JP2003530849A - ヒト脳からの新規の電圧ゲートカリウムチャネル、Ｋｖ１０．１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｓｌｏファミリーメンバーの単離された核酸およびアミノ酸配列（例えば、Ｋｖ１０．１のようなＫｖ１０サブファミリーメンバーに対する抗体）、Ｋｖ１０．１のようなＫｖ１０サブファミリーメンバーを検出する方法、生物学的に活性なＫｖ１０サブファミリーメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）を用いるカリウムチャネルアクチベーターおよびインヒビターについてのスクリーニングの方法、およびＫｖ１０サブファミリーメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）を含む、電圧ゲートカリウムチャネルのアクチベーターおよびインヒビターについてのスクリーニングのための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の相互参照） 本件出願は、ＵＳＳＮ６０／１９７，７９３（２０００年４月１４日出願）の
優先権を主張し、その出願の全体を参考として援用する。

【０００２】 （連邦が援助した研究開発のもとでなされた発明の権利に関する陳述） 適用せず。

【０００３】 （発明の背景） カリウムチャネルは、多数の生理学的プロセス（心拍の調節、動脈の拡張、イ
ンスリンの放出、神経細胞の興奮性、腎臓の電解質輸送の調節を含む）に関与す
る。従って、カリウムチャネルは、例えば、神経組織、筋肉組織、腺組織、免疫
組織、生殖組織、および上皮組織のような広範に種々の動物細胞において見出さ
れる。これらのチャネルは、特定の条件下において、細胞内へ、および／または
細胞内からのカリウムの流れを可能とする。例えば、これらチャネルが開口する
際の、カリウムイオンの外向きの流れは、細胞の内部をより負にして、細胞に適
用された脱分極電圧を相殺する。これらのチャネルは、例えば、カルシウム感受
性、電圧ゲーティング、セカンドメッセンジャー、細胞外リガンド、およびＡＴ
Ｐ感受性によって調節されている。

【０００４】 カリウムチャネルは、予測された構造および機能の類似性に基づいて８つのフ
ァミリーに分類されるαサブユニットから生成される（Ｗｅｉら、Ｎｅｕｒｏｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３５（７）：８０５〜８２９（１９９７））。これら
のファミリーの内の３つ（Ｋｖ、Ｅａｇ関連、およびＫＱＴ（現在は、ＫＣＮＱ
と呼ばれる））は、６つの膜貫通ドメインの共通モチーフを共有し、そして主に
電圧にゲートされる。他の２つのファミリー（ＣＮＧおよびＳＫ／ＩＫ）もまた
このモチーフを含むが、それぞれサイクリックヌクレオチドおよびカルシウムに
ゲートされる。カリウムチャネルαサブユニットの他の３つのファミリーは、異
なるパターンの膜貫通ドメインを有する。Ｓｌｏファミリーのカリウムチャネル
（ＢＫチャネルとしても公知）は、７つの膜貫通ドメインを有し（Ｍｅｅｒａら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４（２５）：１４０６６
〜７１（１９９７））、そして電圧およびカルシウムまたはｐＨの両方にゲート
される（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３５０９〜
１６（１９９８））。別のファミリーである内向き整流（ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ）
カリウムチャネル（Ｋｉｒ）は、２つの膜貫通ドメインを含む構造ファミリー（
例えば、Ｌａｇｒｕｔｔａら、Ｊｐｎ．Ｈｅａｒｔ．Ｊ．３７：６５１〜６６０
１９９６を参照のこと）、およびこの内向き整流モチーフの２つの縦列反復を
含む８番目の機能的に多様性のあるファミリー（ＴＰ、または「２つの孔（ｔｗ
ｏ−ｐｏｒｅ）」）に属する。

【０００５】 カリウムチャネルは、代表的には、４つのαサブユニットから形成され、そし
てホモマー（ｈｏｍｏｍｅｔｒｉｃ）（同一のαサブユニットから生成される）
、またはヘテロマー（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）（２つ以上の異なるタイプのα
サブユニットから生成される）であり得る。さらに、カリウムチャネルは、さら
なる構造的に異なる補助的なサブユニット（すなわち、βサブユニット）を含む
ことが、しばしば見出される（例えば、Ｋｖ、Ｓｌｏ、およびＫＣＮＱカリウム
チャネルファミリー）。これらのβサブユニットは、カリウムチャネル自体を形
成しないが、その代わりに、これらβサブユニットは、αサブユニットによって
形成されたチャネルの機能的性質を調節する補助的なサブユニットとして作用す
る。例えば、Ｋｖのβサブユニットは、細胞質にあり、そしてＫｖチャネルの表
面での発現を増加し、および／またはチャネルの不活化の速度論を調節すること
が公知である（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９３：６２５〜
６３３（１９９６）；Ｓｈｉら、Ｎｅｕｒｏｎ １６（４）：８４３〜８５２（
１９９６））。別の例において、ＫＣＮＱファミリーのβサブユニットであるｍ
ｉｎＫは、主に活性化速度論を変化させる（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８４：８０〜８３（１９９６））。

【０００６】 電圧ゲートカリウムチャネルのＫｖスーパーファミリーは、上記のように代表
的に４つのサブユニットから構成される、ヘテロマーチャネルとホモマーチャネ
ルの両方を含む（例えば、Ｓａｌｉｎａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２
：８７７４〜８７８０（１９９７）；Ｓａｌｉｎａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７２：２４３７１〜２４３７９（１９９７）；Ｐｏｓｔら、ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔｓ．３９９：１７７〜１８２（１９９６）を参照のこと）。電圧ゲートカ
リウムチャネルが、広範に種々の組織および細胞型において見出されており、例
えば、ニューロンの統合、心臓の整調、筋肉の収縮、ホルモン分泌、細胞容量調
節、リンパ球分化、および細胞増殖のようなプロセスに関与する（例えば、Ｓａ
ｌｉｎａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３９：２４３７１〜２４３７９（１９
９７）を参照のこと）。チャネルを構成する、Ｋｖスーパーファミリーのいくつ
かのαサブユニットが、クローニングされ、そして発現されている（例えば、Ｋ
ｖ２．１、、Ｋｖ２．２、Ｋｖ５．１、Ｋｖ６．１（Ｄｒｅｗｅら、Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１２：５３８〜５４８（１９９２）；Ｐｏｓｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔｓ．３９９：１７７〜１８２（１９９６））；Ｋｖ８．１（Ｈｕｇｎｏｔら
、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３３２２〜３３３１（１９９６））；ならびにＫｖ９．
１およびＫｖ９．２（Ｓａｌｉｎａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３９：２４
３７１〜２４３７９（１９９７））を参照のこと）。これらの遺伝子のいくつか
の発現パターンもまた、調べられている（例えば、Ｖｅｒｍａ−Ｋｕｒｖａｒｉ
ら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．４６：５４〜６２（１９９７）；Ｍａｌｅｔ
ｉｃ−Ｓａｖａｔｉｃら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：３８４０〜３８５１（
１９９５）；Ｄｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８４：３７〜４８（１９９８）を参照
のこと）。

【０００７】 （発明の要約） 従って、本発明は、Ｋｖスーパーファミリーの新規のメンバー、およびカリウ
ムチャネルのＫｖ１０ファミリーを初めて提供する。Ｋｖ（またはＫＣＮＱ）遺
伝子ファミリーの電圧ゲートカリウムチャネルをコードする、新規のヒトＤＮＡ
配列であるＫｖ１０．１が、クローニングされ、そして本明細書に示される。Ｋ
ｖ１０．１は、以前に未同定であったＫｖ１０カリウムチャネルサブファミリー
を規定し、そしてＫｖ１０．１は、以前に規定されたサブファミリーのいずれに
も、明確には適合しない。Ｋｖ１０．１は、脳（例えば、脳全体、黒質、および
前頭皮質）、脊髄、前立腺、および網膜において発現する。Ｋｖ１０．１のモジ
ュレーターは、ＣＮＳ障害（例えば、てんかんおよび他の発作障害、パーキンソ
ン病、片頭痛、精神病性の障害（例えば、精神分裂病およびうつ病）、認識障害
（例えば、学習障害および記憶障害）、神経障害性疼痛、視覚障害、前立腺肥厚
）の処置において、精母細胞成熟および精母細胞運動性の制御のため、不妊症の
処置のため、および避妊薬として有用である。モジュレーターもまた、神経保護
剤（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、発作を防ぐため
）として有用である。

【０００８】 １つの局面において、本発明は、Ｋｖ１０カリウムチャネルのαサブユニット
を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、ここで、このポリペ
プチドは：（ｉ）少なくとも１つのさらなるＫｖ１０αサブユニットとともに、
電圧ゲーティングの特徴を有するＫｖカリウムチャネルを形成し、そして（ｉｉ
）配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して、少なくとも６０％のアミノ酸
配列同一性を有する部分配列を含む。

【０００９】 １つの実施形態において、この核酸は、配列番号１または配列番号２のヌクレ
オチド配列を含む。別の実施形態において、この核酸は、中程度にストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下において、配列番号１または配列番号２の
ヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズする。別の実施形態において、核
酸が、以下の群から選択されるプライマーの場合と同一のテンプレート配列に対
して、ストリンジェント条件下で選択的にハイブリダイズするプライマーによっ
て増幅される：

【００１０】

【化２】 別の局面において、本発明は、Ｋｖ１０ポリペプチドをコードする単離された
核酸を提供し、この核酸は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列に
対してストリンジェント条件下で特異的にハイブリダイズする。

【００１１】 別の局面において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸に
対して、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核
酸を提供する。

【００１２】 別の実施形態において、本発明は、核酸を検出する方法を提供し、この方法は
、この核酸と、上記のように単離された核酸とを接触させる工程を包含する。

【００１３】 別の局面において、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクター、およびその
ような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【００１４】 別の局面において、本発明は、Ｋｖ１０カリウムチャネルのαサブユニットを
含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでこのポリペプチドは：（ｉ）少な
くとも１つのさらなるＫｖαサブユニットとともに、電圧ゲーティングの特徴を
有するＫｖカリウムチャネルを形成し、そして（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１
０２〜５１４に対して、少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する部分配
列を含む。

【００１５】 １つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号３に対して惹起され
た抗体に対して特異的に結合する。別の実施形態において、このポリペプチドは
、約５８ｋＤ〜約６８ｋＤの分子量を有する。別の実施形態において、このポリ
ペプチドは、ヒトＫｖ１０．１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において
、このポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。

【００１６】 １つの実施形態において、このポリペプチドは、ホモマーのカリウムチャネル
のαサブユニットを含む。別の実施形態において、この核酸によってコードされ
るポリペプチドは、ヘテロマーのカリウムチャネルのαサブユニットを含む。

【００１７】 別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるＫｖ１０ポリペプチドに
特異的に結合する抗体を提供する。

【００１８】 別の局面において、本発明は、Ｋｖ１０カリウムチャネルを通るイオンフラッ
クスを増加または減少する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、以下の
工程：（ｉ）その化合物を、Ｋｖ１０ポリペプチドと接触させる工程であって、
ここで、このポリペプチドは、（ａ）少なくとも１つのさらなるＫｖαサブユニ
ットとともに、電圧ゲーティングの特徴を有するＫｖカリウムチャネルを形成し
、そして（ｂ）配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して少なくとも６０％
のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドである、工程；および（
ｉｉ）その化合物のカリウムチャネルに対する機能的な効果を決定する工程、を
包含する。

【００１９】 １つの実施形態において、その機能的効果は、物理的効果または化学的効果で
ある。別の実施形態において、その機能的効果は、チャネルに対するリガンドの
結合の測定によって決定される。

【００２０】 １つの実施形態において、そのポリペプチドは、真核生物宿主細胞内または真
核生物宿主細胞膜内において発現される。別の実施形態において、機能的効果は
、イオンフラックス、イオン濃度の変化、電流の変化、または電圧の変化によっ
て決定される。

【００２１】 １つの局面において、そのポリペプチドは、リコンビナントである。

【００２２】 別の局面において、本発明は、Ｋｖ１０ポリペプチドを含むカリウムチャネル
を通るイオンフラックスを増加または減少する化合物を同定する方法を提供し、
この方法は、以下の工程：（ｉ）Ｋｖ１０ポリペプチドの少なくとも２５アミノ
酸のアミノ酸配列か、またはＫｖ１０ポリペプチドをコードする核酸の少なくと
も７５ヌクレオチドを、コンピュータシステムに入力する工程であって、ここで
Ｋｖ１０ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して少なく
とも６０％のアミノ酸配列同一性を有する部分配列を含む、工程；（ｉｉ）アミ
ノ酸配列によってコードされるポリペプチドの三次元構造を作成する工程；（ｉ
ｉｉ）Ｋｖポリペプチドを含むカリウムチャネルの三次元構造を作成する工程；
（ｉｖ）その化合物の三次元構造を作成する工程；および（ｖ）そのポリペプチ
ドの三次元構造と、その化合物の三次元構造を比較して、その化合物がそのポリ
ペプチドに結合するか否かを決定する工程、を包含する。

【００２３】 別の実施形態において、本発明は、Ｋｖカリウムチャネルを通るイオンフラッ
クスを調節する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載される方法を使用し
て、Ｋｖカリウムチャネル（このチャネルは、Ｋｖαサブユニットを含む）を、
同定された化合物の治療有効量と接触させる工程を包含する。

【００２４】 別の局面において、本明細書は、ヒト組織においてｈＫｖ１０核酸およびポリ
ペプチドの存在を検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程；（ｉ）生物
学的サンプルを単離する工程；（ｉｉ）その生物学的サンプルを、ｈＫｖ１０と
選択的に会合するｈＫｖ１０特異的試薬と接触させる工程；および（ｉｉｉ）こ
のサンプルと選択的に会合したｈＫｖ１０特異的試薬のレベルを検出する工程、
を包含する。

【００２５】 １つの実施形態において、ヒトＫｖ１０．１特異的試薬は、以下からなる群よ
り選択される：ヒトＫｖ１０．１特異的抗体、ヒトＫｖ１０．１特異的オリゴヌ
クレオチドプライマー、およびヒトＫｖ１０．１核酸プローブ。

【００２６】 別の局面において、本発明は、コンピュータシステム内においてヒトＫｖ１０
遺伝子の変異をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下の工程：（
ｉ）配列番号１または配列番号２、および保存的に改変されたその改変体のヌク
レオチド配列を有するＫｖ１０ポリペプチドをコードする第１の核酸配列を、コ
ンピュータに入力する工程；（ｉｉ）その第１の核酸配列を、その第１の核酸配
列と実質的同一性を有する第２の核酸配列と比較する工程；および（ｉｉｉ）そ
の第１の核酸配列とその第２の核酸配列との間のヌクレオチドの差異を同定する
工程、を包含する。

【００２７】 １つの実施形態において、その第２の核酸配列は、疾患状態に関連する。

【００２８】 別の局面において、本発明は、コンピュータシステムにおいて、Ｋｖ１０ポリ
ペプチドの三次元構造を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ｉ
）Ｋｖ１０ポリペプチドの少なくとも５０アミノ酸のアミノ酸配列、またはその
ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１５０ヌクレオチドを、そのコンピ
ュータシステムに入力する工程であって、このＫｖ１０ポリペプチドは、配列番
号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性
を有する部分配列を含む、工程；および（ｉｉ）そのアミノ酸配列によってコー
ドされるポリペプチドの三次元構造を作成する工程、を包含する。

【００２９】 １つの実施形態において、そのアミノ酸配列は、一次構造であり、ここでその
作成工程は、以下の工程：（ｉ）その一次構造によって決定されるエネルギーの
項（ｔｅｒｍ）を使用してその一次構造から二次構造を形成する工程；および（
ｉｉ）その二次構造によって決定されるエネルギーの項を使用してその二次構造
から三次構造を形成する工程、を包含する。別の実施形態において、作成工程は
、その三次元構造によってコードされる異方性の項を使用して、その三次構造か
ら四次構造を形成する工程をさらに包含する。別の実施形態において、この方法
はさらに、リガンドに結合するポリペプチドの三次元構造の領域を同定する工程
、およびこの領域を使用して、Ｋｖ１０．１ポリペプチドを含むカリウムチャネ
ルに結合するリガンドを同定する工程をさらに包含する。 （発明の詳細な説明） 本発明は、初めて、電圧ゲートカリウムチャネルのＫｖ１０サブファミリーの
メンバーをコードする核酸を提供する。本発明はまた、Ｋｖ１０サブファミリー
の最初に同定されたメンバーであるＫｖ１０．１の配列を提供する。このポリペ
プチドモノマーは、カリウムチャネルのＫｖファミリーのメンバーである。この
ファミリーのメンバーは、６つの膜貫通領域を有するカリウムチャネルのポリペ
プチドサブユニットである。Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞系におけるＫｖ１０．１遺
伝子の発現は、機能的電圧ゲートカリウムチャネルを生成しない（図３を参照の
こと）。しかし、Ｋｖ１０．１のＫｖ２．１またはＫｖ２．２との同時発現は、
Ｋｖ１０．１が、ヘテロマルチマー形成を通して他のＫｖチャネルの特性を改変
し得ることを示す。Ｋｖ１０．１は、Ｋｖ２．１電流の大きさの強力な減少を、
おそらく、非機能的かまたは電圧のみではゲートし得ないかのいずれかであるヘ
テロダイマーの形成を通して、引き起こす。対照的に、Ｋｖ１０．１は、Ｋｖ２
．２電流の活性化および失活の速度を増大させ、そしてＫｖ２．２活性化の電圧
依存性における脱分極シフトを引き起こす。これらの特性は、ニューロン興奮性
の制御におけるＫｖ１０．１の調節についての役割を示唆する。なぜなら、Ｋｖ
２．１およびＫｖ２．２は、ほとんどのニューロンにおいて主要な遅延整流カリ
ウム電流を含むからである。

【００３０】 したがって、本発明は、Ｋｖ１０サブユニットを含むカリウムチャネルのアク
チベーターおよびインヒビターについてスクリーニングする方法を提供する。こ
のようなカリウムチャネル活性のモジュレーターは、ＣＮＳ障害（例えば、てん
かんおよびその他の発作障害）、パーキンソン病、偏頭痛、視力障害、精神障害
（例えば、精神分裂病および抑圧）、および認知障害（例えば、学習障害および
記憶障害）を含む障害を処置するにおいて有用である。このような調節因子はま
た、神経保護因子（例えば、発作を予防するため）として、および疼痛（例えば
、神経障害性の疼痛）の処置のために有用である。このような調節因子はまた、
視覚障害（網膜における異常電気信号を含む）の処置のために有用である。最終
的に、このような調節因子はまた、前立腺過形成の処置のため、精母細胞成熟お
よび運動性の制御のため、不妊の処置のため、および避妊因子として有用である
。

【００３１】 さらに、本発明は、Ｋｖ１０．１が直接的または間接的なレポーター分子とし
て作用するＫｖ１０活性についてのアッセイを提供する。アッセイおよび検出系
におけるＫｖ１０のレポーター分子としてのこのような用途は、広汎な適用を有
する。例えば、Ｋｖ１０は、レポーター分子として、インビトロ、インビボ、お
よびエキソビボでの、カリウム濃度、膜電位、電流、イオンフラックス、転写、
シグナル伝達、レセプターリガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度にお
ける変化を測定するために使用され得る。１つの実施形態において、Ｋｖ１０は
、特定の方向（例えば、外向きまたは内向きのカリウム流）における電流のイン
ジケーターとして、および別の実施形態においては、Ｋｖ１０は、グリーン蛍光
タンパク質のようなセカンドレポーター分子への結合を介するインジケーターレ
ポーターとして、使用され得る。

【００３２】 本発明はまた、Ｋｖ１０核酸およびタンパク質発現を検出する方法であって、
Ｋｖ１０ファミリーメンバーによって提供されるチャネルの多様性の調査を可能
にする方法、ならびに障害（ＣＮＳ障害（例えば、てんかんおよびその他の発作
性の障害）、パーキンソン病、偏頭痛、精神障害（例えば、精神分裂病、および
抑圧）、認知障害（例えば、学習障害および記憶障害）、神経障害による疼痛、
視覚障害、前立腺過形成、精母細胞成熟障害および運動障害、ならびに不妊を含
む）の診断を提供する。

【００３３】 最後に、本発明は、ｈＫｖ１０遺伝子またはタンパク質の変異についてスクリ
ーニングする方法を提供する。本発明は、コンピューターの使用を伴うｈＫｖ１
０における変異についてのスクリーニングの方法を含むがこれらに限定されない
。同様に、本発明は、Ｋｖ１０ポリペプチド（例えば、Ｋｖ１０．１）の３次元
構造、ならびに得られるＫｖ１０ポリペプチドの３次元構造を含むコンピュータ
読み取り可能画像またはデータを同定する方法を提供する。ｈＫｖ１０遺伝子ま
たはタンパク質の変異をスクリーニングするための他の方法は、高密度オリゴヌ
クレオチドアレイ、ＰＣＲ、イムノアッセイなどを含む。

