BRPI0708010A2 - método para a determinação da atividade do transportador de cátions orgánicos - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA A DETERMINAçãO DA ATI VIDADE DO TRANSPORTADOR DE CáTIONS ORGáNICOS. A presente invenção refere-se a um método para determiner a atividade do transportador de cátions orgânicos (OCT), um método para determinar a atividade ou identificar um composto químico que modula a atividade de OCT com a ajuda de um chip sensor eletrofisiológico isento de células, contendo um eletrodo sensor sobre suporte sólido e uma camada lipídica que contém o OCT localizado na vizinhança espacial imediata do eletrodo sensor, enquanto que o eletrodo sensor é eletricamente isolado em relação às soluções usadas e à camada lipídica, bem como ao chip sensor em si, e um kit que contém o mesmo.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA A DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DO TRANSPORTADOR DE CÁTIONS ORGÂNICOS".
A presente invenção refere-se a um método para determinar aatividade do transportador de cátions orgânicos (OCT), um método para de-terminar a atividade ou identificar um composto químico que modula a ativi-dade do OCT com a ajuda de um chip sensor eletrofisiológico isento de célu-las, que contém um eletrodo sensor sobre um suporte sólido e uma camadalipídica que contém o OCT localizado na vizinhança espacial imediata doeletrodo sensor, enquanto que o eletrodo sensor é eletricamente isolado emrelação às soluções usadas e à camada lipídica, bem como ao chip sensorem si, e um kit que contém o mesmo.
O transporte de cátions orgânicos humanos é um mecanismoimportante para o transporte transcelular de cátions orgânicos. Portanto, ostransportadores de cátions orgânicos (OCTs) não são apenas alvos de fár-macos potenciais que permitem a influência direta sobre anormalidades re-lacionadas à doenças, mas também alvos ADMET (Adsorção, Distribuição,Metabolismo, Excreção e Toxicidade) que permitem alterações de parâme-tros de biodisponibilidade de fármacos potenciais.
O OCT pretence a uma superfamília que inclui uniportes, simpor-tes e antiportes, tais como proteínas de resistência a múltiplos fármacos,sistemas facilitadores de difusão e antiportes de prótons. Eles medeiam otransporte de cátions pequenos com diferentes estruturas moleculares inde-pendentemente de gradientes de sódio e prótons. Foram descritos meca-nismos de transporte específicos do substrato e independentes de sódio porintermédio do OCT humano (hOCT) no fígado, intestino delgado e no siste-ma nervoso (Pritchard, J.B. & Miller, D.S., Physiol. fíev. 73(4):765-796(1993)). O transportador de cátions orgânicos humano, hOCT1, já foi clona-do em 1997 (Zhang, L. et. ai, Mol. Pharmacology 51 (6):913-921 (1997)).
O OCT desloca cargas elétricas enquanto percorre seu ciclo detransporte. Este deslocamento pode se originar a partir do movimento desubstratos eletricamente carregados ou a partir do movimento de grupamen-tos protéicos portadores de cargas (parciais). As atividades dos OCTs po-dem ser monitoradas por intermédio de radiofluxos e eletrofisiologia-padrãocom grampos de voltagem com dois eletrodos, tendo as desvantagens co-muns de qualquer um dos dois métodos, tais como resolução temporal ruim,baixa sensibilidade, discriminação difícil entre bloqueadores e substratoscompetitivos, falsos positivos e negativos, etc. (Arndt et ai, Am. J. Physiol.Renal Physiol. 281 :F454-F468 (2001)).
Em alguns outros casos, as correntes relacionadas com trans-portadores podem ser monitoradas diretamente em um ambiente um tantofisiológico por experimentos com esparadrapo-grampo ou em "mambranaslipídicas negras" artificiais. Neste último caso, uma bicamada lipídica é gera-da em um pequeno furo entre dois reservatórios de tampão, cada um delescontendo um eletrodo de Ag/AgCI. Depois da incorporação da proteína den-tro da bicamada, a atividade biológica (por exemplo, a atividade enzimática)pode ser disparada, por exemplo, por fotoativação de derivados de ATP. A-inda assim, devido à sua falta de estabilidade, nenhum experimento rápidode troca de tampão pode ser conduzido com este sistema, limitando o siste-ma a substratos fotoativáveis. A falta de estabilidade pode ser superada i-mobilizando partículas que contêm proteína sobre uma superfície sensora ouchip sensor.
Um chip sensor eletrofisiológico isento de células baseia-se ge-nericamente em fragmentos ou vesículas de membranas que contêm otransportador de forma usual eletricamente acopladas a um biochip revestidocom ouro. Os fragmentos da membrana usualmente são adsorvidos sobre asuperfície do chip sensor, a qual de preferência porta uma camada lipídicamodificada sobre uma fina película de ouro. Os fragmentos da membranapodem genericamente formar cavidades que são capazes de manter gradi-entes iônicos através das membranas. Depois da ativação com um substratoapropriado, os íons ou substratos eletricamente carregados são transporta-dos através da membrana. Como os fragmentos de membrana adsorvidos etambém a superfície coberta do eletrodo se comportam como capacitoreselétricos, os íons em movimento representam uma corrente em mudançaque se torna detectável caso um eletrodo referencial seja colocado na solu-ção circundante.
