PL213159B1 - Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania - Google Patents

Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania

Info

Publication number
PL213159B1
PL213159B1 PL391045A PL39104510A PL213159B1 PL 213159 B1 PL213159 B1 PL 213159B1 PL 391045 A PL391045 A PL 391045A PL 39104510 A PL39104510 A PL 39104510A PL 213159 B1 PL213159 B1 PL 213159B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
aktrans
strain
growth
mutant
deletion
Prior art date
Application number
PL391045A
Other languages
English (en)
Other versions
PL391045A1 (pl
Inventor
Piotr Koprowski
Andrzej Kubalski
Wojciech Grajkowski
Original Assignee
Inst Biolog Doswiadczalnej Im Marcelego Nenckiego Pan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biolog Doswiadczalnej Im Marcelego Nenckiego Pan filed Critical Inst Biolog Doswiadczalnej Im Marcelego Nenckiego Pan
Priority to PL391045A priority Critical patent/PL213159B1/pl
Priority to EP11729486.8A priority patent/EP2561105B1/en
Priority to AU2011243310A priority patent/AU2011243310B2/en
Priority to US13/642,121 priority patent/US9309575B2/en
Priority to PCT/PL2011/050010 priority patent/WO2011133056A1/en
Priority to CA2796861A priority patent/CA2796861A1/en
Publication of PL391045A1 publication Critical patent/PL391045A1/pl
Publication of PL213159B1 publication Critical patent/PL213159B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku są zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób i zestaw do testowania potencjalnych związków antybakteryjnych będących aktywatorami bakteryjnych kanałów mechanoczułych, wykorzystujący zmutowane szczepy.
Kanały jonowe to wyspecjalizowane białka błonowe umożliwiające przepływ jonów w poprzek błony komórkowej zgodnie z gradientem stężeń. W stanie zamkniętym kanały nie przewodzą jonów, a ich otwarcie może nastąpić pod wpływem zmiany elektrycznego potencjału błonowego (kanały napięciowozależne), ligandów, bądź też naprężeń mechanicznych błony (kanały mechanoczułe). W trakcie otwierania element kanału zwany bramką zmienia swoje położenie odsłaniając por kanału i umożliwiając przepływ jonów. Czasy otwarcia kanałów są bardzo krótkie (kilka milisekund), a ruch jonów następuje z prędkością rzędu 106 jonów/s. Kanały jonowe mogą przewodzić określone jony, mówimy wtedy, że kanały takie posiadają filtry selektywności. W zależności od rodzaju przewodzonych jonów możemy wyróżnić kanały kationowe i anionowe, a wśród tych pierwszych kanały potasowe, sodowe lub wapniowe. Przepływ jonów przez kanały odbywa się zgodnie z gradientem stężeń po obu stronach błony komórkowej.
Jonowe kanały mechanoczułe (MC) są aktywowane poprzez naprężenia mechaniczne błony komórkowej i ich obecność została stwierdzona w komórkach zwierzęcych, roślinnych i bakteryjnych. Kanały MC, obok kanałów jonowych aktywowanych napięciem elektrycznym błony i kanałów aktywowanych i modulowanych ligandami, stanowią trzecią, podstawową klasę kanałów jonowych. Kanały MC są detektorami wszelkich bodźców mechanicznych odgrywających rolę w procesach dotyku, słyszenia, zachowania równowagi czy regulacji naczyń włosowatych. Kanały MC mogą reagować na naprężenia błony wywołane przez siły generowane przez samą komórkę w procesach podziału, morfogenezy i wzrostu komórki i mogą być uniwersalną ochroną wszystkich komórek przed szokami osmotycznymi (nagłymi zmianami osmolarności w środowisku) i właśnie ta ich cecha wydaje się tłumaczyć ich występowanie u bakterii (Hamill O.P., Martinac B., 2001, Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiol. Rev. 81, 685-740). Dwa bakteryjne kanały MC pochodzące z błony cytoplazmatycznej Escherichia coli: MscS (kanał MC o małej przewodności) i MscL (kanał MC o dużej przewodności) są, jak do tej pory, najlepiej poznanymi białkami mechanoczułymi i to zarówno pod względem struktury jak i funkcji. Bakteryjne kanały MC charakteryzują się dużymi przewodnościami i dużymi wartościami naprężeń wywołujących aktywację. Są to cechy, które odróżniają je od eukariotycznych kanałów MC, przewodność kanału MscL jest około 100-krotnie większa niż średniego kanału eukariotycznego (przewodność MscS około 30-krolnie) (Koprowski P., Grajkowski W., Kubalski A., Bakteryjne kanały jonowe jako struktury modelowe., Kosmos, 2005, tom 54, nr 4 (269) str. 373-379).
Większość bakterii, w tym patogennych, bytuje w zmiennym osmotycznie środowisku (np. organizm człowieka - woda). W czasie szoku hipoosmotycznego (przeniesienie ze środowiska o wysokiej osmolarności do środowiska o niskiej osmolarności) na osłony bakteryjne działa duże ciśnienie osmotyczne, które może doprowadzić do rozerwania komórki. Udowodniono, że kanały mechanoczułe MscS i MscL, które otwierane są przez naprężenia błony komórkowej, są niezbędne do przeżycia przez bakterie szoków osmotycznych. Komórki Escherichia coli pozbawione aktywnych produktów genów mscS i mscL poddane szokowi osmotycznemu ulegają lizie. Zgodnie z niezbędną rolą kanałów mechanoczułych MscS i MscL dla bakterii, geny tych białek znajdowane są we wszystkich zsekwencjonowanych genomach bakteryjnych. Kanały te stanowią drogę dla „wyrzucenia” z komórki nadmiaru osmolitów i wody w krótkim czasie, dlatego też są kanałami o największym znanym przewodnictwie.