【００３４】 機能的に、Ｋｖ１０ポリペプチドは、Ｋｖカリウムチャネルのαサブユニット
である。Ｋｖ１０．１チャネルは、電圧ゲートされている。代表的には、このよ
うなチャネルは、ヘテロマーまたはホモマーであり、そして４つのαサブユニッ
トまたはモノマー（それぞれ、６つの膜貫通ドメインを有する）を含む。ヘテロ
マーＫｖチャネルは、１つ以上のＫｖ１０αサブユニットを、Ｋｖ２チャネル（
例えば、Ｋｖ２．１および２．２）のようなＫｖファミリー由来の１つ以上の更
なるαサブユニットとともに含み得る。さらに、このようなチャネルは、１つ以
上の補助的βサブユニットを含み得る。カリウムチャネルにおけるＫｖ１０の存
在はまた、ヘテロマーチャネルの活性を調節し得、したがって、チャネルの多様
性を増強し得る。チャネルの多様性はまた、Ｋｖ１０遺伝子のオルタナティブス
プライシングされた形態で増強される。Ｋｖ１０．１核酸は、ヒト脳および網膜
からｃＤＮＡから単離されている。

【００３５】 構造的に、ヒトＫｖ１０．１のヌクレオチド配列（配列番号１−２）は、約６
２．５ｋＤの予想された分子量および５８〜６８ｋＤの範囲の予想された分子量
を有するポリペプチドモノマーをコードする。特に、Ｋｖ１０．１のアミノ酸配
列は、アミノ酸１０２〜５１４に対応する保存された領域を有する。Ｋｖ１０サ
ブファミリーの他の種およびメンバーに由来する関連するＫｖ１０．１遺伝子は
、保存された領域において、少なくとも約６０％、好ましくは、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を共有する
。

【００３６】 本発明はまた、配列番号３に示されるヒトＫｖ１０．１の多型改変体：９９位
のアミノ酸においてバリン残基がロイシン残基を置換する改変体＃１；２８５位
のアミノ酸においてロイシン残基がメチオニン酸残基を置換する改変体＃２；５
１８位のアミノ酸においてメチオニン残基がバリン残基を置換する改変体＃３；
７７位のアミノ酸においてグルタミン酸残基がグルタミン残基を置換する改変体
＃４を提供する。

【００３７】 Ｋｖ１０ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の特定の領域は、Ｋｖ１０サブファ
ミリーメンバー、およびＫｖ１０．１多型改変体、種間ホモログ、およびアレル
を同定するために使用され得る。この同定は、インビトロで、例えば、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下および配列決定において、または他の
ヌクレオチド配列との比較のためのコンピュータシステムにおける配列情報を使
用して、またはＫｖ１０．１に対して惹起された抗体を使用して、なされ得る。
代表的には、Ｋｖ１０サブファミリーメンバー、ならびにＫｖ１０．１多型改変
体、オルトログ、およびアレルの同定は、配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４
に対応する保存された領域のアミノ酸配列（またはそのアミノ酸配列をコードす
る核酸）を比較することによって成される。保存された領域（配列番号３のアミ
ノ酸１０２〜５１４）における少なくとも約６０％以上、好ましくは、７０％、
６５％、７５％、８０％、８５％以上、最も好ましくは、９０〜９５％以上のア
ミノ酸の同一性は、代表的には、タンパク質がＫｖ１０サブファミリーメンバー
またはＫｖ１０．１多型改変体、種間ホモログ、またはアレルであることを実証
する。配列比較は、代表的には、以下に記載されるように、デフォルトパラメー
タを使用してＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して行われ
る。

【００３８】 Ｋｖ１０サブファミリーメンバーおよびＫｖ１０．１多型改変体、種間ホモロ
グ、およびアレルは、推定Ｋｖ１０ポリペプチドモノマーを発現または同時発現
し、そしてそれがＫｖファミリーの機能的特性および迅速な活性化および失活の
ようなＫｖ１０の特性を有するカリウムチャネルを形成するか否かを試験するこ
とによって確認され得る。このアッセイは、Ｋｖ１０．１の保存された領域に対
して約６０％以上、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、または９５％以上のアミノ酸同一性を有するタンパク質が、Ｋｖ１０．１
と同じ機能的特性を共有し、そしてしたがって、Ｋｖ１０．１の種またはＫｖ１
０サブファミリーのメンバーであることを実証するために使用される。代表的に
は、配列番号３のアミノ酸配列を有するヒトＫｖ１０．１は、Ｋｖ１０サブファ
ミリーメンバーまたはＫｖ１０．１多型改変体、オルトログ、保存的に改変され
た改変体、変異体、またはアレルの同定を実証するための、推定Ｋｖ１０タンパ
ク質と比較しての陽性コントロールとして使用される。

【００３９】 Ｋｖ１０．１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報はまた、コンピュータシス
テムにおける電圧ゲートカリウムチャネルのモデルを構築するために使用され得
る。これらのモデルは、引き続いて、Ｋｖ１０ポリペプチドを含む、電圧ゲート
カリウムチャネルを活性化または阻害し得る化合物を同定するために使用される
。Ｋｖ１０ポリペプチド（例えば、Ｋｖ１０．１）を含むチャネルの活性化を調
節するこのような化合物は、チャネルの活性の調節およびチャネル多様性におけ
るＫｖ１０ポリペプチドの役割を調査するために使用され得る。

【００４０】 生物学的に活性なＫｖ１０．１を初めて単離したことにより、Ｋｖ１０サブユ
ニットを含む電圧ゲートカリウムチャネルのインヒビターおよびアクチベーター
についてアッセイするための手段が提供される。生物学的に活性なＫｖ１０ポリ
ペプチドは、例えば、電圧または電流における変化を測定するインビボ発現およ
びインビトロ発現で使用して、Ｋｖ２（例えば、Ｋｖ２．２および２．２）のよ
うなＫｖ１０および／または他のＫｖメンバーのサブユニットを含む電圧ゲート
カリウムチャネルのインヒビターおよびアクチベーターを試験するために有用で
ある。少なくとも１つのＫｖ１０サブユニット（例えば、Ｋｖ１０．１）、必要
に応じて、４つまでのＫｖ１０サブユニットを含むカリウムチャネルを使用して
同定されたこのようなアクチベーターおよびインヒビターは、カリウムチャネル
の電圧ゲート、チャネル動力学、およびコンダクタンス特性をさらに研究するた
めに使用され得る。このようなアクチベーターおよびインヒビターは、異常なイ
オンフラックスが関与する疾患（例えば、上記のような、てんかんおよび他の発
作性障害のようなＣＮＳ障害、パーキンソン病、偏頭痛、精神分裂病および抑圧
のような精神障害、学習障害および記憶障害のような認知障害、神経障害性疼痛
、視覚障害、前立腺過形成、精母細胞成熟および運動性障害、ならびに不妊を含
む障害）を処置するための薬学的因子として有用である。モジュレーターもまた
、上記のように、神経保護因子（例えば、発作を予防するため）として有用であ
る。Ｋｖ１０核酸およびＫｖ１０ポリペプチドならびにＫｖ１０ポリペプチドを
含むチャネルの発現を検出する方法はまた、例えば、上記のような異常なイオン
フラックスの関与する疾患のための診断的適用において有用である。例えば、ヒ
トＫｖ１０．１をコードする遺伝子の染色体位置は、Ｋｖ１０．１によって引き
起こされ、そしてそれと関連する疾患を同定するために使用され得る。Ｋｖ１０
．１を検出する方法はまた、チャネル多様性およびチャネル活性の調節において
Ｋｖ１０．１の役割を試験するために有用である。

【００４１】 （ＩＩ．定義） 本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に指定されない限り、それに
基づく意味を有する。

【００４２】 用語「保存領域」とは、この特定のタンパク質（配列番号３のおよそ１０２〜
５１４のアミノ酸）を構造的に同定するＫｖ１０．１の領域をいう。この領域は
、Ｋｖ１０サブファミリーメンバーならびにＫｖ１０．１多型改変体、オルトロ
グ、保存的に改変された改変体、変異体および対立遺伝子を同定するために使用
され得、これらの各々は、代表的には、本明細書中に記載されるパラメータを用
いる、ＢＬＡＳＴＰのような配列比較アルゴリズムを使用するアミノ酸配列同一
性比較によって、保存的領域に対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％
、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれより高いア
ミノ酸配列同一性を含む。

【００４３】 「Ｋｖ１０」および「Ｋｖ１０．１」とは、Ｋｖカリウムチャネルのサブユニ
ットまたはモノマー、およびＫｖファミリーのメンバーであるポリペプチドをい
う。Ｋｖ１０が、カリウムチャネル（ホモマーまたはへテロマーのカリウムチャ
ネルのいずれか）の一部である場合、このチャネルは、電圧ゲーティングならび
に迅速な活性化および非活性化の特徴を有する。従って、用語Ｋｖ１０およびＫ
ｖ１０．１は、Ｋｖ１０サブファミリーメンバーおよびＫｖ１０．１多型改変体
、対立遺伝子、変異体および種間のホモログをいい、これらは、（１）Ｋｖ１０
保存的領域（配列番号３の１０２〜５１４のアミノ酸）に対して約６０％を超え
るアミノ酸配列同一性、好ましくは、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％
、約８５％、約９０％、または約９５％のアミノ酸配列同一性を有する配列を有
するか、または必要に応じて、配列番号３のＫｖ１０．１アミノ酸配列に対して
約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約
９５％、またはそれより高い同一性を含み；（２）配列番号３のアミノ酸配列ま
たは配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４およびその保存的に改変された改変体
を含む免疫原に対して惹起される、抗体（例えば、ポリクローナル抗体）に結合
し；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜
２の配列または配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４をコードするヌクレオチド
配列、およびその保存的に改変された改変体に特異的にハイブリダイズするか；
あるいは（４）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号
４〜１１からなる群より選択されるプライマーのセットと同一の配列に特異的に
ハイブリダイズするプライマーによって増幅される。

【００４４】 用語「電圧ゲート」活性または「電圧ゲーティング」とは、個々のポリペプチ
ドモノマーまたはサブユニットから構成されるカリウムチャネルの特徴をいう。
一般的に、電圧ゲートカリウムチャネルオープニングの可能性は、細胞が減極さ
れるにつれて増大する。電圧ゲートカリウムチャネルは、主に、カリウムの流出
を可能にする。なぜなら、それらは、代表的細胞において、カリウムについての
膜電位（Ｅ_K）よりも高い膜電位でオープンである可能性がより高いからである
。Ｅ_K、すなわちカリウムについての膜電位は、細胞膜の内側および外側で検出
されるカリウムの相対濃度に依存し、そして代表的に、哺乳動物細胞について−
６０−ｍＶと１００ｍＶとの間である。Ｅ_Kは、膜電位であり、ここで、カリウ
ムイオンの正味のフローはない。なぜなら、カリウム流入を駆動する電気的電位
（すなわち、電圧電位）は、カリウム流出を指向する濃度勾配（［Ｋ⁺］電位）
と平衡であるからである。この値は、カリウムについての「リバーサル電位」ま
たは「ネルンスト」電位としても知られる。いくつかの電圧ゲートカリウムチャ
ネルは、不活性化をうけ、これにより、より高い膜電位におけるカリウム流出は
減少され得る。カリウムチャネルはまた、それらがＥ_Kに対して負の膜電位にて
オープンのままである場合、特定の場合にカリウム流入を可能にし得る（例えば
、Ａｄａｍｓ ＆ Ｎｏｎｎｅｒ，ｉｎ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈａｎｎｅｌ
ｓ，４０−６０頁（Ｃｏｏｋら、１９９０年）を参照のこと）。電圧ゲーティン
グの特徴は、このチャネルを通った電流およびイオンフラックスにおける変化を
測定するための種々の技術（例えば、外部溶液の［Ｋ⁺］を変化させ、そしてチ
ャネル電流の活性化電位を測定すること（例えば、米国特許第５，６７０，３３
５号を参照のこと）、異なる条件下でのパッチクランプ技術または電圧クランプ
で電流を測定すること、および異なる条件下での放射標識されたトレーサーまた
は電圧感応性色素でイオンフラックスを測定すること）によって決定され得る。

【００４５】 「ホモマーチャネル」とは、同一のαサブユニットで構成されるＫｖ１０チャ
ネルをいい、一方、「へテロマーチャネル」とは、少なくとも１つのＫｖ１０α
サブユニット（例えば、Ｋｖ１０．１）およびＫｖ２のような別のＫｖサブファ
ミリー由来の少なくとも１つの他の異なる型のαサブユニット（例えば、Ｋｖ２
．１または２．２）で構成されるＫｖ１０チャネルをいう。ホモマーチャネルお
よびへテロマーチャネルの両方が、補助的なβサブユニットを含み得る。代表的
に、このチャネルは、４つのαサブユニットで構成され、そしてこのチャネルは
、へテロマーまたはホモマーであり得る。

【００４６】 「βサブユニット」は、αサブユニットで構成されるカリウムチャネルの補助
サブユニットである；しかし、βサブユニット単独は、チャネルを形成し得ない
（例えば、米国特許第５，７７６，７３４号を参照のこと）。βサブユニットは
、例えば、αサブユニットが細胞表面に到達し、活性化速度を変化させ、そして
チャネルへの天然のリガンド結合の感度を変化させることを援助することによっ
てチャネルの数を増加させると知られる。βサブユニットは、孔領域の外側にあ
り得、そして孔領域を含むαサブユニットに結合され得る。それらはまた、孔領
域の外部口に寄与し得る。

【００４７】 Ｋｖ１０を含むチャネルに影響を及ぼす化合物を試験するためのアッセイの状
況における、用語「機能的効果」とは、非直接的または直接的にチャネルの影響
下にある任意のパラメータの決定を含む。それは、物理的および化学的効果（例
えば、イオンフラックスおよび膜電位における変化、リガンド結合における変化
）を含み、そしてまた、他の生理学的効果（例えば、転写またはホルモン放出の
増加または減少）を含む。

【００４８】 「機能的効果を決定すること」とは、細胞または細胞膜上のイオンフラックス
を増加または減少させる化合物の効果を、細胞および細胞膜機能の観点で試験す
ることをいう。イオンフラックスは、チャネルおよびそのアナログを通過する任
意のイオンであり得、例えば、カリウム、ルビジウムであり得る。好ましくは、
この用語は、Ｋｖ１０を含むチャネル上の化合物の機能的効果（例えば、放射性
同位体を含むイオンフラックス、電流の振幅、膜電位、電流、転写、タンパク質
結合、リン酸化、脱リン酸化、第２メッセンジャー濃度（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、
Ｃａ²⁺、ＩＰ₃）、リガンド結合、イオン濃度の変化、および他の生理学的効果
（例えば、ホルモンおよび神経伝達物質放出）、ならびに電圧および電流の変化
）をいう。このような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段（例えば、パッ
チクランピング、電圧感応性色素、イオン感応性色素、完全細胞電流、放射性同
位体流出、誘発性マーカーなど）によって測定され得る。

【００４９】 Ｋｖ１０ポリペプチドを含む電圧ゲートカリウムチャネルの「インヒビター」
、「アクチベーター」または「モジュレーター」は、Ｋｖ１０チャネル機能につ
いてのインビトロおよびインビボアッセイを用いて同定される阻害分子または活
性化分子をいう。インヒビターは、活性化を減少するか、ブロックするか、活性
化を遅延するか、不活性化するか、脱感作するかまたはチャネルをダウンレギュ
レートする化合物である。アクチベーターは、チャネル活性を、増加するか、オ
ープンするか、活性化するか、容易にするか、活性化を増強するか、感作するか
またはアップレギュレートする化合物である。インヒビターおよびアクチベータ
ーのためのこのようなアッセイとしては、例えば、Ｋｖ１０ポリペプチド（例え
ば、Ｋｖ１０．１）を細胞または細胞膜中で発現させ、次いで、チャネルを通っ
たイオンのフラックスを測定かつ分極（電気的電位）の変化を決定することを含
む。あるいは、内因性Ｋｖ１０チャネルを発現する細胞は、このようなアッセイ
で使用され得る。阻害の程度を試験するために、Ｋｖ１０チャネルを含むサンプ
ルまたはアッセイは、ポテンシャルアクチベーターまたはインヒビターで処理さ
れ、そしてインヒビターがないコントロールサンプルと比較される。コントロー
ルサンプル（インヒビターで未処理）は、１００％の相対Ｋｖ１０活性値と設定
される。Ｋｖ１０を含むチャネルの阻害は、コントロールに対するＫｖ１０活性
値が約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５〜０％である場合に、達
成される。Ｋｖ１０を含むチャネルの活性化は、コントロールに対するＫｖ１０
活性化値が１１０％、より好ましくは１５０％、最も好ましくは少なくとも２０
０〜５００％より高いかまたは１０００％以上高い場合に、達成される。

【００５０】 「生物学的に活性な」Ｋｖ１０ポリペプチドは、上記のように試験された電圧
ゲーティングの特徴を有するカリウムチャネルを形成する能力を有するＫｖ１０
ポリペプチド（例えば、Ｋｖ１０．１）をいう。

【００５１】 用語「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、そのネ
イティブ状態で見出されるように、それを通常に随伴する成分が実質的にかまた
は本質的にない物質をいう。純度および同質性は、代表的に、分析的化学技術（
例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィー
）を用いて決定される。調製物中に存在する優性種であるタンパク質は、実質的
に精製される。特に、単離されたＫｖ１０核酸は、Ｋｖ１０遺伝子に隣接し、そ
してＫｖ１０以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから
分離されている。用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動
ゲルにおいて１つのバンドを本質的に生じることを示す。特に、核酸またはタン
パク質は、少なくとも８５％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、お
よび最も好ましくは、少なくとも９９％純粋であることを意味する。

【００５２】 「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本
鎖形態または二本鎖形態のいずれかの形態のそのポリマーをいう。この用語は、
公知のヌクレオチドアナログまたは修飾されたバックボーン残基もしくは連結を
含む核酸を含み、この核酸は、合成、天然および非天然で存在し、参照核酸と類
似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。この
ようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、メチ
ルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチ
ド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５３】 他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたその改変体
（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明白に示される配列を暗
黙のうちに含む。詳細には、縮重コドン置換は、１以上の選択された（またはす
べての）コドンの第３位は、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残
基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋ
ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒ
ｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９
９４））。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、お
よびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。

【００５４】 特定の核酸配列はまた、暗黙のうちに「スプライス改変体」を含む。同様に、
核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体に
よってコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに含む。その名が示唆するよ
うに、「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタネートスプライシングの産物で
ある。転写の後、初期核酸転写物は、異なる（交互の）核酸スプライス産物が、
異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体
の産生についての機構は、変化するが、エクソンのオルタネートスプライシング
を含む。リードスルー転写による同一の核酸から誘導されるオルタネートポリペ
プチドはまた、この定義に含まれる。スプライシング反応の任意の産物（スプラ
イス産物の組み換え形態を含む）は、この定義に含まれる。カリウムチャネルス
プライス改変体の例は、Ｌｅｉｃｈｅｒら、ｊ。Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（
５２）：３５０９５−３５１０１（１９９８）で議論される。

【００５５】 本明細書中で交互に使用される、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および
「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、１以上のア
ミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるア
ミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在し
ないアミノ酸ポリマーに適用する。

【００５６】 用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成的アミノ酸、なら
びにアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体（天然に存在するアミノ酸と類似の
様式で機能する）をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝的コードによってコ
ードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプ
ロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミ
ノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造（すなわち
、水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシ
ン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合するα
炭素）を有する化合物をいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば
、ノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存
在するアミノ酸と同一の塩基化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ
酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似
の様式で機能する化学的化合物をいう。

【００５７】 アミノ酸は、それらの一般的に公知の３文字の略記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
によって推薦される１文字の略記のいずれかで、本明細書中で引用され得る。ヌ
クレオチドは、同様に、一般的に許容される単一文字コードで引用され得る。

【００５８】 「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適
用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一または
本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、あるいは、その核酸が、
アミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列に。遺伝的コードの縮重
のために、多数の機能的に同一な核酸は、任意の所与されたタンパク質をコード
する。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸
アラニンをコードする。従って、アラニンが、コドンによって特異化されるすべ
ての位置において、このコドンは、コードされたペプチドを変更しないで記載さ
れる対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸改変体は、「サ
イレント改変体」であり、保存的に改変された改変体の１種である。ポリペプチ
ドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のすべての可能なサ
イレント改変体を記載する。当業者は、核酸における各コドン（ＡＵＧ（本来、
メチオニンのための唯一のコドンである）およびＴＧＧ（本来、トリプトファン
のための唯一のコドンである）を除く）は、修飾されて、機能的に同一な分子を
与え得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレン
ト改変体は、各記載された配列において暗示的である。

