ES2366080T3 - Proteína de canal de potasio trek-1 humana y de ratón y su uso. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar sustancias que tienen propiedades anestésicas tras su inhalación, que comprende: (a) poner dicha sustancia en contacto con una proteína de transporte de potasio de mamífero, en que dicho transporte de potasio presenta rectificación de potasio hacia fuera; y (b) determinar la actividad de transporte de potasio de dicha proteína de transporte de potasio, en que una activación del transporte de potasio es indicativa de que dicha sustancia tiene dichas propiedades anestésicas, en que dicha proteína de transporte de potasio de mamífero es TASK de secuencia ID. SEC. nº 5.

Description

FUNDAMENTO DEL INVENTO

1. Campo del invento

El invento se refiere a un método para identificar sustancias que son capaces de actuar como anestésicos.

2. Fundamento de la técnica relacionada

Los anestésicos volátiles son una clase notable de agentes que producen un estado seguro y reversible de inconsciencia con amnesia y analgesia concurrentes. Ejercen una acción hiperpolarizante sobre las neuronas de mamífero. Activan una corriente de K+ sináptica inhibitoria (IK(An)) en las neuronas marcapasos de molusco, de la que se ha propuesto que desempeña un papel importante en la anestesia general.

Los anestésicos volátiles hiperpolarizan neuronas motoras de rana, neuronas hipocampales de rata, neuronas talámicas de cobaya y neuronas de la corteza cerebral humana. Por lo tanto, se ha propuesto que el mecanismo molecular de los anestésicos volátiles implica la acción de una clase específica de canales de K+. El hecho de que una corriente de K+ sináptica inhibitoria particular, IK(An), activada reversiblemente por agentes volátiles, esté presente en las neuronas marcapasos de molusco sensibles a anestésicos pero ausente en las neuronas insensibles ha hecho de ella un candidato muy atractivo como diana para estos importantes agentes farmacológicos. La IK(An) actúa como un canal de fondo; no depende del voltaje, se activa inmediatamente y no se inactiva con el tiempo. La IK(An) obedece la ecuación del campo constante de Goldman-Hodgkin-Katz y es resistente al tetraetilamonio y la 4-aminopiridina, dos bloqueadores clásicos del canal de K+.

Lopes et al., "Action of general anaesthetics and arachidonic acid pathway inhibitors on K+ currents activated by volatile anaesthetics and FMRFamide in molluscan neurones", British Journal of Pharmacology (1998) 125, 309-318, describen el estudio de corrientes de K+ activadas por anestésicos generales volátiles. En particular, en este documento se describe la activación de corrientes de fondo por anestésicos volátiles.

