ES2272050T3

ES2272050T3 - Nueva familia de canales de potasio de mamiferos mecanosensibles activados por los acidos grasos poliinsaturados y su utilizacion especialmente para el cribado de farmacos.

Info

Publication number: ES2272050T3
Application number: ES99904937T
Authority: ES
Inventors: Eric Honore; Michel Fink; Michel Lazdunski; Florian Lesage; Fabrice Duprat
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1998-03-05
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2019-02-23
Also published as: EP1058726A2; JP4289790B2; WO1999045108A3; FR2775688B1; EP1058726B1; CA2322055A1; CA2322055C; DE69932807D1; FR2775688A1; DE69932807T2; JP2002505102A; WO1999045108A2; US6942979B1

Abstract

Proteína purificada que forma un canal de potasio mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por el riluzol, cuya secuencia de aminoácidos se representa en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1.

Description

Nueva familia de canales de potasio de mamíferos mecanosensibles activados por los ácidos grasos poliinsaturados y su utilización especialmente para el cribado de fármacos.

La presente invención se refiere a una nueva clase de canales de potasio mecanosensibles activados por los ácidos grasos poliinsaturados. La invención se basa en el descubrimiento de un nuevo canal de potasio, denominado TRAAK por su nombre en inglés TWICK-Related AA-Actived K^{+} channel, mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados e, igualmente, por el riluzol, que es un agente neuroprotector. Las propiedades de los canales de la familia TRAAK, así como su distribución hística, confiere a estos canales un papel primordial en el transporte de potasio en muchos tipos celulares.

Los canales de potasio son proteínas ubicuas y su excepcional diversidad funcional los hacen candidatos ideales para un gran número de procesos biológicos. Intervienen particularmente en la regulación de la excitabilidad neuronal y muscular, en el ritmo cardíaco y en la secreción de hormonas. Se han descrito tres tipos estructurales de canales de potasio en los mamíferos. El primero es el tipo "Shaker" que se compone de subunidades que tienen 6 segmentos transmembranarios y un dominio P que está implicado en la formación del poro iónico. El segundo es el tipo IRK con dos segmentos transmembranarios y un dominio P. El tercero se ha descrito más recientemente y corresponde al tipo TWIK, que tiene cuatro segmentos transmembranarios y dos dominios P. Se han identificado tres canales de este tipo: TWIK-1 [Fink, M. et al. EMBO J, 15, 6854-6862 (1996), Lesage, F et al. EMBO J, 15, 1004-1011 (1996)], TREK-1 y TASK [Duprat, F. et al. EMBO J 16, 5464-5471 (1997)]. A pesar de una estructura general conservada, tienen secuencias primarias poco similares, ya que presentan una identidad de aminoácidos entre el 20 y el 25%.

La presente invención se basa en el descubrimiento y en la clonación de un nuevo canal designado TRAAK, miembro de la familia de los canales TWIK. El gen que codifica este canal es más particularmente homólogo, a nivel de su secuencia de aminoácidos, al canal TREK-1 con el que presenta una identidad del 38% en aminoácidos. La presente invención se basa igualmente en las propiedades electrofisiológicas únicas de estos dos canales TREK-1 y TRAAK. En efecto, estos dos canales producen corrientes selectivas de potasio que se activan aplicando una tensión en la membrana celular, los canales llamados mecanosensibles, o mediante la aplicación de ácidos grasos poliinsaturados, especialmente el ácido araquidónico que es un mensajero esencial de la comunicación inter- e intracelular y un importante modulador de la excitabilidad neuronal [Ordway, R, W., Singer, J. J. y Walsh, J. V. 14, 96-100 (1991), Bliss, T. V. P y Collingridge, G. L. Nature 31-39 (1993), Piomelli, D. Curr. Opin. Cell. Biol. 5, 274-280 (1993), Meves, H. Prog. Neurobiol. 43, 175-186 (1994), Piomelli, D, Crit. Rev. Neurobiol. 8, 65-83 (1994)]. Estos canales también se abren con el riluzol, que es un neuroprotector [Malgouris, C. et al, J. Neurosci. 9, 3720-3727 (1989), Pratt, J, et al. Neurosci. Lett. 140, 225-230 (1992)] utilizado en clínica para prolongar la supervivencia de los enfermos que padecen esclerosis lateral amiotrófica.

