ES2199970T3 - Proteinas de transporte que determina el transporte de xenobioticos y/o farmacos cationicos, secuencias de adn que la codifican y su utilizacion. - Google Patents
Proteinas de transporte que determina el transporte de xenobioticos y/o farmacos cationicos, secuencias de adn que la codifican y su utilizacion.Info
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Abstract
SE SOMETE A CLONACION UNA PROTEINA DE TRANSPORTE, QUE TIENE LUGAR EN CELULAS EPITELIALES DEL HIGADO Y DEL RIÑON ASI COMO EN CELULAS DEL INTESTINO Y SON RESPONSABLES DEL TRANSPORTE DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS CATIONICOS Y/O PRODUCTOS DE XENOBIOTICA. ESTAS PROTEINAS DE TRANSPORTE SON DESCRITAS A TRAVES DE LA SECUENCIA DNA Y DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE FORMA APROXIMADA Y SE DA CONOCER SUS DISTINTAS UTILIZACIONES, QUE TIENEN SIGNIFICADO ESPECIALMENTE EN EL DESARROLLO DE NUEVOS MEDICAMENTOS DE GRAN SIGNIFICADO.
Description
Proteína de transporte que determina el
transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos, secuencias de
ADN que la codifican y su utilización.
En los animales mamíferos y en particular en los
seres humanos, ciertos fármacos y xenobióticos catiónicos con
diversa estructura molecular, catecolaminas y otros cationes
endógenos, son segregados en los riñones y en el hígado por
proteínas de transporte poliespecíficas, que están localizadas en
membranas plasmáticas luminares y basolaterales. Estas proteínas de
transporte se diferencian en el aspecto funcional con respecto de
las proteínas de transporte monoamínicas ya conocidas en membranas
plasmáticas neuronales y vesículas sinápticas y de las proteínas de
exportación dependientes de ATP para fármacos hidrófobos (proteínas
de transporte de "fármacos múltiples").
Dentro del marco del presente invento se aisló en
primer lugar una secuencia de ADN complementario procedente de
riñones de ratas, que codifica una proteína membranal con una
longitud de 556 aminoácidos, que se designa en lo sucesivo como
OCT1. Esta proteína de transporte actúa en la membrana basolateral
de los túbulos renales próximos (canalículos renales) y en
hepatocitos como transportadores de cationes para diferentes
moléculas dianas.
La proteína de transporte designada por OCT1 no
es homóloga con ninguna otra proteína conocida hasta ahora,
presenta una distribución hasta ahora única de aminoácidos
hidrófobos y cargados negativamente, y es encontrada exclusivamente
en los riñones, el hígado y los intestinos. La proteína de
transporte OCT1 transporta cationes con diversa estructura, es
inhibida por un gran número de sustancias catiónicas con diversa
hidrofobia y posee otras propiedades funcionales distintas de las de
una proteína de transporte poliespecífica ya conocida
("transportadora de fármacos múltiples"), que puede
transportar exclusivamente sustancias muy hidrófobas. La proteína de
transporte OCT1 es considerada como un nuevo prototipo de una
proteína de transporte poliespecífica en animales mamíferos.
Muchos cationes orgánicos, inclusive fármacos
utilizados con frecuencia, tales como agentes antihistamínicos,
antiarrítmicos, sedantes, opiatos, diuréticos, citostáticos, y
antibióticos, se segregan en la orina y en la bilis mediante
transporte activo por células epiteliales renales y hepatocitos. En
el caso de la secreción activa en los riñones, los cationes son
transportados por sistemas de transporte poliespecíficos en la
membrana plasmática basolateral y luminar de los túbulos renales
próximos. Ambos sistemas se diferencian en el aspecto funcional.
Las proteínas de transporte en la membrana basolateral, que pueden
transportar cationes diferentes estructuralmente tales como
tetraetil-amonio (TEA),
N^{1}-metil-nicotinamida (NMN) y
4-metil-4-fenil-piridinio
(MPP), son inhibidas por un gran número de cationes extracelulares
estructuralmente diferentes. Estas proteínas de transporte pueden
ser propulsadas por un potencial membranal negativo y situado en el
interior y por un transporte en sentido opuesto de substratos
intracelulares. En la membrana luminar se describieron dos sistemas
de transporte, que son propulsados por un gradiente de protones
dirigido hacia fuera, pero no son influidos por el potencial
membranal. Uno de estos sistemas de transporte tiene una amplia
especificidad para substratos, que es comparable con la del sistema
de transporte de cationes en la membrana basolateral de túbulos
renales próximos. Por causa de las similaridades funcionales, se
supone que este sistema de transporte poliespecífico de la membrana
luminar es idéntico al sistema de transporte extraneuronal para
noradrenalina en el corazón.