Hemos identificado recientemente una nueva familia de canales de K+ de mamífero con un motivo estructural único que consiste en dos dominios de poro en tándem y cuatro segmentos transmembranales. Los cuatro miembros de esta familia, que se muestran en la Figura 1A, han sido clasificados como TWIK-1, TASK, TREK-1 y TRAAK. Se ha mostrado previamente que TWIK-1 se dimeriza, lo que implica que un canal funcional está formado por al menos dos subunidades. No se produce heteromultimerización entre los cuatro miembros de esta nueva familia, como se prueba en células Sf9 que expresan diversas combinaciones de estos canales (datos no publicados). Tres miembros de esta familia, TREK-1 de ratón, TRAAK de ratón y TASK humano, codifican rectificadores de K+ de fondo hacia fuera con propiedades que se parecen a las de IK(An). TRAAK y TREK-1 son directamente abiertos por el ácido araquidónico y otros ácidos grasos poliinsaturados, mientras que TASK codifica un canal de K+ en reposo que es controlado por variaciones de pH externas próximas al pH fisiológico. TREK-1 y TASK se expresan en muchos tejidos y son particularmente abundantes en el cerebro y en el corazón, mientras que TRAAK se expresa selectivamente en el sistema nervioso central. Se detecta expresión neuronal de estos canales con niveles elevados en la corteza, el cerebelo, el hipocampo y el bulbo olfativo, y se detecta expresión cardiaca tanto en el tejido miocárdico como en el conjuntivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Se muestran los resultados de experimentos con cloroformo que demuestran que el cloroformo activa selectivamente TREK-1: A, un esquema que muestra los dos dominios de poro y los cuatro dominios transmembranales de los canales de potasio K+ de dominio 2P, TREK-1, TRAAK, TWIK-1 y TASK. Los cuatro segmentos de dominio transmembranal se indican mediante TM1 a TM4, y las dos regiones de poro se indican mediante P1 y P2. El arbol filogenético indica las tres subfamilias. TWIK-1 es un canal rectificador de K+ hacia dentro y TASK es un canal rectificador de K+ de fondo inhibido por acidosis externa. Tanto TREK-1 como TRAAK son canales rectificadores de K+ de fondo hacia fuera, abiertos por el ácido araquidónico; B, experimentos de pinzamiento zonal ("patch-clamp") de célula completa que muestran que cloroformo 0,8 mM activa intensa y reversiblemente TREK-1 expresado en células COS transfectadas. El estado simulado es el vector de expresión de tipo silvestre (vacío). Se investigaron los efectos del cloroformo sobre las corrientes de K+ provocadas en la configuración de célula completa durante una rampa de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV, como se ilustra en la inserción para TREK-1; C, el cloroformo 0,8 mM indujo una típica corriente de fondo caracterizada por una rectificación hacia fuera que se invierte en el valor predicho para EK+. Se examinaron corrientes de TREK-1 activadas por cloroformo en gradientes de K+ fisiológicos y simétricos. Se restaron digitalmente rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV en ambos estados de K+ y en presencia de cloroformo 0,8 mM, de las rampas en las condiciones testigo; D, el cloroformo 0,8 mM hiperpolarizó reversible y reproduciblemente células COS que expresan TREK-1; E, dependencia de la dosis en la activación de TREK-1. La inserción ilustra el efecto del cloroformo 0,8 mM sobre la corriente de TREK-1 medida en un potencial de fijación de 0 mV. Se indica el número de células en cada estado experimental.

Figura 2. El halotano es un activador común de TREK-1 y TASK. A, efectos comparativos del halotano 1 mM sobre las actividades de canales de K+ de dominio 2P. El estado simulado es el vector de expresión de tipo silvestre (vacío); B, el halotano (1 mM) estimula la actividad del canal TASK provocada en la configuración de célula completa durante rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV; C, corrientes de TASK activadas por halotano (1 mM) en gradientes de K+ fisiológicos y simétricos. Se restan digitalmente rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV en ambos estados de K+ y en presencia de halotano 1 mM, de las rampas en las condiciones testigo; D, curva de dosis-efecto del halotano sobre la activación del canal TREK-1; F, el halotano (1 mM) activa reversiblemente TASK en un potencial de fijación de 0 mV. Se indica el número de células en cada estado experimental.

Figura 3. El isoflurano y el éter dietílico activan diferencialmente TREK-1 y TASK. A, efectos comparativos del isoflurano 2 mM (A) y el éter dietílico 0,6 mM (B) sobre los canales de K+ de dominio 2P. El estado simulado es el vector de expresión de tipo silvestre (vacío). Se investigan los efectos de los anestésicos sobre las corrientes de K+ provocadas en la configuración de célula completa durante rampas de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV, como se ilustra en las inserciones para TREK-1. Se indica el número de células en cada estado experimental.

Figura 4. Anestésicos volátiles estimulan TREK-1 y TASK en las configuraciones de zona escindida ("excised patch"). A, efectos de concentraciones crecientes de halotano sobre la actividad del canal TREK-1 en una zona de cara externa hacia fuera ("outside-out patch"). En una zona de cara externa hacia fuera, el halotano abre reversiblemente un canal TREK-1 de 48 pS de un modo dependiente de la dosis. El potencial de fijación es 0 mV, y las aplicaciones de halotano se indican mediante barras horizontales; B, efecto del cloroformo 0,8 mM sobre la curva I-V de TREK-1 en una zona de cara externa hacia fuera. Se obtiene la curva I-V con una rampa de voltaje de un segundo de duración a partir de un potencial de fijación de -80 mV; C, cinética de activación de TREK-1 por cloroformo 0,8 mM. La curva I-V de la corriente sensible al cloroformo en una zona de cara externa hacia fuera muestra la característica rectificación hacia fuera; D, el halotano (1 mM) provoca la apertura del canal TASK en una zona de cara interna hacia fuera ("inside-out patch"). El potencial de fijación es 0 mV, y de izquierda a derecha se ilustran las actividades de canal antes, durante y después de la adición de halotano 1 mM. El halotano abre reversiblemente un canal TASK de 12 pS.