El haber puesto de manifiesto esta nueva clase de canales de potasio y la expresión heteróloga de estos canales permite particularmente disponer de nuevos medios para buscar, mediante cribado, nuevos fármacos capaces de modular la actividad de estos canales de potasio y, por lo tanto, prevenir o tratar las enfermedades que afectan a estos canales, como la epilepsia, las enfermedades cardíacas (arritmias) y vasculares, las neurodegeneraciones, particularmente las que están asociadas con las isquemias y con las anoxias, las enfermedades endocrinas asociadas con alteraciones de la secreción de hormonas, las enfermedades musculares.

Por lo tanto, la presente invención tiene por objeto una proteína purificada que forma un canal de potasio mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por el riluzol. Más particularmente, la invención se refiere a la proteína que forma el canal TRAAK cuya secuencia de aminoácidos está representada en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o un derivado funcionalmente equivalente de esta proteína.

Tales derivados son aquéllos cuya secuencia comprende una modificación y/o una supresión y/o una adición de uno o varios residuos de aminoácidos, de aquí en adelante esta modificación y/o supresión y/o adición no modificará las propiedades del canal TRAAK. El experto en la técnica puede analizar tales derivados según las técnicas descritas en los ejemplos dados de aquí en adelante, que han permitido poner de manifiesto las propiedades biofísicas y farmacológicas del canal TRAAK. Un derivado de estos es, más particularmente, el canal TREK-1 cuya secuencia de aminoácidos se representa en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 2.

Se pueden preparar anticuerpos poli- o monoclonales dirigidos contra, al menos, una proteína que forma un canal iónico de la invención mediante los métodos clásicos descritos en la bibliografía. Estos anticuerpos son útiles para buscar la presencia de canales iónicos de la invención en diferentes tejidos humanos o animales, pero también se les puede encontrar aplicación en el dominio terapéutico para inhibir o activar in vivo, gracias a su especificidad, un canal TRAAK y/o sus derivados.

La presente invención también tiene por objeto una molécula de ácido nucleico purificada que comprende o que consiste en una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que forma un canal de potasio mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por el riluzol. Más particularmente, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende, al menos, una secuencia que codifica la proteína que forma el canal TRAAK cuya secuencia de aminoácidos está representada en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o por un derivado funcionalmente equivalente de esta proteína. Una molécula de ADN que comprende la secuencia que codifica la proteína TRAAK está representada en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o su secuencia complementaria. Más particularmente, tal secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia comprendida entre los nucleótidos 284 y 1477 de la SEQ ID n.º 1 o su secuencia complementaria.

La invención también se refiere a un vector que comprende, al menos, una molécula del ácido nucleico precedente, ventajosamente asociada a las secuencias de control adaptadas, así como un procedimiento de producción o de expresión, en un hospedador celular, de una proteína que forma un canal iónico según la invención. La preparación de estos vectores, así como la producción o la expresión en un huésped de los canales de la invención, se puede realizar mediante las técnicas de biología molecular y de ingeniería genética bien conocidas por el experto en la técnica.

A modo de ejemplo, un procedimiento de producción de una proteína que forma un canal catiónico según la invención consiste en:

-: transferir una molécula de ácido nucleico de la invención o un vector que contiene dicha molécula a un huésped celular,

-: cultivar dicho huésped celular en unas condiciones que permiten la producción de la proteína que forma el canal de potasio,

-: aislar, mediante cualquiera de los medios apropiados, las proteínas que forman los canales de potasio de la invención.

A modo de ejemplo, un procedimiento de expresión de un canal iónico según la invención consiste en:

-: cultivar dicho huésped celular en las condiciones que permiten la expresión de los canales de potasio de la invención.

El huésped celular realizado en los procedimientos anteriores se puede elegir entre los procariotas o los eucariotas y, particularmente, entre las bacterias, las levaduras, las células de mamíferos, de plantas o de insectos.

El vector utilizado se elige en función del huésped al que se vaya a transferir, pudiéndose tratar de cualquier vector, como un plásmido.

