JP2002508941A - 哺乳動物ナトリウムチャンネル蛋白質 - Google Patents
哺乳動物ナトリウムチャンネル蛋白質Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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-
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、感覚ニューロン特異的２ａ（ＳＮＳ２ａ）という哺乳動物感覚ニューロンの小直径サブユニットで特異的に見出される電圧依存性ナトリウムイオンチャンネルに関する。それをコードするヌクレオチド、それを含有するベクターおよび宿主細胞も特許請求され、疼痛の軽減および／または過敏症病理の治療で使用できるモジュレーターを同定するための該チャンネルをスクリーニングする方法も含まれる。
Description
【０００１】
本発明は、新規電圧依存性ナトリウムイオンチャンネル（ここに、「ナトリウ
ムチャンネル」という）、それをコードするヌクレオチド、それを含有するベク
ターおよび宿主ならびに疼痛の軽減のために該チャンネルのモジュレーターにつ
きスクリーニングする方法および過敏病理での使用に関する。
ムチャンネル」という）、それをコードするヌクレオチド、それを含有するベク
ターおよび宿主ならびに疼痛の軽減のために該チャンネルのモジュレーターにつ
きスクリーニングする方法および過敏病理での使用に関する。
【０００２】
電圧依存性ナトリウムチャンネルは活動電位の上昇期を担い、それ自体、興奮
性組織において電気的活性を媒介する鍵を演じる。ナトリウムチャンネルは膜の
脱分極に応答して活性化される。これは、休止する閉じた立体配座からの活性立
体配座へのチャンネルの電圧依存性立体配座変化を引き起こし、その結果はナト
リウムイオンに対する膜透過性を増大させる（１．２）。
性組織において電気的活性を媒介する鍵を演じる。ナトリウムチャンネルは膜の
脱分極に応答して活性化される。これは、休止する閉じた立体配座からの活性立
体配座へのチャンネルの電圧依存性立体配座変化を引き起こし、その結果はナト
リウムイオンに対する膜透過性を増大させる（１．２）。
【０００３】 電圧依存性ナトリウムチャンネルは１または２のより小さなベータ（ｂ）サブ
ユニット（ｂ１およびｂ２）と通常は会合した大きな（２３０−２７０ｋＤａ）
高度にグリコシル化されたアルファ（α）サブユニットよりなるマルチ−サブユ
ニット複合体を含む（３）。電圧依存性ナトリウムチャンネルのアルファサブユ
ニットは近年増殖された大きなマルチジーンファミリーを形成し、少なくとも９
つの異なる遺伝子が今日哺乳動物で同定されている（４−１０）。このアルファ
サブユニットは４つの相同ドメイン（ＤＩ−ＩＶ）よりなり、各々は、ポア形成
領域をなす６つの可能なα−らせん膜貫通セグメント（ＳＩ−Ｓ６）を含有する
。該チャンネルの機能に臨界的なドメインは電圧依存性ナトリウムチャンネルの
ファミリーを通じて高度に保存されている。これらはＳ４電圧センサー、該チャ
ンネルの不活化に関与するドメインＩＩＩおよびＩＶの間のループおよびチャン
ネルの前庭およびイオン選択性を担う膜貫通領域Ｓ５およびＳ６の間の細胞外ル
ープのＳＳ１およびＳＳ２セグメントを含む（１１−１３）。ｂサブユニットは
ゲーティングの活性化および不活化の間にナトリウムチャンネルの動力学を変更
する役割を有するようである。ｂサブユニットの発現はピーク電流の増加および
膜へサブユニットを運ぶ役割に関連付けられてきた（１４−１７）。
ユニット（ｂ１およびｂ２）と通常は会合した大きな（２３０−２７０ｋＤａ）
高度にグリコシル化されたアルファ（α）サブユニットよりなるマルチ−サブユ
ニット複合体を含む（３）。電圧依存性ナトリウムチャンネルのアルファサブユ
ニットは近年増殖された大きなマルチジーンファミリーを形成し、少なくとも９
つの異なる遺伝子が今日哺乳動物で同定されている（４−１０）。このアルファ
サブユニットは４つの相同ドメイン（ＤＩ−ＩＶ）よりなり、各々は、ポア形成
領域をなす６つの可能なα−らせん膜貫通セグメント（ＳＩ−Ｓ６）を含有する
。該チャンネルの機能に臨界的なドメインは電圧依存性ナトリウムチャンネルの
ファミリーを通じて高度に保存されている。これらはＳ４電圧センサー、該チャ
ンネルの不活化に関与するドメインＩＩＩおよびＩＶの間のループおよびチャン
ネルの前庭およびイオン選択性を担う膜貫通領域Ｓ５およびＳ６の間の細胞外ル
ープのＳＳ１およびＳＳ２セグメントを含む（１１−１３）。ｂサブユニットは
ゲーティングの活性化および不活化の間にナトリウムチャンネルの動力学を変更
する役割を有するようである。ｂサブユニットの発現はピーク電流の増加および
膜へサブユニットを運ぶ役割に関連付けられてきた（１４−１７）。
【０００４】 電圧依存性ナトリウムチャンネルのほとんどの優れたブロッカーはフグ毒、テト
ロドトキシン（ＴＴＸ）である。ほとんどの電圧依存性ナトリウムチャンネルは
低いナノモル濃度のＴＴＸによって阻害されるが、マイクロモル濃度のＴＴＸに
よってのみ阻害される２つのチャンネルがある。これらは主要な心臓チャンネル
（ｈ１またはＳＫＭ２）および感覚ニューロン特異的チャンネル（ＳＮＳ／ＰＮ
３）である（３、６．７）。
ロドトキシン（ＴＴＸ）である。ほとんどの電圧依存性ナトリウムチャンネルは
低いナノモル濃度のＴＴＸによって阻害されるが、マイクロモル濃度のＴＴＸに
よってのみ阻害される２つのチャンネルがある。これらは主要な心臓チャンネル
（ｈ１またはＳＫＭ２）および感覚ニューロン特異的チャンネル（ＳＮＳ／ＰＮ
３）である（３、６．７）。
【０００５】 哺乳動物神経節後根（ＤＲＧ）細胞の感覚ニューロンは感覚情報を末梢から中
枢神経系に伝達し、伝達依存性ナトリウム電流の少なくとも３つの区別される動
力学タイプを発現することが知られている。小さな直径のニューロンは迅速に不
活化する、速いＴＴＸ−感受性電流および遅く活性化し不活化するＴＴＸ−抵抗
性ナトリウム電流を共発現する。より大きな直径の細胞は中程度の活性化および
不活化動力学を有するＴＴＸ−感受性ナトリウム電流のみを発現する（１９−２
０）。この電気生理学的分析は、今日、分子分布研究によって裏付けられており
、これは、負傷に応答しておよび炎症メディエーターへの暴露に際して、発生の
間に変化できるＤＲＧニューロンにおける電圧依存性ナトリウムチャンネルの動
的発現があることを示唆する（２１−２４）。小さな直径のニューロンはミエリ
ン化されず、疼痛インパルスの伝達に関与し、これらはいわゆるｃ−繊維または
侵害受容ニューロンである（２５）。
枢神経系に伝達し、伝達依存性ナトリウム電流の少なくとも３つの区別される動
力学タイプを発現することが知られている。小さな直径のニューロンは迅速に不
活化する、速いＴＴＸ−感受性電流および遅く活性化し不活化するＴＴＸ−抵抗
性ナトリウム電流を共発現する。より大きな直径の細胞は中程度の活性化および
不活化動力学を有するＴＴＸ−感受性ナトリウム電流のみを発現する（１９−２
０）。この電気生理学的分析は、今日、分子分布研究によって裏付けられており
、これは、負傷に応答しておよび炎症メディエーターへの暴露に際して、発生の
間に変化できるＤＲＧニューロンにおける電圧依存性ナトリウムチャンネルの動
的発現があることを示唆する（２１−２４）。小さな直径のニューロンはミエリ
ン化されず、疼痛インパルスの伝達に関与し、これらはいわゆるｃ−繊維または
侵害受容ニューロンである（２５）。
【０００６】 最近の実験的証拠はナトリウム電流を炎症および神経障害起源双方の慢性疼痛
および過敏病理と関連付けた。例えば、小さな直径の侵害受容ニューロンにおい
ては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびセロトニンのごとき痛覚過敏
剤はＴＴＸ抵抗性ナトリウム電流を増強し、不活化についての閾値を減少させる
（２６−２８）。ニューロン負傷はナトリウムチャンネル発現および分布の劇的
変化を生じ、例えば、病巣軸索の神経腫におけるＴＴＸ−感受性ナトリウムチャ
ンネルの蓄積は異所性放電の形成を担うと考えられている（２９、３０）。各場
合において、ニューロンの過剰興奮性の結果、その感受性化状態が誘導され維持
されるのに寄与するようである。それは、感覚ニューロンにおける電圧依存性ナ
トリウムチャンネルが新規な鎮痛剤および抗−過敏症剤の開発のための高度に制
御でき魅力的な標的を提供できるということになる。
および過敏病理と関連付けた。例えば、小さな直径の侵害受容ニューロンにおい
ては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびセロトニンのごとき痛覚過敏
剤はＴＴＸ抵抗性ナトリウム電流を増強し、不活化についての閾値を減少させる
（２６−２８）。ニューロン負傷はナトリウムチャンネル発現および分布の劇的
変化を生じ、例えば、病巣軸索の神経腫におけるＴＴＸ−感受性ナトリウムチャ
ンネルの蓄積は異所性放電の形成を担うと考えられている（２９、３０）。各場
合において、ニューロンの過剰興奮性の結果、その感受性化状態が誘導され維持
されるのに寄与するようである。それは、感覚ニューロンにおける電圧依存性ナ
トリウムチャンネルが新規な鎮痛剤および抗−過敏症剤の開発のための高度に制
御でき魅力的な標的を提供できるということになる。
【０００７】 この仮定は、各々がナトリウムチャンネルブロッキング活性を持つ麻酔、抗痙
攣および抗不整脈薬物が痛覚脱失を生じ得るという観察によって支持される。例
えば、リグノカインおよびブピボカインのサブ麻酔用量はヒトにおいて疼痛閾値
を上昇させることが認識されている（３１、３２）。加えて、抗痙攣剤、フィニ
トイン、カルバマゼピンおよびクラスＩａ抗不整脈剤メキシリテンは神経障害疼
痛で臨床的に使用される（３３−３５）。抗痙攣剤ラモトリジンもまた弱く鎮痛
性である（３６）。
攣および抗不整脈薬物が痛覚脱失を生じ得るという観察によって支持される。例
えば、リグノカインおよびブピボカインのサブ麻酔用量はヒトにおいて疼痛閾値
を上昇させることが認識されている（３１、３２）。加えて、抗痙攣剤、フィニ
トイン、カルバマゼピンおよびクラスＩａ抗不整脈剤メキシリテンは神経障害疼
痛で臨床的に使用される（３３−３５）。抗痙攣剤ラモトリジンもまた弱く鎮痛
性である（３６）。
【０００８】
本発明は哺乳動物感覚ニューロンの小直径サブユニットで特異的に見出された
新規電圧依存性ナトリウムチャンネルを提供する。この新規なチャンネルは感覚
ニューロン特異的２ａ（ＳＮＳ２ａ）と呼ばれるであろう。以後「ＳＮＳ２ａ」
と呼ぶ用語は主としてラットＳＮＳ２ａを意味するが、また該チャンネルのヒト
形態もいうことができる。
新規電圧依存性ナトリウムチャンネルを提供する。この新規なチャンネルは感覚
ニューロン特異的２ａ（ＳＮＳ２ａ）と呼ばれるであろう。以後「ＳＮＳ２ａ」
と呼ぶ用語は主としてラットＳＮＳ２ａを意味するが、また該チャンネルのヒト
形態もいうことができる。
【０００９】 ＳＮＳ２ａラットｃＤＮＡのヌクレオチド配列分析（配列番号：１）は１７６
５アミノ酸蛋白質をコードする５２９８ｂｐオープンリーディングフレームを明
らかにする（配列番号：２）。この推定蛋白質配列は電圧依存性ナトリウムチャ
ンネル遺伝子ファミリーに関連する特徴的特徴の多くを共有し、例えば、ＳＮＳ
２ａは、各々が６つの推定膜にわたるセグメントを含む４つの相同反復ドメイン
を含有する。セリン残基（Ｓ−３５５）はＴＴＸ感受性に臨界的な部位に見出さ
れ、ＳＮＳ／ＰＮ３での実験に基づき、この残基はクローンＳＮＳ２ａにＴＴＸ
抵抗性を付与するはずである（３７）。第１および第２反復ドメインを結合する
予測された第１細胞内ループ領域は、ＳＮＳ／ＰＮ３、心臓チャンネルおよび脳
チャンネルを含めた他の電圧依存性ナトリウムチャンネルの多くにおいて対応す
る領域よりもかなり短い。電圧依存性ナトリウムチャンネル遺伝子ファミリーの
他のメンバーに対するＳＮＳ２ａのコンピューター生成整列は、このイオンチャ
ンネルが今日同定されているチャンネルのいずれとも区別されることを示す。
５アミノ酸蛋白質をコードする５２９８ｂｐオープンリーディングフレームを明
らかにする（配列番号：２）。この推定蛋白質配列は電圧依存性ナトリウムチャ
ンネル遺伝子ファミリーに関連する特徴的特徴の多くを共有し、例えば、ＳＮＳ
２ａは、各々が６つの推定膜にわたるセグメントを含む４つの相同反復ドメイン
を含有する。セリン残基（Ｓ−３５５）はＴＴＸ感受性に臨界的な部位に見出さ
れ、ＳＮＳ／ＰＮ３での実験に基づき、この残基はクローンＳＮＳ２ａにＴＴＸ
抵抗性を付与するはずである（３７）。第１および第２反復ドメインを結合する
予測された第１細胞内ループ領域は、ＳＮＳ／ＰＮ３、心臓チャンネルおよび脳
チャンネルを含めた他の電圧依存性ナトリウムチャンネルの多くにおいて対応す
る領域よりもかなり短い。電圧依存性ナトリウムチャンネル遺伝子ファミリーの
他のメンバーに対するＳＮＳ２ａのコンピューター生成整列は、このイオンチャ
ンネルが今日同定されているチャンネルのいずれとも区別されることを示す。
【００１０】 従って、本発明の１つの態様は配列番号：２に記載された単離された哺乳動物
感覚ニューロンナトリウムチャンネル蛋白質を提供する。好ましくは、本発明の
該ナトリウムチャンネルは神経節後根のニューロンで見出される。該ナトリウム
チャンネル蛋白質はいずれの哺乳動物種、例えばラットまたはヒトからの得るこ
とができる。
感覚ニューロンナトリウムチャンネル蛋白質を提供する。好ましくは、本発明の
該ナトリウムチャンネルは神経節後根のニューロンで見出される。該ナトリウム
チャンネル蛋白質はいずれの哺乳動物種、例えばラットまたはヒトからの得るこ
とができる。
【００１１】 ナトリウムチャンネルＳＮＳ２ａの変異体は本発明に含まれる。かかる変異体
は断片、アナログ、誘導体およびスライス変異体を含む。用語「変異体」とは、
ＳＮＳ２ａと同一の生物学的機能または活性を実質的に保持する蛋白質または蛋
白質の一部をいう。
は断片、アナログ、誘導体およびスライス変異体を含む。用語「変異体」とは、
ＳＮＳ２ａと同一の生物学的機能または活性を実質的に保持する蛋白質または蛋
白質の一部をいう。
【００１２】 断片は例えばスクリーニングにおいて効果的な元の蛋白質の十分な同一性を保
持するＳＮＳ２ａの一部を含む。かかる断片は全長蛋白質の同定のために後に記
載するもののごときプローブであり得る。断片は他のアミノ酸または蛋白質に融
合させることができる（いわゆる「融合」蛋白質）か、あるいはより大きな蛋白
質内に含ませることができる。かかる断片は宿主での発現のために設計された前
駆体蛋白質内に含ませることができる。従って、１つの態様において、用語断片
はＳＮＳ２ａに由来する融合蛋白質またはポリペプチドの一部または複数の一部
を意味する。
持するＳＮＳ２ａの一部を含む。かかる断片は全長蛋白質の同定のために後に記
載するもののごときプローブであり得る。断片は他のアミノ酸または蛋白質に融
合させることができる（いわゆる「融合」蛋白質）か、あるいはより大きな蛋白
質内に含ませることができる。かかる断片は宿主での発現のために設計された前
駆体蛋白質内に含ませることができる。従って、１つの態様において、用語断片
はＳＮＳ２ａに由来する融合蛋白質またはポリペプチドの一部または複数の一部
を意味する。
【００１３】 また、断片は蛋白質の構造的または機能的属性によって特徴付けられるＳＮＳ
２ａの一部も含む。これらは同様のまたは改良された化学的または生物学的活性
あるいは減少した副作用活性を有し得る。例えば、断片はアルファらせんまたは
アルファ−らせん形成領域、ベータシートおよびベーターシート形成領域、ター
ンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル−形成領域、親水性領域、疎水性
領域、両親媒性領域（アルファまたはベータ）、柔軟性領域、表面−形成領域、
基質結合領域および高抗原性指標の領域を含み得る。
２ａの一部も含む。これらは同様のまたは改良された化学的または生物学的活性
あるいは減少した副作用活性を有し得る。例えば、断片はアルファらせんまたは
アルファ−らせん形成領域、ベータシートおよびベーターシート形成領域、ター
ンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル−形成領域、親水性領域、疎水性
領域、両親媒性領域（アルファまたはベータ）、柔軟性領域、表面−形成領域、
基質結合領域および高抗原性指標の領域を含み得る。
【００１４】 断片または一部はペプチド合成によって対応する全長蛋白質を生産するのに使
用することができる。
用することができる。
【００１５】 誘導体は天然に生じる対立遺伝子変異体を含む。対立遺伝子変異体は当該蛋白
質の機能を改変しない１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転位または付加を
有し得る蛋白質配列の別の形態である。また、誘導体は、多数のアミノ酸が置換
、欠失または付加された非天然蛋白質または断片でもあり得る。ＳＮＳ２ａに対
して少なくとも７０％の同一性を有する蛋白質または断片は本発明に含まれる。
好ましくは、同一性は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、な
おより好ましくは少なくともまたは９５％を超える同一性、例えば、ＳＮＳ２ａ
に対して９７％、９８％または９９％同一性である。
質の機能を改変しない１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転位または付加を
有し得る蛋白質配列の別の形態である。また、誘導体は、多数のアミノ酸が置換
、欠失または付加された非天然蛋白質または断片でもあり得る。ＳＮＳ２ａに対
して少なくとも７０％の同一性を有する蛋白質または断片は本発明に含まれる。
好ましくは、同一性は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、な
おより好ましくは少なくともまたは９５％を超える同一性、例えば、ＳＮＳ２ａ
に対して９７％、９８％または９９％同一性である。
【００１６】 アナログは限定されるものではないが活性成熟蛋白質またはポリエチレングリ
コールまたはリーダー／分泌配列のごとき化合物との融合を生じさせて精製を助
ける前駆体蛋白質の切断によって達成することができる前駆体蛋白質を含む。
コールまたはリーダー／分泌配列のごとき化合物との融合を生じさせて精製を助
ける前駆体蛋白質の切断によって達成することができる前駆体蛋白質を含む。
【００１７】 スプライス変異体はコーディング領域内に付加または欠失を含有する、ｍＲＮ
