ES2278386T3 - Proteina receptora, especifica para el epididimo, y su uso. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN NUEVAS PROTEINAS RECEPTORAS ESPECIFICAS DEL EPIDIDIMO DE MAMIFEROS Y UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE LAS CODIFICA. LA PROTEINA RECEPTORA DE LA INVENCION, COMO PROTEINA TRANSMEMBRANA DEL EPITELIO DEL EPIDIDIMO SE ENCUENTRA ESTRECHAMENTE RELACIONADA CON LA MADURACION DE LOS ESPERMATOZOIDES. POR ESTE MOTIVO ES ADECUADA PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE LA INFERTILIDAD MASCULINA ASI COMO MEDIO ANTICONCEPTIVO. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A ANTICUERPOS FRENTE AL POLIPEPTIDO DE LA INVENCION ASI COMO SU UTILIZACION EN EL DIAGNOSTICO DE LA FERTILIDAD MASCULINA.
Description
Proteína receptora, específica para el
epidídimo, y su uso.
El invento se refiere a una nueva proteína
receptora transmembranal, específica para los epidídimos de
mamíferos, a secuencias de ADN que codifican la proteína, y a
ligandos específicos, así como a su utilización para la preparación
de agentes destinados al diagnóstico de la infertilidad masculina y
a la regulación de la maduración de espermatozoides.
En el momento actual, aproximadamente un 15% de
todas las parejas en la República Federal Alemana (RFA) son
involuntariamente estériles (es decir, no pueden tener niños), y su
proporción está aumentando constantemente. Las causas de la
esterilidad se encuentran a partes iguales en los varones y en las
mujeres. Mientras que, sin embargo, las causas en las mujeres han
sido ampliamente investigadas y son diagnosticables, en los varones
solamente se han comprobado causas orgánicas en aproximadamente un
30% de los casos. Aproximadamente una tercera parte del restante 70%
se puede atribuir a oligospermias de origen desconocido, mientras
que las causas en los casos restantes todavía están confusas, de
acuerdo con el estado actual de los conocimientos. En particular, en
el caso de la infertilidad idiopática, en la que a pesar de haber un
número suficiente de espermatozoides en el eyaculado no se efectúa
ninguna fecundación del óvulo femenino (H.W.G. Backer y
colaboradores (1986) Relative incidence of etiological disorders in
male infertility in: Male Reproductive Dysfunction
[Incidencia relativa de trastornos etiológicos en una infertilidad
de varones. En: Disfunción reproductiva de varones] (coordinadores
de edición R.J. Santen y R.S. Swerdloff), páginas 341 - 372 Marcel
Dekker Inc., Nueva York), se supone que ha tenido lugar un trastorno
de la maduración de espermatozoides en el epidídimo.
En el caso de la maduración de los
espermatozoides, el epidídimo desempeña un cometido clave. Él
consiste en los seres humanos en un único canal con una longitud de
aproximadamente 5 m, que está enrollado a modo de meandros. Los
espermatozoides, todavía inmaduros, que se han formado en el
testículo, son transportados hasta el epidídimo y son sometidos a
un proceso de maduración durante un paso que dura de 2 a 3 días. El
medio especial del epidídimo procura que los espermatozoides allí
encerrados permanezcan vitales durante largo tiempo y además de
esto alcancen las especiales propiedades físicas, inmunológicas, así
como bioquímicas, de los espermatozoides capaces de
fecundación.
Por consiguiente hay que partir del hecho de que
la esterilidad masculina, y en particular la infertilidad
idiopática, se deben en numerosos casos a trastornos de los procesos
de maduración que transcurren en el epidídimo.
Aun cuando la estructura anatómica fina del
epidídimo humano ha sido muy bien descrita en términos
macroscópicos, microscópicos y microscópicos electrónicos
(compárese la cita de A.F. Holstein Morphologische Studien am
Nebenhoden des Menschen, Zwanglose Abhandlungen aus dem Gebiet der
normalen und pathologischen Anatomie [Estudios morfológicos en el
epidídimo de un ser humano, informes sin compromiso procedentes del
sector de la anatomía normal y patológica, 20,
1-91 (1969)), sus productos proteínicos, con pocas
excepciones (compárese por ejemplo la cita de Tezon y
colaboradores, Immunochemical localization of secretory antigens in
the human epididymis and their association with spermatozoa,
Biology of Reproduction [Localización inmunoquímica de antígenos
secretores en el epidídimo humano y su asociación con
espermatozoos, Biología de la Reproducción], 32,
591-597 (1985)), se han investigado poco. Casi
todos los conocimientos adquiridos acerca de este órgano proceden de
trabajos con ratas, ratones, hámsteres, berracos, toros u
ocasionalmente monos, siendo grandes las diferencias específicas
para cada animal, tal como es sabido.
Los conocimientos adquiridos con diferentes
especies de animales acerca de la maduración de los espermatozoides
durante el paso a través del epidídimo, se pueden recopilar de la
siguiente manera (compárese la cita de T.G. Cooper The Epididymis.
Sperm Maturation and Fertilisation [El epidídimo, la maduración y
fertilización de los espermatozoides], editorial Springer, Berlín,
(1986)):
- (a)
- Desarrollo de un movimiento de avance dirigido y capacitación para la hiperactivación de los espermatozoides,
- (b)
- Evitación de una capacitación prematura, es decir la predisposición a llevar a cabo la reacción acrosomal, desempeñando un cometido regulador ciertos factores de descapacitación, en cuyos casos se trata presumiblemente de polipéptidos epididimales.
- (c)
- Modificación de los antígenos superficiales de los espermatozoides, con el fin de favorecer la fijación entre los espermatozoides y el óvulo.
- (d)
- Modificación de la membrana de los espermatozoides, con el fin de hacer posible la fusión con el óvulo.
El suceso metabólico en el epidídimo, que
desencadena estos procesos, está ampliamente sin explicar, incluso
en los casos de los animales investigados. Sin embargo, con ayuda de
unas electroforesis en geles se pudo mostrar que, en el epidídimo,
algunos polipéptidos se agregan al líquido seminal que procede de la
Rete testis (red testicular). Dentro de éstos, están presentes en el
caso de ratas los polipéptidos (a) hasta (e) de Cooper (véase cita
anterior, Tabla 20), en los que se contienen la denominada
glicoproteína epididimal ácida (AEG, de "acidic epididymal
glycoprotein" (Lea y colaboradores, (1978)) y respectivamente los
polipéptidos B hasta E de Brooks y colaboradores (D. E. Brooks y J.
Higgins, Characterization and androgen-dependence of
proteins associated wiht luminal fluid and spermatozoa in the rat
epididymis, Journal of Reproduction and Fertility [Caracterización y
dependencia con respecto de los andrógenos de las proteínas
asociadas con el fluido luminar y los espermatozoos en el epidídimo
de ratas, Revista de Reproducción y Fertilidad], 59,
363-375, (1980)). Los resultados de estos modelos
apuntan a que la formación de estos polipéptidos se encuentra bajo
la acción de andrógenos.
Los conocimientos adquiridos a partir de
experimentos con animales, no se pueden transferir, sin embargo, a
los seres humanos, a causa de la alta especificidad para tejidos y
especies. Por ejemplo, los polipéptidos epididimales esenciales en
los casos de ratas o los ARNm's (ácidos ribonucleicos mensajeros)
que las codifican, no se encuentran en ningún otro tejido y,
dejando aparte a los ratones, en ninguna otra especie (D.E. Brooks
y colaboradores, Europ. J. Biochem., 161,
13-18 (1986); J. Biolog. Chem. 261,
4.956-4.981 (1986)).
A partir del documento de solicitud de patente
europea EP-A-0.440.321 se conocen 5
polipéptidos específicos del epidídimo humano, así como secuencias
de nucleótidos que codifican estos polipéptidos, los cuales se
encuentran en una estrecha relación con la maduración de los
espermatozoides en el epidídimo. Estas secuencias de nucleótidos,
así como los correspondientes productos de expresión, como también
los anticuerpos dirigidos contra ellos, son apropiados para el
diagnóstico y para la utilización en el tratamiento de la
infertilidad masculina.
La misión, que constituye el fundamento del
presente invento, consiste, por lo tanto, en la puesta a disposición
de otros agentes, con cuya ayuda se puedan diagnosticar, y
eventualmente curar terapéuticamente, los trastornos del
metabolismo proteico en el epidídimo de seres humanos -y en
particular la infertilidad masculina-.
Para resolver el problema planteado por esta
misión, se proponen la proteína receptora, específica para el
epidídimo (NSRP de Nebenhoden Spezifische Rezeptor Protein),
conforme al invento, según la SEQ ID NO 2, así como secuencias de
ADN que codifican la NSRP conforme al invento, en particular las que
están de acuerdo con SEQ ID NO 1, y secuencias de ADN derivadas de
ésta, así como, tomando en consideración la degeneración del código
genético, secuencias de ADN que coinciden con estas secuencias de
ADN.