O problema da presente invenção refere-se à questão de se aatividade do OCT pode ser detectada de forma específica e sensível comesse chip sensor, embora os experimentos com esparadrapo e grampo comhOCT1 tenham falhado.
Surpreendentemente, descobriu-se que pode ser estabelecidoum ensaio isento de células que apresentou a sensibilidade necessária paradetectar um sinal específico após a ativação do OCT. Foi particularmentesurpreendente porque o OCT funcionou no ensaio isento de células de acor-do com a presente invenção sem fundo celular, isto é, sem substâncias in-tracelulares, o citoesqueleto, etc. Particularmente, o ensaio da presente in-venção pode ser conduzido em uma ampla faixa de pH e/ou alta concentra-ção iônica, o que é uma vantagem específica.
Conseqüentemente, uma primeira modalidade da presente in-venção refere-se a um método para determinar a atividade do OCT com asseguintes etapas consecutivas:
(a) disponibilizar um chip sensor eletrofisiológico isento de célu-las, contendo um eletrodo sensor sobre um suporte e uma camada lipídicaque contém o OCT localizado na vizinhança espacial imediata do eletrodosensor, enquanto que o eletrodo sensor é eletricamente isolado em relaçãoàs soluções e à camada lipídica,
(b) tratar o chip sensor com uma solução nao-ativadora que con-tém íons,
(c) tratar o chip sensor com uma solução ativadora que contémíons e substrato, e
(d) medir o sinal elétrico.
O OCT é selecionado, por exemplo, entre SLC22A1 (0CT1), S-LC22A2 (0CT2, SLC22A3 (0CT3), SLC22A4 (0CTN1), e SLC22A5 (0CTN2).
Usualmente, ele é de origem mamífera, particularmente do rato, camundongo,coelho, porco, porquinho-da-índia, Drosophila meianogaster, Caenorhabditiseiegans ou ser humano. De preferência, ele é 0CT1 humano.O eletrodo compreende usualmente um material metálico ou umoxido de metal eletricamente condutor, particularmente oxido de ouro, plati-na, prata ou índio/estanho.
O eletrodo sensor sobre suporte sólido é geralmente um eletrodosensor sobre um suporte de vidro ou polímero, particularmente um eletrodosensor sobre um suporte de vidro Borofloat, particularmente um eletrodo deouro sobre suporte de vidro Borofloat. Em uma modalidade preferida, a ca-mada lipídica é afixada ao eletrodo por intermédio de uma ligação química,particularmente por intermédio de acoplamento His-tag ou acoplamento es-treptavidina-biotina, ou por forças hidrofóbicas, hidrofílicas ou iônicas.
O eletrodo é ainda eletricamente isolado, por exemplo, por umaou mais monocamadas isolantes, particularmente por um ou mais compos-tos orgânicos anfifílicos isolantes, mais particularmente por uma ou maismonocamadas de membranas isolantes, mais particularmente ainda por umacamada de mercaptanar, especialmente octadecil-tiol, como uma camadasubjacente voltada para o eletrodo e uma monocamada de membrana comouma camada superior voltada para longe do eletrodo.
Um chip sensor contém especialmente um suporte sólido quecarrega o eletrodo sensor e uma placa de cobertura com um furo, formandoum cavidade similar àqueles de placas de titulação. As placas de vidro oupolímero servem como suportes apropriados. No caso de um suporte de vi-dro, por exemplo, uma placa de vidro, o eletrodo contém, de preferência,uma película fina de ouro Iitograficamente estruturada, que foi modificadaquimicamente, por exemplo, por meio de uma mercaptana, sobre sua super-fície, também podem ser usados eletrodos modificados com uma películaespessa de ouro sobre suporte sólido. Devido à gama de substratos apropri-ados, chips sensores únicos podem ser fabricados, bem como tiras sensorasou mesmo placas com arranjos sensores com 96 ou 384 sensores. Particu-larmente, os sensores baseados em polímeros possuem o potencial paraprodução em massa a baixo custo.
Genericamente, no caso de todos tipos de sensores, a superfíciede ouro é transformada em um capacitor depois que a modificação superficialocorreu e o cavidade foi preenchido com uma solução aquosa. As proprieda-des deste capacitar podem ser determinadas com o auxílio de um eletrodoreferencial portador de corrente, tal como Pt/Pt ou Ag/AgCI, oxido de índio eestanho ou outros colocados em contato com a solução. Além disso, a super-fície do sensor é, de preferência, muito hidrofílica, isto é, pegajosa para frag-mentos e vesículas de membrana. Conseqüentemente, o OCT mantido noseu ambiente nativo ou semelhante a nativo, por exemplo, em lâminas demembrana biológica, vesículas ou proteolipossomas, são adsorvidos facilmen-te na superfície hidrofílica do sensor, formando compartimentos cujo espaçointerno com sua solução é eletricamente isolado da superfície de ouro bemcomo da solução circundante dentro da cavidade. Caso inserido em uma cu-beta, o cavidade do chip define o volume interno de uma célula de fluxo, per-mitindo uma rápida troca de solução acima da superfície do sensor.
