JP2009538412A

JP2009538412A - 有機カチオントランスポーター活性の決定方法

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Publication number: JP2009538412A
Application number: JP2008552716A
Authority: JP
Inventors: ヘニング・フォレルト; スヴェン・ガイベル; ベラ・ケレティ; クラウス・フェントラー; ペートラ・アーント; オルガ・ガイコー; インゴー・ヤーナウシュ
Original assignee: Sanofi Synthelabo SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2009-11-05
Anticipated expiration: 2027-01-22
Also published as: AU2007211663A1; EP1982177A1; CN101371137B; AU2007211663B2; MY149177A; WO2007087993A1; CA2636246A1; IL193131A0; IL193131A; HK1125454A1; KR20080093036A; JP5175226B2; CN101371137A; US20090184006A1; BRPI0708010A2

Abstract

本発明は、固体に支持されたセンサー電極と、ＯＣＴを含む脂質層とを含む無細胞の電気生理学的なセンサーチップ（ここでＯＣＴを含む脂質層は、センサー電極に空間的に極めて隣接して位置し、それに対して該センサー電極は、用いられる溶液および脂質層に対して電気的に絶縁されている）を用いて、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）活性を決定する方法、ＯＣＴの活性を決定する方法、またはＯＣＴの活性を調節する化学物質を同定する方法に関し、ならびにセンサーチップそのもの、およびそれらを含むキットに関する。

Description

本発明は、固体に支持されたセンサー電極と、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）を含む脂質層とを含む無細胞の電気生理学的なセンサーチップ（ここでＯＣＴを含む脂質層は、センサー電極に空間的に直に隣接して位置するが、センサー電極は用いられる溶液および脂質層に対して電気的に絶縁される）を使用して、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）活性を決定する方法、ＯＣＴの活性を決定する方法、またはＯＣＴの活性を調節する化学物質を同定する方法、ならびにセンサーチップそのもの、およびそれらを含むキットに関する。

ヒトにおける有機カチオン輸送は、有機カチオンの経細胞輸送にとって重要なメカニズムである。それゆえに、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）は、疾患関連の異常に直接的に影響を与えることを可能にする有望な薬物標的というだけでなく、有望な薬物の生物学的利用能のパラメーターを変更させることができる有望なＡＤＭＥＴ（吸収、分布、代謝、排泄および毒性）標的でもある。

ＯＣＴは、単一輸送体（ｕｎｉｐｏｒｔｅｒ）、共輸送体（ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ）および対向輸送体（ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ）、例えば多剤耐性タンパク質、促進拡散系およびプロトン対向輸送体などを含むスーパーファミリーに属する。これらは、ナトリウムおよびプロトン勾配の、独立して異なる分子構造を有する小さいカチオンの輸送を媒介する。ヒトＯＣＴ（ｈＯＣＴ）を介した基質特異的なナトリウム非依存性輸送メカニズムが肝臓、腎臓、小腸および神経系で説明されている（ＰｒｉｔｃｈａｒｄＪＢ＆ＭｉｌｌｅｒＤＳ（１９９３），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３（４）７６５−７９６）。１９９７年に、ヒト有機カチオントランスポーターｈＯＣＴ１はすでにクローニングされている（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．等（１９９７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ５１（６），９１３〜９２１）。

ＯＣＴは、その輸送サイクルを通過している間に電荷をシフトさせる。このシフトは、電荷を有する基質の動き、または（部分的な）電荷を有するタンパク質部分の動きのいずれかから生ずる可能性がある。ＯＣＴの活性は、放射線の流量（ｒａｄｉｏｆｌｕｘ）、および標準的な２つの電極による電圧固定法の電気生理学によってモニターすることができるが、いずれの方法も、低い時間分解能、低い感度、ブロッカーと競合する基質との間の識別、偽陽性および陰性の間の識別が困難であることなどのような共通の欠点を有する（Ａｒｎｄｔ等（２００１）ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌ，２８１，Ｆ４５４〜Ｆ４６８）。

いくつかのその他のケースにおいて、トランスポーター関連の電流は、どちらかといえば生理学的な環境でパッチクランプ実験によって直接的にモニターすること、または人工的な「黒色脂質膜（ｂｌａｃｋｌｉｐｉｄｍｅｍｂｒａｎｅ）」でモニターすることができる。後者のケースにおいて、脂質二重層は、２つの緩衝液のリザーバ間の小さい孔中で形成され、これらの各リザーバはそれぞれＡｇ／ＡｇＣｌ電極を含む。この二重層にタンパク質が組み込まれると、例えばＡＴＰ誘導体の光活性化によって生物活性（例えば、酵素活性）を始動させ得る。だが依然として安定性に欠けるため、このシステムで迅速に緩衝液交換実験を行うことができず、このシステムは光活性化可能な基質に制限される。この安定性の不足は、センサー表面またはセンサーチップ上にタンパク質含有粒子を固定化することによって克服することができる。

