ES2339412T3 - Canal cationico neuronal humano sensible a acido, su clonacion y aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de transporte de cationes humana aislada y purificada denominada Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano (o hASIC3) representada por la SEC ID Nº 8, que tiene una cinética de desensibilización bifásica con tanto un componente selectivo de Na+ que se inactiva rápidamente como un componente sostenido.
Description
Canal catiónico neuronal humano sensible a
ácido, su clonación y aplicaciones.
La presente invención se refiere a nuevas
familias de canales iónicos sensibles a ácido de mamíferos,
particularmente seres humanos y ratas. Más particularmente, la
invención se refiere a la identificación y caracterización
molecular en seres humanos y ratas de una nueva familia de canales
catiónicos activados por protones, denominados en su conjunto a
continuación polipéptidos ASIC, por Canal Iónico Sensible a
Ácido.
Los canales ASIC constituyen los primeros
miembros de un grupo de canales catiónicos que pertenecen a la
familia de canales de sodio de las degenerinas sensibles a
amilorida [6, 11-14], que se activan temporalmente
por acidificación extracelular.
La sensibilidad a ácido está asociada tanto con
la nocicepción [1] como con la transducción gustativa [2]. La
estimulación de neuronas sensitivas por ácidos es de gran
importancia ya que la acidez acompaña a numerosas situaciones
isquémicas e inflamatorias dolorosas. Se piensa que el dolor causado
por ácidos está mediado por los canales catiónicos presentes a
nivel de las neuronas sensitivas que se activan por protones
[3-5]. Las propiedades biofísicas y farmacológicas
de los canales ASIC de la invención son similares a las de los
canales catiónicos activados por protones descritos en las neuronas
sensitivas [3, 15, 16]. Sin embargo, como se observará en la
descripción a continuación, hasta la fecha no se ha informado de
canales iónicos activados por ligando más simples que los canales
ASIC.
La invención también se refiere a canales
catiónicos híbridos constituidos por la combinación de una primera
proteína que comprende un canal iónico activado por protones de
acuerdo con la invención con un segundo canal iónico activado por
protones.
La presente invención tiene como objeto una
molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que constituye
canales catiónicos neuronales que son sensibles a amilorida y que se
activan por protones.
La invención también se refiere a un vector que
comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico
anteriores, ventajosamente combinada con secuencias de control
adecuadas, así como a un procedimiento para la producción o
expresión en una célula hospedadora de una proteína que constituye
un canal iónico de acuerdo con la invención.
La invención también se refiere a las células
transformadas que expresan canales catiónicos ASIC y/o sus derivados
obtenidas de acuerdo con los métodos anteriores.
La presente invención también se refiere a la
aplicación del canal ASIC para el estudio de modificaciones
patológicas que pueden conducir a degeneraciones neuronales. La
invención también se refiere a las preparaciones farmacéuticas que
comprenden como ingrediente activo al menos una de estas proteínas
de la invención.
Se observarán otras características y ventajas
de la invención en la descripción a continuación relacionada con
actividades de investigación que condujeron a la demostración y a la
caracterización del canal ASIC.
La invención puede entenderse adicionalmente con
referencia a las Figuras, que se analizan a continuación y en los
Ejemplos.
La Figura 1 representa el alineamiento de las
secuencias de las proteínas ASIC de rata (en la parte superior) y
las proteínas ASIC humanas (en la parte inferior) de las secuencias
SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2.
La Figura 2 representa una comparación de la
secuencia proteica del canal rASIC1A con la secuencia de otros
canales iónicos.
La Figura 3 representa el árbol filogenético de
las proteínas de las subunidades \alphaNaCh, \betaNaCh,
\gammaNaCh, \deltaNaCh del canal de sodio sensible a amilorida y
de las degenerinas MEC-4, MEC-10 y
DEG-1 de C. elegans.
La Figura 4 representa la topología propuesta
para esta última familia de canales iónicos [30].
La Figura 5 muestra las propiedades biofísicas
del canal rASIC1A activado por protones.
La Figura 6 muestra el efecto de Ca^{2+} y de
amilorida sobre la corriente de rASIC1A.
La Figura 7 muestra la distribución tisular del
ARNm del canal ASIC1A.
La Figura 8 muestra la hibridación in
situ.
La Figura 9 muestra el alineamiento de las
secuencias proteicas deducidas de hASIC3 y rASIC3.
La Figura 10 muestra la dependencia de pH y la
farmacología de hASIC3.
La Figura 11 muestra la selectividad y las
propiedades de canales individuales de hASIC3.
La Figura 12 muestra la localización cromosómica
humana del gen de hASIC3.
La SEC ID Nº: 1 representa la secuencia
de 526 aminoácidos de la proteína del canal rASIC1A deducida a
partir de la secuencia de ADNc de la rata.
La SEC ID Nº: 2 representa la secuencia
parcial de 514 aminoácidos de la proteína del canal hASIC1A deducida
a partir de la secuencia parcial de ADNc humano.
La SEC ID Nº: 3 representa la secuencia
de 512 aminoácidos de la proteína del canal hASIC2A deducida a
partir de la secuencia de ADNc humano.
La SEC ID Nº: 4 representa la secuencia
de 559 aminoácidos de la proteína del canal rASIC1B así como la
secuencia de una molécula de ADN que comprende la secuencia
codificante de esa proteína.
La SEC ID Nº: 5 representa la secuencia
de 533 aminoácidos de la proteína del canal rASIC3 y la secuencia
de ADN codificante de esa proteína.
La SEC ID Nº: 6 representa la secuencia
de 563 aminoácidos de la proteína del canal rASIC2B, así como la
secuencia de una molécula de ADN que comprende la secuencia
codificante de esa proteína.
La SEC ID Nº: 7 representa la secuencia
de 533 aminoácidos de la proteína del canal hASIC3, así como la
secuencia de una molécula de ADN que comprende la secuencia
codificante de esa proteína.
La presente invención tiene como objeto
proteínas de rata que constituyen canales catiónicos neuronales que
son sensibles a amilorida y que se activan por protones. La
invención se refiere a proteínas que constituyen la familia ASIC de
canales catiónicos o derivados funcionalmente equivalentes de estas
proteínas.
Dichos derivados son los polipéptidos cuyas
secuencias incluyen una modificación y/o una supresión y/o una
adición de uno o más restos aminoacídicos, siempre que esta
modificación, supresión y/o adición no altere las propiedades
funcionales y estructurales del canal ASIC, principalmente su
activación por protones. De hecho, se describen en la presente
memoria tres polipéptidos ASIC diferentes, ASIC1, ASIC2 y ASIC3,
tanto en rata como en seres humanos. Además, los transcritos que
codifican ASIC1 y ASIC2 experimentan un corte y empalme alternativo
que genera derivados funcionales adicionales de las proteínas ASIC1
y ASIC2 (ASIC1A y 1B, ASIC2A y ASIC2B, respectivamente). Se
considera que otros derivados funcionales de las proteínas ASIC y/u
otras formas de los polipéptidos ASIC generadas por corte y empalme
alternativo de los transcritos de ARNm de ASIC están dentro del
alcance de la presente invención. Dichas proteínas y sus derivados
funcionales pueden analizarse por un experto en la materia usando
las técnicas descritas en los Ejemplos que se incluyen en la
presente memoria, que hacen posible demostrar las propiedades
biofísicas y farmacológicas de los canales ASIC.
