DE69932807T2

DE69932807T2 - Familie von mechano-empfindlichen kaliumkanälen bei säugetieren, die durch polyungesättigte fettsäuren aktiviert werden und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69932807T2
Application number: DE69932807T
Authority: DE
Inventors: Eric Honore; Michel Fink; Michel Lazdunski; Florian Lesage; Fabrice Duprat
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1998-03-05
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2019-02-24
Also published as: ES2272050T3; WO1999045108A2; EP1058726B1; CA2322055C; EP1058726A2; JP4289790B2; FR2775688B1; JP2002505102A; FR2775688A1; CA2322055A1; US6942979B1; WO1999045108A3; DE69932807D1

Description

Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf eine neue Klasse von mechanosensiblen Kaliumkanälen, die durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren aktiviert wurden. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen Kaliumkanals, mit der Bezeichnung TRAAK für TWICK-Rolated AA-Actived K⁺channel, der mechanosensbibel ist und durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren aktiviert wurde und auch durch das Riluzol, einem neuroprotektivem Mittel. Die Eigenschaften der Kanäle der Familie TRAAK sowie ihre Gewebeverteilung verleiht diesen Kanälen eine wichtige Rolle bei dem Transport von Kalium bei einer großen Anzahl von Zelltypen.
Die Kaliumkanäle sind ubiquitäre Proteine und ihre außergewöhnliche Funktionsvielfalt macht sie zu idealen Kandidaten für eine große Anzahl biologischer Prozesse. Sie intervenieren vor allem in der Regelung der neuronalen und muskulären Anregungsfähigkeit, im Herzrhythmus und in der Hormonausscheidung. Drei Strukturtypen von Kaliumkanälen wurden bei den Säugetieren beschrieben. Bei dem ersten Typ handelt es sich um den Typ „Shaker", der aus Untereinheiten besteht, die 6 Tansmembran-Segmente haben und einen Bereich P, der in die Bildung der Ionenpore involviert ist. Bei dem zweiten Typ handelt es sich um den Typ IRK mit zwei Transmembran-Segmenten und einem Bereich P. Der dritte Typ wurde früher beschrieben und entspricht dem Typ TWIK, der vier Transmembran-Segmente und zwei Bereich P hat. Drei Kanäle dieses Typs wurden identifiziert: TWIK-1 (Fink, M. und andere EMBO j. 15, 6854–6862 (1996), Lesage, F. und andere EMBO J. 15, 1004–1011 (1996) TREK-1 und TASK (Duprat, F. und andere EMBO J. 16, 5464–5471 (1997). Trotz einer beibehaltenen allgemeinen Struktur haben sie primäre Sequenzen, die sich nur wenig ähnlich sind, da sie zwischen 20 bis 25 % Übereinstimmung mit der Aminosäure haben.
Die gegenwärtige Erfindung basiert auf der Entdeckung und der Klonung eines neuen Kanals mit der Bezeichnung TRAAK, Mitglied der Familie der Kanäle TWIK. Das Gen, das diesen Kanal kodiert, entspricht genauer gesagt, auf der Ebene seiner Sequenz der Aminosäuren, dem Kanal TREK-1, mit dem er eine Übereinstimmung von 38 % an Aminosäure aufweist. Die gegenwärtige Erfindung basiert auch auf den elektrophysiologischen Eigenschaften, die für diese beiden Kanäle TREK-1 und TRAAK einzigartig sind. Diese Kanäle produzieren nämlich alle beiden Auswahlströme für das Kalium, die durch eine Spannung aktiviert werden, die an der Zellmembran angelegt wird, wobei die Kanäle sogenannte mechanosensible Kanäle sind oder durch die Anwendung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere Arachidonsäure, die ein wesentlicher Bote für die interzelluläre und intrazelluläre Kommunikation ist und ein wichtiger Modulator der neuronalen Erregbarkeit (Ordway, R.W., Singer, J.J. und Waish, J.V. 14, 96–100 (1991), Bliss, T.V.P. und Collingridge, G. L. Nature 31–39 (1993), Piomelli, D. Curr. Oopin. Cell. Biol. 5, 274–280 (1993), Meves, H. Prog. Neurobiol. 43, 175–185 (1994), Piomelli, D. Crit. Rev. Neurobiol. 8, 65–83 (1994). Diese Kanäle sind auch offen durch Riluzol, ein neuroprotektives Mittel (Malgouris, C. und andere j. Neuroscl. 9. 3720–3727 (1989), Pratt, j. und andere Neuroscl. Lett. 140, 225–230 (1992), das in der Klink eingesetzt wird, um das Fortleben von Kranken zu verlängern, die an einer amyotrophen Seitensklerose leiden.
