニスカスMが、保護ピペット32に拡がっている。多量の液体34が、保護ピペット32/ピペット16アッセンブリの端部に形成されたリザーバー内に維持されている。リザーバーは、保護ピペット32に拡がっている表面張力とリザーバーの壁に対する多量の液体の毛細管引力とによって、形成されている。多量の液体34は、細胞14が実験の途中に、空気/液体の界面に出会わないことを保証することによって、細胞14のシールの電気的及び機械的な安定性を維持する。
ここで述べた技術は、他の細胞膜受容体(例えば、グアニンタンパク質共役型受容体(GPCR's))、及び、分泌や受容体サイクリングのような他の細胞膜依存性現象に対して、適用できる。
本発明は、幾つかの実施例を有する好ましい実施形態に関連して述べているが、当業者が、添付クレームに示されている本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えることができることは、当然である。
Claims (24)
- 細胞の電気特性についてのパッチクランプ試験を実行する方法において、
少なくとも第1及び第2の層からなり、両層間に界面を構成するよう第1及び第2の層が異なる密度を有している、液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記液体懸濁液にマイクロピペットを挿入する工程と、
マイクロピペットの先端が上記細胞の1つに接触する位置となるように、上記マイクロピペットの先端を、上記界面又はその近傍に位置付ける工程と、を有することを特徴とする方法。 - 上記マイクロピペットの上記先端に対する上記細胞の1つの付着を促進する工程を、更に有している、請求項1記載の方法。
- 促進工程が、上記マイクロピペットに負圧を導入する工程を含んでいる、請求項2記載の方法。
- 促進工程が、上記先端の全域に電界を造り出す工程を含んでいる、請求項2記載の方法。
- 位置付け工程が、上記液体懸濁液中に参照電極を配置する工程と、上記マイクロピペットと上記参照電極との間の電位差をモニターする工程と、を含んでいる、請求項1記載の方法。
- 上記参照電極が、上記界面を通って延びている、請求項5記載の方法。
- 上記層の少なくとも1つが、密度の変化を含んでいる、請求項1記載の方法。
- 上記密度の変化が、傾斜的配置である、請求項7記載の方法。
- 上記第1及び第2の層の各々が、異なる密度の範囲を有している、請求項7記載の方法。
- 容器内に第1液体を配置する工程と、上記第1液体の上に第2液体を配置する工程と、を更に有しており、
上記第1液体が第1密度を有し、上記第2液体が上記第1密度より小さい第2密度を有しており、
上記第1液体が上記第1層を構成し、上記第2液体が上記第2層を構成している、請求項1記載の方法。 - 上記第2液体を配置する工程の前に、上記第1液体中に上記細胞を混合する工程、を更に有している、請求項10記載の方法。
- 上記液体懸濁液が、マルチウェルプレートのウェル内に含まれている、請求項1記載の方法。
- 上記第1液体が、密度変性剤を含んでいる、請求項1記載の方法。
- 上記第2液体が、細胞外生理食塩溶液である、請求項1記載の方法。
- 上記細胞の密度が、上記第1層の密度より概ね小さい、請求項1記載の方法。
- 上記細胞の密度が、上記第2層の密度より概ね大きい、請求項15記載の方法。
- 細胞特性の高スループット試験を可能とするために細胞を位置付ける方法であって、
その中に多数のウェルが構成されているマルチウェルプレートを提供する工程と、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有しており、
上記液体懸濁液が、上記ウェルの少なくとも1つの中に配置されていることを特徴とする方法。 - その中に多数のウェルが構成されているマルチウェルプレートと、
上記ウェルの少なくとも1つの中に配置された液体懸濁液と、からなり、
上記液体懸濁液が、少なくとも第1及び第2の層を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とするマルチウェルプレートアッセイアッセンブリ。 - 細胞抵抗、容量、膜通過電位、及び伝導性、を含む細胞の電気生理学的活性を、種々の化合物との反応により求める検定方法であって、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記懸濁された細胞の1つとマイクロピペットの先端との間に、電気的許容可能なシールを得る工程と、
上記シールされた細胞を1つ以上の化合物に導入して、シールされた細胞の電気生理学的活性を化合物との反応により評価する工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とする検定方法。 - 細胞抵抗、容量、膜通過電位、及び伝導性、を含む細胞の電気生理学的活性に影響する化合物をスクリーニングする方法であって、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記細胞の1つとマイクロピペットの先端との間に、電気的許容可能なシールを得る工程と、
上記シールされた細胞を1つ以上の化合物に導入する工程と、
上記シールされた細胞の電気生理学的活性を、上記1つ以上の化合物との反応により評価する工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とする方法。 - human ether-a-go-go(HERG)gene productに対する種々の化合物の効果を求める検定方法であって、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記懸濁された細胞の1つとマイクロピペットの先端との間に、電気的許容可能なシールを得る工程と、
上記シールされた細胞を1つ以上の化合物に導入して、上記シールされた細胞のHERG gene productに対する化合物の効果を評価する工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とする検定方法。 - human ether-a-go-go(HERG)gene productに影響する化合物をスクリーニングする方法であって、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記細胞の1つとマイクロピペットの先端との間に、電気的許容可能なシールを得る工程と、
上記シールされた細胞を1つ以上の化合物に導入する工程と、
上記シールされた細胞のHERG gene productに対する上記化合物の効果を求める工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とする方法。 - 細胞の電気生理学的活性を種々の化合物との反応により求めるためのアッセイを製作する方法であって、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記懸濁された細胞の1つとマイクロピペットの先端との間に、電気的許容可能なシールを得る工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とする方法。 - human ether-a-go-go(HERG)gene productに対する種々の化合物の効果を求めるためのアッセイを製作する方法であって、
少なくとも第1及び第2の層からなる液体懸濁液中に、多数の細胞を懸濁させる工程と、
上記懸濁された細胞の1つとマイクロピペットの先端との間に、電気的許容可能なシールを得る工程と、を有しており、
上記第1及び第2の層が、両層間に界面を構成するよう、異なる密度を有していることを特徴とする方法。
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