Son ejemplos adicionales de derivados
funcionales de los canales ASIC los siguientes: Se considera que las
proteínas ASIC1A humanas y de rata (hASIC1A y rASIC1A, SEC ID Nº 1
y 2, respectivamente) son funcionalmente equivalentes. Las
secuencias de aminoácidos de estas dos proteínas son altamente
homólogas, pero no son idénticas. Por lo tanto, pueden introducirse
fácilmente sustituciones dentro de la secuencia primaria de
proteínas ASIC sin influir en sus características funcionales
básicas.
Otro ejemplo de derivado funcionalmente
equivalente de este tipo es la proteína que constituye un canal
catiónico anteriormente denominado MDEG [14] o BNaCl [20],
denominado en la presente memoria rASIC2A. La secuencia de
aminoácidos de rASIC2A está representada en la lista de secuencias
adjunta con el número de SEC ID Nº: 3. El rASIC2A se ha descrito
como un canal catiónico de mamífero que es sensible a amilorida y
que se activa en C. elegans por mutaciones que dan como
resultado la neurodegeneración. El canal rASIC2A es estructuralmente
similar al canal ASIC1A, presentando una homología de
aproximadamente 67% en sus secuencias de aminoácidos. El transporte
de cationes por ambos polipéptidos es sensible a amilorida y está
regulado por ácido. Sin embargo, las propiedades
electrofisiológicas de estos dos canales son diferentes ya que no se
activan por los mismos cambios de pH. Por lo tanto, el intervalo de
sensibilidad de rASIC2A (CE_{50} = 4,05) es diferente del de
ASIC1A (CE_{50} = 6,2). También se considera que están dentro del
alcance de la invención otras proteínas funcionalmente equivalentes
que pueden presentar diferentes propiedades electrofisiológicas.
Se ha demostrado que el canal rASIC2A se activa
por las mismas mutaciones que las que causan la degeneración
neuronal en C. elegans. Por lo tanto, como los mutantes
hiperactivos de C. elegans, los mutantes activos de rASIC2A
son responsables de la muerte celular. Esto indica que la
adquisición de función por este canal iónico neuronal podría estar
asociada con diversas formas de degeneración neuronal en mamíferos,
particularmente de roedores y seres humanos. Sin embargo, no se
conoció la función fisiológica normal de rASIC2A hasta la
demostración de su activación por protones de acuerdo con los
canales catiónicos de la presente invención.
Otros ejemplos de proteínas que constituyen un
canal catiónico neuronal que son sensibles a amilorida y que se
activan por protones de acuerdo con la invención se presentan a
continuación:
- -
- Un canal denominado ASIC1B, cuya secuencia de 559 aminoácidos está representada en la lista de secuencias adjunta con el número de SEC ID Nº: 4. El ASIC1B es una variante de corte y empalme del canal ASIC1A clonado a partir del cerebro de rata mediante PCR degenerada. Los primeros 185 aminoácidos se sustituyen por una nueva secuencia de 218 aminoácidos que está subrayada en la SEC ID Nº: 4.
- -
- Un canal denominado rASIC2B. El rASIC2B es una variante de corte y empalme del rASIC2A y está representado por la SEC ID Nº: 6.
- -
- Un canal denominado rASIC3 cuya secuencia de 533 aminoácidos está representada en la lista de secuencias con el número de SEC ID Nº: 5. El rASIC3 se clonó a partir de neuronas sensitivas de la rata usando una secuencia parcial de los bancos de datos (Etiqueta de Secuencia Expresada con número de acceso W62694). Las propiedades de rASIC3 son las siguientes:
- a)
- Se expresa en las neuronas sensitivas pero no en el cerebro.
- b)
- Su expresión en ovocitos de Xenopus o en células de mamífero permite el registro de una corriente de sodio activada por protones que presenta dos componentes: un componente que se activa e inactiva por sí mismo rápidamente y un componente que se activa por sí mismo más lentamente y que no se inactiva por sí mismo. Los dos componentes son selectivos para Na^{+}. Un canal catiónico activado por protones que no se inactiva por sí mismo estaba implicado en la sensación de dolor prolongada causada por acidosis.
- -
- Un canal denominado hASIC3, que está representado por la SEC ID Nº: 7. Esta proteína es una nueva subunidad de canal catiónico dependiente de protones humano que tiene una cinética de desensibilización bifásica, con tanto un componente selectivo de Na^{+} que se inactiva rápidamente como un componente sostenido. La proteína comparte una identidad de secuencia de 84% con el canal catiónico dependiente de protones rASIC3 de neuronas sensitivas de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también se refiere a canales
catiónicos híbridos o a canales constituidos por la combinación de
una primera proteína que comprende un canal iónico activado por
protones de acuerdo con la invención con una segunda proteína que
comprende un canal iónico activado por protones. Ventajosamente,
dicha segunda proteína también es una proteína que comprende un
canal iónico activado por protones de acuerdo con la invención. Un
ejemplo de dicha combinación se ilustra por la combinación del canal
ASIC1A, ASIC2A o ASIC3 con el canal ASIC2A. Dichos canales híbridos
presentan un tercer intervalo de sensibilidad a pH (por ejemplo, con
ASIC: CE_{50} = 4,8). Otro ejemplo de dicho canal híbrido es la
combinación de los canales ASIC1A, ASIC1B, ASIC2A o ASIC3 con el
canal ASIC2B.
El ASIC2B es un canal que se clonó a partir del
cerebro de rata usando una secuencia de ratón parcial accesible en
los bancos de datos (Etiqueta de Secuencia Expresada con número de
acceso W50528) y cuya secuencia de 563 aminoácidos está
representada en la lista de secuencias adjunta con el número de SEC
ID Nº: 6. El ASIC2B es una variante de corte y empalme de ASIC2A.
Los primeros 185 aminoácidos se sustituyen por una nueva secuencia
de 236 aminoácidos que está subrayada en la SEC ID Nº: 6. El ASIC2B
se expresa en el cerebro y en las neuronas sensitivas de los
ganglios de las raíces dorsales.
El ASIC2B expresado en solitario en ovocitos de
Xenopus o en células de mamífero no forma un canal catiónico
activado por protones. Sin embargo, puede combinarse con ASIC2A o
ASIC3 para formar canales heteromultiméricos activados por protones
con propiedades modificadas. El pH de activación del canal formado
después de la coexpresión de ASIC2A y ASIC2B difiere del canal
formado por ASIC2A en solitario. Después de la expresión de ASIC2A y
ASIC2B en células COS, la corriente no ha alcanzado su valor máximo
a pH 3, mientras que la corriente inducida por ASIC2A en solitario
se satura a un pH de entre 4,5 y 4,0. Además, la cinética de
inactivación y la selectividad iónica del canal formado después de
la coexpresión de ASIC2A y ASIC2B son claramente diferentes de las
de ASIC2A en solitario. La corriente de A parece que se inactiva
por sí misma lentamente y apenas es selectiva para Na^{+} y
K^{+}.
En otro ejemplo, la corriente de sodio obtenida
después de la expresión de ASIC3 se vuelve no selectiva (no
diferencia entre sodio y potasio) cuando el ASIC2B se coexpresa con
ASIC3. Esta nueva propiedad es similar a la del canal catiónico
activado por protones que está implicado en la sensación de dolor
prolongada causada por acidosis. Es muy probable que ASIC3 y ASIC2B
sean parte de este canal.
Las homologías de secuencia de aminoácidos de
las proteínas que constituyen los canales ASIC1A, ASIC1B citados de
acuerdo con la invención se presentan en la Tabla 1 a
continuación.
