ES2199970T3

ES2199970T3 - Proteinas de transporte que determina el transporte de xenobioticos y/o farmacos cationicos, secuencias de adn que la codifican y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2199970T3
Application number: ES95110631T
Authority: ES
Inventors: Hermann Prof Dr. Koepsell; Dirk Dr. Grundeman; Valentin Dr. Gorboulev
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: JPH0881497A; ATE242323T1; US6063766A; DK0699753T3; JP3798447B2; EP0699753B1; EP0699753A3; EP0699753A2; PT699753E; DE4424577A1; CA2153756A1; CA2153756C; DE59510710D1; US6063623A

Abstract

SE SOMETE A CLONACION UNA PROTEINA DE TRANSPORTE, QUE TIENE LUGAR EN CELULAS EPITELIALES DEL HIGADO Y DEL RIÑON ASI COMO EN CELULAS DEL INTESTINO Y SON RESPONSABLES DEL TRANSPORTE DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS CATIONICOS Y/O PRODUCTOS DE XENOBIOTICA. ESTAS PROTEINAS DE TRANSPORTE SON DESCRITAS A TRAVES DE LA SECUENCIA DNA Y DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE FORMA APROXIMADA Y SE DA CONOCER SUS DISTINTAS UTILIZACIONES, QUE TIENEN SIGNIFICADO ESPECIALMENTE EN EL DESARROLLO DE NUEVOS MEDICAMENTOS DE GRAN SIGNIFICADO.

Description

Proteína de transporte que determina el transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos, secuencias de ADN que la codifican y su utilización.

En los animales mamíferos y en particular en los seres humanos, ciertos fármacos y xenobióticos catiónicos con diversa estructura molecular, catecolaminas y otros cationes endógenos, son segregados en los riñones y en el hígado por proteínas de transporte poliespecíficas, que están localizadas en membranas plasmáticas luminares y basolaterales. Estas proteínas de transporte se diferencian en el aspecto funcional con respecto de las proteínas de transporte monoamínicas ya conocidas en membranas plasmáticas neuronales y vesículas sinápticas y de las proteínas de exportación dependientes de ATP para fármacos hidrófobos (proteínas de transporte de "fármacos múltiples").

Dentro del marco del presente invento se aisló en primer lugar una secuencia de ADN complementario procedente de riñones de ratas, que codifica una proteína membranal con una longitud de 556 aminoácidos, que se designa en lo sucesivo como OCT1. Esta proteína de transporte actúa en la membrana basolateral de los túbulos renales próximos (canalículos renales) y en hepatocitos como transportadores de cationes para diferentes moléculas dianas.

La proteína de transporte designada por OCT1 no es homóloga con ninguna otra proteína conocida hasta ahora, presenta una distribución hasta ahora única de aminoácidos hidrófobos y cargados negativamente, y es encontrada exclusivamente en los riñones, el hígado y los intestinos. La proteína de transporte OCT1 transporta cationes con diversa estructura, es inhibida por un gran número de sustancias catiónicas con diversa hidrofobia y posee otras propiedades funcionales distintas de las de una proteína de transporte poliespecífica ya conocida ("transportadora de fármacos múltiples"), que puede transportar exclusivamente sustancias muy hidrófobas. La proteína de transporte OCT1 es considerada como un nuevo prototipo de una proteína de transporte poliespecífica en animales mamíferos.

Muchos cationes orgánicos, inclusive fármacos utilizados con frecuencia, tales como agentes antihistamínicos, antiarrítmicos, sedantes, opiatos, diuréticos, citostáticos, y antibióticos, se segregan en la orina y en la bilis mediante transporte activo por células epiteliales renales y hepatocitos. En el caso de la secreción activa en los riñones, los cationes son transportados por sistemas de transporte poliespecíficos en la membrana plasmática basolateral y luminar de los túbulos renales próximos. Ambos sistemas se diferencian en el aspecto funcional. Las proteínas de transporte en la membrana basolateral, que pueden transportar cationes diferentes estructuralmente tales como tetraetil-amonio (TEA), N^{1}-metil-nicotinamida (NMN) y 4-metil-4-fenil-piridinio (MPP), son inhibidas por un gran número de cationes extracelulares estructuralmente diferentes. Estas proteínas de transporte pueden ser propulsadas por un potencial membranal negativo y situado en el interior y por un transporte en sentido opuesto de substratos intracelulares. En la membrana luminar se describieron dos sistemas de transporte, que son propulsados por un gradiente de protones dirigido hacia fuera, pero no son influidos por el potencial membranal. Uno de estos sistemas de transporte tiene una amplia especificidad para substratos, que es comparable con la del sistema de transporte de cationes en la membrana basolateral de túbulos renales próximos. Por causa de las similaridades funcionales, se supone que este sistema de transporte poliespecífico de la membrana luminar es idéntico al sistema de transporte extraneuronal para noradrenalina en el corazón.