Son objeto del presente invento, por lo tanto,
proteínas de transporte, que son competentes para el transporte de
xenobióticos y/o fármacos catiónicos a partir de la sangre dentro
de las células epiteliales hepáticas o renales, o para el transporte
de xenobióticos o fármacos catiónicos desde los intestinos a la
circulación sanguínea.
Las proteínas de transporte conformes al invento
están caracterizadas porque presentan la secuencia de aminoácidos
que se representa en la Figura 2a_{1}, la Figura 2a_{2} o la
Figura 2a_{3}.
Son objeto del presente invento también
secuencias de ADN, que codifican una proteína de transporte
conforme al invento. Las secuencias de ADN conformes al invento
presentan la secuencia de nucleótidos que se muestra en las Figuras
2a_{1}, 2a_{2} o 2a_{3}.
Presentan una importancia especial las proteínas
de transporte y secuencias de ADN conformes al invento en la
investigación medicinal y farmacológica. Con ayuda de las
secuencias de ADN conformes al invento es posible, por ejemplo,
producir linajes de células epiteliales, que expresan
permanentemente una proteína de transporte conforme al invento.
Para ello, con métodos de tecnología genética en sí conocidos, se
incorpora en un vector apropiado la secuencia de ADN que codifica la
proteína de transporte, con la que se transforma un apropiado
linaje de células epiteliales, que no expresaba hasta ahora la
proteína de transporte. Con ello, se pueden obtener linajes de
células que expresan constantemente una proteína de transporte
conforme al invento.
Tales linajes de células epiteliales, que
expresan las proteínas de transporte, se pueden emplear in
vitro para ensayar la segregación renal y biliar que es de
esperar, así como la resorción intestinal de fármacos y/o
xenobióticos catiónicos. Con ayuda de tales linajes de células se
puede comprobar por consiguiente ya in vitro, es decir sin
costosos experimentos en animales, si y, en caso afirmativo, en qué
grado, se segregan fármacos o también otras sustancias activas con
actividad biológica o se resorben desde los intestinos a la
circulación sanguínea.
Con ayuda de las secuencias de ADN conformes al
invento se pueden aislar las proteínas de transporte, que son
homólogas con respecto a las proteínas de transporte conformes al
invento. Por lo tanto, es posible aislar, a partir de todas las
especies de mamíferos y a partir de los seres humanos, las
correspondientes proteínas de transporte, que son homólogas con las
proteínas de transporte divulgadas conformes al invento. Dos
correspondientes secuencias humanas fueron ya captadas y
determinadas. Una posibilidad de cómo se puede efectuar un
aislamiento de este tipo, es la reacción en cadena de polimerasa
que entretanto se ha hecho conocida universalmente. Por lo tanto, se
deben escoger a partir de la secuencia mostrada en las figuras
2a_{1}, 2a_{2} o 2a_{3}, solamente apropiadas secuencias de
ADN, que pueden servir como cebadoras para la reacción en cadena de
polimerasa. Con ayuda de estos cebadores, puede efectuarse sin
dificultades el aislamiento de proteínas de transporte
homólogas.
Una posibilidad adicional de utilización de las
proteínas de transporte conformes al invento y/o de los linajes de
células epiteliales conformes al invento, es el desarrollo de
moléculas señalizadoras catiónicas, que pueden ser unidas a
compuestos biológicamente activos, tales como fármacos, con el fin
de modificar su segregación renal y biliar o su resorción
intestinal. Con ello, es posible comprobar diferentes estructuras
para determinar si favorecen una segregación de la molécula unida
con ellas, a través de los riñones o del hígado, y si fomentan una
resorción desde los intestinos a la circulación sanguínea o si
producen el respectiva fenómeno opuesto.
En particular, las proteínas de transporte
conformes al invento sirven también para el desarrollo de
anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, con cuya ayuda
se puede bloquear la recogida de fármacos en células de túbulos
renales, con el fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos
catiónicos.
Además, en virtud de la divulgación conforme al
invento se puede efectuar el desarrollo de fármacos específicos,
que influyen sobre la segregación de otros determinados fármacos
y/o xenobióticos catiónicos. Con ello, es posible desarrollar
sustancias farmacológicamente activas, que influyen sobre la
recogida de otras sustancias activas. Tal influencia puede
consistir ya sea en que se fomenta o se impide la recogida de una
sustancia activa a partir de los intestinos o que se fomenta o
impide la segregación de una sustancia activa en los riñones y en
el hígado.
Una utilización preferida adicional de las
secuencias de ADN conformes al invento es el desarrollo de
secuencias de nucleótidos antisentido. En este caso, se pueden
desarrollar secuencias de nucleótidos, que impiden la transcripción
y/o la traducción de los correspondientes genes mediante el hecho
de que se fijan a las correspondientes secuencias complementarias
de nucleótidos, que se presentan por naturaleza.