Pueden prepararse anticuerpos policlonales o
monoclonales dirigidos contra al menos una proteína que constituye
un canal iónico de la invención y/o contra un canal híbrido como se
ha descrito anteriormente mediante los métodos clásicos descritos
en la bibliografía. Los anticuerpos son útiles para investigar la
presencia de los canales iónicos de la invención en diversos
tejidos humanos y animales y también pueden usarse para inhibir o
activar un canal ASIC y/o sus derivados in vivo. Dicha
aplicación puede ser útil para el tratamiento de enfermedades que
surgen por un transporte de cationes de ASIC defectuoso.
La presente invención también tiene como objeto
una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que
constituye un canal catiónico neuronal que es sensible a amilorida y
que se activa por protones. Más particularmente, la invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una
secuencia codificante de una proteína que constituye los canales
catiónicos ASIC1A, ASIC1B, ASIC2A, ASIC2B o ASIC3 de ser humano o
de rata.
La invención también se refiere a un vector que
comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico
anteriores, ventajosamente combinada con secuencias de control
adecuadas, así como un procedimiento para la producción o expresión
en una célula hospedadora de una proteína que constituye un canal
iónico de acuerdo con la invención. La preparación de estos
vectores, así como la producción o expresión de los canales de la
invención en una célula hospedadora competente, puede lograrse
mediante métodos establecidos conocidos por los expertos en la
materia.
Por ejemplo, la expresión y producción de una
proteína que constituye un canal catiónico de acuerdo con la
invención puede efectuarse mediante:
- -
- transferencia de una molécula de ácido nucleico de la invención o de un vector que contiene dicha molécula a una célula hospedadora competente,
- -
- cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión de los canales iónicos de la invención,
- -
- aislamiento de las proteínas que constituyen los canales iónicos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La célula hospedadora empleada en los métodos
anteriores puede seleccionarse de entre las procariotas o las
eucariotas y, particularmente, de entre las bacterias, levaduras o
células de mamíferos, plantas o insectos.
El vector usado se selecciona en relación con el
hospedador al que se transferirá; puede usarse cualquier vector tal
como un plásmido.
La invención también se refiere a las células
transformadas que expresan canales catiónicos ASIC y/o sus derivados
obtenidos de acuerdo con los métodos anteriores. Estas células son
útiles para la exploración para identificar sustancias que sean
capaces de modular el transporte de cationes por estos polipéptidos
y, por lo tanto, la percepción de la acidez con respecto tanto a la
nocicepción como a la transducción gustativa. Esta exploración se
lleva a cabo poniendo cantidades variables de una sustancia a
ensayar en contacto con células que expresan los canales ASIC y
determinando los efectos de dicha sustancia sobre las corrientes de
dichos canales catiónicos. Estas exploraciones permiten la
identificación de nuevos fármacos que son útiles en el tratamiento o
la prevención del dolor. También permiten la identificación e
investigación de agentes que modulan el sabor ácido. Además, estos
métodos son útiles para identificar sustancias que bloquean o que
pueden inhibir la neurodegeneración inducida por la hiperexpresión
de estos canales. Las sustancias que se aíslan y detectan por medio
de los métodos anteriores también son parte de la invención. Los
canales ASIC tienen claramente propiedades de selectividad iónica,
particularmente con respecto a su permeabilidad selectiva por sodio,
potasio y calcio que los dota de propiedades excitotóxicas cuando
se hiperestimulan.
También puede ser útil una proteína que
constituye un canal iónico neuronal ASIC para el desarrollo de
fármacos destinados al tratamiento o la prevención de patologías
que implican la percepción dolorosa de acidez que interviene en
enfermedades inflamatorias, isquemias y cierto número de tumores.
Por lo tanto, la invención se refiere también a composiciones
farmacéuticas que comprenden como ingredientes activos al menos una
proteína que constituye un canal iónico de acuerdo con la
invención.
Una molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína que constituye un canal ASIC o un derivado del mismo, o un
vector que comprende esta molécula de ácido nucleico, o una célula
que expresa canales ASIC también son útiles para la preparación de
animales transgénicos. Estos pueden ser animales que superexpresen
dichos canales, pero también animales "knock out", es
decir, animales con expresión deficiente de estos canales o de la
actividad de transporte de cationes de los canales ASIC. Estos
animales transgénicos se preparan por métodos conocidos por los
expertos en la materia y permiten el desarrollo de modelos vivos
para estudiar patologías animales asociadas con canales ASIC.
Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de
la invención o las células transformadas por dichas moléculas
pueden usarse para terapia genética para compensar una deficiencia
en los canales ASIC a nivel de uno o más tejidos de un paciente.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un fármaco que
comprende moléculas de ácido nucleico de la invención o células
transformadas por dichas moléculas de ácido nucleico para el
tratamiento de una patología que implica a los canales ASIC o sus
derivados.
Además de la propiedad de activarse por protones
y de las aplicaciones resultantes descritas anteriormente en
relación con la percepción de la acidez, los canales ASIC, y
particularmente los canales ASIC que tienen mutaciones genéticas,
pueden estar implicados en algunos procesos neurodegenerativos. La
muerte de ciertas neuronas es característica de muchos tipos de
trastornos degenerativos neuronales tales como enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson,
esclerosis lateral amiotrófica y ataxia cerebelar. Los estudios de
dichos procesos neurodegenerativos han identificado sólo unos pocos
genes deficientes que pueden ser responsables de o estar asociados
con estas enfermedades. Es probable que continúen sin identificar
muchos genes más importantes. La red neuronal primitiva del nematodo
C. elegans constituye un buen modelo de desarrollo y muerte
neuronal. La degeneración hereditaria en C. elegans puede
deberse a mutaciones de los genes deg-1,
mec-4 y mec-10. Estos genes
presentan homología con las subunidades de los canales de sodio
sensibles a amilorida. Además, la expresión funcional de las
quimeras de mec-4 del canal de sodio epitelial
sugiere que estos genes son canales iónicos cuya adquisición de
función es la causa de la degeneración neuronal.
Por lo tanto, la presente invención también se
refiere a la aplicación del canal ASIC para el estudio de estas
modificaciones patológicas que pueden conducir a degeneraciones
neuronales. Las técnicas empleadas para estas aplicaciones, por
ejemplo, para la selección de fármacos, son similares a las
descritas anteriormente para la investigación de agentes
moduladores del sabor y agentes analgésicos.
Además, una proteína que constituye un canal
iónico neuronal ASIC, un agonista o un antagonista de dicha
proteína, también puede usarse para la fabricación de fármacos
destinados al tratamiento o la prevención de patologías que
implican degeneración neuronal cerebral. Por lo tanto, la invención
también se refiere a las preparaciones farmacéuticas que comprenden
como ingrediente activo al menos una de estas proteínas de la
invención, posiblemente combinada con un vehículo fisiológicamente
aceptable.
Más específicamente, la invención se refiere a
una sustancia química o biológica que es capaz de modificar las
corrientes de un canal iónico y/o un canal híbrido de acuerdo con la
invención para la preparación de un fármaco capaz de modular la
percepción de la acidez con respecto a la nocicepción, así como a la
transducción gustativa en un sujeto humano o animal.
Otras características y ventajas de la invención
se observarán en la descripción a continuación relacionada con
actividades de investigación que condujeron a la demostración y a la
caracterización del canal ASIC, y en la que se hará referencia a
las secuencias y dibujos adjuntos, en los que:
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 representa el alineamiento de las
secuencias de las proteínas ASIC de rata (en la parte superior) y
las proteínas ASIC humanas (en la parte inferior) de las secuencias
SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2. La comparación de estas secuencias
muestra la ausencia de 14 aminoácidos al comienzo de la fase
codificante humana en comparación con la de la rata.