Figura 5. Caracterización funcional del TREK-1 humano (hTREK-1). Se someten células COS transitoriamente transfectadas que expresan hTREK-1 a fijación de voltaje ("voltage clamp") usando la configuración de pinzamiento zonal de célula completa. A, se registra la corriente basal de TREK-1 en condiciones fisiológicas de K (5 mM) y en condiciones simétricas de K (155 mM). Se fijan las células a -80 mV y se aplican rampas de voltaje de 800 ms de duración, de -130 mV a 100 mV. B, hTREK-1 resulta estimulado por la adición de ácido araquidónico 10 �M al baño. El mismo protocolo que en A. C, hTREK-1 es abierto por concentraciones crecientes de halotano (según se indica). D, en la configuración de zona de cara interna hacia fuera, hTREK-1 es abierto por un tramo de membrana de -8799 Pa. La zona es sometida a una fijación de voltaje a 0 mV.

SUMARIO DEL INVENTO

El invento se refiere a un método para identificar sustancias que tienen propiedades anestésicas tras su inhalación, que comprende:

(a)

poner dicha sustancia en contacto con una proteína de transporte de potasio de mamífero, en que dicho transporte de potasio presenta rectificación de potasio hacia fuera; y

(b)

determinar la actividad de transporte de potasio de dicha proteína de transporte de potasio, en que una activación del transporte de potasio es indicativa de que dicha sustancia tiene dichas propiedades anestésicas,

en que dicha proteína de transporte de potasio de mamífero es TASK de secuencia ID. SEC. nº 5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el canal TREK-1 humano (ID. SEC. nº 1). También se describe la proteína TREK-1 humana aislada (ID. SEC. nº 2). En la ID. SEC. nº 1 se muestran la secuencia del ácido nucleico y la deducida secuencia de aminoácidos.

Se describe la molécula de ácido nucleico aislada que codifica el canal TREK-1 murino (ID. SEC. nº 3). También se describe la proteína aislada, TREK-1 murino (ID. SEC. nº 4).

El método implica poner una sustancia de ensayo en contacto con una proteína de transporte de potasio in vitro y determinar si ha habido activación del transporte de potasio.

Como se utilizan en el método, las células que expresan una proteína de transporte de potasio se usan en presencia de la sustancia de ensayo. La sustancia de ensayo es una sustancia que tendrá ciertas propiedades cuando se use en un mamífero como un agente inhalante volátil. Estas propiedades pueden incluir la inducción de un estado seguro y reversible de inconsciencia, amnesia y analgesia.

La célula que expresa la proteína de transporte de potasio expresa transitoriamente la proteína. Las células pueden ser seleccionadas del grupo que consiste en células de Spodoptera, ovocitos de Xenopus, células de ovario de hámster chino y fibroblastos.

La proteína de transporte de potasio que es adecuada para uso en el invento es TASK (ID. SEC. nº 5), que puede proceder de cualquier fuente de mamífero, tal como rata, ratón o ser humano. La secuencia molecular de TREK-1 puede ser la del TREK-1 humano, como se muestra en la ID. SEC. nº 2, o una secuencia de aminoácidos que sea sustancialmente idéntica a la ID. SEC. nº 2. Por "sustancialmente idéntica" se entiende que se pueden realizar sustituciones de aminoácidos de tal modo que no se altere significativamente la conformación global de la proteína de transporte de potasio: la proteína permanece activa como una proteína de transporte de potasio.

