ES2272050T3 - Nueva familia de canales de potasio de mamiferos mecanosensibles activados por los acidos grasos poliinsaturados y su utilizacion especialmente para el cribado de farmacos. - Google Patents
Nueva familia de canales de potasio de mamiferos mecanosensibles activados por los acidos grasos poliinsaturados y su utilizacion especialmente para el cribado de farmacos. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína purificada que forma un canal de potasio mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por el riluzol, cuya secuencia de aminoácidos se representa en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1.
Description
Nueva familia de canales de potasio de mamíferos
mecanosensibles activados por los ácidos grasos poliinsaturados y su
utilización especialmente para el cribado de fármacos.
La presente invención se refiere a una nueva
clase de canales de potasio mecanosensibles activados por los
ácidos grasos poliinsaturados. La invención se basa en el
descubrimiento de un nuevo canal de potasio, denominado TRAAK por
su nombre en inglés TWICK-Related
AA-Actived K^{+} channel,
mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados e,
igualmente, por el riluzol, que es un agente neuroprotector. Las
propiedades de los canales de la familia TRAAK, así como su
distribución hística, confiere a estos canales un papel primordial
en el transporte de potasio en muchos tipos celulares.
Los canales de potasio son proteínas ubicuas y
su excepcional diversidad funcional los hacen candidatos ideales
para un gran número de procesos biológicos. Intervienen
particularmente en la regulación de la excitabilidad neuronal y
muscular, en el ritmo cardíaco y en la secreción de hormonas. Se han
descrito tres tipos estructurales de canales de potasio en los
mamíferos. El primero es el tipo "Shaker" que se compone de
subunidades que tienen 6 segmentos transmembranarios y un dominio P
que está implicado en la formación del poro iónico. El segundo es
el tipo IRK con dos segmentos transmembranarios y un dominio P. El
tercero se ha descrito más recientemente y corresponde al tipo
TWIK, que tiene cuatro segmentos transmembranarios y dos dominios P.
Se han identificado tres canales de este tipo:
TWIK-1 [Fink, M. et al. EMBO J, 15,
6854-6862 (1996), Lesage, F et al. EMBO
J, 15, 1004-1011 (1996)], TREK-1
y TASK [Duprat, F. et al. EMBO J 16,
5464-5471 (1997)]. A pesar de una estructura
general conservada, tienen secuencias primarias poco similares, ya
que presentan una identidad de aminoácidos entre el 20 y el 25%.
La presente invención se basa en el
descubrimiento y en la clonación de un nuevo canal designado TRAAK,
miembro de la familia de los canales TWIK. El gen que codifica este
canal es más particularmente homólogo, a nivel de su secuencia de
aminoácidos, al canal TREK-1 con el que presenta una
identidad del 38% en aminoácidos. La presente invención se basa
igualmente en las propiedades electrofisiológicas únicas de estos
dos canales TREK-1 y TRAAK. En efecto, estos dos
canales producen corrientes selectivas de potasio que se activan
aplicando una tensión en la membrana celular, los canales llamados
mecanosensibles, o mediante la aplicación de ácidos grasos
poliinsaturados, especialmente el ácido araquidónico que es un
mensajero esencial de la comunicación inter- e intracelular y un
importante modulador de la excitabilidad neuronal [Ordway, R, W.,
Singer, J. J. y Walsh, J. V. 14, 96-100 (1991),
Bliss, T. V. P y Collingridge, G. L. Nature
31-39 (1993), Piomelli, D. Curr. Opin.
Cell. Biol. 5, 274-280 (1993), Meves, H.
Prog. Neurobiol. 43, 175-186 (1994),
Piomelli, D, Crit. Rev. Neurobiol. 8,
65-83 (1994)]. Estos canales también se abren con el
riluzol, que es un neuroprotector [Malgouris, C. et al,
J. Neurosci. 9, 3720-3727 (1989),
Pratt, J, et al. Neurosci. Lett. 140,
225-230 (1992)] utilizado en clínica para prolongar
la supervivencia de los enfermos que padecen esclerosis lateral
amiotrófica.