Die Feststellung dieser neuen Klasse von Kaliumkanälen und die heterologe Expression dieser Kanäle ermöglicht vor allem die Bereitstellung neuer Mittel, um Drogen durch Siebung zu untersuchen, die die Aktivität dieser Kaliumkanäle anpassen können und folglich Krankheiten vorzubeugen und zu behandeln, die diese Kanäle mit sich bringen, wie zum Beispiel Epilepsie, Herz- und Gefäßpathologie (Arrythmien), Neurodegenerationen, vor allem diejenigen, die mit den Ischämien und Anoxien, den endokrinen Pathologien, die mit Anomalien in der Hormonausscheidung, den Muskelpathologien verbunden sind.
Gegenstand der gegenwärtigen Erfindung ist daher ein gereinigtes Protein, das einen mechanosensiblen Kaliumkanal bildet, der durch die mehrfach gesättigten Fettsäuren, vor allem Arachidonsäure und durch Riluzol aktiviert wird. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf das Protein, das den Kanal TRAAK bildet, dessen Sequenz an Aminosäuren in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID No: 1 dargestellt wird oder einem Derivat, das funktionell diesem Protein entspricht.
Bei diesen Derivaten handelt es sich um solche, deren Sequenz eine Änderung und/oder eine Aufhebung und/oder Hinzufügung eines Rückstands oder mehrerer Rückstände von Aminosäuren umfasst, infolgedessen, dass diese Änderung und/oder Aufhebung und/oder Hinzufügung die Eigenschaften des Kanals TRAAK nicht ändert. Solche Derivate können vom Fachmann gemäß den Techniken analysiert werden, die in den nachstehend aufgeführten Beispielen beschrieben werden, die die Feststellung der biophysischen und pharmakologischen Eigenschaften des Kanals TRAAK ermöglicht haben. Ein solches Derivat ist genauer gesagt der Kanal TREK-1, dessen Sequenz an Aminosäuren in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID No: 2 dargestellt wird.
Poly- oder monoklonale Antikörper, die gegen mindestens ein Protein gerichtet sind, das einen Ionkanal der Erfindung bildet, können durch die klassischen Methoden vorbereitet werden, die in der Literatur beschrieben werden. Diese Antikörper sind nützlich, um das Vorhandensein der Ionkanäle der Erfindung in verschiedenen menschlichen oder tierischen Geweben zu untersuchen, aber sie können auch Anwendung im therapeutischen Bereich finden, um dank ihrer Spezifität einen Kanal TRAAK und/oder seine Derivate in vivo zu hemmen oder aktivieren.
Gegenstand der gegenwärtigen Erfindung ist auch ein gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das eine Nukleinsequenz bildet oder aus einer Nukleinsequenz besteht, die vor allem die Arachidonsäure kodiert, für ein Protein, das einen mechanosensiblen Kaliumkanal bildet, der durch die mehrfach gesättigten Fettsäuren und durch das Riluzol aktiviert wird. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf ein Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Sequenz umfasst, die für das Protein kodiert, das den Kanal TRAAK bildet, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID NO: 1 dargestellt wird oder für ein Derivat, das funktionell diesem Protein entspricht. Ein Molekül der ADN, das die kodierende Sequenz für das Protein TRAAK umfasst, ist in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID NO:1 dargestellt oder seiner zusätzlichen Sequenz. Genauer gesagt umfasst eine solche Nukleinsäuresequenz die Sequenz, zwischen den Nukleotiden 284 und 1477 der SEQ ID NO:1 oder der zusätzlichen Sequenz.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf einen Überträger, der mindestens ein voriges Nukleinsäuremolekül umfasst, das vorteilhafterweise mit geeigneten Kontrollsequenzen verbunden ist, sowie ein Verfahren für die Herstellung und die Expression in einer Wirtszelle eines Proteins, das einen Ionkanal gemäß der Erfindung bildet. Die Vorbereitung dieser Überträger sowie die Herstellung oder die Expression in einer Wirtszelle der Kanäle der Erfindung können durch die fachmännisch bekannten Techniken der Molekularbiologie und der Gentechnik durchgeführt werden.