El invento incluye además secuencias homólogas
de aminoácidos y correspondientes secuencias de ADN, con un grado
de homología de por lo menos un 90%. Finalmente, están incluidas
conforme al invento, y son apropiadas en particular como sondas,
unas secuencias de nucleótidos, que se hibridan con las
precedentemente mencionadas en las condiciones seguidamente
definidas.
El aislamiento y la identificación de proteínas
receptoras específicas para el epidídimo, que están participando en
el suministro del medio epididimal arriba descrito, de acuerdo con
procedimientos convencionales, no es posible a causa de las
pequeñas cantidades del tejido que está a disposición.
Dentro del marco del presente invento, se ha
conseguido ahora por primera vez detectar y caracterizar una
proteína receptora transmembranal específica para el epidídimo de
mamíferos, y hacer posible su producción mediante procedimientos
recombinantes o síntesis químicas.
Para la identificación de la proteína receptora
conforme al invento, se organizó en primer lugar una biblioteca de
ADNc (ácido desoxirribonucleico cromosomal) a partir de un ARNm
epididimal en Lambda gt11 (de Clontech, California), seguidamente
los recombinantes específicos para el epidídimo se seleccionaron en
una sucesión de etapas diferenciales de hibridación (compárense las
Figuras 1 y 3 a 5), y a continuación se subclonaron y
caracterizaron en el plásmido bacteriano pBs (de Stratagene,
California, EE.UU.).
El escrutinio diferencial tenía como objetivo
aislar clones de ARNm's, que están presentes en el tejido del
epidídimo, pero no lo están en el tejido de otros órganos distintos
y afines en cuanto a su función. En el caso del procedimiento
empleado conforme al invento sirvió como material comparativo en la
primera etapa un tejido de testículo humano. Puesto que algunas de
las muestras de tejidos, que se utilizaron como material de
partida, procedían de varones orquiectomizados, que habían sido
tratados con diferentes medicamentos, se comprobó en primer lugar
si, y en qué extensión, ejerce influencia la medicación sobre el
respectivo modelo de polipéptido. Sin embargo, en 7 pacientes de
diferentes edades y con diferente medicación se pudo mostrar
(compárense el Ejemplo 2 y las Figuras 2a hasta c), que los modelos
son influidos sólo de una manera insignificante mediante una
precedente administración de medicamentos, y que también son
pequeñas las desviaciones individuales.
Como se representa esquemáticamente en la Figura
1, el escrutinio se efectúo conforme al invento en una etapa
primaria y en otra etapa secundaria, aislándose en la etapa
primaria, mediante hibridación cruzada con un ARNm de testículo,
los clones potencialmente específicos para el epidídimo, y éstos se
seleccionaron adicionalmente en la etapa secundaria mediante
hibridación cruzada con un ARNm procedente del cerebro y del hígado
(compárense el Ejemplo 3 y las Figuras 3 y 4).
Mediante subsiguiente análisis de transferencia
de borrón Northern frente al ARNm total procedente de testículos y
de deciduas humanas, se pudo concentrar adicionalmente el número de
los clones que entraban en consideración y finalmente se pudo
asociar a seis familias independientes de ADNc (compárense el
Ejemplo 3 y la Figura 5). A partir de una de estas familias de ADNc
se aisló el clon de ADNc según la SEQ ID NO 1, que codifica la
proteína receptora conforme al invento.
Los resultados obtenidos conforme al invento
muestran que el ARNm que constituye el fundamento de este clon no
es sintetizado en otros tejidos humanos (compárese la Figura 6); se
trata, por consiguiente, de una molécula específica para el
epidídimo. Las Figuras 6 y 7 muestran los autorradiogramas que en
cada caso constituyen el fundamento.
La secuencia de nucleótidos, así como la
correspondiente secuencia de aminoácidos, del clon de ADNc conforme
al invento, fueron analizadas tal como se indica en el Ejemplo 7. El
resultado está reproducido en SEQ ID NO 1.
La especificidad de este clon, y por
consiguiente del correspondiente producto de expresión, se establece
a partir de su hibridación exclusiva según Northern con un ARN
extraído a partir de un epidídimo humano, que no se pudo detectar
mediante hibridación cruzada en ningún otro tejido humano
investigado, incluyendo a los órganos cerebro e hígado. La
especificidad para tejidos se confirmó además mediante el recurso de
que una sonda génica homóloga, producida mediando aplicación de la
tecnología de PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en
cadena de la polimerasa) procedente de una rata, se hibridaba
asimismo de una manera exclusiva con un ARN procedente del tejido
epididimal, pero no con un ARN de otro tejido distinto de esta
especie de animal (compárese la Figura 7).
Una secuenciación total de una serie de clones
homólogos de ADNc, que se habían aislado a partir de dos bibliotecas
de ADNc de epidídimos humanos o respectivamente por aplicación del
procedimiento 5'RACE (M.A. Frohman, RACE: Rapid Amplification of
cDNA ends. En: Protocols: A Guide to Methods and Applications [RACE:
amplificación rápida de extremos de ADNc, en: protocolos de PCR:
una guía de métodos y aplicaciones], Academic Press Inc., páginas
28 - 38 (1990)), dio como resultado un transcrito génico uniforme
según la SEQ ID NO 1 con una longitud de 4.665 nucleótidos, que se
corresponde con la longitud del ARNm, que se había determinado
mediante una hibridación de Northern. Esta secuencia comprende un
cuadro de lectura completo, que codifica un polipéptido de 1.038
aminoácidos.
Se analizó la homología de las secuencias de
aminoácidos y de ADN conformes al invento (SEQ ID NO 1 y 2) con las
secuencias almacenadas en diferentes Bancos de Datos internacionales
(base de datos de NIH-Genbank, EMBL, PIR). En este
contexto se mostró que existía la máxima homología encontrada frente
a la "superfamilia de secretinas/VIP" de receptores acoplados
a la proteína G (W.C. Probst y colaboradores, Sequence Alignment of
G-Protein Coupled Receptor Superfamily, DNA and
Cell Biology [Alineación de secuencias de la superfamilia de
receptores acoplados a la proteína G, ADN y biología celular],
11, páginas 1-20 (1992)), y que ésta era de
un 25%. Se trata por consiguiente de un receptor hasta ahora
desconocido, cuyo extremo terminal de N largo apunta a la existencia
de un dominio extracelular, que es comparable con el de receptores
de glicoproteínas, es decir, que se trata de un nuevo receptor para
un gran ligando de glicoproteína, que procede de la secreción
testicular. Con ayuda de un análisis de la hidrofobia (Ej. 7) se
mostraron siete regiones hidrófobas claramente definidas, que se
pueden designar como dominios transmembranales (compárese la Figura
8a). La estructura de la proteína conforme al invento caracteriza a
ésta como un receptor situado en membranas, que se ha de asociar con
la familia de genes de los receptores acoplados a la proteína G
(véase más arriba). Ella posee el dominio de fijación a la proteína
G, que es típico para este conjunto de proteínas, con cuya ayuda se
transducen informaciones a través del receptor y se transmiten
ulteriormente a través de proteínas G al interior de células (L.
Bimbaumer, J. Abramowitz y A.M. Brown,
Receptor-effector coupling by G proteins
[Acoplamiento de un receptor y un efector por proteínas G] Biochem.
Biophys. Act. 1031, 163 - 224 (1990).
La proteína receptora conforme al invento se
presenta en el epidídimo en una alta abundancia (el ARNm constituye
aproximadamente un 0,01% de la biblioteca de ADNc) y unos ensayos de
hibridación in situ localizaron al ARNm en las células
epiteliales, que revisten al Ductus epididymidis (conducto
del epidídimo).
Además, se trata de una molécula altamente
conservada dentro de las especies de mamíferos, puesto que en los
casos de las especies de mamíferos investigadas hasta ahora se había
encontrado una homología de los productos de expresión de
aproximadamente un 90%, a igualdad de especificidad para
tejidos.
Las secuencias de nucleótidos, que codifican a
la nueva proteína receptora conforme al invento, se pueden
transferir, de acuerdo con procedimientos habituales, a través de
vectores apropiados, a células anfitrionas pro-o
eucarióticas y se pueden expresar allí como una proteína.