Por lo tanto, la invención se refiere también a los huéspedes celulares y, más particularmente, a las células transformadas que expresan los canales de potasio que presentan unas propiedades y una estructura del tipo de las del canal TRAAK obtenidas según los procedimientos anteriores. Estas células son útiles para el cribado de las sustancias capaces de modular las corrientes de los canales TRAAK. Este cribado se efectúa poniendo en contacto cantidades variables de una sustancia a probar con las células que expresan los canales de la invención, midiendo luego, con cualquiera de los medios adecuados, los posibles efectos de dicha sustancia sobre las corrientes de potasio de dichos canales. Las técnicas electrofisiológicas permiten también estos estudios y son también objeto de la presente invención desde el momento en que estas técnicas implanten los canales TRAAK o sus derivados. Este procedimiento de cribado permite identificar los fármacos capaces de modular la actividad de los canales de potasio de la invención y, por lo tanto, capaces de prevenir o tratar las enfermedades debidas a estos canales. Una sustancia química o biológica capaz de modificar las corrientes de un canal de potasio según la invención que se puede utilizar para la preparación de un medicamento útil para prevenir o tratar las enfermedades del corazón o del sistema nervioso en un sujeto humano o animal, como las enfermedades cardíacas (arritmias) y vasculares, las neurodegeneraciones, particularmente las asociadas a las isquemias y las anoxias, las enfermedades endocrinas asociadas a las alteraciones de la secreción de hormonas, las enfermedades musculares.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que forma un canal TRAAK o un derivado del mismo, o un vector que comprende esta molécula de ácido nucleico o incluso una célula que expresa los canales TRAAK, son también útiles para la preparación de animales transgénicos. Se puede tratar de animales que sobreexpresan dichos canales, pero sobretodo, de animales denominados genosuprimidos (knock-out), es decir, que presentan una deficiencia en estos canales; estos animales transgénicos se preparan mediante los métodos conocidos por el experto en la técnica y permiten disponer de modelos vivos para el estudio de enfermedades de los animales asociadas a los canales
TRAAK.

Estos animales transgénicos, así como los huéspedes celulares descritos anteriormente, son útiles en calidad de modelos para el estudio de las enfermedades asociadas a estos canales de potasio mecanosensibles activados por los ácidos grasos poliinsaturados, bien porque sobreexpresan los canales de potasio del tipo del canal TRAAK, bien porque presentan una deficiencia en estos canales de potasio.

Además, una proteína que forma un canal iónico neuronal TRAAK también puede ser útil para la fabricación de medicamentos destinados a tratar o prevenir las enfermedades en las que intervienen estos canales. Por lo tanto, la invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo, al menos, una de las proteínas opcionalmente asociada a un vehículo fisiológicamente aceptable.

Asimismo, las moléculas de ácido nucleico de la invención o las células transformadas con dicha molécula se pueden, por lo tanto, utilizar en las estrategias de genoterapia con el objetivo de compensar una deficiencia de los canales TRAAK a nivel de uno o varios tejidos de un paciente. Por lo tanto, la invención se refiere también a un medicamento que comprende las moléculas de ácido nucleico de la invención o células transformadas por dichas moléculas para el tratamiento de las enfermedades en las que intervienen los canales TRAAK y sus derivados.

Otras ventajas y características de la invención aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, que describen el trabajo de investigación que ha conducido a la identificación y a la caracterización de estos canales de potasio mecanosensibles activados por los ácidos grasos y en los que se hará referencia a las secuencias y a los dibujos adjuntos en los que:

- la figura 1 y la SEQ ID n.º 1 representan la secuencia nucleotídica del ADNc de TRAAK y la secuencia de aminoácidos de la secuencia codificante.

- la figura 2 representa el alineamiento de las secuencias de TWIK-1, TREK-1, TASK y TRAAK, que son los cuatro canales del tipo TWIK clonados actualmente en los mamíferos, así como el dendrograma deducido de este alineamiento. Los residuos idénticos se representan sobre fondo negro y los residuos conservados sobre fondo gris.

- la figura 3 representa el análisis por RT-PCR de la distribución de TREK-1 y TRAAK en los tejidos de los ratones adultos. Los fragmentos de los transcritos que codifican TREK-1 y TRAAK se han ampliado por PCR con ayuda de oligonucleótidos específicos, transferidos sobre una membrana de nilón y, luego, hibridados con los oligonucleótidos internos marcados con fósforo 32.