Ａの別のスプライシングによって生じた、同一遺伝子の蛋白質産物である（Ｌｅ
ｗｉｎ Ｎ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｖ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，イングランド）。本発明は天然に生じ、ナトリウ
ムチャンネルの活性化閾値を変化させるにおいて役割を演じ得るＳＮＳ２ａナト
リウムチャンネルのスプライス変異体を提供する。
Ａの別のスプライシングによって生じた、同一遺伝子の蛋白質産物である（Ｌｅ
ｗｉｎ Ｎ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｖ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，イングランド）。本発明は天然に生じ、ナトリウ
ムチャンネルの活性化閾値を変化させるにおいて役割を演じ得るＳＮＳ２ａナト
リウムチャンネルのスプライス変異体を提供する。
【００１８】 本発明の蛋白質または変異体は組換え蛋白質、天然蛋白質または合成蛋白質、
好ましくは組換え蛋白質であり得る。
好ましくは組換え蛋白質であり得る。
【００１９】 本発明のさらなる態様は、前記した哺乳動物ナトリウムチャンネルをコードす
る単離されたおよび／または精製されたヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡまた
はＲＮＡまたはその変異体を提供する。また、アンチセンスヌクレオチドまたは
相補的ストランドも本発明に含まれる。
る単離されたおよび／または精製されたヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡまた
はＲＮＡまたはその変異体を提供する。また、アンチセンスヌクレオチドまたは
相補的ストランドも本発明に含まれる。
【００２０】 好ましくは、ヌクレオチド配列はラットまたはトナトリウムチャンネルをコー
ドする。ヌクレオチド配列は配列番号：１に示されたヌクレオチド配列のコーデ
ィング部分の配列を含み得る。
ドする。ヌクレオチド配列は配列番号：１に示されたヌクレオチド配列のコーデ
ィング部分の配列を含み得る。
【００２１】 本発明のナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列は哺乳動物感覚
ニューロン、好ましくは神経節後根に由来するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリ
ーに由来し得る。
ニューロン、好ましくは神経節後根に由来するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリ
ーに由来し得る。
【００２２】 ヌクレオチド配列は、ラットまたはヒトナトリウムチャンネル配列に由来する
プローブでスクリーニングすることによって、あるいは例えばラットまたはヒト
ナトリウムチャンネル配列および／または公知の電圧依存性ナトリウムチャンネ
ルの比較的保存された領域に由来するまたはそれに基づいて設計された適当なオ
リゴヌクレオチドプライマーでゲノムＤＮＡに対して、ポリマー鎖反応（ＰＣＲ
）のごとき当該分野で知られた他の方法によって哺乳動物細胞（好ましくは、ヒ
ト細胞）から単離することができる。細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）は
スクリーニング目的でラットまたはヒトＤＮＡを用いて生成させることができる
。
プローブでスクリーニングすることによって、あるいは例えばラットまたはヒト
ナトリウムチャンネル配列および／または公知の電圧依存性ナトリウムチャンネ
ルの比較的保存された領域に由来するまたはそれに基づいて設計された適当なオ
リゴヌクレオチドプライマーでゲノムＤＮＡに対して、ポリマー鎖反応（ＰＣＲ
）のごとき当該分野で知られた他の方法によって哺乳動物細胞（好ましくは、ヒ
ト細胞）から単離することができる。細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）は
スクリーニング目的でラットまたはヒトＤＮＡを用いて生成させることができる
。
【００２３】 本発明のヌクレオチド配列はＲＮＡ形態、あるいはそのＤＮＡがｃＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本
鎖または一本鎖であってよく、もし一本鎖であれば、コーディングストランドま
たは非コーディング（アンチセンス）ストランドでよい。ナトリウムチャンネル
またはその変異体をコードするコーディング配列は配列番号：１に記載されたコ
ーディング配列と同一であってよく：あるいは遺伝暗号の縮重の結果、そこに記
載された配列と同一の蛋白質をコードする異なるコーディング配列であってもよ
い。
ノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本
鎖または一本鎖であってよく、もし一本鎖であれば、コーディングストランドま
たは非コーディング（アンチセンス）ストランドでよい。ナトリウムチャンネル
またはその変異体をコードするコーディング配列は配列番号：１に記載されたコ
ーディング配列と同一であってよく：あるいは遺伝暗号の縮重の結果、そこに記
載された配列と同一の蛋白質をコードする異なるコーディング配列であってもよ
い。
【００２４】 ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列は、全長蛋白
質のためのコーディング配列またはそのいずれかの変異体；全長蛋白質のための
コーディング配列またはそのいずれかの変異体およびリーダーまたは分泌配列ま
たはプロ配列のごときさらなるコーディング配列：全長蛋白質のためのコーディ
ング配列またはその変異体（および所望によりさらなるコーディング配列）なら
びにイントロンまたは全長蛋白質のためのコーディング配列の５’および／３’
側の非コーディング配列を含み得る。
質のためのコーディング配列またはそのいずれかの変異体；全長蛋白質のための
コーディング配列またはそのいずれかの変異体およびリーダーまたは分泌配列ま
たはプロ配列のごときさらなるコーディング配列：全長蛋白質のためのコーディ
ング配列またはその変異体（および所望によりさらなるコーディング配列）なら
びにイントロンまたは全長蛋白質のためのコーディング配列の５’および／３’
側の非コーディング配列を含み得る。
【００２５】 また、本発明は、ＳＮＳ２ａをコードするヌクレオチド変異体、アナログおよ
び断片を提供する。好ましくは、ＳＮＳ２ａに対してその全長にわたり少なくと
も７０％の同一性を有するヌクレオチドが含まれる。より好ましいものはＳＮＳ
２ａに対してその全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有する配列であるる
なおより好ましいものは、ＳＮＳ２ａに対しその全長にわたり少なくとも９０％
、例えば、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すポリヌクレオチ
ドである。
び断片を提供する。好ましくは、ＳＮＳ２ａに対してその全長にわたり少なくと
も７０％の同一性を有するヌクレオチドが含まれる。より好ましいものはＳＮＳ
２ａに対してその全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有する配列であるる
なおより好ましいものは、ＳＮＳ２ａに対しその全長にわたり少なくとも９０％
、例えば、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すポリヌクレオチ
ドである。
【００２６】 また、本発明は、ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネル蛋白質またはその変異体の
ヌクレオチド配列から構築されたヌクレオチドプローブに関する。かかるプロー
ブはＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列を単離する
ために神経節後根ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするのに
利用することができる。ヌクレオチドプローブはＳＮＳ２ａナトリウムチャンネ
ルの発現を検出し、または実施例に記載されたごとくに例えば蛍光イン・サイチ
ュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて染色体上の存在を突き止めるた
めのアッセイにおいてｍＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせるのに有用な
ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルまたはその変異体のヌクレオチド配列の一部を
含むことができる。
ヌクレオチド配列から構築されたヌクレオチドプローブに関する。かかるプロー
ブはＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列を単離する
ために神経節後根ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするのに
利用することができる。ヌクレオチドプローブはＳＮＳ２ａナトリウムチャンネ
ルの発現を検出し、または実施例に記載されたごとくに例えば蛍光イン・サイチ
ュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて染色体上の存在を突き止めるた
めのアッセイにおいてｍＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせるのに有用な
ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルまたはその変異体のヌクレオチド配列の一部を
含むことができる。
【００２７】 また、本発明のヌクレオチド配列は、ヘキサ−ヒスチジンタグまたはヘマトグ
ルチニン（ＨＡ）タグのごとき本発明の蛋白質の精製を可能とする、あるいはＳ
ＮＳ２ａの効果的ブロックまたはその変調のスクリーニングアッセイでの測定を
可能とするマーカー配列にインフレームで融合したコーディング配列を有し得る
。
ルチニン（ＨＡ）タグのごとき本発明の蛋白質の精製を可能とする、あるいはＳ
ＮＳ２ａの効果的ブロックまたはその変調のスクリーニングアッセイでの測定を
可能とするマーカー配列にインフレームで融合したコーディング配列を有し得る
。
【００２８】 ＳＮＳ２ａにあるいはそれに対して相補的なヌクレオチドにハイブリダイズす
るヌクレオチド配列もまた本発明の一部を形成する。時々使用されるストリンジ
ェントハイブリダイゼーション条件の１つの例は試みられたハイブリダイゼーシ
ョンが約０．９モラーである塩溶液を用いて約３５℃ないし約６５℃の温度で行
われる場合である。しかしながら、当業者であれば、適当にはかかる条件を変化
させてプローブ長さ、塩基組成、存在するイオンのタイプ等のごとき変数を考慮
することができる。
るヌクレオチド配列もまた本発明の一部を形成する。時々使用されるストリンジ
ェントハイブリダイゼーション条件の１つの例は試みられたハイブリダイゼーシ
ョンが約０．９モラーである塩溶液を用いて約３５℃ないし約６５℃の温度で行
われる場合である。しかしながら、当業者であれば、適当にはかかる条件を変化
させてプローブ長さ、塩基組成、存在するイオンのタイプ等のごとき変数を考慮
することができる。
【００２９】 本発明のヌクレオチド配列は組換え技術によってＳＮＳ２ａナトリウムチャン
ネル蛋白質またはその変異体を生産するのに使用することができる。かくして、
例えば、該ヌクレオチド配列は種々の発現ビーイクルまたはクローニングビーイ
クル、特に蛋白質を発現させるためのベクターまたはプラスミドのうちのいずれ
か１つに含ませることができる。かかるベクターは染色体、非染色体および合成
ＤＮＡ配列を含む。適当なベクターの例は細菌プラスミド：ファージＤＮＡ：酵
母プラスミド：プラスミドおよびファージＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの組合せ
に由来するベクターを含む。しかしながら、いずれの他のプラスミドまたはベク
ターも、それが宿主で複製可能であり、生きている限り使用することができる。
ネル蛋白質またはその変異体を生産するのに使用することができる。かくして、
例えば、該ヌクレオチド配列は種々の発現ビーイクルまたはクローニングビーイ
クル、特に蛋白質を発現させるためのベクターまたはプラスミドのうちのいずれ
か１つに含ませることができる。かかるベクターは染色体、非染色体および合成
ＤＮＡ配列を含む。適当なベクターの例は細菌プラスミド：ファージＤＮＡ：酵
母プラスミド：プラスミドおよびファージＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの組合せ
に由来するベクターを含む。しかしながら、いずれの他のプラスミドまたはベク
ターも、それが宿主で複製可能であり、生きている限り使用することができる。
【００３０】 より具体的には、また、本発明は前記したヌクレオチド配列の１以上を含む組
換え構築体も提供する。該構築体は、その中に本発明の配列が順方向または逆方
向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターのごとき発現ベクターを含む
。この実施形態の好ましい態様において、該構築体は、さらに、例えば、当該配
列に作動可能に連結されたプロモーターを含めた、ｍＲＮＡ合成を指令するため
の１以上の調節配列を含む。適当なプロモーターは：ＣＭＶ、ＬＴＲまたはＳＶ
４０プロモーターおよび原核生物または真核生物細胞またはそのウイルスにおい
て遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを含む。発現ベ
クターはエンハンサーおよび翻訳開始のためのリボソーム結合部位およびターミ
ネーターを含有することができる。
換え構築体も提供する。該構築体は、その中に本発明の配列が順方向または逆方
向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターのごとき発現ベクターを含む
。この実施形態の好ましい態様において、該構築体は、さらに、例えば、当該配
列に作動可能に連結されたプロモーターを含めた、ｍＲＮＡ合成を指令するため
の１以上の調節配列を含む。適当なプロモーターは：ＣＭＶ、ＬＴＲまたはＳＶ
４０プロモーターおよび原核生物または真核生物細胞またはそのウイルスにおい
て遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを含む。発現ベ
クターはエンハンサーおよび翻訳開始のためのリボソーム結合部位およびターミ
ネーターを含有することができる。
【００３１】 非常に多数の適当なベクターおよびプロモーター／エンハンサーが当業者に知
られているが、いずれのプラスミドまたはベクター、プロモーター／エンハンサ
ーもそれが宿主内で複製可能であり機能的である限り使用することができる。
られているが、いずれのプラスミドまたはベクター、プロモーター／エンハンサ
ーもそれが宿主内で複製可能であり機能的である限り使用することができる。
【００３２】 原核生物および真核生物で使用される適当なコローニングおよび発現ベクター
は哺乳動物発現ベクター、昆虫発現ベクター、酵母発現ベクター、細菌発現ベク
ターおよびウイルス発現ベクターを含み、これらはＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されて
いる。好ましいベクターはｐＢＫ−ＣＭＶである。
は哺乳動物発現ベクター、昆虫発現ベクター、酵母発現ベクター、細菌発現ベク
ターおよびウイルス発現ベクターを含み、これらはＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されて
いる。好ましいベクターはｐＢＫ−ＣＭＶである。
【００３３】 また、ベクターは発現の選択および／または増幅のための適当な配列を含む。
このため、ベクターは１以上の表現型選択／増幅マーカーを含むであろう。かか
るマーカーもまた当業者によく知られている。
このため、ベクターは１以上の表現型選択／増幅マーカーを含むであろう。かか
るマーカーもまた当業者によく知られている。
【００３４】 さらなる実施形態において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を発現する
ことができる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞のごとき
高等真核生物細胞または酵母細胞のごちき下等真核生物細胞または細菌細胞のご
とき原核生物細胞であり得る。形質転換のための適当な原核生物宿主はＥ．ｃｏ
ｌｉを含む。適当な真核生物はＨＥＫ２９３細胞を含む。
ことができる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞のごとき
高等真核生物細胞または酵母細胞のごちき下等真核生物細胞または細菌細胞のご
とき原核生物細胞であり得る。形質転換のための適当な原核生物宿主はＥ．ｃｏ
ｌｉを含む。適当な真核生物はＨＥＫ２９３細胞を含む。
【００３５】 無細胞翻訳系を使用して、本発明のＤＮＡ構築体に由来するＲＮＡを用いてか
かる蛋白質を生産することもできる。
かる蛋白質を生産することもできる。
【００３６】 硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィーおよびレクチンク
ロマトグラフィーを含めた、当該分野で知られた方法によって組換え細胞培養か
らＳＮＳ２ａナトリウムチャンネル蛋白質を回収し、精製する。要すれば、成熟
蛋白質の競合立体配置において、蛋白質再折り畳み工程を使用することができる
。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程で使用す
ることができる。
換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィーおよびレクチンク
ロマトグラフィーを含めた、当該分野で知られた方法によって組換え細胞培養か
らＳＮＳ２ａナトリウムチャンネル蛋白質を回収し、精製する。要すれば、成熟
蛋白質の競合立体配置において、蛋白質再折り畳み工程を使用することができる