Beispielsweise besteht ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das einen Kationenkanal gemäß der Erfindung bildet, in Folgendem:
Übertragung eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines Überträgers, der das besagte Molekül in einer Wirtszelle enthält,
Kultivierung der besagten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Herstellung des Proteins ermöglichen, das den Kaliumkanal bildet,
Isolierung der Proteine, die die Kaliumkanäle der Erfindung bilden, durch alle geeigneten Mittel
Ein Verfahren für die Expression eines Ionkanals gemäß der Erfindung besteht beispielsweise in Folgendem:
– Übertragung eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines Übertragers, der das besagte Molekül in einer Wirtszelle enthält,
– Kultivierung der besagten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der Kaliumkanäle der Erfindung ermöglichen.
Die in den vorigen Verfahren eingesetzte Wirtszelle kann unter den procaryoten oder den eukaryoten Zellen ausgewählt werden, vor allem unter den Bakterien, den Hefen, den Säugetier-, Pflanzen- oder Insektenzellen.
Der eingesetzte Überträger wird entsprechend der Funktion der Wirtszelle ausgewählt, in die er übertragen wird; Es kann sich um jeden beliebigen Überträger, wie zum Beispiel ein Plasmid handeln.
Die Erfindung bezieht sich daher auch auf die Wirtszellen und genauer gesagt auf die umgeformten Zellen, die Kaliumkanäle ausdrücken, die Eigenschaften aufweisen und eine Struktur, deren Typ denen des Kanals TRAAK entspricht, die man entsprechend den vorigen Verfahren erreicht. Diese Zellen sind für die Siebung von Substanzen nützlich, die die Ströme der Kanäle TRAAK modulieren. Diese Siebung wird durchgeführt, indem variable Mengen einer zu untersuchenden Substanz mit Zellen in Kontakt gebracht werden, die die Kanäle der Erfindung ausdrücken und dann durch Messen mit geeigneten Mitteln der eventuellen Auswirkungen der besagten Substanz auf die Kaliumströme der besagten Kanäle. Elektrophysiologische Techniken ermöglichen außerdem diese Untersuchungen und sind auch Gegenstand der gegenwärtigen Erfindung, sobald sie die Kanäle TRAAK oder ihre Derivate einsetzen. Dieses Siebungsverfahren ermöglicht die Identifizierung der Drogen, die die Aktivität der Kaliumkanäle der Erfindung modulieren können und daher Krankheiten vorbeugen oder behandeln können, die diese Kanäle implizieren. Eine chemische oder biologische Substanz, die die Ströme eines Kaliumkanals verändern kann, gemäß der Erfindung, die für die Vorbereitung eines Medikamentes eingesetzt werden kann, das zur Vorbeugung oder Behandlung von Herzkrankheiten oder Krankheiten des Nervensystems bei einem Menschen oder Tier nützlich ist, wie zum Beispiel die kardialen Pathologien (Arythmien) und vaskulären Pathologien, die Neurodegenerationen, insbesondere diejenigen, die mit den Ischämien und Anoxien verbunden sind und den endokrinen Pathologien, die mit Anomalien in der Hormonausscheidung, den Muskelpathologien verbunden sind.