- la figura 4 muestra las propiedades electrofisiológicas de las corrientes TRAAK registradas mediante la técnica de pinzamiento zonal de membrana (patch clamp) sobre los ovocitos de Xenopus que han recibido una inyección de ARNc de TRAAK (a, b, c) y sobre las células COS transfectadas con un vector que expresa TRAAK (d, e, f). En a): se han mantenido los ovocitos con un potencial de -80 mV y, a continuación, se han registrado las corrientes después de saltos de potencial de -150 a +50 mV a incrementos de 20 mV. Los registros se han realizado en un medio externo que contiene una concentración de K^{+} de 2 mM o de 74 mM. En b): relación corriente-potencial según el mismo experimento que en a). En c): inversión del potencial (E_{rev}) de las corrientes TRAAK en función de la concentración externa de K^{+}. En d): corrientes registradas sobre las células COS transfectadas con TRAAK siguiendo el mismo protocolo que en a). En e): relación corriente-potencial según el mismo experimento que en d).

- la figura 5 muestra el efecto de la osmolaridad del medio externo sobre los ovocitos que han recibido una inyección de ARNc TREK-1 o TASK. En A): comparación de los efectos de la aplicación de una disolución hipertónica (417 mOsm, mediante adición de manitol) sobre los ovocitos testigos (CD8) y sobre los ovocitos que expresan TASK o TREK-1. Se miden las corrientes después de un salto de potencial de -80 a +80 mV. En inserción se muestra la corriente TREK-1 antes y después (indicada con una flecha) de la aplicación de la disolución hipertónica. En B): efecto reversible de una disolución hipertónica (434 mOsm, mediante adición de sacarosa) sobre las relaciones corriente-potencial deducidas de los cambios de potencial que duran 600 ms. En inserción se muestra la cinética del efecto producido por la disolución hipertónica. Las corrientes se miden a 80 mV.

- la figura 6 muestra que TREK-1 es un canal de potasio mecanosensible en las células COS transfectadas. En B): actividades canal (N*Po) en los parches (patch) de membrana mantenidos a 0 mV y obtenidos en la configuración de célula adherida a partir de las células testigos (CD8), o de las células transfectadas con TREK-1 o TASK. En C), el estiramiento de la membrana no tiene efecto sobre la actividad del canal TASK (configuración de célula adherida). El parche se mantiene a 50 mV. En D): los canales TREK-1 están silenciosos en reposo y se abren cuando se produce una tensión de la membrana. El parche se mantiene a +50 mV. En E): histograma que da la amplitud de la actividad del canal creado por la tensión de la membrana e ilustrado en G). En F): relación corriente-potencial en canal único de TREK-1 (n = 6). La conductancia de 81 pS se ha calculado entre 0 y 80 mV. En G): activación de TREK-1 mediante estiramiento de la membrana (30 mm de Hg) en la configuración dentro-afuera (inside-out). El potencial de mantenimiento es de 100 mV. En H): efecto producido por las tensiones cada vez más importantes (5 s de duración) sobre la relación corriente-potencia de un parche que expresa TREK-1. En I): curva dosis-efecto de la activación de TREK-1 por la tensión (n = 6). La curva se traza siguiendo los puntos experimentales que siguen la relación de Boltzmann.

- la figura 7 muestra la activación de TRAAK por el estiramiento de la membrana celular en las células COS transfectadas. La corriente se registra a 0 mV en la configuración dentro-afuera. Las depresiones aplicadas mediante la pipeta de registro se indican a la derecha de la señal.

