JPH0881497A - カチオン系生体異物および／または薬物の輸送を行う輸送タンパク質、それをコードするｄｎａ、およびそれらの用途 - Google Patents
カチオン系生体異物および／または薬物の輸送を行う輸送タンパク質、それをコードするｄｎａ、およびそれらの用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 肝臓上皮細胞、腎臓上皮細胞および腸細胞中
に存在して、カチオン系薬物および／または生体異物を
輸送することに関与する輸送タンパク質のクローニン
グ。 【解決手段】 この輸送タンパク質はそのＤＮＡおよび
アミノ酸配列により具体的に記載されている。
に存在して、カチオン系薬物および／または生体異物を
輸送することに関与する輸送タンパク質のクローニン
グ。 【解決手段】 この輸送タンパク質はそのＤＮＡおよび
アミノ酸配列により具体的に記載されている。
Description
【０００１】
【発明の背景】哺乳動物、特にヒトにおいて、様々な分
子構造のカチオン系薬物および生体異物、更にカテコー
ルアミンや他の内因性カチオンは、管腔および基底外側
原形質膜に存在する多特異性輸送タンパク質により、腎
臓および肝臓によって排出される。これらの輸送タンパ
ク質は、神経原形質膜およびシナプス小胞中の既知モノ
アミン輸送タンパク質と、疎水性薬物を輸出するＡＴＰ
依存性タンパク質（多剤輸送タンパク質）とは、それら
の機能の点で異なる。
子構造のカチオン系薬物および生体異物、更にカテコー
ルアミンや他の内因性カチオンは、管腔および基底外側
原形質膜に存在する多特異性輸送タンパク質により、腎
臓および肝臓によって排出される。これらの輸送タンパ
ク質は、神経原形質膜およびシナプス小胞中の既知モノ
アミン輸送タンパク質と、疎水性薬物を輸出するＡＴＰ
依存性タンパク質（多剤輸送タンパク質）とは、それら
の機能の点で異なる。
【０００２】本発明の範囲内において、相補的ＤＮＡ配
列がラット腎臓から最初に単離されたが、その配列は長
さが５５６アミノ酸の膜タンパク質をコードしており、
以下でＯＣＴ１と呼ぶこととする。この輸送タンパク質
は近位尿細管の基底外側膜および肝細胞で様々な標的分
子のカチオン輸送体として作用する。
列がラット腎臓から最初に単離されたが、その配列は長
さが５５６アミノ酸の膜タンパク質をコードしており、
以下でＯＣＴ１と呼ぶこととする。この輸送タンパク質
は近位尿細管の基底外側膜および肝細胞で様々な標的分
子のカチオン輸送体として作用する。
【０００３】ＯＣＴ１と命名された輸送タンパク質はい
かなる他の既知タンパク質とも相同的ではなく、疎水性
および負荷電アミノ酸のこれまでにない独特な分布を示
し、もっぱら腎臓、肝臓および腸でみられる。ＯＣＴ１
輸送タンパク質は様々な構造のカチオンを輸送し、異な
る疎水性の多数のカチオン系物質により阻害され、非常
に疎水性の物質だけを輸送できる既知多特異性輸送タン
パク質（多剤輸送体）の場合とは異なる機能的性質を有
する。輸送タンパク質ＯＣＴ１は哺乳動物で多特異性輸
送タンパク質の新規原型として考えられる。
かなる他の既知タンパク質とも相同的ではなく、疎水性
および負荷電アミノ酸のこれまでにない独特な分布を示
し、もっぱら腎臓、肝臓および腸でみられる。ＯＣＴ１
輸送タンパク質は様々な構造のカチオンを輸送し、異な
る疎水性の多数のカチオン系物質により阻害され、非常
に疎水性の物質だけを輸送できる既知多特異性輸送タン
パク質（多剤輸送体）の場合とは異なる機能的性質を有
する。輸送タンパク質ＯＣＴ１は哺乳動物で多特異性輸
送タンパク質の新規原型として考えられる。
【０００４】抗ヒスタミン剤、抗不整脈剤、鎮静剤、オ
ピエート、利尿剤、静細胞剤および抗生物質のような汎
用薬物を含めた多数の有機カチオンは、腎臓上皮細胞お
よび肝細胞から能動輸送されることで尿および胆汁中に
排出される。腎臓で能動的に分泌されたとき、カチオン
は近位尿細管の基底外側および管腔原形質膜で多特異性
輸送系により輸送される。２つの系はそれらの機能的に
異なる。基底外側膜の輸送タンパク質は、テトラエチル
アンモニウム（ＴＥＡ）、Ｎ１‐メチルニコチンアミド
（ＮＭＮ）およびＮ‐メチル‐４‐フェニルピリジニウ
ム（ＭＰＰ）のような構造的に異なるカチオンを輸送す
ることができるが、異なる構造の多数の細胞外カチオン
により阻害される。これらの輸送タンパク質は内部が負
の膜電位と細胞内基質の反対方向輸送により駆動させる
ことができる。外部方向プロトン勾配により駆動される
が、膜電位により影響されない、２つの輸送系が管腔膜
において報告されている。これら輸送系のうち１つは近
位尿細管の基底外側膜におけるカチオン輸送系の場合に
匹敵する広い基質特異性を有している。機能的類似性の
ために、管腔膜のこの多特異性輸送系は心臓におけるノ
ルアドレナリンの神経外輸送系と同一であると思われ
る。
ピエート、利尿剤、静細胞剤および抗生物質のような汎
用薬物を含めた多数の有機カチオンは、腎臓上皮細胞お
よび肝細胞から能動輸送されることで尿および胆汁中に
排出される。腎臓で能動的に分泌されたとき、カチオン
は近位尿細管の基底外側および管腔原形質膜で多特異性
輸送系により輸送される。２つの系はそれらの機能的に
異なる。基底外側膜の輸送タンパク質は、テトラエチル
アンモニウム（ＴＥＡ）、Ｎ１‐メチルニコチンアミド
（ＮＭＮ）およびＮ‐メチル‐４‐フェニルピリジニウ
ム（ＭＰＰ）のような構造的に異なるカチオンを輸送す
ることができるが、異なる構造の多数の細胞外カチオン
により阻害される。これらの輸送タンパク質は内部が負
の膜電位と細胞内基質の反対方向輸送により駆動させる
ことができる。外部方向プロトン勾配により駆動される
が、膜電位により影響されない、２つの輸送系が管腔膜
において報告されている。これら輸送系のうち１つは近
位尿細管の基底外側膜におけるカチオン輸送系の場合に
匹敵する広い基質特異性を有している。機能的類似性の
ために、管腔膜のこの多特異性輸送系は心臓におけるノ
ルアドレナリンの神経外輸送系と同一であると思われ
る。
【０００５】
【発明の具体的説明】したがって、本発明は、血液から
肝臓または腎臓の上皮細胞中にカチオン系生体異物およ
び／または薬物を輸送するか、あるいは腸から血液循環
中にカチオン系生体異物または薬物を輸送することに関
与する輸送タンパク質に関する。
肝臓または腎臓の上皮細胞中にカチオン系生体異物およ
び／または薬物を輸送するか、あるいは腸から血液循環
中にカチオン系生体異物または薬物を輸送することに関
与する輸送タンパク質に関する。
【０００６】新規輸送タンパク質は、図７〜９、図１０
〜１２、および図１３〜１５に示されたアミノ酸配列か
ら選択される、少くとも７つのアミノ酸の構成配列を示
す。好ましい態様において、図７〜９、図１０〜１２、
および図１３〜１５からの構成配列は、少くとも１０の
アミノ酸の長さ、特に好ましい態様において少くとも１
４のアミノ酸の長さを有する。
〜１２、および図１３〜１５に示されたアミノ酸配列か
ら選択される、少くとも７つのアミノ酸の構成配列を示
す。好ましい態様において、図７〜９、図１０〜１２、
および図１３〜１５からの構成配列は、少くとも１０の
アミノ酸の長さ、特に好ましい態様において少くとも１
４のアミノ酸の長さを有する。
【０００７】本発明は、新規輸送タンパク質をコードす
るＤＮＡ配列にも関する。新規ＤＮＡ配列は図７〜９、
図１０〜１２、および図１３〜１５に示された配列から
選択される、少くとも２１の塩基の構成配列を示す。特
