ES2342255T3 - Gen nphs2 implicado en el sindrome nefrotico corticorresistente. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado, cuya secuencia se selecciona de la SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10, que representa un fragmento del ADN genómico del gen humano designado NPHS2.
Description
Gen NPHS2 implicado en el síndrome nefrótico
corticorresistente.
En este documento se describe un nuevo gen,
denominado NPHS2, que codifica una proteína implicada en el síndrome
nefrótico corticorresistente.
El síndrome nefrótico idiopático es una
patología que aparece principalmente en la infancia, y que se
caracteriza por una proteinuria masiva, y cambios histológicos no
específicos del riñón incluyendo a veces una glomeruloesclerosis
segmentaria y focal (FSGS). Estas características están asociadas
con una desaparición difusa de los pedicelos de los podocitos
observado a microscopía electrónica (Broyer y col., 1998),
revelador de síndromes nefróticos cualquiera que sea su causa. La
mayoría de los casos responden a una terapia a base de esteroides y
tienen un buen pronóstico, pero aproximadamente el 20% son
resistentes a los esteroides y evolucionan hacia la insuficiencia
renal terminal, conduciendo a una glomeruloesclerosis completa. Se
habla entonces de síndrome nefrótico corticorresistente.
La ultrafiltración de las macromoléculas del
plasma durante la formación de la orina primaria en el glomérulo es
una de las principales funciones del riñón humano. La pared capilar
estructuralmente compleja responsable de esta función esta
compuesta por una membrana basal cubierta por un endotelio
fenestrado sobre su superficie interna y por células epiteliales
especializadas (podocitos) que forman pedicelos sobre la superficie
externa. Se observa en un gran número de enfermedades adquiridas o
hereditarias una disfunción del filtro glomerular resultante de una
pérdida excesiva de proteínas plasmáticas, lo cual conduce a un
síndrome nefrótico, y después quizás a una insuficiencia renal
terminal.
El estudio de enfermedades genéticas que afectan
a la barrera de filtración proporciona modelos útiles para
comprender la fisiopatología del proceso de filtración glomerular.
Se han descrito algunas de estas afecciones hereditarias con
proteinuria y síndrome nefrótico. La más grave es el síndrome
nefrótico congénito de tipo finlandés (CNF), que es una enfermedad
recesiva autosómica, con una proteinuria masiva en el útero, un
síndrome nefrótico al nacer que conduce habitualmente a una
insuficiencia renal terminal durante los dos primeros años de vida.
El CNF está provocado por mutaciones en el gen NPHS1 (Kestilä,
1998). Por otro lado, se han descrito casos de proteinuria familiar
o de síndrome nefrótico con lesiones histológicas de
glomeruloesclerosis segmentaria y focal (FSGS) en pacientes más
mayores, en particular adultos. Se han cartografiado dos locus
genéticos para la FSGS dominante autosómica, respectivamente, sobre
el locus 19q13 próximo al locus del gen NPHS1 (Mathis y
col., 1998) y sobre el locus 11q21-q22 (Winn
y col., 1999).
En 1995, una nueva entidad de síndrome nefrótico
corticorresistente de transmisión autosómica recesiva se
caracterizó de acuerdo con los siguientes criterios: comienzo precoz
entre tres meses y cinco años, resistencia a una terapia a base de
esteroides, evolución hacia la insuficiencia renal terminal antes de
la edad de diez años, ausencia de recidiva después del trasplante
renal y ausencia de cualquier desorden extra-renal.
Histológicamente, sólo se observan modificaciones mínimas en las
biopsias precoces aunque generalmente se presenta una FSGS en
estadios posteriores. Un locus genético implicado en este síndrome
nefrótico corticorresistente se ha cartografiado en la región
1q25-q31 entre los marcadores D1S452 y D1S466,
extendiéndose esta región sobre aproximadamente 12 cM (Fuchshuber,
1995). Otro equipo (Lench y col.., 1998) ha confirmado esta
localización y, más recientemente, también se ha demostrado una
relación de esta región en una familia que presenta una FSGS que
comienza en la edad adulta (Tsukaguchi y col., 1999).
Los autores de la presente invención han
conseguido ahora identificar de manera precisa un nuevo gen
implicado en la entidad del síndrome nefrótico corticorresistente
descrito anteriormente. En principio, este gen se ha denominado
SRN1 y después se ha renombrado como NPHS2.
Adjunto a este documento se encuentra una lista
de secuencias, en la cual la secuencia SEC ID nº 1 representa el
fragmento de ADNc del gen NPHS2 en el ser humano correspondiente a
la fase de lectura abierta (ORF). Este ORF contiene 1149 bases y
codifica una proteína de 383 aminoácidos, denominada podocina, cuya
secuencia se presenta la SEC ID nº 2.
Las secuencias SEC ID nº 3 a SEC ID nº 10
representan fragmentos del ADN genómico del gen NPHS2 humano que
incluye respectivamente 8 exones (en negrita en el listado adjunto),
como se indica a continuación:
SEC ID nº 3:
- Hay 683 pares de bases delante de ATG. Los clones de ADNc obtenidos explorando un banco de ADNc de riñón fetal humano (banco Clontech clonado en el fago \lambdagt11) comienzan generalmente entre las bases 615 y 619. Hay 274 pares de bases de ATG en el sitio del corte y empalme (exón 1), después 147 pares de bases de secuencias intrónicas.
SEC ID nº 4:
- Hay 151 pares de bases intrónicas, después 104 pares de bases de codificación (exón 2), después 123 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 5:
- Hay 336 pares de bases intrónicas, después 73 pares de bases de codificación (exón 3), después 291 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 6:
- Hay 187 pares de bases intrónicas, después 83 pares de bases de codificación (exón 4), después 90 pb intrónicas.