Ein kodierendes Nukleinsäuremolekül für ein Protein, das einen Kanal TRAAK bildet oder eines seiner Derivate oder ein Überträger, der dieses Nukleinsäuremolekül umfasst oder außerdem eine Zelle, die diese Kanäle TRAAK ausdrückt, sind auch nützlich für die Vorbereitung transgener Tiere. Es kann sich um Tiere handeln, die diese Kanäle ausdrücken, aber vor allem um sogenannten „knock out"-Tiere, das heißt solche, die eine Defizienz in diesen Kanälen aufweisen; Diese transgenen Tiere werden durch fachmännische bekannte Methoden vorbereitet und ermöglichen die Anordnung lebender Modelle für die Untersuchung von Tierpathologien, die mit den Kanälen TRAAK verbunden sind.
Diese transgenen Tiere sowie die oben beschriebenen Wirtszellen sind als Modelle für die Untersuchung von Pathologien nützlich, die mit diesen mechanosensiblen Kaliumkanälen verbunden sind, die durch die mehrfach gesättigten Fettsäuren aktiviert werden und zwar entweder, weil sie die Kaliumkanäle des Typs Kanal TRAAK ausdrücken oder, weil sie eine Defizienz in diesen Kaliumkanälen aufweisen.
Außerdem kann auch ein Protein, das einen neuronalen Ionkanal TRAAK bildet, für die Herstellung von Medikamenten nützlich sein, die zur Behandlung oder Vorbeugung der Pathologien, die diese Kanäle implizieren, vorgesehen sind. Die Erfindung bezieht sich daher auch auf die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als Wirkstoff mindestens eines dieser Proteine umfassen, die eventuell mit einem physiologisch annehmbaren Trägerstoff verbunden sind.
Außerdem können die Moleküle der Nukleinsäure der Erfindung oder die Zellen, die durch das besagte Molekül umgeformt wurden, folglich in den Strategien der Gentherapien eingesetzt werden, um eine Defizienz der Kanäle TRAAK im Bereich eines oder mehrerer Gewebe eines Patienten auszugleichen. Die Erfindung bezieht sich folglich auch auf ein Medikament, das Nukleinsäuremoleküle der Erfindung umfasst oder Zellen, die durch die besagten Moleküle umgewandelt wurden für die Pathologiebehandlung, die die Kanäle TRAAK und ihre Derivate implizieren.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich beim Lesen der folgenden Beispiele, die über die Untersuchungsarbeit berichten, die zu der Identifizierung und zur Charakterisierung dieser mechanosensiblen Kaliumkanäle geführt haben, die durch die Fettsäuren aktiviert wurden und dort, wo auf die Sequenzen und Zeichnungen im Anhang Bezug genommen wird:
1 und SEQ ID NO:1 stellen die Nukleotidsequenzen der ADN der TRAAK dar und die Aminosäuresequenz der kodierenden Sequenz.
2 stellt den Abgleich der Sequenzen von TWIK-1, TREK-1, TASK und TRAAK dar, die die vier Kanäle des Typs TWIK sind, die aktuell bei den Säugetieren geklont sind sowie das Dendrogramm des besagten Abgleichs. Die identischen Reste werden auf schwarzem Hintergrund dargestellt und die aufbewahrte Reste auf grauem Hintergrund.
3 stellt die Analyse durch RT-PCR der Verteilung von TREK-1 und TRAAK in den Geweben der ausgewachsenen Maus dar. Fragmente der kodierenden Traskripte TREK-1 und TRAAK wurden durch PCR mit Hilfe von speziellen Oligonukleotiden verstärkt, die auf eine Nylonmembran übertragen werden und dann mit internen Oligonukleotiden sondiert werden, die mit Phosphor 32 markiert sind.