に好ましい態様において、構成配列は少くとも３０の塩
基の長さ、非常に特に好ましい態様において少くとも４
２の塩基の長さを有する。
るＤＮＡ配列にも関する。新規ＤＮＡ配列は図７〜９、
図１０〜１２、および図１３〜１５に示された配列から
選択される、少くとも２１の塩基の構成配列を示す。特
に好ましい態様において、構成配列は少くとも３０の塩
基の長さ、非常に特に好ましい態様において少くとも４
２の塩基の長さを有する。
【０００８】新規輸送タンパク質およびＤＮＡ配列は、
医学的および薬理学的研究で特に重要である。新規ＤＮ
Ａ配列は、例えば新規輸送タンパク質を永続的に発現す
る上皮細胞系を作るために使用できる。この目的のた
め、輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列はそれ自体
公知の遺伝子操作方法を用いて適切なベクター中に組み
込まれ、これが輸送タンパク質を以前発現しなかった適
切な上皮細胞系を形質転換するために用いられる。こう
して、新規輸送タンパク質を常に発現する細胞系が得ら
れる。
医学的および薬理学的研究で特に重要である。新規ＤＮ
Ａ配列は、例えば新規輸送タンパク質を永続的に発現す
る上皮細胞系を作るために使用できる。この目的のた
め、輸送タンパク質をコードするＤＮＡ配列はそれ自体
公知の遺伝子操作方法を用いて適切なベクター中に組み
込まれ、これが輸送タンパク質を以前発現しなかった適
切な上皮細胞系を形質転換するために用いられる。こう
して、新規輸送タンパク質を常に発現する細胞系が得ら
れる。
【０００９】輸送タンパク質を発現するこのような性質
の上皮細胞系は、予想されるカチオン系薬物および／ま
たは生体異物の腎臓および胆汁排出と更に腸吸収を試験
するためにインビトロで用いることができる。このた
め、このような細胞系は、薬物と更に他の生物活性化合
物が腸から血液循環中に排出または吸収されるかどう
か、そうであるとすればその程度について、入念な動物
実験なしに、インビトロ段階で調べるために使用でき
る。
の上皮細胞系は、予想されるカチオン系薬物および／ま
たは生体異物の腎臓および胆汁排出と更に腸吸収を試験
するためにインビトロで用いることができる。このた
め、このような細胞系は、薬物と更に他の生物活性化合
物が腸から血液循環中に排出または吸収されるかどう
か、そうであるとすればその程度について、入念な動物
実験なしに、インビトロ段階で調べるために使用でき
る。
【００１０】新規ＤＮＡ配列は、新規輸送タンパク質と
相同的な輸送タンパク質を単離するために用いることが
できる。したがって、本発明による輸送タンパク質と相
同的な対応輸送タンパク質は、すべての哺乳動物種およ
びヒトから単離できる。２つの対応ヒト配列が既に決定
されている。このような単離を行う１つの可能な手段
は、現在周知のポリメラーゼ連鎖反応法を用いることで
ある。これをするためには、ポリメラーゼ連鎖反応法用
のプライマーとしての図７〜９、図１０〜１２、および
図１３〜１５に示された配列から適切なＤＮＡ配列を選
択することが必要となる。これらのプライマーは相同的
輸送タンパク質を単離する上で特に困難性なく使用でき
る。
相同的な輸送タンパク質を単離するために用いることが
できる。したがって、本発明による輸送タンパク質と相
同的な対応輸送タンパク質は、すべての哺乳動物種およ
びヒトから単離できる。２つの対応ヒト配列が既に決定
されている。このような単離を行う１つの可能な手段
は、現在周知のポリメラーゼ連鎖反応法を用いることで
ある。これをするためには、ポリメラーゼ連鎖反応法用
のプライマーとしての図７〜９、図１０〜１２、および
図１３〜１５に示された配列から適切なＤＮＡ配列を選
択することが必要となる。これらのプライマーは相同的
輸送タンパク質を単離する上で特に困難性なく使用でき
る。
【００１１】新規輸送タンパク質および／または新規上
皮細胞系の更に可能な使用法は、腎臓および胆汁排出ま
たは腸吸収を変えるために、薬物のような生物活性化合
物に結合できるカチオン系シグナル分子の開発を行うた
めに用いることである。こうして、異なる化学構造につ
いて試験を行い、それらが結合する分子の腎臓または肝
臓からの排出を有利にして、しかも腸から血液循環中へ
の吸収を促進するかどうか、あるいはそれらが各場合に
反対の作用を生じるかどうかについてみることができ
る。
皮細胞系の更に可能な使用法は、腎臓および胆汁排出ま
たは腸吸収を変えるために、薬物のような生物活性化合
物に結合できるカチオン系シグナル分子の開発を行うた
めに用いることである。こうして、異なる化学構造につ
いて試験を行い、それらが結合する分子の腎臓または肝
臓からの排出を有利にして、しかも腸から血液循環中へ
の吸収を促進するかどうか、あるいはそれらが各場合に
反対の作用を生じるかどうかについてみることができ
る。
【００１２】新規輸送タンパク質は、カチオン系薬物の
腎毒性を減少させるために、尿細管細胞中への薬物の取
込みを阻止する上で使用できる抗体、特にモノクローナ
ル抗体を作る上でも特に使用できる。
腎毒性を減少させるために、尿細管細胞中への薬物の取
込みを阻止する上で使用できる抗体、特にモノクローナ
ル抗体を作る上でも特に使用できる。
【００１３】更に、本発明の開示は、ある他のカチオン
系薬物および／または生体異物の排出に影響を与える特
異的薬物を開発する上で基礎として使用できる。こうし
て、他の活性化合物の取込みに影響を与えうる薬理活性
物質を開発することができる。この性質の影響は、腸か
らの活性化合物の取込みを促進または防止するか、ある
いは腎臓および肝臓で活性化合物の排出を促進または防
止することからなる。
系薬物および／または生体異物の排出に影響を与える特
異的薬物を開発する上で基礎として使用できる。こうし
て、他の活性化合物の取込みに影響を与えうる薬理活性
物質を開発することができる。この性質の影響は、腸か
らの活性化合物の取込みを促進または防止するか、ある
いは腎臓および肝臓で活性化合物の排出を促進または防
止することからなる。
【００１４】新規ＤＮＡ配列の更なる好ましい使用法
は、アンチセンスヌクレオチド配列を開発する場合であ
る。この関係において、対応する天然相補的ヌクレオチ
ド配列と結合することで対応遺伝子の転写および／また
は翻訳を防止するヌクレオチド配列が開発できる。
は、アンチセンスヌクレオチド配列を開発する場合であ
る。この関係において、対応する天然相補的ヌクレオチ
ド配列と結合することで対応遺伝子の転写および／また
は翻訳を防止するヌクレオチド配列が開発できる。
【００１５】新規ＤＮＡ配列の更なる好ましい使用法
は、腎臓および／または胆汁カチオン排出メカニズムに
おいてゲノムレベルで分子欠陥を診断するための分子試
験キットにおけるそれらの使用である。この性質の分子
試験キットにおいて、ＤＮＡ配列は特に好ましい態様で
ポリメラーゼ連鎖反応法を行うために使用できる。この
場合に、公知のＤＮＡ配列は、カチオン輸送体をコード
する各患者からの遺伝子を増幅させて、この遺伝子を遺
伝子変異について調べるために、ポリメラーゼ連鎖反応
法において使用できるプライマー配列を選択および合成
する上で基礎として用いられる。
は、腎臓および／または胆汁カチオン排出メカニズムに
おいてゲノムレベルで分子欠陥を診断するための分子試
験キットにおけるそれらの使用である。この性質の分子
試験キットにおいて、ＤＮＡ配列は特に好ましい態様で
ポリメラーゼ連鎖反応法を行うために使用できる。この
場合に、公知のＤＮＡ配列は、カチオン輸送体をコード