Son apropiadas, y están incluidas, conforme al
invento, todas las secuencias de ADN que, después de una
transformación de células anfitrionas pro- y/o eucarióticas
apropiadas. garantizan la obtención de ácidos nucleicos para la
utilización como agentes de diagnóstico y/o la expresión de
proteínas o polipéptidos. Estas secuencias en forma mono- o
bicatenaria comprenden en particular:
- a)
- La secuencia de nucleótidos indicada bajo la SEQ ID NO 1 en el protocolo de secuencias, la secuencia allí indicada de los nucleótidos 1 a 3.114, secuencias homólogas con respecto a las secuencias antes mencionadas, con un grado de homología de por lo menos un 90%, o secuencias complementarias;
- b)
- Secuencias de nucleótidos que se hibridan con la región codificadora de proteínas de la secuencia de nucleótidos indicada en a), por ejemplo en las condiciones de hibridación que se indican en los Ejemplos 3 ó 4;
- c)
- Secuencias de nucleótidos que, con excepción de las desviaciones causadas por la degeneración del código genético, se hibridan con las secuencias mencionadas dentro a) y/o b).
Como apropiados vectores para células
anfitrionas procarióticas sirven por ejemplo plásmidos de la serie
de pET (Rosenburg y colaboradores, "Vectors for selective
expression of cloned DNAs by T7 RNA Polymerase" [Vectores para
la expresión selectiva de ADN's clonados por la polimerasa de ARN
T7], Gene, 56, páginas 125-135 (1987), de la
serie pGEX (de Pharmacia, Freiburg), de la serie pRIT (de Pharmacia
Freiburg), y de la serie pH6EX3 (Berthold y colaboradores
"Purification of Recombinant Antigenic Epitopes of the Human
68-kDa (U1) Ribonucleoprotein Antigen Using the
Expression System pH6EX3 Followed by Metal Chelating Affinity
Chromatography, Protein Expression and Purification [Purificación
de epítopos antigénicos recombinantes del antígeno de
ribonucleoproteína de 68-kDa (U1) humano usando el
sistema de expresión pH6EX3 seguido por cromatografía de afinidad
quelante de metales", Expresión y purificación de proteínas],
3, páginas 50-56 (1992). Ejemplos de células
anfitrionas procarióticas son las usuales cepas de laboratorio de
Escherichia coli K12 así como las cepas BL21 (DE3) y
LE392.
Ejemplos de apropiados sistemas de vectores para
células anfitrionas eucarióticas son, en el caso de células de
mamíferos, virus SV40, poliomavirus, adenovirus, diferentes
retrovirus, papilomavirus (P.W.J. Rigby, "Expression of cloned
genes in eucaryotic cells using vector systems derived from viral
replicons", Genetic Engineering ["Expresión de genes clonados
en células eucarióticas usando sistemas de vectores derivados de
replicones víricos" Ingeniería Genética], tomo 3, páginas
84-141 (1982)) así como Vaccinia - virus (Mackett y
colaboradores "The construction and characterization of Vaccinia
virus recombinants expressing foreign genes" DNA Cloning ["La
construcción y caracterización de genes ajenos que expresan
recombinantes de Vaccinia virus" Clonación de ADN], tomo II
(1985), IRL Press, Oxford) y derivados de los mismos, así como los
plásmidos, que tienen partes de genes víricos (p.ej. el pSV2) y se
pueden emplear como "vectores de lanzadera" (= "Shuttle
Vektoren") (P.W.J Rigby, véase cita anterior). Como vectores
para células de insectos entran en consideración, por ejemplo,
baculovirus de pJVETL (de Invitrogen, San Diego California, EE.UU),
mientras que para células de levadura se pueden utilizar, p.ej., el
pJP31, los plásmidos YEp e YIp (Carter y colaboradores "Expression
and secretion of foreing genes in Yeast", DNA Cloning
``Expresión y secreción de genes ajenos en una levadura, Clonación
de ADN], tomo III (1987), IRL Press, Oxford).
Apropiadas células de mamíferos son p.ej.
células COS, células CHO, células AtT20 y células N1H3T3 (Rigby,
véase cita anterior, Mackett y colaboradores, véase cita anterior),
mientras que apropiadas células de insectos son p.ej. las Sf9, Sf21
y TN5 (de Invitrogen, San Diego, California, EE.UU). Apropiadas
células de levadura son p.ej. las X4003-5B (Carter,
véase cita anterior).
Además, la proteína receptora conforme al
invento se puede sintetizar químicamente de acuerdo con
procedimientos conocidos (J.M. Stewart, "Synthesis and use of
neuropeptides" Neuroendocrine Peptide Metodology ["Síntesis y
uso de neuropéptidos" Metodología de Péptidos Neuroendocrinos],
coordinador de edición P.M. Conn, Academic Press, Nueva York,
páginas 815-844 (1989)). Lo mismo es válido para
polipéptidos o epítopos de péptidos con la misma inmunogenicidad,
que son codificados por fragmentos o por secuencias singénicas de la
secuencia de ADN conforme al invento (SEQ ID NO 1).
Los polipéptidos y respectivamente las proteínas
conformes al invento, las secuencias de nucleótidos que codifican a
éstas o éstos, incluyendo a sus secuencias complementarias, así como
los anticuerpos producidos sobre la base de los polipéptidos y las
proteínas, ofrecen por primera vez la posibilidad de diagnosticar
trastornos en el metabolismo proteico del epitelio epididimal y
eventualmente de curarlos terapéuticamente o respectivamente poner
a disposición nuevos agentes contraceptivos.
Así, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos
arriba señaladas pueden ser provistas de marcadores y ser
utilizadas como sondas para la hibridación in situ en el
diagnóstico de tejidos de muestras de biopsias o secciones
delgadas, con el fin de determinar el estado fisiológico del tejido
en lo que se refiere a la presencia y a la concentración de las
proteínas receptoras conformes al invento, y compararlo con valores
patrones.
Anticuerpos policlonales y monoclonales
destinados a la utilización en procedimientos inmunológicos de
detección, se pueden producir de una manera conocida con ayuda del
polipéptido muy puro conforme al invento. Tales anticuerpos se
pueden producir sobre la base de la proteína receptora completa
(compárense los Ejemplos 8, 9).
Los anticuerpos pueden estar marcados y pueden
servir para la detección in vitro o in vivo de la
proteína receptora conforme al invento.
La proteína receptora conforme al invento puede
servir además, en una forma marcada o no marcada, como antígenos
para la identificación de autoanticuerpos en los sueros de varones
infértiles. Esta posibilidad presenta una importancia especial,
puesto que se supone que la infertilidad ha de ser atribuida, en una
gran parte de los casos, a la presencia de autoanticuerpos contra
componentes esenciales del sistema de procreación y reproducción.
Los métodos de ensayo, que hasta ahora están a disposición, miden
sin embargo solamente anticuerpos, que están dirigidos contra
algunos antígenos superficiales de espermatozoides, teniendo que
estar presente un título suficientemente alto de los anticuerpos,
con el fin de permitir efectuarse la aglutinación de los
espermatozoides. Se supone, sin embargo, que los anticuerpos pueden
estar presentes en unos títulos muchísimo más bajos y pueden causar
una infertilidad. Éstos se pueden determinar como antígenos con la
proteína receptora pura, preparada conforme al invento.
Partiendo de la secuencia de aminoácidos, que se
divulga conforme al invento, se recomiendan dos diferentes
procedimientos en relación con la obtención de antígenos para la
producción de anticuerpos.
Por una parte, con ayuda de un ordenador, se
puede escoger una región potencialmente inmunogénica de la secuencia
proteica interesante, la cual, por una parte, es relativamente
hidrófila y por consiguiente está situada en el lado exterior de la
molécula de proteína, pero, por otra parte, no es perturbada en su
conformación estérea mediante la formación de dobles puentes de
cisteína o posibles sitios de glicosilación.
Esta región de péptido es sintetizada a
continuación eventualmente junto con aminoácidos flanqueadores,
seguidamente es acoplada con sustancias de soporte y es empleada
como inmunógeno para la inducción de anticuerpos (compárese el
Ejemplo 9).
Alternativamente, se puede cambiar de clon (es
decir, transclonar) por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que
codifica el polipéptido interesante, en un apropiado vector de
plásmido de expresión. Después de una subsiguiente transformación
en el seno de apropiadas bacterias, estos vectores permiten una
expresión inducible del polipéptido codificado. La proteína
bacteriógena, preparada de esta manera, se puede utilizar, después
de una purificación a partir del extracto bacteriano, directamente
como antígeno para una inmunización destinada a la inducción de
anticuerpos (compárese el Ejemplo 8).
Los anticuerpos pueden ser provistos de un
marcador detectable, tal como p.ej. una molécula fluorescente
(fluorófora) y se puede emplear, por ejemplo, en el caso de
muestras de tejidos, con el fin de determinar, con ayuda de la
inmunofluorescencia, la presencia de la proteína receptora
específica para el epidídimo en el epitelio epidi-
dimal.
dimal.