無細胞の電気生理学的なセンサーチップは、一般的に、トランスポーターを含む膜フラグメントまたは小胞をベースとしており、通常これらは金で被覆されたバイオチップに電気的に連結されている。膜フラグメントは、通常、好ましくは薄い金のフィルム上に改変された脂質層を有するセンサーチップ表面に吸着する。膜フラグメントは、一般的に、膜を通過してイオン勾配を維持することができる空孔を形成することができる。適切な基質で活性化された後、イオンまたは電荷を有する基質は、膜を通過して輸送される。吸着した膜フラグメントおよび被覆された電極表面の両方が、電気的なコンデンサのように振舞うため、運動中のイオンは変化する電流を示し、この電流は周囲の溶液中に参照電極を置く場合に検出できるようになる。

本発明の課題は、ＯＣＴの活性は、ｈＯＣＴ１を用いたパッチクランプ実験が失敗した場合でも、このようなセンサーチップを用いて特異的に、且つ高感度で検出することが可能かどうかという問題に関する。

驚くべきことに、ＯＣＴ活性化の際の特異的なシグナルを検出するために要求される感受性を示す細胞非含有分析を確立できることが発見された。細胞性のバックグラウンドがなくても、すなわち細胞内基質、細胞骨格などがなくても、本発明に係る細胞非含有分析においてＯＣＴが機能したため、これは特に驚くべきことである。特に、本発明の分析は、広範なｐＨおよび／または高いイオン濃度範囲で行うことができ、これは特に有利である。

従って、本発明の第一の実施態様は、以下の連続工程でＯＣＴの活性を決定する方法に関する：
（ａ）固体に支持されたセンサー電極と、ＯＣＴを含む脂質層とを含む無細胞の電気生理学的なセンサーチップを供給し（ここでＯＣＴを含む脂質層は、センサー電極に空間的に直に隣接して位置するが、センサー電極は用いられる溶液および脂質層に対して電気的に絶縁される）、
（ｂ）センサーチップを、イオンを含む非活性化溶液で処理し、
（ｃ）センサーチップを、イオンおよび基質を含む活性化溶液で処理し、および
（ｄ）電気シグナルを測定すること。

ＯＣＴは、例えばＳＬＣ２２Ａ１（ＯＣＴ１）、ＳＬＣ２２Ａ２（ＯＣＴ２）、ＳＬＣ２２Ａ３（ＯＣＴ３）、ＳＬＣ２２Ａ４（ＯＣＴＮ１）、およびＳＬＣ２２Ａ５（ＯＣＴＮ２）から選択される。通常、ＯＣＴは哺乳動物起源のものであり、特にラット、マウス、ウサギ、ブタ、モルモット、キイロショウジョウバエ、カエノラブディティス・エレガンス（ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）、またはヒト由来である。好ましくは、ＯＣＴは、ヒトＯＣＴ１である。

電極は、通常金属材料または導電性の金属酸化物、特に金、白金、銀、または酸化インジウムスズを含む。

固体に支持されたセンサー電極は、一般的に、ガラスまたはポリマーに支持されたセンサー電極であり、特にボロフロート（ｂｏｒｏｆｌｏａｔ）−ガラスに支持されたセンサー電極であり、特にボロフロート−ガラスに支持された金電極である。好ましい実施態様において、脂質層は、電極に、化学結合を介して、特にｈｉｓ−タグカップリングもしくはストレプトアビジン−ビオチンカップリングを介して、または疎水性力、親水性力もしくはイオン力を介して結合している。

電極はさらに、例えば、１またはそれ以上の絶縁性を有する単分子層によって電気的に絶縁されており、特に１またはそれ以上の絶縁性を有する両親媒性の有機化合物によって電気的に絶縁されており、とりわけ１またはそれ以上の絶縁性を有する膜の単分子層によって電気的に絶縁されており、至適には、電極に面する下の層としてメルカプタン層、格別にオクタデシルチオールによって電気的に絶縁され、さらに電極から見て外方に向く上の層として膜の単分子層によって電気的に絶縁されている。

特に、センサーチップは、センサー電極および孔を有するカバープレートを担持する固体支持体を含み、カバープレートはタイタープレートのウェルに類似したウェルを形成する。ガラスまたはポリマープレートのいずれかは、適切な支持体として機能する。ガラス支持体（例えばガラスプレート）の場合、電極は、好ましくはリソグラフィー的に構造化した薄い金フィルムを含み、このフィルムは、例えばメルカプタンによってその表面が化学修飾されており、それに対して、ポリマー支持体を用いた場合、修飾された厚いフィルム状の金電極を用いることもできる。適切な基質の範囲によって、単一のセンサーチップを製造することができ、ならびに、９６または３８４個のセンサーを有するセンサーストリップまたは同様のセンサーアレイプレートを製造することができる。特に、ポリマーベースのセンサーが、低コストで大量生産できる見込みがある。