Kontrola ich aktywności jest kluczowa do przeżycia komórki, niekontrolowane otwarcia powodują deenergetyzację i śmierć komórki. Wyizolowano szereg mutantów kanałów MscL i MscS, których ekspresja jest toksyczna dla komórek bakteryjnych (ang. gain-of-function phenotype). Taki fenotyp możliwy jest dzięki relatywnie dużemu przepływowi jonów w warunkach, w których niezmutowany kanał jest zamknięty - wykazano znacznie obniżony próg otwarcia zmutowanych kanałów.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 6,537,778 B1 ujawniono kwasy nukleinowe kodujące eukariotyczne białko mechanoczułych kanałów przewodzenia (Msc), metody izolowania modulatorów, to jest aktywatorów, inhibitorów, wzmacniaczy itp. mechanoczułych kanałów przewodzenia z wykorzystaniem wyizolowanych naturalnie występujących lub rekombinowanych białek Msc albo fragmentów tych białek i stosując znane w dziedzinie testy wiązania in vitro i in vivo oraz zestawy do izolowania modulatorów białek Msc zawierające białka Msc, odpowiednie reagenty i instrukcje.
PL 213 159 B1
W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 6,942,979 B1, US 2003/0049697 A1, US 7,468,422 B2, US 2006/0024729 A1 i US 2009/0162368 A1 ujawniono oczyszczone białko obejmujące mechanoczuły kanał potasowy aktywowany przez co najmniej jeden wielonienasycony kwas tłuszczowy i riluzol, zastosowanie takich kanałów do identyfikacji potencjalnych leków oraz metody identyfikacji substancji zdolnych do modulowania prądu potasowego białka kanału potasowego TRAAK aktywowanego kwasem arachidonowym.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 7,429,449 B2 ujawniono metody identyfikacji inhibitorów i aktywatorów eukariotycznych kanałów potasowych wykorzystujące komórki saccharomyces cerevisiae, które nie wyrażają funkcjonalnie endogenicznych kanałów potasowych TRK1, TRK2 i TOK1, lecz które heterologicznie wyrażają badane eukariotyczne kanały potasowe, oraz sposoby wytwarzania i zastosowanie takich zmutowanych komórek.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 2003/0073117 A1 ujawniono nowe białka mechanoczułego kanału, otrzymane od myszy i ludzi (odpowiednio SAC1 i hSAC), które są wyrażane specyficznie w nerce i mają funkcję nieselektywnego transportowania kationów do komórek w odpowiedzi na bodziec mechaniczny, DNA kodujący takie białka, sposób identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów aktywności kanału kationowego z zastosowaniem tych białek oraz przeciwciała dla tych białek.
W europejskim opisie patentowym EP 1 535 903 A1 oraz w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 2005/051902 A2 opisano związki i metody stosowane do chemicznej modyfikacji białkowego kanału do zastosowania w farmaceutycznych nośnikach leków do kontrolowanego i/lub miejscowego uwalniania cząsteczek terapeutycznych (np. małych cząsteczek, peptydów, białek lub innych makrocząsteczek), a także ujawniono związki wrażliwe na pH i/lub światło, zdolne do modyfikowania mechanoczułego kanału, takiego jak białkowy kanał MscL E. coli lub jego funkcjonalny ekwiwalent, zastosowanie tych związków do przekształcania białka mechanoczułego kanału w kanał wrażliwy na pH i/lub światło i zastosowanie takich przekształconych kanałów do dostarczania leków.
W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 7,396,816 B2 opisano nowe polipeptydy, które specyficznie hamują aktywność mechanoczułego kanału, oraz inhibitory mechanoczułego kanału i leki na migotanie przedsionków, zawierające te polipeptydy lub ich sole.
W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 2005/002521 A2 opisano między innymi metody identyfikacji związków, które hamują ekspresję genu białka transportującego potas lub biologiczną aktywność produktów tego genu, które obejmują testy wiązania liganda, testy aktywności białka, testy komórkowe i testy na ekspresję genu TRK.
W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 2005/070122 ujawniono metody identyfikacji środków, które zmniejszają aktywność mechanoczułych kanałów jonowych, korzystnie mechanoczułego kanału przepuszczalnego dla Ca2+ (MscCa), a także metody wykorzystujące środki zmniejszające aktywność mechanoczułych kanałów jonowych, obejmujących np. metody leczenia raka, metody zmniejszania przerzutów komórek rakowych i metody redukcji symptomów związanych z rakiem.
