ES2342255T3 - Gen nphs2 implicado en el sindrome nefrotico corticorresistente. - Google Patents

Gen nphs2 implicado en el sindrome nefrotico corticorresistente. Download PDF

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ES2342255T3 ES01907652T ES01907652T ES2342255T3 ES 2342255 T3 ES2342255 T3 ES 2342255T3 ES 01907652 T ES01907652 T ES 01907652T ES 01907652 T ES01907652 T ES 01907652T ES 2342255 T3 ES2342255 T3 ES 2342255T3
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Abstract

Ácido nucleico aislado, cuya secuencia se selecciona de la SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10, que representa un fragmento del ADN genómico del gen humano designado NPHS2.

Description

Gen NPHS2 implicado en el síndrome nefrótico corticorresistente.
En este documento se describe un nuevo gen, denominado NPHS2, que codifica una proteína implicada en el síndrome nefrótico corticorresistente.
El síndrome nefrótico idiopático es una patología que aparece principalmente en la infancia, y que se caracteriza por una proteinuria masiva, y cambios histológicos no específicos del riñón incluyendo a veces una glomeruloesclerosis segmentaria y focal (FSGS). Estas características están asociadas con una desaparición difusa de los pedicelos de los podocitos observado a microscopía electrónica (Broyer y col., 1998), revelador de síndromes nefróticos cualquiera que sea su causa. La mayoría de los casos responden a una terapia a base de esteroides y tienen un buen pronóstico, pero aproximadamente el 20% son resistentes a los esteroides y evolucionan hacia la insuficiencia renal terminal, conduciendo a una glomeruloesclerosis completa. Se habla entonces de síndrome nefrótico corticorresistente.
La ultrafiltración de las macromoléculas del plasma durante la formación de la orina primaria en el glomérulo es una de las principales funciones del riñón humano. La pared capilar estructuralmente compleja responsable de esta función esta compuesta por una membrana basal cubierta por un endotelio fenestrado sobre su superficie interna y por células epiteliales especializadas (podocitos) que forman pedicelos sobre la superficie externa. Se observa en un gran número de enfermedades adquiridas o hereditarias una disfunción del filtro glomerular resultante de una pérdida excesiva de proteínas plasmáticas, lo cual conduce a un síndrome nefrótico, y después quizás a una insuficiencia renal terminal.
El estudio de enfermedades genéticas que afectan a la barrera de filtración proporciona modelos útiles para comprender la fisiopatología del proceso de filtración glomerular. Se han descrito algunas de estas afecciones hereditarias con proteinuria y síndrome nefrótico. La más grave es el síndrome nefrótico congénito de tipo finlandés (CNF), que es una enfermedad recesiva autosómica, con una proteinuria masiva en el útero, un síndrome nefrótico al nacer que conduce habitualmente a una insuficiencia renal terminal durante los dos primeros años de vida. El CNF está provocado por mutaciones en el gen NPHS1 (Kestilä, 1998). Por otro lado, se han descrito casos de proteinuria familiar o de síndrome nefrótico con lesiones histológicas de glomeruloesclerosis segmentaria y focal (FSGS) en pacientes más mayores, en particular adultos. Se han cartografiado dos locus genéticos para la FSGS dominante autosómica, respectivamente, sobre el locus 19q13 próximo al locus del gen NPHS1 (Mathis y col., 1998) y sobre el locus 11q21-q22 (Winn y col., 1999).
En 1995, una nueva entidad de síndrome nefrótico corticorresistente de transmisión autosómica recesiva se caracterizó de acuerdo con los siguientes criterios: comienzo precoz entre tres meses y cinco años, resistencia a una terapia a base de esteroides, evolución hacia la insuficiencia renal terminal antes de la edad de diez años, ausencia de recidiva después del trasplante renal y ausencia de cualquier desorden extra-renal. Histológicamente, sólo se observan modificaciones mínimas en las biopsias precoces aunque generalmente se presenta una FSGS en estadios posteriores. Un locus genético implicado en este síndrome nefrótico corticorresistente se ha cartografiado en la región 1q25-q31 entre los marcadores D1S452 y D1S466, extendiéndose esta región sobre aproximadamente 12 cM (Fuchshuber, 1995). Otro equipo (Lench y col.., 1998) ha confirmado esta localización y, más recientemente, también se ha demostrado una relación de esta región en una familia que presenta una FSGS que comienza en la edad adulta (Tsukaguchi y col., 1999).
Los autores de la presente invención han conseguido ahora identificar de manera precisa un nuevo gen implicado en la entidad del síndrome nefrótico corticorresistente descrito anteriormente. En principio, este gen se ha denominado SRN1 y después se ha renombrado como NPHS2.
Adjunto a este documento se encuentra una lista de secuencias, en la cual la secuencia SEC ID nº 1 representa el fragmento de ADNc del gen NPHS2 en el ser humano correspondiente a la fase de lectura abierta (ORF). Este ORF contiene 1149 bases y codifica una proteína de 383 aminoácidos, denominada podocina, cuya secuencia se presenta la SEC ID nº 2.
Las secuencias SEC ID nº 3 a SEC ID nº 10 representan fragmentos del ADN genómico del gen NPHS2 humano que incluye respectivamente 8 exones (en negrita en el listado adjunto), como se indica a continuación:
SEC ID nº 3:
Hay 683 pares de bases delante de ATG. Los clones de ADNc obtenidos explorando un banco de ADNc de riñón fetal humano (banco Clontech clonado en el fago \lambdagt11) comienzan generalmente entre las bases 615 y 619. Hay 274 pares de bases de ATG en el sitio del corte y empalme (exón 1), después 147 pares de bases de secuencias intrónicas.
SEC ID nº 4:
Hay 151 pares de bases intrónicas, después 104 pares de bases de codificación (exón 2), después 123 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 5:
Hay 336 pares de bases intrónicas, después 73 pares de bases de codificación (exón 3), después 291 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 6:
Hay 187 pares de bases intrónicas, después 83 pares de bases de codificación (exón 4), después 90 pb intrónicas.
SEC ID nº 7:
Hay 250 pares de bases intrónicas, después 204 pares de bases de codificación (exón 5), después 195 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 8:
Hay 367 pares de bases intrónicas, después 56 pares de bases de codificación (exón 6), después 169 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 9:
Hay 327 pb intrónicas, después 79 pares de bases de codificación (exón 7), después 310 pares de bases intrónicas.