全てのセンサーのタイプに一般的に、金の表面の修飾が起こり、ウェルが水溶液で充填されたら、金の表面はコンデンサになる。このコンデンサの特性は、溶液との接触でもたらされた通電参照電極（例えばＰｔ／ＰｔまたはＡｇ／ＡｇＣｌ、酸化インジウムスズ、またはその他）を用いて決定することができる。さらに、センサー表面は、高い親水性を有することが好ましく、すなわち膜フラグメントおよび小胞に粘着性であることが好ましい。その結果として、その天然の環境または天然に似た環境、例えば生物学的な膜のシート、小胞またはプロテオリポソーム内に維持されたＯＣＴは、容易に親水性のセンサー表面に吸着し、内部スペース（その中に含まれる溶液を含む）が、金表面およびウェル内の周囲の溶液との両方から電気的に絶縁されている区画を形成する。このチップのウェルがキュベットに挿入されると、フローセル内部の体積が定義され、センサー表面上の迅速な溶液交換が可能になる。

本発明に用いられる無細胞の電気生理学的なセンサーチップは、例えば、ＷＯ０２／０７４９８３、特に該ＰＣＴ出願の図面の説明も含め請求項および／または図１および／または２に記載されている（上記出願の記載は、本発明において特に他の説明がない限り、参照により加入される）。またこのようなセンサーチップは、イオンゲート・バイオサイエンシズ社（ＩｏｎＧａｔｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＧｍｂＨ，フランクフルト／マイン，ドイツ）からＳＵＲＦＥ²ＲＯＮＥ^(R)バイオセンサーシステムという名称で販売されているものが入手可能である。

ＯＣＴの基質または活性化因子を含まない溶液から、それらを含む溶液に切り替えると、電極の測定可能な一次的な充電電流が誘導され、この電流は、典型的には１００ｐＡ〜４ｎＡの範囲内である。それゆえに、非活性化溶液から活性化溶液（すなわち基質を含む溶液）への置き換えが、ＯＣＴ活性を始動させることになる。その後、これらの溶液を逆の順番に置き換えると、センサーチップはその初期状態に戻る。本発明によれば、これらイオン含有溶液の格別な利点は、人工産物が最小化され、これが特異的で高感度のシグナルをもたらすということである。

溶液交換実験を行うのに必要な全ての構成要素は、ＰＣ制御されたワークステーション、または、その他の方法で制御されたワークステーション内に収容することができる。従来のシステムでは、非活性化（すなわち基質を含まない）溶液および活性化溶液は、一般的に、ガラスボトル中に保存される。通常ボトルにかけられる空気圧は溶液を動かして、電気機械的に作動されるバルブシステムを通過させ、さらにフローセルを通過させる。あるいは、自動サンプラーを用いて、数種の溶液を自動的に処理することができる。

センサーチップの使用前に、電極をイオンを含む洗浄溶液で洗浄することが好ましい。

いずれの場合においても、本発明のイオンを含む溶液は、好ましくは、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ²⁺、および／またはＣａ²⁺から選択される１価および２価イオンを含む。

イオンを含有溶液中のイオンの合計濃度は、好ましくは、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭであり、特に約２００ｍＭ〜約５００ｍＭであり、とりわけ約３００ｍＭ〜約５００ｍＭであり、至適には、約４３５ｍＭである。イオン含有溶液中の１価イオンの濃度は、好ましくは、約３００ｍＭ〜約４００ｍＭであり、イオン含有溶液中の２価イオンの濃度は、好ましくは、約２ｍＭ〜約１０ｍＭであり、特に約５ｍＭ〜約８ｍＭであり、とりわけ約５ｍＭである。

その他の好ましい実施態様において、イオン含有溶液はさらに、緩衝液を含み、具体的にはＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ緩衝液（３０±１０ｍＭ，ｐＨ７.０±１.０）を含む。

イオン含有溶液の例は、以下の通りである：
（ａ）洗浄溶液：
３０±１０ｍＭの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.０±１.０）、
３００±１００ｍＭの１価イオン、例えばＮａＣｌ、
４±２ｍＭの２価イオン、例えばＭｇＣｌ₂。

（ｂ）非活性化溶液：
３０±１０ｍＭの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.０±１.０）、
３００±１００ｍＭの１価イオン、例えばＮａＣｌ、
４±２ｍＭの２価イオン、例えばＭｇＣｌ₂、および
０.５〜１００ｍＭの１価イオン、例えばＮａＣｌ（これは、活性化溶液中の基質濃度と等モルとなる）。

（ｃ）活性化溶液：
３０±１０ｍＭの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ（ｐＨ７.０±１.０）、
３００±１００ｍＭの１価イオン、例えばＮａＣｌ、
４±２ｍＭの２価イオン、例えばＭｇＣｌ₂、および
０.５〜１００ｍＭの基質、例えば塩化コリン。

活性化溶液の基質は、一般的に、有機カチオンであり、特にカチオン性の薬物、カチオン性の生体異物、および／またはカチオン性のビタミンであり、とりわけ第一、第二、第三または第四アミンであり、至適には、コリン、アセチルコリン、ニコチン、Ｎ¹−メチルニコチンアミド、モルヒネ、１−メチル−４−フェニルピリジニウム、プロカインアミド、テトラエチルアンモニウム、トリブチルメチルアンモニウム、デブリソキン、または生体アミン例えばエピネフリン、ノルエピネフリン、またはカルニチン、または親油性化合物例えばキニン、キニジン、またはステロイド例えばコルチコステロン、または有機アニオン例えばパラアミノ馬尿酸、プロベネシドである。