La identificación y la caracterización de la
proteína receptora conforme al invento como una molécula mediadora
altamente específica, que está presente exclusivamente en las
células del epitelio epididimal de mamíferos y que está en
situación de transmitir informaciones acerca de la regulación de la
función celular dentro de las células del epitelio, la convierten
en un candidato extremadamente interesante para el diagnóstico y
eventualmente para el influjo sobre la fisiología antes mencionada
del epitelio epididimal. Mediante un influjo positivo deliberado,
conseguido de esta manera, se puede mejorar el proceso de maduración
de espermatozoides en el epidídimo por una vía terapéutica,
administrando como medicamento, por ejemplo, el ligando que falta en
el individuo que ha de ser tratado, o que se ha formado en una
cantidad insuficiente. Por otra parte, un influjo negativo sobre el
epitelio puede conducir a un empeoramiento de la maduración de
espermatozoides y por consiguiente a la puesta a disposición de
nuevos agentes contraceptivos para los varones. Para esta finalidad,
es apropiado por ejemplo un ligando artificial, que ciertamente se
fija firmemente a la proteína receptora conforme al invento, pero
no provoca ninguna transferencia o respectivamente transmisión de
señales. Además, se pueden emplear anticuerpos dirigidos contra la
proteína receptora conforme al invento, a fin de impedir al o a los
ligando(s) específico(s) para la proteína receptora,
que se fije(n) por la vía de un desplazamiento competitivo,
y por consiguiente impedir que participe(n) en el
desencadenamiento de
señales.
señales.
Mediante aplicación de determinados
procedimientos, tales como p.ej. la visualización (display) de fagos
y la visualización de péptidos (J.K. Scott y G.P. Smith, Searching
for peptide ligand with an epitope library [Investigación en cuanto
a un ligando de péptidos con una biblioteca de epítopos], Science
249, páginas 386-390 (1990); J.J. Devlin y
colaboradores, Random peptide libraries; a source of specific
protein binding molecules [Bibliotecas aleatorias de péptidos, una
fuente de específicas moléculas que se fijan a proteínas], Science
249, páginas 404-406 (1990)), biotecnología
evolutiva (M. Eigen, Selforganization of matter and the evolution
of biological macromolecules, Die Naturwissenschaften
[Autoorganización de la materia y la evolución de macromoléculas
biológicas, Las Ciencias Naturales], 58, páginas
465-523 (1971); M. Eigen, Automated molecular
evolution [Evolución molecular automática],
Max-Planck-Institut f.
Biophysikalische Chemie (1991), es posible sin ninguna dificultad
para un experto en la especialidad identificar ligandos
artificiales, que poseen la capacidad de fijarse específicamente y
con alta afinidad a una de tales proteínas receptoras, y actuar ya
sea de manera agonista o antagonista sobre su capacidad para la
transmisión de señales (Ej. 11). Por esta vía se pueden poner a
disposición unas moléculas, mediante las cuales se puede influir
positivamente (de manera terapéutica) o negativamente (de manera
contraceptiva) en su fisiología sobre las células, que expresan a la
proteína receptora.
El invento se explica seguidamente con detalle
con ayuda de Ejemplos.
El ARN total fue extraído de acuerdo con el
procedimiento de J.M. Chirgwin y colaboradores, Isolation of
biologically active ribonucleic acid from sources enriched in
ribonuclease, Biochemistry [Aislamiento de un ácido ribonucleico
biológicamente activo a partir de fuentes enriquecidas en cuanto a
ribonucleasa, Bioquímica], 18, 5294, (1979), a partir de los
tejidos congelados de testículos y epidídimos humanos que se habían
extraído mediante una orquiectomía de varones con carcinoma de
próstata en las edades de 58 y 74 años, mediando empleo de
isotiocianato de guanidina, y a continuación se habían purificado
mediante una centrifugación con un gradiente de densidades de
cloruro de cesio. Mediante utilización de una columna de
oligo(dT)-celulosa se pudo enriquecer por
cromatografía de afinidad un ARN poli(A)+, tal como ha sido
descrito por H. Aviv & P. Leder, Purification of biologically
active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic
acid-cellulose [Purificación de un ARN mensajero de
globina biológicamente activa mediante cromatografía sobre celulosa
- ácido oligotimidílico], Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69,
1.408-1.412, (1972). Las muestras de ARN fueron
precipitadas con etanol y, después de volverlas a suspender en agua
estéril, fueron conservadas a -80ºC en una concentración de 1
\mug/\mul.
De 0,5 a 1 \mug del ARN poli(A)+ de
epidídimos y testículos del Ejemplo 1, se tradujeron in
vitro en cada caso en un sistema exento de células de un
material lisado de reticulocitos, procedente de conejos (New England
Nuclear (NEN), Dreieich, RFA). La síntesis se llevó a cabo en
presencia de (^{35}S)-metionina (actividad
específica > 1.000 Ci/mmol). Los resultantes productos proteicos
fueron separados a continuación por electroforesis en un gel
bidimensional (compárese la cita de P.H. O'Farrel, High resolution
two-dimensional electrophoresis of proteins
[Electroforesis bidimensional con alta resolución de proteínas], J.
Biol. Chem., 250, 4.007-4021 (1975)). Para
la primera dimensión se aplicó sobre el gel en cada caso una
cantidad de 350.000 cpm de las tandas de traducción marcadas con
(^{35}S)-metionina y se enfocaron
isoeléctricamente con una tensión eléctrica aplicada de 10.000 V.h.
El gradiente de pH estaba situado entre 4,0 y 7,5. La separación de
los polipéptidos según sus pesos moleculares, se llevó a cabo en la
segunda dimensión dentro de un gradiente lineal de 7,5 -15% de
acrilamida (compárese la cita de D.M. Neville & H. Glossman,
Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein
subunits by discontinous gel electrophoresis in dodecylsulfate
[Determinación de los pesos moleculares de subunidades de proteínas
y glicoproteínas de membranas mediante una electroforesis
discontinua en gel en dodecilsulfato], Meth. Enzym. 32,
92-102, (1974)). Para la estimación de los pesos
moleculares, se aplicó en la segunda dimensión un marcador de
proteínas, marcado con ^{14}C (Amersham, GB). A continuación, el
gel fue fluorografiado con ayuda de la película autorradiográfica
Kodak X-AR5 (compárese la cita de W.M. Bonner &
R.A. Laskey, A film detection method for
Tritium-labelled proteine and nucleic acids in
polyacrylamide gels [Un método de detección en película para
proteínas y ácidos nucleicos que se han marcado con litio en geles
de poli(acrilamida)] Europ. J. Biochem, 46,
83-88 (1974)). El tiempo de exposición fue de 8
días. Los resultados están reproducidos en la Figura 2.
La Figura 2, que representa los resultados,
muestra el modelo de los productos de traducción sintetizados sin
células, que se derivan de un ARN poli(A)+, específico para
el epidídimo o respectivamente para el testículo.
En particular:
La Figura 2a muestra un tejido de epidídimo de
un paciente de orquiectomía con una edad de 74 años, tratado con
acetato de ciproterona.
La Figura 2b muestra un tejido de epidídimo de
un paciente de orquiectomía con una edad de 58 años, no tratado con
medicamentos.
La Figura 2c un tejido de testículo del mismo
paciente no tratado con medicamentos (véase la Figura 2b).
Los productos de traducción, específicos para el
epidídimo, cuyas bandas correspondientes no aparecen en la Figura
2c (productos de traducción de ARNm's procedentes de testículos),
son caracterizados mediante pequeñas flechas (véase la Figura
2b).
Una modificación de la expresión en el tejido de
epidídimo mediante un precedente tratamiento con antiandrógenos, la
muestra una comparación de las Figuras 2a y 2b. Unas bandas, que son
reducidas en la Figura 2a en comparación con la Figura 2b, fueron
marcadas por grandes flechas. Los pesos moleculares del marcador de
proteínas se indican en kilodalton. Se caracterizan en cada caso
productos similares a actina (A) y tubulina (T).
La cultivación, la manipulación y la
conservación de bacterias y bacteriófagos, así como el empleo de
técnicas de ADN recombinantes, se efectuaron de acuerdo con los
datos de T. Maniatis y Colaboradores, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio],
Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y.,
(1982).
- a)
- Para la organización de la biblioteca de ADNc, se empleó un ARN poli(A)+ procedente del tejido de epidídimo de un paciente no tratado con medicamentos (en lo que se refiere al modelo de los productos de traducción in vitro, compárese la Figura 2b). 20 \mug de un ARN poli(A)+ de acuerdo con el Ejemplo 1 se transcribieron inversamente, mediando utilización de un oligo(dT) como cebador (compárese la cita de U. Gubler y B.J. Hoffmann, A simple and very efficient method for generating cDNA libraries, Gene [Un método simple y muy eficiente para generar bibliotecas de ADNc, Genes], 15, 263-269 (1983)).
- Las construcciones artificiales bicatenarias de ADNc fueron ligadas por ambos lados con engarzadores de EcoRI y a continuación fueron introducidas en el sitio de clonación con EcoRI del bacteriófago Lambda gt11 (de Clontech, California).