【００５９】 アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸
または数％のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプ
チドまたはタンパク質配列に対する、個々の置換体、欠失体または付加体が、「
保存的に改変された改変体」であり、ここで、この変更が、アミノ酸の化学的に
類似のアミノ酸との置換を生じるこを、認識する。機能的に類似のアミノ酸を提
供する保存的置換テーブルは、当該分野で周知である。このような保存的に改変
された改変体は、多型改変体、種間ホモログ、および本発明の対立遺伝子に付加
的であり、かつこれらを除外しない。

【００６０】 以下の８つのグループの各々は、互いに保存的置換体であるアミノ酸を含む。

【００６１】 １）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
； ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）； ７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および ８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ） （例えば、Ｃｒｅｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。

【００６２】 ポリペプチド構造のような巨大分子構造は、構成の種々のレベルの観点で記載
され得る。この構成の一般的議論について、例えば、Ａｌｂｅｒｔら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４年）
およびＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｆｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｅｓ（１９８０）を参照のこと）。「
１次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「２次構造」とは、局
所的に順序付けられた、ポリペプチド内の３次元の構造をいう。これらの構造は
、ドメインとして一般的に公知である。ドメインは、ポリペプチドのコンパクト
ユニットを形成するポリペプチドの部分であり、そして代表的に５０〜３５０の
アミノ酸長である。代表的ドメインは、より少ない構成（例えば、βシートおよ
びα−へリックスの領域）の部分で作製される。「３次構造」とは、ポリペプチ
ドモノマーの完全な３次元構造をいう。「４次構造」とは、独立した３次元のユ
ニットの非共有結合的関係によって形成される３次元構造をいう。異方性の用語
は、エネルギーの用語としても知られる。

【００６３】 「標識」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段ま
たは化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては
、³²Ｐ、蛍光色素、電子高密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的
に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよび抗血清
またはモノクローナル抗体が利用可能な（例えば、配列番号３のポリペプチドは
、例えば放射標識をペプチドに組み込むことによって検出可能になり得、そして
このペプチドと特異的な反応性の抗体を検出するために使用され得る）タンパク
質が挙げられる。

【００６４】 本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は
、１以上の型の化学結合を介して、通常、相補的塩基対を介して、通常、水素結
合形成を介して、相補配列の標的核酸に結合し得る核酸として規定される。本明
細書中で使用される場合、プローブは、天然の（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ
）塩基または修飾された塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得
る。さらに、プローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションと干渉しない
限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって結合され得る。従って、例えば
、プローブは、ペプチド核酸であり得、ここで、構成塩基は、リン酸ジエステル
結合よりもむしろペプチド結合によって結合される。プローブが、ハイブリダイ
ゼーション条件のストリンジェンシーに依存してプローブ配列と完全な相補性を
欠く標的配列に結合し得ることは、当業者に理解される。このプローブは、好ま
しくは、同位体、発色団、発光団、色原体で直接的に標識されるか、または例え
ば、ストレプトアビジン複合体が後に結合し得るビオチンで間接的に標識される
。プローブの存在または非存在をアッセイすることによって、選択配列または選
択部分配列の存在または非存在を検出し得る。

【００６５】 「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、プローブの存在が
、プローブに結合された標識の存在を検出することによって検出され得るように
、リンカーまたは化学結合を介して共有結合的にか、またはイオン結合、ファン
デルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して非共有結合的に、標識に
結合されるものである。

【００６６】 用語「組み換え」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質もしくはベクタ
ーに対する参照として使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクター
が、異種核酸またはタンパク質の導入あるいは天然の核酸またはタンパク質の変
更によって修飾されているか、または細胞が、そのように修飾された細胞に由来
することを示す。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞のネイティブ（非組み
換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に
発現されるか、発現中であるかまたは全く発現されてないネイティブ遺伝子を発
現する。

【００６７】 「プロモーター」は、核酸の転写を指向する核酸コントロール配列のアレイと
して規定される。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部
位付近の必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にお
いて、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた、必要に応じて、末端
エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み、これらは、転写の開始部位
から数千の塩基対程度に位置付けられ得る。「構成的」プロモーターは、ほとん
どの環境的条件および発展的条件化で活性であるプロモーターである。「誘発性
」プロモーターは、環境的レギュレーションまたは発展的レギュレーション下で
活性なプロモーターである。用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現コン
トロール配列（例えば、プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイ）と第２
の核酸配列との間の機能的結合をいい、ここで、発現コントロール配列は、第２
配列に対応する核酸の転写を指向する。

【００６８】 用語「異種」とは、核酸の部分に対する参照として使用される場合、核酸が、
自然界で互いに同一の関係で見出されない２つ以上の配列を含むことを示す。例
えば、核酸は、代表的に、組み換え的に産生され、新規の機能的核酸（例えば、
１つのソースからのプロモーターおよび別のソースからのコード領域）を作成す
るように配置される無関係の遺伝子由来の２以上の配列を有する。同様に、異種
タンパク質は、タンパク質が自然界で互いに同一の関係で見出されない２以上の
配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。

【００６９】 「発現ベクター」は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の
特定の核酸エレメントで、組み換え的にまたは合成的に産生される、核酸構築物
である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部
であり得る。代表的に、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された
、転写されるべき核酸を含む。

【００７０】 用語「同一（の）」またはパーセント「同一性」は、２以上の核酸またはポリ
ペプチド配列の状況において、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるかも
しくは手動のアライメントおよび外観検査によって測定される場合に比較ウィン
ドウまたは指定された領域にわたる、最大の対応について比較およびアライメン
トされる場合、同じである２以上の配列または部分配列をいうか、または同じで
ある（すなわち、特定の領域（例えば、配列番号３の１０２〜５１４のアミノ酸
）にわたって好ましくは、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％
、約８５％、約９０％または約９５％同一性である）アミノ酸残基またはヌクレ
オチドの特定のパーセンテージを有する２以上の配列または部分配列をいう。次
いで、このような配列は、「実質的に同一」であるといわれる。この規定はまた
、試験配列の相補体をいう。好ましくは、この同一性は、少なくとも約２５個の
アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域またはより好ましくは、５０〜１０
０アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。

【００７１】 配列比較について、代表的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列
として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列
は、コンピューターに入力され、必要な場合、サブ配列座標が、指定され、そし
て配列アルゴリズムプログラムパラメータが、指定される。デフォルトプログラ
ムパラメータが使用され得るか、または代替のパラメータが指定され得る。次い
で、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対
する試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。Ｋｖ１０核酸および
タンパク質（例えば、Ｋｖ１０．１）に対する核酸およびタンパク質の配列比較
について、以下で議論される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム
およびデフォルトパラメータが使用される。

【００７２】 「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、２０〜６００、通例
は、約５０〜約２００、より通例的には約１００〜約１５０からなる群から選択
される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここ
で、配列は、２つの配列が必要に応じてアライメントされた後、連続する位置の
同じ数の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアライメントの方法は、
当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓ
ｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（
１９８１）の局所相同アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎ
ｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同アライメント
アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ
’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の
ための検索によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳ
ＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ Ｐａｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５
７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける）のコンピュー
ター化された実行によってか、または手動のアライメントおよび外観検査（例え
ば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９５年増補）によって実施され得る。

【００７３】 パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズム
の好ましい方法は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、こ
れは、Ａｉｔｓｃｈｕｌｒａ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−
３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１
５：４０３−４１０（１９９０）にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬ
ＡＳＴ２．０は、本明細書中で記載されるパラメータで使用され、本発明の核酸
およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定する。ＢＬＡＳＴ分析
を実行するためのソフトウェアは、ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公に利用可能である。このアル
ゴリズムは、問い合わせ配列における長さＷの短い単語を同定することによって
高スコーリング配列対（ＨＳＰ）を第１に同定することを含み、これは、データ
ベース配列における同じ長さの単語でアライメントされる場合、幾つかのポジテ
ィブな値の闘値スコアＴを一致させるかまたは充足させる。Ｔは、隣接単語スコ
ア闘値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）といわれる。これらの最初の隣接単語のヒ
ットは、検索を開始するための種として作用し、それらを含有するより長いＨＳ
Ｐを見出す。単語のヒットは、累積のアライメントスコアが増大され得る限り、
各配列に沿った方向の両方で拡大される。累積スコアは、ヌクレオチド配列につ
いて、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア；常に＞０）
およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて
計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスは、累積スコア
を計算するために使用される。各方向におけるこの単語ヒットの拡大は、累積整
列スコアが、その最大の達成された値からの量Ｘにだけ減少する場合；累積スコ
アが、１以上のネガティブなスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して０
以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合；に停止される。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およ
びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）
は、デフォルトとして、１１の単語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ
＝４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログ
ラムは、デフォルトとして、３の単語長、および１０の期待値（Ｅ）を使用し、
そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈ
ｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０
９１５（１９８９）を参照のこと）は、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待
値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。

【００７４】 ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行す
る（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小の合計
可能性（Ｐ（Ｎ））であり、これは、可能性の指標を提供し、これによって、２
つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致は、偶然に起こる。例えば、核
酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小の合計可能性が、約０．２
未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満
である場合に、参照配列と類似するとみなされる。

【００７５】 ２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下
に示されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核
酸によってコードされるペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応
性であるということである。従って、ポリペプチドは、代表的に、第２のポリペ
プチドと実質的に同一であり、例えば、ここで、２つのペプチドは、保存的置換
によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、
以下に記載されるように、２つの分子またはそれらの相補体がストリンジェント
な条件下で互いにハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質
的に同一であるというなお別の指標は、同じプライマーが配列を増幅するために
使用され得るということである。

【００７６】 句「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、その配列が複合
混合物（例えば、総細胞性かまたはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）で存在す
る場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチ
ド配列のみへの分子の結合、二重鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）またはハイブリ
ダイズをいう。

【００７７】 句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、代
表的に、核酸の複合混合物中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の
配列にハイブリダイズしない条件下をいう。ストリンジェントな条件は、配列依
存性であり、かつ異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度に
て特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な
手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏ
ｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈ
ｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１
９９３）に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオ
ン強度ｐＨでの特定の配列についての熱的融点（Ｔ_m）より約５〜１０℃低いよ
うに選択される。Ｔ_mは、（規定されたイオン強度ｐＨ、および核濃度のもとで
の）温度であり、この温度において、標的に対して相補的な５０％のプローブは
、平衡状態において標的配列にハイブリダイズする（標的配列が、過剰に存在す
る場合、Ｔ_mにて５０％のプローブは、平衡状態で占有される）。ストリンジェ
ントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３にて約１．０Ｍ未満のナトリウム
イオン、代表的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩
）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に
ついて少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより
も長い）について少なくとも約６０℃である、条件である。ストリンジェントな
条件はまた、ホルムアミドのような不安定化因子の添加を用いて活性化され得る
。高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションのために、ポジティブシグナ
ルは、バックグラウンドの少なくとも２倍のハイブリダイゼーション、好ましく
はバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。例示的な高スト
リンジェンシーまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては
、以下：５０％のホルムアミド、４２℃でインキュベートされた５×ＳＳＣおよ
び１％ ＳＤＳまたは６５℃でインキュベートされた５×ＳＳＣおよび６５℃で
の１％ ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中の洗浄である。

【００７８】 ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコ
ードするポリペプチドが実質的に同一である場合になお実質的に同一である。例
えば、これは、核酸のコピーが、遺伝的コードによって許容される最大コドン縮
重を用いて作製される場合に、起こる。このような場合において、核酸は、代表
的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダ
イズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
」は、４０％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの緩衝液中でのハ
イブリダイゼーション（３７℃）および１×ＳＳＣ中の洗浄（４５℃）を含む。
ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍で
ある。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が類似のストリ
ンジェンシーの条件を提供するように利用され得ることを容易に理解する。ＰＣ
Ｒのために、約３６℃の温度は、低ストリンジェンシー増幅について代表的であ
るが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して、約３２℃と４８℃と
の間で変化し得る。高ストリンジェントなＰＣＲ増幅について、約６２℃の温度
は代表的であるが、高ストリンジェントなアニーリング温度は、プライマーの長
さおよび特異性に依存して、約５０℃から約６５℃までの範囲であり得る。高ス
トリンジェント増幅および低ストリンジェント増幅の両方についての代表的サイ
クル条件は、３０秒〜２分間の９０℃〜９５℃の変性相、３０秒〜２分続くアニ
ーリング相、および１〜２分間の約７２℃の伸長相を含む。

【００７９】 「抗体」とは、抗原と特異的に結合しかつこれを特異的に認識する免疫グロブ
リン遺伝子またはそのフラグメントからのフレームワーク領域を含むポリペプチ
ドをいう。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ
、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子
が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、
μ、α、δまたはεとして分類され、これは、次いで、免疫グロブリンの分類を
、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。

【００８０】 例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマ
ーは、ポリペプチド鎖の２つの同一対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約
２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端
は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する
。用語可変軽鎖（Ｖ_L）および可変重鎖（Ｖ_H）は、これらの軽鎖および重鎖をそ
れぞれいう。

【００８１】 抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとしてかまたは種々のペプチダ
ーゼでの消化によって産生される良好に特徴付けられた多くのフラグメントとし
て存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域においてジスルフィド結
合が少ない抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’₂、Ｆａｂのダイマー（それ自体は、ジ
スルフィド結合によってＶ_H−Ｃ_H１に結合される軽鎖である）を産生する。Ｆ（
ａｂ）’₂は、温和な条件下で還元されてヒンジ領域におけるジスルフィド結合
を壊し得、それによってＦ（ａｂ）’₂ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換する
。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆ
ｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３
年）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関
して規定されるが、当業者は、このようなフラグメントは、化学的にかまたは組
み換えＤＮＡ方法論を用いることによってのいずれかで新規に合成され得ること
を理解する。従って、用語抗体は、本明細書中で使用される場合、完全な抗体の
改変によって産生される抗体フラグメント、組み換えＤＮＡ方法論を用いて新規
に合成される抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）か、またはファージディス
プレイライブラリーを用いて同定される抗体フラグメント（例えば、ＭｃＣａｆ
ｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこ
と）のいずれかを含む。

【００８２】 モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製のために、当該分野で公
知の任意の技術が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、７７−９
６頁、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）を参照のこと
）。単鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発
明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適応され得る。また、トランス
ジェニックマウス、または他の生物体（例えば、他の哺乳動物）は、ヒト化抗体
を発現するために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術は、選択
された抗原に特異的に結合する抗体およびへテロマーＦａｂフラグメントを同定
するために使用され得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３
４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ１０：７７９−７８３（１９９２）を参照のこと）。

【００８３】 「抗Ｋｖ１０」抗体は、Ｋｖ１０の遺伝子、ｃＤＮＡまたはその部分配列（例
えば、Ｋｖ１０．１）によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗
体または抗体フラグメントである。

【００８４】 「キメラ抗体」は、抗体分子であり、ここで、（ａ）定常領域またはその部分
は、変更、置換または交換され、その結果、抗原体結合部位（可変領域）は、異
なるかまたは変更されたクラスの定常領域、エフェクター機能および／または種
、あるいは新規の特性をキメラ抗体に与える完全に異なる分子（例えば、酵素、
毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）に結合されるか；あるいは（ｂ）可変領
域またはその部分は、異なるかまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で
変更、置換または交換される。

【００８５】 用語「イムノアッセイ」は、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイ
である。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、および／または定量するため
の、特定の抗体の特異的結合特性の使用によって特徴付けられる。

【００８６】 抗体に「特異的（または選択的）に結合する」または「特異的に（または選択
的に）免疫反応性の」という句は、タンパク質またはペプチドを参照する場合、
タンパク質の異種集団中のタンパク質および他の生物製剤の存在を決定する結合
反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バッ
クグラウンドの少なくとも２倍にて特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル
中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。このような条件
下での抗体への特定の結合は、特定のタンパク質についてのその特異性のために
選択された抗体を必要とし得る。例えば、配列番号３に示されるような、Ｋｖ１
０．１に惹起されるポリクローナル抗体、またはスプライス改変体もしくはその
部分は、Ｋｖ１０サブファミリーのメンバーと特異的に免疫反応性でありかつ他
のタンパク質と免疫反応性でないそれらのポリクローナル抗体のみを得るように
選択され得る。この選択は、分子（例えば、他のＫｖファミリーメンバー）と交
差反応する抗体を差し引くことによって達成され得る。さらに、Ｋｖ１０．１多
型改変体、対立遺伝子、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）に対して惹起されたポ
リクローナル抗体、および保存的に改変された改変体は、Ｋｖ１０．１を認識す
るが、他のＫｖ１０サブファミリーメンバーを認識しないそれらの抗体のみを得
るように選択され得る。さらに、他のＫｖ１０．１オルトログではないヒトＫｖ
１０．１に対する抗体は、同じ様式で選択され得る。種々のイムノアッセイ形式
は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するように使用され得
る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応
性の抗体を選択するように慣用的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決
定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の説明については、Ｈ
ａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。代表的に、特異的または選択的反
応は、バックグラウンドの少なくとも２倍のシグナルまたはノイズであり、そし
てより代表的に、バックグラウンドの１０〜１００倍より高い。

【００８７】 用語「選択的に会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ）する」とは、上記で
規定されるような別の核酸と「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、また
は上記で規定されるようなタンパク質に「選択的（または特異的に）結合する」
抗体の能力をいう。

【００８８】 「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、そして発現ベクターの複製または発
現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）または真核生物（例えば、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物細胞（例えば
、ＣＨＯ、ＨｅＬａなど）、例えば、培養された細胞、外植片およびインビボの
細胞）であり得る。

【００８９】 本明細書中で使用される場合の「生物学的サンプル」は、Ｋｖ１０ポリペプチ
ドまたはＫｖ１０タンパク質をコードする核酸を含む生物学的組織または流体の
サンプルである。このようなサンプルとしては、ヒトから単離された組織が挙げ
られるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織の切片（例え
ば、組織学的目的のために採取された凍結切片）を含み得る。生物学的サンプル
は、代表的に、真核生物生物体、好ましくは、真核生物（例えば、真菌類、植物
、昆虫、原生生物、鳥類、魚類、爬虫類）、および好ましくは、哺乳動物（例え
ば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギ）、および最も好
ましくは、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）から得られる。

【００９０】 （ＩＩＩ．Ｋｖポリペプチドをコードする遺伝子の単離） （Ａ．一般的組換えＤＮＡ法） 本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用的な技術に依存する。本発明にお
ける使用の一般的な方法を開示する基本書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（
第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０
）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。

【００９１】 核酸については、サイズが、キロベース（Ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいず
れかで与えられる。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルの電気
泳動由来、配列決定された核酸由来または公表されたＤＮＡ配列由来の評価であ
る。タンパク質については、サイズはキロダルトン（ｋＤ）またはアミノ酸残基
数で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタ
ンパク質から、誘導されたアミノ酸配列から、または公表されたタンパク質配列
から見積もられる。

【００９２】 市販されていないオリゴヌクレオチドを、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記
載されるような自動化された合成機を使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（
１９８１）に最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化
学的に合成し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブアクリルアミドゲ
ル電気泳動かまたはＰｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５
：１３７−１４９（１９８３）に記載されるようなアニオン交換ＨＰＬＣのいず
れかによる。

【００９３】 クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、
Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ １６：２１−２６（１９８１）の二本鎖テンプレ
ートの配列決定についてのチェーンターミネーション法を使用してクローニング
後に確認され得る。

【００９４】 （Ｂ．Ｋｖ１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の単離についての
クローニング法） 一般に、Ｋｖ１０．１をコードする核酸配列および関連核酸配列ホモログ（例
えば、他のＫｖ１０サブファミリーメンバー）を、ｃＤＮＡライブラリーおよび
ゲノムＤＮＡライブラリーからクローニングするかまたはオリゴヌクレオチドプ
ライマーでの増幅技術を使用して単離する。例えば、Ｋｖ１０．１配列は、代表
的には核酸プローブまたはポリヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションに
よってヒト核酸（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリーから単離され、この配列
は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）１〜２由来であり得、好ましくは、保存領
域をコードする領域由来である（例えば、配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４
を参照のこと）。Ｋｖ１０．１ＲＮＡおよびｃＤＮＡが単離され得る適切な組織
は、神経系組織（例えば、全脳または網膜）である。

【００９５】 プライマーを使用する増幅技術をまた使用して、Ｋｖ１０．１および他のＫｖ
サブファミリーメンバーをＤＮＡまたはＲＮＡから増幅および単離し得る。以下
のプライマーをまた使用して、ヒトＫｖ１０．１の配列を増幅し得る：

【００９６】

【化３】 これらのプライマーを使用して、例えば、全長配列または１〜数百ヌクレオチ
ドのプローブのいずれかを増幅し得、次いで、全長Ｋｖ１０．１についてライブ
ラリーをスクリーニングするために使用される。

【００９７】 Ｋｖ１０．１をコードする核酸および他のＫｖ１０ファミリーメンバーはまた
、抗体をプローブとして用いて発現ライブラリーから単離され得る。このような
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、配列番号３の配列、またはそ
の免疫原性部位（例えば、配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４）を使用して惹
起され得る。