Son objeto del presente invento, por lo tanto, proteínas de transporte, que son competentes para el transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos a partir de la sangre dentro de las células epiteliales hepáticas o renales, o para el transporte de xenobióticos o fármacos catiónicos desde los intestinos a la circulación sanguínea.

Las proteínas de transporte conformes al invento están caracterizadas porque presentan la secuencia de aminoácidos que se representa en la Figura 2a_{1}, la Figura 2a_{2} o la Figura 2a_{3}.

Son objeto del presente invento también secuencias de ADN, que codifican una proteína de transporte conforme al invento. Las secuencias de ADN conformes al invento presentan la secuencia de nucleótidos que se muestra en las Figuras 2a_{1}, 2a_{2} o 2a_{3}.

Presentan una importancia especial las proteínas de transporte y secuencias de ADN conformes al invento en la investigación medicinal y farmacológica. Con ayuda de las secuencias de ADN conformes al invento es posible, por ejemplo, producir linajes de células epiteliales, que expresan permanentemente una proteína de transporte conforme al invento. Para ello, con métodos de tecnología genética en sí conocidos, se incorpora en un vector apropiado la secuencia de ADN que codifica la proteína de transporte, con la que se transforma un apropiado linaje de células epiteliales, que no expresaba hasta ahora la proteína de transporte. Con ello, se pueden obtener linajes de células que expresan constantemente una proteína de transporte conforme al invento.

Tales linajes de células epiteliales, que expresan las proteínas de transporte, se pueden emplear in vitro para ensayar la segregación renal y biliar que es de esperar, así como la resorción intestinal de fármacos y/o xenobióticos catiónicos. Con ayuda de tales linajes de células se puede comprobar por consiguiente ya in vitro, es decir sin costosos experimentos en animales, si y, en caso afirmativo, en qué grado, se segregan fármacos o también otras sustancias activas con actividad biológica o se resorben desde los intestinos a la circulación sanguínea.

Con ayuda de las secuencias de ADN conformes al invento se pueden aislar las proteínas de transporte, que son homólogas con respecto a las proteínas de transporte conformes al invento. Por lo tanto, es posible aislar, a partir de todas las especies de mamíferos y a partir de los seres humanos, las correspondientes proteínas de transporte, que son homólogas con las proteínas de transporte divulgadas conformes al invento. Dos correspondientes secuencias humanas fueron ya captadas y determinadas. Una posibilidad de cómo se puede efectuar un aislamiento de este tipo, es la reacción en cadena de polimerasa que entretanto se ha hecho conocida universalmente. Por lo tanto, se deben escoger a partir de la secuencia mostrada en las figuras 2a_{1}, 2a_{2} o 2a_{3}, solamente apropiadas secuencias de ADN, que pueden servir como cebadoras para la reacción en cadena de polimerasa. Con ayuda de estos cebadores, puede efectuarse sin dificultades el aislamiento de proteínas de transporte homólogas.

Una posibilidad adicional de utilización de las proteínas de transporte conformes al invento y/o de los linajes de células epiteliales conformes al invento, es el desarrollo de moléculas señalizadoras catiónicas, que pueden ser unidas a compuestos biológicamente activos, tales como fármacos, con el fin de modificar su segregación renal y biliar o su resorción intestinal. Con ello, es posible comprobar diferentes estructuras para determinar si favorecen una segregación de la molécula unida con ellas, a través de los riñones o del hígado, y si fomentan una resorción desde los intestinos a la circulación sanguínea o si producen el respectiva fenómeno opuesto.

En particular, las proteínas de transporte conformes al invento sirven también para el desarrollo de anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, con cuya ayuda se puede bloquear la recogida de fármacos en células de túbulos renales, con el fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos catiónicos.

Además, en virtud de la divulgación conforme al invento se puede efectuar el desarrollo de fármacos específicos, que influyen sobre la segregación de otros determinados fármacos y/o xenobióticos catiónicos. Con ello, es posible desarrollar sustancias farmacológicamente activas, que influyen sobre la recogida de otras sustancias activas. Tal influencia puede consistir ya sea en que se fomenta o se impide la recogida de una sustancia activa a partir de los intestinos o que se fomenta o impide la segregación de una sustancia activa en los riñones y en el hígado.