La Figura 2 representa una comparación de la
secuencia proteica del canal rASIC1A con la secuencia de otros
canales iónicos:
- -
- ASIC2A (MDEG) [14], un canal catiónico de mamífero que se activa por las mutaciones responsables de las neurodegeneraciones con las degenerinas de C. elegans.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
- -
- FaNaCh [10], un péptido de un canal de sodio de Helix aspersa que se activa por FMRFamida.
- -
- La degenerina MEC-4 [12] de C. elegans.
En esta figura, los restos que son idénticos o
similares a los de ASIC están impresos respectivamente en blanco
sobre fondo negro y en negro sobre fondo gris. Las regiones
transmembrana supuestas (MI, MII) de rASIC1A están señaladas
mediante barras negras.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 representa el árbol filogenético de
las proteínas de las subunidades \alphaNaCh, \betaNaCh,
\gammaNaCh, \deltaNaCh del canal de sodio sensible a amilorida y
de las degenerinas MEC-4, MEC-10 y
DEG-1 de C. elegans.
La Figura 4 representa la topología propuesta
para esta última familia de canales iónicos [30].
La Figura 5 muestra las propiedades biofísicas
del canal rASIC1A activado por protones.
- a)
- Las corrientes de flujo de entrada macroscópicas registradas a -70 mV después de cambios rápidos de pH de pH 7,4 a pH 6.
- b)
- La curva de respuesta a la dosis del pH extracelular. El pH inicial era de 7,4 y los puntos representan los valores medios de 6 ensayos. La inserción en esta Figura muestra las respuestas típicas a -70 mV.
- c)
- Las relaciones Q-V del registro zonal con el exterior hacia fuera con 140 mM de Na^{+}(\sqbullet) o de Li^{+}(\bullet) en la solución de baño. Q es la carga transportada durante la transición a pH ácido. La inserción en esta figura muestra las respuestas típicas en un medio que contiene Na^{+}.
- d)
- Las corrientes activadas por los protones H^{+} registrados a diversos potenciales en una zona de membrana con el exterior hacia fuera en un medio que contiene Na^{+}.
- e)
- Las relaciones i-V medias medidas desde la zona de membrana con el exterior hacia fuera con 140 mM de Na^{+} (\sqbullet), 140 mM de Li^{+} (\bullet) o 1,8 mM de Ca^{2+} (\ding{115}), como la mayoría de iones permeables en las soluciones externas; los potenciales de inversión eran respectivamente 65 mV, 58 mV y -34 mV.
- f)
- La corriente de protones a través del canal rASIC1A. Las relaciones entre el pico de corriente y el voltaje se midieron desde una zona de membrana con el exterior hacia fuera en una solución de Na^{+} libre, Ca^{2+} libre, con pipetas que contenían una solución de K^{+} libre a pH 4 (\bullet) y a pH 3 (\sqbullet), representando (\ding{115}) los resultados obtenidos en las mismas condiciones que (\sqbullet) pero con KCl en la pipeta. La inserción en esta figura muestra las respuestas típicas en las condiciones (\ding{115}).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 6 muestra el efecto de Ca^{2+} y de
amilorida sobre la corriente de rASIC1A.
- a)
- Las corrientes activadas por los protones H^{+} registradas a diversos potenciales de membrana desde una zona de membrana con el exterior hacia fuera con 1,8 mM de Ca^{2+} en una solución de Na^{+} libre; las corrientes se invertían a -35 mV.
- b)
- Las relaciones Q-V medias desde una zona de membrana con el exterior hacia fuera registradas en soluciones de Na^{+} libre que contenían 1,8 mM de Ca^{2+} (\medcirc, potencial de inversión -34 mV) o 0,1 mM de Ca^{2+} (\bullet, potencial de inversión -80 mV).
- c)
- El efecto del Ca^{2+} externo sobreel pico de corriente de flujo de entrada macroscópica registrada a -70 mV y activada por un cambio rápido de pH de pH 7,4 a pH 6. La inserción en esta Figura muestra las respuestas típicas. Los puntos representan los valores medios \pm ET de 5 ovocitos.
- d)
- El efecto de amilorida sobre las corrientes activadas por los protones H^{+} registradas a 0 mV desde una zona de membrana con el exterior hacia fuera.
- e)
- La inhibición de la corriente macroscópica (inducida por un cambio de pH de pH 7,4 a pH 6) a -70 mV por amilorida y sus derivados. Los puntos representan los valores medios \pm ET de 5 ovocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 7 muestra la distribución tisular del
ARNm de canal ASIC1A.
- a)
- Análisis de transferencia de Northern de la expresión de ARNm del canal hASIC1A en tejidos humanos.
- b)
- En b: análisis de RT-PCR de la expresión de ARNm del canal de rASIC1A en el cerebro de rata y en los ganglios de las raíces dorsales (DRG). (+), (-) representan respectivamente las muestras con o sin transcriptasa inversa. Las secciones de gel de agarosa se revelaron en bromuro de etidio a 1%. Las flechas indican el tamaño descontado (657 pb) del producto de PCR.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Figura 8 muestra la hibridación in
situ.
- a,
\;
b) - Hibridación de secciones de 6 \mum de un ganglio de la raíz dorsal de una rata de 3 años de edad con la sonda E marcada con digoxigenina. En a: una microfotografía de baja iluminación (30X aumentos). En b: una imagen de alta resolución (80X aumentos) de "a". Se puede observar el marcaje intenso de neuronas de pequeño diámetro (flechas). También se obtuvieron resultados similares con las sondas A, C y D.
- c)
- La distribución del ARNm de canal rASIC1A en el cerebro de una rata adulta analizada por hibridación in situ con el oligonucleótido antisentido C. Se obtuvieron resultados idénticos con el oligonucleótido B. Los colores indican la abundancia (rojo: alta expresión; azul: no detectable). Las abreviaturas usadas en la Figura son las siguientes: Cer = cerebelo; Hip = hipocampo; OB = bulbo olfatorio; Cx = corteza.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 9 muestra el alineamiento de las
secuencias proteicas deducidas de hASIC3 y rASIC3. Los aminoácidos
que son idénticos o similares en ambas secuencias están impresos en
blanco sobre negro o negro sobre fondo gris, respectivamente. Los
dos supuestos dominios transmembrana hidrófobos están marcados con
recuadros. Las secuencias se alinearon con el programa Pileup
(Genetic Computer Group, Wisconsin).
La Figura 10 muestra la dependencia de pH y la
farmacología de hASIC3. Se registraron las corrientes de membrana
inducidas por protones de células COS transfectadas con hASIC3
usando la técnica de pipeta de succión de célula completa.
- a)
- Dependencia de pH de la corriente de hASIC3. Se indujeron corrientes dependientes de H^{+} por disminución rápida del pH extracelular desde pH 7,3 hasta los valores de pH indicados. El pH necesario para la activación semimáxima era pH 6,2 para la corriente transitoria y pH 4,3 para la corriente sosteni- da.
- b)
- Las corrientes de hASIC3 inducidas por H^{+} dependen del pH en reposo. El pH extracelular se disminuyó rápidamente desde el pH en reposo indicado hasta pH 4. Las corrientes en A y B se muestran como la fracción del nivel de saturación del ajuste de Bolzmann.