Una proteína sustancialmente idéntica adecuada es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene generalmente una identidad de al menos 90% con respecto la secuencia de aminoácidos del TREK-1 humano (ID. SEC. nº 2). Más preferiblemente, la proteína tiene una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 2. Muy preferiblemente, la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 99% con respecto a la ID. SEC. nº 1.

Las células utilizadas en el método del presente invento expresan transitoriamente la proteína de transporte de potasio expresada en su superficie. La introducción del ácido nucleico en las células para que se exprese la proteína puede ser mediante cualquier método conocido, tal como la transfección de las células con una construcción de ácido nucleico apropiada, la microinyección de RNA que codifica la proteína, y similares. En la técnica se conocen muchos protocolos diferentes. Aquí se describen brevemente dos métodos; sin embargo, quien tiene una experiencia ordinaria en la técnica apreciará que se pueden realizar muchas modificaciones y sustituciones a estos métodos sin desviarse del espíritu ni el alcance del invento.

La secuencia de codificación de la proteína de transporte de potasio se puede insertar entre las secuencias no codificadoras 5' y 3' de una proteína (tal como la globina) de Xenopus laevis en un vector apropiado, tal como pEXO. La construcción se introduce en un tipo celular apropiado para que se replique el vector y/o se transcriba el RNA. Alternativamente, se puede utilizar el vector como un molde para una transcripción in vitro. Se transcribe un RNA complementario (cRNA) y se inyecta a una célula, tal como un ovocito de Xenopus. Dicho procedimiento puede ser llevado a cabo en una cámara de perfusión de 0,3 ml de capacidad, en la que se ensartan ovocitos sueltos en dos microelectrodos de vidrio estándares (0,5-2,0 MW) cargados con KCl 3 M y se mantienen bajo fijación de voltaje con un amplificador Dagan TEV200. La disolución del baño contiene KCl 98 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 2 mM y HEPES 5 mM con un pH ajustado a 7,4 con KOH.

Alternativamente, la expresión funcional del canal de potasio puede ser llevada a cabo mediante la transfección de células de insecto, tales como células de Spodoptera frugiperda (Sf9). En resumen, se puede utilizar un vector adecuado, tal como pVL1392, y se puede insertar en marco la secuencia de codificación para la proteína de transporte de potasio en el vector para que se pueda realizar la expresión de la proteína de transporte de potasio. La secuencia de codificación para la proteína de transporte de potasio puede ser obtenida mediante cualquier método conveniente, tal como mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction)

o sometiendo un plásmido que contiene la secuencia de codificación de la proteína de transporte de potasio a digestión con una(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s) para la subsiguiente ligación en el vector pVL1392. Similarmente, el producto multiplicado de la PCR puede ser sometido a digestión con enzimas de restricción y ser ligado al vector. La transfección de las células Sf9 puede ser llevada a cabo mediante el protocolo del fabricante (Pharmingen).

Alternativamente, la expresión funcional del canal de potasio puede ser por transfección transitoria de células tales como células COS, para lo cual se siembran células COS con una densidad de 20.000 células por placa de 35 mm. Las células son transfectadas con un vector de expresión, tal como el vector pIRES-CD8, que comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican la deseada proteína de canal de potasio. Las células pueden ser transfectadas mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, el protocolo de DEAEdextrano, la precipitación con Ca2PO4 o la electroporación. Las células transfectadas, que expresan el deseado canal de potasio o en las que se induce la expresión del deseado canal de potasio, pueden ser luego utilizadas en el método del invento, y las células pueden ser examinadas en cuanto al transporte de potasio.

El invento será descrito con mayor detalle por referencia a los ejemplos, que se proporcionan para ilustrar el invento. Los ejemplos no han de ser considerados restrictivos en cuanto al alcance del invento, que se expone en las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS 1. Clonación del canal TREK-1 humano