SEC ID nº 7:
- Hay 250 pares de bases intrónicas, después 204 pares de bases de codificación (exón 5), después 195 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 8:
- Hay 367 pares de bases intrónicas, después 56 pares de bases de codificación (exón 6), después 169 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 9:
- Hay 327 pb intrónicas, después 79 pares de bases de codificación (exón 7), después 310 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 10:
- Hay 285 pares de bases intrónicas, después 911 pares de bases de secuencia de ADNc hasta el sitio de poliadenilación utilizado (exón 8). El codón de terminación está en la posición 562, después 109 pares de bases de secuencias genómicas complementarias que incluyen los otros sitios de poliadenilación potenciales.
La secuencia SEC ID nº 11 abarca una parte del
exón 5, los exones 6 y 7 y una gran parte del exón 8 (de la base
9792 del ADNc).
Las secuencias SEC ID nº 12 a nº 27 son
cebadores utilizados para amplificar secuencias humanas.
La secuencia SEC ID nº 28 es la secuencia del
ADNc de podocina de rata, siendo la secuencia SEC ID nº 29 la
secuencia de aminoácidos correspondiente. La presente invención se
refiere a un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones
1, 4, 5, 6 y 9.
Por otro lado, se describe un ácido nucleico
aislado, cuya secuencia se selecciona entre la SEC ID nº 3 a la SEC
ID nº 10, o una secuencia homóloga, definida como
- i)
- una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10; o
- ii)
- una secuencia que híbrida con la secuencia SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10 o sus secuencias complementarias, en condiciones de hibridación rigurosas.
La presente invención también tiene por objeto
un ácido nucleico aislado, que comprende la secuencia SEC ID nº 1 o
28, o una secuencia homóloga, definida como
- i)
- una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 1; o
- ii)
- una secuencia que híbrida con la secuencia SEC ID nº 1 o su secuencia complementaria, en condiciones de hibridación rigurosas, o
- iii)
- una secuencia que codifica el polipéptido, denominado podocina, como se define anteriormente.
Preferentemente, una secuencia de nucleótidos
homóloga de acuerdo con la invención es idéntica a al menos el 75%
de la secuencia SEC ID nº 1, más preferentemente a al menos el 85%,
o a al menos el 90%.
De manera preferente, una secuencia de
nucleótidos homóloga hibrida específicamente con secuencias
complementarias de las secuencias SEC ID nº 1, 3 a 10, y 28 en
condiciones rigurosas. Los parámetros que definen las condiciones
de rigurosidad dependen de la temperatura a la cual se separan el
50% de las cadenas emparejadas (Tm).
Para las secuencias que comprenden más de 30
bases, Tm se define por la relación: Tm=81,5+0,41(%G+C)+
16,6Log(concentración de cationes)-0,63(% de formamida)-(600/número de bases) (Sambrook y col., 1989).
16,6Log(concentración de cationes)-0,63(% de formamida)-(600/número de bases) (Sambrook y col., 1989).
Para las secuencias de longitud inferior a 30
bases, Tm se define por la relación:
Tm=4(G+C)+2(A+T).
En condiciones de rigurosidad apropiadas, en las
que las secuencias específicas no hibridan, la temperatura de
hibridación es de aproximadamente 5 a 30ºC, preferentemente de 5 a
10ºC inferior a la Tm, y los tampones de hibridación utilizados son
preferentemente
\hbox{soluciones de fuerza iónica elevada, tal como, por ejemplo, una solución de SSC 6x.}
Una secuencia de nucleótidos homóloga a la ORF
representada en la SEC ID nº 1 ó 28 incluye cualquier secuencia de
nucleótidos que difiere la SEC ID nº 1 ó 28 por mutación, inserción,
deleción o sustitución de una o más bases, o por la degeneración
del código genético, siempre que codifique un polipéptido que
presente la actividad biológica de la podocina, como se define a
continuación.
Entre dichas secuencias homólogas se incluyen
las secuencias de genes de mamíferos distintas de las del ser
humano, que codifican la podocina, preferentemente de un primate,
bovino, ovino o porcino, o también un roedor, así como las
variantes alélicas o secuencias polimórficas.
La siguiente tabla presenta un determinado
número de polimorfismos identificados en el gen NPHS2:
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también tiene por objeto
un polipéptido aislado como se define en la reivindicación 2 ó
3.
También se describe en este documento un
polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos SEC
ID nº 2 ó 29, o una secuencia homóloga, definida como
- i)
- una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 2 ó 29; o
- ii)
- una secuencia codificada por una secuencia de ácido nucleico homóloga como se define en la reivindicación 2 ii), es decir una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la SEC ID nº 2 ó 29 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación.
Más generalmente, por "secuencia homóloga de
aminoácidos" se entiende cualquier secuencia de aminoácidos que
difiere de la secuencia SEC ID nº 2 ó 29 por sustitución, deleción
y/o inserción de un aminoácido o de un número reducido de
aminoácidos, particularmente por sustitución de aminoácidos
naturales por aminoácidos no naturales o pseudoaminoácidos en
posiciones tales que estas modificaciones no perjudiquen
significativamente a la actividad biológica de la podocina.
Dichas sustituciones son preferentemente
sustituciones conservativas, es decir, sustituciones de aminoácidos
de la misma clase, tales como sustituciones de aminoácidos de
cadenas laterales no cargadas (tales como asparagina, glutamina,
serina, treonina y tirosina), aminoácidos de cadenas laterales
básicas (tales como lisina, arginina e histidina), aminoácidos de
cadenas laterales ácidas (tales como ácido aspártico y ácido
glutámico) aminoácidos de cadenas laterales apolares (tales como
glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,
fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína).
Preferentemente, dicha secuencia de aminoácidos
homóloga es idéntica al menos al 85% de la secuencia SEC ID nº 2 ó
29, preferentemente al menos al 95%.