4 zeigt die elektrophysiologischen Eigenschaften der Ströme TRAAK, die durch die Technik der Spannung gespeichert werden, die auf den Xenope-Ovozyten angelegt wird, die eine ARNc-Injektion von TRAAK (a, b, c) erhalten haben und auf COS-Zellen, die mit einem Überträger transfiziert wurden, der TRAAK (d, e, f) ausdrückt, Bei (a): Die Ovozyten wurden auf einem Potential von –80 mV gehalten und dann wurden die Ströme registriert, nach den Potentialsprüngen von –150 bis +50 mV durch ein Inkrement von 20 mV. Die Registrierungen wurden in einem externen Milieu durchgeführt, das eine Konzentration in K⁺ von 2 mM oder von 74 mM enthält. Bei (b): Verhältnis Strom-Potential gemäß derselben Erfahrung, wie unter (a). Bei (c): Umkehrung des Potentials (E_reu) der Ströme TRAAK entsprechend der externen Konzentration in K⁺. Bei (d): Registrierte Ströme auf den COS-Zellen, die durch TRAAK gemäß demselben Protokoll, wie unter (a) transfiziert wurden. Bei (e): Verhältnis Strom-Potential gemäß derselben Erfahrung, wie unter (d).
5 zeigt die Wirkung der Osmolarität des externen Milieus auf Ovozyten, die eine ARNc-Injektion TREK1 oder TASK erhalten haben. Bei (A): Vergleich der Wirkungen der Anwendung einer hypertonischen Lösung (417 mOsm, durch Hinzufügen von Mannit) auf Kontrollovozyten (CD8) und auf Ovozyten, die TASK oder TREK-1 ausdrücken. Die Ströme werden nach einem Potentialsprung von –80 bis +80 mV gemessen. Im Inset wird der Strom TREK-1 vor und nach der Anwendung der hypertonischen Lösung (durch einen Pfeil angegeben) dargestellt. Bei (B): Umkehrbare Wirkung einer hypertonischen Lösung (434 mOsm, durch Hinzufügen von Sucrose) auf ie Verhältnisse Strom-Potential der besagten Potentialrampen, die 600 msec. Dauern. Im Inset wird die Kinetik der Wirkung dargestellt, die durch die hypertonische Lösung erzeugt wird. Die Ströme werden mit 80 mV gemessen.
6 zeigt, das TREK-1 ein mechanosensibler Kaliumkanal in den transfizierten Zellen COS ist. Bei (B): Aktivitäten des Kanals (N·Po) in den „Patches" der Membran, die auf 0 mV gehalten werden und in der angehängten Zellkonfiguration durch Kontrollzellen (CD8) oder Zellen, die durch TREK-1 und TASK transfiziert wurden, erhalten werden. Bei (C) hat die Aufdehnung der Membran keine Auswirkung auf die Aktivität des Kanals TASK (Konfiguration der angehängten Zelle). Der „Patch" wird auf 50 mV gehalten. Bei (D): die Kanäle TREK-1 sind lautlos in der Ruhepause und geöffnet bei einer Spannung der Membran. Der „Patch" wird auf +50 mV gehalten. Bei (E) zeigt das Histogramm die Amplitude der Aktivität des Kanals, die durch die Spannung der Membran erzeugt wurde und bei (G) veranschaulicht wird. Bei (F): Verhältnis Strom-Potential in dem einzigen Kanal von TREK-1 (n = 6). Die Leitfähigkeit von 81 pS wurde zwischen 0 und 80 mV berechnet. Bei (G): Aktivierung von TREK-1 durch Aufdehnung der Membran (30 mm Hg) in der Konfiguration „Inside-out". Das Potential zur Aufrecherhaltung beträgt 100 mV. Bei (H): Wirkung, die durch immer höhere Spannungen (mit einer Dauer von 5 Sekunden) erzeugt wird, in dem Verhältnis Strom-Potential eines „Patch", der TREK-1 ausdrückt. Bei (I): Kurve Dosis-Wirkung der Aktivierung von TREK-1 durch die Spannung (n = 6). Die Kurve wird gemäß den erfahrungsgemäßen Punkten gemäß dem Verhältnis von Boltzmann gezeichnet.
7 stellt die Aktivierung von TRAAK durch die Aufdehnung der Zellmembran in den transfizierten COS-Zellen dar. Der Strom wird bei 0 mV in der Konfiguration „Inside-out" registriert. Die Unterdrücke, die über die Registrierungspipette angewendet werden, werden auf der rechten Seite der Spuren angegeben.