する各患者からの遺伝子を増幅させて、この遺伝子を遺
伝子変異について調べるために、ポリメラーゼ連鎖反応
法において使用できるプライマー配列を選択および合成
する上で基礎として用いられる。
【００１６】
【実施例】本発明は下記例を参照して更に詳細に説明さ
れるが、しかしながらそれは発明を制限するためではな
い。
れるが、しかしながらそれは発明を制限するためではな
い。
【００１７】例１ 輸送タンパク質をコードする遺伝子をクローニングする
ために、平滑末端化二本鎖ｃＤＮＡを、第一鎖を合成す
るためのＮｏｔＩオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてラ
ット腎臓ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから最初に調製した。ＳＰ
６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＥｃｏＲＩ
アダプターがｃＤＮＡに結合された後、後者をＮｏｔＩ
で切断し、得られた断片を大きさで分別し（１．５〜
２．３kb）、ベクターｐBluescript(stratagene)のＥｃ
ｏＲＩ制限部位に挿入した。次いで組換えベクターを大
腸菌株ＤＨ１０Ｂ中にエレクトロポレーションした。プ
ラスミドＤＮＡを形質転換株のプールから単離し、Ｎｏ
ｔＩで直鎖化し、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて
転写した。
ために、平滑末端化二本鎖ｃＤＮＡを、第一鎖を合成す
るためのＮｏｔＩオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてラ
ット腎臓ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから最初に調製した。ＳＰ
６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＥｃｏＲＩ
アダプターがｃＤＮＡに結合された後、後者をＮｏｔＩ
で切断し、得られた断片を大きさで分別し（１．５〜
２．３kb）、ベクターｐBluescript(stratagene)のＥｃ
ｏＲＩ制限部位に挿入した。次いで組換えベクターを大
腸菌株ＤＨ１０Ｂ中にエレクトロポレーションした。プ
ラスミドＤＮＡを形質転換株のプールから単離し、Ｎｏ
ｔＩで直鎖化し、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて
転写した。
【００１８】ｃＲＮＡをポリ（Ａ）＋選択により精製
し、卵母細胞当たり２０〜４０ngの濃度で注入した。卵
母細胞をインキュベートし、ＮＭＮ阻害性14Ｃ‐ＴＥＡ
取込みを測定した。標的化スクリーニング法を用いて、
腎臓カチオン輸送体をコードする遺伝子を含んだ単一ク
ローンを遺伝子ライブラリーから単離した。用いた方法
を最適化および部分的に修正した後にのみ、このクロー
ンを単離することができた。同定されたＤＮＡを配列決
定するために、ＯＣＴ１の重複制限断片をサブクローニ
ングし、双方の鎖で完全に配列決定した。
し、卵母細胞当たり２０〜４０ngの濃度で注入した。卵
母細胞をインキュベートし、ＮＭＮ阻害性14Ｃ‐ＴＥＡ
取込みを測定した。標的化スクリーニング法を用いて、
腎臓カチオン輸送体をコードする遺伝子を含んだ単一ク
ローンを遺伝子ライブラリーから単離した。用いた方法
を最適化および部分的に修正した後にのみ、このクロー
ンを単離することができた。同定されたＤＮＡを配列決
定するために、ＯＣＴ１の重複制限断片をサブクローニ
ングし、双方の鎖で完全に配列決定した。
【００１９】ラット腎臓遺伝子バンクから単離された、
鎖長１８８２塩基対のｃＤＮＡ断片からなるＯＣＴ１遺
伝子を、Xenopus laevis卵母細胞で発現させた。この目
的のため、卵母細胞を５mM Hepes-Tris 緩衝液、ｐＨ
７．５、１１０mMＮａＣｌ、３mMＫＣｌ、２mMＣａＣｌ
２、１mMＭｇＣｌ２（以下でＯＲｉと称される）中で３
日間、ＲＮＡ注入後にインキュベートした。輸送はＯＲ
ｉ（２２℃）に溶解された14Ｃ‐ＴＥＡ（テトラエチル
アンモニウム）と共に卵母細胞をインキュベートするこ
とにより測定した。更に、実験は異なる濃度のＮａ＋お
よびＫ＋を用いて、実験中Ｂａ++の存在はそのままで、
異なるｐＨ値および異なる阻害剤の存在下で行った。用
いられた14Ｃ‐ＴＥＡ濃度において、発現されたＯＣＴ
１タンパク質により生じる取込みは９０分間以上にわた
りＯＲｉ緩衝液で直線的であったため、取込み率は９０
分間のインキュベート後に決定した。測定を異なる濃度
のＮａ＋、Ｋ＋およびＨ＋で阻害剤の存在下において行
ったとき、卵母細胞は最初に適切な緩衝液条件下で３０
分間インキュベートし、取込み率を14Ｃ‐ＴＥＡと３０
分間のインキュベート中に決定した。14Ｃ‐ＴＥＡとイ
ンキュベート後、取込みを止め、卵母細胞を洗浄し、そ
れらが取り込んだ放射能の量について調べた。
鎖長１８８２塩基対のｃＤＮＡ断片からなるＯＣＴ１遺
伝子を、Xenopus laevis卵母細胞で発現させた。この目
的のため、卵母細胞を５mM Hepes-Tris 緩衝液、ｐＨ
７．５、１１０mMＮａＣｌ、３mMＫＣｌ、２mMＣａＣｌ
２、１mMＭｇＣｌ２（以下でＯＲｉと称される）中で３
日間、ＲＮＡ注入後にインキュベートした。輸送はＯＲ
ｉ（２２℃）に溶解された14Ｃ‐ＴＥＡ（テトラエチル
アンモニウム）と共に卵母細胞をインキュベートするこ
とにより測定した。更に、実験は異なる濃度のＮａ＋お
よびＫ＋を用いて、実験中Ｂａ++の存在はそのままで、
異なるｐＨ値および異なる阻害剤の存在下で行った。用
いられた14Ｃ‐ＴＥＡ濃度において、発現されたＯＣＴ
１タンパク質により生じる取込みは９０分間以上にわた
りＯＲｉ緩衝液で直線的であったため、取込み率は９０
分間のインキュベート後に決定した。測定を異なる濃度
のＮａ＋、Ｋ＋およびＨ＋で阻害剤の存在下において行
ったとき、卵母細胞は最初に適切な緩衝液条件下で３０
分間インキュベートし、取込み率を14Ｃ‐ＴＥＡと３０
分間のインキュベート中に決定した。14Ｃ‐ＴＥＡとイ
ンキュベート後、取込みを止め、卵母細胞を洗浄し、そ
れらが取り込んだ放射能の量について調べた。
【００２０】こうして、１８８２塩基対ｃＤＮＡ断片を
（前記のように）Xenopus laevis卵母細胞を用いて発現
させた。こうして発現されたＯＣＴ１タンパク質は、Ｎ
ＭＮ（Ｎ１‐メチルニコチンアミド）が阻害できる14Ｃ
‐テトラエチルアンモニウム（14Ｃ‐ＴＥＡ）の取込み
を誘導し、その取込みは卵母細胞に水を注入したコント
ロールで得られる値の２５０倍以上であった。結果は図
１にグラフ化されている。
（前記のように）Xenopus laevis卵母細胞を用いて発現
させた。こうして発現されたＯＣＴ１タンパク質は、Ｎ
ＭＮ（Ｎ１‐メチルニコチンアミド）が阻害できる14Ｃ
‐テトラエチルアンモニウム（14Ｃ‐ＴＥＡ）の取込み
を誘導し、その取込みは卵母細胞に水を注入したコント
ロールで得られる値の２５０倍以上であった。結果は図
１にグラフ化されている。
【００２１】クローン化ＯＣＴ１ ｃＤＮＡは、５５６
アミノ酸を有する膜タンパク質をコードするオープン読
取枠を含んでいる。アミノ酸配列は図７〜９に示されて
いる。それはデータバンクのタンパク質と類似性を示さ
ない。
アミノ酸を有する膜タンパク質をコードするオープン読
取枠を含んでいる。アミノ酸配列は図７〜９に示されて