SEC ID nº 10:
Hay 285 pares de bases intrónicas, después 911 pares de bases de secuencia de ADNc hasta el sitio de poliadenilación utilizado (exón 8). El codón de terminación está en la posición 562, después 109 pares de bases de secuencias genómicas complementarias que incluyen los otros sitios de poliadenilación potenciales.
La secuencia SEC ID nº 11 abarca una parte del exón 5, los exones 6 y 7 y una gran parte del exón 8 (de la base 9792 del ADNc).
Las secuencias SEC ID nº 12 a nº 27 son cebadores utilizados para amplificar secuencias humanas.
La secuencia SEC ID nº 28 es la secuencia del ADNc de podocina de rata, siendo la secuencia SEC ID nº 29 la secuencia de aminoácidos correspondiente. La presente invención se refiere a un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones 1, 4, 5, 6 y 9.
Por otro lado, se describe un ácido nucleico aislado, cuya secuencia se selecciona entre la SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10, o una secuencia homóloga, definida como
i)
una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10; o
ii)
una secuencia que híbrida con la secuencia SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10 o sus secuencias complementarias, en condiciones de hibridación rigurosas.
La presente invención también tiene por objeto un ácido nucleico aislado, que comprende la secuencia SEC ID nº 1 o 28, o una secuencia homóloga, definida como
i)
una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 1; o
ii)
una secuencia que híbrida con la secuencia SEC ID nº 1 o su secuencia complementaria, en condiciones de hibridación rigurosas, o
iii)
una secuencia que codifica el polipéptido, denominado podocina, como se define anteriormente.
Preferentemente, una secuencia de nucleótidos homóloga de acuerdo con la invención es idéntica a al menos el 75% de la secuencia SEC ID nº 1, más preferentemente a al menos el 85%, o a al menos el 90%.
De manera preferente, una secuencia de nucleótidos homóloga hibrida específicamente con secuencias complementarias de las secuencias SEC ID nº 1, 3 a 10, y 28 en condiciones rigurosas. Los parámetros que definen las condiciones de rigurosidad dependen de la temperatura a la cual se separan el 50% de las cadenas emparejadas (Tm).
Para las secuencias que comprenden más de 30 bases, Tm se define por la relación: Tm=81,5+0,41(%G+C)+
16,6Log(concentración de cationes)-0,63(% de formamida)-(600/número de bases) (Sambrook y col., 1989).
Para las secuencias de longitud inferior a 30 bases, Tm se define por la relación: Tm=4(G+C)+2(A+T).
En condiciones de rigurosidad apropiadas, en las que las secuencias específicas no hibridan, la temperatura de hibridación es de aproximadamente 5 a 30ºC, preferentemente de 5 a 10ºC inferior a la Tm, y los tampones de hibridación utilizados son preferentemente
\hbox{soluciones de fuerza iónica elevada, tal
como, por ejemplo,  una solución de SSC 6x.}
Una secuencia de nucleótidos homóloga a la ORF representada en la SEC ID nº 1 ó 28 incluye cualquier secuencia de nucleótidos que difiere la SEC ID nº 1 ó 28 por mutación, inserción, deleción o sustitución de una o más bases, o por la degeneración del código genético, siempre que codifique un polipéptido que presente la actividad biológica de la podocina, como se define a continuación.
Entre dichas secuencias homólogas se incluyen las secuencias de genes de mamíferos distintas de las del ser humano, que codifican la podocina, preferentemente de un primate, bovino, ovino o porcino, o también un roedor, así como las variantes alélicas o secuencias polimórficas.
La siguiente tabla presenta un determinado número de polimorfismos identificados en el gen NPHS2:
\vskip1.000000\baselineskip
Polimorfismos identificados en el gen NPHS2
1
La presente invención también tiene por objeto un polipéptido aislado como se define en la reivindicación 2 ó 3.
También se describe en este documento un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2 ó 29, o una secuencia homóloga, definida como
i)
una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 2 ó 29; o
ii)
una secuencia codificada por una secuencia de ácido nucleico homóloga como se define en la reivindicación 2 ii), es decir una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la SEC ID nº 2 ó 29 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación.
Más generalmente, por "secuencia homóloga de aminoácidos" se entiende cualquier secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia SEC ID nº 2 ó 29 por sustitución, deleción y/o inserción de un aminoácido o de un número reducido de aminoácidos, particularmente por sustitución de aminoácidos naturales por aminoácidos no naturales o pseudoaminoácidos en posiciones tales que estas modificaciones no perjudiquen significativamente a la actividad biológica de la podocina.
Dichas sustituciones son preferentemente sustituciones conservativas, es decir, sustituciones de aminoácidos de la misma clase, tales como sustituciones de aminoácidos de cadenas laterales no cargadas (tales como asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina), aminoácidos de cadenas laterales básicas (tales como lisina, arginina e histidina), aminoácidos de cadenas laterales ácidas (tales como ácido aspártico y ácido glutámico) aminoácidos de cadenas laterales apolares (tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína).
Preferentemente, dicha secuencia de aminoácidos homóloga es idéntica al menos al 85% de la secuencia SEC ID nº 2 ó 29, preferentemente al menos al 95%.
La homología se determina generalmente utilizando un programa de análisis de secuencia (por ejemplo, Secuence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Las secuencias de aminoácidos similares están alineadas para obtener el máximo grado de homología (es decir, de identidad). Con este fin, puede ser necesario introducir de manera artificial huecos ("gaps") en la secuencia. Una vez realizado el alineamiento óptimo, se establece el grado de homología (es decir, de identidad) registrando todas las posiciones para las cuales los aminoácidos de dos secuencias comparadas son idénticos, con respecto al número total de posiciones.
"La actividad biológica de la podocina" se refiere al mantenimiento de la integridad del filtro glomerular. La ausencia o la modificación de la podocina provoca la filtración de proteínas a nivel del glomérulo y por consiguiente la aparición de proteinuria.
El polipéptido de la presente invención puede sintetizarse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos por el experto en la materia. El polipéptido de la invención puede sintetizarse, por ejemplo, por técnicas de síntesis química, tales como la síntesis de tipo Merrifield que es ventajosa por razones de pureza, especificidad antigénica, ausencia de productos secundarios no deseados y por su facilidad de producción.