- c)
- Inhibición de hASIC3 por los diuréticos amilorida y triamtereno. En la curva de respuesta a la dosis para la amilorida (K_{0,5} = 15,9 \muM), las corrientes se expresan como una fracción de la corriente media en ausencia de fármaco. Los puntos de datos (\medcirc, corriente transitoria; I corriente sostenida) representan el promedio \pm ETM de al menos 5 experimentos. Se registraron las corrientes macroscópicas de células pinzadas a -60 mV usando la técnica de pipeta de succión de célula completa.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 11 muestra la selectividad y las
propiedades de canales individuales de hASIC3.
- a)
- Dependencia de voltaje de la corriente transitoria y sostenida de la célula completa. La corriente transitoria se invierte a 37,6 mV, la corriente sostenida se invierte a 10,1 mV.
- b)
- La dependencia de voltaje de las corrientes unitarias de canales espontáneamente activos a pH 7,3 o de canales activados por una etapa a pH 4. La conductancia de la pendiente entre -10 y +40 mV para ambas condiciones es de 15,0 +/- 0,6 pS. V_{inv} = 30,2 mV. El potencial de equilibrio de Na^{+} es a 40,1 mV. Ejemplos de actividad espontánea de canales a un pH en reposo de 7,3 (c) o actividad provocada por una caída hasta pH 4 (d). La actividad de canal registrada a pH 7,3 se inhibía por amilorida 100 \muM (c). Se registraron las corrientes de canales individuales a -60 mV a partir de zonas de membrana con el exterior hacia fuera escindidas de células COS transfectadas con hASIC.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 12 muestra la localización cromosómica
humana del gen de hASIC3. El gen de ASIC3 humano se localiza 6,4
cRad telomérico al marcador flanqueante AFMA082XC9 en el cromosoma 7
(puntuación LOD > 21). La posición de hASIC3 respecto a varios
microsatélites se muestra en la parte derecha de la Figura. Las
posiciones relativas de los marcadores y sus distancias (en cRad)
son el resultado del programa RHMAPPER. Los microsatélites D7S676 y
D7S642 se localizan en la banda q35 del cromosoma 7 (datos de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov). La localización citogenética de esos
dos marcadores se indica con líneas discontinuas.
Las secuencias conservadas de la familia de
canales iónicos ASIC se usaron para preparar las siguientes
secuencias de cebadores de PCR:
- TTYCCIGCIRTIACIITNTGYAAY
\;
y\;
CAIARICCIAIITGNCCNCCDAWRTC.
\newpage
Un banco de ADNc de cerebro de rata (Stratagene
Nº 936515) se hibridó con el producto de PCR de 1 kB de cerebro de
rata y se aislaron los clones parciales. El quinto extremo del ADNc
(202 pb) se aisló por PCR después de ligación adaptada al ADNc
bicatenario.
Se inyectaron 0,25 ng de ARNc en los ovocitos de
Xenopus laevis y los microelectrodos de registro para el
voltaje impuesto y para el pinzamiento zonal se instalaron dos días
después de la inyección. Las soluciones de baño para los registros
zonales con el exterior hacia fuera y las pipetas para los registros
zonales con el exterior hacia fuera y de células completas
contenían: KCl (o NMDG) 140 mM, MgCl_{2} 2 mM, EGTA 5 mM, Hepes
10 mM, pH 7,4 (con KOH). Las pipetas para los registros zonales con
el exterior hacia fuera y las soluciones de baño para los registros
zonales con el exterior hacia fuera y de células completas
contenían: NaCl (o LiCl o NMDGCI) 140 mM, MgCl_{2} 2 mM,
CaCl_{2} 1,8 mM, Hepes 10 mM, pH 7,4 (ajustado con HCl, NaOH, LiOH
o TMAOH). Los cambios rápidos de pH a partir del pH inicial se
obtuvieron por perfusión con una solución de baño ajustada al pH
indicado en las Figuras. La acidificación intracelular de los
ovocitos se llevó a cabo por inyección de 50 ml de la solución
interna a pH 2 o por perfusión y retirada de un medio de baño que
contenía NH_{4}Cl 20 mM. Ninguna de las corrientes registradas
estaba contaminada por la corriente de Ca^{2+} sensible al
Cl^{-} del ovocito de Xenopus. Los datos se muestrearon a 2
kHz y se filtraron a 500 Hz para el análisis. (Logiciel
Biopatch).
El kit de transferencia de Northern se obtuvo en
Clontech Co. (Palo Alto, CA) y contenía aproximadamente 2 \mug de
ARN poli(A+) por línea. La transferencia se hibridó con un
fragmento del clon humano parcial (correspondiente a las bases 270
a 764 del clon de rata) marcado con ^{32}P a 65_{i}C en SSC 6x.
Para el análisis de RT-PCR, se realizó una
transcripción inversa de 5 \mug de ARN total de cerebro de rata y
3 \mug de ganglios de las raíces dorsales y se amplificó 1/30 de
la muestra mediante 30 ciclos de PCR con los siguientes cebadores
de secuencia:
- ATTGCTCTTCCCATCTCTAT
\;
y\;
TTCAAGGCCCATACCTAAGT.
Los controles negativos se trataron de una forma
idéntica con la excepción de la transcriptasa inversa, que no se
añadió. Los oligonucleótidos antisentido correspondientes a las
bases 70 a 114 (A), 215 a 248 (B), 1821 a 1859 (C), 1896 a 1940 (D)
y el ADN bicatenario correspondiente a las bases 1685 a 2672 se
usaron para las hibridaciones in situ. Las secciones de
cerebro de rata adulta se hibridaron con los oligonucleótidos B o
C, cuyos extremos se marcaron con ^{32}P durante una noche a 37ºC
en formamida 50%, SSC 2x, después se lavaron a temperatura ambiente
en SSC 1x. La señal se eliminó mediante un exceso de 500 veces de
oligonucleótidos sin marcar. Las secciones de ganglios de las
raíces dorsales se hibridaron con los oligonucleótidos A, C o D
marcados con digoxigenina (DIG)-dUTP y con sonda E
marcada con DIG-dUTP por PCR. El marcaje de las
sondas, la preparación de las muestras, la hibridación y la
visualización de los ácidos nucleicos con DIG con la fosfatasa
alcalina conjugada con anticuerpos anti-DIG se
realizaron de acuerdo con los protocolos del proveedor (Boehringer
Mannheim).
Los alineamientos de secuencia y el árbol
filogenético (sustitución de Kimura, opción UPGMA) se realizaron
con el programa GCG (Genetics Computer Group, Madison, WI).
La comparación de la secuencia proteica de
DRASIC de rata con la base de datos de Etiquetas de Secuencias
Expresadas (EST) identificó dos secuencias de ADNc parciales de feto
humano completo (acceso GenBank AA449579 y AA449322). Ambas
secuencias proceden del mismo clon (IMAGE ID 785700) que se obtuvo
del UK HGMP RESOURCE CENTRE. La secuenciación de ambas cadenas
usando un secuenciador automático Applied Biosystems mostraba que
el clon contiene la secuencia codificante completa.