El haber puesto de manifiesto esta nueva clase
de canales de potasio y la expresión heteróloga de estos canales
permite particularmente disponer de nuevos medios para buscar,
mediante cribado, nuevos fármacos capaces de modular la actividad
de estos canales de potasio y, por lo tanto, prevenir o tratar las
enfermedades que afectan a estos canales, como la epilepsia, las
enfermedades cardíacas (arritmias) y vasculares, las
neurodegeneraciones, particularmente las que están asociadas con
las isquemias y con las anoxias, las enfermedades endocrinas
asociadas con alteraciones de la secreción de hormonas, las
enfermedades musculares.
Por lo tanto, la presente invención tiene por
objeto una proteína purificada que forma un canal de potasio
mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados,
particularmente el ácido araquidónico, y por el riluzol. Más
particularmente, la invención se refiere a la proteína que forma el
canal TRAAK cuya secuencia de aminoácidos está representada en la
lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o un
derivado funcionalmente equivalente de esta proteína.
Tales derivados son aquéllos cuya secuencia
comprende una modificación y/o una supresión y/o una adición de uno
o varios residuos de aminoácidos, de aquí en adelante esta
modificación y/o supresión y/o adición no modificará las
propiedades del canal TRAAK. El experto en la técnica puede analizar
tales derivados según las técnicas descritas en los ejemplos dados
de aquí en adelante, que han permitido poner de manifiesto las
propiedades biofísicas y farmacológicas del canal TRAAK. Un
derivado de estos es, más particularmente, el canal
TREK-1 cuya secuencia de aminoácidos se representa
en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 2.
Se pueden preparar anticuerpos poli- o
monoclonales dirigidos contra, al menos, una proteína que forma un
canal iónico de la invención mediante los métodos clásicos descritos
en la bibliografía. Estos anticuerpos son útiles para buscar la
presencia de canales iónicos de la invención en diferentes tejidos
humanos o animales, pero también se les puede encontrar aplicación
en el dominio terapéutico para inhibir o activar in vivo,
gracias a su especificidad, un canal TRAAK y/o sus derivados.
La presente invención también tiene por objeto
una molécula de ácido nucleico purificada que comprende o que
consiste en una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que
forma un canal de potasio mecanosensible activado por los ácidos
grasos poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por
el riluzol. Más particularmente, la invención se refiere a una
molécula de ácido nucleico que comprende, al menos, una secuencia
que codifica la proteína que forma el canal TRAAK cuya secuencia de
aminoácidos está representada en la lista de secuencias adjuntas
con el número SEQ ID n.º 1 o por un derivado funcionalmente
equivalente de esta proteína. Una molécula de ADN que comprende la
secuencia que codifica la proteína TRAAK está representada en la
lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o su
secuencia complementaria. Más particularmente, tal secuencia de
ácido nucleico comprende la secuencia comprendida entre los
nucleótidos 284 y 1477 de la SEQ ID n.º 1 o su secuencia
complementaria.
La invención también se refiere a un vector que
comprende, al menos, una molécula del ácido nucleico precedente,
ventajosamente asociada a las secuencias de control adaptadas, así
como un procedimiento de producción o de expresión, en un
hospedador celular, de una proteína que forma un canal iónico según
la invención. La preparación de estos vectores, así como la
producción o la expresión en un huésped de los canales de la
invención, se puede realizar mediante las técnicas de biología
molecular y de ingeniería genética bien conocidas por el experto en
la técnica.
A modo de ejemplo, un procedimiento de
producción de una proteína que forma un canal catiónico según la
invención consiste en:
- -
- transferir una molécula de ácido nucleico de la invención o un vector que contiene dicha molécula a un huésped celular,
- -
- cultivar dicho huésped celular en unas condiciones que permiten la producción de la proteína que forma el canal de potasio,
- -
- aislar, mediante cualquiera de los medios apropiados, las proteínas que forman los canales de potasio de la invención.
A modo de ejemplo, un procedimiento de expresión
de un canal iónico según la invención consiste en:
- -
- transferir una molécula de ácido nucleico de la invención o un vector que contiene dicha molécula a un huésped celular,
- -
- cultivar dicho huésped celular en las condiciones que permiten la expresión de los canales de potasio de la invención.
El huésped celular realizado en los
procedimientos anteriores se puede elegir entre los procariotas o
los eucariotas y, particularmente, entre las bacterias, las
levaduras, las células de mamíferos, de plantas o de insectos.
El vector utilizado se elige en función del
huésped al que se vaya a transferir, pudiéndose tratar de cualquier
vector, como un plásmido.