La homología se determina generalmente
utilizando un programa de análisis de secuencia (por ejemplo,
Secuence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,
University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University
Avenue, Madison, WI 53705). Las secuencias de aminoácidos similares
están alineadas para obtener el máximo grado de homología (es
decir, de identidad). Con este fin, puede ser necesario introducir
de manera artificial huecos ("gaps") en la secuencia. Una vez
realizado el alineamiento óptimo, se establece el grado de
homología (es decir, de identidad) registrando todas las posiciones
para las cuales los aminoácidos de dos secuencias comparadas son
idénticos, con respecto al número total de posiciones.
"La actividad biológica de la podocina" se
refiere al mantenimiento de la integridad del filtro glomerular. La
ausencia o la modificación de la podocina provoca la filtración de
proteínas a nivel del glomérulo y por consiguiente la aparición de
proteinuria.
El polipéptido de la presente invención puede
sintetizarse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos
por el experto en la materia. El polipéptido de la invención puede
sintetizarse, por ejemplo, por técnicas de síntesis química, tales
como la síntesis de tipo Merrifield que es ventajosa por razones de
pureza, especificidad antigénica, ausencia de productos secundarios
no deseados y por su facilidad de producción.
Una podocina recombinante también puede
producirse mediante un procedimiento, en el que un vector que
contiene un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC ID nº 1 ó
nº 28 o una secuencia homóloga se transfiere a una célula huésped
que se cultiva en condiciones que permiten la expresión del
polipéptido correspondiente.
La podocina producida puede después recuperarse
y purificarse.
El experto en la materia conoce los
procedimientos de purificación utilizados. El polipéptido
recombinante obtenido puede purificarse partir de lisados y
extractos celulares, del sobrenadante del medio de cultivo, por
procedimientos utilizados individualmente o en combinación, tales
como fraccionamiento, procedimientos cromatográficos, técnicas de
inmunoafinidad usando anticuerpos mono- o policlonales específicos,
etc.
La secuencia de ácido nucleico de interés, que
codifica la podocina, puede insertarse en un vector de expresión,
en el cual la secuencia está unida operativamente a elementos que
permiten regular su expresión, tales como particularmente
promotores, activadores y/o terminadores de la transcripción.
Las señales que controlan la expresión de las
secuencias de nucleótidos (promotores, activadores, secuencias de
terminación, ...) se seleccionan en función del huésped celular
utilizado. A este efecto, las secuencias de nucleótidos de acuerdo
con la invención pueden insertarse en vectores de replicación
autónoma dentro del huésped seleccionado, o en vectores
integradores del huésped seleccionado. Dichos vectores se prepararán
de acuerdo con los procedimientos normalmente utilizados por el
experto en la materia, y los clones resultantes pueden introducirse
en un huésped apropiado por procedimientos
\hbox{convencionales, tales como por ejemplo, electroporación o precipitación con fosfato de calcio.}
Los vectores de clonación y/o de expresión de
acuerdo con la reivindicación 7 también forman parte de la presente
invención.
La invención también se refiere a células
huésped transfectadas, de manera transitoria o estable, por estos
vectores de expresión. Estas células pueden obtenerse introduciendo
en células huésped, eucariotas o procariotas, una secuencia de
nucleótidos insertada en un vector tal como se define anteriormente
y después cultivando dichas células en condiciones que permitan la
replicación y/o la expresión de la secuencia de nucleótidos
transfectada.
Los ejemplos de células huésped incluyen
particularmente células de mamíferos, tales como las células
COS-7, 293, MDCK, células de insectos tales como
las células SF9, de bacterias tales como E. coli y cepas de
levaduras tales como YRG2.
Las diferentes secuencias de nucleótidos
descritas en este documento pueden ser o no de origen artificial.
Puede tratarse de secuencias de ADN o de ARN, obtenidas explorando
bancos de secuencias por medio de sondas elaboradas basándose en
las secuencias SEC ID nº 1 ó 28 y 3 a 10. Dichos bancos pueden
prepararse por técnicas clásicas de biología molecular, conocidas
por el experto en la materia.
Las secuencias de nucleótidos descritas en este
documento también pueden prepararse por síntesis química o incluso
por procedimientos mixtos que incluyen la modificación química o
enzimática de secuencias obtenidas explorando bancos.
Estas secuencias de nucleótidos permiten
realizar sondas o cebadores, que hibridan específicamente con una
secuencia SEC ID nº 1 ó 28, ó de 3 a 10, de acuerdo con la
invención, o su cadena complementaria. Las condiciones de
hibridación apropiadas corresponden a las condiciones de temperatura
y de fuerza iónica normalmente utilizadas por el experto en la
materia, preferentemente en condiciones rigurosas tales como las
definidas anteriormente. Estas sondas también pueden utilizarse
como herramienta de diagnóstico in vitro para detectar, por
experimentos de hibridación, particularmente de hibridación
"in situ", transcritos específicos del polipéptido de la
invención en muestras biológicas o para poner de manifiesto
síntesis aberrantes o anomalías genéticas resultantes de un
polimorfismo, mutaciones o un mal corte y empalme.
Los ácidos nucleicos de la invención útiles como
sondas incluyen como mínimo 10 nucleótidos, preferentemente al
menos 20 nucleótidos, más preferentemente al menos 100 nucleótidos.
Los ácidos nucleicos útiles como cebadores incluyen como mínimo 10
nucleótidos, preferentemente al menos 14 nucleótidos y
preferentemente menos de 40 nucleótidos.
Más precisamente, en este documento se describe
un ácido nucleico que tiene al menos 10 nucleótidos, que híbrida
específicamente con una de las secuencias de ácido nucleico de SEC
ID nº 1 ó 28, ó 3 a 10 o su cadena complementaria, en condiciones
de hibridación rigurosas.