Ostatnio stosowano inny sposób izolacji mutantów kanału MscS. Szczep E. coli LB2003 (trkA kup1 (trkD1) kdpABC5 rpsL metE thi rha gal), pozbawiony transporterów potasu, do pełnego wzrostu wymaga obecności wysokiego stężenia (>30 mM) jonów potasu (K+) w pożywce (szczep posiadający transportery potasu może rosnąć na pożywce o submilimolarnych stężeniach jonów K+). Ekspresja w LB2003 białek tworzących alternatywne drogi transportu jonów K+ (np. kanałów błonowych, które otwierając się pod wpływem zadanego bodźca umożliwiają wpływ/wypływ K+ do/z wnętrza komórki) pozwala na przywrócenie wzrostu komórek w pożywkach o niskim stężeniu tego jonu. Ta strategia była już wcześniej wykorzystywana do izolacji genów kanałów potasowych. Wyizolowano mutanty z szeregiem mutacji w domenie transmembranowej MscS, którą wcześniej scharakteryzowano jako bramkę kanału. Ponadto okazało się, że nadekspresja niektórych z tych mutantów w szczepie dzikim hamuje wzrost komórek. Fenotyp taki spowodowany jest obniżonym progiem otwarcia kanałów i deenergetyzacją komórki (fenotyp gain-of-function).
Związki chemiczne otwierające kanały mechanoczułe, będą mimikowały takie mutacje i również doprowadzały do śmierci komórki. Takie związki o właściwościach bakteriostatycznych lub bakteriobójczych, będą miały potencjalne zastosowanie farmakologiczne.
Przedmiotem wynalazku są zmutowane szczepy Escherichia coli MG61655 (ATCC nr 47076) pozbawione wszystkich transporterów potasu tj. Kdp, Kup i Trk (AKtrans), obejmujące szczepy pozbawione co najmniej jednego z genów kanałów mechanoczułych mscS i mscL (AKtrans AmscS i/lub
PL 213 159 B1
AmscL). W szczególności wynalazek dotyczy szczepów Escherichia coli MG61655 (ATCC nr 47076) pozbawionych wszystkich transporterów potasu tj. Kdp, Kup i Trk (AKtrans), które dodatkowo zostały pozbawione genu kanału mechanoczułego mscS (AKtrans AmscS), lub genu kanału mechanoczułego mscL (AKtrans AmscL) lub obydwu genów kanałów mechanoczułych mscS i mscL (AKtrans AmscS
AmscL).
Przedmiotem wynalazku jest także sposób testowania związków chemicznych pod kątem potencjalnych właściwości antybakteryjnych, wykorzystujący wyżej wymienione zmutowane szczepy, w którym:
- w pierwszym etapie selekcji prowadzi się pomiar wzrostu hodowli mutantów pozbawionych wszystkich transporterów potasu E. coli (AKtrans) w obecności badanego związku o różnych stężeniach i limitujących stężeń potasu, przy czym wzrost szczepu w takich warunkach wskazuje na umożliwienie transportu potasu do wnętrza komórki przez badany związek,
- korzystnie w drugim etapie selekcji prowadzi się pomiar wzrostu hodowli mutantów pozbawionych wszystkich transporterów potasu E. coli (AKtrans) i hodowli mutantów pozbawionych wszystkich transporterów potasu oraz obydwu genów kanałów mechanoczułych mscS i mscL E. coli (AKtrans AmscS AmscL), w obecności związku wyselekcjonowanego w etapie pierwszym o różnych stężeniach oraz limitujących stężeń potasu, przy czym wzrost obu szczepów oznacza, że badany związek nie wykazuje aktywności względem białek kanałowych MscS i MscL, natomiast wzrost szczepu E. coli (AKtrans) i brak wzrostu szczepu E. coli (AKtrans AmscS AmscL) oznacza wpływ badanego związku na aktywność kanałów mechanoczułych,
- korzystnie w trzecim etapie selekcji prowadzi się pomiar wzrostu hodowli mutantów E. coli (AKtrans AmscL) w obecności związku wyselekcjonowanego w etapie drugim (wykazującym wpływ na aktywność kanałów mechanoczułych) o różnych stężeniach oraz limitujących stężeń potasu i wzrost hodowli wskazuje na to, że badany związek jest specyficznym aktywatorem kanału MscS,
- korzystnie w czwartym etapie selekcji prowadzi się pomiar wzrostu hodowli mutantów E. coli (AKtrans AmscS) w obecności związku wyselekcjonowanego w etapie drugim (wykazującym wpływ na aktywność kanałów mechanoczułych) o różnych stężeniach oraz limitujących stężeń potasu i wzrost hodowli wskazuje na to, że badany związek jest specyficznym aktywatorem kanału MscL.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do testowania związków chemicznych jako potencjalnych substancji o działaniu antybakteryjnym, zawierający zmutowane szczepy wymienione powyżej.
Wytwarzanie zmutowanych szczepów Escherichia coli MG61655 (ATCC nr 47076)
Wszystkie delecje wykonuje się standardową metodą (Datsenko i Wanner, 2000).