El gen de ASIC3 humano se mapeó por PCR en el
panel de ADN de híbridos de radiación Genebridge 4 con los cebadores
CGATTGCAGTTCAGCATCTCT (sentido) y ACCATTCGGCAGCCGCACTT
(antisentido) a una temperatura de hibridación de 65ºC. Los
productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 2%. Las
muestras se consideraban positivas cuando se detectaba una marcada
amplificación de un fragmento de 159 pb (Código 1), ambigua cuando
se detectaba una amplificación débil de este fragmento (Código 2) y
negativa cuando no era visible amplificación a aproximadamente 160
pb (Código 0). El control positivo (ADN genómico humano) era
positivo y el control negativo (ADN genómico de hámster) era
negativo. Se obtuvo la siguiente secuencia de código para los 83
híbridos de radiación y se introdujo en el programa RHMAPPER en el
Instituto Whitehead (http://www-genome.wi.mit.edu)
con un valor de corte de puntuación LOD de 21: 00000 00100 00001
00021 00100 12010 00000 12112 21000 00001 10120 00010 00102 11010
00010 00212 11011 00001 100.
El vector que contenía la secuencia codificante
de hASIC3 se linealizó con NotI y sus extremos se hicieron
romos con la ADN polimerasa T4. Después de la inactivación de la ADN
polimerasa T4, la secuencia codificante de hASIC3 se escindió con
EcoRI y posteriormente se subclonó en el vector de expresión PCI
digerido con EcoRI/SalI (extremos romos) (Promega).
Se transfectaron células COS a una densidad de 20.000 células por
placa de petri de 35 mm de diámetro con una mezcla de CD8 y
hASIC3-PCI (1:5) usando el método de
DEAE-dextrano. Las células se usaron para las
mediciones electrofisiológicas de uno a tres días después de la
transfección. Las células transfectadas con éxito se reconocían por
su capacidad para fijar perlas recubiertas con anticuerpo contra
CD8 [13].
Se registraron las corrientes iónicas usando la
técnica de pinzamiento zonal con el exterior hacia fuera o de
células completas. La solución de la pipeta contenía (en mM): KCl
120, NaCl 30, MgCl_{2} 2, EGTA 5, HEPES 10 (pH 7,2). La solución
de baño contenía en mM: NaCl 140, KCl 5, MgCl_{2} 2, CaCl_{2} 2,
HEPES 10 (pH 7,3). Se indujeron cambios en el pH extracelular por
apertura de una de las seis salidas de un sistema de microperfusión
delante de la célula o zona de membrana. Las soluciones de ensayo
que tenían un pH de menos de 6 se tamponaron con MES 10 mM en lugar
de HEPES pero eran idénticas a la solución de control en todos los
demás aspectos. Los experimentos se realizaron a temperatura
ambiente (20-24ºC).
El ADNc de 35 kb aislado de cerebro de rata
codifica una proteína de 526 aminoácidos que presenta, como se
muestra en la Figura 2, homologías con todos los miembros clonados
de la familia de canales de sodio de las degenerinas sensibles a
amilorida.
Como se muestra en la Figura 5, la expresión del
ARNc en los ovocitos de Xenopus indujo una corriente de
flujo de entrada activada por protones H^{+}. Las propiedades
biofísicas y farmacológicas del canal rASIC1A están próximas a las
descritas por los canales catiónicos activados por protones de
neuronas sensitivas [3, 15, 16]. La reducción del pH extracelular
por debajo de un pH de 6,9 activa una corriente de flujo de entrada
de desensibilización y que aumenta rápidamente (Figuras 5a y b).
Este canal se activa por protones extracelulares ya que, como se
muestra en la Figura 5 (c y d) la aplicación de un ácido en la
superficie extracelular de la zona de membrana con el exterior
hacia fuera activa el canal. La acidificación intracelular de
ovocitos y la acidificación de la superficie intracelular de la
zona de membrana con el exterior hacia fuera no activan el canal
rASIC1A ni alteran la corriente de rASIC1A inducida por los protones
extracelulares.
El análisis de las curvas I-V de
la Figura 5 (c y e) registrado con diferentes cationes
extracelulares muestra que el Na^{+} es la mayoría del ión
permeable (canal de conductancia simple 14,3 pS). Como el canal
iónico sensible a protones de las neuronas sensitivas [15, 16], el
canal ASIC discrimina débilmente entre los cationes (Figuras 5c, e,
f). De hecho, el canal también es permeable a Li^{+}, K^{+},
Ca^{2 +} y H^{+} con las relaciones pNa^{+}/pLi^{+} = 1,3
(Figuras 5c, e), pNa^{+}/pK^{+} = 13 (Figuras 5c, e),
pNa^{+}/Ca^{2+} = 2,5 (Figura 5e) y pNa^{+}/H^{+} = 0,8
(Figura 5f). La permeabilidad a Ca^{2+} de ASIC podría ser una
vía de entrada independiente de voltaje de Ca^{2+} en la célula.
Una corriente de flujo de entrada de Ca^{2+} en la célula por
medio de los canales ASIC puede detectarse en ausencia de Na^{+}
extracelular(Figuras 6a, b). Como se indica en la Figura 5
(e), la conductancia unitaria para Ca^{2+} era de 5,2 pS. En
presencia de 140 mM de Na^{+} extracelular, el aumento de las
concentraciones de Ca^{2+} externo disminuía la amplitud de la
corriente activada por los protones (Figura 6c), demostrando de este
modo que el Ca^{2+} inhibe la permeabilidad a Na^{+}. El
bloqueo por Ca^{2+} externo es característico del
l(H^{+}) de las neuronas sensitivas [17]. La corriente de
flujo de entrada activada por H^{+} en las neuronas sensitivas se
inhibe por la amilorida [18] y la etilisopropilamilorida (EIPA)
[19]. Como se muestra en la Figura 6 (d, e), el canal rASIC1A
presenta la misma farmacología y se bloquea de forma reversible (Kd
= 10 \muM) por la amilorida y sus derivados benzamilo y EIPA.
Además, la proteína del canal rASIC1A presenta
una homología de secuencia de aproximadamente 67% con el canal
iónico de degenerina denominado MDEG [14] o BNaCl [20], denominado
en la presente memoria rASlC2. Sin embargo, las propiedades
electrofisiológicas de estos dos clones expresados en ovocitos de
Xenopus son claramente diferentes:
- -
- Como se muestra en la Figura 5(a), el canal rASlC2 no se activa por los mismos cambios de pH que el canal rASIC1A.
- -
- La sustitución del resto glicina en la posición 430 de rASlC2 por un aminoácido inhibidor ácido tal como valina o fenilalanina activa el canal [14], tal como la mutación de la alanina en la posición 704 de la degenerina MEC-4 causa la neurodegeneración en C. elegans [12]. Mutaciones idénticas de rASIC1A (glicina en posición 431 sustituida por valina o fenilalanina) no conducen a actividad y los mutantes no pueden activarse por protones.
Se han descrito canales catiónicos activados por
protones no sólo en las neuronas sensitivas sino también en las
neuronas del sistema nervioso central [21]. La distribución tisular
de la expresión del ARNm del canal hASIC1A concuerda con esta
observación. Como se muestra en la Figura 7a, se detectó un
transcrito de 4,3 kb en el cerebro por análisis de transferencia de
Northern y los resultados de RT-PCR presentados en
la Figura 7b muestran que los ganglios de las raíces dorsales
expresan el ARNm de rASIC1A. La Figura 8 (a, b) muestra que el ARNm
de rASIC1A se expresa mucho por las pequeñas neuronas de los
ganglios de las raíces dorsales, confirmando el hecho de que el
ASIC es el canal catiónico activado por protones de
desensibilización rápida descrito en las neuronas sensitivas
nociceptoras. Aunque la presencia de canales catiónicos activados
por protones en los ganglios de las raíces dorsales concuerda con
su función de detección de la acidez en la nocicepción, aún no se
ha establecido su papel en el cerebro. Los resultados de la
hibridación in situ en la Figura 8c muestran una expresión
amplia y heterogénea del ARNm de canal rASIC1A. Los mayores niveles
de expresión se observaron en el bulbo olfatorio principal, la
corteza cerebral, el hipocampo, la habénula, el núcleo basolateral
amigdalino y el cerebelo. La actividad sináptica acompaña a los
cambios de pH extracelulares [22, 23] y los cambios de pH rápidos
localizados en o próximos a la hendidura sináptica están
perceptiblemente más saturados y son más marcados que las
fluctuaciones macroscópicas descritas en el pH.