。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程で使用す
ることができる。
【００３７】 本発明の蛋白質およびヌクレオチド配列は、好ましくは、単離された形態で提
供される。用語「単離された」は、当該物質が元の環境から取り出されたことを
意味する（例えば、天然に生じるヌクレオチド配列または生きた動物に存在する
蛋白質は単離されないが、それが天然系で共に存在する物質のいくらかまたは全
てから分離された、同ヌクレオチド配列または蛋白質は単離される）。かかるヌ
クレオチド配列はベクターの一部であり得るかおよび／またはかかるヌクレオチ
ド配列または蛋白質は組成物の一部であり得、かかるベクターまたは組成物がそ
の天然環境の一部ではないように依然として単離されている）。また、本発明の
蛋白質およびヌクレオチド配列は、好ましくは、精製された形態で提供され、好
ましくは、少なくとも５０％純度、より好ましくは約７５％、最も好ましくは９
０％純度または９５％、９８％純粋のごときそれ以上まで精製される。
供される。用語「単離された」は、当該物質が元の環境から取り出されたことを
意味する（例えば、天然に生じるヌクレオチド配列または生きた動物に存在する
蛋白質は単離されないが、それが天然系で共に存在する物質のいくらかまたは全
てから分離された、同ヌクレオチド配列または蛋白質は単離される）。かかるヌ
クレオチド配列はベクターの一部であり得るかおよび／またはかかるヌクレオチ
ド配列または蛋白質は組成物の一部であり得、かかるベクターまたは組成物がそ
の天然環境の一部ではないように依然として単離されている）。また、本発明の
蛋白質およびヌクレオチド配列は、好ましくは、精製された形態で提供され、好
ましくは、少なくとも５０％純度、より好ましくは約７５％、最も好ましくは９
０％純度または９５％、９８％純粋のごときそれ以上まで精製される。
【００３８】 また、本発明は、ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルにつき特異的な抗体も提供
する。本明細書で用いる用語抗体は全ての免疫グロブリンおよび本発明の蛋白質
の抗原決定基のための認識部位を含有するその断片を含む。本発明の抗体はポリ
クローナルであるか好ましくはモノクローナルであってよく、無傷抗体分子また
は抗体の活性結合領域、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２を含有する断片であ
ってよい。また、本発明はキメラ一本鎖およびヒト化抗体および非免疫グロブリ
ン分子との融合を含む。当該分野で知られた種々の手法をかかる抗体および断片
の生産で用いることができる。
する。本明細書で用いる用語抗体は全ての免疫グロブリンおよび本発明の蛋白質
の抗原決定基のための認識部位を含有するその断片を含む。本発明の抗体はポリ
クローナルであるか好ましくはモノクローナルであってよく、無傷抗体分子また
は抗体の活性結合領域、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２を含有する断片であ
ってよい。また、本発明はキメラ一本鎖およびヒト化抗体および非免疫グロブリ
ン分子との融合を含む。当該分野で知られた種々の手法をかかる抗体および断片
の生産で用いることができる。
【００３９】 蛋白質、その変異体、特にその断片、誘導体またはアナログ、またはそれを発
現する細胞を、それに対する抗体を生産するための免疫原として用いることがで
きる。ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルに対して生成する抗体を、動物、好まし
くは非ヒト哺乳動物へのポリペプチドの直接的注入によって得ることができる。
次いで、かく得られた抗体は蛋白質それ自体に結合するであろう。このようにし
て、次いで、本発明の断片のみをコードする配列でさえ全天然蛋白質に結合する
抗体を創製するのに使用することができる。次いで、かかる抗体を用いてその蛋
白質を発現する組織において蛋白質を突き止めることができる。
現する細胞を、それに対する抗体を生産するための免疫原として用いることがで
きる。ＳＮＳ２ａナトリウムチャンネルに対して生成する抗体を、動物、好まし
くは非ヒト哺乳動物へのポリペプチドの直接的注入によって得ることができる。
次いで、かく得られた抗体は蛋白質それ自体に結合するであろう。このようにし
て、次いで、本発明の断片のみをコードする配列でさえ全天然蛋白質に結合する
抗体を創製するのに使用することができる。次いで、かかる抗体を用いてその蛋
白質を発現する組織において蛋白質を突き止めることができる。
【００４０】 また、本発明の抗体はＳＮＳ２ａ蛋白質を精製するのに興味深く、従って、Ｓ
ＮＳ２ａまたはそのいずれかの一部を精製する方法が提供され、その方法は本発
明の抗体を使用することを含む。
ＮＳ２ａまたはそのいずれかの一部を精製する方法が提供され、その方法は本発
明の抗体を使用することを含む。
【００４１】 また、本発明はナトリウムチャンネルのモジュレーターを同定する方法を提供
する。非常に多数の化合物を研究するのを可能するスクリーニングがＳＮＳ２ａ
につき確立されている。高スループットスクリーニングは後記にてより詳細に記
載する１４Ｃグアニジンフラックスアッセイおよび蛍光ベースアッセイに基づく
ことができる。二次スクリーニングはナトリウムチャンネルを阻害し、ブロック
し、またはそうでなければそれと相互作用する小分子、抗体、ペプチド、蛋白質
または他のタイプまたは化合物を同定するためにパッチクランプ技術または２電
極電圧クランプを利用する電気生理学的アッセイを含むことができる。三次スク
リーニングは、よく特徴付けられたラットおよびマウスモデルにおけるモジュレ
ーターの研究を含むことができる。疼痛のこれらのモデルは限定されるものでは
ないがカラギーナン、ホルマリンおよびフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ
）のごとき炎症剤の足底内注入を含む。座骨神経の緩い結紮のごとき神経障害疼
痛のモデルもまた含まれる。
する。非常に多数の化合物を研究するのを可能するスクリーニングがＳＮＳ２ａ
につき確立されている。高スループットスクリーニングは後記にてより詳細に記
載する１４Ｃグアニジンフラックスアッセイおよび蛍光ベースアッセイに基づく
ことができる。二次スクリーニングはナトリウムチャンネルを阻害し、ブロック
し、またはそうでなければそれと相互作用する小分子、抗体、ペプチド、蛋白質
または他のタイプまたは化合物を同定するためにパッチクランプ技術または２電
極電圧クランプを利用する電気生理学的アッセイを含むことができる。三次スク
リーニングは、よく特徴付けられたラットおよびマウスモデルにおけるモジュレ
ーターの研究を含むことができる。疼痛のこれらのモデルは限定されるものでは
ないがカラギーナン、ホルマリンおよびフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ
）のごとき炎症剤の足底内注入を含む。座骨神経の緩い結紮のごとき神経障害疼
痛のモデルもまた含まれる。
【００４２】 従って、本発明は、テスト化合物をナトリウムチャンネルと接触させ、ナトリ
ウムチャンネルの活性または不活性を検出することを特徴とするモジュレーター
につきアッセイする方法を提供する。好ましくは、モジュレーターを同定する方
法またはスクリーニングアッセイは、ナトリウムチャンネルを発現する形質転換
宿主細胞を使用する。典型的には、かかるアッセイはテスト化合物によるナトリ
ウムチャンネルの活性の変化を検出し、かくして、ナトリウムチャンネルのモジ
ュレーターを同定する。
ウムチャンネルの活性または不活性を検出することを特徴とするモジュレーター
につきアッセイする方法を提供する。好ましくは、モジュレーターを同定する方
法またはスクリーニングアッセイは、ナトリウムチャンネルを発現する形質転換
宿主細胞を使用する。典型的には、かかるアッセイはテスト化合物によるナトリ
ウムチャンネルの活性の変化を検出し、かくして、ナトリウムチャンネルのモジ
ュレーターを同定する。
【００４３】 例えば、ナトリウムチャンネルを発現する宿主細胞を、実施例および当該分野
で記載された、２２Ｎａ＋イオンフラックスおよび１４Ｃグアニジンイオンアッ
セイのごときイオンフラックスアッセイ、ならびにＬｅｖｉら（１９９４）Ｊ．
Ｃｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５−２４
１−２５７に記載されたＳＦＢＩ蛍光ナトリウムチャンネルインキュベーターア
ッセイおよびＤｉＢＡＣのごとき電圧検知染料で使用することができる。ＳＮＳ
２ａナトリウムチャンネルを発現する宿主細胞を、Ｓｈｅｌｄｏｎら（１９８６
）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３０：６１７−６２３に記
載された３−Ｈ−バトラコトキシン結合アッセイ；Ｒｏｇａｒｔら（１９８３）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１１０６−１１１０に
記載された３−Ｈ−サキシトキシンアッセイ；およびＷｅｓｔら（１９９２）Ｎ
ｅｕｒｏｎ ８：５９−７０に記載されたスコルピオントキシンアッセイのごと
き結合アッセイで使用することができる。
で記載された、２２Ｎａ＋イオンフラックスおよび１４Ｃグアニジンイオンアッ
セイのごときイオンフラックスアッセイ、ならびにＬｅｖｉら（１９９４）Ｊ．
Ｃｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ５−２４
１−２５７に記載されたＳＦＢＩ蛍光ナトリウムチャンネルインキュベーターア
ッセイおよびＤｉＢＡＣのごとき電圧検知染料で使用することができる。ＳＮＳ
２ａナトリウムチャンネルを発現する宿主細胞を、Ｓｈｅｌｄｏｎら（１９８６
）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３０：６１７−６２３に記
載された３−Ｈ−バトラコトキシン結合アッセイ；Ｒｏｇａｒｔら（１９８３）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１１０６−１１１０に
記載された３−Ｈ−サキシトキシンアッセイ；およびＷｅｓｔら（１９９２）Ｎ
ｅｕｒｏｎ ８：５９−７０に記載されたスコルピオントキシンアッセイのごと
き結合アッセイで使用することができる。
【００４４】 一般に、テスト化合物をアッセイに添加し、ナトリウムフラックスに対するそ
の効果を測定するか、あるいはナトリウムチャンネルに競合的に結合するテスト
化合物の能力を評価する。次いで、ナトリウムチャンネルに対して所望の効果を
有するテスト化合物を選択する。
の効果を測定するか、あるいはナトリウムチャンネルに競合的に結合するテスト
化合物の能力を評価する。次いで、ナトリウムチャンネルに対して所望の効果を
有するテスト化合物を選択する。
【００４５】 ナトリウムチャンネルのモジュレーターは感覚ニューロンに沿ってインパルス
の伝達を妨害しまたは妨げ、それにより、急性、慢性または神経神経障害性疼痛
の治療で、すなわち、鎮痛効果の生産で、および過敏症病理の治療で有用である
。本発明のモジュレーターおよびそれを含む医薬もまた炎症性疾患、例えば、慢
性関節リウマチのごとき関節炎疾患に関連する疼痛の治療で特に有用であり得る
。従って、本発明は、治療で使用される前記方法によって同定可能な前記蛋白質
またはその変異体のモジュレーターを提供する。さらに、本発明は、鎮痛または
抗−過敏症医薬の製造のための前記方法によって所望により同定可能なナトリウ
ムチャンネル蛋白質のモジュレーターの使用を提供する。かかる医薬は、典型的
には、知られており、許容される医薬プラクティスで要求される安定化剤、保存
剤等と共に有効量のモジュレーターを含む医薬組成物である。有効量のモジュレ
ーター、すなわち、治療上有効量は当業者に知られたルーチン的方法に従って決
定することができる。本発明は、さらに、有効量の前記した蛋白質のモジュレー
ターを患者に投与することを特徴とする治療方法を提供する。治療プロトコルは
、治療すべき疾患の重症度を含めた多数の考慮に依存し、かかる考慮は主治医の
考慮の範囲内のものである。また、本発明のモジュレーターは、出典明示してそ
の全内容を本明細書の一部とみなし、読者が特に言及するＰＣＴ／ＧＢ９６／０
１５２３に開示されたイオンチャンネルのモジュレーターと組み合わせて、例え
ば、それと同時に、順次にまたは別々に使用することもできる。
の伝達を妨害しまたは妨げ、それにより、急性、慢性または神経神経障害性疼痛
の治療で、すなわち、鎮痛効果の生産で、および過敏症病理の治療で有用である
。本発明のモジュレーターおよびそれを含む医薬もまた炎症性疾患、例えば、慢
性関節リウマチのごとき関節炎疾患に関連する疼痛の治療で特に有用であり得る
。従って、本発明は、治療で使用される前記方法によって同定可能な前記蛋白質
またはその変異体のモジュレーターを提供する。さらに、本発明は、鎮痛または
抗−過敏症医薬の製造のための前記方法によって所望により同定可能なナトリウ
ムチャンネル蛋白質のモジュレーターの使用を提供する。かかる医薬は、典型的
には、知られており、許容される医薬プラクティスで要求される安定化剤、保存
剤等と共に有効量のモジュレーターを含む医薬組成物である。有効量のモジュレ
ーター、すなわち、治療上有効量は当業者に知られたルーチン的方法に従って決
定することができる。本発明は、さらに、有効量の前記した蛋白質のモジュレー
ターを患者に投与することを特徴とする治療方法を提供する。治療プロトコルは
、治療すべき疾患の重症度を含めた多数の考慮に依存し、かかる考慮は主治医の
考慮の範囲内のものである。また、本発明のモジュレーターは、出典明示してそ
の全内容を本明細書の一部とみなし、読者が特に言及するＰＣＴ／ＧＢ９６／０
１５２３に開示されたイオンチャンネルのモジュレーターと組み合わせて、例え
ば、それと同時に、順次にまたは別々に使用することもできる。
【００４６】 前記定義のヌクレオチド配列の相補的またはアンチセンスストランドを遺伝子
治療で用いることができる。例えば、ｃＤＮＡ配列またはその断片を遺伝子治療
戦略で用いて、ナトリウムチャンネルを下降調節し得る。アンチセンス技術を用
いて、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの三重らせん形成を介して遺伝子発現を
制御することができる（その方法の双方はＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配
列の結合に基づく）。
治療で用いることができる。例えば、ｃＤＮＡ配列またはその断片を遺伝子治療
戦略で用いて、ナトリウムチャンネルを下降調節し得る。アンチセンス技術を用
いて、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの三重らせん形成を介して遺伝子発現を
制御することができる（その方法の双方はＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配
列の結合に基づく）。
【００４７】 転写に関与する遺伝子の領域と相補的となり、それにより、転写およびナトリ
ウムチャンネルの産物を妨げるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ア
ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズ
し、ｍＲＮＡのナトリウムチャンネルへの翻訳をブロックする。標的感覚ニュー
ロンで発現された強力な構成的プロモーターによって駆動されたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築体は、所望により、最小限に侵害的、
例えば、内視鏡手段によって末梢にまたは脊髄にデリバーされるであろう。
ウムチャンネルの産物を妨げるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ア
ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズ
し、ｍＲＮＡのナトリウムチャンネルへの翻訳をブロックする。標的感覚ニュー
ロンで発現された強力な構成的プロモーターによって駆動されたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築体は、所望により、最小限に侵害的、
例えば、内視鏡手段によって末梢にまたは脊髄にデリバーされるであろう。
【００４８】 ナトリウムチャンネル遺伝子の発現を制御する調節領域を遺伝子治療で用いて
、ナトリウムチャンネルを発現する細胞で治療的構築体の発現を制御し得る。
、ナトリウムチャンネルを発現する細胞で治療的構築体の発現を制御し得る。
【００４９】 本発明のさらなる態様において、神経節後根、特に哺乳動物、例えば約１μＭ
のＴＴＸについてのＩＣ５０を有するラットまたはヒトの神経節後根の侵害受容
ニューロンから得ることができる単離されたナトリウムチャンネルが提供される
。
のＴＴＸについてのＩＣ５０を有するラットまたはヒトの神経節後根の侵害受容
ニューロンから得ることができる単離されたナトリウムチャンネルが提供される
。
【００５０】 さらに、配列番号：２の蛋白質の一次アミノ酸配列と少なくとも９０％以上の
同一性を持つ一次アミノ酸配列を有する蛋白質が提供される。
同一性を持つ一次アミノ酸配列を有する蛋白質が提供される。
【００５１】 また、配列番号：３ないし１７の各々で確認される配列を含む配列を含み、こ
こに、増加する数字の順番が、配列番号：３ないし１７が５’から３’方向に読
まれる順番わ表す組換えポリヌクレオチドが提供される。該組換えポリヌクレオ
チドは、さらに、該ポリヌクレオチドが宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞で発現
された場合に、機能的ナトリウムチャンネルがコードされるように、配列番号：
３ないし１７で定義された（読みの方向の点で）配列の間の前または後にスペー
スを置いた配列を含むことができる。
こに、増加する数字の順番が、配列番号：３ないし１７が５’から３’方向に読
まれる順番わ表す組換えポリヌクレオチドが提供される。該組換えポリヌクレオ
チドは、さらに、該ポリヌクレオチドが宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞で発現
された場合に、機能的ナトリウムチャンネルがコードされるように、配列番号：