【００９８】 Ｋｖ１０サブファミリーメンバーおよびＫｖ１０．１多型改変体、オルトログ
（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、およびＫｖ１０．１の保存領域に実質的に同一な対立遺
伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＫｖ１０．１核酸
プローブおよびオリゴヌクレオチドを使用してライブラリーをスクリーニングす
ることによって単離され得る。あるいは、発現ライブラリーを使用して、Ｋｖ１
０サブファミリーメンバーおよびＫｖ１０．１およびＫｖ１０．１多型改変体、
オルトログ、および対立遺伝子を、ヒトＫｖ１０．１およびその部分（例えば、
ヒトＫｖ１０．１の保存領域）に対して作製された抗血清または精製された抗体
（これもまた、Ｋｖ１０．１ホモログを認識しかつ選択的に結合する）で発現し
たホモログを免疫学的に検出する工程によってクローニングし得る。

【００９９】 ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、Ｋｖ１０ ｍＲＮＡ（例えば、ヒト
Ｋｖ１０．１ ｍＲＮＡ）が豊富な供給源（例えば、神経系組織（全脳または網
膜））を選ぶべきである。次いで、逆転写酵素を使用してｍＲＮＡをｃＤＮＡ変
換し、組換えベクターに連結し、そして増殖、スクリーニングおよびクローニン
グのために組換え宿主にトランスフェクトする。ｃＤＮＡライブラリーを作製す
る方法およびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、周知である（
例えば、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１
９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）
。

【０１００】 ゲノムライブラリーについて、ＤＮＡを組織より抽出して、機械的に剪断する
かまたは酵素的に消化するかのいずれかで約１２〜２０ｋｂのフラグメントを得
る。次いで、フラグメントを、グラジエント遠心分離により所望されないサイズ
から分離し、そしてバクテリオファージλベクターに構築する。これらのベクタ
ーおよびファージは、インビトロでパッケージングされる。組換えファージを、
Ｂｅｎｔｏｎ＆Ｄａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０−１８２（１９７
７）に記載されるようにプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コ
ロニーハイブリダイゼーションを、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７２：３９６１−３９６５（１９７５）に一般的
に記載されるように実施する。

【０１０１】 Ｋｖ１０サブファミリーメンバーおよびＫｖ１０．１核酸およびそのオルトロ
グ、対立遺伝子、変異体、多型改変体、および保存的に改変された改変体を単離
する代替の方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用およびＲＮＡまた
はＤＮＡのテンプレートの増幅を結びつける（米国特許第４，６８３，１９５号
および同４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編
、１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ
連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法を使用して、ヒトＫｖ１０．１の核酸配列を、
ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから増幅
し得る。縮重オリゴヌクレオチドを設計して、本明細書に提供される配列を使用
してＫｖ１０．１ホモログを増幅し得る。制限エンドヌクレアーゼ部位を、プラ
イマーに組み込み得る。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法もま
た例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするため
に、生理学的サンプルにおいてＫｖ１０．１をコードするｍＲＮＡの存在を検出
するためのプローブとして使用する核酸を作製するために、核酸を配列決定する
ために、または他の目的のために有用であり得る。ＰＣＲ反応によって増幅され
た遺伝子を、アガロースゲルから精製し得、そして適切なベクターにクローニン
グし得る。

【０１０２】 Ｋｖ１０サブファミリーメンバーおよびＫｖ１０．１の遺伝子発現はまた、当
該分野において公知の技術（例えば、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡま
たはポリＡ⁺ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、
インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、高密度ポリ
ヌクレオチドアレイ技術など）によって分析され得る。

【０１０３】 合成オリゴヌクレオチドを使用して、プローブとしての使用のためにかまたは
タンパク質の発現のために組換えＫｖ１０遺伝子を構築し得る。この方法は、Ｋ
ｖ１０遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に示される通常４０から１
２０ｂｐ長の一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して実施される。次いで、こ
れらのＤＮＡフラグメントをアニールし、連結し、そしてクローニングする。あ
るいは、増幅技術を正確なプライマーと使用して、Ｋｖ１０．１遺伝子の特定の
部分配列を増幅し得る。次いで、この特定の部分配列を、発現ベクターに連結す
る。

【０１０４】 Ｋｖ１０サブファミリーメンバーについての遺伝子（例えば、Ｋｖ１０．１）
が、複製および／または発現のための原核生物細胞または真核生物細胞への形質
転換の前に、中間のベクターに代表的にクローニングされる。これらの中間のベ
クターは、代表的に原核生物細胞ベクター（例えば、プラスミドまたはシャトル
ベクター）である。

【０１０５】 （Ｃ．原核生物および真核生物での発現） Ｋｖ１０サブファミリーメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）をコードするｃＤ
ＮＡのようなクローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るために、代表的
にＫｖ１０．１を転写を指向する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネータ
ー、そしてタンパク質をコードする核酸についての場合、翻訳開始のためのリボ
ソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌性
プロモーターは、当該分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出に記載される。Ｋｖ１０．１タンパク質を発現す
るための細菌性発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．お
よびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（
１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３−５４５（１９
８３））において入手可能である。このような発現系についてのキットは、市販
される。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分
野において周知であり、そしてまた市販される。

【０１０６】 異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の適
用に依存する。プロモーターは、好ましくは、その天然の設定における転写開示
部位からの距離とほぼ同一の異種転写開始部位からの距離に位置付けられる。し
かし、当該分野において公知のように、この距離におけるいくつかの改変が、プ
ロモーター機能の損失なしに受け入れられ得る。

【０１０７】 プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に転写ユニットまたは宿主細
胞においてＫｖ１０をコードする核酸の発現のために要求されるさらなるエレメ
ント全てを含む発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは、Ｋｖ１
０をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写物の効
果的なポリアデニル化に要求されるシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳
ターミネーターを含む。カセットのさらなるエレメントはエンハンサー、そして
ゲノムＤＮＡが構造ゲノムとして使用される場合は、機能的なスプライシングド
ナー部位およびアクセプター部位を伴うイントロンを含み得る。

【０１０８】 プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、構造遺伝子の下流に転写終
止領域を含み、効果的なターミネーションを提供する。終止領域は、プロモータ
ー配列と同一の遺伝子から得られ得るか、または異なる遺伝子から得られ得る。

【０１０９】 遺伝情報を細胞に運ぶために使用される特定の発現ベクターは、特に重要では
ない。真核生物細胞または原核生物細胞における発現に使用される便利な任意の
ベクターが使用され得る。標準的な細菌性発現ベクターとしては、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３ＤならびにＭＢＰ、ＧＳＴ
およびＬａｃＺのような融合発現系が挙げられる。エピトープタグはまた組換え
タンパク質に添加され、便利な単離法を提供し得る（例えば、ｃ−ｍｙｃ）。

【０１１０】 真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、代表的には、
真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクタ
ーおよびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）で使用される。他の典型
的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ⁺、ｐＭＴＯ１０
／Ａ⁺、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよびＣＭＶプロモ
ーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルス
プロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核生物細胞における発現に効
果的であると示された他のプロモーターの指向下でタンパク質を発現し得る任意
の他のベクターが挙げられる。

【０１１１】 真核生物ベクターからのタンパク質の発現はまた、誘導可能なプロモーターを
使用して調節され得る。誘導可能なプロモーターで、発現レベルは、誘導剤（例
えば、テトラサイクリンまたはエクジソン）に応答性のエレメントをプロモータ
ーに組み込むことによってこれらの薬剤の濃度と結び付けられる。一般に、高レ
ベルの発現は、誘導剤の存在下でのみ誘導可能なプロモーターから得られ；基底
の発現レベルは最小である。誘導可能な発現ベクターは、しばしば目的のタンパ
ク質の発現が真核生物細胞に有害である場合に選択される。

【０１１２】 いくつかの発現系は、チミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼのよ
うな遺伝子発現を提供するマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモー
ターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下のＫｖ１０コード
配列を伴う、遺伝子増幅を含まない高収量の発現系（例えば、昆虫細胞における
バキュロウイルスベクターの使用）はまた、適切である。

【０１１３】 発現ベクターに代表的に含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機
能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物
質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入の可能にするプラスミド
の本質的でない領域内に独特の制限部位を含む。選択される特定の抗生物質耐性
遺伝子は、重要ではなく、当該分野において公知の多くの耐性遺伝子のいずれも
が適切である。原核生物配列は、好ましくは選択され、その結果、必要な場合、
原核生物細胞においてＤＮＡの複製を干渉しない。

【０１１４】 標準のトランスフェクション法を使用して、大量のＫｖ１０タンパク質を発現
する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を産生し、次い
で、標準技術を使用して精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０を参照のこ
と）。原核生物細胞および真核生物細胞の形質転換を、標準技術に従って実施す
る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９
７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参
照のこと）。

【０１１５】 外因性ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順のいずれもが
、使用され得る。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポ
リブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック
ス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズ
マベクター、ウイルスベクターおよびクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、合成ＤＮＡまたは他の外因性遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知
の方法のいずれかが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこ
と）。使用された特定の遺伝的操作手順が少なくとも１つの遺伝子をＫｖ１０を
発現し得る宿主細胞に首尾よく導入し得ることのみが必要である。

【０１１６】 発現ベクターが細胞に導入された後に、トランスフェクトされた細胞は、Ｋｖ
１０の発現に都合のよい条件下で培養され、以下に同定される標準技術を使用す
る培養から回収される。

【０１１７】 （ＩＶ．Ｋｖ１０ポリペプチドの精製） 天然に生じるかまたは組換えのいずれかのＫｖ１０サブファミリーメンバー（
例えば、Ｋｖ１０．１）は、機能的アッセイにおける使用のために精製され得る
。天然に生じるＫｖ１０．１モノマーを、例えば、ヒト組織（例えば、全脳また
は網膜およびＫｖ１０．１ホモログの任意の他の供給源）から精製し得る。組換
えＫｖ１０モノマーを、任意の適切な発現系から精製し得る。

【０１１８】 Ｋｖ１０モノマーは、硫酸アンモニウムのような物質での選択的沈殿；カラム
クロマトグラフィー、免疫精製法など（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；
およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）を含む、標準技術によって実質
的に純粋にまで精製され得る。

【０１１９】 組換えＫｖ１０モノマーが精製される場合、多くの手順が利用され得る。例え
ば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、可逆的にＫｖ１０モノマー
に融合され得る。適切なリガントを用いて、Ｋｖ１０モノマーを、精製カラムに
選択的に吸着し得、次いで、比較的純粋な形態でカラムから自由にし得る。次い
で、融合タンパク質を酵素活性によって取り出す。最終的に、Ｋｖ１０モノマー
をイムノアフィニティカラムを使用して精製し得た。

【０１２０】 （Ａ．組換え細菌からのＫｖ１０モノマーの精製） 組換えタンパク質は、典型的に、プロモーター誘導の後に、形質転換された細
菌によって大量に発現されるが；発現は、構成的であり得る。ＩＰＴＧを用いた
プロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の１つの例である。細菌を、当該分
野において標準的な手順に従って増殖させる。新鮮な細菌細胞または凍結した細
菌細胞をタンパク質の単離のために使用する。

【０１２１】 細菌において発現されるタンパク質は、不溶性の凝集物（「封入体」）を形成
し得る。いくつかのプロトコルが、Ｋｖ１０モノマー封入体の精製に適切である
。例えば、封入体の精製は、典型的に、例えば、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣＬ
ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、０．
１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍＭ ＰＭＳＦの緩衝液におけるインキュベーション
によって、細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離および／または精製を含む
。細胞懸濁液は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを２〜３回通して使用して溶解させ
られ得るか、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
を使用してホモジナイズされ得るか、または氷上で超音波処理され得る。細菌を
溶解する代替の方法は、当業者に明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと）。

【０１２２】 必要であれば、封入体を可溶化し、この溶解した細胞懸濁液を、典型的には、
望ましくない不溶性の物体を除くために遠心分離する。封入体を形成したタンパ
ク質を、適合性の緩衝液を用いる希釈または透析によって再生し得る。適切な溶
媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容
積／容積基準で）、およびグアニジン塩酸塩（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられるが
、これらに限定されない。凝集物形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒
（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７０％ギ酸）は、免疫原性およ
び／または活性の欠如を伴う、タンパク質の不可逆的な変性の可能性に起因して
この手順における使用に不適切である。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変
性剤であるが、この変性は不可逆ではなく、再生は変性剤の除去（例えば、透析
による）のときまたは変性剤の希釈のときに起こり得、免疫学的および／または
生物学的に活性なタンパク質の再形成が可能である。他の適切な緩衝液は、当業
者に公知である。ヒトＫｖモノマーは、標準的な分離技術（例えば、Ｎｉ−ＮＴ
Ａアガロース樹脂を用いる）によって他の細菌タンパク質から分離される。

【０１２３】 あるいは、細菌周辺質からＫｖ１０モノマーを精製することが可能である。Ｋ
ｖ１０モノマーが細菌の周辺質に運ばれた場合、細菌の溶解の後、細菌の周辺質
画分は、当業者に公知の他の方法に加えて冷浸透圧衝撃によって単離され得る。
周辺質から組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離して、ペレ
ットを形成する。ペレットを、２０％スクロースを含む緩衝液に再懸濁させる。
細胞を溶解させるために、細菌を遠心分離し、そしてペレットを氷冷５ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ₄に再懸濁し、そして約１０分間氷浴で維持する。細胞懸濁液を遠心分離
し、上清をデカンテーションし、そして保存した。上清に存在する組換えタンパ
ク質を、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離し得
る。

【０１２４】 （Ｂ．Ｋｖ１０モノマーを精製するための標準的なタンパク質分離技術） （可溶性分画） 最初の工程としてしばしば、特にタンパク質混合物が複雑である場合、最初の
塩分画は、目的の組換えタンパク質から、多くの望ましくない宿主細胞タンパク
質（または細胞培養培地に由来するタンパク質）を分離し得る。好ましい塩は、
硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を
効果的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質
は、それらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質がより疎水性になるにつれ
て、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿するようになる。典型的なプロトコル
は、得られる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の間であるように、飽和硫酸
アンモニウムをタンパク質溶液に加える工程を包含する。この濃度は、大部分の
疎水性のタンパク質を沈殿させる。次いで、沈殿を捨て（目的のタンパク質が疎
水性でない場合）、そして硫酸アンモニウムを上清に、目的のたんぱく質を沈殿
させることが公知の濃度まで加える。次いで、沈殿を緩衝液に可溶化させ、必要
であれば、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかで過剰の塩を除く。
タンパク質の可溶性に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈殿）は、当業
者に周知であり、そして複雑なタンパク質混合物を分画するために使用され得る
。

【０１２５】 （サイズ差動濾過） Ｋｖ１０モノマーの分子量は、異なる孔サイズの膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎま
たはＭｉｌｌｉｐｏｒｅの膜）による限外濾過を使用して、より大きなおよびよ
り小さなサイズのタンパク質からそのＫｖ１０モノマーを単離するために使用さ
れ得る。第１の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量よ
りも低い分子量カットオフを有する孔サイズを有する膜を通して限外濾過する。
次いで、限外濾過の保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、目的のタンパク質の分子
量よりも大きな分子カットオフを有する膜に対して限外濾過する。組換えタンパ
ク質は、膜を通って濾液に入る。次いで、濾液を以下に記載のようにクロマトグ
ラフィーにかけ得る。

【０１２６】 （カラムクロマトグラフィー） Ｋｖ１０モノマーはまた、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガ
ンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離され得る。さらに、タン
パク質に対して惹起される抗体は、カラムマトリクスに結合体化され得、そして
タンパク質が免疫精製され得る。これらの方法の全てが当該分野において周知で
ある。クロマトグラフィー技術が任意のスケールで、多くの異なる製造業者（例
えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの器具を使用して実行され得
ることが当業者に明かである。

【０１２７】 （Ｖ．Ｋｖ１０ポリペプチドの免疫学的検出） 核酸ハイブリダイゼーション技術を使用するＫｖ１０遺伝子および遺伝子発現
の検出に加えて、本発明のＫｖ１０モノマーを検出するためにイムノアッセイも
また使用し得る。イムノアッセイを使用して、定性的にまたは定量的にｈＫｖ１
０モノマーを分析し得る。適用可能な技術の一般的な概観は、Ｈａｒｌｏｗおよ
びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（１９８８）に見出され得る。

【０１２８】 （Ａ．Ｋｖ１０モノマーに対する抗体およびＫｖ１０．１モノマーに対する抗
体） Ｋｖ１０モノマー、Ｋｖ１０．１モノマー、またはヒトＫｖ１０．１のような
特定の種由来のＫｖ１０．１モノマーと特異的に反応するポリクローナル抗体お
よびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｃｏ
ｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ（１９９１）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉ
ｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照のこと）。この
ような技術としては、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライ
ブラリーからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫
化することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が挙げら
れる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１
９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９）を
参照のこと）。

【０１２９】 Ｋｖ１０．１モノマーの一部分を含む多くの免疫原を使用して、Ｋｖ１０モノ
マーと特異的に反応する抗体を産生し得る。例えば、組換えＫｖ１０．１モノマ
ーまたはその抗原性フラグメント（例えば、保存領域（例えば、配列番号３のア
ミノ酸１０２〜５１４を参照のこと）は、本明細書中に記載のように単離され得
る。組換えタンパク質は、上記のように真核生物細胞または原核生物細胞におい
て発現され得、そして上で一般的に記載されるように精製され得る。組換えタン
パク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生に好ましい免疫
原である。あるいは、本明細書中に開示される配列から誘導され、キャリアタン
パク質に結合体化される合成ペプチドは、免疫原として使用され得る。天然に存
在するタンパク質もまた、精製形態または純粋でない形態のいずれかで使用され
得る。次いで、産物を、抗体を産生し得る動物に注射する。モノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体のいずれかを、タンパク質を測定するためのイムノア
ッセイにおける引き続く使用のために作製し得る。

【０１３０】 ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に公知である。近交系系統のマウス
（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギを、標準的アジュバント（例えば
、フロイントアジュバント）および標準的な免疫化プロトコルを使用してタンパ
ク質を用いて免疫化する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験採血を
行い、そしてβサブユニットに対する反応性力価を決定することによってモニタ
ーされる。免疫原に対する適切に高い力価の抗体が得られたとき、動物から血液
を集め、そして抗血清を調製する。タンパク質に対して反応性の抗体を富化させ
るための抗血清のさらなる分画は、所望であれば行われ得る（Ｈａｒｌｏｗおよ
びＬａｎｅ、上記を参照のこと）。

【０１３１】 モノクローナル抗体は、当業者によく知られている種々の技術によって得られ
得る。手短には、所望の抗原を用いて免疫化された動物由来の脾細胞を、通常ミ
エローマ細胞との融合によって不死化させる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９（１９７６）を参照の
こと）。不死化の代替の方法としては、エプスタイン−バーウイルス、オンコジ
ーン、またはレトロウイルスを用いた形質転換、あるいは当該分野で周知の他の
方法が挙げられる。単一の不死化した細胞から生じるコロニーを、抗原に対する
所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングし、そしてこの
ような細胞によって産生されたモノクローナル抗体の産生は、脊椎動物宿主の腹
膜腔への注射を含む、種々の技術によって高められ得る。あるいは、Ｈｕｓｅら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）によって概説され
る一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングすることによって、モノクローナル抗体またはそれらの結合フラグメン
トをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。

【０１３２】 モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を収集し、そしてイムノアッセ
イ（例えば、固体支持体に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイ）で免
疫原タンパク質に対して力価決定する。典型的には、１０⁴以上の力価を有する
ポリクローナル抗血清を選択し、そして競合結合イムノアッセイを使用して非Ｋ
ｖファミリータンパク質および他のＫｖファミリータンパク質に対するそれらの
交差反応性について試験する。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクロー
ナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より通常には少なくとも約１μＭ
、好ましくは少なくとも約０．１μＭまたはそれよりも良く、そして最も好まし
くは、０．０１μＭまたはそれよりも良いＫ_dで結合する。特定のＫｖ１０．１
オルトログ（例えば、ヒトＫｖ１０．１）のみに対して特異的な抗体はまた、非
ヒト哺乳動物のような種から他の交差反応性オルトログを引くことによって作製
され得る。

【０１３３】 一旦、Ｋｖ１０．１に対する特異的な抗体が利用可能となると、Ｋｖ１０．１
のようなＫｖ１０サブファミリーメンバーは、種々のイムノアッセイ方法によっ
て検出され得る。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説について、Ｂａ
ｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓおよ
びＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッ
セイは、任意のいくつかの構成で実施され得、これらは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；ならびにＨａｒｌｏｗおよび
Ｌａｎｅ、上記において広範に概説される。