- Para el descubrimiento de clones de longitud completa, se organizó una biblioteca adicional de ADNc específico para el epidídimo, en lo esencial de acuerdo con el procedimiento expuesto, pero con la diferencia de que las construcciones artificiales de ADNc habían sido clonadas unidireccionalmente. Esto se efectuó ligando el respectivo extremo de 5' con un engarzador EcoRI y el respectivo extremo de 3' con un engarzador XhoI, e introduciendo la respectiva construcción artificial seguidamente en el bacteriófago Lambda Uni-ZAP (de Stratagene, La Jolla, California).
- Bacterias de las cepas Y 1090 y XL-1 Blue de E. coli se cultivaron hasta la fase logarítmica, se transfirieron a agarosa blanda y se extendieron en placas juntamente con la biblioteca de Lambda no amplificada, en una densidad de fagos de 500 hasta 1.000 pfu (de plate forming units = unidades de formación de placas) por cada cápsula de Petri (de 15 cm) y se incubaron durante 8 horas a 42ºC y respectivamente a 37ºC.
- Para el escrutinio diferencial, las calvas de cada una de las cápsulas se sembraron en placas de réplicas seguidamente sobre dos filtros de nitrocelulosa (de Schleicher & Schüll, Darmstadt, RFA, BA85), siendo el tiempo de incubación para el primer filtro de 1 minuto y para el segundo filtro de 2 minutos.
- De esta manera se produjeron filtros de réplicas, en total de 20 cápsulas de Petri, y a continuación se hibridaron en cada caso con dos sondas de ADNc monocatenarias (mc.), marcadas radiactivamente (compárese b. abajo) (de manera positiva/negativa).
- b) Las sondas de un ARN poli(A)+ de epidídimo (que proporciona sondas positivas) y de un ARN poli(A)+ de testículo (que proporciona sondas negativas) se produjeron, mediando utilización de un oligo(dT) como cebador, de la siguiente manera:
- Ambas especies de ARN procedían de los correspondientes tejidos de un paciente, que no había sido sometido a ningún tratamiento previo con medicamentos. En cada caso 1 \mug del ARN poli(A)+ de acuerdo con el Ejemplo 1 se desnaturalizó durante 5 minutos a 65ºC en un volumen de 2 \mul. Después de un rápido enfriamiento de las tandas sobre hielo, se añadieron consecutivamente en cada caso los siguientes componentes:
- -
- 2 \mul de oligo(dT) (100 \mug/ml)
- -
- 1 \mul de una mezcla de dNTP (dATP, dGTP, dTTP, en cada caso 2 mM)
- -
- 1 \mul de pirofosfato de sodio 40 mM
- -
- 1 \mul de RNasin (de Amersham; GB)
- -
- 2 \mul de un tampón de 10x transcriptasa inversa (500 mM de Tris-Cl (de pH 8,5), 500 mM de KCl, 100 mM de MgCl_{2}, 100 \mug/ml de BSA, 10 mM de EDTA, 10 mM de ditiotreitol)
- -
- 20 unidades de transcriptasa inversa AMV (de Boehringer Mannheim, RFA)
- -
- 10 \mul de un (\alpha-^{32}P)-dCTP (NEN, 10 \mu Ci/\mul; S.A. > 3.000 ci/mmol).
Las tandas de reacción fueron incubadas durante
15 minutos a 42ºC. Después de haber añadido 1 \mul de una
"Chasemix" (que contenía la totalidad de los cuatro dNTP's en
una concentración en cada caso de 10 mM), se prosiguió la
incubación durante 20 minutos adicionales. La reacción fue detenida
por adición en cada caso de 1 \mul de EDTA 0,5 M, y los productos
se precipitaron con etanol sin ninguna purificación adicional. Las
sondas, marcadas con una actividad específica de > 10^{8}
cpm/\mug, fueron hibridadas paralelamente con los filtros de
réplica arriba mencionados. La hibridación se llevó a cabo en una
solución 5x de Denhardt, 4x SET (200 mM de Tris (de pH 8,0), 20 mM
de EDTA, 0,6 M de NaCl), 0,1% de pirofosfato de sodio y 25 mM de un
tampón de fosfato de sodio (de pH 7,0), durante 72 horas a 65ºC y
con una concentración de la radiactividad de 5 x 10^{6} cpm/ml.
Los filtros fueron lavados a continuación a una temperatura de 65ºC
en 0,1% de SDS, 2 x SSC (300 mM de cloruro de sodio, 30 mM de
citrato de sodio_{3}).
La Figura 3 muestra los autorradiogramas de dos
filtros de réplicas de una de las cápsulas de Petri, que habían
sido hibridados con sondas de ADNc epididimales (a) o
respectivamente testiculares (b). El revelado de los
autorradiogramas se efectuó después de un período de tiempo de
exposición de 16 horas, mediando utilización de una lámina
amplificadora. Los filtros representan aproximadamente 500 clones
independientes de la biblioteca global de ADNc, organizada en el
sistema de Lambda gt11, a base de tejidos de epidídimo. Las señales
de hibridación positivas, específicas para el epidídimo, están
marcadas con puntas de flechas (compárese la Figura 3a).
Con ayuda de este procedimiento de escrutinio
primario (compárese la Figura 1a) se pudieron lisar aproximadamente
10.000 clones de ADNc independientes. En este caso se pudieron
identificar 265 recombinantes, cuyas señales, después de una
hibridación con la sonda de ADNc epididimal, eran muchísimo más
fuertes en comparación con las producidas a base de tejidos de
testículo. Referido a la parte de la biblioteca de fagos, analizada
por escrutinio, el número de clones de ADNc positivos corresponde a
una proporción de 2,5%.
Se aislaron los clones de ADNc positivos y se
subdividieron para un escrutinio secundario en conjuntos con hasta
80 clones.
El procedimiento arriba descrito se repitió, con
la diferencia de que de cada una de las cubetas de Petri, que
habían crecido en conjuntos en cada caso de 80 clones, se produjeron
cada vez 3 filtros de réplica. Para la producción de las sondas de
ADNc negativas se utilizó aquí un ARN poli(A)+ procedente de
un cerebro humano o respectivamente de un hígado humano (de
Clontech California, EE.UU.).
El número de recombinantes positivos se redujo a
59 clones (compárese la Figura 4) después de un análisis de este
procedimiento de escrutinio secundario (compárese la Figura 1b).
El aislamiento de clones positivos se efectuó
sin ninguna purificación adicional de las calvas. El ADN de Lambda
purificado se cortó con EcoRI y los insertos se aislaron
mediante una elución con Biotrap (de Schleicher & Schüll). Los
insertos de EcoRI fueron subclonados en el vector de plásmido
bacteriano pBS (de Stratagene, California, EE.UU.) e introducidos,
mediante el procedimiento de transformación con CaCl_{2}, en las
células de bacterias de la cepa de E. coli XL1 Blue (de
Stratagene, California) (compárese la cita de T. Maniatis y
colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y., (1982)).
20 \mug de un ARN total procedente de un
epidídimo humano (E) de un paciente tratado con acetato de
ciproterona, así como la misma cantidad de un ARN total procedente
de un testículo humano (T) y de una decidua humana (D) se separaron
por electroforesis en un gel horizontal de agarosa y formaldehído al
1,3% durante 16 horas con una tensión eléctrica constante de 25
voltios (compárese la cita de T. Maniatis y colaboradores Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold
Spring Harbour, N.Y., (1982)) (Figuras 5, 6 y 7). Para la
determinación de los tamaños de los ARN's, el gel fue cargado
adicionalmente con un director conductor de ARN
(0,24-9,5 kb (kilobases). El ARN fue transferido a
continuación mediante transferencia de borrón capilar en presencia
de 20 x SSC sobre membranas de nylon (Hybond N., de Amersham). Los
borrones de transferencia fueron hibridados sucesivamente a
continuación con sondas radiactivas de ADNc, potencialmente
específicas para el epidídimo. Las sondas fueron aisladas mediante
una restricción con EcoRI del ADN de Lambda gt11 subclonado
en el plásmido pBS, así como mediante una subsiguiente elución en
Biotrap y, después de una marcación radiactiva, tenían una
radiactividad específica de > 10^{9} cpm/\mug (compárese la
cita de A.P. Feinberg y B. Vogelstein, A technique for
radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high
specific activity, Analytical Biochemistry [Una técnica para marcar
radiológicamente fragmentos de de endonucleasas de restricción de
ADN a una alta actividad específica. Bioquímica Analítica],
132, 6-13 (1983)). La hibridación se efectuó
durante una noche con una concentración de la radiactividad de
1-2 x 10^{6} cpm/\mul. Seguidamente, los filtros
se lavaron escalonadamente mediando rigurosidad creciente,
comenzando con 2 x SSC a la temperatura ambiente hasta llegar a 0,1
x SSC a una temperatura de 65ºC. Para la deshibridación, los filtros
se incubaron durante 15 minutos a 65ºC en presencia de 2 mM de Tris
(de pH 7,5), 1 mM de EDTA y 0,1% de SDS. Los filtros secados se
investigaron por autorradiografía en cuanto a la presencia de un
material de sonda, antes de que ellos, en el caso de no aparecer
señales, se utilizasen para una hibridación repetida con una sonda
adicional.