Una podocina recombinante también puede producirse mediante un procedimiento, en el que un vector que contiene un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC ID nº 1 ó nº 28 o una secuencia homóloga se transfiere a una célula huésped que se cultiva en condiciones que permiten la expresión del polipéptido correspondiente.
La podocina producida puede después recuperarse y purificarse.
El experto en la materia conoce los procedimientos de purificación utilizados. El polipéptido recombinante obtenido puede purificarse partir de lisados y extractos celulares, del sobrenadante del medio de cultivo, por procedimientos utilizados individualmente o en combinación, tales como fraccionamiento, procedimientos cromatográficos, técnicas de inmunoafinidad usando anticuerpos mono- o policlonales específicos, etc.
La secuencia de ácido nucleico de interés, que codifica la podocina, puede insertarse en un vector de expresión, en el cual la secuencia está unida operativamente a elementos que permiten regular su expresión, tales como particularmente promotores, activadores y/o terminadores de la transcripción.
Las señales que controlan la expresión de las secuencias de nucleótidos (promotores, activadores, secuencias de terminación, ...) se seleccionan en función del huésped celular utilizado. A este efecto, las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónoma dentro del huésped seleccionado, o en vectores integradores del huésped seleccionado. Dichos vectores se prepararán de acuerdo con los procedimientos normalmente utilizados por el experto en la materia, y los clones resultantes pueden introducirse en un huésped apropiado por procedimientos
\hbox{convencionales, tales como por ejemplo, electroporación 
o precipitación con fosfato de calcio.}
Los vectores de clonación y/o de expresión de acuerdo con la reivindicación 7 también forman parte de la presente invención.
La invención también se refiere a células huésped transfectadas, de manera transitoria o estable, por estos vectores de expresión. Estas células pueden obtenerse introduciendo en células huésped, eucariotas o procariotas, una secuencia de nucleótidos insertada en un vector tal como se define anteriormente y después cultivando dichas células en condiciones que permitan la replicación y/o la expresión de la secuencia de nucleótidos transfectada.
Los ejemplos de células huésped incluyen particularmente células de mamíferos, tales como las células COS-7, 293, MDCK, células de insectos tales como las células SF9, de bacterias tales como E. coli y cepas de levaduras tales como YRG2.
Las diferentes secuencias de nucleótidos descritas en este documento pueden ser o no de origen artificial. Puede tratarse de secuencias de ADN o de ARN, obtenidas explorando bancos de secuencias por medio de sondas elaboradas basándose en las secuencias SEC ID nº 1 ó 28 y 3 a 10. Dichos bancos pueden prepararse por técnicas clásicas de biología molecular, conocidas por el experto en la materia.
Las secuencias de nucleótidos descritas en este documento también pueden prepararse por síntesis química o incluso por procedimientos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas explorando bancos.
Estas secuencias de nucleótidos permiten realizar sondas o cebadores, que hibridan específicamente con una secuencia SEC ID nº 1 ó 28, ó de 3 a 10, de acuerdo con la invención, o su cadena complementaria. Las condiciones de hibridación apropiadas corresponden a las condiciones de temperatura y de fuerza iónica normalmente utilizadas por el experto en la materia, preferentemente en condiciones rigurosas tales como las definidas anteriormente. Estas sondas también pueden utilizarse como herramienta de diagnóstico in vitro para detectar, por experimentos de hibridación, particularmente de hibridación "in situ", transcritos específicos del polipéptido de la invención en muestras biológicas o para poner de manifiesto síntesis aberrantes o anomalías genéticas resultantes de un polimorfismo, mutaciones o un mal corte y empalme.
Los ácidos nucleicos de la invención útiles como sondas incluyen como mínimo 10 nucleótidos, preferentemente al menos 20 nucleótidos, más preferentemente al menos 100 nucleótidos. Los ácidos nucleicos útiles como cebadores incluyen como mínimo 10 nucleótidos, preferentemente al menos 14 nucleótidos y preferentemente menos de 40 nucleótidos.
Más precisamente, en este documento se describe un ácido nucleico que tiene al menos 10 nucleótidos, que híbrida específicamente con una de las secuencias de ácido nucleico de SEC ID nº 1 ó 28, ó 3 a 10 o su cadena complementaria, en condiciones de hibridación rigurosas.
De manera ventajosa, como sonda puede utilizarse el ácido nucleico constituido por la secuencia SEC ID nº 11, que abarca una parte del exón 5, los exones 6 y 7 y una gran parte del exón 8 (de la base de 728 a la base 1792 del ADNc).
Por otro lado, para una amplificación (por ejemplo, por PCR) pueden utilizarse, como cebador, los ácidos nucleicos constituidos por las secuencias de la SEC ID nº 12 a la SEC ID nº 27.
Preferentemente, las sondas o los cebadores de la invención se marcan antes de su uso. Para esto, el experto en la materia dispone de varias técnicas, como por ejemplo el marcaje fluorescente, radiactivo, quimioluminiscente o enzimático.
En la presente invención se incluyen procedimientos de diagnóstico in vitro en los que se aplican estos oligonucleótidos para la detección de mutaciones o transformaciones genómicas, a nivel del gen NPHS2.
El experto en la materia conoce bien los procedimientos convencionales para analizar el ADN contenido en una muestra biológica y para diagnosticar un trastorno genético. Están disponibles numerosas estrategias de análisis genotípico (Antonarakis y col., 1989, Cooper y col., 1991).
Preferentemente, para detectar una anomalía en el gen NPHS2, puede utilizarse el procedimiento DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante), el procedimiento de SSCP (polimorfismo de conformación de cadena sencilla) o el procedimiento DHPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante; Kuklin y col. 1997; Huber y col., 1995). Preferentemente, después de estos procedimientos se realiza una secuenciación directa. El procedimiento de RT-PCR puede realizarse ventajosamente para detectar anomalías en el transcrito de NPHS2, porque permite visualizar las consecuencias de una mutación de corte y empalme que provoca la pérdida de 1 o más exones a nivel del transcrito, o un corte y empalme aberrante debido a la activación de un sitio críptico. Preferentemente, también después de este procedimiento se realiza una secuenciación directa. Los procedimientos desarrollados más recientemente que utilizan microplacas de ADN también pueden aplicarse para detectar una anomalía en el gen NPHS2 (Bellis y col., 1997).