De manera ventajosa, como sonda puede utilizarse
el ácido nucleico constituido por la secuencia SEC ID nº 11, que
abarca una parte del exón 5, los exones 6 y 7 y una gran parte del
exón 8 (de la base de 728 a la base 1792 del ADNc).
Por otro lado, para una amplificación (por
ejemplo, por PCR) pueden utilizarse, como cebador, los ácidos
nucleicos constituidos por las secuencias de la SEC ID nº 12 a la
SEC ID nº 27.
Preferentemente, las sondas o los cebadores de
la invención se marcan antes de su uso. Para esto, el experto en la
materia dispone de varias técnicas, como por ejemplo el marcaje
fluorescente, radiactivo, quimioluminiscente o enzimático.
En la presente invención se incluyen
procedimientos de diagnóstico in vitro en los que se aplican
estos oligonucleótidos para la detección de mutaciones o
transformaciones genómicas, a nivel del gen NPHS2.
El experto en la materia conoce bien los
procedimientos convencionales para analizar el ADN contenido en una
muestra biológica y para diagnosticar un trastorno genético. Están
disponibles numerosas estrategias de análisis genotípico
(Antonarakis y col., 1989, Cooper y col., 1991).
Preferentemente, para detectar una anomalía en
el gen NPHS2, puede utilizarse el procedimiento DGGE (electroforesis
en gel de gradiente desnaturalizante), el procedimiento de SSCP
(polimorfismo de conformación de cadena sencilla) o el
procedimiento DHPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento
desnaturalizante; Kuklin y col. 1997; Huber y col.,
1995). Preferentemente, después de estos procedimientos se realiza
una secuenciación directa. El procedimiento de
RT-PCR puede realizarse ventajosamente para detectar
anomalías en el transcrito de NPHS2, porque permite visualizar las
consecuencias de una mutación de corte y empalme que provoca la
pérdida de 1 o más exones a nivel del transcrito, o un corte y
empalme aberrante debido a la activación de un sitio críptico.
Preferentemente, también después de este procedimiento se realiza
una secuenciación directa. Los procedimientos desarrollados más
recientemente que utilizan microplacas de ADN también pueden
aplicarse para detectar una anomalía en el gen NPHS2 (Bellis y
col., 1997).
La clonación del gen NPHS2 así como la
identificación de diversas mutaciones responsables del síndrome
nefrótico corticorresistente permiten contemplar diagnósticos
directos. La especificidad y la fiabilidad de dichos procedimientos
de diagnóstico son particularmente apreciables para un diagnóstico
prenatal. Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos
descritas en este documento representan una herramienta
particularmente interesante para el asesoramiento genético.
Por lo tanto, la presente invención tiene por
tanto la utilización de acuerdo con la reivindicación 13.
Por lo tanto, la invención tiene por objeto un
procedimiento de diagnóstico in vitro de un síndrome
nefrótico corticorresistente asociado a una mutación del gen NPHS2,
que comprende las etapas constituidas por:
- a1)
- poner en contacto una muestra biológica que contenga el ADN con oligonucleótidos específicos que permitan la amplificación de todo o parte del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con la reivindicación 1;
- b1)
- amplificar dicho ADN;
- c1)
- detectar los productos de amplificación;
- d1)
- comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho gen NPHS2, indicadora de un síntoma nefrótico corticorresistente asociado a una mutación en el gen NPHS2;
\vskip1.000000\baselineskip
o, de acuerdo con una alternativa,
- a2)
- poner en contacto una muestra biológica que contenga el ARN con oligonucleótidos específicos que permitan la ampliación de todo o parte del transcrito del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6;
- b2)
- amplificar dicho ARN;
- c2)
- detectar los productos de amplificación;
- d2)
- comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho transcrito del gen NPHS2, indicadora de un síntoma nefrótico corticorresistente, asociado a una mutación del gen NPHS2.
También forman parte de la invención los ácidos
nucleicos aislados constituidos por una secuencia diferente de la
secuencia SEQ ID nº 1 por una mutación, inserción o deleción,
particularmente en al menos una de las posiciones de los
nucleótidos 481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607 y
940 o también 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422,
442, 571, 572, 583, 783, 794 y 848, a reserva de que dicho ácido
nucleico aislado esté implicado en un síndrome nefrótico
corticorresistente.
Entre las mutaciones ya identificadas, se
destacan particularmente las siguientes, presentadas en las tablas
1 y 2.
No se han vuelto a encontrar mutaciones en 40
controles
\newpage
No se han vuelto a encontrar mutaciones en 40
controles.
Estos ensayos pueden aprovecharse
particularmente en familias que ya tienen un niño afectado, para el
diagnóstico presintomático (en particular diagnóstico
prenatal).
En los casos esporádicos, la detección de una
mutación del gen NPHS2 permite modificar el tratamiento (y en
particular evitar tratamientos inmunosupresores que serán
ineficaces) y predecir la ausencia de recidiva después del
trasplante renal.
Este ensayo diagnóstico también puede servir
para investigar la asociación de determinadas variantes polimórficas
de la podocina en otras patologías que implican anomalías
secundarias del filtro glomerular (nefropatía diabética, nefropatía
del SIDA, reducción nefrónica, hipertensión arterial). Estas
variantes podrían representar factores de susceptibilidad en el
desencadenamiento o progresión de la nefropatía en estas
enfermedades.
La invención también tiene por objeto
anticuerpos dirigidos contra el polipéptido podocina tal como se
define en la reivindicación 2 ó 3.
Se puede tratar de anticuerpos poli- o
monoclonales o de sus fragmentos, anticuerpos quiméricos,
particularmente humanizados o inmunoconjugados.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse a
partir del suero de un animal inmunizado contra un polipéptido de
acuerdo con los modos operativos usuales.