一般的に、電気シグナルは、電流測定、および／または電位差測定の手段を用いて測定され、工程（ｂ）〜（ｄ）は、少なくとも２回、特に２〜４回行われる。

用語「電気シグナル」または「電流」は、本発明の文脈では、非活性化溶液の活性化溶液による置き換えに応答するピーク電流を意味するものとし、例えば、これらに限定されないが、最大のピーク電流が挙げられる。電流振幅は通常、１０〜１００ｍｓの範囲内で生じ、それに続いて約２秒内にゆっくり減衰する。電流の極性は、輸送されたイオンの極性および／またはタンパク質のシフトした部分の極性、ならびに区画の膜を通過するまたはその内部でのそれらの輸送またはシフトのベクトル方向に応じて、正の場合もあるしまたは負の場合もある。活性化溶液の非活性化溶液への置き換えまたは非活性化溶液の洗浄溶液への置き換えから生じた電流は、一般的にＯＣＴ活性の決定に関して考慮に入れない。流速およびインターバルは、好ましくは、非活性化溶液の活性化溶液への置き換えに対する電流応答が、その他の置き換え工程によって引き起こされる電流応答による偏りが生じない状態が保たれるように選択される。

また本発明の方法は、化学物質、特に刺激物質（活性化因子）またはＯＣＴ阻害剤の存在下で行うこともできる。

それゆえに、本発明はまた、ＯＣＴの活性を調節する化学物質を同定するための方法に関し、本方法は、以下の連続工程を含む：
（ａ）本発明の方法を行うこと、および
（ｂ）化学物質を同定すること。

上記化学物質は、一般的に有機カチオン、特にカチオン性の薬物、カチオン性の生体異物および／またはカチオン性のビタミン、および／または生体アミン、とりわけ第一、第二、第三または第四アミンであり、ここにおいて化学物質は、通常刺激物質またはＯＣＴ阻害剤である。化学物質は、例えば化学物質ライブラリーに存在するものでもよい。

本発明のその他の主題は、無細胞の電気生理学的なセンサーチップそのものであり、本チップは上で詳述したＯＣＴを含む。ＯＣＴは、一般的に当業者既知の方法および／または実施例で具体的に説明されている方法に従って、センサーチップに結合させる。

センサーチップはさらに、電極から測定データを得るためのデータ取得装置、ならびに場合により、イオン含有溶液を交換および／または混合するのに利用できるようにする交換および／または混合手段を含んでいてもよい。またセンサーチップは、マイクロプレートまたはマイクロタイタープレートの形態であってもよい。

本発明のその他の主題は、本発明のセンサーチップ、参照電極、電極から測定データを得るためのデータ取得装置、イオン含有溶液を交換および／または混合するのに利用できるようにする交換および／または混合手段、フロー分析装置、電源、コンピューター、ならびにオートサンプラーを含む装置である。参照電極は、好ましくはＰｔ／Ｐｔ、Ａｇ／ＡｇＣｌまたは酸化インジウムスズ電極である。

本発明のさらなる主題は、
（ａ）本発明の無細胞の電気生理学的なセンサーチップまたは本発明の装置、
（ｂ）少なくとも１種の上記で定義されたイオンを含む溶液、および場合により
（ｃ）上記で定義された基質、
を含むキットである。

以下の図、表、配列および実施例は、本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

図面の説明
図１Ａは、１ｍＭのＴＢＡで阻害する前（黒色のトレース）および阻害した後（灰色のトレース）で、活性化溶液（３０ｍＭの塩化コリン）を添加した際のｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）を保持させた固定化膜を有する典型的なセンサーの電気的応答を示す。
図１Ｂは、１ｍＭのＴＢＡで阻害する前（黒色のトレース）および阻害した後（灰色のトレース）で、活性化溶液（３０ｍＭの塩化コリン）を添加した際のｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ１）を保持させた固定化膜を有する典型的なセンサーの電気的応答を示す。
図２Ａは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のコリン濃度依存性を示す（ＣＨＯ細胞膜）。
図２Ｂは、ｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ１）のコリン濃度依存性を示す（ＣＨＯ細胞膜）。
図３は、昆虫細胞からのｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）およびｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ２）のｐＨ依存性を示す。
図４Ａは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のＴＢＡのＩＣ５０を示す（ＣＨＯ細胞）。ＩＣ５０は、基質として１０ｍＭのコリンを用いて決定された。
図４Ｂは、ｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ２）のＴＢＡのＩＣ５０を示す（ＣＨＯ細胞）。ＩＣ５０は、基質として３０ｍＭのコリンを用いて決定された。
図５Ａは、パッチクランプ実験において安定して発現されたｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）の電流を示す（ＣＨＯ細胞）。
図５Ｂは、パッチクランプ実験において安定して発現されたｈＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）の電流を示す（ＣＨＯ細胞）。
図６Ａは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のキニンのＩＣ５０を示す（ＣＨＯ細胞）。ＩＣ５０は、基質として１０ｍＭのコリンを用いて決定された。
図６Ｂは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のアセチルコリン濃度の依存性を示す（ＣＨＯ細胞）。
図７は、ヒトＯＣＴ２（ｈＯＣＴ２、ＳＬＣ２２Ａ２））のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＡ）部位は、太字と下線で示す。ＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）クローニング部位は、下線で示す。
図８は、ラットＯＣＴ２（ｒＯＣＴ２；ｓｌｃ２２ａ２）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＧＡ）部位は、太字と下線で示す。ＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）およびＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）クローニング部位は、下線で示す。
図９は、ヒトＯＣＴ１（ｈＯＣＴ１；ＳＬＣ２２Ａ１）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＧＡ）部位は、太字と下線で示す。ＨＩＮＤＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）およびＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）クローニング部位は、下線で示す。
図１０は、ヒトＯＣＴ３（ｈＯＣＴ３；ＳＬＣ２２Ａ３）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）部位は、太字と下線で示す。
図１１は、ヒトＯＣＴＮ１（ＳＬＣ２２Ａ４）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＧＡ）部位は、太字と下線で示す。
図１２は、ヒトＯＣＴＮ２（ＳＬＣ２２Ａ５）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）部位は、太字と下線で示す。