Los canales catiónicos activados por protones
son los únicos canales iónicos conocidos que se activan directamente
por un cambio en el pH y se esperaba que las fluctuaciones
extracelulares en el pH desempeñaran un papel neuromodulador [23].
La expresión de canales catiónicos en el cerebro confirma además la
hipótesis de que las fluctuaciones de pH no son solamente una
activación neuronal por un producto, sino más bien una vía de
comunicación en el sistema nervioso central.
Además de los canales catiónicos activados por
protones que se inactivan rápidamente, se ha descrito la presencia
en neuronas sensitivas de canales catiónicos activados por protones
que presentan una cinética más lenta [4, 24]. Los canales
catiónicos activados por protones forman probablemente, como otros
canales catiónicos activados por ligando [25, 26], una familia de
canales catiónicos en la que diferentes subunidades o combinaciones
de subunidades constituyen canales con diversas propiedades
farmacológicas y fisiológicas.
La sensación de acidez no está únicamente
implicada en la nocicepción sino que también está asociada con la
transducción gustativa [2]. Las estimulaciones ácidas activan los
canales catiónicos activados por protones en las células gustativas
[2, 27] y la amilorida inhibe la percepción del sabor ácido [2].
Además, los datos fisiológicos así como farmacológicos indican que
el rASIC1A y otros miembros de esta familia están implicados en la
transducción gustativa. Es decir, de hecho, es especialmente
sorprendente que la misma clase de canales iónicos esté asociada
con diferentes aspectos de la percepción sensorial:
- -
- los canales de sodio sensibles a amilorida están asociados con la transducción del sabor salado [2].
- -
- las degenerinas de C. elegans están implicadas en la transducción mecánica y se ha propuesto que forman los canales iónicos mecanosensitivos [28, 29].
- -
- la familia ASIC de canales está implicada en la nocicepción y en la transducción del sabor ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
La comparación de la secuencia de rASlC3 con la
base de datos de etiquetas de secuencias expresadas identificó un
nuevo miembro humano de esta familia de canales iónicos. Este nuevo
clon de una biblioteca de embriones humanos completos codifica una
proteína de 533 aminoácidos que comparte la homología más próxima
(identidad 84%, homología 87%) con rASlC3 (Figura 9). La clonación
de un ADNc casi idéntico de testículo humano (hTNaC1), aunque sin
expresión funcional, se ha descrito recientemente [14].
La expresión del nuevo clon de hASlC3 en células
COS indujo una corriente de cationes dependiente de H^{+} con una
cinética muy similar a la de rASIC3. Cuando el pH disminuía
rápidamente de pH 7,3 a pH 5, se observaba una corriente bifásica.
Un componente que se inactiva rápidamente se sigue de una corriente
sostenida (Figura 10A). Esta cinética muy peculiar que también se
encuentra con el canal rASlC3 [9] junto con la homología de
secuencia (identidad de aminoácidos 84%, de ácido nucleico 82%) con
el rASlC3 sugiere que este nuevo clon es el ASIC3 humano. Por lo
tanto, se denomina hASlC3 (Canal Iónico Sensible a Ácido Humano
3).
La dependencia de pH de la corriente de hASlC3
transitoria (pH_{0,5} = 6,2, Figura 10A) es casi idéntica a la
descrita para el rASlC3 (pH_{0,5} = 6,5) [9]. Sin embargo, las
dependencias de pH de las corrientes sostenidas de rASlC3 y hASlC3
son claramente diferentes. Aunque el rASlC3 requiere valores de pH
muy ácidos (<pH 4,5) [9] para la activación de la corriente
sostenida, la corriente sostenida de hASlC3 comienza a activarse
cuando el pH extracelular disminuye por debajo de pH 6 y alcanza una
actividad semimáxima a pH 4,3 (Figura 10A). La actividad de canal
de hASlC3 depende, tal como la del canal rASlC3, del pH en reposo
(Figura 10B). La actividad máxima de la corriente transitoria de
hASlC3 se observó cuando el pH en reposo estaba por encima de pH 8,
indicando que una fracción de los canales catiónicos dependientes de
H^{+} de activación transitoria se inactivan a pH fisiológico. La
activación semimáxima de la corriente transitoria se observó a pH
7,5, un pH ligeramente más alcalino que el descrito para el clon
rASlC3 (pH 6,5) [9]. Cuando el pH en reposo estaba por debajo de pH
7, sólo podía observarse la activación de la corriente sostenida
después de la acidificación del medio de baño (Figura 10B). La
corriente sostenida de hASIC3 puede, tal como el canal sostenido
rASIC3, estar todavía activada cuando el pH inicial es bastante
ácido (pH 5)
(Figura 10B).
(Figura 10B).
Todos los miembros de la familia ASIC clonados
hasta la fecha son sensibles al diurético amilorida. El canal
hASlC3 no es una excepción. El efecto de la amilorida sobre la
corriente de hASlC3 es similar al descrito para el rASIC3 [9]. La
corriente transitoria se inhibe por la amilorida (K_{D} = 15,9
\muM; Figura 2C) así como por el triamtereno (Figura 10C)
mientras que la corriente de hASlC3 sostenida prácticamente no se
ve afectada por esos diuréticos.
La corriente transitoria de hASlC3 se invierte a
37,6 mV, próximo al potencial de inversión del Na^{+}, indicando
una alta selectividad por el Na^{+} frente al K^{+} (Figura
11A). Por el contrario, la corriente sostenida discrimina mucho
menos entre Na^{+} y K^{+} (relación de selectividad
gNa^{+}/gK^{+} = 1,62) ya que se invierte a 10,1 mV (Figura
11A). La baja selectividad por el Na^{+} frente al K^{+} de la
corriente sostenida de hASlC3 distingue claramente el canal hASlC3
del canal rASIC3 que es altamente selectivo para el Na^{+}
[9].
Se registraron corrientes unitarias inducidas
por protones a partir de zonas de membrana con el exterior hacia
fuera escindidas (Figuras 11 B-D). En una ventana de
pH estrecha de aproximadamente pH 7,3, puede observarse actividad
espontánea de canales (Figura 11C) que desaparece tras un aumento en
el pH hasta 8,0, una disminución en el pH hasta 6,0 (no se muestra)
o en presencia de amilorida 100 \muM (Figura 11C). Esta corriente
basal se transporta principalmente por el Na^{+}, ya que se
invierte a 30,2 mV (Figura 11B). Cuando el pH en la cara
extracelular de una zona de membrana con el exterior hacia fuera se
disminuye de pH 7,3 a pH 4, se inducen corrientes unitarias (Figura
11D) que se invierten al mismo potencial de membrana que el canal
espontáneamente activo (Figura 11B). La conductancia unitaria del
canal hASlC3 para el Na^{+} es de 15 \pm 0,6 pS, próximo al
descrito para el ASIC3 de rata (12,6 pS) [9]. Aunque la corriente
sostenida de hASlC3 activada por H^{+} no selectiva podía
detectarse fácilmente en registros de células completas, no podía
registrarse corriente sostenida o no selectiva en las zonas de
membrana con el exterior hacia fuera. Una explicación posible es
que podrían ser necesarios factores solubles que se pierden durante
la escisión de la zona de membrana.