Se clonó el canal TREK-1 por tecnología de PCR degenerada utilizando la secuencia murina previamente caracterizada. En resumen, aunque dicha tecnología se describe ampliamente en la bibliografía y es familiar a quienes tienen una experiencia normal en la técnica, se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos degenerados, seleccionados para multiplicar una región del TREK-1 murino, y se sometieron a una multiplicación por reacción en cadena de la polimerasa utilizando DNA humano con unos apropiados tampón, nucleótidos y DNA polimerasa. La mezcla de reacción es sometida a ciclos a través de fases de temperatura para la desnaturalización del DNA (generalmente, a aproximadamente 94 °C), la hibridación de los cebadores con el molde de DNA (esta temperatura se puede variar para optimizar la multiplicación y se puede basar en muchos factores, incluyendo la longitud del cebador y el contenido de GC), y la extensión de la polimerización del DNA mediante la DNA polimerasa (generalmente a la temperatura óptima para la actividad de la DNA polimerasa, que normalmente es aproximadamente 72 °C). El fragmento de DNA multiplicado puede ser aislado y ser clonado en un vector plasmídico para el subsiguiente análisis de la secuencia, o el DNA multiplicado puede ser directamente secuenciado por métodos conocidos.

Debido a la degeneración del código del DNA, quien tiene una experiencia ordinaria en la técnica entenderá bien que se puede realizar la sustitución de nucleótidos sin que cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, se entiende en la técnica que, para la secuencia de aminoácidos de una proteína dada, se puede realizar la sustitución de ciertos aminoácidos de la secuencia sin un efecto significativo sobre la función de la proteína. Dichas sustituciones son conocidas en la técnica como "sustituciones conservativas". Se describen proteínas TREK1 humanas que contienen sustituciones conservativas, en que la función de la proteína no está alterada. Generalmente, la identidad de dicho TREK-1 mutante será de al menos 90% con respecto a la ID. SEC. nº 2. Preferiblemente, el TREK-1 mutante tendrá una identidad de al menos 97% con respecto a la ID. SEC. nº 2. Muy preferiblemente, el TREK-1 mutante tendrá una identidad de al menos 99% con respecto a la ID. SEC. nº 2.

2. Secuenciación del canal TREK-1 murino

En la ID. SEC. nº 4 se muestra la secuencia del TREK-1 murino, que es una forma corregida del TREK-1 murino previamente presentado. Hay un marco de lectura abierto más largo que el originalmente presentado, lo que produce una proteína con una deducida secuencia de aminoácidos de 411 aminoácidos. Debido a la degeneración del código del DNA, quien tiene una experiencia ordinaria en la técnica entenderá bien que se puede realizar la sustitución de nucleótidos sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por lo tanto, el invento incluye cualquier secuencia de ácido nucleico para el canal TREK-1 murino, que codifica la secuencia de aminoácidos determinada para el TREK-1 murino (ID. SEC. nº 4). Además, como es el caso con el TREK-1 humano, se entiende en la técnica que, para la secuencia de aminoácidos de una proteína dada, se puede realizar la sustitución de ciertos aminoácidos de la secuencia sin un efecto significativo sobre la función de la proteína. El invento abarca proteínas TREK-1 murinas que contienen sustituciones conservativas, en las que la función de la proteína no está alterada. Generalmente, la identidad de dicho TREK-1 mutante será de al menos 90% con respecto a la ID. SEC. nº 4. Preferiblemente, el TREK-1 mutante tendrá una identidad de al menos 95% con respecto a la ID. SEC. nº 4. Más preferiblemente, el TREK-1 mutante tendrá una identidad de al menos 97% con respecto a la ID. SEC. nº 4. Muy preferiblemente, el TREK-1 mutante tendrá una identidad de al menos 99% con respecto a la ID. SEC. nº 4.

3. Expresión funcional del canal TREK-1 humano

Se estudiaron las propiedades funcionales del canal TREK-1 humano sobre la base de células COS transfectadas que expresan temporalmente la proteína. Como el canal murino, el canal humano es selectivo para el potasio y es activado por ácidos grasos cis-insaturados y anestésicos volátiles y por estiramiento de la membrana plasmática. La selectividad de las corrientes de TREK-1 para el potasio se muestra en la Figura 5A. Las corrientes son registros en la configuración de célula completa de la técnica de pinzamiento zonal (impuesto un gradiente de potencial de -130 a +100 mV). El potencial inverso de las corrientes sigue el potencial de equilibrio del potasio cuando la concentración extracelular de iones potasio asciende de 5 a 155 mM. En la Figura 5B se muestra que la aplicación de ácido araquidónico (10 µM) provocaba la activación de las corrientes de TREK-1. En la figura 5C se muestra que la aplicación de anestésicos volátiles (halotano en este caso) en las concentraciones empleadas en la anestesia general provocaban la activación del canal TREK-1. En la Figura 5D se muestra que las corrientes de TREK-1 registradas en una zona escindida (configuración de cara interna hacia fuera) son mecanosensibles. Cuando se aplica una presión de -8799 Pa a la membrana, las corrientes de TREK-1 se activan de un modo reversible.