【０１３４】 （Ｂ．免疫学的結合アッセイ） 本発明のＫｖ１０ポリペプチドは、多くのよく認識された免疫学的結合アッセ
イ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同
第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号を参照のこと）のい
ずれかを使用して検出および／または定量され得る。一般的なイムノアッセイの
概説について、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９
３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉ
ｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）もまた参照のこと。免疫学的結合
アッセイ（つまり、イムノアッセイ）は、典型的に、選択したタンパク質または
抗原（この場合、Ｋｖ１０サブファミリーメンバーまたはＫｖ１０．１またはそ
れらの抗原性部分配列）に特異的に結合する抗体を使用する。抗体（例えば、抗
Ｋｖ１０）は、当業者に周知の多くの手段のいずれかによってそして上記のよう
に産生され得る。

【０１３５】 イムノアッセイはまた、しばしば、抗体および抗原によって形成される複合体
に特異的に結合し、そして標識する標識化剤を使用する。標識化剤は、それ自身
、抗体／抗原複合体を構成する部分の１つであり得る。従って、標識化剤は、標
識されたＫｖ１０ポリペプチドまたは標識された抗Ｋｖ１０抗体であり得る。あ
るいは、標識化剤は、第３の部分（例えば、二次抗体）であり得、これは、抗体
／Ｋｖ１０複合体に特異的に結合する（二次抗体は、典型的に、第１の抗体が誘
導される種の抗体に特異的である）。免疫グロブリン定常領域（例えば、プロテ
インＡまたはプロテインＧ）に特異的に結合し得る他のタンパク質はまた、標識
剤として使用され得る。これらのタンパク質は、これらのタンパク質は、種々の
種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性の反応性を示す（例えば
、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１〜１４０６（１９
７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９〜２５
４２（１９８５）を参照のこと）。標識化剤は、別の分子（例えば、ストレプト
アビジン）が特異的に結合し得る検出可能な部分（例えば、ビオチン）を用いて
改変され得る。種々の検出可能な部分は、当業者に周知である。

【０１３６】 アッセイ全体にわたって、インキュベーション工程および／または洗浄工程は
、試薬のそれぞれの組み合わせの後に必要とされ得る。インキュベーション工程
は、約５秒〜数時間、好ましくは、約５分〜約２４時間で変動し得る。しかし、
インキュベーション時間は、アッセイ形式、抗原、溶液の容積、濃度などに依存
する。通常、アッセイは周囲温度で実施されるが、アッセイは、ある範囲の温度
（例えば、１０℃〜４０℃）で行われ得る。

【０１３７】 （非競合アッセイ形式） サンプル中のＫｖ１０を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競
合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイは、抗原の量が直接測定さ
れるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例え
ば、抗Ｋｖ１０サブユニット抗体は、それらが固定化される固体基材に直接結合
され得る。次いで、これらの固定化された抗体は、試験サンプルに存在するＫｖ
１０を捕捉する。このようにして、Ｋｖ１０モノマーを固定化し、次いで標識化
剤（例えば、標識を有する第２のＫｖ１０抗体）によって結合される。あるいは
、第２の抗体は、標識を欠き得るが、次に、第２の抗体が誘導される種の抗体に
特異的な標識された第３の抗体によって結合され得る。第２の抗体または第３の
抗体は、典型的に、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合し
て検出可能な部分を提供する検出可能な部分（例えば、ビオチン）を用いて改変
される。

【０１３８】 （競合アッセイ形式） 競合アッセイにおいて、サンプルに存在するＫｖ１０の量は、サンプルに存在
する未知のＫｖ１０によって抗Ｋｖ１０抗体から置換される（競合によって除去
され）既知の加えられた（外因性）Ｋｖ１０の量を測定することによって、間接
的に測定される。１つの競合アッセイにおいて、既知の量のＫｖ１０がサンプル
に加えられ、次いでサンプルを、Ｋｖ１０に特異的に結合する抗体と接触させる
。抗体に結合した外因性のＫｖ１０の量は、サンプルに存在するＫｖ１０の濃度
と逆に比例する。特に好ましい実施形態において、抗体を固体基材に固定する。
抗体に結合されたＫｖ１０の量は、Ｋｖ１０／抗体複合体に存在するＫｖ１０の
量を測定することによって、あるいは残りの複合体化されていないタンパク質の
量を測定することによってのいずれかで決定され得る。Ｋｖ１０の量は、標識さ
れたＫｖ１０分子を提供することによって検出され得る。

【０１３９】 ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合アッセイである。このアッセイに
おいて、公知のＫｖ１０は、固体基材に固定化される。既知の量の抗Ｋｖ１０抗
体をサンプルに加え、次いで、サンプルを固定化されたＫｖ１０と接触させる。
既知の固定化されたＫｖ１０に結合された抗Ｋｖ１０の量は、サンプルに存在す
るＫｖ１０の量に逆に比例する。また、固定化された抗体の量は、固定化された
抗体の画分または溶液に残る抗体の画分のいずれかを検出することによって検出
され得る。検出は、抗体が標識されて直接的であり得るか、または上記のように
抗体に特異的に結合する標識された部分のその後の添加によって間接的であり得
る。

【０１４０】 （交差反応性の決定） 競合結合形式におけるイムノアッセイはまた、Ｋｖ１０サブファミリーメンバ
ーおよびＫｖ１０．１に対する交差反応性決定のために使用され得る。例えば、
配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも部分的に対応するＫｖ１０．１タンパク
質またはその免疫原領域（例えば、保存領域（例えば、配列番号３のアミノ酸１
０２〜５１４））が、固体支持体に固定化され得る。他のＫｖファミリーメンバ
ーのような他のタンパク質は、固定化された抗原に対する抗血清の結合に競合す
るように、アッセイに加えられる。固定化されたタンパク質に対する抗血清の結
合に競合する、加えられたタンパク質の能力は、Ｋｖ１０．１またはその免疫原
性部分の、それら自身と競合する能力と比較される。上記タンパク質に対する交
差反応性のパーセントを、標準的な計算を使用して計算する。上に列挙された加
えられたタンパク質のそれぞれとの１０％未満の交差反応性を有する抗血清を、
選択し、そしてプールする。交差反応する抗体を必要に応じて、加えられた考慮
されるタンパク質（例えば、遠く関連するホモログ）との免疫吸収（ｉｍｍｕｎ
ｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）によってプールされた抗血清から除去する。Ｋｖ１０
サブファミリーメンバーのみに、またはＫｖ１０．１の特定のオルトログ（例え
ば、ヒトＫｖ１０．１）のみに特異的に結合する抗体もまた、この方法論を使用
して作製され得る。

【０１４１】 次いで、免疫吸収され、そしてプールされた抗血清を、第２のタンパク質（お
そらく、Ｋｖ１０サブファミリーメンバーあるいはＫｖ１０．１の対立遺伝子、
オルトログ、または多型改変体と考えられ得る）を免疫原タンパク質と比較する
ために、上記のように競合結合イムノアッセイにおいて使用する。この比較を行
うために、２つのタンパク質を幅広い範囲の濃度でそれぞれアッセイし、そして
固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合の５０％を阻害するために必要と
されるそれぞれのタンパク質の量を決定する。結合の５０％を阻害するために必
要とされる第２のタンパク質の量が結合の５０％を阻害するために必要とされる
Ｋｖ１０．１によってコードされるタンパク質の量の１０倍未満である場合、第
２のタンパク質が、それぞれのＫｖ１０．１免疫原に対して産生されるポリクロ
ーナル抗体に特異的に結合するといえる。

【０１４２】 （他のアッセイ形式） ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析を使用して、サンプル中のＫｖ１０
の存在を検出および定量する。この技術は、一般的に、分子量に基づいてゲル電
気泳動によりサンプルタンパク質を分離する工程、分離されたタンパク質を適切
な支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または
誘導されたナイロンフィルター）に移す工程、およびＫｖ１０に特異的に結合す
る抗体とともにサンプルをインキュベーションする工程を包含する。抗Ｋｖ１０
抗体は、固体支持体上のＫｖ１０に特異的に結合する。これらの抗体は、直接的
に標識され得るか、あるいは抗Ｋｖ１０抗体に特異的に結合する標識された抗体
（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を使用して後で検出され得る。

【０１４３】 他のアッセイ形式としては、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられ
、これは、特定の分子（例えば抗体）に結合し、そしてカプセル化された試薬ま
たはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。次いで、放出
された化学物質は、標準的な技術（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒ
ｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４〜４１（１９８６）を参照のこと）に従って検出される
。

【０１４４】 （非特異的結合の減少） 当業者は、イムノアッセイにおける非特異的結合を最少化することがしばしば
望ましいことを認める。特に、アッセイが、固体基材に固定された抗原または抗
体を含む場合、基材に対する非特異的結合の量を最少化することが望ましい。こ
のような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知である。典型的には、
この技術は、基材をタンパク質の組成物でコーティングする工程を包含する。詳
細には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンのようなタ
ンパク質組成物が幅広く使用され、粉乳が最も好ましい。

【０１４５】 （標識） アッセイにおいて用いられる特定の標識または検出可能な基は、これが、アッ
セイにおいて用いられる抗体の特異的結合を大いに妨害しない限り、本発明の重
要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を
有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの
分野において充分に開発されており、そして一般に、このような方法において有
用な大部分の任意の標識が、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光光度
学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的
手段または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において
有用な標識としては、以下が挙げられる：磁性ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡ
ＤＳ^TM）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ
ｒｅｄ、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｈ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃま
たは³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される他の酵素）、および比色標識（
例えば、コロイド状金または着色したガラスもしくはプラスチックのビーズ（例
えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど））。

【０１４６】 標識は、当該分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に対して直接
的または間接的に結合され得る。上記で示したように、広範な種々の標識が用い
られ得、標識の選択は、必要とされる感度、化合物の結合体化の容易さ、安定性
要件、利用可能な装置および使い捨て設備に依存する。

【０１４７】 非放射性標識がしばしば、間接的手段によって付着される。一般に、リガンド
分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いで、このリガンドは
、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合し、この別の分子は、固有に
検出可能であるか、またはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物ま
たは化学発光化合物）に共有結合されるかのいずれかである。リガンドおよびそ
れらの標的は、ｈＫｖ１０を認識する抗体または抗ｈＫｖ１０抗体を認識する二
次抗体との任意の適切な組み合わせで用いられ得る。

【０１４８】 分子はまた、直接的にシグナル生成化合物へと、例えば、酵素または発蛍光団
との結合体化によって結合体化され得る。標識としての目的の酵素は主に、ヒド
ロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）または
オキシダーゼ（特に、ペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物としては、フルオ
レセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリ
フェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリンおよび２，
３−ジヒドロフタラジンジオン(例えば、ルミノール)が挙げられる。用いられ得
る種々の標識またはシグナル生成系の概説については、米国特許第４，３９１，
９０４号を参照のこと。

【０１４９】 標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性
標識である場合、検出手段としては、シンチレーションカウンターまたはオート
ラジオグラフィーにおいてのような写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識
である場合、この標識は、発蛍光団を適切な波長の光で励起し、そして得られる
蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムに
よって、電気的検出器（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管な
ど）の使用によって検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素にとって適切
な基質を提供し、そして得られる反応産物を検出することによって検出され得る
。最後に、単純な比色標識は、標識に関連した色を観察することによって単純に
検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合体化
された金はしばしばピンク色に見え、一方、種々の結合体化ビーズはビーズの色
に見える。

【０１５０】 いくつかのアッセイ形式は、標識成分の使用を必要としない。例えば、凝集ア
ッセイを用いて、標的抗体の存在を検出し得る。この場合、抗原でコーティング
された粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、ど
の成分も標識される必要がなく、標的抗体の存在は、単純な目視によって検出さ
れる。

【０１５１】 （ＶＩ．Ｋｖ１０のモジュレーターについてのアッセイ） （Ａ．アッセイ） ヒトＫｖ１０サブファミリーのモノマーおよびＫｖ１０．１の対立遺伝子、オ
ルトログおよび多型改変体は、カリウムチャネルのサブユニットである。Ｋｖ１
０を含むカリウムチャネルの活性は、種々のインビトロおよびインビボでのアッ
セイを用いて、例えば、電流を測定することによって、膜電位を測定することに
よって、リガンド結合を測定することによって、イオンフラックス（例えば、カ
リウムまたはルビジウム）を測定することによって、イオン濃度を測定すること
によって、セカンドメッセンジャーおよび転写レベルを測定することによって、
カリウム依存性酵母増殖アッセイを用いることによって、リガンド結合を測定す
ることによって、および例えば、電圧感受性色素、イオン感受性色素（例えば、
カリウム感受性色素）、放射性トレーサーおよびパッチクランプ電気生理学を用
いることによって評価され得る。

【０１５２】 さらに、このようなアッセイを用いて、Ｋｖ１０（例えば、Ｋｖ１０．１）を
含むチャネルのインヒビターおよびアクチベーターについて試験し得る。カリウ
ムチャネルのこのようなモジュレーターは、カリウムチャネルに関与する種々の
障害を処置するために有用である。機能不全の処置としては、例えば、ＣＮＳ障
害（例えば、癲癇、片頭痛、視覚の問題）、精神障害（例えば、精神分裂症およ
び鬱病）、痙攣および認知障害（例えば、学習障害および記憶障害）が挙げられ
る。このようなモジュレーターはまた、神経防御因子（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、発作を予防するため）として、そして疼痛（
例えば、神経障害性疼痛）の処置のために有用である。このようなモジュレータ
ーはまた、Ｋｖ１０サブファミリーのメンバーによって提供されるチャネル多様
性、ならびにＫｖ１０サブファミリーのメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）によ
って提供されるカリウムチャネル活性の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）／調節（
ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の調査のために有用である。

【０１５３】 Ｋｖカリウムチャネルのモジュレーターは、生物学的に活性なＫｖ１０（組換
え体かまたは天然に存在するかのいずれか、好ましくは、ヒトＫｖ１０．１）を
用いて試験される。Ｋｖ１０は、細胞において単離、同時発現または発現され得
るか、または細胞に由来する膜において発現され得る。このようなアッセイにお
いて、Ｋｖ１０は、単独で発現されてホモマーカリウムチャネルを形成するかま
たは第２のαサブユニット（例えば、別のＫｖファミリーのメンバー（例えば、
Ｋｖ２、好ましくはＫｖ２．１またはＫｖ２．２））と共に同時発現されて、そ
の結果、ヘテロマーカリウムチャネルを形成する。Ｋｖ１０ポリペプチドはまた
、さらなるβサブユニットと共に発現され得る。調節は、上記のインビトロまた
はインビボのアッセイのうちの１つを用いて試験される。潜在的なカリウムチャ
ネルインヒビターまたはアクチベーターとともに処理されるサンプルまたはアッ
セイは、試験化合物を有さないコントロールサンプルに対して比較されて、調節
の程度が調べられる。コントロールサンプル（アクチベーターでもインヒビター
でも処理されていない）は、１００という相対的カリウムチャネル活性値が割り
当てられる。Ｋｖ１０ポリペプチドを含むチャネルの阻害は、コントロールと比
較したカリウムチャネル活性値が約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは
２５％である場合に達成される。Ｋｖ１０ポリペプチドを含むチャネルの活性化
は、コントロールと比較したカリウムチャネル活性値が１１０％、より好ましく
は１５０％、より好ましくは２００％より高い場合に達成される。イオンフラッ
クスを増加させる化合物は、Ｋｖ１０ポリペプチドを含むチャネルが開く可能性
を増加させることによって、Ｋｖ１０ポリペプチドを含むチャネルが閉じる可能
性を減少させることによって、このチャネルを通してのコンダクタンスを増加さ
せることによって、および／またはイオンの通過を可能にすることによって、イ
オン電流密度において検出可能な増加を引き起こす。

【０１５４】 イオンフラックスにおける変化は、Ｋｖ１０ポリペプチドを含むカリウムチャ
ネルを発現する細胞または膜の分極（すなわち、電位）における変化を決定する
ことによって評価され得る。細胞分極における変化を決定するために好ましい手
段は、電圧固定技術およびパッチクランプ技術（例えば、「細胞付着」形態、「
裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」形態および「細胞全体」形態）を用いて電流
における変化を測定すること（それによって、分極における変化を測定すること
）による（例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３
６：１５７５−１５９５（１９９７）を参照のこと）。細胞全体電流は、標準的
な方法論を用いて便利に決定される（例えば、Ｈａｍｉｌら，ＰＦｌｕｇｅｒｓ
．Ａｒｃｈｉｖ．３９１：８５（１９８１）を参照のこと）。他の公知のアッセ
イとしては、以下が挙げられる：放射標識ルビジウムフラックスアッセイおよび
電圧感受性色素またはイオン感受性色素を用いた蛍光アッセイ（例えば、Ｖｅｓ
ｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．８８：
６７−７５（１９８８）；Ｄａｎｉｅｌら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ
．２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３７：５９−７０（１９９４）を参照のこと）。
Ｋｖ１０ポリペプチドを含むチャネルタンパク質を通してカリウムフラックスを
阻害または増加し得る化合物についてのアッセイは、本発明のチャネルを有する
細胞と接触していてこれを含む浴溶液への化合物の適用によって行われ得る（例
えば、Ｂｌａｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ ３２３：７１８−７２０（１９８６）；Ｐ
ａｒｋ、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８１：５５５−５７０（１９９４）を参照のこ
と）。一般的に、試験されるべき化合物は、１ｐＭ〜１００ｍＭの範囲で存在す
る。

【０１５５】 チャネルの機能に対する試験化合物の影響は、電流もしくはイオンフラックス
における変化によって、または電流およびフラックスの変化の結果によって測定
され得る。電流またはイオンフラックスにおける変化は、イオン（カリウムイオ
ンまたはルビジウムイオン）のフラックスにおける増加または減少のいずれかに
よって測定される。イオンは、種々の標準的な方法において測定され得る。これ
らは、イオンの濃度変化（例えば、細胞内濃度における変化）によって直接的に
、または膜電位もしくはイオンの放射性標識によって間接的に測定され得る。イ
オンフラックスに対する試験化合物の結果は、極めて変動し得る。従って、任意
の適切な生理学的変化を用いて、本発明のチャネルに対する試験化合物の影響が
評価され得る。試験化合物の影響は、毒素結合アッセイによって測定され得る。
インタクトな細胞または動物を用いて機能的な結果が決定された場合、種々の影
響（例えば、伝達物質の放出（例えば、ドーパミン）、細胞内カルシウム変化、
ホルモン放出（例えば、インスリン）、公知の遺伝マーカーおよび特徴付けられ
ていない遺伝マーカーの両方の転写変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞の
容積変化（例えば、赤血球において）、免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）、細
胞代謝（例えば、細胞増殖またはｐＨ変化）における変化、ならびに細胞内セカ
ンドメッセンジャー（例えば、サイクリックヌクレオチド）における変化）もま
た測定し得る。

【０１５６】 好ましくは、アッセイにおいて用いられる、カリウムチャネルの一部であるＫ
ｖ１０ポリペプチドは、配列番号３に表される配列またはその保存的に改変され
た改変体を有する。あるいは、アッセイのＫｖ１０は、真核生物から誘導され、
そしてヒトＫｖ１０．１の保存された領域（例えば、配列番号３のアミノ酸１０
２〜５１４を参照のこと）に対して実質的なアミノ酸配列同一性を有するアミノ
酸部分配列を含む。一般に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも６０％、好まし
くは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％であり、
最も好ましくは少なくとも９５％である。

【０１５７】 Ｋｖ１０サブファミリーのメンバーならびにＫｖ１０．１のオルトログ、対立
遺伝子、多型改変体および保存的に改変された改変体は一般に、上記のように、
実質的に類似した特性を、Ｋｖ１０ポリペプチドを含むチャネルに対して付与す
る。好ましい実施形態では、Ｋｖ１０ホモログであることが推定される化合物と
接触させた細胞は、真核生物細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ（例えば、Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞も
しくはＨｅＬａ細胞））におけるイオンフラックスの増加または減少についてア
ッセイされる。Ｋｖ１０．１と類似のように化合物によって影響されたチャネル
は、Ｋｖ１０サブファミリーのメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）のホモログま
たはオルトログであると考えられる。

【０１５８】 （Ｂ．モジュレーター） Ｋｖ１０サブユニットを含むＫｖチャネルのモジュレーターとして試験される
化合物は、任意の低分子化学化合物または生物学的実体（例えば、タンパク質、
糖、核酸または脂質）であり得る。あるいは、モジュレーターは、遺伝的に改変
されたバージョンのＫｖ１０サブユニットであり得る。代表的に、試験化合物は
、低分子化学分子およびペプチドである。本質的に任意の化学化合物は、本発明
のアッセイにおける潜在的モジュレーターまたはリガンドとして用いられ得るが
、最も頻繁には、化合物は、水性または有機性（特にＤＭＳＯベース）の溶液に
溶解されて使用され得る。アッセイは、（これらは代表的には並行して行われる
（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレートでのマイクロタ
イター形式において））アッセイ工程を自動化し、そして任意の便利な供給源か
らアッセイへと化合物を提供することによって大きな化学的ライブラリーをスク
リーニングするように設計される。以下を含めて、化学化合物の多くの供給業者
が存在することが認識される：Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄ
ｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎ
ａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）など。