La clonación del gen NPHS2 así como la identificación de diversas mutaciones responsables del síndrome nefrótico corticorresistente permiten contemplar diagnósticos directos. La especificidad y la fiabilidad de dichos procedimientos de diagnóstico son particularmente apreciables para un diagnóstico prenatal. Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento representan una herramienta particularmente interesante para el asesoramiento genético.
Por lo tanto, la presente invención tiene por tanto la utilización de acuerdo con la reivindicación 13.
Por lo tanto, la invención tiene por objeto un procedimiento de diagnóstico in vitro de un síndrome nefrótico corticorresistente asociado a una mutación del gen NPHS2, que comprende las etapas constituidas por:
a1)
poner en contacto una muestra biológica que contenga el ADN con oligonucleótidos específicos que permitan la amplificación de todo o parte del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico, de acuerdo con la reivindicación 1;
b1)
amplificar dicho ADN;
c1)
detectar los productos de amplificación;
d1)
comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho gen NPHS2, indicadora de un síntoma nefrótico corticorresistente asociado a una mutación en el gen NPHS2;
\vskip1.000000\baselineskip
o, de acuerdo con una alternativa,
a2)
poner en contacto una muestra biológica que contenga el ARN con oligonucleótidos específicos que permitan la ampliación de todo o parte del transcrito del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6;
b2)
amplificar dicho ARN;
c2)
detectar los productos de amplificación;
d2)
comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho transcrito del gen NPHS2, indicadora de un síntoma nefrótico corticorresistente, asociado a una mutación del gen NPHS2.
También forman parte de la invención los ácidos nucleicos aislados constituidos por una secuencia diferente de la secuencia SEQ ID nº 1 por una mutación, inserción o deleción, particularmente en al menos una de las posiciones de los nucleótidos 481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607 y 940 o también 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571, 572, 583, 783, 794 y 848, a reserva de que dicho ácido nucleico aislado esté implicado en un síndrome nefrótico corticorresistente.
Entre las mutaciones ya identificadas, se destacan particularmente las siguientes, presentadas en las tablas 1 y 2.
TABLA 1 Mutaciones en el gen NPHS2
3
No se han vuelto a encontrar mutaciones en 40 controles
\newpage
TABLA 2 Otras mutaciones en el gen NPHS2
5
No se han vuelto a encontrar mutaciones en 40 controles.
Estos ensayos pueden aprovecharse particularmente en familias que ya tienen un niño afectado, para el diagnóstico presintomático (en particular diagnóstico prenatal).
En los casos esporádicos, la detección de una mutación del gen NPHS2 permite modificar el tratamiento (y en particular evitar tratamientos inmunosupresores que serán ineficaces) y predecir la ausencia de recidiva después del trasplante renal.
Este ensayo diagnóstico también puede servir para investigar la asociación de determinadas variantes polimórficas de la podocina en otras patologías que implican anomalías secundarias del filtro glomerular (nefropatía diabética, nefropatía del SIDA, reducción nefrónica, hipertensión arterial). Estas variantes podrían representar factores de susceptibilidad en el desencadenamiento o progresión de la nefropatía en estas enfermedades.
La invención también tiene por objeto anticuerpos dirigidos contra el polipéptido podocina tal como se define en la reivindicación 2 ó 3.
Se puede tratar de anticuerpos poli- o monoclonales o de sus fragmentos, anticuerpos quiméricos, particularmente humanizados o inmunoconjugados.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse a partir del suero de un animal inmunizado contra un polipéptido de acuerdo con los modos operativos usuales.
De acuerdo con un modo de realización de la invención, se puede utilizar como antígeno un fragmento peptídico apropiado, que puede acoplarse por medio de un resto radioactivo a una proteína o a otro péptido. Se inmunizaron conejos con el equivalente de 1 mg del antígeno peptídico de acuerdo con el procedimiento descrito por Benoit et al. (1982). A intervalos de cuatro semanas, los animales se trataron mediante inyecciones de 200 \mug de antígeno y de 10 a 14 días más tarde se desangraron. Después de la tercera inyección, el antisuero se examinó para determinar su capacidad para unirse al péptido antigénico radiomarcado con yodo, preparado por el procedimiento de cloramina-T y a continuación se purificó mediante una cromatografía en columna de intercambio iónico de carboximetil celulosa (CMC). A continuación, las moléculas de anticuerpo se recogieron en los mamíferos y se aislaron hasta la concentración deseada por procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, utilizando DEAE Sephadex para obtener la fracción de IgG.
Con objeto de aumentar la especificidad del suero policlonal, los anticuerpos pueden purificarse mediante una cromatografía de inmunoafinidad utilizando polipéptidos que inmunizan en fase sólida. Los anticuerpos se ponen en contacto con el polipéptido que inmuniza en fase sólida durante un tiempo suficiente de manera que se hace inmuno-reaccionar el polipéptido con la molécula de anticuerpo para formar un complejo inmunológico en fase
sólida.
A modo de ejemplo, se han producido anticuerpos policlonales en el conejo contra dos proteínas recombinantes que comprenden los fragmentos de los aminoácidos 15 a 89 y 135 a 383 de la podocina, acoplados a seis restos histidina del extremo N-terminal, habiéndose subclonado los ADNc en el vector PQ E32 (Quiagen) y expresado en E. coli.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de acuerdo con el procedimiento clásico de cultivo de hibridomas descrito por Köhler y Milstein (1975).
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fab y F(ab')2. También pueden presentarse en forma de immunoconjugados o de anticuerpos marcados.
Los anticuerpos de la invención, en particular los anticuerpos monoclonales, pueden utilizarse particularmente para análisis por inmunohistoquímica de la podocina sobre cortes de tejidos específicos, por ejemplo, por inmunofluorescencia, marcaje con oro, inmunoperoxidasa...
Los anticuerpos así producidos también pueden utilizarse ventajosamente en cualquier situación en la que deba observarse la expresión de la podocina.
La invención también tiene por objeto el uso de al menos un anticuerpo, de acuerdo con la reivindicación 11, para la detección o purificación de un polipéptido tal como se define en la reivindicación 2 ó 3 en una muestra
biológica.