３ないし１７で定義された（読みの方向の点で）配列の間の前または後にスペー
スを置いた配列を含むことができる。
【００５２】
以下の例は説明目的のものであり、本発明を限定するものではない。
【００５３】 例 １：ＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリースクリーニング 例１ａ：プローブを得ること ナトリウムチャンネルプローブを創製して、ＤＲＧに存在する新規ナトリウム
チャンネルを同定する目的でラットＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングを可能とした。パン特異的ナトリウムチャンネルプローブが、鋳型としての
ラットゲノムＤＮＡおよび脳ＩＩ、心臓、骨格筋および神経膠電圧依存性ナトリ
ウムチャンネルの３’コーディング領域内から設計された縮重ＰＣＲプライマー
を用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）実験から得られた。この分析で用いたオ
リゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：順方向プライマー（５’Ｃ
ＣＴＧ／ＶＧＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣ３’）および逆方向プライマー（５
’ＣＴＣＡＴＡＡ／ＧＧＡＡ／ＧＡＣ／ＴＣＴＴＧＧＡＧ／ＡＧＧＧ３’）。使
用したＰＣＲ条件は３０秒間の９４℃、１分間の５０℃および２分間の７２℃で
あった。これらの条件を３５サイクルのＰＣＲで用いた。得られたＰＣＲ産物を
１％アガロースゲルで分離し、製造業者の指示に従ってＴＡクローニングキット
テ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。得られたクローンを配列分析の
ために採取し、別々のクローンを、公表されたラット脳ＩＩ、心臓、骨格筋およ
び神経膠電圧依存性ナトリウムチャンネルに対し同一配列で同定した。
チャンネルを同定する目的でラットＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングを可能とした。パン特異的ナトリウムチャンネルプローブが、鋳型としての
ラットゲノムＤＮＡおよび脳ＩＩ、心臓、骨格筋および神経膠電圧依存性ナトリ
ウムチャンネルの３’コーディング領域内から設計された縮重ＰＣＲプライマー
を用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）実験から得られた。この分析で用いたオ
リゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：順方向プライマー（５’Ｃ
ＣＴＧ／ＶＧＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣ３’）および逆方向プライマー（５
’ＣＴＣＡＴＡＡ／ＧＧＡＡ／ＧＡＣ／ＴＣＴＴＧＧＡＧ／ＡＧＧＧ３’）。使
用したＰＣＲ条件は３０秒間の９４℃、１分間の５０℃および２分間の７２℃で
あった。これらの条件を３５サイクルのＰＣＲで用いた。得られたＰＣＲ産物を
１％アガロースゲルで分離し、製造業者の指示に従ってＴＡクローニングキット
テ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。得られたクローンを配列分析の
ために採取し、別々のクローンを、公表されたラット脳ＩＩ、心臓、骨格筋およ
び神経膠電圧依存性ナトリウムチャンネルに対し同一配列で同定した。
【００５４】 ラットＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリーを、λＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ バクテ
リオファージ系（Ｄｔｒａｔａｇｅｎｅ）で構築し、それがｐＢＫ−ＣＭＶ切除
ベクター内で方向的にクローン化されるようにした。略言すれば、腰ＤＲＧ組織
を成体ラットから摘出し、加工する準備ができるまで液体窒素中で凍結した。製
造業者の指示に従って、全ＲＮＡをＲＮａｚｏｌＢ（Ｂｉｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）
を用いて抽出した。この方法は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）１６２ １５６
−１６９によって開発されたグアニジンイソチオシアネートおよびフェノール／
クロロホルム抽出方法に基づく。次いで、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを製造業者の指示
に従ってオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に
よって全ＲＮＡプールから単離した。５μｇのこのポリ（Ａ＋）ラットＤＲＧ
ＲＮＡをｃＤＮＡライブラリー合成のための出発鋳型として用いた。これは、Ｇ
ｉｐａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄクローニングキットを用い、ＺＡＰ発現ｃＤ
ＮＡライブラリーの構築のためのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ支持マニュアルに記載さ
れたごとくに正確に行った。
リオファージ系（Ｄｔｒａｔａｇｅｎｅ）で構築し、それがｐＢＫ−ＣＭＶ切除
ベクター内で方向的にクローン化されるようにした。略言すれば、腰ＤＲＧ組織
を成体ラットから摘出し、加工する準備ができるまで液体窒素中で凍結した。製
造業者の指示に従って、全ＲＮＡをＲＮａｚｏｌＢ（Ｂｉｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）
を用いて抽出した。この方法は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）１６２ １５６
−１６９によって開発されたグアニジンイソチオシアネートおよびフェノール／
クロロホルム抽出方法に基づく。次いで、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを製造業者の指示
に従ってオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に
よって全ＲＮＡプールから単離した。５μｇのこのポリ（Ａ＋）ラットＤＲＧ
ＲＮＡをｃＤＮＡライブラリー合成のための出発鋳型として用いた。これは、Ｇ
ｉｐａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄクローニングキットを用い、ＺＡＰ発現ｃＤ
ＮＡライブラリーの構築のためのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ支持マニュアルに記載さ
れたごとくに正確に行った。
【００５５】 最初に、このライブラリーからの２００万プラーク形成単位を（ＤＮＡ導入お
よびハイブリダイゼーションおよびプロービングに概説したごとく）パン特異的
チャンネルプローブでスクリーニングした。得られた陽性プラークを（Ｇｉｐａ
ｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄクローニングキットを用いるＺＡＰ発現ｃＤＮＡラ
イブラリーの構築用のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ指示マニュアルに概説されているご
とく）均一に精製し、配列分析に付した。電圧依存性ナトリウムチャンネルに関
して新規配列を示すいくつかのクローンを得た。これらのクローンの最長を図１
にＬＡＲＩ／ＱＦＬとして呼んだ。図１はＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリースクリ
ーニングから得られた鍵となるクローンを示す。この新規な配列は本発明ではＳ
ＮＳ２ａというナトリウムチャンネルの断片であった。
よびハイブリダイゼーションおよびプロービングに概説したごとく）パン特異的
チャンネルプローブでスクリーニングした。得られた陽性プラークを（Ｇｉｐａ
ｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄクローニングキットを用いるＺＡＰ発現ｃＤＮＡラ
イブラリーの構築用のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ指示マニュアルに概説されているご
とく）均一に精製し、配列分析に付した。電圧依存性ナトリウムチャンネルに関
して新規配列を示すいくつかのクローンを得た。これらのクローンの最長を図１
にＬＡＲＩ／ＱＦＬとして呼んだ。図１はＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリースクリ
ーニングから得られた鍵となるクローンを示す。この新規な配列は本発明ではＳ
ＮＳ２ａというナトリウムチャンネルの断片であった。
【００５６】 引き続いて、さらなるものおよび５０万プラークを、この新規ナトリウムチャ
ンネルに特異的なプローブ（ＬＡＲＩ／ＱＦＬ）を用いてスクリーニングした。
さらなる陽性クローンが得られ、配列分析によって証明した。図１でクローン６
３．１と命名したこれらのクローンの最大のものは長さが３．６ｋｂであった。
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計してＤＲＧ ＲＮＡにつきＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応を行った。用いたプライマーは以下の通りであった： ５’ＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡ／Ｃ３’：および ５’ＡＧＴＧＧＡＴＡ／ＣＧＡＧＡＡ／ＣＣＡＴＧＴＧＧＧ３’。
ンネルに特異的なプローブ（ＬＡＲＩ／ＱＦＬ）を用いてスクリーニングした。
さらなる陽性クローンが得られ、配列分析によって証明した。図１でクローン６
３．１と命名したこれらのクローンの最大のものは長さが３．６ｋｂであった。
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計してＤＲＧ ＲＮＡにつきＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応を行った。用いたプライマーは以下の通りであった： ５’ＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＡ／Ｃ３’：および ５’ＡＧＴＧＧＡＴＡ／ＣＧＡＧＡＡ／ＣＣＡＴＧＴＧＧＧ３’。
【００５７】 用いた条件は３０秒間の９４℃、１分間の５０℃および２分間の７２℃であった
。これらの条件をＰＣＲの３５サイクルで使用した。得られたＰＣＲ産物を１％
アガロースゲルで分離し、製造業者の指示に従ってＴＡクローニングキット（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。得られたクローンを配列分析のために
採取した。この結果、部分的ＳＮＳ２ａクローン１８／１４が得られた。これを
図１で１８／１４と命名し、これは、ＳＮＳ２ａの全長配列に対するこのクロー
ンの位置を示す。１８／１４と命名されたこのプローブを用い、２００万プラー
クを第３まｃＤＮＡライブラリースクリーニングでスクリーニングした（ハイブ
リダイゼーションおよびプロービングにおけるごとくプローブ標識）。このスク
リーニングからの得られた陽性クローンの分析の結果、１６／１４、３１／４２
および３．４ｋｂクローン７１／７２として図１に命名された断片が発見された
。７１／７２および６３．１（図１）と命名された２つのクローンは相互に重複
し、かくして、それらがＳＮＳ２ａの位置２８９５ｂｐないし２９００ｂｐから
のユニークＢｇｌ ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）制限部位
を用いて一緒に接合されることを可能とする。この工程により、配列番号：１に
示される全長ＳＮＳ２ａクローンが得られた。
。これらの条件をＰＣＲの３５サイクルで使用した。得られたＰＣＲ産物を１％
アガロースゲルで分離し、製造業者の指示に従ってＴＡクローニングキット（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。得られたクローンを配列分析のために
採取した。この結果、部分的ＳＮＳ２ａクローン１８／１４が得られた。これを
図１で１８／１４と命名し、これは、ＳＮＳ２ａの全長配列に対するこのクロー
ンの位置を示す。１８／１４と命名されたこのプローブを用い、２００万プラー
クを第３まｃＤＮＡライブラリースクリーニングでスクリーニングした（ハイブ
リダイゼーションおよびプロービングにおけるごとくプローブ標識）。このスク
リーニングからの得られた陽性クローンの分析の結果、１６／１４、３１／４２
および３．４ｋｂクローン７１／７２として図１に命名された断片が発見された
。７１／７２および６３．１（図１）と命名された２つのクローンは相互に重複
し、かくして、それらがＳＮＳ２ａの位置２８９５ｂｐないし２９００ｂｐから
のユニークＢｇｌ ＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）制限部位
を用いて一緒に接合されることを可能とする。この工程により、配列番号：１に
示される全長ＳＮＳ２ａクローンが得られた。
【００５８】 ＳＮＳ２ａは、哺乳動物発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）のＳａｌＩ／ＮｃｏＩ部位、哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａｌＩ／ＮｃｏＩ部位で組み立てられた。また、ＳＮＳ２
ａをＣｌｏｎｔｅｃｈ ＩＲＥＳベクターｐＩＲＥＳｎｅｏにクローン化し、こ
のベクターの多重クローニング部位を修飾してＮｓｉＩ／ＮｃｏＩ部位を含ませ
、これを正しい向きのクローニングＳＮＳ２ａで用いた。これは、ＨＥＫ２９３
細胞（ＡＴＣＣ）のごとき哺乳動物において一過性および安定な発現実験を可能
とする。
ｇｅｎｅ）のＳａｌＩ／ＮｃｏＩ部位、哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）のＳａｌＩ／ＮｃｏＩ部位で組み立てられた。また、ＳＮＳ２
ａをＣｌｏｎｔｅｃｈ ＩＲＥＳベクターｐＩＲＥＳｎｅｏにクローン化し、こ
のベクターの多重クローニング部位を修飾してＮｓｉＩ／ＮｃｏＩ部位を含ませ
、これを正しい向きのクローニングＳＮＳ２ａで用いた。これは、ＨＥＫ２９３
細胞（ＡＴＣＣ）のごとき哺乳動物において一過性および安定な発現実験を可能
とする。
【００５９】 配列番号：１のヌクレオチド配列分析は、１７６５アミノ酸蛋白質をコードす
る５２９８ｂｐオープンリーディングフレームを明らかとする（配列番号：２）
。この推定蛋白質配列は電圧依存性ナトリウムチャンネルファミリーの特徴的敷
く長の多くを共有するが、第１および第２反復ドメインに関する好ましい第１分
子内ループ領域は、ＳＮＳ／ＰＮ３、心臓チャンネルおよび脳チャンネルを含め
た他の電圧依存性ナトリウムチャンネルの多くにおける対応する領域よりもかな
り短い。
る５２９８ｂｐオープンリーディングフレームを明らかとする（配列番号：２）
。この推定蛋白質配列は電圧依存性ナトリウムチャンネルファミリーの特徴的敷
く長の多くを共有するが、第１および第２反復ドメインに関する好ましい第１分
子内ループ領域は、ＳＮＳ／ＰＮ３、心臓チャンネルおよび脳チャンネルを含め
た他の電圧依存性ナトリウムチャンネルの多くにおける対応する領域よりもかな
り短い。
【００６０】 例１ｂ：ＤＮＡ導入 ファージ感染プレートの表面に１分間置くことによって、ＤＮＡをＧｅｎｅＳ
ｃｒｅｅｎＴＭハイブリダイゼーション導入膜（ＤＵＰＯＮＴ）に導入した。該
膜を１Ｍ ＮａＯＨで２分間２回洗浄し、続いてさらに２分間、１Ｍトリス（ｐ
Ｈ７．４）で２回中和工程を行った。洗浄工程に先立って、さらなる複製リフト
を５分間、プレート上のフィルターで行った。次いで、該膜を一晩風乾し、ＵＶ
Ｓｔｒａｒａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて架橋させた。
ｃｒｅｅｎＴＭハイブリダイゼーション導入膜（ＤＵＰＯＮＴ）に導入した。該
膜を１Ｍ ＮａＯＨで２分間２回洗浄し、続いてさらに２分間、１Ｍトリス（ｐ
Ｈ７．４）で２回中和工程を行った。洗浄工程に先立って、さらなる複製リフト
を５分間、プレート上のフィルターで行った。次いで、該膜を一晩風乾し、ＵＶ
Ｓｔｒａｒａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて架橋させた。
【００６１】 例１ｃ：ハイブリダイゼーションおよびプロービング 該膜を４時間ハイブリダイズさせ、１０％デキストラン硫酸、１％硫酸ラウリ
ル（ＳＤＳ）（溶液および培地参照）および１Ｍ ＮａＣｌ溶液中、６０℃で震
盪させた。使用したプローブは、３３ｂの５’および中央領域からの、各々、Ｌ
ＡＲＩ＆ＱＦＬおよび１８／１４であった。プローブをＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ
ＤＮＡラベリング系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）で標識して、１ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液当たりほ
ぼ５００，０００ｃｐｍの標識プローブを得た。略言すると、１００ｎｇの各プ
ローブを３分間沸騰させ（変性）、次いで、４５μｌの全容量中で２分間氷上で
冷却した。これを３μｌのｄＣＴＰと共にキットからの標識チューブに添加し、
続いて３７℃で３０分間インキュベートした。４００μｇの５０ｍｌの濃度の４
００μｌのＨｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を標識プローブ
に添加し、９９℃で３分間加熱し、続いて氷上で迅速に冷却した。標識プローブ
を添加し、プレハイブリダイゼーション溶液中で十分に混合した。膜を５５℃で
一晩ハイブリダイズさせた。
ル（ＳＤＳ）（溶液および培地参照）および１Ｍ ＮａＣｌ溶液中、６０℃で震
盪させた。使用したプローブは、３３ｂの５’および中央領域からの、各々、Ｌ