いる。それはデータバンクのタンパク質と類似性を示さ
ない。
【００２２】14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの発現は、注入された
ＯＣＴ１ ｃＲＮＡの量に依存していた。これらの結果
は図２に示されている。発現された取込みのｃＲＮＡ依
存性はｎ＝約２であるHill式により記載することができ
る。
ＯＣＴ１ ｃＲＮＡの量に依存していた。これらの結果
は図２に示されている。発現された取込みのｃＲＮＡ依
存性はｎ＝約２であるHill式により記載することができ
る。
【００２３】ＯＣＴ１輸送タンパク質により示される14
Ｃ‐ＴＥＡ取込みの基質依存性は、Michaelis Menten式
に従った。これらの結果は図３に示されている。９５±
μＭの評価Ｋｍ値は、初期実験で決定されたラット近位
尿細管の基底外側膜からのカチオン輸送に関するＫｍ値
（１６０μＭ）と似ていた。それはラット近位尿細管の
刷子縁膜における多特異性Ｈ＋カチオン対向輸送体に関
する大体のＫｍ値の１／１４であった。
Ｃ‐ＴＥＡ取込みの基質依存性は、Michaelis Menten式
に従った。これらの結果は図３に示されている。９５±
μＭの評価Ｋｍ値は、初期実験で決定されたラット近位
尿細管の基底外側膜からのカチオン輸送に関するＫｍ値
（１６０μＭ）と似ていた。それはラット近位尿細管の
刷子縁膜における多特異性Ｈ＋カチオン対向輸送体に関
する大体のＫｍ値の１／１４であった。
【００２４】例２ 加えて、ＯＣＴ１輸送タンパク質が基底外側膜の電位依
存性多特異性カチオン輸送系または刷子縁膜の電位依存
性多特異性Ｈ＋カチオン対向輸送系を表すかどうかにつ
いて確定するために、ＯＣＴ１輸送タンパク質による取
込みが膜電位または膜全体のタンパク質勾配に依存して
いるかどうかを調べる試験を行った。発現される14Ｃ‐
ＴＥＡ取込みを阻害する異なる阻害剤の能力も研究し
た。
存性多特異性カチオン輸送系または刷子縁膜の電位依存
性多特異性Ｈ＋カチオン対向輸送系を表すかどうかにつ
いて確定するために、ＯＣＴ１輸送タンパク質による取
込みが膜電位または膜全体のタンパク質勾配に依存して
いるかどうかを調べる試験を行った。発現される14Ｃ‐
ＴＥＡ取込みを阻害する異なる阻害剤の能力も研究し
た。
【００２５】図４および５は、ＯＣＴ１輸送タンパク質
により媒介される14Ｃ‐ＴＥＡの取込みが膜電位に依存
しているが、ｐＨ単位で１の内部方向または外部方向タ
ンパク質勾配が適用されたときにさほど変わらないこと
を明らかにしている。したがって、ＯＣＴ１輸送タンパ
ク質は近位尿細管の基底外側膜全体で測定されたカチオ
ン輸送と同様の基本的特徴を有している。
により媒介される14Ｃ‐ＴＥＡの取込みが膜電位に依存
しているが、ｐＨ単位で１の内部方向または外部方向タ
ンパク質勾配が適用されたときにさほど変わらないこと
を明らかにしている。したがって、ＯＣＴ１輸送タンパ
ク質は近位尿細管の基底外側膜全体で測定されたカチオ
ン輸送と同様の基本的特徴を有している。
【００２６】図６および表１は、ＯＣＴ１による14Ｃ‐
ＴＥＡの取込みが異なる分子構造の有機カチオンにより
阻害されることを明らかにしている。これらの構造に
は、キニン、デシプラミン、プロカインアミドおよびＯ
‐メチルイソプレナリンのようないくつかの汎用薬物が
ある。評価Ｋｉ値は１‐エチル‐２‐〔（１，４‐ジメ
チル‐２‐フェニル‐６‐ピリミジニリデン）メチル〕
キノリニウムクロリド（シアニン８６３）の０．１３μ
Ｍとテトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）の１mMとの間
である。
ＴＥＡの取込みが異なる分子構造の有機カチオンにより
阻害されることを明らかにしている。これらの構造に
は、キニン、デシプラミン、プロカインアミドおよびＯ
‐メチルイソプレナリンのようないくつかの汎用薬物が
ある。評価Ｋｉ値は１‐エチル‐２‐〔（１，４‐ジメ
チル‐２‐フェニル‐６‐ピリミジニリデン）メチル〕
キノリニウムクロリド（シアニン８６３）の０．１３μ
Ｍとテトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）の１mMとの間
である。
【００２７】
【表１】
【００２８】表１は、ＯＣＴ１腎臓輸送タンパク質のｃ
ＲＮＡを注入したXenopus laevis卵母細胞における14Ｃ
‐ＴＥＡ取込みの感受性を示している。
ＲＮＡを注入したXenopus laevis卵母細胞における14Ｃ
‐ＴＥＡ取込みの感受性を示している。
【００２９】阻害実験を行うとき、Xenopus laevis卵母
細胞にＯＣＴ１ ｃＲＮＡ５ngを注入し、表１で示され
た阻害剤の５〜８つの異なる濃度の効果を卵母細胞中９
５μＭ取込みで測定した。その値も図６に示されてい
る。阻害曲線を非直線回帰分析により適合させ、Ｋｉ値
（±ＳＤ）を決定した。
細胞にＯＣＴ１ ｃＲＮＡ５ngを注入し、表１で示され
た阻害剤の５〜８つの異なる濃度の効果を卵母細胞中９
５μＭ取込みで測定した。その値も図６に示されてい
る。阻害曲線を非直線回帰分析により適合させ、Ｋｉ値
（±ＳＤ）を決定した。
【００３０】既知多特異性輸送タンパク質とは対照的
に、疎水性物質のみにより阻害されるいわゆる多剤輸送
体、新規ＯＣＴ１輸送タンパク質はＴＭＡおよびＮＭＮ
のような親水性化合物によっても阻害された。デシプラ
ミンは、神経細胞の原形質膜で神経ノルアドレナリン輸
送を阻害する場合よりも７００倍大きなＫｉ値で、ＯＣ
Ｔ１による輸送を阻害した。５μＭレセルピンはＯＣＴ
１誘導輸送に効果を有しないが、シナプス小胞の神経モ
ノアミン輸送タンパク質はナノモル濃度以下のレセルピ
ンで阻害される。
に、疎水性物質のみにより阻害されるいわゆる多剤輸送
体、新規ＯＣＴ１輸送タンパク質はＴＭＡおよびＮＭＮ
のような親水性化合物によっても阻害された。デシプラ
ミンは、神経細胞の原形質膜で神経ノルアドレナリン輸
送を阻害する場合よりも７００倍大きなＫｉ値で、ＯＣ
Ｔ１による輸送を阻害した。５μＭレセルピンはＯＣＴ
１誘導輸送に効果を有しないが、シナプス小胞の神経モ
ノアミン輸送タンパク質はナノモル濃度以下のレセルピ
ンで阻害される。
【００３１】例３ ＯＣＴ１輸送タンパク質は、膜小胞および培養腎臓上皮
細胞を用いた測定から既に得られた機能データとＯＣＴ
１ Ｋｉ値を比較することにより、基底外側カチオン系
輸送タンパク質と同一であることを確認することができ
た。このような比較をする上では、カチオン輸送におけ
る種依存性差異と、カチオン輸送の阻害を測定するため
の異なる方法の方法論的制限に関する考慮が払われねば
ならない。以前の研究において、ラット腎臓におけるカ
チオン輸送は短いインキュベート時間（４秒間）を用い
て行われねばならないミクロ灌流実験により調べた。高
親和性阻害剤に関する拡散非依存性Ｋｉ値を調べるため
にこの方法を用いることはできないため、我々は低親和
性阻害剤を比較することに制限した。低親和性阻害剤Ｔ
ＭＡおよびＮＭＮの比較において、我々はＯＣＴ１発現
輸送タンパク質のＫｉ値（約１mM）がラット近位尿細管
中へのＴＥＡの基底外側取込みに関して測定されたＫｉ
値（ＴＭＡ１．４mMおよびＮＭＮ０．５４mM）に相当す
ることを発見した。それらはＴＥＡの管腔取込みに関し
て測定されたＫｉ値（ＴＭＡ７０mMおよびＮＭＮ８．３
mM）と明らかに異なる。
細胞を用いた測定から既に得られた機能データとＯＣＴ
１ Ｋｉ値を比較することにより、基底外側カチオン系
輸送タンパク質と同一であることを確認することができ