配列の説明
配列番号１は、ヒトＯＣＴ２（ｈＯＣＴ２；ＳＬＣ２２Ａ２）のコード領域を含む核酸配列を示す。
配列番号２は、ラットＯＣＴ２（ｒＯＣＴ２；ｓｌｃ２２ａ２））のコード領域を含む核酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトＯＣＴ１（ｈＯＣＴ１；ＳＬＣ２２Ａ３）のコード領域を含む核酸配列を示す。
配列番号４は、ヒトＯＣＴ３（ｈＯＣＴ３；ＳＬＣ２２Ａ３）のコード領域を含む核酸配列を示す。
配列番号５は、ヒトＯＣＴＮ１（ＳＬＣ２２Ａ４）のコード領域を含む核酸配列を示す。
配列番号６は、ヒトＯＣＴＮ２（ＳＬＣ２２Ａ５）のコード領域を含む核酸配列を示す。

材料

アッセイ法
（ａ）膜の調製
ウイルスによってトランスフェクションしたＳｆ９またはハイファイブ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）懸濁細胞系、または安定してトランスフェクションされた付着性のＣＨＯ細胞系から遠心分離によって細胞を採取した後、湿重量で約２ｇの細胞のアリコートを液体窒素中で迅速に凍結させ、さらなる調製のために−８０℃で保存した。

この細胞ペレットを氷上で解凍し、氷冷した緩衝液（０.２５Ｍのスクロース、５ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）、２ｍＭのＤＴＴ、５０ｍｌあたり１個の完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ・ダイアグノスティックス社（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ），マンハイム，ドイツ）に移した。

膜フラグメントを、細胞を破裂させることによって調製した。パール細胞破砕器（ＰａｒｒｃｅｌｌｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎＢｏｍｂ）（パール・インスツルメント社（ＰａｒｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ），イリノイ州，米国）を利用した窒素細胞破壊法によって、またはダウンス型ホモジナイザー（７ｍｌ，ノボダイレクト社（ＮｏｖｏｄｉｒｅｃｔＧｍｂＨ），ケール／ライン，ドイツ製）を利用したダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイズ法によって細胞をホモジナイズし、この懸濁液を４℃および６８０ｇで１０分間、および４℃および６１００ｇで１０分間遠心分離した。上清を集め、再度ＳＷ４１スイングアウトローターで４℃および１００,０００ｇで１時間遠心分離した。

ペレットを５ｍＭのトリス（ｐＨ７.５）約２ｍｌに懸濁した。８７％のスクロース（５ｍＭのトリス中）を用いて、この懸濁液を５６％に調節した。次に、底部で５６％分画２ｍｌで始まり、続いて４５％スクロース３ｍｌ、３５％スクロース３ｍｌ、および９％スクロース２ｍｌのスクロース濃度勾配を構築した。

再度、４℃および１０００００ｇで２.５時間（またはさらにそれ以上の時間）遠心分離し、濃度勾配のバンドをパスツールピペットで慎重に吸引し、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、３０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）、または１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.５）のいずれか５ｍｌと共に新しいチューブに集めた。

さらに、１５００００ｇ、４℃で１時間の遠心分離工程を行った。

得られたペレットを３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２ｍＭのＤＴＴ、３０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）、１０％グリセロールに再懸濁した。