Una utilización preferida adicional de las
secuencias de ADN conformes al invento es su utilización en
estuches de ensayo moleculares para el diagnóstico de defectos
moleculares genómicos en mecanismos renales y/o biliares de
segregación de cationes. En tales estuches de ensayo moleculares,
las secuencias de ADN se pueden utilizar en una forma especialmente
preferida de ejecución para la realización de la reacción en cadena
de polimerasa. En tal caso, con ayuda de la secuencia conocida de
ADN, se seleccionan y sintetizan secuencias de cebadores, con cuya
ayuda, en la reacción en cadena de polimerasa, se puede amplificar
el gen que codifica el transportador de cationes del respectivo
paciente, y se puede investigar en lo que se refiere a las
mutaciones genéticas.
Con ayuda de los siguientes Ejemplos, que sin
embargo no deben limitar al invento, se explica con mayor detalle
la esencia del presente invento.
Para la clonación de los genes que codifican la
proteína de transporte, se prepararon en primer lugar ADN_{c}
(ácidos desoxirribonucleicos complementarios) bicatenarios con
extremos lisos de ARN (ácidos ribonucleicos)
poli(A)^{+} (positivos para poli(A)) a
partir de riñones de rata, utilizándose un cebador con
NotI-oligo(dT) para la síntesis de la
primera cadena. Después de que se hubieron colocado junto a los ADNc
adaptadores para EcoRI, que contienen un promotor de polimerasa de
ARN SP6, se digirió con NotI, se separó en cuanto al tamaño (1,5 a
2,3 kb) y se incorporó en las partes de corte por restricción con
EcoRI del vector pBluescript (de Stratagene) y a continuación se
electroporó en la cepa DH10B de E. coli. A partir de agrupaciones
de transformantes se aísló el ADN de plásmido, se linealizó con NotI
y se transcribió con ayuda de la polimerasa de ARN SP6. El ARNc
(complementario) se purificó por selección frente a
poli(A)^{+} y se inyectó en una concentración de 20
a 40 ng por oocito. Los oocitos se incubaron y se midió la recogida
de ^{14}C-TEA que se podía inhibir mediante NMN.
Mediante un procedimiento de búsqueda planificada se aisló a partir
de la biblioteca genética (genoteca) un clon individual, que
contenía el gen que codificaba un transportador de cationes a partir
de los riñones. El aislamiento de este clon era posible solamente
después de una optimización y de una modificación parcial de los
métodos aplicados. Para la secuenciación de los ADN identificados,
se subclonaron fragmentos de restricción solapados de OCT1 y se
secuenciaron totalmente en las dos cadenas.
El gen de OCT1, aíslado a partir de un banco de
genes de riñones de ratas, que constaba de un fragmento de ADNc con
una longitud de 1.882 pares de bases, se expresó en oocitos de
Xenopus laevis. En este caso, los oocitos, después de una inyección
del ARN, se incubaron durante tres días con 5 mM de un tampón
Hepes-Tris, de pH 7,5, 110 mM de NaCl, 3 mM de KCl,
2 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2} (designado en lo sucesivo
como ORi). El transporte se midió por incubación de los oocitos con
^{14}C-TEA (tetraetilamonio) que se había
disuelto en ORi (22ºC). Además, se llevaron a cabo experimentos con
diferentes concentraciones de Na^{+} y K^{+} así como
experimentos en la presencia de Ba^{++}, a diferentes valores del
pH y en presencia de distintos inhibidores. Puesto que con las
concentraciones utilizadas de ^{14}C-TEA era
lineal durante mas de 90 minutos la recogida en el tampón ORi
provocada por la proteína OCT1 expresada, se determinaron los
regímenes de recogida después de incubación durante 90 minutos. Para
las mediciones con concentraciones modificadas de Na^{+}, K^{+},
H^{+} y en presencia de inhibidores, los oocitos se incubaron
primeramente durante 30 minutos en las correspondientes condiciones
de tamponamiento y los regímenes de recogida se determinaron durante
un período de incubación de 30 minutos con
^{14}C-TEA. Después de la incubación con
^{14}C-TEA, se interrumpió la recogida y los
oocitos se lavaron y se investigaron en lo que referente a la
radiactividad recogida.
Por lo tanto, el fragmento de ADNc con una
longitud de 1.882 pares de bases se expresó mediando utilización de
oocitos de Xenopus laevis (tal como antes se ha descrito); la
proteína OCT1, expresada de esta manera, inducía una recogida de
^{14}C- tetraetil-amonio
^{14}C-TEA), que podía ser inhibida por NMN
(N^{1}-metil-nicotinamida),
estando situada la recogida en un múltiplo de más de 250 veces por
encima de los valores de testigos a los que se inyectaba agua en
los oocitos. Los resultados se representan gráficamente en la
Figura 1a.