Una utilización preferida adicional de las secuencias de ADN conformes al invento es el desarrollo de secuencias de nucleótidos antisentido. En este caso, se pueden desarrollar secuencias de nucleótidos, que impiden la transcripción y/o la traducción de los correspondientes genes mediante el hecho de que se fijan a las correspondientes secuencias complementarias de nucleótidos, que se presentan por naturaleza.

Una utilización preferida adicional de las secuencias de ADN conformes al invento es su utilización en estuches de ensayo moleculares para el diagnóstico de defectos moleculares genómicos en mecanismos renales y/o biliares de segregación de cationes. En tales estuches de ensayo moleculares, las secuencias de ADN se pueden utilizar en una forma especialmente preferida de ejecución para la realización de la reacción en cadena de polimerasa. En tal caso, con ayuda de la secuencia conocida de ADN, se seleccionan y sintetizan secuencias de cebadores, con cuya ayuda, en la reacción en cadena de polimerasa, se puede amplificar el gen que codifica el transportador de cationes del respectivo paciente, y se puede investigar en lo que se refiere a las mutaciones genéticas.

Con ayuda de los siguientes Ejemplos, que sin embargo no deben limitar al invento, se explica con mayor detalle la esencia del presente invento.

Ejemplo 1

Para la clonación de los genes que codifican la proteína de transporte, se prepararon en primer lugar ADN_{c} (ácidos desoxirribonucleicos complementarios) bicatenarios con extremos lisos de ARN (ácidos ribonucleicos) poli(A)^{+} (positivos para poli(A)) a partir de riñones de rata, utilizándose un cebador con NotI-oligo(dT) para la síntesis de la primera cadena. Después de que se hubieron colocado junto a los ADNc adaptadores para EcoRI, que contienen un promotor de polimerasa de ARN SP6, se digirió con NotI, se separó en cuanto al tamaño (1,5 a 2,3 kb) y se incorporó en las partes de corte por restricción con EcoRI del vector pBluescript (de Stratagene) y a continuación se electroporó en la cepa DH10B de E. coli. A partir de agrupaciones de transformantes se aísló el ADN de plásmido, se linealizó con NotI y se transcribió con ayuda de la polimerasa de ARN SP6. El ARNc (complementario) se purificó por selección frente a poli(A)^{+} y se inyectó en una concentración de 20 a 40 ng por oocito. Los oocitos se incubaron y se midió la recogida de ^{14}C-TEA que se podía inhibir mediante NMN. Mediante un procedimiento de búsqueda planificada se aisló a partir de la biblioteca genética (genoteca) un clon individual, que contenía el gen que codificaba un transportador de cationes a partir de los riñones. El aislamiento de este clon era posible solamente después de una optimización y de una modificación parcial de los métodos aplicados. Para la secuenciación de los ADN identificados, se subclonaron fragmentos de restricción solapados de OCT1 y se secuenciaron totalmente en las dos cadenas.

El gen de OCT1, aíslado a partir de un banco de genes de riñones de ratas, que constaba de un fragmento de ADNc con una longitud de 1.882 pares de bases, se expresó en oocitos de Xenopus laevis. En este caso, los oocitos, después de una inyección del ARN, se incubaron durante tres días con 5 mM de un tampón Hepes-Tris, de pH 7,5, 110 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 2 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2} (designado en lo sucesivo como ORi). El transporte se midió por incubación de los oocitos con ^{14}C-TEA (tetraetilamonio) que se había disuelto en ORi (22ºC). Además, se llevaron a cabo experimentos con diferentes concentraciones de Na^{+} y K^{+} así como experimentos en la presencia de Ba^{++}, a diferentes valores del pH y en presencia de distintos inhibidores. Puesto que con las concentraciones utilizadas de ^{14}C-TEA era lineal durante mas de 90 minutos la recogida en el tampón ORi provocada por la proteína OCT1 expresada, se determinaron los regímenes de recogida después de incubación durante 90 minutos. Para las mediciones con concentraciones modificadas de Na^{+}, K^{+}, H^{+} y en presencia de inhibidores, los oocitos se incubaron primeramente durante 30 minutos en las correspondientes condiciones de tamponamiento y los regímenes de recogida se determinaron durante un período de incubación de 30 minutos con ^{14}C-TEA. Después de la incubación con ^{14}C-TEA, se interrumpió la recogida y los oocitos se lavaron y se investigaron en lo que referente a la radiactividad recogida.