Por lo tanto, la invención se refiere también a
los huéspedes celulares y, más particularmente, a las células
transformadas que expresan los canales de potasio que presentan unas
propiedades y una estructura del tipo de las del canal TRAAK
obtenidas según los procedimientos anteriores. Estas células son
útiles para el cribado de las sustancias capaces de modular las
corrientes de los canales TRAAK. Este cribado se efectúa poniendo
en contacto cantidades variables de una sustancia a probar con las
células que expresan los canales de la invención, midiendo luego,
con cualquiera de los medios adecuados, los posibles efectos de
dicha sustancia sobre las corrientes de potasio de dichos canales.
Las técnicas electrofisiológicas permiten también estos estudios y
son también objeto de la presente invención desde el momento en que
estas técnicas implanten los canales TRAAK o sus derivados. Este
procedimiento de cribado permite identificar los fármacos capaces de
modular la actividad de los canales de potasio de la invención y,
por lo tanto, capaces de prevenir o tratar las enfermedades debidas
a estos canales. Una sustancia química o biológica capaz de
modificar las corrientes de un canal de potasio según la invención
que se puede utilizar para la preparación de un medicamento útil
para prevenir o tratar las enfermedades del corazón o del sistema
nervioso en un sujeto humano o animal, como las enfermedades
cardíacas (arritmias) y vasculares, las neurodegeneraciones,
particularmente las asociadas a las isquemias y las anoxias, las
enfermedades endocrinas asociadas a las alteraciones de la secreción
de hormonas, las enfermedades musculares.
Una molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína que forma un canal TRAAK o un derivado del mismo, o un
vector que comprende esta molécula de ácido nucleico o incluso una
célula que expresa los canales TRAAK, son también útiles para la
preparación de animales transgénicos. Se puede tratar de animales
que sobreexpresan dichos canales, pero sobretodo, de animales
denominados genosuprimidos (knock-out), es
decir, que presentan una deficiencia en estos canales; estos
animales transgénicos se preparan mediante los métodos conocidos por
el experto en la técnica y permiten disponer de modelos vivos para
el estudio de enfermedades de los animales asociadas a los
canales
TRAAK.
TRAAK.
Estos animales transgénicos, así como los
huéspedes celulares descritos anteriormente, son útiles en calidad
de modelos para el estudio de las enfermedades asociadas a estos
canales de potasio mecanosensibles activados por los ácidos grasos
poliinsaturados, bien porque sobreexpresan los canales de potasio
del tipo del canal TRAAK, bien porque presentan una deficiencia en
estos canales de potasio.
Además, una proteína que forma un canal iónico
neuronal TRAAK también puede ser útil para la fabricación de
medicamentos destinados a tratar o prevenir las enfermedades en las
que intervienen estos canales. Por lo tanto, la invención se
refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden
como principio activo, al menos, una de las proteínas opcionalmente
asociada a un vehículo fisiológicamente aceptable.
Asimismo, las moléculas de ácido nucleico de la
invención o las células transformadas con dicha molécula se pueden,
por lo tanto, utilizar en las estrategias de genoterapia con el
objetivo de compensar una deficiencia de los canales TRAAK a nivel
de uno o varios tejidos de un paciente. Por lo tanto, la invención
se refiere también a un medicamento que comprende las moléculas de
ácido nucleico de la invención o células transformadas por dichas
moléculas para el tratamiento de las enfermedades en las que
intervienen los canales TRAAK y sus derivados.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, que describen
el trabajo de investigación que ha conducido a la identificación y a
la caracterización de estos canales de potasio mecanosensibles
activados por los ácidos grasos y en los que se hará referencia a
las secuencias y a los dibujos adjuntos en los que:
- la figura 1 y la SEQ ID n.º 1 representan la
secuencia nucleotídica del ADNc de TRAAK y la secuencia de
aminoácidos de la secuencia codificante.
- la figura 2 representa el alineamiento de las
secuencias de TWIK-1, TREK-1, TASK y
TRAAK, que son los cuatro canales del tipo TWIK clonados actualmente
en los mamíferos, así como el dendrograma deducido de este
alineamiento. Los residuos idénticos se representan sobre fondo
negro y los residuos conservados sobre fondo gris.