Más precisamente, en este documento se describe un procedimiento in vitro para la detección o la medición del índice de expresión de la podocina en una muestra biológica, que comprende poner en contacto al menos un anticuerpo como se define anteriormente con dicha muestra biológica en condiciones que permitan la posible formación de complejos inmunológicos específicos entre la podocina y el o dichos anticuerpos, y detectar los complejos inmunológicos específicos posiblemente formados. La puesta a punto de dicho ensayo (de tipo ELISA por ejemplo) podría ser particularmente útil para investigar el desarrollo de anticuerpos anti-podocina después del trasplante renal, en determinadas enfermedades renales autoinmunes, incluso en el síndrome nefrótico corticosensible.
También se describe un kit para aplicar este procedimiento que comprende:
-
al menos un anticuerpo específico de la podocina, posiblemente fijado sobre un soporte;
-
medios de revelación de la formación de complejos antígenos/anticuerpos específicos entre la podocina y dicho anticuerpo y/o medios de cuantificación de estos complejos.
La invención también tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende un polipéptido podocina tal como se define en la reivindicación 2 ó 3, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los modos de administración, las posologías y las formas galénicas de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención, que contienen al menos un polipéptido, pueden determinarse de la manera habitual por el experto en la materia, particularmente de acuerdo con los criterios generalmente tomados en cuenta para establecer un tratamiento terapéutico adaptado a un paciente, como por ejemplo la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios constatados, etc.
De manera general, puede administrarse a adultos humanos una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz que varía de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1 mg.
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También se describe una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico como se describe anteriormente, que codifica un polipéptido con actividad de podocina y un vehículo farmacéuticamente aceptable, destinándose dicha composición para utilizarse en terapia génica. El ácido nucleico preferentemente insertado en un vector generalmente viral (tal como adenovirus y retrovirus) puede administrarse en forma desnuda, exento de cualquier vehículo que favorezca la transferencia a la célula diana, tal como liposomas aniónicos, lípidos catiónicos, micropartículas, por ejemplo micropartículas de oro, agentes de precipitación, por ejemplo, fosfato de calcio, o cualquier otro agente que facilite la transfección. En este caso, el polinucleótido puede diluirse simplemente en una solución fisiológicamente aceptable, tal como una solución estéril o una solución estéril taponada en presencia o ausencia de un
vehículo.
De manera alternativa, un ácido nucleico de la invención puede asociarse a agentes que faciliten la transfección. Puede estar, entre otras cosas, (i) asociado a un agente químico que modifica la permeabilidad celular, tal como la bupivacaína; (ii) encapsulado en liposomas, posiblemente en presencia de sustancias complementarias que facilitan la transfección; o (iii) asociado a lípidos catiónicos o micropartículas de sílice, de oro o de tungsteno.
Cuando las construcciones de ácido nucleico de la invención recubren micropartículas, éstas pueden inyectarse por vía intradérmica o intraepidérmica por la técnica del bombardeo de genes, "gene gun" (documento WO 94/24263).
La cantidad a utilizar como medicamento depende particularmente de la propia construcción del ácido nucleico, del individuo al cual se administra este ácido nucleico, del modo de administración y del tipo de formulación, y de la patología. De manera general, puede administrarse a adultos humanos una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz que varía de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1 mg, preferentemente de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 800 \mug y, de manera preferente de aproximadamente 25 \mug a aproximadamente
250 \mug.
Las construcciones de ácidos nucleicos de la invención pueden administrarse por cualquier vía de administración convencional tal como particularmente por la vía parenteral. La elección de la vía de administración depende en particular de la formulación seleccionada. Una administración diana en el tejido renal, en particular en los glomérulos, puede ser particularmente ventajosa.
El polipéptido de la invención o el ácido nucleico que codifica este polipéptido son útiles como medicamento, particularmente para el tratamiento de una enfermedad renal, en particular para el tratamiento de un síndrome nefrótico corticorresistente asociado a una mutación del gen NPHS2 o que se produce en el marco de una enfermedad general (SIDA, diabetes ...).
También se describe un procedimiento de tratamiento terapéutico, en el cual se administra a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un polipéptido podocina tal como se define anteriormente o un ácido nucleico que codifica este polipéptido.
El paciente en cuestión es generalmente un ser humano, pero la solicitud también puede extenderse a cualquier mamífero si fuera necesario.
Los ejemplos siguientes, así como la figura adjunta, ilustran la invención sin limitar su alcance.
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Leyenda de la figura
La figura adjunta es un mapa de la región NPHS2. La región candidata de 2,5 Mb está delimitada por los marcadores D1S1640 y 183f10-CA. En el mapa se indica la posición de los marcadores polimórficos y de las secuencias STS (en negrita e itálica) y las secuencias ETS únicas y agrupaciones UniGene de EST (en letra normal). Los YAC, PAC y cósmidos se representan por líneas. Los genes se indican por cuadros rayados. El NGAP está representado por dos cuadros separados por una línea horizontal que simboliza la presencia de exones cortados y empalmados de manera alternativa en posición 5', probablemente debido a un promotor alternativo. El RPS14P, un pseudogen de la proteína ribosomal S14, se localiza en el interior del intrón de NGAP.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Identificación del gen NPHS2
El enfoque utilizado por los autores de la presente invención para identificar el gen NPHS2 ha sido definir el intervalo genético mínimo en el que se situaba el gen, después establecer el mapa físico de la región construyendo un cóntigo de PAC que abarca la región, hacer el inventario de los genes conocidos y los EST de la región y caracterizar los EST (por RACE-PCR y selección del banco de ADNc de riñón fetal).
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1. Cartografía física de la región candidata y localización del gen NPHS2
Un análisis de unión usando marcadores microsatélites (Dib et al., 1996), así como nuevas familias de pacientes, ha permitido localizar el locus NPHS2 entre los marcadores D1S480 y D1S2883. Se ha construido un cóntigo de YAC (20 clones) que abarca la región entre estos dos marcadores. También se ha construido un cóntigo de cromosomas artificiales P1 (PAC) para abarcar esta región estimada en aproximadamente 3 Mb. Otros marcadores microsatélites también se han podido caracterizar en este cóntigo. Dos familias que presentan eventos de recombinación han permitido localizar de manera exacta el locus de la enfermedad entre D1S1640 y 183F10CA, nuevo marcador microsatélite identificado por secuenciación de subclones de la región. El cóntigo 35 PAC entre estos dos marcadores abarca aproximadamente de 2 a 2,5 Mb, pero contiene 5 espacios parcialmente rellenados por 14 cósmidos.