（ｂ）バイオセンサーの調製
バイオセンサーを、以下のプロトコールに従って調製した。
１．バイオセンサーに、メルカプタン溶液（イソプロパノール中の２％メルカプタン）３０μｌを添加し、
２．１５分間インキュベートし、
３．イソプロパノール（３×７０μｌ）でリンスし、
４．バイオセンサーを真空乾燥し、
５．３０分間乾燥し、
６．脂質（８００単位のｎ−デカンに溶解させた６０単位（重量）の２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン＋１単位のオクタデシルアミン）２μｌを添加し、
７．その直後に、ＤＴＴ−緩衝液（ＤＴＴ１,５４２ｍｇ／緩衝液Ｃ５０ｍｌ）３０μｌを添加し、
８．２０分間インキュベートし、
９．膜標品（２０μｌ）＋ＤＴＴ−緩衝液Ｃ（１３５μｌ）を添加して混合し（６種のセンサーについて）、
１０．超音波破砕を２×１０回（設定：０.５秒／３０％、氷上での３０秒の中止期間を含む）で行い、
１１．バイオセンサーから緩衝液を除去し、
１２．その直後に、バイオセンサーに膜溶液２５μｌを添加し（３回混合）、
１３．冷蔵庫で一晩保存した（高い湿度を保持するペトリ皿中で）。

（ｃ）溶液交換プロトコール
ＯＣＴタンパク質の活性を決定するために、ＯＣＴタンパク質を、連続的に洗浄溶液、非活性化溶液および活性化溶液で処理し、充電から活性化処理へ変化させた際の電流を測定した。洗浄溶液および非活性化溶液の活性化溶液（基質含有溶液）への置き換えによって、ＯＣＴ活性が始動した。その後、逆の順番で溶液を置換すると、センサーチップがその初期状態に戻った。

１分間中断した。

５分間中断し、分析しようとする化合物を添加した。

１分間中断した。

５分間中断し、同じ化合物をその他の濃度で添加するか、またはその他の化合物等を添加した。

ｈＯＣＴ２測定のために、以下の設定を用いた：
バイオセンサーシステムの緩衝液の容器Ａ、ＢおよびＣを、「活性化」緩衝液および「非活性化」緩衝液で充填した後、センサーホルダーにダミーをマウントし、このシステムを全ての緩衝液でフラッシングし、流体系全体から気泡を除去した。次に、何も含まれていない、またはブラインドのセンサーを、ｈＯＣＴ２含有ＣＨＯ膜フラグメント（直径３ｍｍの化学修飾された金表面；イオンゲート・バイオサイエンシズ社，フランクフルト／マイン，ドイツ）を予めローディングした標準的なガラスベースのセンサーで置き換えた。センサーフローセルを含む流体系を通る液体輸送を、緩衝液の容器に空気圧をかけることによって達成した。

測定は、通常２５０ｍｂａｒの超過圧力で行われ、それにより約３００μｌ／秒の流速が得られた。その活性を測定するために、ＯＣＴタンパク質を保持する膜を、「非活性化」および「活性化」溶液で連続的に処理した。その後、溶液を逆の順番で置き換えたところ、センサーチップが初期状態に戻った。コントロールソフトウェアによって、センサー表面上に「非活性化」緩衝液を流し、それに続いて「活性化」緩衝液および「非活性化」緩衝液を流す順序を定義した（図１を参照）。この順番の全体の間、電流応答をデジタル化し（２０００サンプル／秒）、データファイルに保存した。用量応答実験のために、阻害剤を、「非活性化」および「活性化」緩衝液それぞれに溶解させた。全ての化学物質のグレードは、分析グレードであるか、またはそれより優れたグレードのものとした。

データ分析
高コントロール：阻害の前に１００ｍＭの塩化コリンで活性化した後の、電気的な谷を示す電流；
低コントロール：阻害後に０ｍＭの塩化コリンで活性化した後の、電気的な谷を示す電流；
補正された生データから結果を計算した。

結果
１．図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ阻害する前（黒色のトレース）および阻害した後（灰色のトレース）の、ｒＯＣＴ２およびｈＯＣＴ２を保持させた固定化膜を有するセンサーにコリンを含む活性化溶液を添加した際の、電気的な応答を示す。ピークの振幅は、トランスポーターの初期の活性と同等であった；減衰の原因は、バイオセンサーのサンドイッチ構造における電気容量の充電にあるはずである。
２．図２Ａおよび２Ｂは、それぞれｒＯＣＴ２およびｈＯＣＴ２を含む膜における電気的な応答の振幅に対するコリン濃度の影響（高コントロール）を示す。
その後の試験では、コリン濃度滴定の結果に従って、高い振幅を有するシグナルを測定することができるように１００ｍＭのコリン濃度を用いた。
３．測定されたｐＨ依存性から、ｐＨ７.４で最高のタンパク質活性が示されたことから、その後の試験でも用いらた（図３）。阻害実験の場合、コリン濃度を１０ｍＭに低くした（競合的阻害作用を検出するためのＫＭ値の範囲で）。ＯＣＴの標準的な阻害剤（ＴＢＡ）のＩＣ５０は、それぞれｒＯＣＴ２の場合は３.５μＭ（図４Ａ）、およびｈＯＣＴ２の場合は２.９μＭ（図４Ｂ）と決定された。
４．上記で定義されたパラメーターを用いて、組換え細胞系由来の様々な膜標品を比較した。ＣＨＯ細胞系を用いた場合に最良の結果が得られた。昆虫細胞標品は高品質のシグナルを発生させたが、ＩＣ₅₀決定には不適切な減少を伴った。
５．ＣＨＯ細胞系を、イオントランスポーター研究の金標準とみなして手動のパッチクランプ電気生理学的な方法によってさらにモニターした。ｒＯＣＴ２の場合、ｈＯＣＴ２に関する電流はほとんど検出できず、ＩＣ５０値は決定できなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。
６．シグナルの感受性をさらに評価のために、追加の基質および阻害剤を試験した。図６Ａおよび６Ｂは、これらの実施例を示す。