Por lo tanto, el fragmento de ADNc con una longitud de 1.882 pares de bases se expresó mediando utilización de oocitos de Xenopus laevis (tal como antes se ha descrito); la proteína OCT1, expresada de esta manera, inducía una recogida de ^{14}C- tetraetil-amonio ^{14}C-TEA), que podía ser inhibida por NMN (N^{1}-metil-nicotinamida), estando situada la recogida en un múltiplo de más de 250 veces por encima de los valores de testigos a los que se inyectaba agua en los oocitos. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 1a.

El ADNc de OCT1 clonado contiene un cuadro de lectura abierto, que codifica una proteína membranal con 556 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos se representa en la Figura 2a_{1}. Ésta no muestra ninguna similaridad con las proteínas existentes en bancos de datos.

La expresión de la recogida de ^{14}C-TEA era dependiente de la cantidad del ARNc de OCT1 inyectado. Estos resultados se representan en la Figura 1b. La dependencia con respecto al ARNc de la recogida expresada se pudo describir por una ecuación de Hill con n = aproximadamente 2.

La dependencia con respecto de los substratos de la recogida de ^{14}C-TEA producida por la proteína de transporte OCT1 siguió la ecuación de Michaelis Menten. Estos resultados se representan en la Figura 1c. El valor estimado de K_{m} de 95\pm\muM se asemejaba al valor de K_{m} (160 \muM), que había sido determinado en experimentos anteriores para el transporte de cationes a través de la membrana basolateral de túbulos renales próximos de ratas. Éste era 14 veces menor que el valor aparente de K_{m} para el transportador en sentido opuesto, poliespecífico para cationes H^{+} en la membrana de costura pilosa o en cepillo (del alemán Bürstensaummembran) de túbulos renales próximos de ratas.

Ejemplo 2

Con el fin de comprobar adicionalmente si en el caso de la proteína de transporte OCT1 se trata del sistema de transporte de cationes poliespecífico dependiente del potencial procedente de la membrana basolateral o del sistema de transporte en sentido opuesto de cationes H^{+}, poliespecífico, dependiente del potencial de la membrana de costura pilosa, se investigó si la recogida producida por la proteína de transporte OCT1 es dependiente del potencial de membrana o de un gradiente de protones a través de la membrana. Además, se investigó la inhibición de la recogida de ^{14}C-TEA expresada mediante diferentes inhibidores.

Las Figuras 1d y 1e muestran que la recogida de ^{14}C-TEA mediada por la proteína de transporte OCT1 es dependiente del potencial de membrana, pero no se modifica esencialmente cuando se aplica un gradiente de protones dirigido hacia dentro o fuera de una unidad de pH. La proteína de transporte OCT1 tiene por lo tanto las mismas características fundamentales que el transporte de cationes medido a través de la membrana basolateral de los túbulos renales próximos.

La Figura 1f en la Tabla 1 muestra que la recogida de ^{14}C-TEA producida por OCT1 es inhibida por cationes orgánicos con diferente estructura molecular. Estas estructuras incluyen varios fármacos frecuentemente utilizados. tales como quinina, desipramina, procainamida y O-metil-isoprenalina. Los valores estimados de K_{i} están situados entre 0,13 \mu para el cloruro de 1-etil-2-([1,4-dimetil-2-fenil-6- pirimidiniliden]metil)quinolinio (Cyanin 863) y 1 mM para tetrametilamonio (PMA).

TABLA 1

Inhibidor	K_{i} (\muM)
Cyanin 863	0,13\pm0,02
Decynium 22	0,38\pm0,08
Tetrapentil-amonio	0,43\pm0,09
Quinina	0,93\pm0,08
Desipramina	2,8\pm0,6
Mepiperfenidol	5,2\pm0,3
Procainamida	13\pm2

TABLA 1 (continuación)

Inhibidor	K_{i} (\muM)
1-Metil-4-piridinio	13\pm2
Corticosterona	> 10
Reserpina	> 20
O-metil-isoprenalina	43\pm100
Tetrametilamonio	1.000\pm100
N^{1}-metil-nicotinamida	1.000\pm200

La Tabla 1 muestra la sensibilidad de la recogida de ^{14}C-TEA en oocitos de Xenopus laevis, a los que se había inyectado el ARNc de la proteína de transporte renal OCT1.