Los autores de la invención también han localizado sobre este cóntigo, investigando en los bancos de datos las secuencias potencialmente localizadas en la región y secuenciando los extremos de los YAC, de los PAC y de los cósmicos, así como de subclones de diferentes PAC que contienen potencialmente islotes CpG, genes ya conocidos, agrupaciones de EST (UniGene) y EST independientes.
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2. Identificación del gen NPHS2
Consultando la base de datos del Sanger Centre, se ha descubierto que el PAC 545A16 contenía el marcador D1S215 localizado cerca del límite telomérico de la región de interés así como el EST AA398634, que provenía de un banco de testículo y contenía secuencias cortas débilmente homólogas al gen de la estomatina, pero curiosamente, a priori, en sentido opuesto al EST. Los autores de la invención han localizado por tanto este EST en el cósmido 28e17 y en el PAC 302d13 y han demostrado por RT-PCR que se expresaba en el riñón.
Después han sido necesarios múltiples ensayos de RACE-PCR para obtener un ADNc a partir de este EST. En efecto, los productos obtenidos correspondían, en la mayoría de los experimentos, a ADN genómicos que aparecían sin empalmes. Sin embargo, uno de los productos obtenidos correspondía a un transcrito que contenía una corta fase de lectura abierta y homólogo a seis EST (agrupación Unigene Hs. 192657), provenientes todos de un banco de riñón humano, pero que no se había localizado en el genoma. De hecho, se comprueba que los EST del agrupamiento Unigene Hs. 254975 al cual pertenece el EST AA398634 parecen pertenecer a otro gen o pseudogen cuyo sentido de la transcripción es opuesto al NPHS2 y que solapa parcialmente con la secuencia 3' de NPHS2, lo que explica los datos proporcionados por los bancos de datos relativos al EST AA398634. Utilizando este producto de RACE-PCR descrito anteriormente como sonda para hibridar una transferencia de Northern que contiene ARN de diferentes tejidos, se ha demostrado que este trascrito de aproximadamente 2 kb se expresaba solamente en el riñón. Estos resultados se han confirmado hibridando una transferencia puntual que contenía ARN de 50 tejidos diferentes (Clontech). Se obtuvo una señal intensa solamente con el riñón adulto y el riñón fetal. La localización de este gen en el cóntigo y su expresión casi exclusiva en el riñón hacían de este gen un excelente gen candidato, hipótesis reforzada por la casi ausencia del producto de amplificación por RT-PCR, utilizando cebadores situados a la vez en la parte 5' y en la parte 3' del ADNc, con el ARN extraído del riñón de un paciente terminal. El ADNc completo del gen NPHS2 se ha clonado por corte y empalme de un banco de ADNc de riñón fetal humano con la sonda utilizada para hibridar la transferencia de Northern (Secuencia ID nº 11).
Las uniones intrones-exones y las secuencias genómicas aguas arriba del exón 1 se han obtenido por secuenciación directa de PAC 302d13 y del cósmido 28e17.
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Ejemplo 2
Identificación de mutaciones en familias de pacientes
Los autores de la invención que han caracterizado la estructura intrón-exón del gen, han continuado investigando después por SSCP ("Polimorfismo Conformacional Monocatenario") mutaciones en 16 pacientes no emparentados que presentan un síndrome nefrótico corticorresistente familiar tal como se describe anteriormente (inicio precoz, evolución rápida hacia la insuficiencia renal terminal, sin recidiva después del implante y lesiones de glomeruloesclerosis segmentaria y focal en las biopsias renales) y que pertenecen a familias en las que el estudio de haplotipos era compatible con una relación en el locus NPHS2.
Para este análisis SSCP, los exones se amplificaron por PCR utilizando cebadores intrónicos flanqueantes. Las condiciones de PCR y los cebadores se seleccionaron utilizando el programa Oligo 5.0 (NBI) y eran los siguien-
tes:
exón 1, 5'-GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT-3' (SEC ID nº 12) y 5'-TCA GTG GGT CTC GTG GGG AT-3' (SEQ ID nº 13);
exón 2, 5'-AGG CAG TGA ATA CAG TGA AG-3' (SEC ID nº 14) y 5'-GGC CTC AGG AAA TTA CCT A-3' (SEQ ID nº 15);
exón 3, 5'-TTC TGG GAG TGA TTT GAA AG-3' (SEC ID nº 16) y 5'-TGA AGA AAT TGG CAA GTC AG-3' (SEQ ID nº 17);
exón 4, 5'- AAG GTG AAA CCC AAA CAG C -3' (SEC ID nº 18) y 5'-CGG TAG GTA GAC CAT GGA AA-3' (SEC ID nº 19);
exón 5, 5'-CAT AGG AAA GGA GCC CAA GA-3' (SEC ID nº 20) y 5-TTT CAG CAT ATT GGC CAT TA-3' (SEC ID nº 21);
exón 6, 5'-CTC CCA CTG ACA TCT GA-3' (SEC ID nº 22) y 5'-AAT TTA AAA TGA AAC CAG AA-3' (SEC ID nº 23);
exón 7, 5'-CTA AAT CAT GGC TGC ACA CC-3' (SEC ID nº 24) y 5'-CTT CCT AAA GGG CAG TCT GG-3' (SEC ID nº 25);
exón 8, 5'-GGT GAA GCC TTC AGG GAA TG-3' (SEC ID nº 26) y 5'-TTC TAT GGC AGG CCC CTT TA-3' (SEC ID nº 27);
a temperaturas de hibridación de 50ºC (exón 6), 55ºC (exones 2, 3, 4 y 5), 60ºC (exones 1, 7 y 8). A razón de la gran cantidad de GC del exón 1, la PCR se efectuó utilizando la Taq polimerasa de Qiagen y la solución -Q de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, debido a su tamaño, el producto de PCR del exón 1 ha debido digerirse por la enzima SmaI en dos fragmentos antes de la electroforesis en gel. La migración se ha realizado durante dos horas a 600 V, 25 mA y 15 W con la unidad de electroforesis Genephor, utilizando el kit GeneGel Excel 12.5/24 (Pharmacia). La clonación se realizó con un colorante "Automated Gel Stainer GeneStain" utilizando el kit de tinción PlusOne Silver (Pharmacia).