- la figura 3 representa el análisis por
RT-PCR de la distribución de TREK-1
y TRAAK en los tejidos de los ratones adultos. Los fragmentos de los
transcritos que codifican TREK-1 y TRAAK se han
ampliado por PCR con ayuda de oligonucleótidos específicos,
transferidos sobre una membrana de nilón y, luego, hibridados con
los oligonucleótidos internos marcados con fósforo 32.
- la figura 4 muestra las propiedades
electrofisiológicas de las corrientes TRAAK registradas mediante la
técnica de pinzamiento zonal de membrana (patch clamp) sobre
los ovocitos de Xenopus que han recibido una inyección de
ARNc de TRAAK (a, b, c) y sobre las células COS transfectadas con un
vector que expresa TRAAK (d, e, f). En a): se han mantenido los
ovocitos con un potencial de -80 mV y, a continuación, se han
registrado las corrientes después de saltos de potencial de -150 a
+50 mV a incrementos de 20 mV. Los registros se han realizado en un
medio externo que contiene una concentración de K^{+} de 2 mM o de
74 mM. En b): relación corriente-potencial según el
mismo experimento que en a). En c): inversión del potencial
(E_{rev}) de las corrientes TRAAK en función de la concentración
externa de K^{+}. En d): corrientes registradas sobre las células
COS transfectadas con TRAAK siguiendo el mismo protocolo que en a).
En e): relación corriente-potencial según el mismo
experimento que en d).
- la figura 5 muestra el efecto de la
osmolaridad del medio externo sobre los ovocitos que han recibido
una inyección de ARNc TREK-1 o TASK. En A):
comparación de los efectos de la aplicación de una disolución
hipertónica (417 mOsm, mediante adición de manitol) sobre los
ovocitos testigos (CD8) y sobre los ovocitos que expresan TASK o
TREK-1. Se miden las corrientes después de un salto
de potencial de -80 a +80 mV. En inserción se muestra la corriente
TREK-1 antes y después (indicada con una flecha) de
la aplicación de la disolución hipertónica. En B): efecto
reversible de una disolución hipertónica (434 mOsm, mediante adición
de sacarosa) sobre las relaciones
corriente-potencial deducidas de los cambios de
potencial que duran 600 ms. En inserción se muestra la cinética del
efecto producido por la disolución hipertónica. Las corrientes se
miden a 80 mV.
- la figura 6 muestra que TREK-1
es un canal de potasio mecanosensible en las células COS
transfectadas. En B): actividades canal (N*Po) en los parches
(patch) de membrana mantenidos a 0 mV y obtenidos en la
configuración de célula adherida a partir de las células testigos
(CD8), o de las células transfectadas con TREK-1 o
TASK. En C), el estiramiento de la membrana no tiene efecto sobre la
actividad del canal TASK (configuración de célula adherida). El
parche se mantiene a 50 mV. En D): los canales
TREK-1 están silenciosos en reposo y se abren
cuando se produce una tensión de la membrana. El parche se mantiene
a +50 mV. En E): histograma que da la amplitud de la actividad del
canal creado por la tensión de la membrana e ilustrado en G). En F):
relación corriente-potencial en canal único de
TREK-1 (n = 6). La conductancia de 81 pS se ha
calculado entre 0 y 80 mV. En G): activación de
TREK-1 mediante estiramiento de la membrana (30 mm
de Hg) en la configuración dentro-afuera
(inside-out). El potencial de mantenimiento
es de 100 mV. En H): efecto producido por las tensiones cada vez
más importantes (5 s de duración) sobre la relación
corriente-potencia de un parche que expresa
TREK-1. En I): curva dosis-efecto de
la activación de TREK-1 por la tensión (n = 6). La
curva se traza siguiendo los puntos experimentales que siguen la
relación de Boltzmann.
- la figura 7 muestra la activación de TRAAK por
el estiramiento de la membrana celular en las células COS
transfectadas. La corriente se registra a 0 mV en la configuración
dentro-afuera. Las depresiones aplicadas mediante
la pipeta de registro se indican a la derecha de la señal.
- la figura 8 muestra la activación de
TREK-1 por el ácido araquidónico en las células COS
transfectadas. En A): la actividad de TREK-1 se
registra en la configuración de célula adherida. Se estimula el
parche mediante un incremento de potencial durante 800 ms cada 5 s.