ＡＲＩ＆ＱＦＬおよび１８／１４であった。プローブをＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ
ＤＮＡラベリング系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）で標識して、１ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液当たりほ
ぼ５００，０００ｃｐｍの標識プローブを得た。略言すると、１００ｎｇの各プ
ローブを３分間沸騰させ（変性）、次いで、４５μｌの全容量中で２分間氷上で
冷却した。これを３μｌのｄＣＴＰと共にキットからの標識チューブに添加し、
続いて３７℃で３０分間インキュベートした。４００μｇの５０ｍｌの濃度の４
００μｌのＨｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を標識プローブ
に添加し、９９℃で３分間加熱し、続いて氷上で迅速に冷却した。標識プローブ
を添加し、プレハイブリダイゼーション溶液中で十分に混合した。膜を５５℃で
一晩ハイブリダイズさせた。
【００６２】 次いで、該膜を、まず、２×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７）および１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）中で５
分間室温で、続いて５０℃で３０分間２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で洗浄し、
および要すれば、さらに、同温度で３０分間、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ
または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄した。次いで、−７０℃で一
晩増感スクリーンを用いＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｌｍ Ａ
ｒ（Ｋｏｄａｋ）に該膜を暴露し、該フイルムを現像した。
ン酸ナトリウム、ｐＨ７）および１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）中で５
分間室温で、続いて５０℃で３０分間２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で洗浄し、
および要すれば、さらに、同温度で３０分間、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ
または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄した。次いで、−７０℃で一
晩増感スクリーンを用いＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｌｍ Ａ
ｒ（Ｋｏｄａｋ）に該膜を暴露し、該フイルムを現像した。
【００６３】 例１ｄ：サザーンブロット分析 アガロースゲル電気泳動を用いて分離したＰＣＲ産物を、ゲルを１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ中で１０分間、続いて０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液中で３０分間ゆっくりと震
盪することによってイン・サイチュにて変性させた。毛管作用によるＧｅｎｅＳ
ｃｒｅｅｎＴＭハイブリダイゼーション導入膜（ＤＵＰＯＮＴ）へのＤＮＡ導入
は一晩起こり、続いて２×ＳＳＣ中で２分間洗浄し、風乾させた。ハイブリダイ
ゼーションおよびプロービングは、ライブラリースクリーニングに関してと同様
に行った。
ａＣｌ中で１０分間、続いて０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液中で３０分間ゆっくりと震
盪することによってイン・サイチュにて変性させた。毛管作用によるＧｅｎｅＳ
ｃｒｅｅｎＴＭハイブリダイゼーション導入膜（ＤＵＰＯＮＴ）へのＤＮＡ導入
は一晩起こり、続いて２×ＳＳＣ中で２分間洗浄し、風乾させた。ハイブリダイ
ゼーションおよびプロービングは、ライブラリースクリーニングに関してと同様
に行った。
【００６４】 例 ２：イン・ビボ切除分析 ほぼ６ファージプラグをアガロースゲルから除去し、５００μｌのＳＭ緩衝液
に入れた。ファージ粒子の溶出は、２−３時間温和に震盪しつつ、室温で起こっ
た。１μｌのＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭＨｅｌｐｅｒファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）をＳＭ緩衝液（培地および溶液参照）中の１００μｌのファージストックに
添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。３ｍｌの液体ブロス（培地およ
び溶液参照）を添加し、続いて３７℃にて３時間２２５ｒｐｍで震盪した。７０
℃での１５分間の加熱ショックに続いて、４℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠
心した。上清を注意深く滅菌５０ｍｌｆａｌｃｏｎチューブにデカントし、必要
となるまで４℃で貯蔵した。
に入れた。ファージ粒子の溶出は、２−３時間温和に震盪しつつ、室温で起こっ
た。１μｌのＥｘＡｓｓｉｓｔＴＭＨｅｌｐｅｒファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）をＳＭ緩衝液（培地および溶液参照）中の１００μｌのファージストックに
添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。３ｍｌの液体ブロス（培地およ
び溶液参照）を添加し、続いて３７℃にて３時間２２５ｒｐｍで震盪した。７０
℃での１５分間の加熱ショックに続いて、４℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠
心した。上清を注意深く滅菌５０ｍｌｆａｌｃｏｎチューブにデカントし、必要
となるまで４℃で貯蔵した。
【００６５】 １０μｌおよび１００μｌの救済された組換えプラスミド（前記工程からの上
清）を用いて、ＯＤ６００１．０で２００μｌのＸＬＯＬＡ細胞（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）を形質転換し、３７℃で１５分聞インキュベートした。試料を、３０
０μｌのＬ−ブロス（培地および溶液参照）の添加後に３７℃でさらに４５分間
インキュベートし、続いて、ｋａｎ−プレート（１５μｇ／ｍｌ）（培地および
溶液参照）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートする。ＸｈｏＩおよびＥｃｏ
ＲＩ制限酵素を用いる消化分析によって陽性クローンを分析し、続いてサザーン
ブロット分析を行った。
清）を用いて、ＯＤ６００１．０で２００μｌのＸＬＯＬＡ細胞（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）を形質転換し、３７℃で１５分聞インキュベートした。試料を、３０
０μｌのＬ−ブロス（培地および溶液参照）の添加後に３７℃でさらに４５分間
インキュベートし、続いて、ｋａｎ−プレート（１５μｇ／ｍｌ）（培地および
溶液参照）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートする。ＸｈｏＩおよびＥｃｏ
ＲＩ制限酵素を用いる消化分析によって陽性クローンを分析し、続いてサザーン
ブロット分析を行った。
【００６６】 例 ３：哺乳動物細胞におけるＳＮＳ２ａの一過性発現 それらがトランスフェクション手法のために５０−８０％密集となるように、
トランスフェクションに２４時間先立って、ＨＥＫ２９３細胞のごとき哺乳動物
細胞を平板培養した。トランスフェクションの日に、新鮮な培地を細胞に添加し
た。使用すべきトランスフェクションプロトコルはリン酸カルシウム方法（Ｃａ
ｌＰｈｏｓマキシマー、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に頼るものであったが、いずれの一
過性トランスフェクション方法も使用することができる。略言すると、４×１０
５細胞当たり２−４μｇプラスミド、５−３０μｌのＣａｌＰｈｏｓマキシマー
、１２．４μｌの２Ｍカルシウム溶液、滅菌水を含有する溶液Ａと呼ばれる溶液
を１００μｌに作成した。また、１００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝化セーラインを含
有する溶液Ｂと呼ばれる以下の溶液も作成した。溶液Ａを滴下しつつ、溶液Ｂを
注意深く撹拌した。混合した溶液を室温で２０分間インキュベートした。この時
点後に、溶液を温和に撹拌し、細胞培養培地に添加した。２００μｌの溶液を、
４×１０５細胞を含む３５ｍｍ２容器当たりで用いた。次いで、容器を温和に揺
らして、溶液を分配した。細胞を３７℃で２−６時間インキュベートし、しかる
後、培地を吸引によって取り出し、細胞をリン酸緩衝化セーラインで洗浄した。
次いで、新鮮な培地を細胞に添加した。トランスフェクション２４−７４時間後
に分岐生理学的アッセイを行い、あるいは、安定な細胞系の創製のために２４時
間後に抗生物質選択を適用した。
トランスフェクションに２４時間先立って、ＨＥＫ２９３細胞のごとき哺乳動物
細胞を平板培養した。トランスフェクションの日に、新鮮な培地を細胞に添加し
た。使用すべきトランスフェクションプロトコルはリン酸カルシウム方法（Ｃａ
ｌＰｈｏｓマキシマー、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に頼るものであったが、いずれの一
過性トランスフェクション方法も使用することができる。略言すると、４×１０
５細胞当たり２−４μｇプラスミド、５−３０μｌのＣａｌＰｈｏｓマキシマー
、１２．４μｌの２Ｍカルシウム溶液、滅菌水を含有する溶液Ａと呼ばれる溶液
を１００μｌに作成した。また、１００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝化セーラインを含
有する溶液Ｂと呼ばれる以下の溶液も作成した。溶液Ａを滴下しつつ、溶液Ｂを
注意深く撹拌した。混合した溶液を室温で２０分間インキュベートした。この時
点後に、溶液を温和に撹拌し、細胞培養培地に添加した。２００μｌの溶液を、
４×１０５細胞を含む３５ｍｍ２容器当たりで用いた。次いで、容器を温和に揺
らして、溶液を分配した。細胞を３７℃で２−６時間インキュベートし、しかる
後、培地を吸引によって取り出し、細胞をリン酸緩衝化セーラインで洗浄した。
次いで、新鮮な培地を細胞に添加した。トランスフェクション２４−７４時間後
に分岐生理学的アッセイを行い、あるいは、安定な細胞系の創製のために２４時
間後に抗生物質選択を適用した。
【００６７】 例 ４：ノーザンブロット分析 ＮＧＦで予備処理した、ＤＲＧ、心臓、脊髄、副腎、ＰＣ細胞（ＡＴＣＣ）お
よびＰＣ１２細胞からの２０μｇの全ＲＮＡを８％ホルムアルデヒドを含有する
１％アガロースゲル上の電気泳動に付した。（全ＲＮＡの調製はラットＤＲＧ
ｃＤＮＡライブラリーの構築で記載したごとくに行った）。次いで、該ゲルを実
施例１ｄに記載されたごとくにＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎＴＭ膜にブロットし、実施
例１ｃに記載されたごとくに１８／１４プローブでプローブした。Ｋｏｄａｋ
Ｘ−ＡＲフイルムへの暴露は一晩起こった。
よびＰＣ１２細胞からの２０μｇの全ＲＮＡを８％ホルムアルデヒドを含有する
１％アガロースゲル上の電気泳動に付した。（全ＲＮＡの調製はラットＤＲＧ
ｃＤＮＡライブラリーの構築で記載したごとくに行った）。次いで、該ゲルを実
施例１ｄに記載されたごとくにＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎＴＭ膜にブロットし、実施
例１ｃに記載されたごとくに１８／１４プローブでプローブした。Ｋｏｄａｋ
Ｘ−ＡＲフイルムへの暴露は一晩起こった。
【００６８】 ＳＮＳ２ａに特異的な１８／１４プローブを用いるこのノーザンブロット分析
の結果はＤＲＧ細胞中のほぼ９ｋｂの転写体サイズを示し、他方、神経成長因子
（ＭＧＦ）の存在下または不存在下で、脊髄、脳、副腎、心臓およびラット・フ
ェノクロモサイトーマ細胞系（ＰＣ１２）で発現は観察されなかった（図４）。
ＤＲＧセクションで行ったイン・サイチュハイブリダイゼーション実験は、ＳＮ
Ｓ２ａ発現は小直径細胞に限定されたことを示した（図５）。同様のイン・サイ
チュハイブリダイゼーション実験を脊髄および全脳セクションで行い、特異的標
識は観察されず、ノーザン分析仕事が確認された。
の結果はＤＲＧ細胞中のほぼ９ｋｂの転写体サイズを示し、他方、神経成長因子
（ＭＧＦ）の存在下または不存在下で、脊髄、脳、副腎、心臓およびラット・フ
ェノクロモサイトーマ細胞系（ＰＣ１２）で発現は観察されなかった（図４）。
ＤＲＧセクションで行ったイン・サイチュハイブリダイゼーション実験は、ＳＮ
Ｓ２ａ発現は小直径細胞に限定されたことを示した（図５）。同様のイン・サイ
チュハイブリダイゼーション実験を脊髄および全脳セクションで行い、特異的標
識は観察されず、ノーザン分析仕事が確認された。
【００６９】 疼痛の２つの別々のラットモデル、すなわち、フロイントの完全アジュバント
（ＣＦＡ）モデルおよび座骨神経切断（軸索切断）モデルから摘出されたＤＲＧ
組織で、ＤＲＧにおけるＳＮＳ２ａの発現を実験した。本セクションに前記した
プローブ１８／１４を用いるノーザンブロット分析によってＳＮＳ２ａの発現を
実験した。２４時間の時点におけるＣＦＡモデルにおいて、ＳＮＳ２ａの発現の
有意な増加があったが、軸索切断モデルにおいて４８時間および７日の時点でＳ
ＮＳ２ａｍＲＮＡのレベルの有意な減少があった（図７）。この重要なシリーズ
の実験は、疼痛のよく特徴付けられたモデルにおいてこの新規チャンネルＳＮＳ
２ａの異なる調節を示した。
（ＣＦＡ）モデルおよび座骨神経切断（軸索切断）モデルから摘出されたＤＲＧ
組織で、ＤＲＧにおけるＳＮＳ２ａの発現を実験した。本セクションに前記した
プローブ１８／１４を用いるノーザンブロット分析によってＳＮＳ２ａの発現を
実験した。２４時間の時点におけるＣＦＡモデルにおいて、ＳＮＳ２ａの発現の
有意な増加があったが、軸索切断モデルにおいて４８時間および７日の時点でＳ
ＮＳ２ａｍＲＮＡのレベルの有意な減少があった（図７）。この重要なシリーズ
の実験は、疼痛のよく特徴付けられたモデルにおいてこの新規チャンネルＳＮＳ
２ａの異なる調節を示した。
【００７０】 例 ５：リボプローブ創製 ノーザンブロット分析でＳＮＳ２ａに特異的であった１８／１４プローブを用
いて、リボプローブを創製した。該１８／１４プローブをベクターｐＣＲ−ＩＩ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。標識されたＲＮＡストランドを、
ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いて
ベクタープロモーターＳＰ６およびＴ７からイン・ビトロで転写した。１μｇの
線状化鋳型ＤＮＡを用いて、ランオフ転写体を得た。ＤＩＧ−ＵＴＰを基質とし
て用い、転写体に取り込んだ。創製されたＤＩＧ標識ＲＮＡの量は、ＤＩＧ定量
および制御テストストリップ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用い
て測定した。ＤＩＧ標識センスおよびアンチセンスＲＮＡプローブをイン・サイ
チュハイブリダイゼーションで用いて、ＤＲＧセクションを染色した（抗体創製
についてのセクション参照）。
いて、リボプローブを創製した。該１８／１４プローブをベクターｐＣＲ−ＩＩ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。標識されたＲＮＡストランドを、
ＤＩＧ ＲＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いて
ベクタープロモーターＳＰ６およびＴ７からイン・ビトロで転写した。１μｇの
線状化鋳型ＤＮＡを用いて、ランオフ転写体を得た。ＤＩＧ−ＵＴＰを基質とし
て用い、転写体に取り込んだ。創製されたＤＩＧ標識ＲＮＡの量は、ＤＩＧ定量
および制御テストストリップ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用い
て測定した。ＤＩＧ標識センスおよびアンチセンスＲＮＡプローブをイン・サイ
チュハイブリダイゼーションで用いて、ＤＲＧセクションを染色した（抗体創製
についてのセクション参照）。
【００７１】 例 ６：抗体創製 供給業者によって推奨された条件下で固相Ｆｍｏｃ化学を用い、ＳＮＳ２ａの
アミノ酸残基１７４８ないし１７６５に関するオクタデカペプチドＣＮＧＤＬＳ
ＳＬＤＶＡＫＶＫＨＮＤ、およびＳＮＳ２ａのアミノ酸残基２ないし１５に関す
るペプチドＥＥＲＹＹＰＶＩＦＰＤＥＲＮＣをＢｉｏｓｅａｒｃｈ９５００ペプ
チド合成器で合成した。切断されたペプチドをゲル濾過によって精製し、スルホ
−ＳＭＣＣを用いチューバークリン（ＰＰＤ）の精製された蛋白質誘導体にコン
ジュゲートさせた。ＢＣＧに対して予備感作させたダッチウサギをフロイントの
不完全アジュバント中で乳化させた得られたコンジュゲートで免疫化させた。３
週間間隔でウサギにブースター注射し、各注射の７日後にテスト出血から血清を
調製した。特異的抗体反応に続いて、抗原として遊離合成ペプチドを用いて間接
的ＥＬＩＳＡを行った。高力価抗血清をさらなる実験で用いた。
アミノ酸残基１７４８ないし１７６５に関するオクタデカペプチドＣＮＧＤＬＳ
ＳＬＤＶＡＫＶＫＨＮＤ、およびＳＮＳ２ａのアミノ酸残基２ないし１５に関す
るペプチドＥＥＲＹＹＰＶＩＦＰＤＥＲＮＣをＢｉｏｓｅａｒｃｈ９５００ペプ
チド合成器で合成した。切断されたペプチドをゲル濾過によって精製し、スルホ
−ＳＭＣＣを用いチューバークリン（ＰＰＤ）の精製された蛋白質誘導体にコン
ジュゲートさせた。ＢＣＧに対して予備感作させたダッチウサギをフロイントの
不完全アジュバント中で乳化させた得られたコンジュゲートで免疫化させた。３
週間間隔でウサギにブースター注射し、各注射の７日後にテスト出血から血清を
調製した。特異的抗体反応に続いて、抗原として遊離合成ペプチドを用いて間接