Poniższa procedura pozwala na uzyskanie wielokrotnych delecji. W metodzie tej kaseta niosąca oporność na kanamycynę i oflankowana sekwencjami FRT rozpoznawanymi przez rekombinazę FLP, która jest częścią plazmidu pKD13, jest używana jako matryca do reakcji PCR. Primery używane do tej reakcji zawierają regiony P, komplementarne do matrycy na ich 3' końcach i regiony H, komplementarne do sekwencji flankującej gen podlegający delecji na ich 5' końcach. Następnie produkty PCR są transformowane do komórek E. coli eksprymujących rekombinazę XRED z plazmidu pKD46, która pozwala na homologiczną rekombinację transformowanych produktów PCR. Komórki są następnie hodowane w temperaturze 37°C na medium selekcyjnym zwierającym kanamycynę w celu izolacji integrantów genu oporności na kanamycynę. Wyizolowane klony są hodowane bez antybiotyków w temperaturze 43°C w celu eliminacji plazmidu pKD46. Następnie komórki transformowane są plazmidem pCP20 eksprymującym rekombinazę FLP, która pozwala na eliminację genu oporności na kanamycynę z genomu. Transformanty selekcjonowane są w temperaturze 30°C na ampicylinie, po czym są pasażowane nieselekcyjnie w temperaturze 43°C. W ten sposób następuje eliminacja plazmidu pCP20 z komórki. Bakterie są następnie testowane na utratę markerów antybiotykowych. Delecje są potwierdzane przez reakcje PCR z użyciem primerów: k1 5'-CGGCCACAGTCGATGAATCC-3' i k2 5'-CGGTGCCCTGAATGAACTGC-3'.
Datsenko KA, Wanner BL (2000.) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97: 6640-6645.
Li, C, Edwards, M.D., Jeong, H., Roth, J., i LR. Booth. 2007. Identification of mutations that alter the gating of the Escherichia coli mechanosensitive channel protein, MscK. Mol. Microbiol. 64:560-574.
PL 213 159 B1
Sposób testowania potencjalnych związków antybakteryjnych
Szczep E. coli (AKtrans), pozbawiony transporterów potasu, do pełnego wzrostu wymaga obecności wysokiego stężenia (> 30 mM) jonów potasu (K+) w pożywce (szczep posiadający transportery potasu może rosnąć na pożywce o submilimolarnych stężeniach K+).
Ekspresja w E. coli AKtrans białek tworzących alternatywne drogi transportu K+ (np. kanały błonowe, które otwierając się pod wpływem zadanego bodźca umożliwiają wpływ/wypływ K+ do wnętrza komórki), pozwala na przywrócenie wzrostu komórek w pożywkach z niskim stężeniem tego jonu (1-5 mM K+). Kanały mechanoczułe z mutacjami w bramce kanału (rozszczelnione) również umożliwiają przepływ K+ i wzrost przy niskim stężeniu potasu. Nadekspresja niektórych z tych mutantów w szczepie dzikim hamuje wzrost komórek. Fenotyp laki spowodowany jest obniżonym progiem otwarcia kanałów i deenergetyzacją komórki (fenotyp gain-of-function, GOF).
Test z zastosowaniem mutanta E. coli (AKtrans AmscS AmscL) - pierwszy etap selekcji związków pod kątem rozszczelniania kanałów mechanoczułych
Testy obejmują pomiary wzrostu hodowli mutantów szczepu E. coli (AKtrans) w obecności kilku stężeń badanych związków drobnocząsteczkowych (w zakresie stężeń od nanomolarnego do mikromolarnego). Wzrost szczepu w obecności limitujących stężeń potasu i w obecności badanego związku świadczy o umożliwieniu transportu potasu do wnętrza komórki przez badany związek. E. coli (AKtrans) jak i E. coli (AKtrans AmscS AmscL) rosną na pożywce o wysokim stężeniu K+. Jeśli dodanie związku z puli związków przeszukiwanych pod kątem potencjalnych właściwości antybakteryjnych spowoduje obniżenie stężenia koniecznego do wzrostu w obu szczepach to oznacza, że substancja nie działa na białka kanałowe MscS i MscL, lecz zmienia inne właściwości błony/białek błonowych innych niż kanały mechanoczułe, powodując jej nieszczelność. Z drugiej strony wzrost E. coli (AKtrans) i brak wzrostu szczepu E. coli (AKtrans AmscL AmscS) w obecności badanego związku oznacza wpływ związku na aktywność kanałów mechanoczułych. Wpływ ten może być bezpośredni (przez wiązanie się do białka) lub pośredni (przez wbudowywanie się do błony cytoplazmatycznej i modyfikację jej własności). Rozróżnienie miedzy tymi scenariuszami odbywa się poprzez zbadanie wzrostu, w obecności limitujących stężeń potasu i badanego związku, dwóch szczepów E. coli (AKtrans AmscL) i E. coli (AKtrans AmscS). W tym przypadku wzrost obu szczepów w obecności badanej substancji świadczy o pośrednim niespecyficznym działaniu związku na kanały mechanoczułe (białka MscS i MscL nie wykazują ani podobieństwa sekwencji aminokwasowej ani struktury). Z drugiej strony wzrost jednego z dwóch szczepów identyfikuje związek jako specyficzny aktywator jednego z kanałów.
Test z zastosowaniem mutanta E. coli (AKtrans AmscL).
Badana substancja, zidentyfikowana poprzednio jako umożliwiająca wzrost szczepu E. coli (AKtrans), ale nie E. coli (AKtrans AmscS AmscL), jest testowana na szczepie E. coli (AKtrans AmscL). Jeśli badana substancja umożliwia wzrost szczepu E. coli (AKtrans AmscL) w niskim stężeniu jonów potasu oznacza to, że jest ona specyficznym aktywatorem kanału MscS. Zastosowanie takiej substancji w wyższym stężeniu niż w testach opisanych powyżej może prowadzić do śmierci komórek. Efekt będzie wywołany nieszczelnością kanału MscS i jest porównywalny z efektami mutacji w różnych rejonach kanału np. mutacji GOF A98S w rejonie bramki, obniżającej próg pobudzenia kanału (Edwards i współ., 2005).