Las corrientes se miden a 80 mV. Las aplicaciones de ácido
araquidónico (AA, 10 \muM) se indican mediante barras
horizontales. Durante el experimento, se ha estimulado el parche
con tensiones de 50 mm Hg (indicadas con flechas). A los 9 minutos,
se ha escindido el parche en la configuración
dentro-afuera. En B): relaciones
corriente-potencial que corresponden al experimento
ilustrado en A). En C): actividad de TREK-1 en la
configuración de célula adherida con AA a 10 \muM en la pipeta. El
aumento del potencial dura 800 ms y las corrientes se miden a 80
mV. En D): relaciones corriente-potencial del canal
único en el momento en el que se coloca la pipeta sobre la membrana
o después de 20 min y 1 min después de haber escindido el parche en
la configuración dentro-afuera. En E), efecto del AA
(10 \muM) sobre la corriente TREK-1 registrada
sobre una célula entera. Se mide la corriente a 80 mV. En F): el AA
no tiene efecto sobre la corriente TREK-1 medida en
la célula entera cuando está en la pipeta. Se mide la corriente 30
min después de haber roto el parche (señal de control) con un
aumento del potencial durante 800 ms. A continuación, se mide la
corriente después de una aplicación de AA de 1 minuto en el medio
externo (señal de AA).
- la figura 9 muestra el efecto del ácido
araquidónico y de otros ácidos grasos sobre el canal TRAAK
expresado en las células COS transfectadas. En a): relaciones
corriente-potencial obtenidas a partir de aumentos
del potencial de 500 ms que van de -150 a +50 mV, después de la
aplicación de AA (10 \muM) y después de lavar. En inserción se
representan las corrientes desencadenadas por los cambios de
potencial de -130 a +50 mV por incrementos de 20 mV. El potencial
de mantenimiento es de -80 mV. En b): relación
dosis-efecto de la activación de TRAAK por el AA.
En c): relaciones corriente-potencial obtenidas como
en a) en la configuración fuera-afuera
(outside-out). En inserción se muestra el
efecto del AA a 20 mV. En e): histograma que representa el
coeficiente de aumento de las corrientes obtenidas después de la
aplicación de diferentes ácidos grasos (10 \muM). En f):
histograma que muestra el valor de las corrientes registradas en la
configuración de célula entera antes y después de la aplicación del
AA sobre las células transfectadas transitoriamente con
TWIK-1, TASK, TREK-1 y TRAAK y
sobre las células transfectadas de forma estable con TRAAK. Se
indica el coeficiente de aumento en cada caso.
- la figura 10 muestra el efecto del riluzol
sobre las corrientes TREK-1 y TRAAK denominado
TREK-2. Las relaciones
corriente-potencial se obtienen como en la figura 9a
antes y después de la aplicación del riluzol (100 \muM) sobre
células COS transfectadas. En inserción se muestran los efectos del
riluzol sobre las corrientes registradas en la configuración
fuera-afuera.
La secuencia del canal TWIK-1 se
ha utilizado para buscar secuencias homólogas en las bases de datos
públicas de ADN (Genbank y EMBL) utilizando el programa de
alineamientos BLAST. Así se ha identificado una secuencia expresada
TAG humana que ha servido para cribar una base de datos de ADNc de
cerebro de ratón. Se han aislado y caracterizado varios clones. Se
ha secuenciado el más largo. Se han puesto de manifiesto las
siguientes características:
- -
- los ADNc aislados contienen un marco abierto de lectura de 1197 nucleótidos que codifican un polipéptido de 398 restos. En la figura 1 se muestran las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas.
- -
- esta proteína contiene 4 posibles segmentos transmembranarios y dos dominios P. Posee, por lo tanto, la misma estructura general que los canales TWIK-1, TREK-1 y TASK. Además, presenta homologías de secuencia con estos canales: una identidad de aproximadamente el 20 al 25% con TWIK-1 y TASK, y del 38% con TREK-1. Fuera de los dominios P que están presentes en todos los canales de potasio clonados, no tiene homología de secuencia significativa con los canales de tipo Shaker e IRK. Por lo tanto, pertenece a la familia TWIK-1 y su homólogo más cercano es TREK-1. Estas relaciones aparecen en la figura 2 en el alineamiento de las secuencias de las proteínas así como en el dendrograma que se ha deducido de este alineamiento. Por lo tanto, TRAAK y TREK-1 forman una subclase estructural en el seno de la familia TWIK-1.