的ＥＬＩＳＡを行った。高力価抗血清をさらなる実験で用いた。
【００７２】 ＳＮＳ２ａに向けられたこれらの抗−ペプチド抗体を免疫化学実験で用いるこ
とができる。また、いくつかの融合蛋白質抗体をＳＮＳ２ａに対して創製させた
。融合ペプチドを創製するのに使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった 融合ペプチド１ ５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴ
ＣＡＧＧＡ３’および５’ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴ
ＣＡＡＧＧＡ３’ 融合ペプチド２ ５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＣ
ＡＣＣＴＣ３’および５’ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡ
ＣＣＣＣ％％３’ 融合ペプチド３ ５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣ
ＣＣＣＡＡ３’および５７ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴ
ＣＴＴＣＧＣ３’ 抗−ペプチド抗体はＨＥＫ２９３細胞で発現された組換えＳＮＳ２ａの特異的
染色によって証明されている（ＳＮＳ２ａの一過性発現についてのセクション参
照）。ＨＥＫ２９３細胞をａ）ＳＮＳ２ａＤＮＡまたはｂ）対照としてのＹＦＰ
黄色蛍光蛋白質、ＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションから４
８時間後、ＲＩＰＡで調製された全細胞溶解物を、非免疫ウサギＩｇＧおよびプ
ロテインＡ−セファロースを用いて予備清澄化させ、続いて遠心した。次いで、
特異的抗体を得られた上清に添加することによって、免疫反応性蛋白質を沈殿さ
せた。溶解させた沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、抗−ＳＮＳ２ａ抗体のカクテ
ルを用いて免疫ブロットした。ＨＲＰ−標識二次抗体およびＥＣＬ検出を用いて
結合した免疫グロブリンを明らかとした。抗−ＳＮＳ２ａ抗体はＳＮＳ２ａＤＮ
Ａでトランスフェクトされた細胞への特異的結合を示し、該抗体の特異性および
ＳＮＳ２ａ蛋白質の存在が確認された（図１０）。
とができる。また、いくつかの融合蛋白質抗体をＳＮＳ２ａに対して創製させた
。融合ペプチドを創製するのに使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった 融合ペプチド１ ５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴ
ＣＡＧＧＡ３’および５’ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＴ
ＣＡＡＧＧＡ３’ 融合ペプチド２ ５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＣ
ＡＣＣＴＣ３’および５’ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＡ
ＣＣＣＣ％％３’ 融合ペプチド３ ５’ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣ
ＣＣＣＡＡ３’および５７ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴ
ＣＴＴＣＧＣ３’ 抗−ペプチド抗体はＨＥＫ２９３細胞で発現された組換えＳＮＳ２ａの特異的
染色によって証明されている（ＳＮＳ２ａの一過性発現についてのセクション参
照）。ＨＥＫ２９３細胞をａ）ＳＮＳ２ａＤＮＡまたはｂ）対照としてのＹＦＰ
黄色蛍光蛋白質、ＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションから４
８時間後、ＲＩＰＡで調製された全細胞溶解物を、非免疫ウサギＩｇＧおよびプ
ロテインＡ−セファロースを用いて予備清澄化させ、続いて遠心した。次いで、
特異的抗体を得られた上清に添加することによって、免疫反応性蛋白質を沈殿さ
せた。溶解させた沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、抗−ＳＮＳ２ａ抗体のカクテ
ルを用いて免疫ブロットした。ＨＲＰ−標識二次抗体およびＥＣＬ検出を用いて
結合した免疫グロブリンを明らかとした。抗−ＳＮＳ２ａ抗体はＳＮＳ２ａＤＮ
Ａでトランスフェクトされた細胞への特異的結合を示し、該抗体の特異性および
ＳＮＳ２ａ蛋白質の存在が確認された（図１０）。
【００７３】 抗−ペプチド抗体およびリボプローブは、ＤＩＧセクションを染色するために
イン・サイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学で使用されてきた。
成体雄スプラグ・ドーレイラットからの新鮮な凍結１．４および１．５神経節後
根を２０μｍにて切断し、風乾し、固定し、アセチル化し、５００ｍｇ／ｍｌの
ジゴキシゲニン−標識リボプローブとハイブリダイズさせた（ＳＮＳ２ａリボプ
ローブについてのセクション参照）。センスプローブを対照として用いた。該セ
クションをＳＮＳ／ＰＮ３またはＳＮＳ２ａ抗体いずれか中で一晩インキュベー
トする前に写真を取った（１：２０００）。染色はＶｅｃｔａｓｔａｔｉｎエリ
ートＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて達成された。細胞プロフィール面積
分析については、ＳＮＳ／ＰＮ３またはＳＮＳ２ａｍＲＮＡで染色したセクショ
ンをランダムに選択し、可視的核を持つ標識細胞を描き（ＳＮＳ／ＰＮ３：ｎ＝
２１２；ＳＮＳ２ａ；ｎ＝２０６）、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ１．６１を用いて面積
を計算した。もう一度、抗体およびリボプローブが末梢感覚ニューロンの小直径
細胞体を認識する（図１０．ＤおよびＥ）。ＳＮＳ／ＰＮ３ ｍＲＮＡ標識細胞
と比較したＳＮＳ２ａのプロフィール面積頻度分布分析は、ＳＮＳ２ａの発現は
小さな（直径が１５−３０μｍ）の細胞体に限られることを示す（図９．Ｃおよ
びＦ）。
イン・サイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学で使用されてきた。
成体雄スプラグ・ドーレイラットからの新鮮な凍結１．４および１．５神経節後
根を２０μｍにて切断し、風乾し、固定し、アセチル化し、５００ｍｇ／ｍｌの
ジゴキシゲニン−標識リボプローブとハイブリダイズさせた（ＳＮＳ２ａリボプ
ローブについてのセクション参照）。センスプローブを対照として用いた。該セ
クションをＳＮＳ／ＰＮ３またはＳＮＳ２ａ抗体いずれか中で一晩インキュベー
トする前に写真を取った（１：２０００）。染色はＶｅｃｔａｓｔａｔｉｎエリ
ートＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて達成された。細胞プロフィール面積
分析については、ＳＮＳ／ＰＮ３またはＳＮＳ２ａｍＲＮＡで染色したセクショ
ンをランダムに選択し、可視的核を持つ標識細胞を描き（ＳＮＳ／ＰＮ３：ｎ＝
２１２；ＳＮＳ２ａ；ｎ＝２０６）、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ１．６１を用いて面積
を計算した。もう一度、抗体およびリボプローブが末梢感覚ニューロンの小直径
細胞体を認識する（図１０．ＤおよびＥ）。ＳＮＳ／ＰＮ３ ｍＲＮＡ標識細胞
と比較したＳＮＳ２ａのプロフィール面積頻度分布分析は、ＳＮＳ２ａの発現は
小さな（直径が１５−３０μｍ）の細胞体に限られることを示す（図９．Ｃおよ
びＦ）。
【００７４】 この観察をヒトＤＩＧ組織まで拡大し、この実験は、ラット配列に対して生起
した抗体が事実ヒトＳＮＳ２ａチャンネルと交差反応することを示す。
した抗体が事実ヒトＳＮＳ２ａチャンネルと交差反応することを示す。
【００７５】 同一セクションにおけるｍＲＮＡおよび蛋白質についての二重標識実験は、小
直径ニューロン細胞体のみで共局所化を示した（図９、Ｇ．Ｈ．Ｉ．Ｊ．）。大
きなニューロンは、ＳＮＳ２ａ蛋白質またはｍＲＮＡが存在しないＳＮＳ／ＰＮ
３ ｍＲＮＡまたは蛋白質についてのシグナルで頻繁に観察された。小直径細胞
体におけるＳＮＳ／ＰＮ３とのＳＮＳ２ａの共局所化は機能的に重要であり得る
。
直径ニューロン細胞体のみで共局所化を示した（図９、Ｇ．Ｈ．Ｉ．Ｊ．）。大
きなニューロンは、ＳＮＳ２ａ蛋白質またはｍＲＮＡが存在しないＳＮＳ／ＰＮ
３ ｍＲＮＡまたは蛋白質についてのシグナルで頻繁に観察された。小直径細胞
体におけるＳＮＳ／ＰＮ３とのＳＮＳ２ａの共局所化は機能的に重要であり得る
。
【００７６】 例 ６：アンチセンス アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成して、ＳＮＳ２ａのＤＩＧニューロン
中のＴＴＸ−Ｒ電流への寄与をさらに有効とした。アンチセンスおよびミスマッ
チオリゴを、塩基対４５からのＳＮＳ２ａヌクレオチド配列の５’領域に対して
設計し、配列は以下の通りであった： アンチセンス１ ５’−ＡＧＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＣＴ−
３’ ミスマッチ１ ５’−ＡＧＴ ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ−３
’ アンチセンス２ ５’−ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＴＡ ＧＴＡ ＣＣＴ ＣＴＣ−
３’ ミスマッチ２ ５’−ＣＡＣ ＧＣＧ ＣＴＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＴＣ−３
’ アンチセンス３ ５’−ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＣＴ−
３’ ミスマッチ３ ５’−ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＣＴ−３
’ アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養したラットＤＲＧニューロンと共にイ
ン・ビトロで用いて、ＤＲＧニューロンの電気生理学的特性に対するＳＮＳ２ａ
蛋白質のノックアウトの効果を調べることができる。ラットＤＲＧニューロンに
おけるＳＮＳ２ａのノックアウトの挙動的効果を、カニューレを通じての脊髄へ
のアンチセンスデリバリーを用いてイン・ビボで調べることができる。ＳＮＳ２
ａ蛋白質レベルの低下は、定量的ウェスタンブロットによって測定することがで
きる。次いで、十分な電気生理学的分析を行うことができる。これは、ニューロ
ン侵害受容におけるおよび炎症および神経障害疼痛モデルにおけるＳＮＳ２ａの
役割の分析を可能とする。
中のＴＴＸ−Ｒ電流への寄与をさらに有効とした。アンチセンスおよびミスマッ
チオリゴを、塩基対４５からのＳＮＳ２ａヌクレオチド配列の５’領域に対して
設計し、配列は以下の通りであった： アンチセンス１ ５’−ＡＧＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＣＴ−
３’ ミスマッチ１ ５’−ＡＧＴ ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ−３
’ アンチセンス２ ５’−ＣＡＣ ＣＧＧ ＧＴＡ ＧＴＡ ＣＣＴ ＣＴＣ−
３’ ミスマッチ２ ５’−ＣＡＣ ＧＣＧ ＣＴＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＴＣ−３
’ アンチセンス３ ５’−ＧＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＣＴ−
３’ ミスマッチ３ ５’−ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＣＴ−３
’ アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養したラットＤＲＧニューロンと共にイ
ン・ビトロで用いて、ＤＲＧニューロンの電気生理学的特性に対するＳＮＳ２ａ
蛋白質のノックアウトの効果を調べることができる。ラットＤＲＧニューロンに
おけるＳＮＳ２ａのノックアウトの挙動的効果を、カニューレを通じての脊髄へ
のアンチセンスデリバリーを用いてイン・ビボで調べることができる。ＳＮＳ２
ａ蛋白質レベルの低下は、定量的ウェスタンブロットによって測定することがで
きる。次いで、十分な電気生理学的分析を行うことができる。これは、ニューロ
ン侵害受容におけるおよび炎症および神経障害疼痛モデルにおけるＳＮＳ２ａの
役割の分析を可能とする。
【００７７】 例 ７：電気生理学 重要なことには、ＳＮＳ２ａは、全細胞パッチクランプ電気生理学的を用いて
測定されるごとく、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）で発現させると、
機能的電圧依存性Ｎａ＋チャンネルを形成する。
測定されるごとく、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）で発現させると、
機能的電圧依存性Ｎａ＋チャンネルを形成する。
【００７８】 標準的電気生理学的技術を使用して、全細胞Ｎａ＋電流を測定した（Ｈａｍｉ
ｌｌら，１９８１）。電圧コマンドプロトコルを創製し、ｐＣＬＡＭＰ６ Ｃｌ
ａｍｐｅｘソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、Ａｘｏ
ｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器、およびマイクロコンピューター（Ｖｉｇｌｅｎ
Ｐｅｎｔｉｎｕｍ）によって制御されたデジデータ１２００アナログ／デジタル
インターフェイス（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を介して電流記録を保
存した。シグナルを５ｋＨｚバンド幅で予備濾過し、２０ｋＨｚでサンプリング
した。キャパシタンストランジエントおよび直列抵抗誤差増幅器回路を用いて補
償し（８０−８５％）、市販のソフトウェアパッケージによって供給されたオン
−ライン「Ｐ−４」手法を用いて、直線的遺漏電流を差し引いた。ほとんどの場
合、誘導されたＮａ＋電流は−６００ｐＡないし−４５００ｐＡの範囲であり、
かくして、補償された直列抵抗を横切る最大予測電圧降下は４ｍＶ未満に達する
であろう。マイクロピペットプーラー（ＳｕｔｔｅｒモドルＰ９７）を用いて、
パッチピペットを１．５ｍｍ外径ボロシリケート毛管ガラス（Ｃｌａｒｋ Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ）から製造し、火炎研磨（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ Ｍｉ
ｃｒｏｆｏｒｇｅ）して、２−４ｍΩの最終先端抵抗を得た。浴参照電極として
銀／塩化銀ペレットを用い、この電極および記録電極の間の電位差を、シール形
成前にゼロ電流につき調整した。×４００の最終倍率にて、変調コントラストオ
プティックスを備えたＤｉａｐｈｏｔ２００倒立顕微鏡を用いて細胞を可視化し
た。ピペットおよびニューロン細胞膜の間の高抵抗シール（１−１０ＧΩ）は温
和な吸引によって達成され、「全細胞」立体配置はさらなる吸引を適用すること
によって達成される。
ｌｌら，１９８１）。電圧コマンドプロトコルを創製し、ｐＣＬＡＭＰ６ Ｃｌ
ａｍｐｅｘソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、Ａｘｏ
ｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器、およびマイクロコンピューター（Ｖｉｇｌｅｎ
Ｐｅｎｔｉｎｕｍ）によって制御されたデジデータ１２００アナログ／デジタル
インターフェイス（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を介して電流記録を保
存した。シグナルを５ｋＨｚバンド幅で予備濾過し、２０ｋＨｚでサンプリング
した。キャパシタンストランジエントおよび直列抵抗誤差増幅器回路を用いて補
償し（８０−８５％）、市販のソフトウェアパッケージによって供給されたオン
−ライン「Ｐ−４」手法を用いて、直線的遺漏電流を差し引いた。ほとんどの場
合、誘導されたＮａ＋電流は−６００ｐＡないし−４５００ｐＡの範囲であり、
かくして、補償された直列抵抗を横切る最大予測電圧降下は４ｍＶ未満に達する
であろう。マイクロピペットプーラー（ＳｕｔｔｅｒモドルＰ９７）を用いて、
パッチピペットを１．５ｍｍ外径ボロシリケート毛管ガラス（Ｃｌａｒｋ Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ）から製造し、火炎研磨（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ Ｍｉ
ｃｒｏｆｏｒｇｅ）して、２−４ｍΩの最終先端抵抗を得た。浴参照電極として
銀／塩化銀ペレットを用い、この電極および記録電極の間の電位差を、シール形
成前にゼロ電流につき調整した。×４００の最終倍率にて、変調コントラストオ
プティックスを備えたＤｉａｐｈｏｔ２００倒立顕微鏡を用いて細胞を可視化し
た。ピペットおよびニューロン細胞膜の間の高抵抗シール（１−１０ＧΩ）は温
和な吸引によって達成され、「全細胞」立体配置はさらなる吸引を適用すること
によって達成される。
【００７９】 ＳＮＳ２ａトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（トランスフェクション方法参
照）におけるＮａ＋電流の測定では、ＮａＣｌ １１０、Ｃａｌ２ １、Ｄ−グ
ルコース ２０、ＭｇＣｌ２ ５、ＫＣｌ５、ｐＨ７．４、２９０−２０５ｍｏ
ｓｍを含有する浴溶液（ｍＭ濃度）を用いた。内部溶液（ピペット）溶液はＣｓ
Ｆ １２０、ＮａＣｌ １５、Ｃｓ−ＥＧＴＡ １０、ＨＥＰＥＳ １０、ｐＨ
７．２５、２７５−２８５ｍｏｓｍを含有した。細胞を−９０ｍＶの保持電位に
保持し、脱分極工程に先立って１秒間−１４０ｍＶに予備パルスした。これらの
条件下で非トランスフェクト細胞で活動電位は観察されなかった。