Um chip sensor eletrofisiológico isento de células usado para apresente invenção está descrito, por exemplo, no documento n2 WO02/074983, particularmente nas reivindicações e/ou figuras 1 e/ou 2, incluin-do a descrição das figuras do ditto pedido de patente PCT, que é aqui incor-porado como referência, caso não descrito de outra forma na presente in-venção. Ele está disponível também na IonGate Biosciences GmbH, Frank-furt/Main, Alemanha, comercializado sob a denominação sistema biosensorSURFE2R ONE®.
Caso se troque de uma solução que não contém um substrato ouativador do OCT para uma solução que o contém, uma corrente carregadoratransiente mensurável do eletrodo é induzida, a qual fica tipicamente dentroda faixa de 100 pA a 4 nA. Portanto, a substituição da solução não-ativadorapela solução ativadora, isto é, a solução que contém substrato, disparará aatividade do OCT. Substituindo as soluções subseqüentemente na ordem in-versa devolve o chip sensor para seu estado inicial. De acordo com a presen-te invenção, uma vantagem específica das soluções que contêm íons é queos artigos são minimizados, o que leva a um sinal específico e sensível.
Todos componentes necessários para conduzir experimentos detroca de soluções podem ser adaptados em uma estação de trabalho contro-Iada com um PC ou de outra forma. No sistema convencional, a soluçãonão-ativadora (isto é, isenta de substrato) e a solução ativadora são generi-camente estocadas em frascos de vidro. A pressão de ar usualmente aplica-da aos frascos impulsiona a solução através de um sistema de válvulas ope-radas de forma eletromecânica e através da célula de fluxo. Alternativamen-te, um auto-amostrador pode ser usado para processar várias soluções deuma maneira automatizada.
Antes do uso do chip sensor, prefere-se lavar o eletrodo comuma solução de lavagem que contém íons.
Em qualquer caso, as soluções que contêm íons da presenteinvenção contêm, de preferência, íons monovalentes e bivalentes seleciona-dos entre Na+, K+, Mg2+ e/ou Ca2+.
A concentração total dos íons nas soluções que contêm íons é,de preferência, entre cerca de 100 mM e cerca de 1.000 mM, particularmen-te entre cerca de 200 mM e cerca de 500 mM, mais particularmente entrecerca de 300 mM e cerca de 500 mM, e com a maior preferência, cerca de435 mM. A concentração dos íons monovalentes nas soluções que contêmíons é, de preferência, entre cerca de 300 mM e cerca de 400 mM e a con-centração dos íons bivalentes é, de preferência, entre cerca de 2 mM e cer-ca de 10 mM, particularmente entre cerca de 5 mM e cerca de 8 mM, maisparticularmente cerca de 5 mM.
Em outra modalidade preferida, as soluções que contêm íonscontêm ainda um tampão, particularmente um tampão de HEPES/NMG, 30 ±10 mM, pH 7,0 ± 1,0.
Os exemplos das soluções que contêm íons são
(a) uma solução de lavagem:
30 ± 10 mM de um tampão, por exemplo, HEPES/NMG, pH 7,0 ±1,0,
300 ± 100 mM de um íon monovalente, por exemplo, NaCI,
4 ± 2 mM de um íon bivalente, por exemplo, MgCI2.
(b) uma solução não-ativadora:
30 ± 10 mM de um tampão, por exemplo, HEPES/NMG, pH 7,0 ±1,0,
300 ± 100 mM de um íon monovalente, por exemplo, NaCI,4 ± 2 mM de um íon bivalente, por exemplo, MgCI2, e0,5 - 100 mM de um íon monovalente, por exemplo, NaCI1 quedeve ser eqüimolar à concentração do substrato na solução ativadora.(c) uma solução ativadora:
30 ± 10 mM de um tampão, por exemplo, HEPES/NMG, pH 7,0 ± 1,0,
300 ± 100 mM de um íon monovalente, por exemplo, NaCI,
4 ± 2 mM de um íon bivalente, por exemplo, MgCI2, e
0,5 - 100 mM de um substrato, por exemplo, cloreto de colina.
O substrato da solução ativadora é genericamente um cátionorgânico, particularmente um fármaco catiônico, um xenobiótico catiônicoe/ou uma vitamina catiônica, mais particularmente uma amina secundária,terciária ou quaternária, mais particularmente ainda, colina, acetilcolina, nico-tina, N1-metilnicotinamida, morfina, 1 -metil-4-fenilpiridínio, procainamida, te-traetil-amônio, tributil-metil-amônio, debrisoquineor, uma amina biogênicasemelhante à epinefrina, norpeinefrina ou carnitina ou compostos lipofílicostais como quinina, quinidina ou esteróides tais como corticosterona ou cá-tions orgânicos tais como ácido para-amino hipúrico, probenecid.