En la realización de los experimentos de inhibición se inyectaron a los oocitos de Xenopus laevis 5 ng de ARNc de OCT1 y se midieron las repercusiones de los agentes inhibidores expuestos en la Tabla 1 en el caso de 5 hasta 8 diferentes concentraciones de un agente inhibidor sobre la recogida de 95 \muM en los oocitos. Los valores se representaron también en la Figura 1f. Las curvas de inhibición se adaptaron por análisis de regresión no lineal y se determinaron los valores de K_{i} (\pmDT = desviación típica).

A diferencia de la proteína de transporte poliespecífica ya conocida, la denominada transportadora de fármacos múltiples, que es inhibida exclusivamente por sustancias hidrófobas, la proteína de transporte OCT1 conforme al invento fue inhibida también por compuestos hidrófilos tales como TMA y NMN. La desipramina inhibía el transporte producido por OCT1 con un valor de K_{i} 700 veces mayor que el transporte de noradrenalina neuronal en membranas plasmáticas de células nerviosas. La reserpina 5 \muM no influye sobre el transporte producido por OCT1, mientras que la proteína de transporte monoamínica neuronal es inhibida en vesículas sinápticas por concentraciones de reserpina menores que la nanomolar.

Ejemplo 3

Por comparación de los valores de K_{i} de OCT1 con datos funcionales, obtenidos con anterioridad, de vesículas de membranas y de mediciones con células epiteliales renales cultivadas, se pudo confirmar la identidad de la proteína de transporte OCT1 con la proteína de transporte catiónica basolateral. En el caso de una comparación de este tipo, se deben tomar en cuenta las diferencias dependientes de las especies en el transporte de cationes y las limitaciones metodológicas de los diferentes procedimientos para medir la inhibición del transporte de cationes. En investigaciones anteriores se determinó el transporte de cationes en riñones de ratas por medio de experimentos de microperfusión, que se deben llevar a cabo con cortos períodos de tiempo de incubación (4 segundos). Puesto que con este método no es posible ninguna determinación de la K_{i} de agentes inhibidores, independiente de la difusión de agentes inhibidores con alta afinidad, los autores nos hemos limitado a la comparación de sustancias inhibidoras con baja afinidad. En el caso de una comparación de los agentes inhibidores de baja afinidad, TMA y NMM, hemos encontrado que los valores de K_{i} de la proteína de transporte expresada por OCT1 (aproximadamente 1 mM) corresponden a los valores de K_{i} (TMA 1,4 mM, NMN 0,54 mM), que se midieron para la recogida de TEA basolateral en los túbulos renales próximos de ratas. Éstos se diferencian manifiestamente de los valores de K_{i} (TMA 70 mM, NMN 8,3 mM), que se determinaron para la recogida de TEA luminar.

Ejemplo 4

La localización basolateral de la OCT1 se respalda adicionalmente por el valor de K_{i} (0,4 \muM), que se había obtenido para la inhibición de la recogida producida por la OCT1 mediante yoduro de 1,1'-dietil-2,2'-cianina (Decynium 22). En células LLC-PK1 se determinó para el transporte de TEA a través de la membrana luminar un valor de K_{i} de 5,6 nM, mientras que se estimó que el valor de K_{i} para el transporte de TEA a través de la membrana basolateral era > 0,1 \muM. Con el fin de caracterizar adicionalmente a la proteína de transporte OCT1, se ensayó si la MPP, que tiene una afinidad 10 veces mayor que el TEA, también es transportada por la OCT1. Después de inyección de 8 ng de ARNc de OCT1 en oocitos se expresó una recogida específica de ^{3}H-MPP, que podía ser inhibida por quinina. En una tanda de oocitos se determinaron similares valores de V_{max} para la recogida expresada de ^{14}C-TEA (148\pm4 pmol x oocito^{-1} x h^{-1}) y de ^{3}H-MPP (97\pm5 pmol x oocito^{-1} x H^{-1}). En células hepáticas se ha descrito la existencia de transportadoras de cationes poliespecíficas. Hace poco tiempo se midió la recogida de MPP en hepatocitos cultivados. En tal caso se puso de manifiesto que aproximadamente un 90% de la recogida de MPP se podía inhibir por las mismas sustancias inhibidoras que en el transporte de cationes expresado por OCT1. Los valores de K_{i} determinados en los hepatocitos para la recogida de MPP (O-metil-isoprenalina 78 \muM, MPP 13 \muM, quinina 0,8 \muM, Decynium 22 0,23 \muM y Cyanin 863 0,10 \muM) eran casi idénticos a los valores que se habían obtenido para la recogida de TEA por la proteína OCT1 expresada por oocitos de Xenopus. Estos datos permiten suponer que la proteína de transporte OCT1 o una proteína de transporte altamente homóloga está presente en la membrana plasmática de hepatocitos.