照）におけるＮａ＋電流の測定では、ＮａＣｌ １１０、Ｃａｌ２ １、Ｄ−グ
ルコース ２０、ＭｇＣｌ２ ５、ＫＣｌ５、ｐＨ７．４、２９０−２０５ｍｏ
ｓｍを含有する浴溶液（ｍＭ濃度）を用いた。内部溶液（ピペット）溶液はＣｓ
Ｆ １２０、ＮａＣｌ １５、Ｃｓ−ＥＧＴＡ １０、ＨＥＰＥＳ １０、ｐＨ
７．２５、２７５−２８５ｍｏｓｍを含有した。細胞を−９０ｍＶの保持電位に
保持し、脱分極工程に先立って１秒間−１４０ｍＶに予備パルスした。これらの
条件下で非トランスフェクト細胞で活動電位は観察されなかった。
【００８０】 ＳＮＳ２ａトランスフェクト細胞においては、膜の脱分極は、−７０ｍＶより
正の電位において一過性の内向き電流が誘導され、これは−２０ｍＶでピークと
なり、逆にＮａ＋平衡電位に近くなった（＋５７ｍＶ）。Ｎａ＋コンダクタンス
を記載するベルツマン関数についてのＶ１２および傾きパラメーターは、各々、
−４５±１ｍＶおよび５．３±０．２ｍＶ／ｅ−倍であった（ｎ＝５）。ピーク
電流は０．２−０．８ｎＡの範囲であった。単一の指数関数をピーク電流の不活
化相に適合させると、１．２±０．１ｍｓのｔ値が得られた（ｎ＝５）。ＳＮＳ
２ａ電流はＴＴＸに対してかなり抵抗性であった；見積もったＩＣ５０値は１ｍ
Ｍであり、これは、組換え脳Ｎａ＋チャンネルよりも１０００倍感度が低かった
（Ｉｓｏｍら，１９９５）。ＨＥＫ細胞で発現された組換えＳＮＳ２ａ Ｎａチ
ャンネルの鍵となる特徴は図１１にまとめる。
正の電位において一過性の内向き電流が誘導され、これは−２０ｍＶでピークと
なり、逆にＮａ＋平衡電位に近くなった（＋５７ｍＶ）。Ｎａ＋コンダクタンス
を記載するベルツマン関数についてのＶ１２および傾きパラメーターは、各々、
−４５±１ｍＶおよび５．３±０．２ｍＶ／ｅ−倍であった（ｎ＝５）。ピーク
電流は０．２−０．８ｎＡの範囲であった。単一の指数関数をピーク電流の不活
化相に適合させると、１．２±０．１ｍｓのｔ値が得られた（ｎ＝５）。ＳＮＳ
２ａ電流はＴＴＸに対してかなり抵抗性であった；見積もったＩＣ５０値は１ｍ
Ｍであり、これは、組換え脳Ｎａ＋チャンネルよりも１０００倍感度が低かった
（Ｉｓｏｍら，１９９５）。ＨＥＫ細胞で発現された組換えＳＮＳ２ａ Ｎａチ
ャンネルの鍵となる特徴は図１１にまとめる。
【００８１】 現在までに同定されている電圧依存性ナトリウムチャンネルの全て関するＳＮ
Ｓ２ａの多重配列整列は、ＳＮＳ２ａが、ＴＴＸ−ＲおよびＴＴＸ−Ｓナトリウ
ムチャンネル双方に関する、新しい遺伝子ファミリーであり得ることを示唆する
。これと合致して、ＳＮＳ２ａは、ＴＴＸ−Ｓチャンネルにより特徴的な、ＴＴ
Ｘ抵抗（μＭ範囲のＴＴＸについてのＩＣ５０）およびチャンネル生物物理学的
特性の組合せを呈する。
Ｓ２ａの多重配列整列は、ＳＮＳ２ａが、ＴＴＸ−ＲおよびＴＴＸ−Ｓナトリウ
ムチャンネル双方に関する、新しい遺伝子ファミリーであり得ることを示唆する
。これと合致して、ＳＮＳ２ａは、ＴＴＸ−Ｓチャンネルにより特徴的な、ＴＴ
Ｘ抵抗（μＭ範囲のＴＴＸについてのＩＣ５０）およびチャンネル生物物理学的
特性の組合せを呈する。
【００８２】 ＳＮＳ２ａはＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されると機能的電圧依存性ナトリウム
チャンネルをコードしており、これは、同一細胞で発現させたＳＮＳ／ＰＮ３で
観察されたもの（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１５２３参照）よりも迅速な活性化およ
び不活化動力学および低い活性化閾値を呈した。小直径ＤＲＧ細胞の従前の電気
生理学的実験は、ＴＴＸ−Ｒ電流の不均一性に匹敵するデータを供した（Ｒｉｚ
ｚｏら，１９９４；ＲｕｓｈおよびＥｌｌｉｏｔ １９９７；Ｓｃｈｏｌｚら，
１９９８）。我々もまた、ＴＴＸ−Ｒ電流プロフィールが細胞間で変化すること
を見出し；少数の細胞では、ＴＴＸ−Ｒ電流は生物物理学的特性は、ＨＥＫ２９
３Ｔ細胞において、および小群の他のものにおいて、ＳＮＳ２ａによって発現さ
れるプロフィールと同様であり、動力学はＳＮＳ／ＰＮ３によって発現されたプ
ロフィールとより同様であった。興味深いことには、我々は、ＳＮＳ２ａで当て
はまるような−６０ｍＶもと低い電圧で活性化されたＤＲＧニューロンでＴＴＸ
−Ｒ電流を決して観察しなかった。これは、我々の分布データと合致し、これは
、ＳＮＳ２ａが単独では見出されないが、より高い閾値のＳＮＳ／ＰＮ３チャン
ネルと共に常に一緒に発現されることを示唆する。しかしながら、ＴＴＸ−Ｒの
電流生物物理学的特性は２つの間の中間であり、これは、電流がＳＮＳ２ａおよ
びＳＮＳ／ＰＮ３チャンネル双方の活性の組合せに由来することを示唆する。
チャンネルをコードしており、これは、同一細胞で発現させたＳＮＳ／ＰＮ３で
観察されたもの（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１５２３参照）よりも迅速な活性化およ
び不活化動力学および低い活性化閾値を呈した。小直径ＤＲＧ細胞の従前の電気
生理学的実験は、ＴＴＸ−Ｒ電流の不均一性に匹敵するデータを供した（Ｒｉｚ
ｚｏら，１９９４；ＲｕｓｈおよびＥｌｌｉｏｔ １９９７；Ｓｃｈｏｌｚら，
１９９８）。我々もまた、ＴＴＸ−Ｒ電流プロフィールが細胞間で変化すること
を見出し；少数の細胞では、ＴＴＸ−Ｒ電流は生物物理学的特性は、ＨＥＫ２９
３Ｔ細胞において、および小群の他のものにおいて、ＳＮＳ２ａによって発現さ
れるプロフィールと同様であり、動力学はＳＮＳ／ＰＮ３によって発現されたプ
ロフィールとより同様であった。興味深いことには、我々は、ＳＮＳ２ａで当て
はまるような−６０ｍＶもと低い電圧で活性化されたＤＲＧニューロンでＴＴＸ
−Ｒ電流を決して観察しなかった。これは、我々の分布データと合致し、これは
、ＳＮＳ２ａが単独では見出されないが、より高い閾値のＳＮＳ／ＰＮ３チャン
ネルと共に常に一緒に発現されることを示唆する。しかしながら、ＴＴＸ−Ｒの
電流生物物理学的特性は２つの間の中間であり、これは、電流がＳＮＳ２ａおよ
びＳＮＳ／ＰＮ３チャンネル双方の活性の組合せに由来することを示唆する。
【００８３】 例 ８：スクリーニング ＳＮＳ２ａが疼痛標的として有意な可能性を有することを確立したので、スク
リーニング戦略を決定してチャンネル機能のモジュレーターを同定した。高スル
ープットスクリーニングは、ＳＢＦＩのごときナトリウム指示薬染料およびＤｉ
ＢＡＣのごとき電圧検知染料双方を用いる１４Ｃガイドラインフラックスアッセ
イおよび蛍光ベースアッセイのごときアッセイに基づく。二次スクリーニングは
、パッチクランプ技術または２電極電圧クランプを利用する電気生理学的アッセ
イを含む。三次スクリーニングは疼痛のラットおよびマウスモデルにおけるモジ
ュレーターの研究を含む。
リーニング戦略を決定してチャンネル機能のモジュレーターを同定した。高スル
ープットスクリーニングは、ＳＢＦＩのごときナトリウム指示薬染料およびＤｉ
ＢＡＣのごとき電圧検知染料双方を用いる１４Ｃガイドラインフラックスアッセ
イおよび蛍光ベースアッセイのごときアッセイに基づく。二次スクリーニングは
、パッチクランプ技術または２電極電圧クランプを利用する電気生理学的アッセ
イを含む。三次スクリーニングは疼痛のラットおよびマウスモデルにおけるモジ
ュレーターの研究を含む。
【００８４】 ＳＮＳ２ａ高スループットスクリーニングにおける鍵となる工程を描く臨界的
経路を以下に示す。該スクリーニングは一次スクリーニングで少なくとも２００
，０００化合物をカバーすることを狙うものであるべきであるが、１００万化合
物と高くてもよく、ヒット化合物を次いで脳および／または心臓ナトリウムチャ
ンネルを発現している哺乳動物細胞系に対して再テストする。三次スクリーニン
グは優れており選択的である化合物を採用し、次いで、それらをイン・ビボ疼痛
モデルでテストする。
経路を以下に示す。該スクリーニングは一次スクリーニングで少なくとも２００
，０００化合物をカバーすることを狙うものであるべきであるが、１００万化合
物と高くてもよく、ヒット化合物を次いで脳および／または心臓ナトリウムチャ
ンネルを発現している哺乳動物細胞系に対して再テストする。三次スクリーニン
グは優れており選択的である化合物を採用し、次いで、それらをイン・ビボ疼痛
モデルでテストする。
【００８５】 一次 二次 三次 スクリーニング スクリーニング スクリーニング ＞２００Ｋ 化合物 ＨＴＳ： 選択性／ インビボ ＨＬＰＲ／ 用途依存性 単離された神経 Ｇ−フラックス 炎症性疼痛 組換えＳＮＳ２ａ 脳／心臓 神経病理学的疼痛 細胞系 （ＳＫＮ−ＳＨ−ＳＹ５Ｙ） ＨＴパッチ Ｎ−タイプの さらなる選択性 カルシウム 詳細な電気生理学。
【００８６】 Ｇ−フラックスモデルは選択された方法であり、それは、トリトン中での細胞
の消化およびシンチレーションバイアルへの移動の必要性を除去するＣｔｏｓｔ
ａｒ−Ｔプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の導入で改良されている。Ｃｔｏｓｔａ
ｒ−Ｔプレートは標準的フォーマットの組織培養処理プレートであり、ここに、
各ウエルの透明なベースはポリスチレンおよび接着請求項１記載の遺伝子発現お
よび送達系細胞単層の培養および観察を可能とするシンチラントよりなる。細胞
内の生物学的プロセスにより該ベースと近接した放射性同位体は、それにより、
光の生成をもたらす。
の消化およびシンチレーションバイアルへの移動の必要性を除去するＣｔｏｓｔ
ａｒ−Ｔプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の導入で改良されている。Ｃｔｏｓｔａ
ｒ−Ｔプレートは標準的フォーマットの組織培養処理プレートであり、ここに、
各ウエルの透明なベースはポリスチレンおよび接着請求項１記載の遺伝子発現お
よび送達系細胞単層の培養および観察を可能とするシンチラントよりなる。細胞
内の生物学的プロセスにより該ベースと近接した放射性同位体は、それにより、
光の生成をもたらす。
【００８７】 ガイドラインフォーマット（Ｇ−フラックス）アッセイ ＳＮＳ２ａを安定に過剰発現する哺乳動物細胞は９６ウェルプレートで培養さ
れるであろう。１つのＴ２２５ｃｍ３フラスコは、各ウェルに１００μｌの細胞
培養培地の容量を持つ１０の９６ウェルプレートを設定するのに十分である。各
アッセイを行う前夜にこれらのプレートを設定する。培養培地を取り出し、１０
０μｌのアッセイ緩衝液（１２５ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
５．５ｍＭクルコース、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４
）を添加する。次いで、テスト化合物をウェルに添加し、１０分間プレ−インキ
ュベートする。サソリ毒（０．３１ｍｇ ｍｌ−１）およびベナトリン（１．２
５ｍｇ ｍｌ−１）（Ｓｉｇｍａ）を次いで添加して、ナトリウムチャンネルを
活性化させ、これらの化合物を開いた立体配座の該チャンネルを保持する。細胞
を１４Ｃグアニジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加に先立ってさらに１０分間イン
キュベートする。これを３分間インキュベートし、しかる後、全プレートをシン
チレーションカウンターで読むことができる。
れるであろう。１つのＴ２２５ｃｍ３フラスコは、各ウェルに１００μｌの細胞
培養培地の容量を持つ１０の９６ウェルプレートを設定するのに十分である。各
アッセイを行う前夜にこれらのプレートを設定する。培養培地を取り出し、１０
０μｌのアッセイ緩衝液（１２５ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
５．５ｍＭクルコース、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４
）を添加する。次いで、テスト化合物をウェルに添加し、１０分間プレ−インキ
ュベートする。サソリ毒（０．３１ｍｇ ｍｌ−１）およびベナトリン（１．２
５ｍｇ ｍｌ−１）（Ｓｉｇｍａ）を次いで添加して、ナトリウムチャンネルを
活性化させ、これらの化合物を開いた立体配座の該チャンネルを保持する。細胞
を１４Ｃグアニジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加に先立ってさらに１０分間イン
キュベートする。これを３分間インキュベートし、しかる後、全プレートをシン
チレーションカウンターで読むことができる。
【００８８】 例 ９：ヒトＳＮＳ２ａのクローニング ヒトＳＮＳ２ａ遺伝子はゲノムＤＮＡ断片としてクローン化されている。ラッ
トＳＮＳ２ａ配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲ
実験をヒト・ゲノムＤＮＡで行った。ヒトＳＮＳ２ａ遺伝子に対応する断片を引
き続いて単離し、配列決定した。次いで、ヒト配列から設計したＰＣＲプライマ
ーを用い、ヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）をスクリーニングした。１２０ｋｂのＢＡＣクローン（ＢＡＣ
＃４）を単離し、これをＢＡＣクローンからのランダムライブラリーの構築後に
十分に特徴付けた（以下のセクション参照）。このクローンはヒトＳＮＳ２ａを
コードする遺伝子を含有する。（配列番号：３ないし１７）は、コーディング配
列が理想化された鋳型に対してＢＡＣクローンから単離されている領域を示す。
トＳＮＳ２ａ配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲ
実験をヒト・ゲノムＤＮＡで行った。ヒトＳＮＳ２ａ遺伝子に対応する断片を引
き続いて単離し、配列決定した。次いで、ヒト配列から設計したＰＣＲプライマ
ーを用い、ヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）をスクリーニングした。１２０ｋｂのＢＡＣクローン（ＢＡＣ
＃４）を単離し、これをＢＡＣクローンからのランダムライブラリーの構築後に
十分に特徴付けた（以下のセクション参照）。このクローンはヒトＳＮＳ２ａを
コードする遺伝子を含有する。（配列番号：３ないし１７）は、コーディング配
列が理想化された鋳型に対してＢＡＣクローンから単離されている領域を示す。
【００８９】 蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によってヒトＳＮＳ
２ａを含有するこのＢＡＣクローン（ＢＡＣ＃４）をヒト染色体にマップした（
図３）。ヒトＳＮＳ／ＰＮ３遺伝子も同一染色体遺伝子座にマップされている。
ヒト心臓チャンネルもまた染色体３ｐ２１にマップされていることは注目すべき
である。ＴＴＸ−抵抗性ナトリウムチャンネルの新しい遺伝子クラスターは、従
って、ヒト染色体３上に同定されている。
２ａを含有するこのＢＡＣクローン（ＢＡＣ＃４）をヒト染色体にマップした（
図３）。ヒトＳＮＳ／ＰＮ３遺伝子も同一染色体遺伝子座にマップされている。
ヒト心臓チャンネルもまた染色体３ｐ２１にマップされていることは注目すべき
である。ＴＴＸ−抵抗性ナトリウムチャンネルの新しい遺伝子クラスターは、従
って、ヒト染色体３上に同定されている。
【００９０】 例 １０：ＢＡＣ ＤＮＡの精製 Ｑｉａｇｅｎ ＢＡＣ ＤＮＡ方法に従ってＢＡＣ ＤＮＡを精製した。略言
すれば、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール選択にて、ＢＡＣ液体培養を
Ｌブロスの５ｍｌ培養培地に接種した。これを用いて２００ｍｌのＬブロスを接
種し、次いで、（選択）それで激しく震盪しつつ３７℃で１４時間増殖させた。
次いで、培養を４５００×ｇで２０分間遠心した。細菌ペレットを２０ｍｌの緩
衝液ｐｌに再懸濁させた。２０ｍｌのＰ２を添加し、溶液を温和に混合し、２１
℃で５分間インキュベートし、２０ｍｌの冷却された緩衝液Ｐ３を添加した。溶
液を温和に混合し、氷上で１５分間インキュベートした。３０分間の２０００×
ｇでの遠心後に、上清を平衡化されたＱｉａｇｅｎ Ｔｉｐ１００に適用した。
カラムを１０ｍｌの緩衝液ＱＣで２回洗浄した。ＤＮＡを５回の１ｍｌ分の緩衝
液ＱＣで溶出させ、６５℃まで予備加温した。ＤＮＡを３．５ｍｌのイソプロパ
ノールで沈殿させ、１５０００×ｇで１５分間遠心した。上清を除去し、ペレッ
トを２ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、１５００×ｇで１０分間遠心した。ペ
レットを最後に１０分間風乾し、水に再懸濁させた。
すれば、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール選択にて、ＢＡＣ液体培養を
Ｌブロスの５ｍｌ培養培地に接種した。これを用いて２００ｍｌのＬブロスを接
種し、次いで、（選択）それで激しく震盪しつつ３７℃で１４時間増殖させた。
次いで、培養を４５００×ｇで２０分間遠心した。細菌ペレットを２０ｍｌの緩
衝液ｐｌに再懸濁させた。２０ｍｌのＰ２を添加し、溶液を温和に混合し、２１
℃で５分間インキュベートし、２０ｍｌの冷却された緩衝液Ｐ３を添加した。溶
液を温和に混合し、氷上で１５分間インキュベートした。３０分間の２０００×
ｇでの遠心後に、上清を平衡化されたＱｉａｇｅｎ Ｔｉｐ１００に適用した。
カラムを１０ｍｌの緩衝液ＱＣで２回洗浄した。ＤＮＡを５回の１ｍｌ分の緩衝
液ＱＣで溶出させ、６５℃まで予備加温した。ＤＮＡを３．５ｍｌのイソプロパ
ノールで沈殿させ、１５０００×ｇで１５分間遠心した。上清を除去し、ペレッ
トを２ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、１５００×ｇで１０分間遠心した。ペ
レットを最後に１０分間風乾し、水に再懸濁させた。
【００９１】 例 １１：ＢＡＣクローンからのランダムライブラリーの構築 これは、ヒトＳＮＳ２ａ遺伝子を含有する１２０ｋｂのＢＡＣクローンを分析
するための重要な要件である。
するための重要な要件である。
【００９２】 ５０μｌ容量中の５μｇのＢＡＣ ＤＮＡを、パルス間に氷上で１分間冷却し
つつ、パワーレベル２にて１秒間の２パルスで、カップホーン中で音波処理した
。断片化されたＤＮＡ分子の、音波処理によって引き起こされた突出またはタグ
ド末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼ
活性によって平滑末端とした。成分は以下の通りであった：４７．５μｌ音波処