- -
- se han deducido las secuencias de diferentes oligonucleótidos a partir de la secuencia de TRAAK. Estos oligonucleótidos han permitido, por RT-PCR, estudiar la distribución del transcrito que codifica TRAAK en los tejidos del ratón adulto. Tal y como se muestra en la figura 3, TRAAK se expresa exclusivamente en los tejidos neuronales: cerebro, cerebelo, médula espinal y retina. Esta distribución es muy diferente de la de su homólogo más próximo, que es el canal TREK-1. Éste tiene una distribución casi ubicua y está presente tanto en los tejidos excitables como en los tejidos no excitables.
Para el estudio funcional, se ha insertado la
secuencia codificante de TRAAK en el vector pEXO y se ha sintetizado
un ARN complementario (ARNc) a partir de esta construcción, que se
ha inyectado en los ovocitos de Xenopus. Para la expresión
en las células COS, se ha subclonado la secuencia de TRAAK en un
vector de expresión bajo el control de un promotor eucariota y se
ha transfectado en las células. Mediante la técnica de pinzamiento
zonal de membrana (patch clamp) se ha medido una corriente no
inactivadora ausente en los ovocitos y las células de testigo tal y
como se representa en la figura 4. La activación es instantánea y no
se puede resolver, ya que está enmascarada por la descarga
capacitiva de la corriente registrada al principio del aumento del
potencial. La relación corriente-potencial se
rectifica en el sentido saliente cuando la concentración externa de
K^{+} es igual a 2 mM. Se observan corrientes entrantes cuando
aumenta la concentración externa de K^{+}. Cualquiera que sea
esta concentración, las curvas corriente-potencial
siguen perfectamente la relación de
Goldman-Hodgkin-Katz. Esto demuestra
que las corrientes TRAAK no tienen ninguna otra rectificación que la
debida a las concentraciones disimétricas de K^{+} de cada lado
de la membrana y que TRAAK es un canal que no es dependiente del
potencial. El canal TRAAK es específico de potasio. La inversión del
potencial de las corrientes sigue el potencial de equilibrio del
K^{+}, y el cambio por 10 de la concentración de K^{+} conduce
a un cambio del valor de la inversión del potencial conforme a lo
predicho por la ecuación de Nernst (48,7 \pm 0,7 mV por 10, n =
4).
Las propiedades de TRAAK, la ausencia de
cinéticas de activación e inactivación así como su apertura a todos
los potenciales de membrana son características de los canales de
potasio denominados de fuga. Tal y como está previsto para los
canales de este tipo, su expresión en los ovocitos se asocia a una
fuerte polarización. El potencial en reposo de la membrana pasa de
-43 \pm 2,4 mV (n = 7), en los ovocitos de control, a -88 \pm
1,4 mV (n = 23) en los ovocitos transfectados, un valor próximo al
potencial de equilibrio del potasio. También se ha expresado TRAAK
en las células COS-M6 transfectadas. También en este
sistema, las corrientes TRAAK son instantáneas y no se inactivan.
El registro de los parches en la configuración
fuera-afuera indica una conductancia unitaria de
TRAAK igual a 45,5 \pm 3,7 pS (n = 10).
Se ha establecido que la subclase estructural
formada por los canales de K^{+} TREK-1 y TRAAK
está asociada a las propiedades electrofisiológicas únicas entre
los canales de K^{+} de tipo TWIK. En efecto, los canales
TREK-1 y TRAAK se activan por una tensión aplicada
en la membrana plasmática. Esta tensión se obtiene bien
indirectamente cambiando la osmolaridad del medio externo y, por lo
tanto, el volumen de la célula, o bien más directamente aplicando
una depresión en la pipeta de registro. Se han puesto de manifiesto
las características siguientes:
- -
- la figura 5 muestra que la expresión del canal TREK-1 en los ovocitos de Xenopus que se mantienen en un medio hipotónico induce corrientes instantáneas y no inactivantes. Cuando la osmolaridad del medio externo se aumenta al añadirle manitol, se observa una importante disminución de la amplitud de la corriente TREK-1, lo que demuestra que el canal es sensible al volumen celular. El canal TASK no se ve afectado por la osmolaridad del medio externo.