- la figura 8 muestra la activación de TREK-1 por el ácido araquidónico en las células COS transfectadas. En A): la actividad de TREK-1 se registra en la configuración de célula adherida. Se estimula el parche mediante un incremento de potencial durante 800 ms cada 5 s. Las corrientes se miden a 80 mV. Las aplicaciones de ácido araquidónico (AA, 10 \muM) se indican mediante barras horizontales. Durante el experimento, se ha estimulado el parche con tensiones de 50 mm Hg (indicadas con flechas). A los 9 minutos, se ha escindido el parche en la configuración dentro-afuera. En B): relaciones corriente-potencial que corresponden al experimento ilustrado en A). En C): actividad de TREK-1 en la configuración de célula adherida con AA a 10 \muM en la pipeta. El aumento del potencial dura 800 ms y las corrientes se miden a 80 mV. En D): relaciones corriente-potencial del canal único en el momento en el que se coloca la pipeta sobre la membrana o después de 20 min y 1 min después de haber escindido el parche en la configuración dentro-afuera. En E), efecto del AA (10 \muM) sobre la corriente TREK-1 registrada sobre una célula entera. Se mide la corriente a 80 mV. En F): el AA no tiene efecto sobre la corriente TREK-1 medida en la célula entera cuando está en la pipeta. Se mide la corriente 30 min después de haber roto el parche (señal de control) con un aumento del potencial durante 800 ms. A continuación, se mide la corriente después de una aplicación de AA de 1 minuto en el medio externo (señal de AA).

- la figura 9 muestra el efecto del ácido araquidónico y de otros ácidos grasos sobre el canal TRAAK expresado en las células COS transfectadas. En a): relaciones corriente-potencial obtenidas a partir de aumentos del potencial de 500 ms que van de -150 a +50 mV, después de la aplicación de AA (10 \muM) y después de lavar. En inserción se representan las corrientes desencadenadas por los cambios de potencial de -130 a +50 mV por incrementos de 20 mV. El potencial de mantenimiento es de -80 mV. En b): relación dosis-efecto de la activación de TRAAK por el AA. En c): relaciones corriente-potencial obtenidas como en a) en la configuración fuera-afuera (outside-out). En inserción se muestra el efecto del AA a 20 mV. En e): histograma que representa el coeficiente de aumento de las corrientes obtenidas después de la aplicación de diferentes ácidos grasos (10 \muM). En f): histograma que muestra el valor de las corrientes registradas en la configuración de célula entera antes y después de la aplicación del AA sobre las células transfectadas transitoriamente con TWIK-1, TASK, TREK-1 y TRAAK y sobre las células transfectadas de forma estable con TRAAK. Se indica el coeficiente de aumento en cada caso.

- la figura 10 muestra el efecto del riluzol sobre las corrientes TREK-1 y TRAAK denominado TREK-2. Las relaciones corriente-potencial se obtienen como en la figura 9a antes y después de la aplicación del riluzol (100 \muM) sobre células COS transfectadas. En inserción se muestran los efectos del riluzol sobre las corrientes registradas en la configuración fuera-afuera.

I- Clonación, estructura primaria y distribución hística de TRAAK

La secuencia del canal TWIK-1 se ha utilizado para buscar secuencias homólogas en las bases de datos públicas de ADN (Genbank y EMBL) utilizando el programa de alineamientos BLAST. Así se ha identificado una secuencia expresada TAG humana que ha servido para cribar una base de datos de ADNc de cerebro de ratón. Se han aislado y caracterizado varios clones. Se ha secuenciado el más largo. Se han puesto de manifiesto las siguientes características:

-: los ADNc aislados contienen un marco abierto de lectura de 1197 nucleótidos que codifican un polipéptido de 398 restos. En la figura 1 se muestran las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas.

-: esta proteína contiene 4 posibles segmentos transmembranarios y dos dominios P. Posee, por lo tanto, la misma estructura general que los canales TWIK-1, TREK-1 y TASK. Además, presenta homologías de secuencia con estos canales: una identidad de aproximadamente el 20 al 25% con TWIK-1 y TASK, y del 38% con TREK-1. Fuera de los dominios P que están presentes en todos los canales de potasio clonados, no tiene homología de secuencia significativa con los canales de tipo Shaker e IRK. Por lo tanto, pertenece a la familia TWIK-1 y su homólogo más cercano es TREK-1. Estas relaciones aparecen en la figura 2 en el alineamiento de las secuencias de las proteínas así como en el dendrograma que se ha deducido de este alineamiento. Por lo tanto, TRAAK y TREK-1 forman una subclase estructural en el seno de la familia TWIK-1.