El ADNc de OCT1 clonado contiene un cuadro de
lectura abierto, que codifica una proteína membranal con 556
aminoácidos. La secuencia de aminoácidos se representa en la Figura
2a_{1}. Ésta no muestra ninguna similaridad con las proteínas
existentes en bancos de datos.
La expresión de la recogida de
^{14}C-TEA era dependiente de la cantidad del
ARNc de OCT1 inyectado. Estos resultados se representan en la Figura
1b. La dependencia con respecto al ARNc de la recogida expresada se
pudo describir por una ecuación de Hill con n = aproximadamente
2.
La dependencia con respecto de los substratos de
la recogida de ^{14}C-TEA producida por la
proteína de transporte OCT1 siguió la ecuación de Michaelis Menten.
Estos resultados se representan en la Figura 1c. El valor estimado
de K_{m} de 95\pm\muM se asemejaba al valor de K_{m} (160
\muM), que había sido determinado en experimentos anteriores para
el transporte de cationes a través de la membrana basolateral de
túbulos renales próximos de ratas. Éste era 14 veces menor que el
valor aparente de K_{m} para el transportador en sentido opuesto,
poliespecífico para cationes H^{+} en la membrana de costura
pilosa o en cepillo (del alemán Bürstensaummembran) de
túbulos renales próximos de ratas.
Con el fin de comprobar adicionalmente si en el
caso de la proteína de transporte OCT1 se trata del sistema de
transporte de cationes poliespecífico dependiente del potencial
procedente de la membrana basolateral o del sistema de transporte en
sentido opuesto de cationes H^{+}, poliespecífico, dependiente
del potencial de la membrana de costura pilosa, se investigó si la
recogida producida por la proteína de transporte OCT1 es
dependiente del potencial de membrana o de un gradiente de protones
a través de la membrana. Además, se investigó la inhibición de la
recogida de ^{14}C-TEA expresada mediante
diferentes inhibidores.
Las Figuras 1d y 1e muestran que la recogida de
^{14}C-TEA mediada por la proteína de transporte
OCT1 es dependiente del potencial de membrana, pero no se modifica
esencialmente cuando se aplica un gradiente de protones dirigido
hacia dentro o fuera de una unidad de pH. La proteína de transporte
OCT1 tiene por lo tanto las mismas características fundamentales que
el transporte de cationes medido a través de la membrana
basolateral de los túbulos renales próximos.
La Figura 1f en la Tabla 1 muestra que la
recogida de ^{14}C-TEA producida por OCT1 es
inhibida por cationes orgánicos con diferente estructura molecular.
Estas estructuras incluyen varios fármacos frecuentemente
utilizados. tales como quinina, desipramina, procainamida y
O-metil-isoprenalina. Los valores
estimados de K_{i} están situados entre 0,13 \mu para el
cloruro de
1-etil-2-([1,4-dimetil-2-fenil-6-
pirimidiniliden]metil)quinolinio (Cyanin 863) y 1 mM
para tetrametilamonio (PMA).
| Inhibidor | K_{i} (\muM) |
| Cyanin 863 | 0,13\pm0,02 |
| Decynium 22 | 0,38\pm0,08 |
| Tetrapentil-amonio | 0,43\pm0,09 |
| Quinina | 0,93\pm0,08 |
| Desipramina | 2,8\pm0,6 |
| Mepiperfenidol | 5,2\pm0,3 |
| Procainamida | 13\pm2 |
TABLA 1
(continuación)
| Inhibidor | K_{i} (\muM) |
| 1-Metil-4-piridinio | 13\pm2 |
| Corticosterona | > 10 |
| Reserpina | > 20 |
| O-metil-isoprenalina | 43\pm100 |
| Tetrametilamonio | 1.000\pm100 |
| N^{1}-metil-nicotinamida | 1.000\pm200 |
La Tabla 1 muestra la sensibilidad de la recogida
de ^{14}C-TEA en oocitos de Xenopus laevis, a los
que se había inyectado el ARNc de la proteína de transporte renal
OCT1.
En la realización de los experimentos de
inhibición se inyectaron a los oocitos de Xenopus laevis 5 ng de
ARNc de OCT1 y se midieron las repercusiones de los agentes
inhibidores expuestos en la Tabla 1 en el caso de 5 hasta 8
diferentes concentraciones de un agente inhibidor sobre la recogida
de 95 \muM en los oocitos. Los valores se representaron también
en la Figura 1f. Las curvas de inhibición se adaptaron por análisis
de regresión no lineal y se determinaron los valores de K_{i}
(\pmDT = desviación típica).