La localización cromosómica humana del gen de
hASIC3 se determinó por PCR en un panel de ADN de híbridos de
radiación de humano-hámster. El gen de hASlC3 se
localiza en el cromosoma humano 7q35, 6,4 cRad telomérico del
microsatélite AFMA082XC9 (puntuación LOD > 21). Hasta donde
sabemos, no se han mapeado en esta región del genoma humano
enfermedades hereditarias con síntomas que concuerden con una
función alterada de un canal catiónico dependiente de H^{+}.
La subunidad del canal hASlC3 forma una canal
catiónico sostenido dependiente de H^{+} que tiene propiedades
similares a las descritas para el canal rASlC3. Sin embargo, existen
diferencias muy importantes. Lo que es más importante, la corriente
sostenida de hASlC3 requiere un pH menos ácido para la activación
que el rASIC3 [9]. A este respecto, las propiedades del canal
hASlC3 coinciden mejor con los datos fisiológicos y
electrofisiológicos de neuronas sensitivas que las del rASlC3. La
perfusión subcutánea de voluntarios humanos con tampón ácido causa
dolor. A pH 5,2, el dolor se clasificó de 20% en una escala que
variaba de 0 a 100% (dolor insoportable) [2]. Además, una
subpoblación de fibras C polimodales en preparaciones de
nervios-piel de rata puede excitarse por pH ácido
[4]. El umbral para la activación se encuentra entre pH 6,9 y pH
6,1, alcanzándose la estimulación máxima a pH 5,2. El canal
catiónico dependiente de H^{+} endógeno registrado en neuronas
sensitivas de rata comienza a activarse por debajo de pH 6,6 [5].
La dependencia de pH de la corriente sostenida de hASlC3 coincide
estrechamente con los datos fisiológicos, mientras que el rASlC3
tiene una dependencia de pH que se desplaza dos unidades de pH
hacia valores de pH más ácidos [9]. Una explicación posible para las
diferencias entre los datos fisiológicos y la dependencia de pH del
canal sostenido ASIC3 (especialmente el rASIC3) podría ser la
participación de subunidades todavía desconocidas en la formación
del canal nativo. Se ha demostrado anteriormente un ensamblaje
heteromultimérico para el canal rASlC3 [9]. El rASIC3 puede
asociarse con rASlC2b dando como resultado una selectividad
alterada del canal. Aunque el rASlC3 es totalmente selectivo de
Na^{+}, la corriente sostenida del canal heteromultimérico
rASlC3/rASlC2b no puede discriminar entre Na^{+} y K^{+}. El
canal catiónico dependiente de H^{+} registrado en neuronas
sensitivas de rata tampoco discrimina entre Na^{+} y K^{+} [5],
sugiriendo que tanto el rASIC3 como el rASIC2b participan en la
formación de este canal iónico en neuronas sensitivas de rata. Por
el contrario, con el canal de rASlC3, el hASlC3 no requiere la
coexpresión de otras subunidades para generar una corriente
sostenida no selectiva. La selectividad iónica de los canales
catiónicos sostenidos humanos dependientes de H^{+} no se conoce
todavía. Será necesaria una caracterización electrofisiológica más
detallada de canales catiónicos sostenidos humanos dependientes de
H^{+} para permitir una comparación de las propiedades del canal
nativo con las del canal hASlC3.
\vskip1.000000\baselineskip
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INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 3562 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 123..1700
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Comienzo de la página 28 =
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1620 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: humano
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 1 .. 1542
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Comienzo de la página 31 =
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1666 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: humano
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: MDEG
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 127..1663
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Comienzo de la página 34 =
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 3647 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC1B
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 109..1785
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Comienzo de la página 38 =
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1602 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC3
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 1 .. 1602
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Comienzo de la página 41 =
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1948 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC2B
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 16..1707
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1736 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: humano
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC3
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 18..1611
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 531
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: single
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: humano
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: hASlC3
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 1-531
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 3562 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 123 .. 1700
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1620 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: humano
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 1 1542
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1666 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: humano
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: MDEG
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 127 .. 1663
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 3647 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: ASIC1B
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 109 .. 1785
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1602 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: DRASIC
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 1 .. 1602
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN REFERENTE A LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 1948 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- vi)
- ORIGEN: rata
\vskip0.800000\baselineskip
- ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- NOMBRE/CLAVE: MDEG2
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- LOCALIZACIÓN: 16 .. 1707
\vskip0.800000\baselineskip
- xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\newpage
SEQ ID No.
7
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No.
8
Claims (16)
1. Una proteína de transporte de cationes humana
aislada y purificada denominada Canal Iónico Sensible a Ácido 3
humano (o hASIC3) representada por la SEC ID Nº 8, que tiene una
cinética de desensibilización bifásica con tanto un componente
selectivo de Na^{+} que se inactiva rápidamente como un componente
sostenido.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada y
purificada que codifica la proteína de transporte de cationes
humana hASIC3 de la reivindicación 1.
3. La secuencia de la reivindicación 2, que
mapea en el cromosoma 7q35.
4. La proteína de la reivindicación 1, que forma
un canal catiónico dependiente de protones.
5. La proteína de la reivindicación 4, en la que
la actividad del canal de transporte depende del pH en reposo.
6. La proteína de la reivindicación 4, que
también presenta una cinética de desensibilización bifásica.
7. La proteína de la reivindicación 1, que es
sensible a amilorida.
8. Un canal de transporte de cationes humano que
comprende al menos una molécula de Canal Iónico Sensible a Ácido 3
humano (o hASIC3) como se define en la reivindicación 1 y al menos
una molécula de un segundo canal catiónico dependiente de protones
humano.
9. El canal de transporte de cationes de la
reivindicación 8, en el que la segunda proteína de transporte de
cationes se selecciona del grupo que consiste en hASIC2A, hASIC2B,
hASIC1A y hASIC1B.
10. Un vehículo de clonación que comprende una
secuencia de la reivindicación 2.
11. El vehículo de clonación de la
reivindicación 10, que comprende además una secuencia que codifica
una segunda proteína de transporte de cationes seleccionada del
grupo que consiste en hASIC2A, hASIC2B, hASIC1A y hASIC1B.
12. Una célula transformada que contiene el
vehículo de clonación de la reivindicación 10.
13. La célula transformada de la reivindicación
12, que expresa el Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano.
14. Una célula transformada que contiene el
vehículo de clonación de la reivindicación 11.
15. La célula transformada de la reivindicación
14, que expresa un canal de transporte de cationes humano que
comprende al menos una molécula de Canal Iónico Sensible a Ácido 3
humano y al menos una molécula de una segunda proteína de
transporte de cationes seleccionada del grupo que consiste en
hASIC2A, hASIC2B, hASIC1A y hASIC1B.
16. Un método de exploración de sustancias
capaces de modular la actividad de canales de trasporte de cationes
compuestos por el Canal Iónico Sensible a Ácido 3 humano como se
define en la reivindicación 1, que comprende poner en contacto
cantidades preseleccionadas de la sustancia a ensayar con células
que expresen dicho canal de transporte de cationes, medir los
efectos de la sustancia sobre las funciones de transporte del canal
de transporte de cationes e identificar la sustancia que tiene un
efecto positivo o negativo sobre la actividad del canal de
potasio.
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