た。このような比較をする上では、カチオン輸送におけ
る種依存性差異と、カチオン輸送の阻害を測定するため
の異なる方法の方法論的制限に関する考慮が払われねば
ならない。以前の研究において、ラット腎臓におけるカ
チオン輸送は短いインキュベート時間（４秒間）を用い
て行われねばならないミクロ灌流実験により調べた。高
親和性阻害剤に関する拡散非依存性Ｋｉ値を調べるため
にこの方法を用いることはできないため、我々は低親和
性阻害剤を比較することに制限した。低親和性阻害剤Ｔ
ＭＡおよびＮＭＮの比較において、我々はＯＣＴ１発現
輸送タンパク質のＫｉ値（約１mM）がラット近位尿細管
中へのＴＥＡの基底外側取込みに関して測定されたＫｉ
値（ＴＭＡ１．４mMおよびＮＭＮ０．５４mM）に相当す
ることを発見した。それらはＴＥＡの管腔取込みに関し
て測定されたＫｉ値（ＴＭＡ７０mMおよびＮＭＮ８．３
mM）と明らかに異なる。
【００３２】例４ ＯＣＴ１の基底外側存在に関する追加的支持は、１，
１′‐ジエチル‐２，２′‐シアニンヨージド（デシニ
ウム２２）によるＯＣＴ１誘導性取込みの阻害に関して
得られたＫｉ値（０．４μＭ）により与えられた。ＬＬ
Ｃ‐ＰＫ１細胞において、５．６nMのＫｉ値が管腔膜を
通るＴＥＡの輸送に関して測定され、一方基底外側膜を
通るＴＥＡの輸送に関するＫｉ値は＞０．１μＭである
と評価された。ＯＣＴ１輸送タンパク質を更に特徴付け
るために、ＴＥＡよりも約１０倍多い親和性を有するＭ
ＰＰも同様にＯＣＴ１により輸送されるかどうかについ
て調べる試験を行った。卵母細胞中へのＯＣＴ１ ｃＲ
ＮＡ８ngの注入後、３Ｈ‐ＭＰＰの特異的取込みが発現
されたが、これはキニンで阻害された。14Ｃ‐ＴＥＡ
（１４８±４pmol×卵母細胞-1×ｈ-1）および３Ｈ‐Ｍ
ＰＰ（９７±５pmol×卵母細胞-1×ｈ-1）の発現取込み
に関する同様のＶmax 値も卵母細胞のサンプルで調べ
た。肝臓細胞中における多特異性カチオン輸送体の存在
が報告されている。培養肝細胞中へのＭＰＰの取込みが
最近測定された。この関係において、ＯＣＴ１により発
現されるカチオン輸送を阻害する同様の阻害剤を用いて
ＭＰＰ取込みの約９０％を阻害できることがわかった。
肝細胞でＭＰＰ取込みについて調べられたＫｉ値（Ｏ‐
メチルイソプレナリン７８μＭ、ＭＰＰ１３μＭ、キニ
ン０．８μＭ、デシニウム２３ ０．２３μＭおよびシ
アニン８６３ ０．１０μＭ）は、Xenopus 卵母細胞に
より発現されたＯＣＴ１タンパク質によるＴＥＡの取込
みについて得られた値と事実上同一であった。これらの
データは、ＯＣＴ１輸送タンパク質または高度に相同的
な輸送タンパク質が肝細胞の原形質膜に存在することを
示唆している。
１′‐ジエチル‐２，２′‐シアニンヨージド（デシニ
ウム２２）によるＯＣＴ１誘導性取込みの阻害に関して
得られたＫｉ値（０．４μＭ）により与えられた。ＬＬ
Ｃ‐ＰＫ１細胞において、５．６nMのＫｉ値が管腔膜を
通るＴＥＡの輸送に関して測定され、一方基底外側膜を
通るＴＥＡの輸送に関するＫｉ値は＞０．１μＭである
と評価された。ＯＣＴ１輸送タンパク質を更に特徴付け
るために、ＴＥＡよりも約１０倍多い親和性を有するＭ
ＰＰも同様にＯＣＴ１により輸送されるかどうかについ
て調べる試験を行った。卵母細胞中へのＯＣＴ１ ｃＲ
ＮＡ８ngの注入後、３Ｈ‐ＭＰＰの特異的取込みが発現
されたが、これはキニンで阻害された。14Ｃ‐ＴＥＡ
（１４８±４pmol×卵母細胞-1×ｈ-1）および３Ｈ‐Ｍ
ＰＰ（９７±５pmol×卵母細胞-1×ｈ-1）の発現取込み
に関する同様のＶmax 値も卵母細胞のサンプルで調べ
た。肝臓細胞中における多特異性カチオン輸送体の存在
が報告されている。培養肝細胞中へのＭＰＰの取込みが
最近測定された。この関係において、ＯＣＴ１により発
現されるカチオン輸送を阻害する同様の阻害剤を用いて
ＭＰＰ取込みの約９０％を阻害できることがわかった。
肝細胞でＭＰＰ取込みについて調べられたＫｉ値（Ｏ‐
メチルイソプレナリン７８μＭ、ＭＰＰ１３μＭ、キニ
ン０．８μＭ、デシニウム２３ ０．２３μＭおよびシ
アニン８６３ ０．１０μＭ）は、Xenopus 卵母細胞に
より発現されたＯＣＴ１タンパク質によるＴＥＡの取込
みについて得られた値と事実上同一であった。これらの
データは、ＯＣＴ１輸送タンパク質または高度に相同的
な輸送タンパク質が肝細胞の原形質膜に存在することを
示唆している。
【００３３】例５ ＯＣＴ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図７
〜９に示されている。Kozak タイプ（ＡＣＧＣＣＡＴ
Ｇ）の停止コドンおよび翻訳開始部位はオープン読取枠
の上流にみられる。
〜９に示されている。Kozak タイプ（ＡＣＧＣＣＡＴ
Ｇ）の停止コドンおよび翻訳開始部位はオープン読取枠
の上流にみられる。
【００３４】ＯＣＴ１の親水性／疎水性の分析から、膜
をおそらく横断している１１の疎水性α‐ヘリックス領
域を確認した。疎水性／親水性インデックスは図１６に
示されている。推定膜貫通領域は長さ１７〜２７アミノ
酸である。それらは１つの長い、２つの中間長さおよび
７つの短い親水性領域で互いに結合されている。３つの
潜在的Ｎ‐グリコシル化部位が最初の２つの膜横断タン
パク質領域間にある親水性領域で予想されたため、図１
７に示されたＯＣＴ１の向きが提案された。第一の親水
性領域は１４の負荷電アミノ酸を含んでおり、ＯＣＴ１
のカチオンの結合にとり重要である。
をおそらく横断している１１の疎水性α‐ヘリックス領
域を確認した。疎水性／親水性インデックスは図１６に
示されている。推定膜貫通領域は長さ１７〜２７アミノ
酸である。それらは１つの長い、２つの中間長さおよび
７つの短い親水性領域で互いに結合されている。３つの
潜在的Ｎ‐グリコシル化部位が最初の２つの膜横断タン
パク質領域間にある親水性領域で予想されたため、図１
７に示されたＯＣＴ１の向きが提案された。第一の親水
性領域は１４の負荷電アミノ酸を含んでおり、ＯＣＴ１
のカチオンの結合にとり重要である。
【００３５】例６ 様々なラット組織および一部の細胞系を、いわゆるノー
ザンブロットを用いて、ＯＣＴ１輸送タンパク質特異性
ｍＲＮＡの局在性について分析した。この目的のため、
全ＲＮＡをグアニジニウム／フェノール／クロロホルム
法により単離し、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）‐セルロー
スクロマトグラフィーにより精製した。ｍＲＮＡをホル
ムアルデヒドアガロースゲル電気泳動により分別し、Hy
bond‐Ｎ膜(Amersham)に移し、その後ハイブリッド形成
させた。このために、ラット細胞および細胞系２９３か
らのｍＲＮＡ５μｇと細胞系Ｃａｋｉ‐１およびＬＬＣ
‐ＰＫＩ１からのｍＲＮＡ１．５μｇをホルムアルデヒ
ドアガロースゲル上にのせた。ハイブリッド形成はプラ
スミドｐＯＣＴ１からの新たなＤＮＡ配列の32Ｐ‐標識
ｃＤＮＡ断片を用いて行った（ヌクレオチド２８５〜１
１９６を用いた）。ハイブリッド形成はハイブリッド用
溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhar
dt's溶液、０．５％ＳＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ２０μ
ｇ）中４２℃で１８時間行った。膜を６０℃で０．２５