Ejemplo 5

La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de OCT1 se representan en la Figura 2a_{1}. Delante del cuadro de lectura abierto pueden encontrarse codones de detención y un sitio de iniciación de la traducción del tipo de Kozak (ACGCCATG).

Un análisis de la hidrofilia e hidrofobia de OCT1 permitió reconocer 11 regiones \alpha-helicoidales hidrófobas, que atraviesan presumiblemente a la membrana. Una representación de los índices de hidrofobia e hidrofilia se encuentra en la Figura 2b. Las zonas que presumiblemente tienden a la membrana tienen una longitud de 17 a 27 aminoácidos. Éstas se encuentran unidas entre ellas por una zona hidrófila larga, dos zonas hidrófilas de longitud intermedia y siete zonas hidrófilas cortas. Puesto que se predijeron tres sitios potenciales de glicosilación en N junto a la zona hidrófila entre las dos primeras zonas de proteínas que atraviesan a la membrana, se propuso la orientación de OCT1 que se representa en la Figura 2c. La primera zona hidrófila contiene 14 aminoácidos cargados negativamente, que pueden ser importantes para la fijación de cationes a la OCT1.

Ejemplo 6

Diferentes tejidos de rata y algunos linajes celulares se analizaron con ayuda de la denominada transferencia de borrones Northern en lo que se refiere a la localización del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) específico para la proteína de transporte OCT1. Para ello, la totalidad del ARN se aisló mediante el método de guanidinio, fenol y cloroformo, y el ARNm se purificó mediando utilización de la cromatografía con oligo(dT)- celulosa. El ARNm se fraccionó con ayuda de una electroforesis en gel de agarosa y formaldehído, se transfirió a través de una membrana Hybond-N (de Amersham) y a continuación se hibridó. Para ello, a partir de las células de rata y a partir del linaje celular 293 se aplicaron 5 \mug, y a partir de los linajes celulares Caki-1 y LLC-PKI1, 1,5 \mug de ARNm sobre el gel de formaldehído y agarosa. La hibridación se efectuó con un fragmento de ADNc, marcado con ^{32}P, de la secuencia de ADN conforme al invento del plásmido pOCT1 (se utilizaron los nucleótidos 285 a 1.196). La hibridación se llevó a cabo durante 18 horas a 42ºC en la solución de hibridación (von 50% de formamida, 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,5% de SDS y 20 \mug de ADN de esperma de salmón). La membrana se lavó en varias etapas hasta una rigurosidad definitiva de 0,25 x SPE, 0,1% de SDS a 60ºC. Para la representación del linaje LLC-PK1 se efectuó una exposición de la película durante 24 horas y para los otros vestigios se efectuó una exposición de la película durante seis horas. Para la determinación del tamaño de los fragmentos de ARN se utilizó un patrón de ARN (con una zona de 0,14 a 9,5 kilobases de GIBCO/BRL). Los tamaños se indican en la Figura 3.

En la Figura 3 se representa la autorradiografía obtenida mediante el análisis por transferencia de borrones Northern. En la corteza renal, en la médula renal, en el hígado y en los intestinos se observaron bandas manifiestas con 1,9 kilobases y otras bandas con 3,4 y 4,8 kilobases. En el linaje celular LLC-PK1 se pudo observar solamente una hibridación en la zona de 3,4 kilobases. Por el contrario, no se pudieron observar señales algunas para OCT1 en las papilas renales, en el músculo del esqueleto, en el músculo cardíaco (miocardio), en el cerebro, en el linaje de células renales 293 embrional humano y en células Caki-1. Puesto que las células del corazón y de Caki-1 contienen la proteína de transporte de noradrenalina extraneuronal, que probablemente es idéntica a la proteína de transporte en sentido opuesto de cationes H+ a membranas renales luminares, las proteínas de transporte de cationes en las membranas basolaterales y luminares de los túbulos renales próximos pertenecen probablemente a diferentes familias genéticas. Unas hibridaciones in situ mostraron que la proteína de transporte OCT1 era expresada en los túbulos renales próximos, en las células epiteliales del hígado y en los enterocitos del intestino delgado.