Genericamente, o sinal elétrico é medido usando meios amperi-métricos e/ou potenciométricos, e as etapas (b) a (d) são conduzidas pelomenos 2 vezes, particularmente 2 a 4 vezes.
O termo "sinal elétrico" ou "corrente" no contexto desta invençãodeve significar a corrente de pico em resposta à substituição da solução não-ativadora pela ativadora, incluindo, porém sem limitações, a corrente de picomáxima. A amplitude da corrente se eleva usualmente dentro de 10 a 100ms, e em seguida, um decaimento mais lento dentro de cerca de 2 segun-dos. A polaridade da corrente pode ser positiva ou negativa, dependendo dapolaridade dos íons transportados e/ou da polaridade dos grupamentos des-locados da proteína e a orientação vetorial do seu tansporte ou deslocamen-to através ou dentro das membranas dos compartimentos. As correntes re-sultantes da substituição da solução ativadora pela solução não-ativadora ouda substituição da solução não-ativadora pela solução de lavagem não sãogeralmente levadas em consideração com relação à determinação da ativi-dade do OCT. As vazões e os intervalos são escolhidos, de preferência, detal modo que a resposta da corrente à substituição da solução não-ativadorapela solução ativadora permaneça não-polarizada por respostas de correnteprovocadas pelas outras etapas de substituição.
O método da presente invenção pode ser conduzido também napresença de um composto químico, particularmente um estimulador (ativa-dor) ou um inibidor de OCT.
Portanto, a presente invenção refere-se também a um métodopara identificar um composto químico que modula a atividade de OCT comas seguintes etapas consecutiva:
(a) conduzir o método da presente invenção, e
(b) identificar o compost químico.
O composto químico é geralmente Um cátion orgânico, particu-larmente um fármaco catiônico, um xenobiótico catiônico e/ou uma vitaminacatiônica e/ou aminas biogênicas, mais particularmente uma amina primária,secundária, terciária ou quaternária , onde o composto químico é usualmen-te um estimulador ou um inibidor de OCT. O composto químico pode estarpresente, por exemplo, em uma biblioteca de compostos químicos.
Outro tema da presente invenção é o chip sensor eletrofisiológi-co isento de células em si, que contém o OCT, como descrito detalhadamen-te acima. O OCT é unido ao chip sensor de acordo com métodos generica-mente conhecidos pelos versados nessas técnicas e/ou como descrito espe-cificamente no exemplo.
O chip sensor pode compreender ainda um dispositivo de obten-ção de dados para obter dados de medição a partir do eletrodo, e opcional-mente um meio de troca e/ou mistura para disponibilizar a troca e/ou misturadas soluções que contêm íons. O chip sensor pode estar também na formade uma microplaca ou placa de microtitulação.
Outro tema da presente invenção é um aparelho que contém umchip sensor da presente invenção, um eletrodo referencial, um dispositivo deobtenção de dados para obter dados de medição a partir do eletrodo, um meiode troca e/ou mistura para disponibilizar a troca e/ou mistura de soluções quecontêm íons, um dispositivo de análise de fluxo, um suprimento de energia elé-trica, um computador e um atuo-amostrador. O eletrodo referencial é, de prefe-rência, um eletrodo de Pt/Pt, Ag/AgCI ou oxido de índio e estanho.
Um outro tema da presente invenção é um kit que contém
(a) um chip sensor eletrofisiológico isento de células da presenteinvenção ou um aparelho da presente invenção,
(b) pelo menos uma solução que contém íons, como definidaacima, e opcionalmente
(c) um substrato como definido acima.
As figuras, Tabelas, Seqüências, e Exemplos que se seguemdevem explicar a presente invenção sem limitar o escopo da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
figura 1A ilustra as respostas elétricas de um sensor típico commembranas imobilizadas que abrigam rOCT2 (slc22a2) após a adição desolução ativadora (cloreto de colina 30 mM) antes (traço preto) e depois dainibição (traço cinza) com TBA 1 mM.
figura 1B ilustra as respostas elétricas de um sensor típico commembranas imobilizadas que abrigam hOCT2 (SLC22A1) pós a adição desolução ativadora (cloreto de colina 30 mM) antes (traço preto) e depois dainibição (traço cinza) com TBA 1 mM.
figura 2A ilustra a dependência da concentração de colina derOCT2 (slc22a2) (membranas de células CHO).
figura 2B ilustra a dependência da concentração de colina dehOCT2 (SLC22A1) (membranas de células CHO).
figura 3 ilustra a dependência do pH de rOCT2 (slc22a2) ehOCT2 (SLC22A2) a partir de células de inseto.
figura 4A ilustra a Cl50 de TBA de rOCT2 (slc22a2) (célulasCHO). A CI5O foi determinada usando colina 10 mM como substrato.
figura 4B ilustra a Cl50 de TBA de hOCT2 (SLC22A2) (célulasCHO). A CI5O foi determinada usando colina 30 mM como substrato.