En la Figura 5 se representan Ejemplos para los
autorradiogramas de los análisis de transferencia de borrón
Northern de clones de ADNc potencialmente positivos. El período de
tiempo de exposición fue de 20 horas. Con ayuda de los diferentes
modelos de hibridación, se valoraron cualitativamente los clones en
lo que se refería a su especificidad para tejidos.
- a)
- Un clon positivo de ADNc, indicado por una hibridación específica para el epidídimo.
- b)
- Un modelo de hibridación positivo, pero no específico para el epidídimo.
- c)
- Un clon positivo de ADNc (*), que también se hibrida con un ARNr (ácido ribonucleico ribosomal)
- d)
- Un clon de ADNc sin expresión específica para tejidos.
Con ayuda de este procedimiento se pudo
identificar un número de 36 clones de ADNc epididimales. La señal
de hibridación específica de cada uno de los insertos de clones con
ARN epididimal era más fuerte en por lo menos un orden de magnitud
que la obtenida con un ARN procedente de testículos o de deciduas
(compárese la Figura 5a).
Mediante los resultados procedentes de
hibridaciones cruzadas con la original biblioteca de fagos, los 36
clones de ADNc específicos para el epidídimo pudieron ser asignados
a seis familias independientes, las cuales abarcaban en cada caso
un conjunto de clones afines entre ellos. En tal caso, se pudo
mostrar que cinco de las familias de clones de ADNc se derivaban de
diferentes moléculas de ARNm, relativamente cortas, con una
longitud media de 600 a 1.000 nucleótidos, mientras que el clon
conforme al invento, que contiene la información genética para la
presente proteína receptora, tiene una longitud de aproximadamente
5.000 nucleótidos.
Puesto que también a partir de la segunda
biblioteca de ADNc se pudieron aislar solamente fragmentos de ADNc
con una longitud máxima de 3,7 kb (compárese la Figura 8b), en
virtud de los resultados de la hibridación de Northern, había que
partir sin embargo de una longitud de ARNm de aproximadamente 5 kb,
el comienzo en 5' de este ADNc se clonó mediando aplicación del
método 5'-RACE (RACE = Rapid amplification of cDNA
ends [Amplificación rápida de extremos de ADNc; M.A. Frohman y
colaboradores, "Rapid production of full-length
cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single
gene-specific oligonucleotide primer" [Producción
rápida de ADNc's de plena longitud a partir de transcritos raros:
Amplificación usando un único cebador de oligonucleótidos
específico para un gen], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, páginas
8.988-9.002 (1988)). Para esto, a partir de la
región 5' de la conocida secuencia de ADNc que abarcaba 3,7 kb, se
produjeron dos cebadores antisentido específicos para un gen, A1 y
A2 (A1 = 5' AGC TAT GGG TGA AG 3', A2 = 5' TGT CAA TGG CAG GGC TG
3'). Con ayuda de estos cebadores, se obtuvo, partiendo de 1 \mug
de ARN total, procedente de un epidídimo humano, mediando
aplicación del protocolo "5'RACE System for Rapid Amplification of
cDNA Ends" [Sistema 5'RACE para la amplificación rápida de
extremos de ADNc] de la entidad Gibco BRL, Berlín, un fragmento de
5' con una longitud de 996 nucleótidos, que se solapaba con la
secuencia de ADNc ya conocida a lo largo de una longitud de 49
nucleótidos (incluyendo al cebador A1) (compárese la Figura 8b,
fragmento de 5'RACE, 1,0 kb).
En cada caso 20 \mug de un ARN total
procedente de deciduas, epidídimos y testículos de origen humano se
separaron de acuerdo con el Ejemplo 4 y se transfirieron sobre
membranas de nylon. Para el control de la especificidad para tejidos
del clon conforme al invento, se transfirieron además en cada caso
10 \mug de un ARN poli(A)+ procedente de epidídimos y el
ARN total procedente de conductos deferentes (Vas deferens) de
espermatozoides, así como en cada caso 20 \mug de un ARN total
procedente de un linaje de células linfoblastoides (Daudi), a partir
de linajes de células de carcinoma de próstata (LNCaP, DU145) y a
partir de linajes de células epididimales embrionarias (RVP, REP) se
separaron de una manera análoga y se transfirieron asimismo sobre
una membrana de nylon. Como sonda se empleó en la Figura 6a un
inserto de ADNc marcado con ^{32}P, procedente de la región de 3'
del clon conforme al invento (compárese la Figura 8b,
3'-UTR) y se hibridó con borrones de transferencia
Northern de acuerdo con el Ejemplo 4. En la Figura 6b se empleó, a
diferencia de esto, un inserto de ADNc de BamHI, marcado con
^{32}P, procedente de la región de 5' del clon conforme al invento
(compárese la Figura 8b, fragmento 5'BamHI). La Figura 6c muestra un
borrón de transferencia Northern después de una hibridación con un
fragmento 5'-RACE marcado con ^{32}P del clon
conforme al invento.
Los resultados representados en las Figuras 6
a-c muestran que el clon de ADNc conforme al invento
proporciona una señal de hibridación inequívoca solamente con el ARN
epididimal. Además, con ayuda del autorradiograma correspondiente a
la Figura 6c, se pudo confirmar la autenticidad del fragmento
5'-RACE (considérese la exclusiva señal con un ARN
de epidídimo a aproximadamente 5 kb).
Con el fin de investigar si ciertas homólogas de
la proteína receptora conforme al invento son expresadas también en
otras especies de mamíferos con la misma especificidad para tejidos,
mediando aplicación de la técnica de PCR (referencia general,
compárese la cita de R.S. Cha y W.G. Thilly, Specificity, Efficiency
and Fidelity of PCR, PCR-Methods and Applications
[Especificidad, eficiencia y fidelidad de una PCR, métodos de PCR y
aplicaciones], volumen 3, páginas 18-29 (1993)) se
intentó con el subfragmento E - F1 humano (compárese la Figura 8b,
subclones de PCR, producidos mediando utilización de los cebadores E
= 5' CAT CCG AAA ATA CAT CC 3' y F1 = 5' TGA AGG CAC ACA TCT CC
3'), amplificar correspondientes fragmentos procedentes del ARN
total de epidídimos de ratas, ratones y perros.
En cada caso 5 \mug de un ARN total de las
mencionadas especies de animales se sometieron a un reanillado en un
volumen total en cada caso de 20 \mul mediando utilización de 0,5
\mug de un oligo(dT)_{12-18} (de
Pharmacia, Freiburg). La subsiguiente síntesis de la primera cadena
se efectuó en presencia en cada caso de 10 mM de dATP, dGTP, dCTP y
dTTP así como de 200 unidades de una transcriptasa inversa (de
Superscript, Gibco BRL, Berlín). Para la subsiguiente amplificación
por PCR, se mezcló en cada caso 1 \mul de los productos de la
síntesis de la primera cadena en cada caso con 10 mM de los cuatro
dNTP's, en cada caso con 20 pM de los cebadores E y F1 humanos
específicos para genes (véase más arriba). así como en cada caso con
7 unidades de una polimerasa de Taq (de Promega, Heidelberg) en un
volumen total en cada caso de 50 \mul, y se sometieron a los
siguientes ciclos de PCR: desnaturalización (durante 5 minutos a
95ºC), luego a 30 ciclos que comprendían una desnaturalización
(durante 1 minuto a 95ºC), un reanillado (durante 1 minuto a 55ºC) y
una elongación (durante 1 minuto a 72ºC). Los fragmentos de ADNc
complementarios, obtenidos de esta manera, fueron separados por
electroforesis en geles de agarosa al 1,2%. A continuación, unos
fragmentos con una longitud de aproximadamente 750 nucleótidos
fueron electroeluidos e insertados en el vector de clonación pCRII
(de Invitrogen, ITC Biotechnology, Heidelberg). La determinación de
las secuencias de los fragmentos clonados de ADN se efectuó tal como
se describe en el siguiente Ejemplo 7 y proporcionó - tanto en el
plano de los nucleótidos como también en el de los aminoácidos - una
respectiva homología de aproximadamente un 90% con respecto a la
secuencia humana. Este sorprendente resultado muestra que la
secuencia de ADN, que codifica la proteína receptora conforme al
invento, presenta, por lo menos dentro de los mamíferos, un alto
grado de conservación.