-: se han deducido las secuencias de diferentes oligonucleótidos a partir de la secuencia de TRAAK. Estos oligonucleótidos han permitido, por RT-PCR, estudiar la distribución del transcrito que codifica TRAAK en los tejidos del ratón adulto. Tal y como se muestra en la figura 3, TRAAK se expresa exclusivamente en los tejidos neuronales: cerebro, cerebelo, médula espinal y retina. Esta distribución es muy diferente de la de su homólogo más próximo, que es el canal TREK-1. Éste tiene una distribución casi ubicua y está presente tanto en los tejidos excitables como en los tejidos no excitables.

II. Expresión funcional de TRAAK

Para el estudio funcional, se ha insertado la secuencia codificante de TRAAK en el vector pEXO y se ha sintetizado un ARN complementario (ARNc) a partir de esta construcción, que se ha inyectado en los ovocitos de Xenopus. Para la expresión en las células COS, se ha subclonado la secuencia de TRAAK en un vector de expresión bajo el control de un promotor eucariota y se ha transfectado en las células. Mediante la técnica de pinzamiento zonal de membrana (patch clamp) se ha medido una corriente no inactivadora ausente en los ovocitos y las células de testigo tal y como se representa en la figura 4. La activación es instantánea y no se puede resolver, ya que está enmascarada por la descarga capacitiva de la corriente registrada al principio del aumento del potencial. La relación corriente-potencial se rectifica en el sentido saliente cuando la concentración externa de K^{+} es igual a 2 mM. Se observan corrientes entrantes cuando aumenta la concentración externa de K^{+}. Cualquiera que sea esta concentración, las curvas corriente-potencial siguen perfectamente la relación de Goldman-Hodgkin-Katz. Esto demuestra que las corrientes TRAAK no tienen ninguna otra rectificación que la debida a las concentraciones disimétricas de K^{+} de cada lado de la membrana y que TRAAK es un canal que no es dependiente del potencial. El canal TRAAK es específico de potasio. La inversión del potencial de las corrientes sigue el potencial de equilibrio del K^{+}, y el cambio por 10 de la concentración de K^{+} conduce a un cambio del valor de la inversión del potencial conforme a lo predicho por la ecuación de Nernst (48,7 \pm 0,7 mV por 10, n = 4).

Las propiedades de TRAAK, la ausencia de cinéticas de activación e inactivación así como su apertura a todos los potenciales de membrana son características de los canales de potasio denominados de fuga. Tal y como está previsto para los canales de este tipo, su expresión en los ovocitos se asocia a una fuerte polarización. El potencial en reposo de la membrana pasa de -43 \pm 2,4 mV (n = 7), en los ovocitos de control, a -88 \pm 1,4 mV (n = 23) en los ovocitos transfectados, un valor próximo al potencial de equilibrio del potasio. También se ha expresado TRAAK en las células COS-M6 transfectadas. También en este sistema, las corrientes TRAAK son instantáneas y no se inactivan. El registro de los parches en la configuración fuera-afuera indica una conductancia unitaria de TRAAK igual a 45,5 \pm 3,7 pS (n = 10).

III - TREK-1 y TRAAK son canales mecanosensibles

Se ha establecido que la subclase estructural formada por los canales de K^{+} TREK-1 y TRAAK está asociada a las propiedades electrofisiológicas únicas entre los canales de K^{+} de tipo TWIK. En efecto, los canales TREK-1 y TRAAK se activan por una tensión aplicada en la membrana plasmática. Esta tensión se obtiene bien indirectamente cambiando la osmolaridad del medio externo y, por lo tanto, el volumen de la célula, o bien más directamente aplicando una depresión en la pipeta de registro. Se han puesto de manifiesto las características siguientes:

-: la figura 5 muestra que la expresión del canal TREK-1 en los ovocitos de Xenopus que se mantienen en un medio hipotónico induce corrientes instantáneas y no inactivantes. Cuando la osmolaridad del medio externo se aumenta al añadirle manitol, se observa una importante disminución de la amplitud de la corriente TREK-1, lo que demuestra que el canal es sensible al volumen celular. El canal TASK no se ve afectado por la osmolaridad del medio externo.