figura 5A ilustra a corrente elétrica de rOCT2 (slc22a2) expressadode forma estável em experimentos de esparadrapo grampo (células CHO).
figura 5B ilustra a corrente elétrica de hOCT2 (slc22a2) expressadode forma estável em experimentos de esparadrapo grampo (células CHO).
figura 6A ilustra a CI5o de guinina de rOCT2 (slc22a2) (célulasCHO). A CI5O foi determinada usando colina 10 mM como substrato.
figura 6B ilustra a dependência da concentração de acetilcolinade rOCT2 (slc22a2) (células CHO).
figura 7 ilustra uma següência de ácidos nucléicos que contém aregião codificadora de OCT2 humano (hOCT2, SLC22A2). Os sítios de início(ATG) e interrupção (TAA) do gene estão em negrito e sublinhados. Os sítiosde clonagem de Xhol/Xhol (CTCGAG) estão sublinhados.
figura 8 ilustra uma següência de ácidos nucléicos gue contém aregião codificadora de OCT2 do rato (rOCT2; slc22a2). Os sítios de início(ATG) e interrupção (TGA) do gene estão em negrito e sublinhados. Os sítiosde clonagem de Kpnl (GGTACC) e BamHI (GGATCC) estão sublinhados.
figura 9 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos que contém aregião codificadora de OCT1 humano (hOCT1; SLC22A1). Os sítios de início(ATG) e interrupção (TGA) do gene estão em negrito e sublinhados. Os sítiosde clonagem de HINDIII (AAGCTT) e EcoRV (GATATC) estão sublinhados.
figura 10 ilustra uma següência de aminoácidos que contém aregião codificadora de OCT3 humano (hOCT3; SLC22A3). Os sítios de início(ATG) e interrupção (TAG) do gene estão em negrito e sublinhados.
figura 11 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos que contéma região codificadora de OCTN1 humano (SLC22A4). Os sítios de início(ATG) e interrupção (TGA) do gene estão em negrito e sublinhados.
figura 12 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos que contéma região codificadora de OCTN2 humano (SLC22A5). Os sítios de início(ATG) e interrupção (TAG) do gene estão em negrito e sublinhados.
DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NO: 1 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos quecontém a região codificadora de OCT2 humano (hOCT2; SLC22A2).
SEQ ID NO: 2 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos quecontém a região codificadora de OCT2 do rato (rOCT2; slc22a2)).
SEQ ID NO: 3 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos quecontém a região codificadora de OCT1 humano (hOCT1; SLC22A3).
SEQ ID NO: 4 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos quecontém a região codificadora de OCT3 humano (hOCT3; SLC22A3).
SEQ ID NO: 5 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos quecontém a região codificadora de OCTN1 humano (SLC22A4).
SEQ ID NO: 6 ilustra uma seqüência de ácidos nucléicos quecontém a região codificadora de OCTN2 humano (SLC22A5).
EXEMPLOS
Materiais
Solução de lavagem (C):
<table>table see original document page 12</column></row><table>
Em soução C, B e A, respectivamente
Procedimento do Ensaio
(a) Preparação de MembranasDepois de colher as células a partir de uma linhagem de célulasem suspensão Sf9 ou HighFive transfectadas com vírus ou uma linhagem decélulas CHO aderentes transfectadas de forma estável por intermédio decontrifugação, alíquotas de aproximadamente 2 g de peso seco foram con-geladas rapidamente em nitrogênio líquido e estocadas a -80°C para prepa-ração adicional.
O pélete de células foi descongelado sobre gelo e transferidopara tampão gelado (sacarose 0,25 M1 Tris 5 mM, pH 7,5, DTT 2 mM, umcomprimido de coquetel complete de inibidor de protease por 50 mL (RocheDiagnosticsGmbH1Mannheim1AIemanha).
Os fragmentos de membrana foram preparados por ruptura decélulas. As células foram homogeneizadas pelo método de rompimento celu-lar com nitrogênio, utilizando uma Bomba de Rompimento Celular Parr (ParrInstrument Company, Illinois, EUA) ou o método de homogeneização Doun-ce, utilizando um Homogeneizador Dounce (7ml_ de Novodirect GmbH, Ke-hl/Rhein, Alemanha) e a suspensão foi centrifugada por 10 min a 4°C e 680g e 10 min a 4°C e 6.100 χ g. Os sobrenadantes foram coletados e centrifu-gados novamente por 1 ha 4°C e 100.000 χ g em rotor oscilante SW41.
Os péletes foram colocados em suspensão em aproximadamen-te 2 mL de Tris 5 mM, pH 7,5. Com sacarose a 87% (em Tris 5 mM) a sus-pensão foi ajustada para 56%. O gradiente de sacarose foi então formadocomeçando com 2 mL da fração de 56% no fundo, e em seguida, 3 mL desacarose a 45%, 3 mL a 35% e 2 mL a 9% de sacarose.