【０１５９】 １つの好ましい実施形態では、高処理能力スクリーニング方法は、多数の潜在
的治療化合物（潜在的モジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナト
リアル化学ライブラリーまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーを提供す
ることを含む。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」また
は「リガンドライブラリー」は、本明細書中に記載されるように１以上のアッセ
イにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的活性を提示するライブラリーメ
ンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。このようにして同定され
た化合物は、従来の「リード化合物」として役立ち得るか、またはこれら自体が
潜在的治療剤もしくは実際の治療剤として用いられ得る。

【０１６０】 コンビナトリアル化学ライブラリーは、多数の化学的「構築ブロック」（例え
ば、試薬）を合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかに
よって生成される多様な化学化合物のコレクションである。例えば、線形コンビ
ナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、化学的
構築ブロック（アミノ酸）のセットをあらゆる可能な方法で所定の化合物長（す
なわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸数）に合わせることによって形成
される。数百万の化学化合物は、化学的構築ブロックのこのようなコンビナトリ
アル混合を通して合成され得る。

【０１６１】 コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に
周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、以下が挙
げられるがこれらに限定されない：ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第
５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ
．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ
３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）。化学的多様性ライブラリー
を作製するための他の化学もまた用いられ得る。このような化学としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９１／１９７３５）、コードされるペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
３／２０２４２）、ランダム生体オリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２
／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号
）、ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾ
ジアゼピンおよびジペプチド）（Ｈｏｂｂｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニロガス（ｖｉ
ｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプ
チド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリー
の類似の有機合成（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２
６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライ
ブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て前出を
参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０
８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）
およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、糖ライブラリー（例えば
、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）お
よび米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機低分子ライブラリー
（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ、１月１８日，３３頁（１９
９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンお
よびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）、米国特許第５，５４９
，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１
９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジ
アゼピン、同第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。

【０１６２】 コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（
例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅ
ｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂ
ｕｒｎ，ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、９０５０ Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ，ＭＡを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが、そ
れ自体市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．
Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ、３Ｄ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。

【０１６３】 １つの実施形態では、本発明は、高処理能力形式における、固相に基づくイン
ビトロアッセイを提供し、ここで、ヒトＫｖ１０．１サブユニットを含むＫｖチ
ャネルを発現する細胞または組織は、固相基材へと付着される。本発明の高処理
能力アッセイでは、１日で数千個までの異なるモジュレーターまたはリガンドを
スクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各々
のウェルを用いて、選択された潜在的なモジュレーターに対して別個のアッセイ
が行われ得るか、または濃度もしくはインキュベーション時間の影響が観察され
る場合、５〜１０ウェルごとに単一のモジュレーターを試験し得る。従って、単
一の標準的なマイクロタイタープレートは、約９６のモジュレーターについてア
ッセイし得る。１５３６ウェルプレートを用いるならば、単一のプレートは、約
１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。１日あたり多くの
プレートをアッセイすることが可能である；約６，０００、２０，０００、５０
，０００または１００，０００以上までの異なる化合物についてのアッセイスク
リーニングは、本発明の一体型システムを用いて可能である。

【０１６４】 （Ｃ．固相状態および可溶性高処理能力アッセイ） １つの実施形態では、本発明は、Ｋｖ１０ポリペプチド（例えば、Ｋｖ１０．
１）を含むカリウムチャネル；Ｋｖ１０カリウムチャネルを含む膜、または天然
に存在するかもしくは組換え体のいずれかのＫｖ１０ポリペプチドを含むカリウ
ムチャネルを発現する細胞もしくは組織を用いた可溶性アッセイを提供する。別
の実施形態では、本発明は、固相に基づくインビトロアッセイを高処理能力形式
で提供し、ここで、Ｋｖ１０カリウムチャネルが固相基材に付着される。

【０１６５】 本発明の高処理能力アッセイでは、数千までの異なるモジュレーターまたはリ
ガンドを１日にスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイター
プレートの各ウェルを用いて、選択された潜在的モジュレーターに対する別個の
アッセイを行い得るか、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響が
観察される場合には、５〜１０ウェルごとに単一のモジュレーターを試験し得る
。従って、単一の標準的マイクロタイタープレートは、約１００（例えば、９６
）のモジュレーターをアッセイし得る。１５３６ウェルプレートを用いたならば
、単一のプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし
得る。１日あたり多くのプレートをアッセイすることが可能である；約６，００
０、２０，０００、５０，０００または１００，０００を超えるまでの異なる化
合物についてのアッセイスクリーニングは、本発明の一体型システムを用いて可
能である。

【０１６６】 目的のチャネルまたは目的のチャネルを含む細胞もしくは膜は、固体状態の成
分に直接的もしくは間接的に、共有結合もしくは非共有結合的結合（例えば、タ
グ）を介して結合され得る。タグは、任意の種々の成分であり得る。一般に、タ
グに結合する分子（例えば、タグバインダー）は、固体支持体に固定され、そし
て目的のタグ化分子（例えば、目的の味覚伝達分子）が、タグとタグバインダー
との相互作用によって固体支持体へと付着される。

【０１６７】 多数のタグおよびタグバインダーが、文献に充分に記載される公知の分子相互
作用に基づいて用いられ得る。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオ
チン、プロテインＡまたはプロテインＧ）を有する場合、これは、適切なタグバ
インダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートロアビジン（ｎｅｕｔｒａ
ｖｉｄｉｎ）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）と関連して用いられ得る。天然
のバインダー（例えば、ビオチン）を伴う分子に対する抗体もまた広範に利用可
能であり、そして適切なタグバインダーについては、ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８カタログＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯを
参照のこと。

【０１６８】 同様に、任意のハプテン性または抗原性化合物は、適切な抗体と組み合わせて
用いられて、タグ／タグバインダー対を形成し得る。数千の特異的抗体が市販さ
れており、そして多くのさらなる抗体が、文献に記載されている。例えば、１つ
の一般的な構成では、タグは、第１の抗体であり、そしてタグバインダーは、第
１の抗体を認識する第２の抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、レセプタ
ー−リガンド相互作用もまた、タグおよびタグバインダー対として適切である。
例えば、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、細胞レ
セプター−リガンド相互作用（例えば、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイル
スレセプターリガンド、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、イン
ターロイキンレセプター、免疫グロブリンレセプターおよび抗体、カドヘリン（
ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）ファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミ
リーなど））；例えば、ＰｉｇｏｔｔおよびＰｏｗｅｒ，Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉ
ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ Ｉ（１９９３）を参照のこと
。同様に、毒素および毒物、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエー
ト、ステロイドなど）、細胞内レセプター（例えば、種々の低分子リガンド（ス
テロイド、チロイドホルモン、レチノイドおよびビタミンＤ；ペプチドを含む）
の効果を媒介するレセプター）、薬物、レクチン、糖、核酸（直鎖状ポリマー構
造および環状ポリマー構造の両方）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗
体は全て、種々の細胞レセプターと相互作用し得る。

【０１６９】 合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポ
リウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリ
シロキサン、ポリイミドおよびポリアセテート）もまた、適切なタグまたはタグ
バインダーを形成し得る。多くの他のタグ／タグバインダー対もまた、本開示を
概観すれば当業者に明らかであるように、本明細書中に記載されるアッセイシス
テムにおいて有用である。

【０１７０】 通常のリンカー（例えば、ペプチド、ポリエーテルなど）もまた、タグとして
役立ち得、そしてポリペプチド配列（例えば、約５アミノ酸と２００アミノ酸と
の間のポリｇｌｙ配列）を含み得る。このような可撓性リンカーは、当業者に公
知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔ
ｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから
入手可能である。これらのリンカーは必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリ
ル結合またはヘテロ官能性結合を有する。

【０１７１】 タグバインダーは、現在利用可能な任意の種々の方法を用いて固体基材へと固
定される。固体基材は通常、全てまたは一部の基材を、化学基を、タグバインダ
ーの一部と反応性である表面へと固定する化学試薬へと曝露することによって誘
導体化または官能化される。例えば、より長い鎖の部分への付着に適切である基
は、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基を含む。アミ
ノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いて、種々の表面（例え
ば、ガラス表面）を官能化し得る。このような固相生体高分子アレイの構築は、
文献に充分に記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えば、ペプチドの固
相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２
５９−２７４（１９８７）（ピン上での固相成分の合成を記載する）；Ｆｒａｎ
ｋおよびＤｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１−６０４０（
１９８８）（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載する）
；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈ
ｅｌｄｏｎら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４）：７１８−
７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｄｉｃｉｎｅ
２（７）：７５３−７５９（１９９６）（全て、固体基材へと固定した生体高分
子のアレイを記載する）を参照のこと。タグバインダーを基材へと固定する非化
学的アプローチとしては、他の通常の方法（例えば、熱、ＵＶ照射による架橋な
ど）が挙げられる。

【０１７２】 （ＶＩＩ．ｈＫｖ１０を使用するコンピュター支援薬物設計） Ｋｖ１０チャネルの活性を調節する化合物についてのなお別のアッセイ法は、
コンピューター支援薬物設計を含み、そこで、コンピューターシステムが、アミ
ノ酸配列によってコードされる構造の情報に基づいて、Ｋｖ１０．１の三次元構
造を生成するために使用される。インプットアミノ酸配列は、タンパク質の二次
、三次、および四次構造モデルを生成するための、モデルコンピュータープログ
ラムにおいて以前に確立されたアルゴリズムと、直接および活発に相互作用する
。タンパク質の構造モデルは次いで、例えば、リガンドまたは他のカリウムチャ
ネルサブユニットに結合する能力を有する構造領域を同定するために、調査され
る。これらの領域は次いで、そのタンパク質、またはＫｖ１０．１が他のカリウ
ムチャネルサブユニットと相互作用する領域に結合するリガンド、を同定するた
めに使用される。

【０１７３】 タンパク質の三次元構造モデルは、少なくとも２５，５０，７５、または１０
０アミノ酸残基のチャネルタンパク質アミノ酸配列またはＫｖ１０．１モノマー
をコードする対応する核酸配列を、コンピューターシステムに入力することによ
って生成される。モノマーのそれぞれのアミノ酸配列は、配列番号３、およびそ
の保存的に改変されたバージョン、または配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４
を含むその免疫原性部分からなる群より選択される。アミノ酸配列は、それぞれ
のタンパク質の一次配列または部分配列を示しており、それは、タンパク質の構
造情報をコードしている。少なくとも２５，５０，７５、または１００残基のア
ミノ酸配列（または、少なくとも約２５，５０，７５、または１００アミノ酸を
コードするヌクレオチド配列）が、コンピューターキーボード、コンピューター
読み取り可能な物（電子記憶媒体（例えば、磁気ディスケット、テープ、カート
リッジ、およびチップ）、光学的媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）を含むがそれに
限定されない）、インターネットサイトによって分配される情報、およびＲＡＭ
によって分配される情報からコンピューターシステムに入力される。チャネルタ
ンパク質の三次元構造モデルは次いで、当業者に公知のソフトウェアを使用して
、アミノ酸配列およびコンピュターシステムの相互作用によって生成される。生
じる三次元コンピューターモデルは次いで、コンピューター読み取り可能な物上
に保存され得る。

【０１７４】 そのアミノ酸配列は、モノマー、および４つのモノマーを含むヘテロマーカリ
ウムチャネルの二次、三次、および四次構造を形成するのに必要な情報をコード
する一次構造を示す。ソフトウェアは、構造モデルを生成するために、その一次
配列によってコードされる、特定のパラメーターを調べる。これらのパラメータ
ーは、「エネルギーの項（ｅｎｅｒｇｙ ｔｅｒｍ）」、または異方性の項（ａ
ｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｔｅｒｍ）と呼ばれ、そして主に、静電ポテンシャル、
疎水性ポテンシャル、溶媒が到達可能な表面、および水素結合を含む。第二のエ
ネルギーの項は、ファンデルワールスポテンシャルを含む。生物学的分子は、累
積的様式で、エネルギーの項を最小にする構造を形成する。コンピュータープロ
グラムは従って、二次構造モデルを創出するために、一次構造またはアミノ酸配
列によってコードされるこれらの項を使用している。

【０１７５】 二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造は次いで、二次構造のエ
ネルギーの項に基づいて形成される。この時点で使用者は、さらなる変量（例え
ば、タンパク質が、膜結合であるか、可溶性であるかどうか）、身体中のその位
置、およびその細胞位置（例えば、細胞質の位置、表面の位置、または核の位置
）を入力し得る。二次構造のエネルギーの項に加えて、これらの変量は、三次構
造のモデルを形成するために使用される。三次構造のモデリングでは、コンピュ
ータープログラムは、二次構造の親水性面を同種とマッチさせ、そして二次構造
の疎水性面を同種と適合させる。

【０１７６】 一旦構造が、生成されると、可能性のあるリガンド結合領域が、コンピュータ
ーシステムによって同定される。可能性のあるリガンドが、上記のように、アミ
ノ酸配列もしくはヌクレオチド配列または化合物の化学式を入力することにより
作成される。次いで、その可能性のあるリガンドの三次元構造が、Ｋｖ１０サブ
ファミリーメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）に結合するリガンドを同定するた
めに、Ｋｖ１０タンパク質の三次元構造と比較される。どのリガンドが、そのタ
ンパク質に結合する増加した確率を有するかを決定するために、エネルギーの項
を使用して、そのタンパク質とリガンドとの間の結合親和性が、決定される。

【０１７７】 コンピューターシステムはまた、Ｋｖ１０サブファミリーメンバー遺伝子（例
えば、Ｋｖ１０．１）の変異、多型改変体、対立遺伝子および種間ホモログをス
クリーニングするために、使用される。そのような変異は、疾患状態と関連し得
る。一旦改変体が同定されると、診断アッセイが、疾患状態に関連したそのよう
な変異遺伝子を有する患者を同定するために使用され得る。変異したＫｖ１０遺
伝子の同定は、第一の核酸（例えば、配列番号１−２）、またはＫｖ１０．１を
コードするアミノ酸配列（例えば、配列番号３）、およびその保存的に改変され
たバージョン、または配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４を含むアミノ酸配列
のインプットを受け取ることを含む。その配列は、上記記載のコンピューターシ
ステムに入力される。その第一の核酸またはアミノ酸配列は次いで、その第一の
配列に対して実質的同一性を有する第二の核酸またはアミノ酸配列と比較される
。第二の配列は、上記記載の方法で、コンピューターシステムに入力される。一
旦その第一および第二配列が比較されると、それらの配列間のヌクレオチドまた
はアミノ酸の差異が同定される。そのような配列は、Ｋｖ１０遺伝子（好ましく
は、Ｋｖ１０．１遺伝子、さらに好ましくは、ヒトＫｖ１０．１遺伝子）の対立
遺伝子の差異および疾患状態に関連した変異を示し得る。上記記載の第一および
第二の配列は、コンピューター読み取り可能な物に保存され得る。

【０１７８】 Ｋｖ１０モノマーをコードする核酸は、本発明のＫｖ１０サブファミリーメン
バーおよびＫｖ１０．１ホモログ、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、対立遺伝
子、保存的に改変された改変体、および多型改変体を同定するために、高密度オ
リゴヌクレオチドアレイ技術（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標））を用い
て、使用され得る。同定されているホモログが、既知の疾患に関連している場合
、そのホモログは、生物学的サンプルにおいてその疾患を検出する際、診断の道
具としてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いて使用され得る（例えば、Ｇｕｎ
ｔｈａｎｄら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：
８６９−８７６（１９９８）；Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７
５９（１９９６）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：１１
０−１０６（１９９５）；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．１４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓ．８：４３５−４４８（１９９８）；Ｈａｃｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８６５−３８６６（１９９８）を参照のこと）。

【０１７９】 （ＶＩＩＩ．細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療） 本発明は、インビトロおよびインビボでの細胞のトランスフェクションのため
のＫｖ１０サブファミリーメンバーの核酸を提供する。これらの核酸は、以下に
記載の標的細胞および生物のトランスフェクションのための周知の多数のベクタ
ーのメンバーのいずれかに挿入し得る。核酸は、ベクターと標的細胞との相互作
用を介して、細胞にエキソビボまたはインビボで、トランスフェクトされる。プ
ロモーターの制御下にあるＫｖ１０（例えば、Ｋｖ１０．１）の核酸は、次いで
本発明のＫｖ１０．１モノマーを発現し、それによりＫｖ１０．１遺伝子の不在
、部分的不活化、または異常な発現の影響を和らげる。組成物は、患者の治療応
答を誘導するのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するために適切な
量は、「治療上効果的な用量または量」として定義される。

【０１８０】 そのような遺伝子治療手順は、多数の状況で、後天性および遺伝性の遺伝子欠
損、癌、およびウイルス感染を直すために使用されている。ヒトで人工遺伝子を
発現する能力は、多数の重要なヒト疾患（他の治療法による処置に影響を受けな
い多くの疾患を含む）の予防および／または治療を容易にする（遺伝子治療手順
の概説については、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０
８−８１３（１９９２）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ
１１：２１１−２１７（１９９３）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ９２６−９３２（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１
６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４
６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１
０）：１１４９−１１５４（１９９８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（
１９９５）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａ
ｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ編、１
９９５）；およびＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９
４）を参照のこと）。

【０１８１】 遺伝子または遺伝物質を細胞に送達することは、疾患の遺伝子治療処置におけ
る最初の工程である。大多数の送達法が、当業者に周知である。好ましくは、核
酸は、インビトロまたはエキソビボ遺伝子治療での使用のために、投与される。
非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および送達ビヒク
ル（例えば、リポソーム）と複合体化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系
は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、それはエピソームのゲノムまたは細胞
への送達後の組み込まれるゲノムのどちらかを有する。

【０１８２】 核酸の非ウイルス送達方法については、リポフェクション、マイクロインジェ
クション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、ビロゾーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）
、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸の
ＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増加するＤＮＡの取り込みが挙げられる。
リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４
，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており
、そしてリポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔａｍ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））。ポリヌクレオ
チドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適した、陽イオン性および中
性の脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４，ＷＯ９１／１６０２４の
脂質を含む。送達は、細胞へ（エキソビボ投与）であり得るし、または標的組織
へ（インビボ投与）であり得る。

【０１８３】 脂質：核酸複合体（イムノリピド複合体のような標的化リポソームを含む）の
調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４））；Ｇａｏら、Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，
１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同
第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８
号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９
４６，７８７号を参照のこと）。

【０１８４】 核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイル
スを身体中の特定の細胞に標的化するため、およびウイルス搭載物を核に輸送す
るための、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直
接投与され得るか（インビボ）、またはそれらは、インビトロで細胞を処置する
ために使用され得、そしてその改変された細胞は、患者に投与される（エキソビ
ボ）。核酸の送達のための慣例的なウイルスに基づいた系としては、遺伝子移入
のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベ
クター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが
挙げられ得る。ウイルスベクターは、標的細胞および標的組織における遺伝子移
入の、現在最も効率が良くかつ汎用性のある方法である。宿主ゲノムでの組み込
みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移
入方法を用いて、可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期にわたる
発現を生じる。さらに、高い形質導入効率が、多数の異なった細胞型および標的
組織で観察されている。

【０１８５】 レトロウイルスの親和性は、外来のエンベロープタンパク質を取り込むことに
よって、改変され得、これにより標的細胞の潜在的な標的集団が増加される。レ
ンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、またはそれに感染し、
そして代表的には高いウイルス力価を生成することのできる、レトロウイルスベ
クターである。従って、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は標的組織に依存す
る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング
能力を有する、シス作用性の長い末端反復から構成される。最小限のシス作用性
ＬＴＲは、このベクターの複製およびパッケージングに十分であり、そのベクタ
ーは次いで、永続性の導入遺伝子発現を提供するために、標的細胞に治療遺伝子
を組み込むために使用される。幅広く使用されるレトロウイルスベクターとして
は、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ
）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およ
びその組み合わせに基づくベクターが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅ
ｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７
００を参照のこと）。

【０１８６】 核酸の一過的な発現が好まれる適用では、アデノウイルスに基づいた系が、代
表的に使用される。アデノウイルスに基づいたベクターは、多数の細胞型におい
て、非常に高い形質導入効率を可能とし、そして細胞分裂を必要としない。その
ようなベクターを用いて、高い力価および高い発現効率が得られている。このベ
クターは、比較的単純な系において、大量に生成し得る。アデノ随伴ウイルス（
「ＡＡＶ」）ベクターもまた、標的核酸で細胞を形質導入するために使用される
（例えば、インビトロでの核酸およびペプチドの生成において、ならびにインビ
ボおよびエキソビボの遺伝子治療手順のために（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号
；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍｅｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと））。組換えＡＡＶベクター
の構築は、多数の刊行物に記載されており、そのような刊行物としては、米国特
許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔお
よびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）が挙げられる。

【０１８７】 特に、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、臨床試験における遺
伝子移入に現在利用でき、レトロウイルスが、断然頻度が高く使用される系であ
る。これらウイルスベクターの全ては、形質導入剤を生成するために、ヘルパー
細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を含むアプローチを利用す
る。