Test z zastosowaniem mutanta E. coli (AKtrans AmscS).
Badana substancja, zidentyfikowana poprzednio jako umożliwiająca wzrost szczepu E. coli (AKtrans), ale nie E. coli (AKtrans AmscS AmscL), jest testowana na szczepie E. coli (AKtrans AmscS). Jeśli badana substancja umożliwia wzrost szczepu E. coli (AKtrans AmscS) w niskim stężeniu jonów potasu oznacza to, że jest ona specyficznym aktywatorem kanału MscL. Zastosowanie takiej substancji w wyższym stężeniu niż do testów opisanych powyżej może prowadzić do śmierci komórek. Efekt będzie wywołany nieszczelnością kanału MscL i jest porównywalny z efektami mutacji w różnych rejonach kanału np. mutacji GOF V23A w rejonie bramki, obniżającej próg pobudzenia kanału (Ou i współ., 1998).
Edwards MD, Li Y, Kim S, Miller S, Bartlett W, Black S, Dennison S, Iscla I, Blount P, Bowie JU, Booth IR. (2005) Pivotal role of the glycine-rich TM3 helix in gating the MscS mechanosensitive channel. Nat Struct Mol Biol. 12(2): 113-9.
PL 213 159 B1
Ou X, Blount P, Hoffman RJ, Kung C. (1998) One face of a transmembrane helix is crucial in mechanosensitive channel gating. Proc Natl Acad Sci USA.95(19): 11471-5.
Niżej podane przykłady ilustrują wynalazek
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie mutantów
Materiały i metody
Pożywka KLM: 10 g/l bacto tryptonu (DIFCO), 5 g/l ekstraktu drożdżowego (DIFCO), 10 g/l KCl, pH=7.0
Jako medium nielimilującego wzrost mutantów E. coli (AKtrans) używano pożywki 10 K115 zawierającej K2HPO4, 46 mM; KH2PO4, 23 mM; (NH4)2SO4, 8 mM; MgSO4, 0,4 mM; FeSO4, 6 μΜ; cytrynian sodu, 1 mM; chlorowodorek tiaminy, 1 mg/l; i glukozę, 0,2% (Li i współ., 2007). W celu otrzymania pożywki bez potasu K0 stosowano Na2HPO4, 46 mM; NaH2PO4, 23 mM; (NH4)2SO4, 8 mM; MgSO4, 0,4 mM; FeSO4, 6 μM; cytrynian sodu, 1 mM; chlorowodorek tiaminy, 1 mg/l; i glukozę, 0,2% (masa/objętość). W celu przygotowania pożywki o pośredniej zawartości potasu mieszano pożywki K115 i K0 w odpowiednich proporcjach.
Szczepy pozbawione aktywności trzech znanych transporterów potasu Kdp, Kup, Trk, opisywane w literaturze były wielokrotnie.
W celu inaktywacji wszystkich transporterów potasu tj. Kdp, Kup i Trk wykonano sekwencyjnie delecje genów dla podjednostek tych transporterów: kdpABC, kup i trkA. Tak otrzymany szczep oznaczony dalej E. coli ((AKtrans), użyty został do delecji genów kanałów mechanoczułych mscS i mscL w celu uzyskania szczepów o genotypie E. coli (AKtrans AmscL), E. coli (AKtrans AmscS) i E. coli (AKtrans AmscL AmscS).
Do tego celu przy użyciu primerów 1 i 2 namnażono przez PCR (używając polimerazy Pfu (Stratagen) w buforze i z parametrami zalecanymi przez producenta) kasetę kanR z plazmidu pKD13 (Datsenko i Wanner, 2000). Każda z par primerów 1 i 2 składała się z dwóch fragmentów H i P o strukturze 5'-HxPx-3' tak wiec primer 1 miał strukturę 5'-H1P1-3'
Fragmenty P były stałe o następujących sekwencjach:
Pl:
5’-AlTCGGGGGATGCGTCGACC-3’ oraz
P2:
’ -TCT AGGGTGG A GC FGCITCC3-3 ‘
Fragmenty H były zmienne i specyficzne dla delecji danego genu:
- dla delecji trkA:
HI:
5WrAATAAGGCGTCATTAGACWCTTAlTAATTACAAGAAGAAAGGGCTrGG-3’
H2:
5’-TrTACG(TrAAGCTAATCAAAAAGTGATGA<}ATAACG€K3KOCGACTOATG-3·
- dla delecji kdpABC:
HI:
5ł-GACrCATATTCAGTGCTCACTCAATATCATCA(K1AGAGATAlTC(.XXX:AC-3’
112:
5’-GTCATFGATTTACTGCTGACCGTTTOCGGTCTGGTGTGAGGTTTACCATG-3’
- dla delecji kup:
HI:
S^-CCCCTTATCAAGAAAGGAGGCGTCIGGCGTlWGAlTrcGACCroAarACC-S’
PL 213 159 B1
Η2:
5’-CK 'C A At JGG AGTAAGCAC AC ATTTC ATATITt7 A AC X i AAAC I AC.T AGTC 7Γ A' ΙΌ-3'
- dla delecji mscS:
III:
5TCA(JAGAGTATTATCTGG(XTCAGCGlTCrATTAC(K7AGCnTraTC'n’CTTT--3?