Novamente centrifugação por 2,5 h (ou mesmo mais) a 4°C e100.000 χ g, as bandas de gradientes foram aspiradas cuidadosamente comuma pipeta Pasteur e coletadas em tubos frescos junto com 5 mL de NaCI300 mM, MgCI2 5 mM, Hepes 30 mM, pH 7,5 ou Tris/HCI 10 mM, pH 7,5.
Seguiu-se outra etapa de centrifugação: 1 h a 150.000 χ g, 4°C.
O pélete resultante foi colocda em suspensão em NaCI 300 mM,MgCI2 5 mM, DTT 2 mM, Hepes 30 mM, pH 7,5, 10% de glicerina.
(b) Preparação de Biossensores
Os biossensores foram preparados de acordo com o seguinteprotocolo:
1. Adição de 30 μΙ_ de solução de mercaptana (2% de mercaptana emisopropanol) para o biossensor
2. Tempo de Incubação: 15 min
3. Enxágüe com 3 x70 μΙ_ de isopropanol
4. Secar a vácuo o biossensor
5. Tempo de secagem: 30 min
6. Adição de 2 pL de lipídeo (60 unidades (peso) de 2-Difitanoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina + 1 unidade de octadecilamina dissolvida em 800 uni-dades de n-decano)
7. Adição imediata de 30 μΙ_ de Tampão DTT (1,542 mg de DTT/50 mL deTampão C)
8. Tempo de incubação: 20 min.
9. Adição de 20 μί de preparação de membrana + 135 μι. DTT-Tampão Ce Misturação (para 6 sensores)
10. Ultra-som: 2x10 vezes (ajustes de 0,5 s /30%) com uma pausa sobregelo de 30 s
11. Remoção de tampão do biossensor
12. Adição imediata de 25 μι de solução de membrana aos biossensores(misturar 3 vezes)
13. Estocar de um dia para o outro no refrigerador (em placa Petri com altaumidade)
(c) Protocolo de Troca de Soluções
Para a determinação da sua atividade, a proteína OCT foi trata-da consecutivamente com uma solução de lavagem, uma não-ativadora euma ativadora, e a corrente elétrica foi medida quando se mudou o carrega-mento para o tratamento ativador. A substituição da solução de lavagem enão-ativadora pela solução ativadora (solução que contém substrato) disparaa atividade do OCT. Subseqüentemente, substituir as soluções na ordeminversa devolve o chip sensor para seu estado inicial.Ciclo 1:
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5 minutos de intervalo e adição do mesmo composto em outra concentraçãoou adição de outro composto, etc.
Os seguintes ajustes foram usados para as médicos de hOCT2:
Depois que os recipientes de tampões A, B, e C do sistema debiossensor tinham sido enchidos com tampão "ativador" e tampão "não-ativador", um "dummy" foi montado no porta-sensor, e o sistema foi enxa-guado com todos tampões para remover as bolhas de ar do sistema fluídicointeiro. Um sensor vazio ou cego foi então substituído por um sensor basea-do em vidro-padrão pré-carregado com fragmentos de membrana de CHOcontendo hOCT2 (superfície de ouro quimicamente modificada de 3 mm dediâmetro; IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt/M., Alemanha). O transportede líquido através do sistema fluídico, incluindo a célula de fluxo do sensor,foi realizado aplicando pressão de ar aos recipientes de tampões.
As medidas foram conduzidas usualmente com uma sobrepres-são de 25 Kpa (250 mbar), resultando em uma vazão de cerca de 300 μΙ_ s'1.
Para a determinação da sua atividade, as membranas que abrigam a proteí-na OCT foram tratadas consecutivamente com uma solução "não-ativadora"e uma "ativadora". Subseqüentemente, substituindo as soluções na ordeminversa devolve o chip sensor para seu estado inicial. Por meio do softwarede controle, uma seqüência foi definida (vide figura 1), na qual o tampão"não-ativador" escoava sobre a superfície do sensor, seguido de tampão"ativador" e tampão "não-ativador". Durante a seqüência inteira, a respostada corrente foi digitalizada (2.000 amostras s"1) e salvada para os arquivosde dados. Para estes experimentos de resposta à dose, os inibidores foramdissolvidos em tampão "não-ativador" e "ativador", respectivamente. Todos produtos químicos eram de grau analítico ou melhor.
Análise dos Dados
Alto controle: corrente elétrica do vale depois da ativação comcloreto de colina 100 mM antes da inibição;
Baixo controle: corrente elétrica do vale depois da ativação comcloreto de colina 0 mM depois da inibição;
Os resultados são calculados a partir dos dados brutos corrigidos.Inibição do transportador = 100
(amostra — baixocontrole)
(altocontrole - baixocontrole)
Resultados
1. As figuras 1A e 1B ilustram a resposta elétrica após a adiçãode colina contendo solução ativadora aos sensores com membranas imobili-zadas portadoras de rOCT2 e hOCT2 respectivamente, antes (traço preto) edepois da inibição (traço cinza). A amplitude de pico é equivalente à ativida-de inicial dos transportadores; o decaimento deve ser atribuído ao carrega-mento da capacitância da estrutura-sanduíche do biossensor.