【０１８８】 ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベ
クターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１
９９５）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；
Ｍａｌｅｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：
２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺
伝子治療試験で使用される最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効
率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターで観察された（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒ
ａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７））。

【０１８９】 組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性の
パルボウイルスである２型アデノ随伴ウイルスに基づいた、有望な別の遺伝子送
達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接する、ＡＡＶの
１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細
胞のゲノムへの組み込みに起因する、効率的な遺伝子移入および安定した導入遺
伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅ
ｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。

【０１９０】 複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、主に一過性発現の遺伝子
治療に使用される。なぜなら、このベクターは、高い力価で生成され得、そして
それらは、多数の異なった細胞型に簡単に感染するからである。多くのアデノウ
イルスベクターは、導入遺伝子が、Ａｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、およびＥ３遺伝子を
置換するように操作される；続いての複製欠損ベクターは、欠損遺伝子機能をト
ランスで提供するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターは、インビボで
、複数の型の組織（分裂中でない分化した細胞（例えば、肝臓、腎臓および筋肉
系組織で発見されるような細胞）を含む）を形質導入し得る。慣例的なＡｄベク
ターは、大規模な運搬能力を有する。臨床試験でのＡｄベクターの使用例は、筋
内注射を用いた抗腫瘍性免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Ｓｔｅｒ
ｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨
床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターのさらなる使用例と
しては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４１：５−１０（１
９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３
−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２
０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５
：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７
−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：
１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

【０１９１】 多数の遺伝子治療適用では、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型に高度の特
異性を有して送達され得ることが所望される。ウイルスベクターは、ウイルス外
表面上でのウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現
することによって、所定の細胞型に特異性を有するように代表的に改変される。
そのリガンドは、目的の細胞型に存在することが既知であるレセプターに親和性
を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマ
ウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌ
ｉｎ）を発現するように改変され得、そしてその組換えウイルスが、ヒト表皮増
殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。こ
の原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスとレセプターを発現する
標的細胞との他の組み合わせに広げられ得る。例えば、糸状ファージは、事実上
任意の選択された細胞レセプターに対する特異的な結合親和性を有する抗体フラ
グメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の
記載は、おもにウイルスベクターに適用されるが、同じ原理が、非ウイルスベク
ターに適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを
支持すると考えられる特定の取り込み配列を含むように操作され得る。

【０１９２】 遺伝子治療ベクターは、インビトロで、個々の患者に投与することによって送
達され得る（代表的には、全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、筋内注
入、皮下注入、または頭蓋内注入）または以下に記載されるような局所適用によ
って）。あるいは、ベクターは、エキソビボで細胞（例えば、個々の患者から移
植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）または普遍的なドナ
ー造血幹細胞）に送達され得、通常そのベクターを取り込んだ細胞の選択の後に
、患者への細胞の再移植が行なわれる。

【０１９３】 診断、研究、または遺伝子治療のためのエキソビボの細胞トランスフェクショ
ン（例えば、形質導入細胞の宿主生物への再注入を介して）は、当業者に周知で
ある。好ましい実施形態では、細胞は被験体生物より単離され、核酸（遺伝子ま
たはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、そして被験体生物（例えば、患者）へ
再注入される。エキソビボのトランスフェクションに適した、種々の細胞型は、
当業者に周知である（患者からの細胞の単離および培養方法の考察については、
例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ
ｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第三版、１９
９４年）およびそこに引用される参考文献を参照のこと。

【０１９４】 治療核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソ
ームなど）はまた、インビボで、細胞の形質導入のために生物に直接投与され得
る。あるいは、裸の核酸が投与され得る。投与は、最終的に血液または組織細胞
と接触するように、分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによっ
て行なわれる。そのような核酸を投与する適切な方法は、当業者に利用可能であ
りかつ周知であり、そして、１つより多くの経路が、特定の組成物を投与するの
に使用され得るが、特定の経路はしばしば、別の経路よりも、より即時性および
より効果的な反応を提供し得る。

【０１９５】 投与は、最終的に血液または組織細胞と接触するように、分子を導入するため
に通常使用される経路のいずれかによって行なわれる。核酸は、任意の適切な方
法によって投与され、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアとともに投与さ
れる。そのような核酸を投与する適切な方法は当業者に利用可能でありかつ周知
であって、そして１つより多くの経路が、特定の組成物を投与するのに使用され
得るが、特定の経路はしばしば、別の経路よりもより即時性のおよびより効果的
な反応を提供し得る。

【０１９６】 （ＩＸ．薬学的組成物および投与） 薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物（例えば、核酸、タ
ンパク質、調節性化合物またはトランスフェクション細胞）によって、およびそ
の組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される
。従って、本発明の薬学的組成物の広範な適切な処方がある（例えば、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版
、１９８９年を参照のこと）。投与は、任意の便利な様式で（例えば、注射、経
口投与、吸入、経皮性適用、または直腸投与によって）、行なわれ得る。

【０１９７】 経口投与に適した処方物は、（ａ）液状溶液（例えば、希釈液（例えば、水、
生理食塩水またはＰＥＧ４００）中に懸濁された有効量のパッケージ化された核
酸）；（ｂ）カプセル、小袋または錠剤（それぞれが、活性成分（液体、固体、
顆粒またはゼラチンとして）予定量を含む）；（ｃ）適切な液体中での懸濁液；
および（ｄ）適切なエマルジョンからなり得る。錠剤形態は、ラクトース、スク
ロース、マニトール、ソルビトール、カルシウムホスフェート、コーンスターチ
、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状ニ酸化ケイ素、
タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色料
、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿剤、防腐剤、香味料、染料、崩壊剤、お
よび薬学的に適合性のキャリアの１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香味料
中（例えば、スクロース）の活性成分、および活性成分に加えて、当該分野で公
知のキャリアを含む不活性なベース（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたは
スクロースおよびアカシアエマルジョン、ゲルなど）中に活性成分を含む芳香製
剤を含み得る。

【０１９８】 えり抜きの化合物を、単独または他の適切な成分と組み合わせて、吸引を介し
て投与されるエアロゾル処方（すなわち、それらは「噴霧され」得る）を作製し
得る。エアロゾル処方は、加圧された受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフ
ルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。

【０１９９】 例えば、関節内（関節中の）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下経路
などによる、非経口投与に適した処方物は、水性および非水性、等張性滅菌注入
溶液（それは、酸化防止剤を含み得る）、緩衝液、静菌剤、およびその処方物を
、意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、および懸濁剤、溶解剤、濃
厚剤、安定剤、そして保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。
本発明を実施する際に、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局
所的に、腹腔内的に、膀胱内にまたはクモ膜下腔内に、投与され得る。非経口投
与および静脈内投与は、投与の好ましい方法である。推奨される処方物は、単回
用量または複数用量の封印された容器（例えば、アンプルおよびバイアル）で提
供され得る。

【０２００】 注入溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠
剤から調製され得る。エクソビボ治療のための核酸によってトランスフェクショ
ンされた細胞はまた、上記記載のように、静脈内または非経口投与され得る。

【０２０１】 本発明の文脈において、患者に投与される用量は、ある期間にわたって患者に
おける有益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、用いられ
る特定のベクターの効率および患者の状態、ならびに処置される患者の体重また
は表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定のベクターの投与に伴
う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度、または特定の患者のトランス
フェクションされた細胞型によって決定される。

【０２０２】 Ｋｖ１０サブユニットを含むＫｖチャネルの減少したまたは異常な発現による
状態の処置または予防において、投与されるベクターの有効量を決定する際、医
師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクター毒性、疾患の進行、および抗ベクタ
ー抗体の生産を評価する。概して、ベクター由来の裸の核酸に等価な用量は、代
表的な７０ｋｇの患者に対して約１μｇ〜１００μｇであり、レトロウイルス粒
子を含むベクターの用量が、治療核酸の等価量を産生するために計算される。

【０２０３】 投与のために、本発明の化合物およびトランスフェクション細胞が、患者の体
重および全体としての健康状態に適合するように、インヒビター、ベクター、ま
たはトランスフェクション細胞型のＬＤ−５０、および種々の濃度でのインヒビ
ター、ベクターまたは細胞型の副作用によって決定された割合で、投与され得る
。投与は、単回用量または分割された用量を介してなされ得る。

【０２０４】 （Ｘ．キット） ヒトＫｖ１０サブファミリーのメンバー（例えば、Ｋｖ１０．１）およびその
ホモログは、カリウムチャネルの発現および調節を調べるのに有用な道具である
。ｈＫｖ１０核酸に特異的にハイブリダイズするヒトＫｖ１０特異的試薬（例え
ば、ｈＫｖ１０プローブおよびプライマー）およびｈＫｖ１０タンパク質に特異
的に結合するｈＫｖ１０特異的試薬（例えば、ｈＫｖ１０抗体）が、発現および
調節を調べるために使用される。

【０２０５】 サンプル中のｈＫｖ１０ＤＮＡおよびＲＮＡの存在についての核酸アッセイは
、当業者に公知の多数の技術（例えば、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロ
ット、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１分析、ＰＣＲおよびＬＣＲのような増幅技術、およ
びインサイチュハイブリダイゼーション）を含む。例えば、インサイチュハイブ
リダイゼーションでは、標的核酸は、引き続いての解釈および分析のために細胞
形態を保持しながら、細胞内でのハイブリダイゼーションに利用できるように、
細胞環境から遊離される。以下の論文は、インサイチュハイブリダイゼーション
の分野概要を提供する：Ｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２
３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，第８巻、１８９−２２６頁（１９８４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ（Ｈａｍｅｓら編、１９８７）。さらに、ｈＫｖ１０タンパク質は、上記記載
の種々のイムノアッセイ技術で検出され得る。試験サンプルは、代表的には、ポ
ジティブコントロール（例えば、組み換えＫｖ１０モノマーを発現するサンプル
）およびネガティブコントロールの両方と比較される。

【０２０６】 本発明はまた、本発明のカリウムチャネルのモジュレーターをスクリーニング
するためのキットを提供する。そのようなキットは、簡単に入手できる物質およ
び試薬より調製され得る。例えば、そのようなキットは、任意の１つ以上の以下
の物質を含み得る：Ｋｖ１０モノマー、反応チューブ、およびＫｖ１０を含むカ
リウムチャネルの活性を試験するための使用説明書。広範な種々のキットおよび
成分は、キットの意図される使用者および使用者の特定の必要性に依存して本発
明に従って、調製され得る。例えば、キットは、Ｋｖ１０モノマーを含むカリウ
ムチャネルの活性を測定するインビトロまたはインビボアッセイに合わせて作ら
れ得る。

【０２０７】 それぞれの個々の刊行物または特許出願は、具体的および個々に、参考として
取り入れられることが意図されるがのごとく、本明細書中に引用されたすべての
刊行物および特許出願は、本明細書中に参考として引用される。

【０２０８】 前述の発明は、理解を明確にする目的のために、説明および例示によって、い
くらか詳細に記述されるが、本発明の教示を考慮して、添付した特許請求の範囲
の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対してある変化および改変が
なされ得ることは、当業者に直ちに明らかである。

【０２０９】 （実施例） 以下の実施例は、説明のためにのみ提供され、限定のために提供されるもので
はない。当業者は、本質的に同様の結果を生じるために変化され得または改変さ
れ得る種々の重要でないパラメーターを容易に認識する。

【０２１０】 （実施例１：Ｋｖ１０．１のクローニング） Ｋｖ１０．１の約９５０ｂｐのフラグメントを、Ｋｖ１０ファミリーのカリウ
ムチャネルに類似したヒトゲノム部分配列に基づいたオリゴを使用して、ヒト脳
ｃＤＮＡより増幅した（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＣ０１９２２２．１）。使用
されたセンスオリゴは、

【０２１１】

【化４】 であり、そして使用されたアンチセンスオリゴは、５’−ＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧ
ＡＡＧＣＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧ（オリゴ２；配列番号５）であった。（１）の太
字型のヌクレオチドのみが、Ｋｖ１０．１ゲノム配列に一致する；２つの付加ヌ
クレオチドが、メチオニンコドン（ＡＴＧ）の上流のＫｏｚａｋ配列を完成する
ために加えられた。このことは、このＡＴＧコドンが、開始コドンとなる場合、
発現ベクターの構築を早める。２つのヌクレオチドは、Ｋｖ１０．１を増幅する
のには必要でない。

【０２１２】 Ｋｖ１０読み枠の５’末端は、２回のネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）５’ＲＡＣＥ
ＰＣＲを使用して、確かめられた。ヒト脳ｃＤＮＡは、遺伝子特異的なアンチ
センスオリゴ５’−ＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＧＡＡＡ（オリゴ
３；配列番号６）を使用して、標準的なＲＡＣＥ ＰＣＲ技術によって増幅され
た。この反応のアリコートは次いで、ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）遺伝子特異的ア
ンチセンスオリゴ５’−ＣＧＧＣＣＧＧＧＴＣＧＣＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴ（
オリゴ４；配列番号７）を使用して増幅され、約６００ｂｐのフラグメントを得
た。このフラグメントは、上記同定された９５０ｂｐフラグメントと重複し、そ
してＫｖ１０．１の開始コドンは、９５０ｂｐフラグメントの最も５’側のＡＴ
Ｇであることが決定された。停止コドンは、このメチオニンコドンの上流の全て
の読み枠で生じる。

【０２１３】 Ｋｖ１０．１の３’末端は、２工程で得られた。第一に、標準的な３’ＲＡＣ
Ｅ ＰＣＲの２回のネスト化が、約１．５ｋｂのフラグメントを得るために使用
された。このフラグメントを得るために使用された遺伝子特異的センスオリゴは
、最初のラウンドで上記のオリゴ（１）であり、そして第二ラウンドのネスト化
オリゴ５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧ
ＣＡ（オリゴ５；配列番号８）であった。このフラグメントは、上記のクローニ
ングされた９５０ｂｐのフラグメントと重複していた。そしてＫｖ１０．１のコ
ード配列を約５００ｂｐ伸長した。まとめると、それらは、開始メチオニンから
Ｋｖカリウムチャネルの保存された細孔ドメインの５’末端側に伸びる、連続す
るＫｖ１０．１の読み枠を生じる。しかし、この保存配列の３’末端は発見され
ておらず、そして可能性のあるイントロン／エクソンの境界は、他の既知のＫｖ
ファミリーチャネルとは異なる配列の地点に存在した。従って、試行された新し
い３’ＲＡＣＥ反応は、この領域の近くに位置する新しい遺伝子特異的センスオ
リゴを使用して行なわれた（５’−ＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＣ
ＡＣＧＡＴ（オリゴ６；配列番号９））。この技術を使用して、約７５０ｂｐフ
ラグメントを、ヒト網膜ｃＤＮＡから増幅した。このフラグメント（Ｋｖ１０．
１フラグメントの元の９５０ｂｐと重複する）の配列分析は、全体のＫｖ細孔配
列（ＫｖチャネルのＳ６ドメインに相同な領域）および終止コドンを示した。こ
のフラグメントは、元の９５０ｂｐフラグメントおよび５’ＲＡＣＥフラグメン
トと重複し、Ｋｖ１０．１の完全なコード配列を得た。

【０２１４】 Ｋｖ１０．１の全コード領域を、オリゴ（１）およびＫｖ１０．１の３’非翻
訳配列に基づくアンチセンスオリゴ５’−ＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡ
ＧＴＡＣＴＴＴＧＴＧ（オリゴ７；配列番号１０）を使用して、ヒト網膜ｃＤＮ
Ａから増幅した。コード領域のみを増幅するために、（７）を、５’−ＡＴＴＣ
ＴＣＴＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧ（オリゴ８；配列番号１１）と交換
し得る。ヒト網膜由来の第一鎖のｃＤＮＡは、Ｋｖ１０．１の増幅のための好ま
しい鋳型であるが、ヒト脳由来の第一鎖のｃＤＮＡも同様に適している。これら
のオリゴを用いて、Ｋｖ１０．１のコード領域を増幅するのに使用された条件は
：９５℃で１５秒間、７０〜５８℃で１５秒間（連続した各サイクルで、０．５
℃ずつ温度を下げた）、７２℃で２分間を２４サイクル行なった後に、９５℃で
１５分間、５８℃で１５秒間、および７２℃で２分間を２０サイクル行なった。
約１．８ｋｂのバンドが単離され、そして配列分析によって、Ｋｖ１０．１の全
コード領域を含むことが示された。

【０２１５】 上記列挙された番号の付いたオリゴヌクレオチドを、上記記載の条件を使用し
て、適切な鋳型よりＫｖ１０．１ｃＤＮＡ断片を増幅するために、種々の組み合
わせで、使用され得る。１は、全コード配列（約１．６５ｋｂ）を増幅するため
に、８とともに使用され得、コード配列およびいくらかの３’非翻訳配列（約１
．８ｋｂ）を増幅するために、７とともに使用され得、開始メチオニンからＳ１
ドメイン（約９５０ｂｐ）増幅するために、２とともに使用され得、そしてコー
ド配列の５’側から約３５０ｂｐを増幅するために、４とともに使用される。オ
リゴ５は、約６０ｂｐ短いバンドを生じる上記の反応のいずれにおいても、オリ
ゴ１の代わりとなり得る。オリゴ６は、約４５０ｂｐおよび３００ｂｐのフラグ
メントを生成するために、それぞれ７および８とともに使用され得る。これらの
増幅のうち少なくとも１つを、ある遺伝子より得ることができ、そしてフラグメ
ントの配列が実質的にＫｖ１０．１の配列と同一であるならば、その配列は、Ｋ
ｖ１０．１の１種と考えられる。

【０２１６】 ヒトＫｖ２．１およびＫｖ２．２のアミノ酸配列に対するＫｖ１０．１のアミ
ノ酸配列のアライメントで、２つの既知の遺伝子は、最もＫｖ１０．１に相同で
ある。Ｋｖ１０．１は、Ｋｖ２．１およびＫｖ２．２に対して４０％未満の同一
性を示す。対照的に、Ｋｖ２．１およびＫｖ２．２は６０％を越えるアミノ酸同
一性を共有する。従って、Ｋｖ１０．１は、Ｋｖカリウムチャネル遺伝子の新規
のＫｖサブファミリーのメンバーを示さないが、Ｋｖカリウムチャネルの新規な
ファミリーを初めて示す。これは、１０番目に同定されたＫｖサブファミリーで
あるので、この遺伝子はＫｖ１０．１と名づけられ、そしてサブファミリーは、
Ｋｖ１０と名づけられる。図１のアライメントはまた、Ｋｖ１０．１種を定義す
るのに使用され得る最も良好な領域を示す。Ｋｖ２．１チャネルとの実質上の保
存は、１０２アミノ酸より始まる（Ｋｖカリウムチャネルの４量体化ドメイン（
Ｔ１）の始まり）。保存は、これらのＫｖチャネルの細胞質領域のＣ末端の５１
４アミノ酸の近くで終了する。この領域内で、Ｋｖ１０．１は、Ｋｖ２．１およ
びＫｖ２．２に対して、約４０％のアミノ酸同一性を共有する。同じＫｖサブフ
ァミリーのメンバーは、代表的に、この領域内で、より高い相同性を共有する。
例えば、Ｋｖ２．１およびＫｖ２．２は、同じ領域上で、９０％を越えて同一で
ある。この領域で、Ｋｖ１０．１に対して６０％より大きなアミノ酸同一性を共
有するタンパク質は、カリウムチャネルのＫｖ１０サブファミリーのメンバーで
ある。

【０２１７】 Ｋｖカリウムチャネルは、大多数の生理学的プロセス（例えば、ニューロン、
心筋細胞および他の興奮性の細胞の電気的特性への寄与、細胞増殖の調節、分泌
の制御、ならびに静止電位への寄与）に関連することが公知である。Ｋｖチャネ
ルは、４量体タンパク質であり、そしてほとんどのＫｖチャネルタンパク質は、
機能的なホモ４量体チャネル（全ての４つのサブユニットは同一である）を形成
し得る。しかし、Ｋｖカリウムチャネルの特定のサブクラス（Ｋｖ５、Ｋｖ６、
Ｋｖ８およびＫｖ９サブファミリーのメンバー）は、ホモ４量体として、電気的
に沈黙している。それらは、Ｋｖ２サブファミリー（Ｋｖ２．１およびＫｖ２．
２）のメンバーとヘテロ４量体を形成するときのみ、機能的チャネルを形成する
。これらのチャネルは、Ｓ６膜貫通領域の他のＫｖチャネルとは、いくつかの明
確な差異を有する。Ｋｖ１０．１は、これらの差異の多くを共有するため（図２
）、Ｋｖ１０．１は、他のＫｖチャネル（例えば、Ｋｖ２．１およびＫｖ２．２
）とヘテロマルチマーを形成することができる電気的に沈黙したＫｖチャネルの
新規のクラスを示すようである。