本明細書で報告したＯＣＴ２に関するアッセイと共に、ファミリーに含まれるさらなる種類、例えばｈＯＣＴ１またはｈＯＣＴ３、およびコンストラクトをクローニングし、生成させた。細胞系は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＦｌｐｌｎ−およびＴ−ＲＥＸ系（カタログ番号Ｒ７５８−０７）を利用して生成された。

１Ａは、１ｍＭのＴＢＡで阻害する前（黒色のトレース）および阻害した後（灰色のトレース）で、活性化溶液（３０ｍＭの塩化コリン）を添加した際のｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）を保持させた固定化膜を有する典型的なセンサーの電気的応答を示す。１Ｂは、１ｍＭのＴＢＡで阻害する前（黒色のトレース）および阻害した後（灰色のトレース）で、活性化溶液（３０ｍＭの塩化コリン）を添加した際のｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ１）を保持させた固定化膜を有する典型的なセンサーの電気的応答を示す。２Ａは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のコリン濃度の依存性を示す（ＣＨＯ細胞膜）。２Ｂは、ｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ１）のコリン濃度の依存性を示す（ＣＨＯ細胞膜）。昆虫細胞からのｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）およびｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ２）のｐＨ依存性を示す。４Ａは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のＴＢＡのＩＣ５０を示す（ＣＨＯ細胞）。ＩＣ５０は、基質として１０ｍＭのコリンを用いて決定された。４Ｂは、ｈＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ２）のＴＢＡのＩＣ５０を示す（ＣＨＯ細胞）。ＩＣ５０は、基質として３０ｍＭのコリンを用いて決定された。５Ａは、パッチクランプ実験において安定して発現されたｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）の電流を示す（ＣＨＯ細胞）。５Ｂは、パッチクランプ実験において安定して発現されたｈＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）の電流を示す（ＣＨＯ細胞）。６Ａは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のキニンのＩＣ５０を示す（ＣＨＯ細胞）。ＩＣ５０は、基質として１０ｍＭのコリンを用いて決定された。６Ｂは、ｒＯＣＴ２（ｓｌｃ２２ａ２）のアセチルコリン濃度の依存性を示す（ＣＨＯ細胞）。ヒトＯＣＴ２（ｈＯＣＴ２、ＳＬＣ２２Ａ２））のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＡ）部位は、太字と下線で示す。ＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）クローニング部位は、下線で示す。図７−１の続きである。ラットＯＣＴ２（ｒＯＣＴ２；ｓｌｃ２２ａ２）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＧＡ）部位は、太字と下線で示す。ＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣＣ）およびＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）クローニング部位は、下線で示す。図８−１の続きである。ヒトＯＣＴ１（ｈＯＣＴ１；ＳＬＣ２２Ａ１）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＧＡ）部位は、太字と下線で示す。ＨＩＮＤＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）およびＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）クローニング部位は、下線で示す。図９−１の続きである。ヒトＯＣＴ３（ｈＯＣＴ３；ＳＬＣ２２Ａ３）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）部位は、太字と下線で示す。ヒトＯＣＴＮ１（ＳＬＣ２２Ａ４）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＧＡ）部位は、太字と下線で示す。ヒトＯＣＴＮ２（ＳＬＣ２２Ａ５）のコード領域を含む核酸配列を示す。この遺伝子の開始（ＡＴＧ）および停止（ＴＡＧ）部位は、太字と下線で示す。図１２−１の続きである。