De acuerdo con un modo de realización de la
invención, se puede utilizar como antígeno un fragmento peptídico
apropiado, que puede acoplarse por medio de un resto radioactivo a
una proteína o a otro péptido. Se inmunizaron conejos con el
equivalente de 1 mg del antígeno peptídico de acuerdo con el
procedimiento descrito por Benoit et al. (1982). A
intervalos de cuatro semanas, los animales se trataron mediante
inyecciones de 200 \mug de antígeno y de 10 a 14 días más tarde
se desangraron. Después de la tercera inyección, el antisuero se
examinó para determinar su capacidad para unirse al péptido
antigénico radiomarcado con yodo, preparado por el procedimiento de
cloramina-T y a continuación se purificó mediante
una cromatografía en columna de intercambio iónico de carboximetil
celulosa (CMC). A continuación, las moléculas de anticuerpo se
recogieron en los mamíferos y se aislaron hasta la concentración
deseada por procedimientos bien conocidos por el experto en la
materia, por ejemplo, utilizando DEAE Sephadex para obtener la
fracción de IgG.
Con objeto de aumentar la especificidad del
suero policlonal, los anticuerpos pueden purificarse mediante una
cromatografía de inmunoafinidad utilizando polipéptidos que
inmunizan en fase sólida. Los anticuerpos se ponen en contacto con
el polipéptido que inmuniza en fase sólida durante un tiempo
suficiente de manera que se hace inmuno-reaccionar
el polipéptido con la molécula de anticuerpo para formar un complejo
inmunológico en fase
sólida.
sólida.
A modo de ejemplo, se han producido anticuerpos
policlonales en el conejo contra dos proteínas recombinantes que
comprenden los fragmentos de los aminoácidos 15 a 89 y 135 a 383 de
la podocina, acoplados a seis restos histidina del extremo
N-terminal, habiéndose subclonado los ADNc en el
vector PQ E32 (Quiagen) y expresado en E. coli.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de
acuerdo con el procedimiento clásico de cultivo de hibridomas
descrito por Köhler y Milstein (1975).
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de
la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos quiméricos,
anticuerpos humanizados, fragmentos Fab y F(ab')2. También
pueden presentarse en forma de immunoconjugados o de anticuerpos
marcados.
Los anticuerpos de la invención, en particular
los anticuerpos monoclonales, pueden utilizarse particularmente
para análisis por inmunohistoquímica de la podocina sobre cortes de
tejidos específicos, por ejemplo, por inmunofluorescencia, marcaje
con oro, inmunoperoxidasa...
Los anticuerpos así producidos también pueden
utilizarse ventajosamente en cualquier situación en la que deba
observarse la expresión de la podocina.
La invención también tiene por objeto el uso de
al menos un anticuerpo, de acuerdo con la reivindicación 11, para
la detección o purificación de un polipéptido tal como se define en
la reivindicación 2 ó 3 en una muestra
biológica.
biológica.
Más precisamente, en este documento se describe
un procedimiento in vitro para la detección o la medición
del índice de expresión de la podocina en una muestra biológica, que
comprende poner en contacto al menos un anticuerpo como se define
anteriormente con dicha muestra biológica en condiciones que
permitan la posible formación de complejos inmunológicos
específicos entre la podocina y el o dichos anticuerpos, y detectar
los complejos inmunológicos específicos posiblemente formados. La
puesta a punto de dicho ensayo (de tipo ELISA por ejemplo) podría
ser particularmente útil para investigar el desarrollo de
anticuerpos anti-podocina después del trasplante
renal, en determinadas enfermedades renales autoinmunes, incluso en
el síndrome nefrótico corticosensible.
También se describe un kit para aplicar este
procedimiento que comprende:
- -
- al menos un anticuerpo específico de la podocina, posiblemente fijado sobre un soporte;
- -
- medios de revelación de la formación de complejos antígenos/anticuerpos específicos entre la podocina y dicho anticuerpo y/o medios de cuantificación de estos complejos.
La invención también tiene por objeto una
composición farmacéutica que comprende un polipéptido podocina tal
como se define en la reivindicación 2 ó 3, o un ácido nucleico que
codifica dicho polipéptido, en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Los modos de administración, las posologías y
las formas galénicas de las composiciones farmacéuticas de acuerdo
con la invención, que contienen al menos un polipéptido, pueden
determinarse de la manera habitual por el experto en la materia,
particularmente de acuerdo con los criterios generalmente tomados en
cuenta para establecer un tratamiento terapéutico adaptado a un
paciente, como por ejemplo la edad o el peso corporal del paciente,
la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los
efectos secundarios constatados, etc.
De manera general, puede administrarse a adultos
humanos una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz
que varía de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1 mg.
\newpage
También se describe una composición farmacéutica
que comprende un ácido nucleico como se describe anteriormente, que
codifica un polipéptido con actividad de podocina y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, destinándose dicha composición para
utilizarse en terapia génica. El ácido nucleico preferentemente
insertado en un vector generalmente viral (tal como adenovirus y
retrovirus) puede administrarse en forma desnuda, exento de
cualquier vehículo que favorezca la transferencia a la célula
diana, tal como liposomas aniónicos, lípidos catiónicos,
micropartículas, por ejemplo micropartículas de oro, agentes de
precipitación, por ejemplo, fosfato de calcio, o cualquier otro
agente que facilite la transfección. En este caso, el polinucleótido
puede diluirse simplemente en una solución fisiológicamente
aceptable, tal como una solución estéril o una solución estéril
taponada en presencia o ausencia de un
vehículo.
vehículo.
De manera alternativa, un ácido nucleico de la
invención puede asociarse a agentes que faciliten la transfección.
Puede estar, entre otras cosas, (i) asociado a un agente químico que
modifica la permeabilidad celular, tal como la bupivacaína; (ii)
encapsulado en liposomas, posiblemente en presencia de sustancias
complementarias que facilitan la transfección; o (iii) asociado a
lípidos catiónicos o micropartículas de sílice, de oro o de
tungsteno.