4. Registro electrofisiológico

La transfección, el cultivo y la electrofisiología de las células COS son bien conocidas en la técnica y se describen en la bibliografía, tal como en las referencias citadas.

Como aquí se lleva a cabo, se sembraron células COS en una densidad de 20.000 células por placa de 35 mm 24 horas antes de la transfección. Se transfectaron las células mediante el protocolo de DEAE-dextrano (1 µg de DNA por placa). Se multiplicaron fragmentos de TREK-1 de ratón (GenBank, número de acceso U73488), TASK humano (GenBank, número de acceso AF006823) y TRAAK de ratón (GenBank, número de acceso AF056492) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se subclonaron en el vector pIRES-CD8. Las células transfectadas fueron visualizadas 48 horas después de la transfección utilizando el método de los glóbulos revestidos con anticuerpo anti-CD8. Para los experimentos de célula completa y zona escindida, la disolución interna era KCl 150 mM, MgCl2 3 mM, EGTA 5 mM y HEPES 10 mM con un pH ajustado a 7,2 con KOH, y el medio externo contenía NaCl 150 mM, KCl 5 mM, MgCl2 3 mM, CaCl2 1 mM y HEPES 10 mM con un pH ajustado a 7,4 con NaOH. Las células fueron continuamente sometidas a superperfusión con un sistema de microperfusión durante el curso de los experimentos (0,1 ml/min), llevados a cabo a temperatura ambiental. Para los registros de células completas así como para los registros de un solo canal, se utilizó un amplificador RK300 para pinzamientos zonales (Biologic, Grenoble, Francia). Se determinaron y registraron continuamente las corrientes iónicas usando un sistema registrador DAT (Biologic. Grenoble, Francia). Posteriormente, los datos fueron reintroducidos y muestreados utilizando el software pClamp. El análisis de los datos se llevó a cabo utilizando Clampfit (pClamp) para el registro de células completas y también el software Biopatch (Biologic) para los registros de canales individuales. Se midió la capacitancia de las membranas durante una operación de hiperpolarización a 10V a partir de un potencial de fijación de -80 mV. Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico (P < 0,001).

5. Suministro y concentración de anestésicos

Se disolvieron directamente los anestésicos generales en disoluciones salinas. Todos los experimentos fueron llevados a cabo a temperatura ambiental (24 °C). Se prepararon disoluciones cada 3 horas como disoluciones madre (concentraciones calculadas de 510 mM) en botellas impermeables a los gases. Se prepararon diluciones sucesivas justo antes del experimento electrofisiológico. Se pusieron 2,5 ml de cada disolución experimental, en la concentración deseada, en una jeringa conectada al sistema de superperfusión experimental. Las mediciones electrofisiológicas se llevaron a cabo en 45 minutos.

Se determinaron posteriormente las concentraciones reales de los anestésicos por medio de un método de cromatografía en fase gaseosa (sistema HP 6890 provisto de una columna DB624) utilizando detección por FID. Se recogieron muestras (2,5 ml de disolución) antes (t0) y después (t45) de la perfusión por medio del ajuste experimental. Las disoluciones se recogieron utilizando un tubo impermeable a los gases y se almacenaron a 4 °C en recipientes de vidrio sellados para el análisis subsiguiente. Los muestreos y las mediciones se llevaron a cabo por duplicado. Se determinaron las concentraciones reales de los anestésicos multiplicando la concentración calculada por la relación t45/t0 (cloroformo: 0,16; halotano: 0,37; isoflurano: 0,76; y éter dietílico: 0,57). En las curvas de dosis-efecto, se estimaron las concentraciones umbral como las concentraciones que producían un aumento superior al 10% en la amplitud de corriente.