-: la figura 6 demuestra que el canal TREK-1 es mecanosensible. En las células COS transfectadas y en las condiciones de reposo, no se detecta la actividad de TREK-1 en la configuración de célula adherida, mientras que la actividad de TASK se mide fácilmente en las mismas condiciones. Sin embargo, la aplicación de una depresión en la membrana por medio de la pipeta de registro desencadena una apertura del canal TREK-1. No se observa ningún efecto semejante con TASK. La activación de TREK-1 inducida por la tensión también se obtiene en la configuración dentro-afuera, es decir, cuando se escinde el parche y cuando la cara interna de la membrana se encuentra en contacto con el medio externo. En esta configuración, la actividad del canal también está ausente o es muy débil si no se aplica tensión a la membrana. El efecto de la tensión es gradual y se detecta una activación que es igual a la mitad del valor máximo para una depresión equivalente a 23 mm Hg. Por otra parte, la figura 6h muestra que la activación inducida por el estiramiento es independiente del potencial de la membrana.

IV - TREK-1 y TRAAK son activados por el ácido araquidónico y otros ácidos grasos poliinsaturados

La activación de los canales TREK-1 y TRAAK por el estiramiento mecánico de la membrana se imita con la aplicación del ácido araquidónico y con la aplicación de otros ácidos grasos poliinsaturados, pero no con la aplicación de ácidos grasos saturados. Se han puesto de manifiesto las siguientes características:

-: la figura 8 muestra que TREK-1 es activado por el ácido araquidónico (AA). La aplicación del AA sobre las células de testigo (CD8) no tiene ningún efecto. Las activaciones obtenidas por el estiramiento de la membrana y con la aplicación del AA son similares en amplitud, pero no son aditivas. Los dos tipos de activación están reprimidos en la configuración de célula adherida. Cuando la pipeta de registro contiene el AA, la escisión del parche en la configuración dentro-afuera induce de forma reproducible un aumento importante de la actividad de TREK-1. Del mismo modo, la amplitud de la activación inducida por una depresión aplicada en la pipeta de registro es más importante cuando el parche está escindido. Finalmente, se ha observado que, en la célula entera, el AA interno no inactiva TREK-1. Cuando la célula se dializa durante periodos de hasta 30 minutos, no tiene lugar ninguna activación del canal por el AA interno, aunque se observe la activación algunos segundos después de la aplicación del AA en el medio externo. Estos resultados indican que el AA activa TREK-1 sólo cuando se aplica sobre la cara externa de la membrana.

-: la figura 9 demuestra que el canal TRAAK es activado por el AA del mismo modo que TREK-1. La activación es reversible y dependiente de la concentración aplicada. Esta activación también se observa en la configuración "fuera-afuera". La activación de TRAAK por el AA no se previene cuando la perfusión del AA contiene una mezcla de inhibidores del metabolismo del AA (ácido nordihidroguaiarético para la lipoxigenasa, la indometacina para la ciclooxigenasa, el clotrimazol para la epoxigenasa y el ETYA que inhibe el conjunto de vías de metabolización del AA, todos a 10 mM). En estas condiciones, el aumento de la corriente inducido por el AA es de 6,6 \pm 0,5 veces (n = 3) (a +50 mV). Se puede observar un aumento de 1,7 \pm 0,4 veces (n = 3) de la corriente de potasio de fondo después de la administración del cóctel de inhibidores en ausencia del AA. Este resultado demuestra que la activación por el AA no requiere que el AA se transforme en eicosanoides.

-: la figura 9 muestra igualmente que otros ácidos grasos que no sean el AA activan el canal. Esta activación es específica de los ácidos grasos cis poliinsaturados y se observa con los ácidos oleico (C18\Delta9), linoleico (C18\Delta9,12), linolénico (C18\Delta9,12,15), eicosapentaenoico (EPA, C20\Delta5,8,11,14,17) y docosohexaenoicos (DOHA, C20\Delta4,7,10,13,16,19) a una concentración de 10 mM. Los ácidos saturados tales como los ácidos palmítico (C16), esteárico (C18) y araquídico (C20) no producen ningún efecto. Los derivados del AA y del ácido docosohexaenoico en los que el grupo carboxílico está sustituido por un grupo alcohol (AA-OH) o éster metílico (AA-ME, DOHA-ME) son igualmente inactivos sobre TRAAK. El efecto del AA sobre TRAAK es observable también sobre las células transfectadas tanto de forma transitoria como de forma estable (se han probado 3 líneas de células estables independientes).