- -
- la figura 6 demuestra que el canal TREK-1 es mecanosensible. En las células COS transfectadas y en las condiciones de reposo, no se detecta la actividad de TREK-1 en la configuración de célula adherida, mientras que la actividad de TASK se mide fácilmente en las mismas condiciones. Sin embargo, la aplicación de una depresión en la membrana por medio de la pipeta de registro desencadena una apertura del canal TREK-1. No se observa ningún efecto semejante con TASK. La activación de TREK-1 inducida por la tensión también se obtiene en la configuración dentro-afuera, es decir, cuando se escinde el parche y cuando la cara interna de la membrana se encuentra en contacto con el medio externo. En esta configuración, la actividad del canal también está ausente o es muy débil si no se aplica tensión a la membrana. El efecto de la tensión es gradual y se detecta una activación que es igual a la mitad del valor máximo para una depresión equivalente a 23 mm Hg. Por otra parte, la figura 6h muestra que la activación inducida por el estiramiento es independiente del potencial de la membrana.
La activación de los canales
TREK-1 y TRAAK por el estiramiento mecánico de la
membrana se imita con la aplicación del ácido araquidónico y con la
aplicación de otros ácidos grasos poliinsaturados, pero no con la
aplicación de ácidos grasos saturados. Se han puesto de manifiesto
las siguientes características:
- -
- la figura 8 muestra que TREK-1 es activado por el ácido araquidónico (AA). La aplicación del AA sobre las células de testigo (CD8) no tiene ningún efecto. Las activaciones obtenidas por el estiramiento de la membrana y con la aplicación del AA son similares en amplitud, pero no son aditivas. Los dos tipos de activación están reprimidos en la configuración de célula adherida. Cuando la pipeta de registro contiene el AA, la escisión del parche en la configuración dentro-afuera induce de forma reproducible un aumento importante de la actividad de TREK-1. Del mismo modo, la amplitud de la activación inducida por una depresión aplicada en la pipeta de registro es más importante cuando el parche está escindido. Finalmente, se ha observado que, en la célula entera, el AA interno no inactiva TREK-1. Cuando la célula se dializa durante periodos de hasta 30 minutos, no tiene lugar ninguna activación del canal por el AA interno, aunque se observe la activación algunos segundos después de la aplicación del AA en el medio externo. Estos resultados indican que el AA activa TREK-1 sólo cuando se aplica sobre la cara externa de la membrana.
- -
- la figura 9 demuestra que el canal TRAAK es activado por el AA del mismo modo que TREK-1. La activación es reversible y dependiente de la concentración aplicada. Esta activación también se observa en la configuración "fuera-afuera". La activación de TRAAK por el AA no se previene cuando la perfusión del AA contiene una mezcla de inhibidores del metabolismo del AA (ácido nordihidroguaiarético para la lipoxigenasa, la indometacina para la ciclooxigenasa, el clotrimazol para la epoxigenasa y el ETYA que inhibe el conjunto de vías de metabolización del AA, todos a 10 mM). En estas condiciones, el aumento de la corriente inducido por el AA es de 6,6 \pm 0,5 veces (n = 3) (a +50 mV). Se puede observar un aumento de 1,7 \pm 0,4 veces (n = 3) de la corriente de potasio de fondo después de la administración del cóctel de inhibidores en ausencia del AA. Este resultado demuestra que la activación por el AA no requiere que el AA se transforme en eicosanoides.
- -
- la figura 9 muestra igualmente que otros ácidos grasos que no sean el AA activan el canal. Esta activación es específica de los ácidos grasos cis poliinsaturados y se observa con los ácidos oleico (C18\Delta9), linoleico (C18\Delta9,12), linolénico (C18\Delta9,12,15), eicosapentaenoico (EPA, C20\Delta5,8,11,14,17) y docosohexaenoicos (DOHA, C20\Delta4,7,10,13,16,19) a una concentración de 10 mM. Los ácidos saturados tales como los ácidos palmítico (C16), esteárico (C18) y araquídico (C20) no producen ningún efecto. Los derivados del AA y del ácido docosohexaenoico en los que el grupo carboxílico está sustituido por un grupo alcohol (AA-OH) o éster metílico (AA-ME, DOHA-ME) son igualmente inactivos sobre TRAAK. El efecto del AA sobre TRAAK es observable también sobre las células transfectadas tanto de forma transitoria como de forma estable (se han probado 3 líneas de células estables independientes).