Claims

有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）活性を決定する方法であって、以下の連続工程：
（ａ）固体に支持されたセンサー電極と、ＯＣＴを含む脂質層とを含む無細胞の電気生理学的なセンサーチップを供給し（ここでＯＣＴを含む脂質層はセンサー電極に空間的に直に隣接して位置するが、センサー電極は用いられる溶液および脂質層に対して電気的に絶縁される）、
（ｂ）センサーチップを、イオンを含む非活性化溶液で処理し、
（ｃ）センサーチップを、イオンおよび基質を含む活性化溶液で処理し、そして
（ｄ）電気シグナルを測定すること、
を含む、上記方法。
ＯＣＴは、ＯＣＴ１（ＳＬＣ２２Ａ１）、ＯＣＴ２（ＳＬＣ２２Ａ２）、ＯＣＴ３（ＳＬＣ２２Ａ３）、ＯＣＴＮ１（ＳＬＣ２２Ａ４）、ＯＣＴＮ２（ＳＬＣ２２Ａ５）から選択される、請求項１に記載の方法。
ＯＣＴは、哺乳動物起源のものであり、特にラット、マウス、ウサギ、ブタ、モルモット、キイロショウジョウバエ、カエノラブディティス・エレガンス、またはヒト由来であり、とりわけヒトＯＣＴ１（ＳＬＣ２２Ａ１）由来である、請求項１または２に記載の方法。
電極は、金属材料、または導電性の金属酸化物であり、特に金、白金、銀、または酸化インジウムスズを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
固体に支持されたセンサー電極は、ガラスまたはポリマーに支持されたセンサー電極であり、特にボロフロート−ガラスに支持されたセンサー電極であり、とりわけボロフロート−ガラスに支持された金電極である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
脂質層は、電極に、化学結合を介して、特にｈｉｓ−タグカップリングもしくはストレプトアビジン−ビオチンカップリングを介して、または疎水性力、親水性力もしくはイオン力を介して結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
電極は、１またはそれ以上の絶縁性を有する単分子層によって電気的に絶縁されており、特に１またはそれ以上の絶縁性を有する両親媒性の有機化合物によって電気的に絶縁されており、とりわけ１またはそれ以上の絶縁性を有する膜の単分子層によって電気的に絶縁されており、至適には、電極に面する下の層としてメルカプタン層、特にオクタデシルチオールによって電気的に絶縁され、そして、電極から見て外方に向く上の層として膜の単分子層によって電気的に絶縁されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
電極は、最初にイオンを含む洗浄溶液で洗浄される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
イオンを含む溶液は、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ²⁺、および／またはＣａ²⁺から選択される１価および２価イオンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
イオンを含む溶液中のイオンの合計濃度は、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭであり、特に約２００ｍＭ〜約５００ｍＭであり、とりわけ約３００ｍＭ〜約５００ｍＭであり、至適には、約４３５ｍＭである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
イオンを含む溶液中の１価のイオンの濃度は、約３００ｍＭ〜約４００ｍＭである、請求項９または１０に記載の方法。
イオンを含む溶液中の２価イオンの濃度は、約２ｍＭ〜約１０ｍＭであり、特に約５ｍＭ〜約８ｍＭであり、とりわけ約５ｍＭである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
イオンを含む溶液はさらに、緩衝液を含み、特にＨＥＰＥＳ／ＮＭＧ緩衝液（３０±１０ｍＭ，ｐＨ７.０±１.０）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
活性化溶液の基質は、有機カチオンであり、特にカチオン性の薬物、カチオン性の生体異物および／またはカチオン性のビタミンであり、とりわけ第一、第二、第三または第四アミンであり、至適にはコリン、アセチルコリン、ニコチン、Ｎ¹−メチルニコチンアミド、モルヒネ、１−メチル−４−フェニルピリジニウム、プロカインアミド、テトラエチルアンモニウム、トリブチルメチルアンモニウムデブリソキン、または生体アミン例えばエピネフリン、ノルエピネフリンまたはカルニチン、または親油性化合物例えばキニン、キニジン、またはステロイド例えばコルチコステロン、または有機アニオン例えばパラアミノ馬尿酸、プロベネシドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
電気シグナルは、電流測定および／または電位差測定の手段を用いて測定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）〜（ｄ）は、少なくとも２回、特に２〜４回行われる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
方法は、化学物質、特にＯＣＴ阻害剤の存在下で行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
化学物質の活性を決定する方法であって、以下の連続工程：
（ａ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法を行い、そして
（ｂ）化学物質の活性を測定すること、
を含む、上記方法。
方法は、活性化溶液の基質の存在下および／または非存在下で行われる、請求項１８に記載の方法。
ＯＣＴの活性を調節する化学物質を同定するための方法であって、以下の連続工程：
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を行い、そして
（ｂ）化学物質を同定すること、
を含む、上記方法。
化学物質は、有機カチオンであり、特にカチオン性の薬物、カチオン性の生体異物、および／またはカチオン性のビタミン、生体アミンであり、とりわけ第一、第二、第三または第四アミン、親油性化合物、有機アニオンである、請求項２０に記載の方法。
化学物質は、ＯＣＴ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
化学物質は、化学物質ライブラリーに存在する、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜７および１５のいずれか一項に定義される、無細胞の電気生理学的なセンサーチップ。
電極から測定データを得るためのデータ取得装置、ならびに場合によりイオンを含む溶液を交換および／または混合するのに利用できる交換および／または混合手段をさらに含む、請求項２４に記載のセンサーチップ。
マイクロプレートまたはマイクロタイタープレートの形態である、請求項２４または２５に記載のセンサーチップ。
請求項２４または２６に記載のセンサーチップ、参照電極、電極から測定データを得るためのデータ取得装置、イオンを含む溶液を交換および／または混合するのに利用できる交換および／または混合手段、フロー分析装置、電源、コンピューター、ならびにオートサンプラーを含む装置。
参照電極は、Ｐｔ／Ｐｔ、Ａｇ／ＡｇＣｌまたは酸化インジウムスズ電極である、請求項２７に記載の装置。
（ａ）請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の無細胞の電気生理学的なセンサーチップ、または請求項２７または２８に記載の装置、
（ｂ）請求項９〜１３のいずれか一項に記載のイオンを含む溶液の少なくとも１種、および場合により、
（ｄ）請求項１４に定義された基質、
を含むキット。