Cuando las construcciones de ácido nucleico de
la invención recubren micropartículas, éstas pueden inyectarse por
vía intradérmica o intraepidérmica por la técnica del bombardeo de
genes, "gene gun" (documento WO 94/24263).
La cantidad a utilizar como medicamento depende
particularmente de la propia construcción del ácido nucleico, del
individuo al cual se administra este ácido nucleico, del modo de
administración y del tipo de formulación, y de la patología. De
manera general, puede administrarse a adultos humanos una cantidad
terapéuticamente o profilácticamente eficaz que varía de
aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1 mg, preferentemente
de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 800 \mug y, de
manera preferente de aproximadamente 25 \mug a
aproximadamente
250 \mug.
250 \mug.
Las construcciones de ácidos nucleicos de la
invención pueden administrarse por cualquier vía de administración
convencional tal como particularmente por la vía parenteral. La
elección de la vía de administración depende en particular de la
formulación seleccionada. Una administración diana en el tejido
renal, en particular en los glomérulos, puede ser particularmente
ventajosa.
El polipéptido de la invención o el ácido
nucleico que codifica este polipéptido son útiles como medicamento,
particularmente para el tratamiento de una enfermedad renal, en
particular para el tratamiento de un síndrome nefrótico
corticorresistente asociado a una mutación del gen NPHS2 o que se
produce en el marco de una enfermedad general (SIDA, diabetes
...).
También se describe un procedimiento de
tratamiento terapéutico, en el cual se administra a un paciente que
necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un polipéptido
podocina tal como se define anteriormente o un ácido nucleico que
codifica este polipéptido.
El paciente en cuestión es generalmente un ser
humano, pero la solicitud también puede extenderse a cualquier
mamífero si fuera necesario.
Los ejemplos siguientes, así como la figura
adjunta, ilustran la invención sin limitar su alcance.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura adjunta es un mapa de la región NPHS2.
La región candidata de 2,5 Mb está delimitada por los marcadores
D1S1640 y 183f10-CA. En el mapa se indica la
posición de los marcadores polimórficos y de las secuencias STS (en
negrita e itálica) y las secuencias ETS únicas y agrupaciones
UniGene de EST (en letra normal). Los YAC, PAC y cósmidos se
representan por líneas. Los genes se indican por cuadros rayados. El
NGAP está representado por dos cuadros separados por una
línea horizontal que simboliza la presencia de exones cortados y
empalmados de manera alternativa en posición 5', probablemente
debido a un promotor alternativo. El RPS14P, un pseudogen de
la proteína ribosomal S14, se localiza en el interior del intrón de
NGAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El enfoque utilizado por los autores de la
presente invención para identificar el gen NPHS2 ha sido definir el
intervalo genético mínimo en el que se situaba el gen, después
establecer el mapa físico de la región construyendo un cóntigo de
PAC que abarca la región, hacer el inventario de los genes conocidos
y los EST de la región y caracterizar los EST (por
RACE-PCR y selección del banco de ADNc de riñón
fetal).
\vskip1.000000\baselineskip
Un análisis de unión usando marcadores
microsatélites (Dib et al., 1996), así como nuevas familias
de pacientes, ha permitido localizar el locus NPHS2 entre los
marcadores D1S480 y D1S2883. Se ha construido un cóntigo de YAC (20
clones) que abarca la región entre estos dos marcadores. También se
ha construido un cóntigo de cromosomas artificiales P1 (PAC) para
abarcar esta región estimada en aproximadamente 3 Mb. Otros
marcadores microsatélites también se han podido caracterizar en
este cóntigo. Dos familias que presentan eventos de recombinación
han permitido localizar de manera exacta el locus de la enfermedad
entre D1S1640 y 183F10CA, nuevo marcador microsatélite identificado
por secuenciación de subclones de la región. El cóntigo 35 PAC entre
estos dos marcadores abarca aproximadamente de 2 a 2,5 Mb, pero
contiene 5 espacios parcialmente rellenados por 14 cósmidos.
Los autores de la invención también han
localizado sobre este cóntigo, investigando en los bancos de datos
las secuencias potencialmente localizadas en la región y
secuenciando los extremos de los YAC, de los PAC y de los cósmicos,
así como de subclones de diferentes PAC que contienen potencialmente
islotes CpG, genes ya conocidos, agrupaciones de EST (UniGene) y
EST independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Consultando la base de datos del Sanger Centre,
se ha descubierto que el PAC 545A16 contenía el marcador D1S215
localizado cerca del límite telomérico de la región de interés así
como el EST AA398634, que provenía de un banco de testículo y
contenía secuencias cortas débilmente homólogas al gen de la
estomatina, pero curiosamente, a priori, en sentido opuesto
al EST. Los autores de la invención han localizado por tanto este
EST en el cósmido 28e17 y en el PAC 302d13 y han demostrado por
RT-PCR que se expresaba en el riñón.
Después han sido necesarios múltiples ensayos de
RACE-PCR para obtener un ADNc a partir de este EST.