×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳの最終厳密さまで数工程で
洗浄した。細胞系ＬＬＣ‐ＰＫ１に関する結果を示すた
めに、フィルムを２４時間暴露し、フィルムを他のトラ
ックについて６時間暴露した。ＲＮＡ標準（GIBCO/BRL
から０．１４〜９．５キロ塩基範囲）を用いて、ＲＮＡ
断片のサイズを調べた。そのサイズは図１８に示されて
いる。
ザンブロットを用いて、ＯＣＴ１輸送タンパク質特異性
ｍＲＮＡの局在性について分析した。この目的のため、
全ＲＮＡをグアニジニウム／フェノール／クロロホルム
法により単離し、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）‐セルロー
スクロマトグラフィーにより精製した。ｍＲＮＡをホル
ムアルデヒドアガロースゲル電気泳動により分別し、Hy
bond‐Ｎ膜(Amersham)に移し、その後ハイブリッド形成
させた。このために、ラット細胞および細胞系２９３か
らのｍＲＮＡ５μｇと細胞系Ｃａｋｉ‐１およびＬＬＣ
‐ＰＫＩ１からのｍＲＮＡ１．５μｇをホルムアルデヒ
ドアガロースゲル上にのせた。ハイブリッド形成はプラ
スミドｐＯＣＴ１からの新たなＤＮＡ配列の32Ｐ‐標識
ｃＤＮＡ断片を用いて行った（ヌクレオチド２８５〜１
１９６を用いた）。ハイブリッド形成はハイブリッド用
溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhar
dt's溶液、０．５％ＳＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ２０μ
ｇ）中４２℃で１８時間行った。膜を６０℃で０．２５
×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳの最終厳密さまで数工程で
洗浄した。細胞系ＬＬＣ‐ＰＫ１に関する結果を示すた
めに、フィルムを２４時間暴露し、フィルムを他のトラ
ックについて６時間暴露した。ＲＮＡ標準（GIBCO/BRL
から０．１４〜９．５キロ塩基範囲）を用いて、ＲＮＡ
断片のサイズを調べた。そのサイズは図１８に示されて
いる。
【００３６】ノーザンブロット分析から得られたオート
ラジオグラフは図１８に示されている。１．９キロ塩基
の明確なバントと３．４および４．８キロ塩基の追加バ
ントが腎皮質、腎髄質、肝臓および腸の場合で観察され
た。細胞系ＬＬＣ‐ＰＫ１において、ハイブリッド形成
は３．４キロ塩基領域のみで観察された。逆に、ＯＣＴ
１シグナルは腎乳頭、骨格筋、心筋、脳またはヒト胚芽
腎細胞系２９３とＣａｋｉ‐１細胞で観察された。心臓
およびＣａｋｉ‐１細胞は管腔腎臓膜のＨ＋カチオン対
向輸送タンパク質とおそらく同一である神経外ノルアド
レナリン輸送タンパク質を含んでいるため、近位尿細管
の基底外側および管腔膜にあるカチオン輸送タンパク質
は異なる遺伝子ファミリーに属するらしい。その場のハ
イブリッド形成では、ＯＣＴ１輸送タンパク質が近位尿
細管、肝臓の上皮細胞および小腸の腸細胞で発現される
ことを示した。
ラジオグラフは図１８に示されている。１．９キロ塩基
の明確なバントと３．４および４．８キロ塩基の追加バ
ントが腎皮質、腎髄質、肝臓および腸の場合で観察され
た。細胞系ＬＬＣ‐ＰＫ１において、ハイブリッド形成
は３．４キロ塩基領域のみで観察された。逆に、ＯＣＴ
１シグナルは腎乳頭、骨格筋、心筋、脳またはヒト胚芽
腎細胞系２９３とＣａｋｉ‐１細胞で観察された。心臓
およびＣａｋｉ‐１細胞は管腔腎臓膜のＨ＋カチオン対
向輸送タンパク質とおそらく同一である神経外ノルアド
レナリン輸送タンパク質を含んでいるため、近位尿細管
の基底外側および管腔膜にあるカチオン輸送タンパク質
は異なる遺伝子ファミリーに属するらしい。その場のハ
イブリッド形成では、ＯＣＴ１輸送タンパク質が近位尿
細管、肝臓の上皮細胞および小腸の腸細胞で発現される
ことを示した。
【００３７】上記例は、腎臓および肝臓からカチオン系
薬物を除去する上で重要な役割を果たす新規で独特なタ
ンパク質がクローニングされたことを証明している。こ
のタンパク質はおそらく腸からのカチオン系化合物の吸
収にも関与している。カチオン輸送および薬物の排出は
３０年以上も研究されてきたが、過去の進歩はわずかで
あった。これに関する理由は、肝臓および腎臓からの薬
物の排出が上皮細胞の基底外側および管腔原形質膜を通
る輸送を含み、これらの輸送プロセスが機能的に異なる
カチオン輸送タンパク質により起こるためである。これ
に加えて、同様の基質特異性を有する異なるカチオン輸
送タンパク質が管腔および基底外側腎臓膜双方に存在す
る可能性が排除しえないからである。カチオン輸送タン
パク質の１つのタイプが新規ＯＣＴ１輸送タンパク質を
クローニングした結果として確認された。これはカチオ
ン系薬物の排出に関する以後の研究のために多くの選択
肢を与えるものである。
薬物を除去する上で重要な役割を果たす新規で独特なタ
ンパク質がクローニングされたことを証明している。こ
のタンパク質はおそらく腸からのカチオン系化合物の吸
収にも関与している。カチオン輸送および薬物の排出は
３０年以上も研究されてきたが、過去の進歩はわずかで
あった。これに関する理由は、肝臓および腎臓からの薬
物の排出が上皮細胞の基底外側および管腔原形質膜を通
る輸送を含み、これらの輸送プロセスが機能的に異なる
カチオン輸送タンパク質により起こるためである。これ
に加えて、同様の基質特異性を有する異なるカチオン輸
送タンパク質が管腔および基底外側腎臓膜双方に存在す
る可能性が排除しえないからである。カチオン輸送タン
パク質の１つのタイプが新規ＯＣＴ１輸送タンパク質を
クローニングした結果として確認された。これはカチオ
ン系薬物の排出に関する以後の研究のために多くの選択
肢を与えるものである。
【００３８】例７ 本出願に記載された技術を用いて、ＯＣＴ１と相同的な
２つのヒト遺伝子をクローニングして、それらを完全に
または部分的に配列決定できることが各々わかった。完
全に配列決定された遺伝子（ＨＯＣＴ１）は１８８５塩
基からなり、５５３アミノ酸のタンパク質をコードして
いる。それは図１０〜１２に示されている。ＣＴ１およ
びＨＯＣＴ１のアミノ酸間には７８％の同一率がある。
第二のヒト遺伝子（ＨＯＣＴ２）は１８９６塩基からな
り、５５５アミノ酸のタンパク質をコードしている。Ｏ
ＣＴ２のヌクレオチド配列および演繹されたアミノ酸配
列は図１３〜１５に示されている。ＯＣＴ１およびＨＯ
ＣＴ２のアミノ酸間には６８％の同一率がある。
２つのヒト遺伝子をクローニングして、それらを完全に
または部分的に配列決定できることが各々わかった。完
全に配列決定された遺伝子（ＨＯＣＴ１）は１８８５塩
基からなり、５５３アミノ酸のタンパク質をコードして
いる。それは図１０〜１２に示されている。ＣＴ１およ
びＨＯＣＴ１のアミノ酸間には７８％の同一率がある。
第二のヒト遺伝子（ＨＯＣＴ２）は１８９６塩基からな
り、５５５アミノ酸のタンパク質をコードしている。Ｏ
ＣＴ２のヌクレオチド配列および演繹されたアミノ酸配
列は図１３〜１５に示されている。ＯＣＴ１およびＨＯ
ＣＴ２のアミノ酸間には６８％の同一率がある。
【図１】図１〜６はXenopus laevis卵母細胞におけるＯ
ＣＴ１の発現について示している。示された14Ｃ‐ＴＥ
Ａ取込み率は１０〜２０回測定の平均値±標準偏差を表
す。図１は水、ラット腎臓ｍＲＮＡ２０ngまたはＯＣＴ
１ ｃＲＮＡ１０ng注入後に観察された14Ｃ‐ＴＥＡの
ＮＭＮ阻害取込みの比較について示している。インキュ