【０２１８】 （実施例２：アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫｖ１０．１の発現） アフリカツメガエル卵母細胞で発現されるとき、Ｋｖ１０．１は、確かに電気
的に沈黙している。図３（Ａ）は、電圧ゲートのカリウム電流が、Ｋｖ１０．１
ｍＲＮＡを注入した卵母細胞では、全く検出されず、Ｋｖ１０．１は、ホモマ
ルチマーとして、機能的な電圧ゲートカリウムチャネルを形成できないことを示
している。Ｋｖ１０．１ホモマルチマーは機能的であるが、電圧以外の刺激に依
存する可能性が残っている。他の電気的に沈黙したＫｖサブユニットのように、
Ｋｖ１０．１は、Ｋｖ２ファミリーカリウムチャネル遺伝子によって発現される
、チャネルの特性を改変することができる。図３（Ｂ）および３（Ｃ）は、Ｋｖ
２．１とともに発現されるとき、Ｋｖ１０．１がＫｖ２．１電流の強い減少を起
こすことを示す。このことは、Ｋｖ１０．１およびＫｖ２．１サブユニットが、
会合し得るが、生じるヘテロマルチマーは、非機能的であるかまたは電圧のみに
は依存しないことを示唆している。対照的に、図３（Ｄ）、３（Ｅ）および４は
、Ｋｖ１０．１が、Ｋｖ２．２と機能的ヘテロマルチマーを形成することを示し
ている。Ｋｖ１０．１−Ｋｖ２．２ヘテロマルチマーは、電圧ゲートされるが、
Ｋｖ２．２ホモマルチマーよりも、より迅速に活性化および不活性化する。また
、Ｋｖ１０．１−Ｋｖ２．２ヘテロマルチマーの活性化の電圧依存性で、目立っ
た脱分極側への移動が存在する。

【０２１９】 Ｋｖ２ファミリーチャネルは、ほとんどのニューロンで存在し、そこでそれら
は、主要な遅延整流性カリウムチャネルとして機能する（Ｍｕｒａｋｏｓｈｉお
よびＴｒｉｍｍｅｒ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９（５）：１７２８−１７３５
（１９９９）、Ｄｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，８４（１）：３７−４８（１９９８
）；Ｆｉｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６３４１−２６３４（１
９９６））。Ｋｖ２ファミリーチャネルとして、同じニューロン中でのＫｖ１０
．１の発現は、これらのチャネルの機能的役割を変化させる。Ｋｖ１０．１は、
Ｋｖ１０．１およびＫｖ２．１の両方を発現する細胞で、遅延整流性の電流密度
を大幅に減少させ得る。このことは、遅延整流がそのようなニューロンの電気特
性の制御に寄与するのを制限する。活性化の電圧依存における脱分極側への移動
および再分極の際の迅速な不活性化のために、ニューロンにおけるＫｖ１０．１
およびＫｖ２．２の同時発現は、過分極電圧での、遅延整流の寄与を制限する（
図４（Ｂ））。しかし、Ｋｖ１０．１−２．２ヘテロマルチマーの迅速な活性の
ために、脱分極電圧での電気活性を決定することへの遅延整流の寄与が、増加さ
れ得る。

【０２２０】 （実施例３．Ｋｖ１０．１遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析） ｃＤＮＡは、標準的なオリゴｄＴプライミング技術を使用して、ヒト総ＲＮＡ
サンプルまたはヒトｍＲＮＡサンプルのどちらかから調製された。次にそれぞれ
のｃＤＮＡの５０分の１を、Ｋｖ１０．１特異的プライマー５’−ＴＧＧＧＣＴ
ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴ−３’および５’−ＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＴ
ＣＣＣＴＧＣＧＴＡＴＧＧＴ−３’を使用して、３５サイクル増幅した。それぞ
れのサイクルは、９５℃で２０秒間の変性工程および６３℃で４０秒間のアニー
リング／伸長工程からなる。これらの状況下でのＫｖ１０．１の増幅は、３２０
ｂｐフラグメントの生成を導く。ヒトＲＮＡサンプルでのＫｖ１０．１ ｍＲＮ
Ａの相対的な発現レベルは、このフラグメントの存在および強度を測定すること
によって決定された。

【０２２１】 高レベルのＫｖ１０．１発現が、網膜、精巣および前立腺において発見された
（図５）。より低いレベルでの発現がまた、脊髄および黒質において発見された
。微量レベルの発現が、前頭部皮質および全脳サンプルにおいて検出できた。全
脳サンプルで検出された、低いレベルのＫｖ１０．１は、脊髄、前頭部皮質およ
び黒質において発見されるＫｖ１０．１の発現を反映し得る。それはまた、この
アッセイでは試験されていない、他の脳領域での低いレベルのＫｖ１０．１の発
現を示唆し得る。

【０２２２】 Ｋｖ１０．１は、中枢神経系で発現され、少なくともニューロンの部分集合中
で、Ｋｖ２ファミリーチャネル（例えば、Ｋｖ２．１および２．２）と同時発現
されることを示唆する。さらに、ＲＴ−ＰＣＲは、Ｋｖ１０．１は、ヒト網膜で
高度に発現されることを示す。Ｋｖ２ファミリーチャネル（例えば、Ｋｖ２．１
および２．２）はまた、網膜で発現されるので、Ｋｖ１０．１−Ｋｖ２へテロマ
ルチマーは、視覚系ニューロンにも存在するようである。ニューロンの電気活性
を制御するための遅延整流電流の重要性のために、Ｋｖ１０．１サブユニットを
含むカリウムチャネルのモジュレーターは、異常興奮を含む種々のＣＮＳ障害を
処置する際に有用である。

【０２２３】 黒質および前頭部皮質での発現は、パーキンソン病および精神病障害（例えば
、精神分裂病およびうつ病）の処置におけるＫｖ１０．１モジュレーターの潜在
的な役割を示唆する。脊髄におけるＫｖ１０．１の発現は、Ｋｖ１０．１モジュ
レーターが、てんかんおよび他のてんかん発作障害、偏頭痛および認知障害を含
む処置に使用され得ることを示す。これらのモジュレーターはまた、神経保護（
ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）にとっても有用である。網膜における高レベ
ルのＫｖ１０．１の発現は、Ｋｖ１０．１が網膜の興奮性において特に重要な役
割を果していることを示す。従って、Ｋｖ１０．１のモジュレーターは網膜の異
常な電気シグナル伝達を含む種々の視覚障害を処置するために有用である。

【０２２４】 前立腺におけるＫｖ１０．１の発現は、前立腺過形成を処置する際の役割を示
唆する。Ｋｖ１０．１モジュレーターは、前立腺平滑筋を緩めること、そして前
立腺過形成によって引き起こされる閉塞を和らげるのを助けることを可能とし得
る。Ｋｖ１０．１モジュレーターはまた、この状況において細胞増殖を減少させ
るのに有用であり得る。精巣におけるＫｖ１０．１の高い発現は、Ｋｖ１０．１
モジュレーターが精母細胞の成熟化および運動性を制御するのに有用であること
を示唆する。そのようなモジュレーターは、男性不妊の特定の症例の処置におい
て、および避妊薬として有用である。

【０２２５】 （配列表） （配列番号１−ヒトＫｖ１０．１ヌクレオチド配列）

【０２２６】

【化５】 （配列番号２−ヒトＫｖ１０．１ヌクレオチドコード配列）

【０２２７】

【化６】 （配列番号３−ヒトＫｖ１０．１アミノ酸配列）

【０２２８】

【化７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、Ｋｖ１０．１のＫｖ２．１およびＫｖ２．２とのアミノ酸アラインメ
ントを提供する。同一のアミノ酸に影を付し、そしてアミノ酸位置を左側の余白
に示した。アラインメント中のギャップを、−（ダッシュ）で示す。

【図２】 図２は、Ｋｖ１０．１、Ｋｖ６．１およびＫｖ２．１のＳ６ドメインのアミノ
酸アラインメントを提供する。矢印は、ホモマルチマーとしての機能的なチャネ
ルを形成する正常なＫｖチャネルポリペプチドと、ヘテロマルチマーとしての機
能的なチャネルを形成する電気的にサイレントなＫｖチャネルポリペプチドとの
間において代表的に異なる２つの残基を示す。これらの残基は、ホモテトラマー
として発現するＫｖサブユニットにおいて常に、それぞれグリシン（Ｇ）および
プロリン（Ｐ）である。Ｋｖ１０．１は、電気的にサイレントなサブユニットＫ
ｖ６．１とほぼ同様に、これらの残基において異なる。

【図３】 Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるＫｖ１０．１の発現。全てのウインドウは、
電圧クランプ下で記録した電流のファミリーを示す。使用された保持電位（ｈｏ
ｌｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、−９０ｍＶであり、−６０ｍＶから＋２
０ｍＶのステップを２０ｍＶの増分で示す。テール電流を、（Ａ）〜（Ｃ）にお
いて−６０ｍＶで測定し、そして（Ｄ）〜（Ｅ）において−４０ｍＶで測定した
。（Ａ）において、ステップは、１．５ｓのテールステップで３．５ｓの持続時
間であった。（Ｂ）において、ステップは、２５０ｍｓのテールステップで５０
０ｍｓの持続時間であった。（Ｃ）〜（Ｅ）について、ステップは、１５００ｍ
ｓの持続時間であり、テールステップは、５００ｍｓであった。（Ａ）Ｋｖ１０
．１遺伝子をコードするｍＲＮＡを注射した卵母細胞から電流を記録した。有意
な電流は存在しなかった。これは、Ｋｖ１０．１が、ホモマルチマーとして機能
的な電圧ゲートチャネルを形成しないことを示唆する。（Ｂ）Ｋｖ１０．１とＫ
ｖ２．１との両方からのｍＲＮＡを注射した卵母細胞からの電流を記録した。パ
ネル（Ｃ）に示される特徴的なＫｖ２．１電流は、存在しない。これは、Ｋｖ１
０．１モノマーがＫｖ２．１モノマーと同時構成され得ることを示す。過剰のＫ
ｖ１０．１を、ホモマルチマーＫｖ２．１チャネルを排除するために注射した。
（Ｃ）電流は、（Ｂ）において使用されたＫｖ２．１ｍＲＮＡの量の１／１０を
注射した卵母細胞から記録された。大きな電圧依存的外向カリウム電流は、より
低いｍＲＮＡ濃度にも関わらず脱重合の際に観察される。（Ｄ）電流は、Ｋｖ１
０．１とＫｖ２．２ｍＲＮＡの両方を注射された卵母細胞から記録された。過剰
のＫｖ１０．１ｍＲＮＡを使用して、Ｋｖ２．２ホモダイマーを排除した。（Ｅ
）ホモマルチマーＫｖ２．２電流は、Ｋｖ２．２ｍＲＮＡのみを注射した卵母細
胞から記録した。（Ｄ）と（Ｅ）との間における失活速度における劇的な差異（
矢印）に注意のこと。その他の機能的特性におけるこ（れら）の差異（図４を参
照のこと）は、（Ｄ）において観察された電流が、ホモマルチマーＫｖ２．２電
流ではなく、そのかわり、Ｋｖ１０．１〜Ｋｖ２．２ヘテロマルチマーチャネル
によって生成されることを示す。

【図４】 （Ａ）Ｋｖ２．２、または、Ｋｖ２．２およびＫｖ１０．１両方を発現する卵
母細胞についてのコンダクタンス対電圧の関係。エラーバーは、標準誤差を示し
、そして滑らかな曲線は、データのボルツマンフィットを表し、このデータから
、以下に示されるその電圧依存性パラメータを導く。Ｋｖ１０．１は、曲線の勾
配の減少および劇的な脱分極化シフトの両方を引き起こすことに注意のこと。Ｋ
ｖ２．２についてのＶ₅₀（フルコンダクタンスの１／２が達成される点）は、−
６．９±１．７ｍＶである。対照的に、Ｋｖ２．２−Ｋｖ１０．１電流について
得られたＶ₅₀は、２５ｍＶから＋１９．０±２．０ｍＶにかけてシフトする。（
Ｂ）Ｋｖ２．２ホモマルチマーおよびＫｖ２．２−Ｋｖ１０．１ヘテロマルチマ
ーは、活性化および失活動力学に基づいて区別され得る。活性化および失活時間
定数は、０ｍＶおよび−５０ｍＶそれぞれにおける電流の両方について与えられ
る。エラーバーは、標準誤差を示す。Ｋｖ１０．１は、失活の速度における劇的
な増加を引き起こし、そしてまた、活性化の速度におけるほぼ２倍の増加を引き
起こす。

【図５】 選択されたヒト組織におけるＫｖ１０．１のｍＲＮＡ発現。Ｋｖ１０．１発現
は、実施例３に記載されるようにＲＴ−ＰＣＲを使用してアッセイされた。陽性
発現は、＋の符号で示され（＋＋＋＝非常に高い、＋＋＝高い、＋＝中程度、ｔ
ｒ＝微量、低い）、そして発現なしは、−（ダッシュ）で示される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 15/18 Ａ６１Ｐ 25/00 25/00 25/06 25/06 25/16 25/16 25/18 25/18 25/24 25/24 25/28 25/28 27/02 27/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA31 BA80 CA04 CA09 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ41 QR32 QR38 QR55 QR69 QR80 QR82 QS12 QS25 QS34 QS39 QX01 QX04 4B065 AA01X AA57X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 CA60 4C084 AA17 NA14 ZA012 ZA022 ZA062 ZA122 ZA152 ZA182 ZA212 ZA332 ZA812 ZA862 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA86 EA50 FA74

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｋｖ１０カリウムチャネルのαサブユニットを含むポリペプ
   チドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドは、以下： （ｉ）少なくとも１つのさらなるＫｖαサブユニットで、電圧ゲーティングの
   特徴を有するＫｖカリウムチャネルを形成し；そして （ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して少なくとも６０％のア
   ミノ酸配列同一性を有する部分配列を含む、単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドは、配列番号３に対して産生された抗体に
   特異的に結合する、請求項１に記載の核酸。
3. 【請求項３】 前記ポリペプチドは、ヒト電圧ゲートカリウムチャネルをコ
   ードする、請求項１に記載の核酸。
4. 【請求項４】 前記核酸は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする、請求
   項１に記載の核酸。
5. 【請求項５】 前記核酸は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配
   列を含む、請求項１に記載の核酸。
6. 【請求項６】 前記核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
   件下で、以下： 【化１】 からなる群より選択されるプライマーと同じ配列に選択的にハイブリダイズする
   プライマーによって増幅される、請求項１に記載の核酸。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の核酸であって、該核酸によってコードされ
   る前記ポリペプチドは、へテロマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、
   核酸。
8. 【請求項８】 前記核酸は、中程度のストリンジェントなハイブリダイゼー
   ション条件下で、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列に選択的にハ
   イブリダイズする、請求項１に記載の核酸。
9. 【請求項９】 Ｋｖ１０ポリペプチドをコードする単離された核酸であって
   、該核酸は、ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号２のヌクレ
   オチド配列に特異的にハイブリダイズする、核酸。
10. 【請求項１０】 ストリンジェントな条件下で配列番号３のアミノ酸配列を
    コードする核酸に特異的にハイブリダイズする、単離された核酸。
11. 【請求項１１】 核酸を検出する方法であって、該方法は、該核酸を請求項
    １に記載の単離された核酸と接触させる工程を包含する、方法。
12. 【請求項１２】 Ｋｖ１０カリウムチャネルのαサブユニットを含む単離さ
    れたポリペプチドであって、該ポリペプチドは： （ｉ）少なくとも１つのさらなるＫｖαサブユニットで、電圧ゲーティングの
    特徴を有するＫｖカリウムチャネルを形成し；そして （ｉｉ）配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して少なくとも６０％のア
    ミノ酸配列同一性を有する部分配列を含む、ポリペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号３に対して産生された抗体に特異的に結合する、
    請求項１２に記載のポリペプチド。
14. 【請求項１４】 約５８ｋＤと約６８ｋＤとの間の分子量を有する、請求項
    １２に記載のポリペプチド。
15. 【請求項１５】 ヒトＫｖ１０．１のアミノ酸配列を有する、請求項１２に
    記載のポリペプチド。
16. 【請求項１６】 配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の
    ポリペプチド。
17. 【請求項１７】 ホモマーカリウムチャネルのαサブユニットを含む、請求
    項１２に記載のポリペプチド。
18. 【請求項１８】 請求項１２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記
    核酸によってコードされる該ポリペプチドは、へテロマーカリウムチャネルのα
    サブユニットを含む、ポリペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項１２に記載のＫｖポリペプチドに特異的に結合する
    、抗体。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の抗体であって、該抗体が結合する前記
    ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、抗体。
21. 【請求項２１】 請求項１に記載の核酸を含有する、発現ベクター。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載のベクターでトランスフェクトされた、
    宿主細胞。
23. 【請求項２３】 カリウムチャネルを通過するイオンフラックスを増加また
    は減少させる化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程： （ｉ）該化合物をＫｖ１０ポリペプチドと接触させる工程であって、該ポリペ
    プチドは、 （ａ）少なくとも１つのさらなるＫｖαサブユニットで、電圧ゲーティング
    の特徴を有するＫｖカリウムチャネルを形成し；そして （ｂ）配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に対して少なくとも６０％のア
    ミノ酸配列同一性を有する部分配列を含み；および （ｉｉ）該カリウムチャネルに対する該化合物の機能的効果を決定する工程、
    を包含する方法。
24. 【請求項２４】 前記機能的効果が物理的効果である、請求項２３に記載の
    方法。
25. 【請求項２５】 前記機能的効果が化学的効果である、請求項２３に記載の
    方法。
26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドが真核生物宿主細胞または細胞膜におい
    て発現される、請求項２３に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記機能的効果は、イオンフラックス、イオン濃度の変化
    、電流の変化または電圧の変化を測定することによって決定される、請求項２６
    に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記機能的効果は、前記チャネルに結合するリガンドを測
    定することによって決定される、請求項２３に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記ポリペプチドがリコンビナントである、請求項２３に
    記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記カリウムチャネルがへテロマーである、請求項２３に
    記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記ポリペプチドがヒトＫｖ１０．１である、請求項２３
    に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有する、
    請求項２３に記載の方法。
33. 【請求項３３】 Ｋｖ１０ポリペプチドを含むカリウムチャネルを通過する
    イオンフラックスを増加または減少させる化合物を同定するための方法であって
    、該方法は、以下の工程： （ｉ）Ｋｖ１０ポリペプチドの少なくとも２５個のアミノ酸または該Ｋｖ１０
    ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも７５個のヌクレオチドのアミノ酸配
    列を、コンピューターシステムに入力する工程であって、該Ｋｖ１０ポリペプチ
    ドは、配列番号３のアミノ酸１０２〜５１４に少なくとも６０％のアミノ酸配列
    同一性を有する部分配列を含む、工程： （ｉｉ）該アミノ酸配列によってコードされる該ポリペプチドの３次元構造を
    作製する工程； （ｉｉｉ）該Ｋｖ１０ポリペプチドを含む該カリウムチャネルの３次元構造を
    作製する工程； （ｉｖ）該化合物の３次元構造を作製する工程；および （ｖ）該化合物が該ポリペプチドに結合するか否かを決定するために、該ポリ
    ペプチドと該化合物の該３次元構造を比較する工程、 を包含する、方法。
34. 【請求項３４】 被験体における疾患を処置するために、Ｋｖ１０ポリペプ
    チドを含むＫｖカリウムチャネルを通過するイオンフラックスを調節する方法で
    あって、該方法は、請求項２３または３３に記載の方法を用いて同定された治療
    有効量の化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
35. 【請求項３５】 ヒト組織におけるｈＫｖ１０の存在を決定する方法であっ
    て、該方法は、以下の工程： （ｉ）生物学的サンプルを単離する工程； （ｉｉ）該生物学的サンプルを選択的にｈＫｖ１０と結合するｈＫＶ１０特異
    的試薬と接触させる工程；および （ｉｉｉ）該サンプルと選択的に結合するｈＫＶ１０特異的試薬のレベルを決
    定する工程、 を包含する、方法。
36. 【請求項３６】 前記ｈＫｖ１０特異的試薬は、ｈＫｖ１０特異的抗体、ｈ
    Ｋｖ１０特異的オリゴヌクレオチドプライマー、およびｈＫＶ１０核酸プローブ
    からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 コンピューターシステムにおいて、ヒトＫｖ１０．１遺伝
    子の変異についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程： （ｉ）配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を有するＫｖ１０．１
    ポリペプチドをコードする第１核酸配列、およびその保存的に改変されたバージ
    ョンを、該コンピューターに入力する工程； （ｉｉ）該第１核酸配列を該第１核酸配列に対して実質的な同一性を有する第
    ２核酸配列と接触させる工程；および （ｉｉｉ）該第１核酸配列と該第２核酸配列との間のヌクレオチドの差異を同
    定する工程、 を包含する、方法。
38. 【請求項３８】 前記第２の核酸配列が、疾患状態に関連する、請求項３７
    に記載の方法。