- -
- finalmente, la figura 9 demuestra que el efecto de inactivación por el AA es específico del TREK-1 y de TRAAK. No se observa ningún efecto del mismo tipo sobre los canales TWIK-1 y TASK.
En los ovocitos, TRAAK es insensible a los
agentes que bloquean los canales de potasio clásicos tales como el
tetraetilamonio (TEA, 1 mM), la 4-aminopiridina
(4-AP, 1 mM) y la quinina (100 mM). Y a la inversa,
el Ba^{2+} (1 mM) bloquea el 56,7 \pm 4,6%, n = 5, de la
corriente TRAAK a +40 mV.
El riluzol es un agente neuroprotector que se
utiliza para prolongar la supervivencia de los enfermos que padecen
esclerosis lateral amiotrófica. La figura 10 demuestra que este
agente farmacológico es un abridor de los canales
TREK-1 y TRAAK. TREK-1 y TRAAK son
los primeros canales iónicos cuya actividad se estimula con el
riluzol.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1794 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: TRAAK
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: de 284 a 1477
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIA: SEQ ID N.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: ... pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: TREK-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: de 484 a 1596
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Proteína purificada que forma un canal de
potasio mecanosensible activado por los ácidos grasos
poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por el
riluzol, cuya secuencia de aminoácidos se representa en la lista de
secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1.
2. Anticuerpos poli- o monoclonales dirigidos
contra, al menos, una proteína que forma un canal iónico según la
reivindicación 1.
3. Molécula de ácido nucleico purificado, que
comprende o consiste en una secuencia nucleica que codifica una
proteína según la reivindicación 1.
4. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 3, que comprende la secuencia comprendida entre los
nucleótidos 284 y 1477 de la secuencia representada en la lista de
secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o su secuencia
complementaria.
5. Vector que comprende, al menos, una molécula
de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó
4.
6. Procedimiento de producción de una proteína
que forma un canal de potasio según la reivindicación 1,
caracterizado porque consiste en:
- transferir una molécula de ácido nucleico
según una de las reivindicaciones 3 ó 4 o un vector según la
reivindicación 5 a un huésped celular,
- cultivar dicho huésped celular en condiciones
que permiten la producción de la proteína que forma dicho canal de
potasio,
- aislar, por cualquiera de los medios
adecuados, las proteínas que forman dichos canales.
7. Procedimiento para expresar un canal de
potasio según la reivindicación 1, caracterizada porque
consiste en:
- transferir una molécula de ácido nucleico
según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 o un vector
según la reivindicación 5 a un huésped celular,
- cultivar dicho huésped celular en las
condiciones que permiten la producción de dichos canales de
potasio.
8. Huésped celular no humano que se puede
obtener mediante un procedimiento según la reivindicación 7.
9. Procedimiento de cribado de las sustancias
capaces de modular la actividad de los canales de potasio
mecanosensibles activados por los ácidos grasos poliinsaturados
según la reivindicación 1, caracterizado porque se ponen en
contacto cantidades variables de una sustancia a probar con células
según la reivindicación 7 y, luego, se mide, mediante cualquiera de
los medios adecuados, los posibles efectos de dicha sustancia sobre
las corrientes de dichos canales.
10. Procedimiento según la reivindicación 9
aplicado al cribado de sustancias capaces de prevenir o de tratar
las enfermedades del sistema nervioso en un ser humano o un
animal.
11. Procedimiento según la reivindicación 10
aplicado al cribado de las sustancias capaces de prevenir o de
tratar las neurodegeneraciones.
12. Procedimiento según la reivindicación 11
aplicado al cribado de las sustancias capaces de prevenir o de
tratar las neurodegeneraciones asociadas a las isquemias y a las
anoxias.
13. Composición farmacéutica que comprende como
principio activo, al menos, una proteína que forma un canal de
potasio según la reivindicación 1, o un anticuerpo según la
reivindicación 2, o una molécula de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 3 ó 4, o un vector según la reivindicación 5.
14. Composición según la reivindicación 13,
caracterizada porque dicho principio activo se asocia a un
vehículo fisiológicamente aceptable.
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