En efecto, los productos obtenidos correspondían, en la mayoría de
los experimentos, a ADN genómicos que aparecían sin empalmes. Sin
embargo, uno de los productos obtenidos correspondía a un transcrito
que contenía una corta fase de lectura abierta y homólogo a seis
EST (agrupación Unigene Hs. 192657), provenientes todos de un banco
de riñón humano, pero que no se había localizado en el genoma. De
hecho, se comprueba que los EST del agrupamiento Unigene Hs. 254975
al cual pertenece el EST AA398634 parecen pertenecer a otro gen o
pseudogen cuyo sentido de la transcripción es opuesto al NPHS2 y
que solapa parcialmente con la secuencia 3' de NPHS2, lo que explica
los datos proporcionados por los bancos de datos relativos al EST
AA398634. Utilizando este producto de RACE-PCR
descrito anteriormente como sonda para hibridar una transferencia de
Northern que contiene ARN de diferentes tejidos, se ha demostrado
que este trascrito de aproximadamente 2 kb se expresaba solamente en
el riñón. Estos resultados se han confirmado hibridando una
transferencia puntual que contenía ARN de 50 tejidos diferentes
(Clontech). Se obtuvo una señal intensa solamente con el riñón
adulto y el riñón fetal. La localización de este gen en el cóntigo
y su expresión casi exclusiva en el riñón hacían de este gen un
excelente gen candidato, hipótesis reforzada por la casi ausencia
del producto de amplificación por RT-PCR, utilizando
cebadores situados a la vez en la parte 5' y en la parte 3' del
ADNc, con el ARN extraído del riñón de un paciente terminal. El
ADNc completo del gen NPHS2 se ha clonado por corte y empalme de un
banco de ADNc de riñón fetal humano con la sonda utilizada para
hibridar la transferencia de Northern (Secuencia ID nº 11).
Las uniones intrones-exones y
las secuencias genómicas aguas arriba del exón 1 se han obtenido por
secuenciación directa de PAC 302d13 y del cósmido 28e17.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los autores de la invención que han
caracterizado la estructura intrón-exón del gen, han
continuado investigando después por SSCP ("Polimorfismo
Conformacional Monocatenario") mutaciones en 16 pacientes no
emparentados que presentan un síndrome nefrótico corticorresistente
familiar tal como se describe anteriormente (inicio precoz,
evolución rápida hacia la insuficiencia renal terminal, sin recidiva
después del implante y lesiones de glomeruloesclerosis segmentaria
y focal en las biopsias renales) y que pertenecen a familias en las
que el estudio de haplotipos era compatible con una relación en el
locus NPHS2.
Para este análisis SSCP, los exones se
amplificaron por PCR utilizando cebadores intrónicos flanqueantes.
Las condiciones de PCR y los cebadores se seleccionaron utilizando
el programa Oligo 5.0 (NBI) y eran los siguien-
tes:
tes:
- exón 1, 5'-GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT-3' (SEC ID nº 12) y 5'-TCA GTG GGT CTC GTG GGG AT-3' (SEQ ID nº 13);
- exón 2, 5'-AGG CAG TGA ATA CAG TGA AG-3' (SEC ID nº 14) y 5'-GGC CTC AGG AAA TTA CCT A-3' (SEQ ID nº 15);
- exón 3, 5'-TTC TGG GAG TGA TTT GAA AG-3' (SEC ID nº 16) y 5'-TGA AGA AAT TGG CAA GTC AG-3' (SEQ ID nº 17);
- exón 4, 5'- AAG GTG AAA CCC AAA CAG C -3' (SEC ID nº 18) y 5'-CGG TAG GTA GAC CAT GGA AA-3' (SEC ID nº 19);
- exón 5, 5'-CAT AGG AAA GGA GCC CAA GA-3' (SEC ID nº 20) y 5-TTT CAG CAT ATT GGC CAT TA-3' (SEC ID nº 21);
- exón 6, 5'-CTC CCA CTG ACA TCT GA-3' (SEC ID nº 22) y 5'-AAT TTA AAA TGA AAC CAG AA-3' (SEC ID nº 23);
- exón 7, 5'-CTA AAT CAT GGC TGC ACA CC-3' (SEC ID nº 24) y 5'-CTT CCT AAA GGG CAG TCT GG-3' (SEC ID nº 25);
- exón 8, 5'-GGT GAA GCC TTC AGG GAA TG-3' (SEC ID nº 26) y 5'-TTC TAT GGC AGG CCC CTT TA-3' (SEC ID nº 27);
a temperaturas de hibridación de 50ºC (exón 6),
55ºC (exones 2, 3, 4 y 5), 60ºC (exones 1, 7 y 8). A razón de la
gran cantidad de GC del exón 1, la PCR se efectuó utilizando la Taq
polimerasa de Qiagen y la solución -Q de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Además, debido a su tamaño, el
producto de PCR del exón 1 ha debido digerirse por la enzima
SmaI en dos fragmentos antes de la electroforesis en gel. La
migración se ha realizado durante dos horas a 600 V, 25 mA y 15 W
con la unidad de electroforesis Genephor, utilizando el kit GeneGel
Excel 12.5/24 (Pharmacia). La clonación se realizó con un colorante
"Automated Gel Stainer GeneStain" utilizando el kit de tinción
PlusOne Silver (Pharmacia).
\vskip1.000000\baselineskip
Se observaron diez mutaciones diferentes.
Algunas dan lugar a un desplazamiento de la fase de lectura o a la
aparición de un codón de terminación prematuro y son por lo tanto
mutaciones inactivadoras, lo que demuestra que el gen identificado
es en efecto el gen NPHS2. Otras son mutaciones de sentido erróneo
producidas en regiones muy conservadas de la proteína, que se
segregan en las familias con la enfermedad y que no se han vuelto a
encontrar en 80 cromosomas de control, lo que sugiere en gran medida
que estas mutaciones son responsables del fenotipo en los niños
afectados.
Una de las mutaciones de sentido erróneo (R138Q)
se ha vuelto a encontrar en seis individuos no emparentados, pero
que provenían de la misma parte de Europa, sugiriendo la posibilidad
de un efecto fundador para esta mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Secciones de riñón de 6 \mum cubiertas con
parafina se separaron de su parafina y se rehidrataron y después se
trataron con microondas en un tampón de citrato de sodio (0,01 M, pH
6) para aumentar la señal hibridación. Las ribosondas de NPHS2 se
sintetizaron a partir del producto de PCR de 1065 pares de bases
(posición 728 a 1792 del ANDc de NPHS2, SEQ ID nº 1)
sub-clonado en el vector PGEM-Teasy.