A diferencia de la proteína de transporte
poliespecífica ya conocida, la denominada transportadora de
fármacos múltiples, que es inhibida exclusivamente por sustancias
hidrófobas, la proteína de transporte OCT1 conforme al invento fue
inhibida también por compuestos hidrófilos tales como TMA y NMN. La
desipramina inhibía el transporte producido por OCT1 con un valor de
K_{i} 700 veces mayor que el transporte de noradrenalina neuronal
en membranas plasmáticas de células nerviosas. La reserpina 5 \muM
no influye sobre el transporte producido por OCT1, mientras que la
proteína de transporte monoamínica neuronal es inhibida en vesículas
sinápticas por concentraciones de reserpina menores que la
nanomolar.
Por comparación de los valores de K_{i} de OCT1
con datos funcionales, obtenidos con anterioridad, de vesículas de
membranas y de mediciones con células epiteliales renales
cultivadas, se pudo confirmar la identidad de la proteína de
transporte OCT1 con la proteína de transporte catiónica
basolateral. En el caso de una comparación de este tipo, se deben
tomar en cuenta las diferencias dependientes de las especies en el
transporte de cationes y las limitaciones metodológicas de los
diferentes procedimientos para medir la inhibición del transporte
de cationes. En investigaciones anteriores se determinó el
transporte de cationes en riñones de ratas por medio de experimentos
de microperfusión, que se deben llevar a cabo con cortos períodos
de tiempo de incubación (4 segundos). Puesto que con este método no
es posible ninguna determinación de la K_{i} de agentes
inhibidores, independiente de la difusión de agentes inhibidores con
alta afinidad, los autores nos hemos limitado a la comparación de
sustancias inhibidoras con baja afinidad. En el caso de una
comparación de los agentes inhibidores de baja afinidad, TMA y NMM,
hemos encontrado que los valores de K_{i} de la proteína de
transporte expresada por OCT1 (aproximadamente 1 mM) corresponden a
los valores de K_{i} (TMA 1,4 mM, NMN 0,54 mM), que se midieron
para la recogida de TEA basolateral en los túbulos renales próximos
de ratas. Éstos se diferencian manifiestamente de los valores de
K_{i} (TMA 70 mM, NMN 8,3 mM), que se determinaron para la
recogida de TEA luminar.
La localización basolateral de la OCT1 se
respalda adicionalmente por el valor de K_{i} (0,4 \muM), que
se había obtenido para la inhibición de la recogida producida por
la OCT1 mediante yoduro de
1,1'-dietil-2,2'-cianina
(Decynium 22). En células LLC-PK1 se determinó para
el transporte de TEA a través de la membrana luminar un valor de
K_{i} de 5,6 nM, mientras que se estimó que el valor de K_{i}
para el transporte de TEA a través de la membrana basolateral era
> 0,1 \muM. Con el fin de caracterizar adicionalmente a la
proteína de transporte OCT1, se ensayó si la MPP, que tiene una
afinidad 10 veces mayor que el TEA, también es transportada por la
OCT1. Después de inyección de 8 ng de ARNc de OCT1 en oocitos se
expresó una recogida específica de ^{3}H-MPP, que
podía ser inhibida por quinina. En una tanda de oocitos se
determinaron similares valores de V_{max} para la recogida
expresada de ^{14}C-TEA (148\pm4 pmol x
oocito^{-1} x h^{-1}) y de ^{3}H-MPP
(97\pm5 pmol x oocito^{-1} x H^{-1}). En células hepáticas se
ha descrito la existencia de transportadoras de cationes
poliespecíficas. Hace poco tiempo se midió la recogida de MPP en
hepatocitos cultivados. En tal caso se puso de manifiesto que
aproximadamente un 90% de la recogida de MPP se podía inhibir por
las mismas sustancias inhibidoras que en el transporte de cationes
expresado por OCT1. Los valores de K_{i} determinados en los
hepatocitos para la recogida de MPP
(O-metil-isoprenalina 78 \muM, MPP
13 \muM, quinina 0,8 \muM, Decynium 22 0,23 \muM y Cyanin 863
0,10 \muM) eran casi idénticos a los valores que se habían
obtenido para la recogida de TEA por la proteína OCT1 expresada por
oocitos de Xenopus. Estos datos permiten suponer que la proteína de
transporte OCT1 o una proteína de transporte altamente homóloga
está presente en la membrana plasmática de hepatocitos.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos de OCT1 se representan en la Figura 2a_{1}. Delante
del cuadro de lectura abierto pueden encontrarse codones de
detención y un sitio de iniciación de la traducción del tipo de
Kozak (ACGCCATG).