112:
5'-GGCGGAGTGTATTTCTCCATTTTOAGTCAGTTGAAAAGGAATATTGAATG~3'
- dla delecji tnsd HI:
5’-ACCACTGGTCrrCTGCTTTCAGGCGCnG'n'AAGAGCGG’n'ATTCrGCrC-3'
H2:
5’-TOUCATFTGrrAGACTTATGGTTCTCGGC.TrcATAGGGAGAATAACATC~3'
Produkty PCRu transformowano przez elektroporację do szczepu dzikiego typu - MG1655 (ATCC, nr 47076) E. coli niosącego plazmid pKD46. Transformacje wyrażano przez 1 godz., w temperaturze 37°C w pożywce SOC. Transformanty selekcjonowano na pożywce stałej KLM z dodatkiem kanamycyny (25 gg/ml) w temperaturze 37°C. Następnie transformanty pasażowano na LB bez antybiotyków i hodowano w temperaturze 43°C. Komórki testowano na wrażliwość na ampicilinę (utrata plazmidu pKD46). Klony wrażliwe na ampicylinę transformowano następnie plazmidem pCP20. Transformanty selekcjonowane były na pożywce KLM z ampicyliną (100 u g/ml) w temperaturze 30°C, a następnie pasażowane na KEM bez antybiotyków w temperaturze 43°C. Następnie pojedyncze kolonie E. coli testowano na KLM z ampicyliną lub kanamycyną w celu potwierdzenia utraty obu markerów antybiotykowych.
Uzyskane szczepy E. coli (AKtrans), E. coli (AKtrans AmscL), E. coli (AKtrans AmscS) i E. coli (AKtrans AmscL AmscS) testowano na wzrost w obecności różnych stężeń potasu: nielimitujących na pożywce z potasem o stężeniu 115 mM (K115), jak i limitujących na pożywce z potasem o stężeniu 1-15 mM (K1, K15). Wszystkie wyżej wymienione szczepy rosły tylko na pożywce K115 i nie wykazywały wzrostu na pożywkach K1 i K15.
P r z y k ł a d 2
Test identyfikujący potencjalne związki antybakteryjne
Media
Jako medium nielimitującego wzrost mutantów E. coli (AKtrans) używano pożywki K115 zawierającej K2HPO4, 46 mM; KH2PO4, 23 mM; (NH4)2SO4, 8 mM; MgSO4, 0.4 mM; FeSO4, 6 gM; cytrynian sodu, 1 mM; chlorowodorek tiaminy, 1 mg/l; oraz glukozę, 0,2% (Li i współ., 2007). W celu otrzymania pożywki bez potasu K0 używano Na2HPO4, 46 mM; NaH2PO4, 23 mM; (NH4)2SO4, 8 mM; MgSO4, 0,4 mM; FeSO4, 6 gM; cytrynian sodu, 1 mM; chlorowodorek tiaminy, 1 mg/l; i glukozę, 0,2% (masa/objętość). W celu przygotowania pożywki o pośredniej zawartości potasu mieszano pożywki K115 i K0 w odpowiednich proporcjach.
Szczepy bakteryjne E. coli (AKtrans), E. coli (AKtrans AmscL), E. coli (AKtrans AmscS) i E. coli (AKtrans AmscL AmscS) hodowano na pożywce K115 przez noc. Następnego dnia bakterie każdego ze szczepów rozcieńczono do OD600 ~ 0,01 w pożywkach K1, K5, K10, K15. Rozcieńczone hodowle rozpipetowywano po 100 gl do szalek mikrotitracyjnych 96 dołkowych. Do tak rozpipetowanych hodowli dodano związki drobnocząsteczkowe w stężeniu od 1 do 1000 nM. Hodowle w szalkach mikrotitracyjnych inkubowano przez noc w temperaturze 37°C z niewielkim wytrząsaniem (70 obrotów/minutę). Wzrost hodowli bakteryjnych w indywidualnych dołkach oceniono wizualnie, bądź przy użyciu czytnika płytek SpectraMax (Molecular Devices) przy długości fali 600 nm.
P r z y k ł a d 3
Zestaw do testowania związków chemicznych jako potencjalnych substancji o działaniu antybakteryjnym zawierał szczepy bakteryjne E. coli (AKtrans), E. coli (AKtrans AmscL), E. coli (AKtrans AmscS) i E. coli (AKtrans AmscL AmscS), jako medium nielimitujące wzrost mutantów E. coli (AKtrans)
PL 213 159 B1
- pożywkę K115 zawierającą K2HPO4, 46 mM; KH2PO4, 23 mM; (NH4)2SO4, 8 mM; MgSO4, 0.4 mM;
FeSO4, 6 μΜ; cytrynian sodu, 1 mM; chlorowodorek tiaminy, 1 mg/l; oraz glukozę, 0,2% (Li i współ., 2007), oraz pożywkę niezawierającą jonów potasu K0 obejmującą Na2HPO4, 46 mM; NaH2PO4, 23 mM; (NH4)2SO4, 8 mM; MgSO4, 0.4 mM; FeSO4, 6 μΜ; cytrynian sodu, 1 mM; chlorowodorek tiaminy, 1 mg/l; i glukozę, 0,2% (masa/objętość).