RESULTADOS

En la ID. SEC. nº 1 se muestra la secuencia de ácido nucleico que corresponde al marco de lectura abierto del canal TREK-1 humano. La secuencia de 1236 nucleótidos codifica una proteína de 411 aminoácidos. La conservación entre las proteínas humana y murina es muy elevada, con una homología que sobrepasa el 99%.

TASK y TREK-1, dos canales de K+ de dominio 2P de mamífero que tienen propiedades similares a IK(An), son activados por anestésicos generales volátiles. El cloroformo, el éter dietílico, el halotano y el isoflurano activaron TREK-1, mientras que sólo el halotano y el isoflurano activaron TASK. Las regiones C-terminales tanto de TREK-1 como de TASK son críticas para la activación por anestésicos. De este modo, tanto TREK-1 como TASK son sitios diana importantes para estos agentes.

En los experimentos de pinzamiento zonal de célula completa mostrados en la Figura 1B, el cloroformo activaba intensa y reversiblemente el TREK-1 expresado en células COS transfectadas, mientras que deprimía ligeramente TASK y no ejercía efecto alguno sobre TRAAK. Como se muestra en la Figura 1C, el cloroformo provocó una típica corriente de fondo caracterizada por una rectificación hacia fuera que se invierte en el valor predicho para EK+, como quedó demostrado por el desplazamiento del potencial de inversión a 0 mV en condiciones de K+ simétricas. No se observó activación de corriente en las células simuladamente transfectadas (Figura 1B). En la Figura 1D se muestra que el cloroformo también hiperpolarizó reversible y reproduciblemente células COS que expresaban TREK-1 (pero no células simuladamente transfectadas, no mostrado; n = 5). La activación de TREK-1 era dependiente de la dosis, con una concentración umbral para activación de 500 µM, como se muestra en la Figura 1E. La inserción de la Figura 1E muestra que la activación de corriente, medida en un potencial de fijación de 0 mV, comenzó rápidamente, pero la activación en estado estacionario apenas se alcanzó después de un minuto en presencia de cloroformo.

Tanto TREK como TASK, pero no TRAAK, fueron abiertos por el halotano. Como se muestra en las Figuras 2B y 2C, la corriente provocada por halotano presentaba una rectificación hacia fuera y se invertía en el valor predicho para EK+. Las curvas de dosis-efecto (mostradas en la Figura 2D y la Figura 2E) demostraban que las concentraciones umbral para el halotano eran 400 µM y 200 µM, respectivamente, sobre TREK-1 y TASK. Los efectos del halotano sobre TASK eran rápida y completamente reversibles. La apertura de TASK por cloroformo fue más rápida que la apertura de TREK-1 (compárese la Figura 2F con la Figura 1E, inserciones). Estos resultados sugieren que los componentes de la activación de ambos canales por anestésicos pueden ser mediados por diferentes mecanismos moleculares.

El isoflurano, como el halotano, activaba los canales tanto TREK-1 como TASK sin alterar TRAAK, como se muestra en la Figura 3A. El éter dietílico, como el cloroformo, abría TREK-1 pero no afectaba a TRAAK. El éter dietílico también disminuía la actividad de TASK.

Para demostrar que la activación por anestésicos volátiles no tiene lugar a través de rutas de segundos mensajeros, se llevaron a cabo experimentos sobre zonas escindidas. En la Figura 4A se muestra que, en una zona escindida de cara externa hacia fuera, el halotano abría reversiblemente, y de un modo dependiente de la dosis, un canal TREK-1 de 48 pS. No se observó actividad de canal alguna en ausencia del anestésico, lo que sugiere que el halotano convierte canales inactivos en canales activos. La curva I-V de la corriente sensible al cloroformo en una zona de cara externa hacia fuera muestra la característica rectificación hacia fuera previamente observada en las condiciones macroscópicas de célula completa, como se muestra en las Figuras 4B-4C y la Figura 1B (inserciones). Como se muestra en las Figuras 4D-4E, en la configuración de zona de cara interna hacia fuera, el halotano abría reversiblemente un canal TASK de 12 pS. En ausencia de anestésicos se abrió un solo canal TASK, como se muestra en los gráficos izquierdos de las Figuras 4D-4E. La adición de halotano provocó la apertura de un segundo canal (véanse los gráficos centrales de las Figuras 4D-4E) que se cerró de nuevo después de un lavado (véanse los gráficos derechos de las Figuras 4D y 4E). Todos los datos, conjuntamente considerados, demuestran que los anestésicos generales volátiles abren canales TASK y TREK-1 y que es probable que estos efectos sean directos e independientes de segundos mensajeros.