Para el control de la especificidad para tejidos
del clon conforme al invento en una rata, se separaron en cada caso
20 \mug del ARN total procedente de diferentes tejidos de ratas
(con excepción de la 2ª traza (testículo), solamente 4 \mug) de
acuerdo con el Ejemplo 4, y se transfirieron sobre membranas de
nylon. Como sonda se empleó un inserto de ADNc marcado con ^{32}P
(actividad específica 19^{9} cpm/\mug) procedente del homólogo
para rata del clon conforme al invento (E - F1) y se hibridó con
borrones de transferencia Northern de acuerdo con el Ejemplo 4. En
la Figura 7 se representan esquemáticamente los autorradiogramas,
revelados después de un período de tiempo de exposición de 15 horas,
del análisis por transferencia de borrón Northern para el clon
conforme al invento. En el centro de la Figura 7 se representa una
rehibridación del borrón de transferencia reproducido encima con una
sonda testigo para actina, a partir de la que se desprende que en
todas las trazas del gel se habían encontrado cantidades
aproximadamente equimolares de ARN.
La Figura 7 muestra que la sonda E - F1 de la
rata se hibridaba exclusivamente con un ARN de epidídimo, siendo
las señales de máxima intensidad dentro del epidídimo en la región
caput o de cabeza (proximal) y en la región caudal o de cola
(distal) (véanse las trazas 5-7).
Los resultados con la rata confirman el modelo
de expresión, específico para el epidídimo, de la secuencia
conforme al invento, puesto que en los casos de las otras especies
investigadas de tejidos (en total 15) no se pudo detectar ninguna
hibridación cruzada.
La secuencia de bases del más largo clon de ADNc
conforme al invento, de acuerdo con los Ejemplos 4, 5 y 6, se
determinó con ayuda del método didesoxi según Sanger F. y Coulson
A.R. "A rapid method for determining sequences in DNA by primed
synthesis with DNA polymerase" ["Un método rápido para
determinar secuencias en un ADN mediante una síntesis cebada con
una polimerasa de ADN"] J. Mol. Biol. 94, 441 (1975). Con
esta finalidad, se produjeron subclones de acuerdo con el Ejemplo 3
y se transformaron en condiciones alcalinas en ADN's
monocatenarios.
El resultado para el clon conforme al invento se
representa en el protocolo de secuencias (SEQ ID NO 1).
La Figura 8a muestra el resultado de la
representación gráfica (plot) de la hidrofobia, siendo representadas
secuencias hidrófobas de aminoácidos por debajo de la línea cero.
Son llamativas las regiones hidrófobas situadas entre la posición
620 y la posición 900 de la secuencia de aminoácidos, que
caracterizan a los 7 dominios transmembranales y que permiten sacar
la conclusión de la existencia de un receptor con la estructura que
se representa en términos generales en la Figura 8c (a partir de:
J.D. Watson y colaboradores "Rekombinierte DNA" [ADN
recombinado], 2ª edición, editorial Spektrum, página 299 (1993)). Es
digno de hacerse observar, además, el extremo terminal de N
extracelular que comprende 620 aminoácidos. En la Figura 8b se
representa un correspondiente diagrama de barras de la proteína
conforme al invento. Éste muestra el cuadro de lectura abierto (ORF,
de Open Reading Frame) en forma de una caja con una longitud de
3.114 nucleótidos, lo cual corresponde a una capacidad de
codificación de 1.038 aminoácidos (aa). Los 7 dominios
transmembranales están resaltados de un modo sombreado y se
corresponden con los resultados del análisis de la hidrofobia. La
secuencia de nucleótidos desde la posición 3.115 hasta la posición
4.665 comprende la región no traducida en 3' (3'UTR) del clon
conforme al invento y se corresponde aproximadamente con el clon de
ADNc aislado a partir de la primera biblioteca de ADNc. Por debajo
del diagrama de barras se representan los dos clones de ADNc, que
habían sido aislados y secuenciados a partir de las dos bibliotecas
de ADNc del epidídimo (biblioteca 1/biblioteca 2). Finalmente se
representan debajo unos subclones de PCR y los cebadores (A1, A2, E,
F1) empleados para su respectiva síntesis. Los fragmentos utilizados
como sondas están resaltados como barras
negras.
negras.
La región codificadora de proteínas del clon de
ADNc conforme al invento, insertado en los subclones pBS producidos
de acuerdo con el Ejemplo 3, fue recortada con ayuda de usuales
endonucleasas de restricción y cambiada de clon por una vía usual
(Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning - A Laboratory
Manual" [Clonación molecular - un manual de laboratorio] 2ª
edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)) en el vector
plásmido de expresión pET3 (Rosenberg y colaboradores "Vectors
for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA Polymerase"
[Vectores para la expresión selectiva de ADN's clonados mediante la
polimerasa de ARN T7], Gene 56, 125-135 (1989))
tomando en consideración el cuadro de lectura. Este vector hace
posible la inserción del inserto de ADNc directamente detrás
(secuencia abajo) de una secuencia de promotor, que es específica
para la enzima polimerasa T7 y comprende además un gen de
resistencia a ampicilina.
Después de una transformación de estas
construcciones artificiales en el seno de la cepa BL21 (DE3) de
E. coli, que dispone del gen para la polimerasa T7, se
efectuó la cultivación de los transformantes mediando una selección
con ampicilina. Por adición de rifampicina se desactivaron todas las
polimerasas propias de E. coli. Puesto que solamente la
polimerasa T7 es resistente frente a este antibiótico y el inserto
de ADNc conforme al invento estaba sometido al control del promotor
para la polimerasa T7, se expresó principalmente el polipéptido
conforme al invento.
Los polipéptidos bacteriógenos, producidos de
esta manera, fueron a continuación purificados por electroforesis
en gel a partir de los extractos bacterianos, y fueron utilizados
directamente como antígenos para una inmunización de conejos,
gallinas y ratas.
La secuencia
Arg-Ile-Lys-Lys-Lys-Lys
(que se corresponde con los nucleótidos 2.503-2.520
y respectivamente con los codones 835-840 de SEQ ID
NO 1) se identificó por ordenador como posible epítopo antígeno de
la proteína receptora conforme al invento y se sintetizó
químicamente, junto con los aminoácidos flanqueadores en la
secuencia total
Cys-Arg-Ile-Lys-Lys-Lys-Lys-Gln-Leu-Gly-Ala-Gln-Arg-Lys-Thr
(que se corresponde con los nucleótidos 2.500-2.544
y respectivamente con los codones 834-848 de la SEQ
ID NO 1) de acuerdo con el procedimiento de Merrifield (J.M.
Stewart "Synthesis and use of neuropeptides" Neuroendocrine
Peptide Methodology ["Síntesis y uso de neuropéptidos"
Metodología de Péptidos Neuroendocrinos], coordinador de edición
P.M. Conn, Academic Press, Nueva York, páginas
815-844 (1989)), estando contenida en el extremo
terminal de N una cisteína natural.
Los fragmentos inmunógenos del polipéptido
conforme al invento, producidos de esta manera, fueron acoplados a
continuación en cada caso con un éster de
N-hidroxi-succinimida del ácido
m-maleimido benzoico (M8759 de Sigma) (Sambrook y
colaboradores, "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" 2ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a sustancias
de soporte (hemocianina de lapa de bocallave = Keyhole Limpet
Hemocyanin, KLH) y se emplearon como antígenos para la inmunización
de conejos, gallinas y ratas con el fin de producir
anticuerpos.
Los anticuerpos policlonales, obtenidos de esta
manera, son apropiados en particular para la detección diagnóstica
cualitativa y cuantitativa de la proteína receptora conforme al
invento en secciones tisulares de pacientes de infertilidad. La
detección puede efectuarse de acuerdo con métodos inmunohistológicos
conocidos, mediando utilización de un segundo anticuerpo obtenible
en el comercio, marcado eventualmente de acuerdo con procedimientos
usuales, que reconoce de una manera específica a los anticuerpos
mencionados en primer lugar (Harlow y Lane, Antibodies - A
Laboratory Manual [Anticuerpos, un manual de laboratorio], Cold
Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York
(1988)).
Mediando utilización del fragmento E - F1 con
una longitud de 743 pb (pares de bases) (compárese el Ejemplo 6) de
la secuencia de ADN conforme al invento, se produjo en presencia de
[\alpha^{35}S]CTP, mediante una transcripción in
vitro, una sonda específica, que se había empleado para la
determinación de la expresión de la secuencia conforme al invento
en secciones congeladas.