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Resultados
Se observaron diez mutaciones diferentes. Algunas dan lugar a un desplazamiento de la fase de lectura o a la aparición de un codón de terminación prematuro y son por lo tanto mutaciones inactivadoras, lo que demuestra que el gen identificado es en efecto el gen NPHS2. Otras son mutaciones de sentido erróneo producidas en regiones muy conservadas de la proteína, que se segregan en las familias con la enfermedad y que no se han vuelto a encontrar en 80 cromosomas de control, lo que sugiere en gran medida que estas mutaciones son responsables del fenotipo en los niños afectados.
Una de las mutaciones de sentido erróneo (R138Q) se ha vuelto a encontrar en seis individuos no emparentados, pero que provenían de la misma parte de Europa, sugiriendo la posibilidad de un efecto fundador para esta mutación.
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Ejemplo 3
Estudio de la expresión del gen NPHS2 en el riñón por hibridación in situ Procedimiento
Secciones de riñón de 6 \mum cubiertas con parafina se separaron de su parafina y se rehidrataron y después se trataron con microondas en un tampón de citrato de sodio (0,01 M, pH 6) para aumentar la señal hibridación. Las ribosondas de NPHS2 se sintetizaron a partir del producto de PCR de 1065 pares de bases (posición 728 a 1792 del ANDc de NPHS2, SEQ ID nº 1) sub-clonado en el vector PGEM-Teasy. La sonda antisentido se sintetizó después de la digestión con SalI utilizando la polimerasa T7 y la sonda sentido después de la digestión con SaclI utilizando la polimerasa Sp6. Las ribosondas se marcaron con digoxigenina-11-UTP (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con [^{35}S]UTP como se describe en Sibony et al, 1995. Los experimentos de hibridación in situ se realizaron como se describe en Kalatzis et al. (1998) y Heidet et al. (1997) para sondas de digoxigenina-11-UTP y [35^{S}] UTP, respectivamente.
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Resultados
Estos experimentos de hibridación in situ han permitido demostrar que el gen NPHS2 se expresaba únicamente a nivel de los podocitos en el riñón maduro. En los riñones fetales, no se observó ninguna señal en las primeras fases del desarrollo de la nefrona. En cambio, se detectaron señales intensas en el segmento inferior del cuerpo en S, en la región correspondiente a futuros podocitos. Esta expresión persiste en los glomérulos inmaduros y en los glomérulos maduros del córtex profundo. Estos resultados que demuestran la expresión exclusiva del gen NPHS2 en los podocitos, a la vez precozmente durante el desarrollo y en los glomérulos maduros, están completamente de acuerdo con la patología observada, y justifican la denominación de "podocina" para la proteína codificada por el gen
NPHS2.
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Bibliografía
- Antonarakis S. E., Diagnosis of genetic disorders at the DNA level. N Engl J. Med. 320:153-163 (1989).
- Antonarakis, S. E., Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group. Hum. Mut. 11, 1-3 (1998).
- Bellis y col., medecine/sciences, 13:1317-24, (1997).
- Benoit y col., PNAS USA, 79, 917-921 (1982).
- Broyer M., Meyrier A., Niaudet P. & Habib R. Minimal changes and focal segmental glomerular sclerosis. In Oxford Textbook of Clinical Nephrology 2ª ed. (eds Davison A.M. y col.,) 493-535 (Oxford University Press, Inc., 1998).
- Cooper y col., Diagnosis of genetic disease using recombinant DNA, 3ª Edición Hum Genet., 87:519-560 (1991).
- Conton, P. J. y col., Clinical and pathologic features of familial focal segmental glomerulosclerosis. Am. J. Kidney Dis. 26, 34-40 (1995).
- Dib, C. y col., A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380, 152-154 (1996).
- Fuchshuber, A. y col., Mapping a gene (NPHS2) to chromosome 1 q25-q31 in idiopathic nephrotic syndrome confirms a distinct entity of autosomal recessive nephrosis. Hum. Mol. Genet. 4, 2155-2158 (1995).
- Heidet, L. y col., Diffuse leiomyomatosis associated with X-linked Alport syndrome: extracellular matrix study using immunohistochemistry and in situ hybridization. Lab. Invest. 76, 233-243 (1997).
- Huber, C. G. y col., Rapid and accurate sizing of DNA fragments by ion-pair chromatography on alkylated nonporous poly(styrenedivinylbenzene) particles. Anal. Chem. 67, 578-585 (1995).
- Kuklin, A. y col., Detection of single-nucleotide polymorphisms with the WAVE^{TM} DNA fragment analysis system. Genetic Testing 1, 201-206 (1997/98).
- Kalatzis, V., Sahly, I., El-Amraoui, A. & Petit, C. Eya1 expression in the developing ear and kidney: towards the understanding of the pathogenesis of Branchio-Oto-Renal (BOR) syndrome. Dev. Dyn. 213, 486-499 (1998).
- Kestilä, M. y col., Positionally cloned gene for a novel glomerular protein-nephrin-is mutated in congenital nephrotic syndrome. Mol. Cell 1, 575-582 (1998).
- Köhler y Milstein, Nature, 256, 495-497, (1975).
- Lench y col., Am. J. Hum. Genet. 63, A296 (1998).
- Mathis, B. J. y col., A locus for inherited focal segmental glomerulosclerosis maps to chromosome 19q13. Kidney. Int. 53, 282-286 (1998).
- Sambrook y col., Molecular cloning, a laboratory manual Spring Harbor Laboratory Press, 9.54-62 (1989).
- Tsukaguchi y col., Adult onset familial FSGS mapping to chromosome 1 q. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 443A (1999).
- Winn, M. P. y col., Linkage of a gene causing familial focal segmental glomerulosclerosis to chromosome 11 and further evidence of genetic heterogeneity. Genomics 58, 113-120 (1999).