2. As figuras 2A e 2B ilustram a influência da concentração decolina sobre a amplitude da resposta elétrica (alto controle) sobre membra-nas que contêm rOCT2 e hOCT2, respectivamente.
De acordo com os resultados de uma titulação da concentraçãode colina, uma concentração de colina 100 mM foi usada nos testes que seseguem, pois isto permitiu medir os sinais com alta amplitude.
3. A dependência do pH medido apresentou atividade mais alta daproteína em pH 7,4, que foi portanto usado em testes subseqüentes (figura 3).Para os experimentos de inibição, a concentração de colina foi diminuída para10 mM (na faixa do valor de KM para detectar efeitos competitivos do inibidor).A CI5O para um inibidor-padrão do OCT (TBA) foi determinada para 3,5 μΜ pararOCT2 (figura 4A) e 2,9 μΜ para hOCT2 (figura 4B), respectivamente.
4. Usando os parâmetros definidos acima, diferentes prepara-ções de membrana de linhagens de células recombinantes foram compara-das. Os melhores resultados foram obtidos com a linhagem de células CHO.
As preparações de células de insetos produziram sinais de alta qualidade;entretanto, com uma exaustão inadequada para a determinação da Cl50.
5. A linhagem de células CHO foi monitorada adicionalmente porintermédio de eletrofisiologia manual de esparadrapo e grampo, consideradacomo padrão de ouro para pesquisa de transportadores de íons. No caso derOCT2 as correntes elétricas foram dificilmente detectáveis, no caso dehOCT2 elas foram não-detectáveis, e os valores da Cl50 não puderam serdeterminados (figuras 5A e 5B).
6. Para avaliação adicional da sensibilidade do sinal, outros subs-tratos e inibidores foram testados. As figuras 6A e 6B ilustram estes exemplos.
Junto com os ensaios aqui relatados para OCT2s outros mem-bros da família, como por exemplo, hOCT1 ou hOCT3, e construções foramclonadas e geradas. As linhagens de células foram geradas utilizando o Sis-tema Flpln- e T-REX da Invitrogen (N2 do Catálogo R758-07).Listagem de Seqüência
<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH
<120> MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DO TRANSPORTADOR DE CÁTIONS ORGÂNICOS
<130> DE2006/001<160> 6
<170> versão de Patente 3.3
<210> 1
<211> 7407
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador<400> 1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
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gacgccatcc acgctgttt.t gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgga 960
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attctgcaga tatccagcac agtggcggcc gctcgagggc cctgccctga aggctggtca 1080
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cgtcttcctg ggcttcaccc ctgaccaccg ctgccggagc cccggagtgg ccgagctgag 13802697967_1.TXT
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tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 3540
gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg 3600
gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 3660
gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 3720
gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 3780
ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 3840
aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtacc tagaagttcc tattccgaag ttcctattct 3900
ctagaaagta taggaacttc cttggccaaa aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag 3960
aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa 4020
gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc 4080
tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc 4140
ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc 4200
cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg 4260
cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg 4320
ttcggcccat tcggaccgcá aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc 4380
gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg 4440
tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg 4500
cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca 4560
gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc 4620
ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg 4680
catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac 4740
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Claims (29)
1. Método para determinar a atividade do transportador de cá-tions orgânicos (OCT), onde o dito método compreende as etapas consecu-tivas de:(a) disponibilizar um chip sensor eletrofisiológico isento de célu-las, contendo um eletrodo sensor sobre um suporte sólido e uma camadalipídica que contém o OCT localizado na vizinhança espacial imediata doeletrodo sensor, enquanto que o eletrodo sensor é eletricamente isolado emrelação às soluções usadas e à camada lipídica,(b) tratar o chip sensor com uma solução não-ativadora que con-tém íons,(e) tratar o chip sensor com uma solução uma solução ativadoraque contém íonsé substrato, e(f) medir o sinal elétrico.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o OCT é sele-cionado entre 0CT1 (SLC22A1), 0CT2 (SLC22A2), 0CT3 (SLC22A3),OCTN1 (SLC22A4), 0CTN2 (SLC22A5).
3. Método, de acordo coma reivindicação 1 ou 2, onde o OCT éde origem mamífera, particularmente do rato, camundongo, coelho, porco,porquinho-da-índia, Drosophila meianogaster, Caenorhabditis elegans ouhumana, mais particularmente 0CT1 humano (SLC22A1).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3,onde o electrodo compreende um material metálico ou um oxido de metaleletricamente condutor, particularmente ouro, platina, prate ou óxido de índioe estanho.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4,onde o eletrodo sensor sobre suporte sólido é um eletrodo sensor sobre su-porte de vidro ou polímero, particularmente um eletrodo sensor sobre supor-te de vidro Borofloat, mais particularmente um eletrodo de ouro sobre supor-te de vidro Borofloat.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5,onde a camada lipídica é afixada ao eletrodo por intermédio de uma ligaçãoquímica, particularmente por intermédio de um acoplamento His-tag ou aco-plamento estreptavidina-biotina, ou por intermédio de forças hidrofóbicas,hidrofílicas ou iônicas.