理ＤＮＡ、２０μｌの５×Ｔ４ ＤＮＡ緩衝液、１０μｌの２ｍＭの各ｄＴＮＰ
、１７．５μｌ二重蒸留水、５μｌのＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌ（１単位／μｌ Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。この反応ミックスを３７℃で３時間インキュベートした
。該ＤＮＡをＰｈａｒｍａｃｉａのＳｉｚｅＳｅｐ４００スピンカラムでサイズ
選択した。得られたＤＮＡ断片をＳｍａｌＩリン酸化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩ
Ｉ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、引き続いて、ＸＬ１ブル
ーコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換した。インサ
ートに近接するＭ１３ベクターおよびＭ１３−２０プライマーで個々のクローン
をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をネステッドプライマーＴ３およびＴ７を用いて
配列決定した。
つつ、パワーレベル２にて１秒間の２パルスで、カップホーン中で音波処理した
。断片化されたＤＮＡ分子の、音波処理によって引き起こされた突出またはタグ
ド末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼ
活性によって平滑末端とした。成分は以下の通りであった：４７．５μｌ音波処
理ＤＮＡ、２０μｌの５×Ｔ４ ＤＮＡ緩衝液、１０μｌの２ｍＭの各ｄＴＮＰ
、１７．５μｌ二重蒸留水、５μｌのＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌ（１単位／μｌ Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。この反応ミックスを３７℃で３時間インキュベートした
。該ＤＮＡをＰｈａｒｍａｃｉａのＳｉｚｅＳｅｐ４００スピンカラムでサイズ
選択した。得られたＤＮＡ断片をＳｍａｌＩリン酸化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩ
Ｉ ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、引き続いて、ＸＬ１ブル
ーコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換した。インサ
ートに近接するＭ１３ベクターおよびＭ１３−２０プライマーで個々のクローン
をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をネステッドプライマーＴ３およびＴ７を用いて
配列決定した。
【００９３】 以下のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ修復を除き前記したことくに第２の方法を使
用した。オリゴヌクレオチドリンカーをＤＮＡ断片に連結した。これらのオリゴ
内の部位に向けられたプライマーを用い、ＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した
。リンカー連結反応ミックスを以下のごとくに設定し：１の音波処理ＢＡＣ Ｄ
ＮＡ、５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００単位／μｌ ＮＥＢ）、５μｌの
１０×リガーゼ緩衝液、２μｌのリンカー、３７．５μｌの二重蒸留水、次いで
、２１℃で８時間インキュベートした。５０ピコモルのリンカープライマー、１
×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．５ｍＭ ＭａＣｌ２、１００μＭの各ｄＮＴ
Ｐ、ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５単位を用いてＰＣＲ増幅を行った。反応容
量は５０μｌであり、ＰＣＲパラメーターは：２分間の９４℃、３０秒間の９４
℃、１分間の５５℃、２分間の７２℃の４０サイクル、１０分間の７２℃。得ら
れたＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し
、ＩＮＶαＦ−コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換
した。次いで、得られたＰＣＲ産物を、ネステッドプライマーであるＴ３および
Ｔ７で配列決定した。
用した。オリゴヌクレオチドリンカーをＤＮＡ断片に連結した。これらのオリゴ
内の部位に向けられたプライマーを用い、ＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した
。リンカー連結反応ミックスを以下のごとくに設定し：１の音波処理ＢＡＣ Ｄ
ＮＡ、５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００単位／μｌ ＮＥＢ）、５μｌの
１０×リガーゼ緩衝液、２μｌのリンカー、３７．５μｌの二重蒸留水、次いで
、２１℃で８時間インキュベートした。５０ピコモルのリンカープライマー、１
×緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．５ｍＭ ＭａＣｌ２、１００μＭの各ｄＮＴ
Ｐ、ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５単位を用いてＰＣＲ増幅を行った。反応容
量は５０μｌであり、ＰＣＲパラメーターは：２分間の９４℃、３０秒間の９４
℃、１分間の５５℃、２分間の７２℃の４０サイクル、１０分間の７２℃。得ら
れたＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し
、ＩＮＶαＦ−コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換
した。次いで、得られたＰＣＲ産物を、ネステッドプライマーであるＴ３および
Ｔ７で配列決定した。
【００９４】
【００９５】
【参考文献】
【００９６】
【参考文献】
【００９７】
【参考文献】
【００９８】
【参考文献】
【表１】
【表１】
【表１】
【表１】
【表１】
【表１】
【表１】
【表２】
【表２】
【表２】
【表２】
【表２】
【表２】
【表２】
【表３】
【表３】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は単離されたラットＳＮＳ２ａイオンチャンネル断片、および分析に用い
たプローブの概要である。
たプローブの概要である。
【図２】 図２はラットＳＮＳ２ａクローンに対する配列番号：３ないし配列番号：１７
の位置を示す。
の位置を示す。
【図３】 図３はソト染色体３ｐ２１へのヒトＳＮＳ２ａの位置決定を示す。
【図４】 図４はＳＮＳ２ａでプローブした多重組織ノーザンブロットを示す。レーン１
＝ＤＲＧ、レーン２＝脊髄、レーン３＝全脳レーン４＝副腎、レーン５＝心臓、
レーン６＝ＰＣ１２、レーン７＝ＰＣ１２＋ＮＧＦ、レーン８＝ＲＮＡマーカー
。
＝ＤＲＧ、レーン２＝脊髄、レーン３＝全脳レーン４＝副腎、レーン５＝心臓、
レーン６＝ＰＣ１２、レーン７＝ＰＣ１２＋ＮＧＦ、レーン８＝ＲＮＡマーカー
。
【図５】 図５はＳＮＳ２ａ特異的プローブを用いるラットＤＲＧ組織におけるイン・サ
イチュハイブリダイゼーションを示す。図５ａ）はセンスプローブを、５ｂ）は
アンチセンスプローブを示す。
イチュハイブリダイゼーションを示す。図５ａ）はセンスプローブを、５ｂ）は
アンチセンスプローブを示す。
【図６】 図６はヒトＤＲＧへのＳＮＳ２ａの位置決定を示す。
【図７】 図７はラット疼痛モデルから採取したＤＲＧ組織を用いるＳＮＳ２ａでプロー
ブしたノーザンブロットを示す。レーン１＝対照ＤＲＧ、レーン２＝ＤＲＧ＋２
４時間フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）；レーン３＝ＤＲＧ＋２４時間座
骨神経切断；レーン４＝ＤＲＧ＋４８時間座骨神経切断；レーン５＝ＤＲＧ＋７
日座骨神経切断。
ブしたノーザンブロットを示す。レーン１＝対照ＤＲＧ、レーン２＝ＤＲＧ＋２
４時間フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）；レーン３＝ＤＲＧ＋２４時間座
骨神経切断；レーン４＝ＤＲＧ＋４８時間座骨神経切断；レーン５＝ＤＲＧ＋７
日座骨神経切断。
【図８】 図８はラットＳＮＳ２ａがクローン化された３つのベクター：ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐＣ１−ｎｅｏおよびｐＣＩＮ５を示す。
ｒｉｐｔ、ｐＣ１−ｎｅｏおよびｐＣＩＮ５を示す。
【図９ａ】 図９ａはｍＲＮＡおよび蛋白質についてのＳＮＳ２ａおよびＳＮＳ／ＰＮ３染
色の顕微鏡写真を示す。Ｄ．Ｅ．Ｆ．はＳＮＳ２ａ標識が小ニューロン（１９−
２５μｍ直径）では専ら見出されることを確認する。ＳＮＳ２ａおよびＳＮＳ／
ＰＮ３
色の顕微鏡写真を示す。Ｄ．Ｅ．Ｆ．はＳＮＳ２ａ標識が小ニューロン（１９−
２５μｍ直径）では専ら見出されることを確認する。ＳＮＳ２ａおよびＳＮＳ／
ＰＮ３
【図９ｂ】 図９ｂはｍＲＮＡおよび蛋白質についてのＳＮＳ２ａおよびＳＮＳ／ＰＮ３染
色の顕微鏡写真を示す。 ｍＲＮＡおよび蛋白質についての二重標識（Ｇ．Ｈ．Ｉ．Ｊ．）は小ニュー
ロンにおける着色を示す（矢印）：より大きなニューロンはＳＮＳ／ＰＮ３では
陽性に見ることができるが、ＳＮＳ２ａでは陰性に見ることができる（矢印頭部
）。
色の顕微鏡写真を示す。 ｍＲＮＡおよび蛋白質についての二重標識（Ｇ．Ｈ．Ｉ．Ｊ．）は小ニュー
ロンにおける着色を示す（矢印）：より大きなニューロンはＳＮＳ／ＰＮ３では
陽性に見ることができるが、ＳＮＳ２ａでは陰性に見ることができる（矢印頭部
）。
【図１０】 図１０はＳＮＳ２ａに対して設計された２つの抗ペプチド抗体でのＳＮＳ２ａ
ＤＮＡでトランスフェクトした細胞からのレーンにおける特異的染色を示す免疫
沈殿ウェスタンブロットを示す。細胞を黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）でトランスフ
ェクトした対照レーンは染色を示さなかった。
ＤＮＡでトランスフェクトした細胞からのレーンにおける特異的染色を示す免疫
沈殿ウェスタンブロットを示す。細胞を黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）でトランスフ
ェクトした対照レーンは染色を示さなかった。
【図１１】 図１１はＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現された組換えラットＳＮＳ２ａＮａ＋チャ
ンネルの生物物理学的および薬理学的特性を示す。代表的な電流の記録はそのピ
ーク電流−電圧関係で示される（Ａ．Ｂ．）。キャパシタンストランジエントは
明瞭性のためブランクとしている。パネルＣはＳＮＳ２ａに対するＴＴＸの効果
を示す。それはＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルのｎＭ感度と比較したサブμ
Ｍ濃度のＴＴＸに抵抗性である。
ンネルの生物物理学的および薬理学的特性を示す。代表的な電流の記録はそのピ
ーク電流−電圧関係で示される（Ａ．Ｂ．）。キャパシタンストランジエントは
明瞭性のためブランクとしている。パネルＣはＳＮＳ２ａに対するＴＴＸの効果
を示す。それはＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルのｎＭ感度と比較したサブμ
Ｍ濃度のＴＴＸに抵抗性である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年５月３１日（２０００．５．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (72)発明者 ヒック、キャロライン・アン イギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハ ートフォードシャー、スティーブンエイ ジ、ガンネルズ・ウッド・ロード、グラク ソ・ウェルカム・ピーエルシー内（番地な し) (72)発明者 テイト、サイモン・ニコラス イギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハ ートフォードシャー、スティーブンエイ ジ、ガンネルズ・ウッド・ロード、グラク ソ・ウェルカム・ピーエルシー内（番地な し) Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B063 QA01 QA05 QR48 QR73 QR80 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA081 ZA211 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 DA76 EA50 FA72 FA74
Claims (19)
- 【請求項１】 配列番号：２に示されたアミノ酸配列を含む単離された哺乳
動物ナトリウムチャンネル蛋白質またはその変異体。 - 【請求項２】 鎮痛または抗−過敏症活性を持つ剤をスクリーニングする方
法で使用される請求項１記載のナトリウムチャンネル蛋白質またはその変異体。 - 【請求項３】 請求項１記載のナトリウムチャンネル蛋白質またはその変異
体をコードするヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ。 - 【請求項４】 該配列が配列番号：１に示される請求項３記載の単離された
ヌクレオチド配列。 - 【請求項５】 請求項３または４いずれかにおいて言及されたヌクレオチド
配列のいずれかの部分にハイブリダイズする単離されたヌクレオチド配列。 - 【請求項６】 配列番号：３ないし１７のうちの１以上で定義されたヌクレ
オチド配列またはその変異体を含む組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 配列番号：３ないし１７のうちの各々で定義された配列を含
む配列をみ、ここに、増える数字の順序が、配列番号が５’から３’の方向で読
まれる順序を表す組換えポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項７または７の配列によってコードされた単離されたア
ミノ酸配列。 - 【請求項９】 約１μＭのＴＴＸについてのＩＣ５０を有する哺乳動物、例
えば、ラットまたはヒトの神経節後根から誘導可能な単離されたナトリウムチャ
ンネル。 - 【請求項１０】 配列番号：２に定義された配列と少なくとも約９０％同一
性を有する第一級アミノ酸配列を含む蛋白質。 - 【請求項１１】 請求項３ないし７いずれか１つに記載のヌクレオチド配列
を含むベクター、例えば、プラスミド。 - 【請求項１２】 請求項１１記載のベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞。 - 【請求項１３】 請求項１記載のナトリウムチャンネルまたはその変異体を
認識しそれに結合する抗体またはその断片。 - 【請求項１４】 当該チャンネルをテスト化合物と接触つせ、次いで、該チ
ャンネルの活性または不活性を検出することを特徴とする請求項１記載のナトリ
ウムチャンネルまたはその変異体のモジュレーターを同定する方法。 - 【請求項１５】 宿主細胞において請求項１記載の蛋白質またはその変異体
を発現させ；該蛋白質をテスト化合物と接触させ；次いで、ナトリウムフラック
スを測定することを特徴とするナトリウムフラックスを変調するテスト化合物を
アッセイする方法。 - 【請求項１６】 請求項１または１０に定義された蛋白質またはその変異体
のモジュレーター。 - 【請求項１７】 請求項１６記載のモジュレーターを含む医薬。
- 【請求項１８】 疼痛または過敏症治療用の医薬を製造するための請求項１
６記載のモジュレーターの使用。 - 【請求項１９】 有効量の請求項１７記載の医薬を患者に投与することを特
徴とする治療方法。
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|---|---|---|---|
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| PCT/GB1999/000838 WO1999047670A1 (en) | 1998-03-18 | 1999-03-18 | Mammalian sodium channel proteins |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=10828811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2000536853A Pending JP2002508941A (ja) | 1998-03-18 | 1999-03-18 | 哺乳動物ナトリウムチャンネル蛋白質 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2002508941A (ja) |
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| GB (1) | GB9805793D0 (ja) |
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| ATE455304T1 (de) * | 2000-04-14 | 2010-01-15 | Genencor Int | Verfahren zur selektiven zielen |
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-
1999
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- 1999-03-18 EP EP99910530A patent/EP1062334A1/en not_active Withdrawn
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|---|---|
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