La sonda antisentido se sintetizó después de la digestión con
SalI utilizando la polimerasa T7 y la sonda sentido después
de la digestión con SaclI utilizando la polimerasa Sp6. Las
ribosondas se marcaron con
digoxigenina-11-UTP (Boehringer
Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con
[^{35}S]UTP como se describe en Sibony et al, 1995.
Los experimentos de hibridación in situ se realizaron como se
describe en Kalatzis et al. (1998) y Heidet et al.
(1997) para sondas de
digoxigenina-11-UTP y [35^{S}]
UTP, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos de hibridación in situ
han permitido demostrar que el gen NPHS2 se expresaba únicamente a
nivel de los podocitos en el riñón maduro. En los riñones fetales,
no se observó ninguna señal en las primeras fases del desarrollo de
la nefrona. En cambio, se detectaron señales intensas en el segmento
inferior del cuerpo en S, en la región correspondiente a futuros
podocitos. Esta expresión persiste en los glomérulos inmaduros y en
los glomérulos maduros del córtex profundo. Estos resultados que
demuestran la expresión exclusiva del gen NPHS2 en los podocitos, a
la vez precozmente durante el desarrollo y en los glomérulos
maduros, están completamente de acuerdo con la patología observada,
y justifican la denominación de "podocina" para la proteína
codificada por el gen
NPHS2.
NPHS2.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> INSERM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen NPHS2 implicado en el síndrome
nefrótico corticorresistente, proteína codificada por este gen y
usos de diagnóstico y terapéuticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BFF 99/0667
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0000709
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-01-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1853
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (70) .. (1221)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 3
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<211> 1104
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 378
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 700
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 360
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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\hskip0,8cm
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<210> 7
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<211> 649
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\hskip0,8cm
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<210> 8
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<211> 592
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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\hskip0,8cm
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<210> 9
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<211> 716
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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\hskip0,8cm
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1305
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 1065
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 26
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<213> Homo sapiens
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<400> 26
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\hfill20
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<210> 27
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 27
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\hfill20
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<210> 28
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<211> 1652
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47) .. (1195)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (16)
1. Ácido nucleico aislado, cuya secuencia se
selecciona de la SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10, que representa un
fragmento del ADN genómico del gen humano designado NPHS2.
2. Polipéptido aislado, denominado podocina,
constituido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.
3. Polipéptido aislado, constituido por una
secuencia homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2,
definiéndose dicha secuencia homóloga como:
- i)
- una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 2; o
- ii)
- una secuencia codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia SEC ID nº 1 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación, tales como las proporcionadas por una temperatura de hibridación de 5 a 30ºC inferior a la Tm, y un tampón de hibridación SSC 6x,
entendiéndose que dicho polipéptido presenta la
actividad biológica de la podocina, polipéptido de secuencia SEC ID
nº 2.
4. Ácido nucleico aislado, constituido por una
secuencia diferente de la secuencia SEC ID nº 1 por una mutación,
inserción o deleción, en al menos una posición entre los nucleótidos
481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607 y 940, o
también 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571,
572, 583, 783, 794 y 848, a reserva de que dicho ácido nucleico
aislado esté implicado en un síndrome nefrótico
corticorresistente.
5. Ácido nucleico aislado, constituido por la
secuencia SEC ID nº 1 que codifica un polipéptido designado
podocina.
6. Ácido nucleico aislado, constituido por una
secuencia homóloga a la secuencia SEC ID nº 1, definiéndose dicha
secuencia homologa como:
- i)
- una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 1, entendiéndose que dicha secuencia codifica un polipéptido que presenta la actividad biológica del polipéptido denominado podocina de secuencia SEC ID nº 2; o
- ii)
- una secuencia que codifica el polipéptido, como se define en la reivindicación 2 ó 3.
7. Vector de clonación y/o de expresión que
contiene un ácido nucleico, de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1, 4, 5 o 6.
8. Célula huésped transfectada por un vector de
acuerdo con la reivindicación 7.
9. Ácido nucleico constituido por una secuencia
seleccionada entre las secuencias SEC ID nº 11 a SEC ID nº 27.
10. Procedimiento de producción de un
polipéptido recombinante podocina, en el que un vector que contiene
un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 se
transfiere a una célula huésped, que se cultiva en condiciones que
permiten la expresión del polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 3, respectivamente.
11. Anticuerpo dirigido contra el polipéptido
como se define en la reivindicación 2 ó 3.
12. El uso de al menos un anticuerpo de acuerdo
con la reivindicación 11 para detectar o purificar un polipéptido
como se define en la reivindicación 2 ó 3 en una muestra
biológica.
13. El uso de al menos un ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 1, 4, 5 ó 6 para detectar una anomalía
en el gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o, en su transcrito,
definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 5 ó 6.
14. Procedimiento de diagnóstico in vitro
de un síndrome nefrótico corticorresistente, que comprende las
etapas constituidas por:
- a1)
- poner en contacto una muestra biológica que contiene el ADN con oligonucleótidos específicos que permitan la amplificación de todo o parte del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1;
- b1)
- amplificar dicho ADN;
- c1)
- detectar los productos de amplificación;
- d1)
- comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho gen NPHS2, indicadora de un síndrome nefrótico corticorresistente
o, según una alternativa,
- a2)
- poner en contacto una muestra biológica que contiene el ARN con oligonucleótidos específicos que permitan la amplificación de todo o parte del transcrito del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6;
- b2)
- amplificar dicho ARN;
- c2)
- detectar los productos de amplificación;
- d2)
- comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho transcrito del gen NPHS2, indicadora de un síndrome nefrótico corticorresistente.
15. Composición farmacéutica que comprende un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, o un ácido
nucleico que codifica dicho polipéptido, en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación
2 ó 3, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, para su
uso en el tratamiento de enfermedades renales, particularmente de un
síndrome nefrótico corticorresistente.
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