-: finalmente, la figura 9 demuestra que el efecto de inactivación por el AA es específico del TREK-1 y de TRAAK. No se observa ningún efecto del mismo tipo sobre los canales TWIK-1 y TASK.

En los ovocitos, TRAAK es insensible a los agentes que bloquean los canales de potasio clásicos tales como el tetraetilamonio (TEA, 1 mM), la 4-aminopiridina (4-AP, 1 mM) y la quinina (100 mM). Y a la inversa, el Ba^{2+} (1 mM) bloquea el 56,7 \pm 4,6%, n = 5, de la corriente TRAAK a +40 mV.

V - Los canales TREK-1 y TRAAK son activados por un agente neuroprotector: el riluzol

El riluzol es un agente neuroprotector que se utiliza para prolongar la supervivencia de los enfermos que padecen esclerosis lateral amiotrófica. La figura 10 demuestra que este agente farmacológico es un abridor de los canales TREK-1 y TRAAK. TREK-1 y TRAAK son los primeros canales iónicos cuya actividad se estimula con el riluzol.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1794 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: DOBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: TRAAK

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: de 284 a 1477

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIA: SEQ ID N.º 1:

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N.º 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: ... pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: TREK-1

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: de 484 a 1596

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 2

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

6

Claims

1. Proteína purificada que forma un canal de potasio mecanosensible activado por los ácidos grasos poliinsaturados, particularmente el ácido araquidónico, y por el riluzol, cuya secuencia de aminoácidos se representa en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1.

2. Anticuerpos poli- o monoclonales dirigidos contra, al menos, una proteína que forma un canal iónico según la reivindicación 1.

3. Molécula de ácido nucleico purificado, que comprende o consiste en una secuencia nucleica que codifica una proteína según la reivindicación 1.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, que comprende la secuencia comprendida entre los nucleótidos 284 y 1477 de la secuencia representada en la lista de secuencias adjuntas con el número SEQ ID n.º 1 o su secuencia complementaria.

5. Vector que comprende, al menos, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4.

6. Procedimiento de producción de una proteína que forma un canal de potasio según la reivindicación 1, caracterizado porque consiste en:

- transferir una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 ó 4 o un vector según la reivindicación 5 a un huésped celular,

- cultivar dicho huésped celular en condiciones que permiten la producción de la proteína que forma dicho canal de potasio,

- aislar, por cualquiera de los medios adecuados, las proteínas que forman dichos canales.

7. Procedimiento para expresar un canal de potasio según la reivindicación 1, caracterizada porque consiste en:

- transferir una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 o un vector según la reivindicación 5 a un huésped celular,

- cultivar dicho huésped celular en las condiciones que permiten la producción de dichos canales de potasio.

8. Huésped celular no humano que se puede obtener mediante un procedimiento según la reivindicación 7.

9. Procedimiento de cribado de las sustancias capaces de modular la actividad de los canales de potasio mecanosensibles activados por los ácidos grasos poliinsaturados según la reivindicación 1, caracterizado porque se ponen en contacto cantidades variables de una sustancia a probar con células según la reivindicación 7 y, luego, se mide, mediante cualquiera de los medios adecuados, los posibles efectos de dicha sustancia sobre las corrientes de dichos canales.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 aplicado al cribado de sustancias capaces de prevenir o de tratar las enfermedades del sistema nervioso en un ser humano o un animal.

11. Procedimiento según la reivindicación 10 aplicado al cribado de las sustancias capaces de prevenir o de tratar las neurodegeneraciones.

12. Procedimiento según la reivindicación 11 aplicado al cribado de las sustancias capaces de prevenir o de tratar las neurodegeneraciones asociadas a las isquemias y a las anoxias.

13. Composición farmacéutica que comprende como principio activo, al menos, una proteína que forma un canal de potasio según la reivindicación 1, o un anticuerpo según la reivindicación 2, o una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 ó 4, o un vector según la reivindicación 5.

14. Composición según la reivindicación 13, caracterizada porque dicho principio activo se asocia a un vehículo fisiológicamente aceptable.