Un análisis de la hidrofilia e hidrofobia de OCT1
permitió reconocer 11 regiones
\alpha-helicoidales hidrófobas, que atraviesan
presumiblemente a la membrana. Una representación de los índices de
hidrofobia e hidrofilia se encuentra en la Figura 2b. Las zonas
que presumiblemente tienden a la membrana tienen una longitud de 17
a 27 aminoácidos. Éstas se encuentran unidas entre ellas por una
zona hidrófila larga, dos zonas hidrófilas de longitud intermedia y
siete zonas hidrófilas cortas. Puesto que se predijeron tres sitios
potenciales de glicosilación en N junto a la zona hidrófila entre
las dos primeras zonas de proteínas que atraviesan a la membrana, se
propuso la orientación de OCT1 que se representa en la Figura 2c.
La primera zona hidrófila contiene 14 aminoácidos cargados
negativamente, que pueden ser importantes para la fijación de
cationes a la OCT1.
Diferentes tejidos de rata y algunos linajes
celulares se analizaron con ayuda de la denominada transferencia de
borrones Northern en lo que se refiere a la localización del ARNm
(ácido ribonucleico mensajero) específico para la proteína de
transporte OCT1. Para ello, la totalidad del ARN se aisló mediante
el método de guanidinio, fenol y cloroformo, y el ARNm se purificó
mediando utilización de la cromatografía con oligo(dT)-
celulosa. El ARNm se fraccionó con ayuda de una electroforesis en
gel de agarosa y formaldehído, se transfirió a través de una
membrana Hybond-N (de Amersham) y a continuación se
hibridó. Para ello, a partir de las células de rata y a partir del
linaje celular 293 se aplicaron 5 \mug, y a partir de los linajes
celulares Caki-1 y LLC-PKI1, 1,5
\mug de ARNm sobre el gel de formaldehído y agarosa. La
hibridación se efectuó con un fragmento de ADNc, marcado con
^{32}P, de la secuencia de ADN conforme al invento del plásmido
pOCT1 (se utilizaron los nucleótidos 285 a 1.196). La hibridación se
llevó a cabo durante 18 horas a 42ºC en la solución de hibridación
(von 50% de formamida, 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% de
SDS y 20 \mug de ADN de esperma de salmón). La membrana se lavó
en varias etapas hasta una rigurosidad definitiva de 0,25 x SPE,
0,1% de SDS a 60ºC. Para la representación del linaje
LLC-PK1 se efectuó una exposición de la película
durante 24 horas y para los otros vestigios se efectuó una
exposición de la película durante seis horas. Para la determinación
del tamaño de los fragmentos de ARN se utilizó un patrón de ARN
(con una zona de 0,14 a 9,5 kilobases de GIBCO/BRL). Los tamaños se
indican en la Figura 3.
En la Figura 3 se representa la autorradiografía
obtenida mediante el análisis por transferencia de borrones
Northern. En la corteza renal, en la médula renal, en el hígado y
en los intestinos se observaron bandas manifiestas con 1,9 kilobases
y otras bandas con 3,4 y 4,8 kilobases. En el linaje celular
LLC-PK1 se pudo observar solamente una hibridación
en la zona de 3,4 kilobases. Por el contrario, no se pudieron
observar señales algunas para OCT1 en las papilas renales, en el
músculo del esqueleto, en el músculo cardíaco (miocardio), en el
cerebro, en el linaje de células renales 293 embrional humano y en
células Caki-1. Puesto que las células del corazón y
de Caki-1 contienen la proteína de transporte de
noradrenalina extraneuronal, que probablemente es idéntica a la
proteína de transporte en sentido opuesto de cationes H+ a membranas
renales luminares, las proteínas de transporte de cationes en las
membranas basolaterales y luminares de los túbulos renales próximos
pertenecen probablemente a diferentes familias genéticas. Unas
hibridaciones in situ mostraron que la proteína de transporte
OCT1 era expresada en los túbulos renales próximos, en las células
epiteliales del hígado y en los enterocitos del intestino
delgado.
Los Ejemplos anteriores muestran que se había
clonado una nueva y única proteína que desempeña un cometido
importante en la eliminación de fármacos catiónicos en los riñones
y en el hígado. Presumiblemente, esta proteína participa también en
la reabsorción de compuestos catiónicos en los intestinos. Aunque
el transporte de cationes y la excreción de fármacos se han
investigado intensamente desde hace más de 30 años, en el pasado se
pudieron conseguir solamente pequeños progresos. La razón de ello
consiste en que la segregación de fármacos en el hígado y los
riñones incluye el transporte a través de las membranas plasmáticas
basolaterales y luminares de las células epiteliales y que estos
procesos de transporte pueden ser producidos por proteínas de
transporte de cationes funcionalmente diferentes. Además de ello,
no se puede excluir que tanto en la membrana renal luminar como
también en la membrana renal basolateral existen diferentes
proteínas de transporte de cationes con similar especificidad para
substratos. Por medio de la clonación de la proteína de transporte
OCT1 conforme al invento, se identificó un tipo de la proteína de
transporte de cationes. Con ello se abrieron muchas posibilidades
para la investigación adicional de la segregación de fármacos
catiónicos.