<110> INSERM
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<120> Gen NPHS2 implicado en el síndrome nefrótico corticorresistente, proteína codificada por este gen y usos de diagnóstico y terapéuticos
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<130> BFF 99/0667
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<140>
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<141>
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<150> FR 0000709
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<151> 20-01-2000
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<160> 29
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1853
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (70) .. (1221)
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<400> 1
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7
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8
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9
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<210> 2
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<211> 383
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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10
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<210> 3
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<211> 1104
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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12
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<211> 378
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<210> 7
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<211> 649
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 9
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<211> 716
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 1305
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<212> ADN
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<210> 11
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<211> 1065
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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<210> 12
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gcagcgactc cacagggact
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tcagtgggtc tcgtggggat
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\hskip-.1em\dddseqskip
aggcagtgaa tacagtgaag
\hfill
20
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<210> 15
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
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ggcctcagga aattaccta
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<210> 16
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 16
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ttctgggagt gatttgaaag
\hfill
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<210> 17
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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tgaagaaatt ggcaagtcag
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20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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aaggtgaaac ccaaacagc
\hfill
19
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<210> 19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 19
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cggtaggtag accatggaaa
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<210> 21
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<212> ADN
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tttcagcata ttggccatta
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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ctcccactga catctga
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<210> 23
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 23
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aatttaaaat gaaaccagaa
\hfill
20
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<210> 24
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 24
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ctaaatcatg gctgcacacc
\hfill
20
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<210> 25
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 25
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cttcctaaag ggcagtctgg
\hfill
20
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<210> 26
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 26
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ggtgaagcct tcagggaatg
\hfill
20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 27
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ttctatggca ggccccttta
\hfill
20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1652
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Rattus rattus
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (47) .. (1195)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 28
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
21
\hskip0,8cm
22
\hskip0,8cm
23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip0,8cm
24
\hskip0,8cm
25

Claims (16)

1. Ácido nucleico aislado, cuya secuencia se selecciona de la SEC ID nº 3 a la SEC ID nº 10, que representa un fragmento del ADN genómico del gen humano designado NPHS2.
2. Polipéptido aislado, denominado podocina, constituido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.
3. Polipéptido aislado, constituido por una secuencia homóloga a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2, definiéndose dicha secuencia homóloga como:
i)
una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 2; o
ii)
una secuencia codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la secuencia SEC ID nº 1 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación, tales como las proporcionadas por una temperatura de hibridación de 5 a 30ºC inferior a la Tm, y un tampón de hibridación SSC 6x,
entendiéndose que dicho polipéptido presenta la actividad biológica de la podocina, polipéptido de secuencia SEC ID nº 2.
4. Ácido nucleico aislado, constituido por una secuencia diferente de la secuencia SEC ID nº 1 por una mutación, inserción o deleción, en al menos una posición entre los nucleótidos 481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607 y 940, o también 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571, 572, 583, 783, 794 y 848, a reserva de que dicho ácido nucleico aislado esté implicado en un síndrome nefrótico corticorresistente.
5. Ácido nucleico aislado, constituido por la secuencia SEC ID nº 1 que codifica un polipéptido designado podocina.
6. Ácido nucleico aislado, constituido por una secuencia homóloga a la secuencia SEC ID nº 1, definiéndose dicha secuencia homologa como:
i)
una secuencia idéntica a al menos el 70% de la secuencia SEC ID nº 1, entendiéndose que dicha secuencia codifica un polipéptido que presenta la actividad biológica del polipéptido denominado podocina de secuencia SEC ID nº 2; o
ii)
una secuencia que codifica el polipéptido, como se define en la reivindicación 2 ó 3.
7. Vector de clonación y/o de expresión que contiene un ácido nucleico, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1, 4, 5 o 6.
8. Célula huésped transfectada por un vector de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Ácido nucleico constituido por una secuencia seleccionada entre las secuencias SEC ID nº 11 a SEC ID nº 27.
10. Procedimiento de producción de un polipéptido recombinante podocina, en el que un vector que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 se transfiere a una célula huésped, que se cultiva en condiciones que permiten la expresión del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, respectivamente.
11. Anticuerpo dirigido contra el polipéptido como se define en la reivindicación 2 ó 3.
12. El uso de al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11 para detectar o purificar un polipéptido como se define en la reivindicación 2 ó 3 en una muestra biológica.
13. El uso de al menos un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, 4, 5 ó 6 para detectar una anomalía en el gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o, en su transcrito, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6.
14. Procedimiento de diagnóstico in vitro de un síndrome nefrótico corticorresistente, que comprende las etapas constituidas por:
a1)
poner en contacto una muestra biológica que contiene el ADN con oligonucleótidos específicos que permitan la amplificación de todo o parte del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1;
b1)
amplificar dicho ADN;
c1)
detectar los productos de amplificación;
d1)
comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho gen NPHS2, indicadora de un síndrome nefrótico corticorresistente
o, según una alternativa,
a2)
poner en contacto una muestra biológica que contiene el ARN con oligonucleótidos específicos que permitan la amplificación de todo o parte del transcrito del gen NPHS2, definido como que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6;
b2)
amplificar dicho ARN;
c2)
detectar los productos de amplificación;
d2)
comparar los productos de amplificación obtenidos con los obtenidos con una muestra de control, y detectar de esta manera una posible anomalía en dicho transcrito del gen NPHS2, indicadora de un síndrome nefrótico corticorresistente.
15. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, para su uso en el tratamiento de enfermedades renales, particularmente de un síndrome nefrótico corticorresistente.
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WO2011084548A2 (en) * 2009-12-15 2011-07-14 King Faisal Specialist Hospital & Research Centre Methods and compositions for detecting recesssive familial fsgs and uses thereof
JP5830329B2 (ja) * 2010-09-28 2015-12-09 国立大学法人 岡山大学 腎障害の新規マーカー
WO2015066640A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Kit and method for identifying individual responsiveness to steroid therapy of nephrotic syndrome
US10881686B2 (en) 2017-10-27 2021-01-05 Zeta Biolongevity, Inc Compositions and methods for treating and preventing proteinuria and endothelial erosion
GB201900702D0 (en) 2019-01-18 2019-03-06 Univ Bristol Therapy
GB202003109D0 (en) * 2020-03-04 2020-04-15 Univ Bristol Gene therapy
CN113186189A (zh) * 2021-05-19 2021-07-30 中国人民解放军总医院第一医学中心 一种用于敲除猪NPHS2基因的gRNA及其相关应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2804127B1 (fr) * 2000-01-20 2004-12-24 Inst Nat Sante Rech Med Gene srn1 implique dans le syndrome nephrotique cortico- resistant, proteine codee par ce gene et utilisations diagnostiques et therapeutiques
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof

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