7. Método, de acordo com qualque uma das reivindicações 1-6,onde o electrodo é eletricamente isolado por uma ou mais monocamadasisolantes, particularmente por um ou mais compostos orgânicos anfifílicosisolantes, mais particularmente por uma ou mais monocamadas de membra-na isolatentes, mais particularmente ainda por uma camada de mercaptana,especialmente octadecil-tiol, como uma camada subjacente voltada para oeletrodo e uma monocamada de membrana como uma camada superior vol-tada para longe do eletrodo.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7,onde o eletrodo é primeiramente lavado com uma solução de lavagem quecontém íons.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8,onde as soluções que contêm íons contêm íons monovalentes e bivalentesselecionados entre Na+, K+, Mg2+ e/ou Ca2+.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, onde a concentração total dos íons nas soluções que contêm íons é entrecerca de 100 mM e cerca de 1.000 mM, particularmente entre cerca de 200mM e cerca de 500 mM, mais particularmente entre cerca de 300 mM e cer-ca de 500 mM, mais particularmente ainda cerca de 435 mM.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, onde a con-centração dos íons monovalentes nas soluções que contêm íons é entrecerca de 300 mM e cerca de 400 mM.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-11, onde a concentração dos íons bivalentes nas soluções que contêm íonsé entre cerca de 2 mM e cerca de 10 mM, particularmente entre cerca de 5mM e cerca de 8 mM, mais particularmente cerca de 5 mM.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, onde as soluções que contêm íons contêm ainda um tampão, particular-mente um tampão de HEPES/NMG, 30 ± 10 mM, pH 7,0 ± 1,0.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, onde o substrato da solução ativadora é um cátion orgânico, particular-mente um fármaco catiônico, um xenobiótico catiônico e/ou uma vitaminacatiônica, mais particularmente uma amina primária, secundária, terciária ouquaternária, mais particularmente ainda, colina, acetilcolina, nicotina, N1-metilnicotinamida, morfina, 1 -metil-4-fenilpiridínio, procainamida, tetraetil-amônio, tributil-metil-amônio, debrisoquina, uma amina biogênica semelhan-te à epinefrina, norpeinefrina ou carnitina ou compostos lipofílicos tais comoquinina, quinidina ou esteróides tais como corticosterona ou cátions orgâni-cos tais como ácido para-amino-hipúrico, probenecid.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, onde o sinal elétrico é medido usando meios amperimétricos e/ou poten-ciométricos.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, onde as etapas (b) a (d) são conduzidas pelo menos 2 vezes, particular-mente 2 a 4 vezes.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 16, onde o método é conduzido na presença de um composto químico, parti-cularmente um inibidor de OCT.
18. Método para determinar a atividade de um composto quími-co, onde o dito método compreende as etapas consecutivas de:(a) conduzir o método de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1-17, e(b) determinar a atividade do composto químico.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, onde o método éconduzido na presença e/ou na ausência do substrato da solução ativadora.
20. Método para identificar um composto químico que modula aatividade de OCT, onde o dito método compreende as etapas consecutivas de:(a) conduzir o método de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1-19, e(b) identificar o composto químico.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde o compostoquímico é um cátion orgânico, particularmente um fármaco catiônico, umxenobiótico catiônico e/ou uma vitamina catiônica, aminas biogênicas, maisparticularmente uma amina primária, secundária, terciária ou quaternária,compostos lipofílicos, anions orgânicos.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde o compostoquímico é um inibidor de OCT.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-22, onde o composto químico está presente em uma biblioteca de compos-tos químicos.
24. Chip sensor eletrofisiológico isento de células como definidoem qualquer uma das reivindicações 1-7 e 15.
25. Chip sensor, de acordo com a reivindicação 24, compreenden-do ainda um dispositivo de obtenção de dados para obter os dados de mediçãoa partir do electrodo, e opcionalmente meios de troca e/ou misturação para dis-ponibilizar a troca e/ou a misturação das soluções que contêm íons.
26. Chip sensor, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, naforma de uma microplaca ou placa de microtitulação.
27. Aparelho que contém um chip sensor como definido na rei-vindicação 24 ou 26, um eletrodo referencial, um dispositivo de obtenção dedados para obter dados de medição a partir do eletrodo, um meio de trocae/ou misturação para disponibilizar a troca e/ou misturação das soluções quecontêm íons, um dispositivo de análise de fluxo, um suprimento de energiaelétrica, um computador e um auto-amostrador.
28. Aparelho, de acordo com a reivindicação 27, onde o eletrodoreferencial é um eletrodo de Pt/Pt, Ag/AgCI ou oxido de índio e estanho.
29. Kit que contém(a) um chip sensor eletrofisiológico isento de células como defi-nido em qualquer uma das reivindicações 24-26 ou um aparelho como defi-nido na reivindicação 27 ou 28,(b) pelo menos uma solução que contém íons como definida emqualquer uma das reivindicações 9-13, e opcionalmente(c) um substrato como definido na reivindicação 14.
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