Con ayuda de las técnicas descritas en la
presente solicitud se pudieron clonar dos genes humanos homólogos
para OCT1 y se pudieron secuenciar de modo total o parcial. El gen
totalmente secuenciado (HOCT1) consta de 1.885 bases y codifica una
proteína con 553 aminoácidos. Éste se representa en la Figura 2a.
Entre los aminoácidos de OCT1 y HOCT1 existe una identidad de 78%.
El otro gen humano (HOCT2) consta de 1.896 bases y codifica una
proteína con 555 aminoácidos. La secuencia de nucleótidos y la
secuencia derivada de aminoácidos de OCT2 se representa en la Figura
2a_{3}. Entre los aminoácidos de OCT1 y HOCT2 existe una
identidad de 68%.
La Figura 1 muestra la expresión de OCT1 en
oocitos de Xenopus laevis. Los indicados regímenes de recogida de
^{14}C-TEA constituyen los valores medios de 10 a
20 mediciones \pm la desviación típica.
La Figura 1a muestra una comparación de la
recogida de ^{14}C-TEA inhibida por NMN, que se
había observado después de la inyección de agua, 20 ng de ARNm de
riñón de rata o 10 ng de ARNc de OCT1. Las concentraciones de
^{14}C-TEA y NMN en los medios de incubación
fueron respectivamente de 200 \muM y 10 mM.
La figura 1b muestra los regímenes de recogida de
200 \muM de ^{14}C-TEA después de la inyección
de diferentes cantidades de ARNc de OCT1. La curva se calculó por
adaptación de la ecuación de Hill a los datos obtenidos (n = 1,9
\pm 0,2).
La Figura 1c muestra la dependencia con respecto
de substratos de la recogida de ^{14}C-TEA, que
se había expresado después de la inyección de 3 ng de ARNc de OCT1
por oocito. La línea continua muestra la recogida total, que
contiene un componente saturable y un componente lineal, que se
había determinado en oocitos testigos, a los que se había inyectado
agua. El componente lineal fue adaptado mediante regresión lineal
(línea de trazos, 30 fmol x h^{-1} x oocito^{-1} x
\muM^{-1}). El componente saturable fue adaptado mediante la
ecuación de Michaelis Menten (K_{m} 95 \pm 10 \muM, V_{max}
81 \pm 5 pmol x h^{-1} x oocito^{-1}). La línea extendida se
calculó por adaptación a una ecuación, que contiene los dos
componentes.
La Figura 1d muestra la dependencia con respecto
del potencial de la recogida de ^{14}C-TEA en
oocitos, a los que se habían inyectado 3 ng de ARNc de OCT1. La
recogida de 95 \muM de ^{14}C-TEA se midió en
presencia de las concentraciones indicadas de Na^{+}, K^{+} y
Ba^{2+}. En estas condiciones, los potenciales de membrana estaban
situados entre -40 y -60 mV (100 mM de Na^{+}, 3 mM de K^{+}),
de 0 a -10 mV (1 mM de Na^{+}, 102 mM de K^{+}) y entre -18 y
-22 mV (100 mM de Na^{+}, 3 mM de K^{+}, 10 mM de
Ba^{2+}).
La Figura 1e muestra la recogida de 95 \muM de
^{14}C-TEA en presencia y en ausencia de
gradientes de protones en oocitos, a los que se habían inyectado 3
ng de ARNc de OCT1. Con el fin de impedir modificaciones del
potencial de membrana, causadas por gradientes de protones, que
modifican la recogida de ^{14}C-TEA, las
mediciones se llevaron a cabo en presencia de 102 mM de K^{+} y 1
mM de Na^{+} en el medio de incubación. Con ello, el potencial de
membrana se llevó a aproximadamente 0 mV. Las mediciones del pH con
microelectrodos mostraron que durante el período de recogida de 30
minutos el valor del pH se había modificado en menos de 0,1
unidades.
La Figura 1f muestra la inhibición de la recogida
de ^{14}C-TEA producida por OCT1 mediante
Decynium 22 (o), quinina (\Delta), desipramina (\oblong),
procainamida (\bullet),
O-metil-isoprenalina
(\diamondsuit) y tetrametilamonio (\blacklozenge). A los
oocitos se les inyectaron 5 ng de ARNc de OCT1 y las mediciones se
llevaron a cabo con ^{14}C-TEA 95 \muM.