ベート培地中14Ｃ‐ＴＥＡおよびＮＭＮの濃度は、各々
２００μＭおよび１０mMであった。
ＣＴ１の発現について示している。示された14Ｃ‐ＴＥ
Ａ取込み率は１０〜２０回測定の平均値±標準偏差を表
す。図１は水、ラット腎臓ｍＲＮＡ２０ngまたはＯＣＴ
１ ｃＲＮＡ１０ng注入後に観察された14Ｃ‐ＴＥＡの
ＮＭＮ阻害取込みの比較について示している。インキュ
ベート培地中14Ｃ‐ＴＥＡおよびＮＭＮの濃度は、各々
２００μＭおよび１０mMであった。
【図２】異なる量のＯＣＴ１ ｃＲＮＡ注入後２００μ
Ｍ14Ｃ‐ＴＥＡの取込み率について示している。曲線は
得られたデータにHill式を適合させた後コンピューター
計算した（ｎ＝１．９±０．２）。
Ｍ14Ｃ‐ＴＥＡの取込み率について示している。曲線は
得られたデータにHill式を適合させた後コンピューター
計算した（ｎ＝１．９±０．２）。
【図３】卵母細胞当たりＯＣＴ１ ｃＲＮＡ３ngの注入
後に発現された14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの基質依存性につい
て示している。連続線は水を注入したコントロール卵母
細胞で測定された飽和性成分および直線的成分を含む全
取込みについて示している。直線的成分は直線的回帰に
より適合させた（点線、３０fmol×ｈ-1×卵母細胞-1×
μＭ-1）。飽和性成分はMichaelis Menten式を用いて適
合させた（Ｋｍ９５±１０μＭ、Ｖmax ８１±５pmol×
ｈ-1×卵母細胞-1）。実線は双方の成分を含んだ式に合
わせることでコンピューター計算した。
後に発現された14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの基質依存性につい
て示している。連続線は水を注入したコントロール卵母
細胞で測定された飽和性成分および直線的成分を含む全
取込みについて示している。直線的成分は直線的回帰に
より適合させた（点線、３０fmol×ｈ-1×卵母細胞-1×
μＭ-1）。飽和性成分はMichaelis Menten式を用いて適
合させた（Ｋｍ９５±１０μＭ、Ｖmax ８１±５pmol×
ｈ-1×卵母細胞-1）。実線は双方の成分を含んだ式に合
わせることでコンピューター計算した。
【図４】ＯＣＴ１ ｃＲＮＡ３ngを注入した卵母細胞に
おける14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの電位依存性について示して
いる。９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡの取込みを所定濃度のＮａ
＋、Ｋ＋およびＢａ++の存在下で測定した。これらの条
件下において、膜電位は−４０〜−６０mV（１００mMＮ
ａ＋および３mMＫ＋）、０〜−１０mV（１mMＮａ＋およ
び１０２mMＫ＋）および−１８〜−２２mV（１００mMＮ
ａ＋、３mMＫ＋および１０mMＢａ++）であった。
おける14Ｃ‐ＴＥＡ取込みの電位依存性について示して
いる。９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡの取込みを所定濃度のＮａ
＋、Ｋ＋およびＢａ++の存在下で測定した。これらの条
件下において、膜電位は−４０〜−６０mV（１００mMＮ
ａ＋および３mMＫ＋）、０〜−１０mV（１mMＮａ＋およ
び１０２mMＫ＋）および−１８〜−２２mV（１００mMＮ
ａ＋、３mMＫ＋および１０mMＢａ++）であった。
【図５】ＯＣＴ１ ｃＲＮＡ３ngを注入した卵母細胞中
プロトン勾配の存在および不在下における９５μＭ14Ｃ
‐ＴＥＡの取込みについて示している。14Ｃ‐ＴＥＡの
取込みを変える膜電位のプロトン勾配誘導性変化を妨げ
るために、測定をインキュベート培地中１０２mMＫ＋お
よび１mMＮａ＋の存在下で行った。これにより、膜電位
は約０mVになった。微小電極を用いたｐＨ測定では、ｐ
Ｈが３０分の取込み時間中０．１単位以下で変化するこ
とを示した。
プロトン勾配の存在および不在下における９５μＭ14Ｃ
‐ＴＥＡの取込みについて示している。14Ｃ‐ＴＥＡの
取込みを変える膜電位のプロトン勾配誘導性変化を妨げ
るために、測定をインキュベート培地中１０２mMＫ＋お
よび１mMＮａ＋の存在下で行った。これにより、膜電位
は約０mVになった。微小電極を用いたｐＨ測定では、ｐ
Ｈが３０分の取込み時間中０．１単位以下で変化するこ
とを示した。
【図６】デシニウム２２（ｏ）、キニン（△）、デシプ
ラミン（□）、プロカインアミド（黒丸）、Ｏ‐メチル
イソプレナリン（◇）およびテトラメチルアンモニウム
（黒ひし形）によるＯＣＴ１誘導性14Ｃ‐ＴＥＡ取込み
の阻害について示している。卵母細胞にＯＣＴ１ ｃＲ
ＮＡ５ngを注入し、９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡを用いて測定
を行った。
ラミン（□）、プロカインアミド（黒丸）、Ｏ‐メチル
イソプレナリン（◇）およびテトラメチルアンモニウム
（黒ひし形）によるＯＣＴ１誘導性14Ｃ‐ＴＥＡ取込み
の阻害について示している。卵母細胞にＯＣＴ１ ｃＲ
ＮＡ５ngを注入し、９５μＭ14Ｃ‐ＴＥＡを用いて測定
を行った。
【図７】ＯＣＴ１のヌクレオチド配列とそれから演繹さ
れたアミノ酸配列について示している。推定貫膜領域に
は下線がひかれ、ＮＸＴ／Ｓタイプの潜在的Ｎ‐グリコ
シル化部位は星印で示されている。
れたアミノ酸配列について示している。推定貫膜領域に
は下線がひかれ、ＮＸＴ／Ｓタイプの潜在的Ｎ‐グリコ
シル化部位は星印で示されている。
【図８】図７の配列の続きである。
【図９】図８の配列の続きである。
【図１０】相同的ヒト腎臓遺伝子（ＨＯＣＴ１）のヌク
レオチドおよびアミノ酸配列について示している。示さ
れた遺伝子断片は１８８５塩基を含み、５５３アミノ酸
をコードする。
レオチドおよびアミノ酸配列について示している。示さ
れた遺伝子断片は１８８５塩基を含み、５５３アミノ酸
をコードする。
【図１１】図１０の配列の続きである。
【図１２】図１１の配列の続きである。
【図１３】第二の相同的ヒト腎臓遺伝子（ＨＯＣＴ２）
のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について示して
いる。示された遺伝子断片は１８５６塩基を含み、５５
５アミノ酸をコードする。
のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について示して
いる。示された遺伝子断片は１８５６塩基を含み、５５
５アミノ酸をコードする。
【図１４】図１３の配列の続きである。
【図１５】図１４の配列の続きである。
【図１６】９アミノ酸の窓を用いたＯＣＴ１のKyte/Doo
little疎水性／親水性分析について示している。推定貫
膜領域は番号１〜１１である。
little疎水性／親水性分析について示している。推定貫
膜領域は番号１〜１１である。
【図１７】ＯＣＴ１の概略を示している。アミノ酸残基
Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓはプラス記号で示し、アミ
ノ酸残基ＧｌｕおよびＡｓｐはマイナス記号で示してい
る。第一親水性ループにおける潜在的グリコシル化部位
が確認された。
Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓはプラス記号で示し、アミ
ノ酸残基ＧｌｕおよびＡｓｐはマイナス記号で示してい