Claims (7)

1. Zmutowany szczep Escherichia coli, znamienny tym, że posiada delecję AKtrans następujących genów transporterów potasu: Kdp, Kup i Trk, przy czym korzystnie jest mutantem szczepu Escherichia coli MG61655 (ATCC nr 47076).
2. Zmutowany szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo posiada także delecję AmscS i/lub delecję AmscL co najmniej jednego z genów kanałów mechanoczułych wybranych z grupy zawierającej: mscS i mscL.
3. Zmutowany szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że posiada następujące delecje: AKtrans oraz AmscS.
4. Zmutowany szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że posiada następujące delecje: AKtrans oraz AmscL.
5. Zmutowany szczep według zastrz. 2, znamienny tym, że posiada następujące delecje: AKtrans, AmscS oraz AmscL.
6. Sposób testowania związków chemicznych pod kątem potencjalnych właściwości antybakteryjnych, znamienny tym, że
- uzyskuje się mutanta szczepu Escherichia coli posiadającego delecję AKtrans następujących genów transporterów potasu: Kdp, Kup i Trk, korzystnie wykorzystując szczep Escherichia coli MG61655 (ATCC nr 47076), prowadzi się pomiar wzrostu hodowli uzyskanego mutanta w obecności badanego związku i limitujących stężeń potasu, przy czym wzrost szczepu posiadającego delecję AKtrans wskazuje na umożliwienie transportu potasu do wnętrza komórki przez badany związek, korzystnie w kolejnym etapie
- uzyskuje się mutanta szczepu Escherichia coli posiadającego delecję AKtrans następujących genów transporterów potasu: Kdp, Kup i Trk oraz dodatkowo posiadającego także delecję AmscS i/lub delecję AmscL co najmniej jednego z genów kanałów mechanoczułych wybranych z grupy zawierającej: mscS i mscL, wykorzystując ten sam wyjściowy szczep Escherichia coli, korzystnie MG61655 (ATCC nr 47076), a następnie prowadzi się pomiar wzrostu hodowli tego mutanta w obecności badanego związku oraz limitujących stężeń potasu, przy czym:
- wzrost szczepu posiadającego delecję AKtrans oraz wzrost szczepu posiadającego delecje: AKtrans, AmscS i AmscL oznacza, że badany związek nie wykazuje aktywności względem białek kanałowych MscS i MscL,
- wzrost szczepu posiadającego delecję AKtrans i brak wzrostu szczepu posiadającego delecje: AKtrans, AmscS i AmscL oznacza wpływ badanego związku na aktywność kanałów mechanoczułych,
- wzrost szczepu posiadającego delecje AKtrans i AmscL w obecności badanego związku wykazującego wpływ na aktywność kanałów mechanoczułych oznacza, że badany związek jest specyficznym aktywatorem kanału MscS,
- wzrost szczepu posiadającego delecje AKtrans i AmscS w obecności badanego związku wykazującego wpływ na aktywność kanałów mechanoczułych oznacza, że badany związek jest specyficznym aktywatorem kanału MscL.
7. Zestaw do testowania związków chemicznych jako potencjalnych substancji o działaniu antybakteryjnym, znamienny tym, że zawiera mutanta określonego w zastrz. od 1 do 5.
PL391045A 2010-04-23 2010-04-23 Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania PL213159B1 (pl)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL391045A PL213159B1 (pl) 2010-04-23 2010-04-23 Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania
EP11729486.8A EP2561105B1 (en) 2010-04-23 2011-04-23 Mutant strains of escherichia coli, a method of testing potential antibacterial agents using said strains as well as a testing kit
AU2011243310A AU2011243310B2 (en) 2010-04-23 2011-04-23 Mutant strains of Escherichia coli, a method of testing potential antibacterial agents using said strains as well as a testing kit
US13/642,121 US9309575B2 (en) 2010-04-23 2011-04-23 Mutant strains of Escherichia coli, a method of testing potential antibacterial agents using said strains as well as a testing kit
PCT/PL2011/050010 WO2011133056A1 (en) 2010-04-23 2011-04-23 Mutant strains of escherichia coli, a method of testing potential antibacterial agents using said strains as well as a testing kit
CA2796861A CA2796861A1 (en) 2010-04-23 2011-04-23 Mutant strains of escherichia coli, a method of testing potential antibacterial agents using said strains as well as a testing kit

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL391045A PL213159B1 (pl) 2010-04-23 2010-04-23 Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL391045A1 PL391045A1 (pl) 2011-10-24
PL213159B1 true PL213159B1 (pl) 2013-01-31

Family

ID=44486429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL391045A PL213159B1 (pl) 2010-04-23 2010-04-23 Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9309575B2 (pl)
EP (1) EP2561105B1 (pl)
AU (1) AU2011243310B2 (pl)
CA (1) CA2796861A1 (pl)
PL (1) PL213159B1 (pl)
WO (1) WO2011133056A1 (pl)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109369786B (zh) * 2018-11-12 2021-08-31 贵州省烟草科学研究院 一种烟草kup8蛋白及其编码基因与应用