La Figura 2a_{1} muestra la secuencia de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la OCT1, que se deriva
de ella. Aquellas zonas, que presumiblemente son zonas
transmembranales, se subrayaron y los sitios de glicosilación en N
potencial del tipo NXT/S se indicaron por asteriscos.
La Figura 2a_{2} muestra las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de un gen humano homólogo procedente del
riñón (HOCT1). El trozo de gen representado abarca 1.885 bases y
codifica 553 aminoácidos.
La Figura 2a_{3} muestra una secuencia de
nucleótidos y aminoácidos de un segundo gen humano homólogo
procedente del riñón (HOCT2). El trozo de gen representado abarca
1.856 bases y codifica 555 aminoácidos.
La Figura 2b muestra un análisis de hidrofobia e
hidrofilia según Kyte-Doolittle de OCT1 mediando
utilización de una ventana de 9 aminoácidos. Las zonas, que
presumiblemente son zonas transmembranales, fueron numeradas con 1 a
11.
La Figura 2c muestra una representación
esquemática de OCT1. Los radicales de aminoácidos Arg, Lys y His
fueron indicados por signos positivos y los radicales de
aminoácidos Glu y Asp fueron caracterizados por signos negativos.
Los sitios potenciales de glicosilación en el primer bucle
hidrófilo son hechos reconocibles.
La Figura 3 muestra la localización de ARNm
específicos para OCT1 en diferentes tejidos de ratas y en algunos
linajes celulares.
Claims (13)
1. Proteína de transporte, que es responsable
del transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos a partir de
la sangre en las células epiteliales hepáticas o renales o para el
transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos a partir de los
intestinos, caracterizada porque tiene las secuencias de
aminoácidos que se representan en las Figuras 2a_{1}, 2a_{2} o
2a_{3}.
2. Secuencia aislada de ADN, caracterizada
porque codifica una proteína de transporte de acuerdo con la
reivindicación 1.
3. Utilización de una secuencia de ADN de acuerdo
con la reivindicación 2, para la producción de un linaje de células
epiteliales, que expresa constantemente una proteína de transporte
de acuerdo con la reivindicación 1.
4. Linaje de células epiteliales, que expresa una
proteína de transporte de acuerdo con la reivindicación 1.
5. Linaje de células epiteliales de acuerdo con
la reivindicación 4, para el ensayo de la segregación renal y biliar
que es de esperar, así como de la resorción intestinal de fármacos
y/o xenobióticos catiónicos in vitro.
6. Utilización de una secuencia de ADN de acuerdo
con la reivindicación 2, para el aislamiento de proteínas de
transporte homólogas para proteínas de transporte de acuerdo con la
reivindicación 1.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
6, caracterizada porque el aislamiento se efectúa con ayuda
de la reacción en cadena de polimerasa.
8. Utilización de las proteínas de transporte de
acuerdo con la reivindicación 1 y/o del linaje de células
epiteliales de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5 para el
desarrollo de moléculas señalizadoras catiónicas, que pueden ser
unidas a compuestos biológicamente activos, tales como fármacos, a
fin de modificar su segregación renal y biliar o su resorción
intestinal.
9. Utilización de la proteína de transporte de
acuerdo con la reivindicación 1 y/o del linaje de células
epiteliales de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5, para el
desarrollo de anticuerpos, con cuya ayuda se puede bloquear la
recogida de fármacos en células de túbulos renales, a fin de
disminuir la nefrotoxicidad de fármacos y/o xenobióticos
catiónicos.
10. Utilización de la proteína de transporte de
acuerdo con la reivindicación 1 y/o del linaje de células
epiteliales de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para el
desarrollo de fármacos específicos, con cuya ayuda se puede bloquear
la recogida de otros fármacos y/o xenobióticos en células de
túbulos renales, a fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos
catiónicos.
11. Utilización de una secuencia de ADN de
acuerdo con la reivindicación 2, para el desarrollo de una secuencia
de nucleótidos antisentido, con cuya ayuda se puede bloquear la
recogida de fármacos y/o xenobióticos en células de túbulos renales,
a fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos catiónicos.
12. Utilización de una secuencia de ADN de
acuerdo con la reivindicación 2 en estuches de ensayo moleculares
para el diagnóstico de defectos genéticos moleculares en mecanismos
renales y biliares de segregación de cationes.
13. Utilización de acuerdo con la reivindicación
12, caracterizada porque el estuche de ensayo molecular
contiene los componentes que se necesitan para la realización de la
reacción en cadena de polimerasa.
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