Los Ejemplos anteriores muestran que se había clonado una nueva y única proteína que desempeña un cometido importante en la eliminación de fármacos catiónicos en los riñones y en el hígado. Presumiblemente, esta proteína participa también en la reabsorción de compuestos catiónicos en los intestinos. Aunque el transporte de cationes y la excreción de fármacos se han investigado intensamente desde hace más de 30 años, en el pasado se pudieron conseguir solamente pequeños progresos. La razón de ello consiste en que la segregación de fármacos en el hígado y los riñones incluye el transporte a través de las membranas plasmáticas basolaterales y luminares de las células epiteliales y que estos procesos de transporte pueden ser producidos por proteínas de transporte de cationes funcionalmente diferentes. Además de ello, no se puede excluir que tanto en la membrana renal luminar como también en la membrana renal basolateral existen diferentes proteínas de transporte de cationes con similar especificidad para substratos. Por medio de la clonación de la proteína de transporte OCT1 conforme al invento, se identificó un tipo de la proteína de transporte de cationes. Con ello se abrieron muchas posibilidades para la investigación adicional de la segregación de fármacos catiónicos.

Ejemplo 7

Con ayuda de las técnicas descritas en la presente solicitud se pudieron clonar dos genes humanos homólogos para OCT1 y se pudieron secuenciar de modo total o parcial. El gen totalmente secuenciado (HOCT1) consta de 1.885 bases y codifica una proteína con 553 aminoácidos. Éste se representa en la Figura 2a. Entre los aminoácidos de OCT1 y HOCT1 existe una identidad de 78%. El otro gen humano (HOCT2) consta de 1.896 bases y codifica una proteína con 555 aminoácidos. La secuencia de nucleótidos y la secuencia derivada de aminoácidos de OCT2 se representa en la Figura 2a_{3}. Entre los aminoácidos de OCT1 y HOCT2 existe una identidad de 68%.

Explicación de los dibujos

La Figura 1 muestra la expresión de OCT1 en oocitos de Xenopus laevis. Los indicados regímenes de recogida de ^{14}C-TEA constituyen los valores medios de 10 a 20 mediciones \pm la desviación típica.

La Figura 1a muestra una comparación de la recogida de ^{14}C-TEA inhibida por NMN, que se había observado después de la inyección de agua, 20 ng de ARNm de riñón de rata o 10 ng de ARNc de OCT1. Las concentraciones de ^{14}C-TEA y NMN en los medios de incubación fueron respectivamente de 200 \muM y 10 mM.

La figura 1b muestra los regímenes de recogida de 200 \muM de ^{14}C-TEA después de la inyección de diferentes cantidades de ARNc de OCT1. La curva se calculó por adaptación de la ecuación de Hill a los datos obtenidos (n = 1,9 \pm 0,2).

La Figura 1c muestra la dependencia con respecto de substratos de la recogida de ^{14}C-TEA, que se había expresado después de la inyección de 3 ng de ARNc de OCT1 por oocito. La línea continua muestra la recogida total, que contiene un componente saturable y un componente lineal, que se había determinado en oocitos testigos, a los que se había inyectado agua. El componente lineal fue adaptado mediante regresión lineal (línea de trazos, 30 fmol x h^{-1} x oocito^{-1} x \muM^{-1}). El componente saturable fue adaptado mediante la ecuación de Michaelis Menten (K_{m} 95 \pm 10 \muM, V_{max} 81 \pm 5 pmol x h^{-1} x oocito^{-1}). La línea extendida se calculó por adaptación a una ecuación, que contiene los dos componentes.

La Figura 1d muestra la dependencia con respecto del potencial de la recogida de ^{14}C-TEA en oocitos, a los que se habían inyectado 3 ng de ARNc de OCT1. La recogida de 95 \muM de ^{14}C-TEA se midió en presencia de las concentraciones indicadas de Na^{+}, K^{+} y Ba^{2+}. En estas condiciones, los potenciales de membrana estaban situados entre -40 y -60 mV (100 mM de Na^{+}, 3 mM de K^{+}), de 0 a -10 mV (1 mM de Na^{+}, 102 mM de K^{+}) y entre -18 y -22 mV (100 mM de Na^{+}, 3 mM de K^{+}, 10 mM de Ba^{2+}).

La Figura 1e muestra la recogida de 95 \muM de ^{14}C-TEA en presencia y en ausencia de gradientes de protones en oocitos, a los que se habían inyectado 3 ng de ARNc de OCT1. Con el fin de impedir modificaciones del potencial de membrana, causadas por gradientes de protones, que modifican la recogida de ^{14}C-TEA, las mediciones se llevaron a cabo en presencia de 102 mM de K^{+} y 1 mM de Na^{+} en el medio de incubación. Con ello, el potencial de membrana se llevó a aproximadamente 0 mV. Las mediciones del pH con microelectrodos mostraron que durante el período de recogida de 30 minutos el valor del pH se había modificado en menos de 0,1 unidades.