CN111849847B (zh) * 2020-07-08 2022-05-06 江南大学 一种提高大肠杆菌胞内血红素含量的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7468422B2 (en) 1998-03-05 2008-12-23 Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs Mechanosensitive mammalian potassium channel activatable by polyunsaturated fatty acids
US20090162368A1 (en) 1998-03-05 2009-06-25 Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs, Corporation Of France Mechanosensitive mammalian potassium channel activatable by polyunsaturated fatty acids
FR2775688B1 (fr) 1998-03-05 2002-04-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelle famille de canaux potassium de mammiferes mecanosensibles et actives par les acides gras polyinsatures et leur utilisation notamment pour le criblage de drogues
US6537778B1 (en) 1999-09-09 2003-03-25 The Regents Of The University Of California Eukaryotic mechanosensory transduction channel
DE10000651A1 (de) 2000-01-11 2001-07-26 Aventis Pharma Gmbh Kalium-Kanal-Mutanten der Hefe Saccharomyces cerevisiae und deren Verwendung für das Screening von eukaryotischen Kaliumkanälen
WO2001062915A1 (fr) 2000-02-25 2001-08-30 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Nouvelle proteine et gene codant pour elle
FR2806411B1 (fr) 2000-03-14 2004-11-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelle famille de canaux potassium humains mecanosensibles et actives par les acides gras polyinsatures et leur utilisation
WO2004085647A1 (ja) 2003-03-26 2004-10-07 Pharmadesign, Inc. イオンチャネルの活性を阻害する低分子ペプチド
US20050048593A1 (en) 2003-06-27 2005-03-03 Dezwaan Todd M. Methods for the identification of inhibitors of acetolactate synthase as antibiotics
EP1535903A1 (en) 2003-11-25 2005-06-01 Applied NanoSystems B.V. Modified MscL protein channel
WO2005070122A2 (en) 2004-01-09 2005-08-04 Boards Of Regents, The University Of Texas System Mechanosensitive ion channels and methods of use
WO2009031818A2 (en) 2007-09-05 2009-03-12 Genexel-Sein. Inc. Biomarker for purification or identification of mesenchymal stem cells and methods of purification of mesenchymal stem cells by using it

Also Published As

Publication number Publication date
PL391045A1 (pl) 2011-10-24
CA2796861A1 (en) 2011-10-27
AU2011243310A1 (en) 2012-11-15
US9309575B2 (en) 2016-04-12
WO2011133056A1 (en) 2011-10-27
EP2561105A1 (en) 2013-02-27
AU2011243310B2 (en) 2015-07-02
US20130040336A1 (en) 2013-02-14
EP2561105B1 (en) 2014-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lassak et al. Molecular analysis of the crenarchaeal flagellum
Zhang et al. Cell growth and protein expression of Shewanella oneidensis in biofilms and hydrogel-entrapped cultures
Toueille et al. A comparative proteomic approach to better define Deinococcus nucleoid specificities
Ueta et al. Ribosomal protein L31 in Escherichia coli contributes to ribosome subunit association and translation, whereas short L31 cleaved by protease 7 reduces both activities
US9605268B2 (en) Method for introducing an exogenous DNA by overcoming the restriction modification barrier of a target bacterium
CA3187601A1 (en) Methods for manufacturing adas
JP2023530967A (ja) 細菌分泌装置を含むａｄａｓ
Knobloch et al. Mycobacterium marinum produces distinct mycobactin and carboxymycobactin siderophores to promote growth in broth and phagocytes
WO2020021740A1 (ja) 細胞外電子移動作用に関与する酵素及びその利用
US6387694B1 (en) Mycobacterial isocitrate lyase gene and uses thereof
PL213159B1 (pl) Zmutowane szczepy Escherichia coli, sposób testowania potencjalnych zwiazków antybakteryjnych wykorzystujacy te szczepy oraz zestaw do testowania
HUE028023T2 (en) Removal of arsenic by the use of dissimilation arsenic reductase
Valenčíková et al. Clostridial DivIVA and MinD interact in the absence of MinJ
Masi et al. Overexpression and purification of the three components of the Enterobacter aerogenes AcrA–AcrB–TolC multidrug efflux pump
Varadarajan et al. Rapid diffusion of large TatA complexes detected using single particle tracking microscopy
Zappa et al. The HmrABCX pathway regulates the transition between motile and sessile lifestyles in Caulobacter crescentus by a HfiA-independent mechanism
Grudniak et al. Conjugal transfer of plasmid R6K γ ori minireplicon derivatives from Escherichia coli to various genera of pathogenic bacteria
Boas Lichty et al. LeuO and H-NS are part of an expanded regulatory network for ectoine biosynthesis expression
Patil Crosstalk Between Prokaryotic Replication Initiation and Acidic Phospholipids
Kargeti et al. Experimental evolution of a reduced bacterial chemotaxis network
Pires Investigation of quinone reductases from Staphylococcus aureus
Derese Siyum Role of Esx-3 Secretion System and Stress Response in Mycobacteria smegmatis
Pei et al. LLPS condensates of Fha initiate the inside-out assembly of the type VI secretion system
Rollefson Identification of extracellular matrix components essential for a conductive Geobacter sulfurreducens biofilm
Morton A New Phosphorelay that Positively Regulates Swarming Motility and Negatively Regulates Holdfast Production in Caulobacter crescentus