TREK-1 y TASK son canales probablemente críticos para la acción de anestésicos generales volátiles. La apertura de estos canales de K+ junto con la conocida modulación de los receptores de neurotransmisores explicarán probablemente la acción de los anestésicos generales. Probablemente, los efectos de los anestésicos volátiles sobre canales iónicos dependientes de ligando, tales como los receptores GABAA, son particularmente importantes a nivel postsináptico. La apertura de canales TREK-1 y TASK de fondo por anestésicos volátiles podría ser muy importante tanto a nivel presináptico (IK(An)) como a nivel postsináptico. Se espera que una activación de sólo una pequeña fracción de estos canales IK(An) ejerza efectos significativos sobre la polarización de la membrana y, en consecuencia, efectos potencialmente importantes en las funciones tanto presináptica como postsináptica. Los canales TREK-1 y TASK se expresan en células neuronales pero también se expresan en otros tejidos, y particularmente en el corazón. Por lo tanto, no es sorprendente que los anestésicos volátiles tengan efectos secundarios depresivos sobre la función del corazón. Estos efectos incluyen una lentificación de la frecuencia cardiaca y efectos inotrópicos negativos, y son totalmente compatibles con una apertura exagerada de canales de K+ de fondo por anestésicos volátiles. Las mismas consideraciones podrían explicar muy bien la depresión ventilatoria.

LISTA DE SECUENCIAS

<110>

PATEL, AMANDA J.

HONORE, ERIC

LESAGE, FLORIAN

ROMEY, GEORGES

LAZDUSKI, MICHEL

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Un método para la identificación de anestésicos

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TREK humano-f17b12prov3

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6079727

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4

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ADN

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3

<211>

3580

<212>

ADN

<213>

Mus musculus

5

<220>

<221>

CDS

<222>

(484)..(1719)

<400>

3

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 4

<211>

411

<212>

PRT

<213>

Mus musculus

5

<400> 4

imagen1

imagen1

<210>

5

<211>

394

<212>

PRT

5

<213> Mus sp.

<223>

TASK

<400>

5

imagen1

imagen1

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para identificar sustancias que tienen propiedades anestésicas tras su inhalación, que comprende:

   (a) poner dicha sustancia en contacto con una proteína de transporte de potasio de mamífero, en que dicho 5 transporte de potasio presenta rectificación de potasio hacia fuera; y

   (b) determinar la actividad de transporte de potasio de dicha proteína de transporte de potasio, en que una activación del transporte de potasio es indicativa de que dicha sustancia tiene dichas propiedades anestésicas,

   en que dicha proteína de transporte de potasio de mamífero es TASK de secuencia ID. SEC. nº 5.
2. 2. El método de la Reivindicación 1, que comprende:

   10 (a) poner dicha sustancia en contacto con células transfectadas, en que dichas células transfectadas están transfectadas con un vector nucleotídico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica dicho TASK, en que dichas células transfectadas expresan transitoriamente dicho TASK en una superficie de dichas células transfectadas, y en que dicho TASK presenta rectificación de potasio hacia fuera; y

   (b) determinar la actividad de transporte de potasio de dicho TASK, en que una activación del transporte de 15 potasio es indicativa de que dicha sustancia tiene dichas propiedades anestésicas.
3. 3. El método de la Reivindicación 2, en que dichas células transfectadas son seleccionadas del grupo que consiste en Spodoptera, ovocitos de Xenopus, células de ovario de hámster chino y fibroblastos.