La Figura 1f muestra la inhibición de la recogida de ^{14}C-TEA producida por OCT1 mediante Decynium 22 (o), quinina (\Delta), desipramina (\oblong), procainamida (\bullet), O-metil-isoprenalina (\diamondsuit) y tetrametilamonio (\blacklozenge). A los oocitos se les inyectaron 5 ng de ARNc de OCT1 y las mediciones se llevaron a cabo con ^{14}C-TEA 95 \muM.

La Figura 2a_{1} muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de la OCT1, que se deriva de ella. Aquellas zonas, que presumiblemente son zonas transmembranales, se subrayaron y los sitios de glicosilación en N potencial del tipo NXT/S se indicaron por asteriscos.

La Figura 2a_{2} muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de un gen humano homólogo procedente del riñón (HOCT1). El trozo de gen representado abarca 1.885 bases y codifica 553 aminoácidos.

La Figura 2a_{3} muestra una secuencia de nucleótidos y aminoácidos de un segundo gen humano homólogo procedente del riñón (HOCT2). El trozo de gen representado abarca 1.856 bases y codifica 555 aminoácidos.

La Figura 2b muestra un análisis de hidrofobia e hidrofilia según Kyte-Doolittle de OCT1 mediando utilización de una ventana de 9 aminoácidos. Las zonas, que presumiblemente son zonas transmembranales, fueron numeradas con 1 a 11.

La Figura 2c muestra una representación esquemática de OCT1. Los radicales de aminoácidos Arg, Lys y His fueron indicados por signos positivos y los radicales de aminoácidos Glu y Asp fueron caracterizados por signos negativos. Los sitios potenciales de glicosilación en el primer bucle hidrófilo son hechos reconocibles.

La Figura 3 muestra la localización de ARNm específicos para OCT1 en diferentes tejidos de ratas y en algunos linajes celulares.

Claims

1. Proteína de transporte, que es responsable del transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos a partir de la sangre en las células epiteliales hepáticas o renales o para el transporte de xenobióticos y/o fármacos catiónicos a partir de los intestinos, caracterizada porque tiene las secuencias de aminoácidos que se representan en las Figuras 2a_{1}, 2a_{2} o 2a_{3}.

2. Secuencia aislada de ADN, caracterizada porque codifica una proteína de transporte de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Utilización de una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, para la producción de un linaje de células epiteliales, que expresa constantemente una proteína de transporte de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Linaje de células epiteliales, que expresa una proteína de transporte de acuerdo con la reivindicación 1.

5. Linaje de células epiteliales de acuerdo con la reivindicación 4, para el ensayo de la segregación renal y biliar que es de esperar, así como de la resorción intestinal de fármacos y/o xenobióticos catiónicos in vitro.

6. Utilización de una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, para el aislamiento de proteínas de transporte homólogas para proteínas de transporte de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque el aislamiento se efectúa con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa.

8. Utilización de las proteínas de transporte de acuerdo con la reivindicación 1 y/o del linaje de células epiteliales de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5 para el desarrollo de moléculas señalizadoras catiónicas, que pueden ser unidas a compuestos biológicamente activos, tales como fármacos, a fin de modificar su segregación renal y biliar o su resorción intestinal.

9. Utilización de la proteína de transporte de acuerdo con la reivindicación 1 y/o del linaje de células epiteliales de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5, para el desarrollo de anticuerpos, con cuya ayuda se puede bloquear la recogida de fármacos en células de túbulos renales, a fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos y/o xenobióticos catiónicos.

10. Utilización de la proteína de transporte de acuerdo con la reivindicación 1 y/o del linaje de células epiteliales de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, para el desarrollo de fármacos específicos, con cuya ayuda se puede bloquear la recogida de otros fármacos y/o xenobióticos en células de túbulos renales, a fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos catiónicos.

11. Utilización de una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, para el desarrollo de una secuencia de nucleótidos antisentido, con cuya ayuda se puede bloquear la recogida de fármacos y/o xenobióticos en células de túbulos renales, a fin de disminuir la nefrotoxicidad de fármacos catiónicos.

12. Utilización de una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 en estuches de ensayo moleculares para el diagnóstico de defectos genéticos moleculares en mecanismos renales y biliares de segregación de cationes.

13. Utilización de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque el estuche de ensayo molecular contiene los componentes que se necesitan para la realización de la reacción en cadena de polimerasa.