る。第一親水性ループにおける潜在的グリコシル化部位
が確認された。
【図１８】様々なラット組織および一部の細胞系におけ
るＯＣＴ１特異性ｍＲＮＡの位置を示している。
るＯＣＴ１特異性ｍＲＮＡの位置を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (19)
- 【請求項１】血液から肝臓上皮細胞または腎臓上皮細胞
中にカチオン系生体異物および／または薬物を輸送する
か、あるいは腸からカチオン系生体異物および／または
薬物を輸送することに関与する輸送タンパク質であっ
て、 図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜１５に示され
たアミノ酸配列から選択される少くとも７つのアミノ酸
の構成配列を示す輸送タンパク質。 - 【請求項２】図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜
１５に示されたアミノ酸配列から選択される少くとも１
０のアミノ酸の構成配列を示す、請求項１に記載の輸送
タンパク質。 - 【請求項３】図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜
１５に示されたアミノ酸配列から選択される少くとも１
４のアミノ酸の構成配列を示す、請求項１に記載の輸送
タンパク質。 - 【請求項４】図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜
１５に示されたアミノ酸配列を示す、請求項１に記載の
輸送タンパク質。 - 【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載の輸送
タンパク質をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項６】図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜
１５に示されたＤＮＡ配列から少くとも２１の塩基の構
成配列を示す、請求項５に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項７】図７〜９、図１０〜１２、または図１３〜
１５に示されたＤＮＡ配列から少くとも３０の塩基の構
成配列を示す、請求項５に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項８】図７〜９、図１０〜１２または図１３〜１
５に示されたＤＮＡ配列から少くとも４２の塩基の構成
配列を示す、請求項５に記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項９】請求項１〜４のいずれか一項に記載の輸送
タンパク質を常に発現する上皮細胞系を調製するため
の、請求項５〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列の
使用。 - 【請求項１０】請求項１〜４のいずれか一項に記載の輸
送タンパク質を常に発現する上皮細胞系。 - 【請求項１１】予想されるカチオン系薬物および／また
は生体異物の腎臓および胆汁排出と腸吸収のインビトロ
試験に用いられる、請求項１０に記載の上皮細胞系。 - 【請求項１２】請求項１〜４のいずれか一項に記載の輸
送タンパク質と相同的な輸送タンパク質を単離するため
の、請求項５〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列の
使用。 - 【請求項１３】単離がポリメラーゼ連鎖反応法を用いて
行われる、請求項１２に記載の使用。 - 【請求項１４】腎臓および胆汁排出または腸吸収を変え
るために薬物のような生物活性化合物に結合できるカチ
オン系シグナル分子を開発するための、請求項１〜４の
いずれか一項に記載の輸送タンパク質および／または請
求項１０または１１に記載の上皮細胞系の使用。 - 【請求項１５】カチオン系薬物および／または生体異物
の腎毒性を減少させるために尿細管細胞中への薬物の取
込みを阻止する上で使用できる抗体を開発するための、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の輸送タンパク質お
よび／または請求項１０または１１に記載の上皮細胞系
の使用。 - 【請求項１６】カチオン系薬物の腎毒性を減少させるた
めに尿細管細胞中への他の薬物および／または生体異物
の取込みを阻止する上で使用できる特異的薬物を開発す
るための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の輸送タ
ンパク質および／または請求項１０または１１に記載の
上皮細胞系の使用。 - 【請求項１７】カチオン系薬物の腎毒性を減少させるた
めに尿細管細胞中への薬物および／または生体異物の取
込みを阻止する上で使用できるアンチセンスヌクレオチ
ド配列を開発するための、請求項５〜８のいずれか一項
に記載のＤＮＡ配列の使用。 - 【請求項１８】腎臓および胆汁カチオン排出メカニズム
において遺伝子レベルで分子欠陥を診断するための分子
試験キットのための、請求項５〜８のいずれか一項に記
載のＤＮＡ配列の使用。 - 【請求項１９】分子試験キットがポリメラーゼ連鎖反応
法を行う上で必要な要素を含んでなる、請求項１８に記
載の使用。
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| DE4424577.7 | 1994-07-13 | ||
| DE4424577A DE4424577A1 (de) | 1994-07-13 | 1994-07-13 | Transportprotein, das den Transport von kationischen Xenobiotika und/oder Pharmaka bewirkt, dafür kodierende DNA-Sequenzen und deren Verwendung |
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| JP3798447B2 JP3798447B2 (ja) | 2006-07-19 |
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-
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- 1995-07-07 PT PT95110631T patent/PT699753E/pt unknown
- 1995-07-07 DK DK95110631T patent/DK0699753T3/da active
- 1995-07-12 CA CA002153756A patent/CA2153756C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 US US08/501,572 patent/US6063623A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-13 JP JP17767195A patent/JP3798447B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
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