Los resultados de correspondientes experimentos
de hibridación in situ se representan en la Figura 9. Los
puntitos blancos de la sección congelada de origen humano, que se
representa en la Imagen a mediando utilización de un microscopio de
campo oscuro, muestran señales específicas procedentes de la
hibridación in situ en presencia del fragmento anterior como
sonda "antisentido". La Imagen b representa el resultado de un
ensayo testigo llevado a cabo con una sección tisular comparable,
en la que en lugar de la sonda "antisentido" precedentemente
utilizada, la cadena complementaria se utiliza como sonda "del
mismo sentido" (testigo negativo).
La Imagen a muestra con claridad que la
secuencia de ADN conforme al invento es expresada exclusivamente en
la capa epitelial del epidídimo, pero no en las células de estroma o
músculo del mismo tejido humano.
Las Imágenes c y d muestran ensayos llevados a
cabo paralelamente, mediando utilización de secciones tisulares del
epidídimo de ratas. La Imagen c muestra una sección de la región
proximal del epidídimo, mientras que en la Imagen d se representa
la región distal del mismo tejido. Al realizar una consideración
comparativa de las Imágenes c y d se pone en claro que la región
proximal suministra señales más intensas, lo cual se ha de atribuir
presumiblemente a una especialización funcional de esta región.
Los resultados de este Ejemplo demuestran la
extremadamente alta especificidad para tipos de células de la
proteína receptora conforme al invento. y por consiguiente la
idoneidad de las sustancias propuestas conforme al invento para el
influjo positivo o negativo, específico y por consiguiente
exclusivo, sobre las funciones del epidídimo en conexión con la
maduración de los espermatozoides. Además, los resultados ilustran
la utilización, propuesta conforme al invento, de las secuencias
puestas a disposición, incluyendo a fragmentos de las mismas, como
sondas específicas para investigaciones diagnósticas tanto
cualitativas como también cuantitativas de muestras de biopsias.
Además de esto, la tasa de expresión, extremadamente alta, de la
proteína receptora conforme al invento apunta a su idoneidad como
mediadora prometedora de éxito en el marco de formas de aplicación
terapéuticas o contraceptivas.
Para la obtención de ligandos específicos para
la proteína receptora conforme al invento, se produjo el dominio
extracelular terminal de N (desde la posición 1 hasta la 620 de la
secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO 2) de la proteína
receptora en un sistema eucariótico de expresión, tal como el linaje
de células COS-7. Para esta finalidad, la región
del ADNc que codificaba este dominio (correspondiente a las
posiciones 1 a 1.860 de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
SEQ ID NO 1) fue provisto en el extremo 3' de una secuencia de
bandera (flag), es decir de una secuencia de oligonucleótidos, que
codificaba un epítopo de péptido conocido, muy específico, y se
clonó en el vector de expresión pRc/CMV (de Invitrogen San Diego,
California, EE.UU.). Después de haberse efectuado la transfección
del linaje de células COS-7 con el descrito vector
de expresión, se obtuvo el producto de fusión de acuerdo con
procedimientos conocidos y se purificó por una cromatografía de
afinidad mediando utilización de anticuerpos inmovilizados,
dirigidos hacia el epítopo de bandera.
A continuación, el producto de fusión se empleó
como sonda en un procedimiento convencional de escrutinio de
proteínas (compárese la cita de J. Sambrook. E.F. Fritsch, y T.
Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N. Y., capítulo 2 (1989)),
mediando utilización de una biblioteca de expresión de un ADNc
procedente de un testículo humano, producida en bacteriófagos
Lambda. Para esto, se transfirieron sobre membranas de nylon
aproximadamente 1 millón de clones bacterianos de ADNc
independientes, que mediante inducción por IPTG expresan productos
testiculares y por consiguiente potenciales ligandos, y se
incubaron en condiciones apropiadas (véase más arriba) con el
dominio recombinante de fijación a receptores. Seguidamente, los
fragmentos de receptores no fijados específicamente, se eliminaron
en condiciones rigurosas de lavado, de manera tal que sobre los
filtros se encontraban solamente unos complejos de fijación
específicos, que pudieron ser hechos visibles a través del epítopo
de bandera con sistemas convencionales de detección de anticuerpos
(sistema con utilización de una fosfatasa alcalina, de Sigma,
Deisenhofen). Las colonias de fagos identificadas de esta manera
fueron aisladas y purificadas, así como aportadas a una
determinación de secuencias.
Con el fin de determinar si los ligandos
encontrados pueden inducir una transducción de señales mediante el
receptor conforme al invento, y por lo tanto si son apropiados para
la estimulación de la maduración de espermatozoides en el caso de
mamíferos subfértiles, unos cultivos del linaje de células
COS-7, transfectado con toda la construcción
artificial de ADNc, se incubaron por separado con los ligandos
positivos, y se determinó su modificación, causada por la fijación
específica, del nivel de cAMP intracelular y/o del contenido de
Ca^{2+}. Los ligandos positivos, que no estaban en situación de
provocar tales modificaciones, son apropiados por ejemplo como
antagonistas para la inhibición de la maduración de espermatozoides
y se pueden emplear para la preparación de agentes
contraceptivos.
La utilización de tales ligandos para
finalidades terapéuticas es especialmente ventajosa, puesto que
mediante la expresión, específica para tejidos, de la proteína
receptora conforme al invento se influye selectivamente sobre este
tipo de tejido y por lo tanto no son de esperar efectos colaterales
de ningún tipo o solamente son de esperar pequeños efectos
colaterales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:Institut für Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Grandweg 64
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Hamburgo
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 22529
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA SOLICITUD: Proteína receptora específica para el epidídimo
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA LÓGICO - SOFTWARE: Patent In Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID. NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4.665 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..3.114
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: 3'UTR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 3.115..4.665
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de poliA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 4.647..4.652
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID. NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.038 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2
Claims (19)
1. Ácido nucleico, que comprende
- a.
- la secuencia de nucleótidos que se representa en SEQ ID NO 1,
- b.
- una secuencia parcial de la secuencia de los nucleótidos 1 a 3.114, indicada en a.,
- c.
- secuencias homólogas con respecto a las secuencias antes mencionadas, con un grado de homología de por lo menos un 90%,
- d.
- una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de a. y b. dentro del marco de la degeneración del código genético, o
- e.
- una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con las secuencias de a., b. o d.,
codificando el ácido nucleico
procedente de a - e una proteína receptora específica para el
epidídimo.
2. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende un segmento que codifica proteínas,
que corresponde a la secuencia de ácido nucleico que se representa
en SEQ ID NO 1.
3. Ácido nucleico, que codifica un polipéptido
con la secuencia de aminoácidos que se representa en SEQ ID NO.
2.
4. Polipéptidos codificados por un ácido
nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-3.
5. Polipéptido, que comprende la secuencia de
aminoácidos que se representa en SEQ ID NO. 2.
6. Fragmento de polipéptido que corresponde a
la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO. 2 desde la
posición 1 hasta la 620.
7. Anticuerpos, caracterizados porque
están en situación de tomar parte en una reacción inmunitaria con
una de las proteínas o con uno de los polipéptidos de acuerdo con
las reivindicaciones 4-6.
8. Anticuerpos monoclonales de acuerdo con la
reivindicación 7.
9. Moléculas de vectores que contienen por lo
menos una copia de un ácido nucleico de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-3.
10. Moléculas de vectores de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizadas porque ellas contienen
insertadas las secuencias de una manera tal que se puede efectuar
su expresión en apropiados microorganismos.
11. Célula anfitriona procariótica o
eucariótica, caracterizada porque ella es transfectada con un
ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-3 o con un vector de acuerdo con la reivindicación
9.
12. Procedimiento para la preparación de las
proteínas o de los polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones
4-6, caracterizado porque las células
anfitrionas de acuerdo con la reivindicación 11 se cultivan en unas
condiciones, que permiten la expresión de la secuencia de ADN, y el
producto de expresión se puede obtener a partir de la tanda de
cultivo.
13. Composición farmacéutica, que como
componente activo contiene una o varias de las proteínas o uno o
varios de los polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones
4-6, o que se prepara de acuerdo con la
reivindicación 12 o que contiene una célula de acuerdo con la
reivindicación 11, como componente activo.
14. Composición farmacéutica, que contiene
anticuerpos de acuerdo con las reivindicaciones 7-8,
como componente activo.
15. Composición farmacéutica, que como
sustancia activa eficaz contiene unas secuencias de nucleótidos, que
se hibridan con las secuencias de nucleótidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1-3.
16. Composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 15, estando las secuencias de nucleótidos provistas
de un marcador detectable.
17. Composición farmacéutica de acuerdo con las
reivindicaciones 13-16 para el diagnóstico de
trastornos de la reproducción masculina.
18. Composición farmacéutica de acuerdo con las
reivindicaciones 13 - 16 para la terapia de trastornos de la
reproducción masculina o para la contracepción.
19. Utilización de las proteínas o de los
polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 4-6
para el aislamiento y la preparación de ligandos específicos.
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