In 8 wird die Aktivierung von TREK-1 durch die Arachidonsäure in den transfizierten COS-Zellen gezeigt. Bei (A): Die Aktivität von TREK-1 wird in der angehängten Zellkonfiguration registriert. Der „Patch" wird durch eine Potentialrampe über eine Dauer von 800 msec. Alle 5 sec. Stimuliert. Die Ströme werden bei 80 mV gemessen. Die Anwendungen der Arachidonsäure (AA, 10 μM) werden durch die horizontalen Streifen angegeben. Im Laufe des Versuchs wurde der „Patch" durch Spannungen von 50 mm Hg (angegeben durch die Pfeile) stimuliert. Bei 9 Min. wurde der „Patch" in der Konfiguration „Inside-out" ausgeschnitten. Bei (B): Verhältnisse Strom-Potential, die der unter (A) veranschaulichten Erfahrung entsprechen. Bei (C): Aktivität TREK-1 in der angehängten Zell-Konfiguration mit 10 μM AA in der Pipette. Die Potentialrampe dauert 800 msec, und die Ströme werden bei 80 mV gemessen. Bei (D): Verhältnisse Strom-Potential im einzigen Kanal zum Zeitpunkt, wo die Pipette auf die Membran gelegt wird oder nach 20 Min. und 1 Min. nach Exzision des „Patch" in der Konfiguration „inside-out". Bei (E) Wirkung von AA (10 μM) auf dem Strom TREK-1, der in der ganzen Zelle registriert wird. Der Strom wird bei 80m mV gemessen. Bei (F): AA hat keine Auswirkung auf den Strom TREK-1, der in der ganzen Zelle gemessen wird, wenn er in der Pipette ist. Der Strom wird 30 Min. nach Unterbrechung des „Patch" (kontrollierte Spur) durch eine Potentialrampe von 800 mSek. gemessen.
Der Strom wird dann nach einer Anwendung von AA von 1 Min. in dem externen Milieu (Spur AA) gemessen
9 zeigt die Auswirkung der Arachidonsäure und anderer Fettsäuren auf den Kanal TRAAK, der in den transfizierten COS-Zellen ausgedrückt wird. I (a): Verhältnisse Strom-Potential, die durch Potentialrampen von 500 mSek. Zwischen –150 und +50 mV erreicht werden, nach Anwendung von AA (10 μM) und nach dem Spülen. Im Inset werden die Ströme dargestellt, die durch Potentialsprünge von –130 bis +50 mV durch ein Inkrement von 20 mV ausgelöst werden. Das Potential zur Aufrechterhaltung beträgt –80 mV. Bei (b): Verhältnis Dosis-Wirkung der Aktivierung von TRAAK durch AA. Bei (c): Verhältnisse Strom-Potential, die wie bei (a) in der Konfiguration „outside-out" erreicht werden. Im Inset wird die Auswirkung von AA bei 20 mV dargestellt. Bei (e): Histogramm, das den Koeffizienten der Erhöhung der Ströme darstellt, die nach der Anwendung verschiedener Fettsäuren (10 μM) erreicht werden. Bei (f): Histogramm, das den Wert der registrierten Ströme zeigt, in der Konfiguration der ganzen Zelle vor und nach Anwendung von AA auf die Zellen, die übergangsweise durch TWIK-1, TREK-1 und TRAAK transfiziert werden und auf Zellen, die auf stabile Art und Weise durch TRAAK transfiziert werden. Der Erhöhungskoeffizient wird in jedem Fall angezeigt.
10 zeigt die Wirkung des Riluzols auf die Ströme TREK-1 und TRAAK mit der Bezeichnung TREK-2. Die Verhältnisse Strom-Potential werden wie in 9 vor und nach der Anwendung des Riluzols (100 μM) auf die transfizierte COS-Zellen erreicht. Im Inset werden die Wirkungen des Riluzols auf die registrierten Ströme in der Konfiguration „Outside-out" gezeigt.
Klonung, primäre Struktur und Gewebeverteilung von TRAAK
Die Sequenz des Kanals TWIK-1 wurde zur Ermittlung der homologen Sequenzen in den öffentlichen Datenbanken (Genbank und EMBL) der ADN eingesetzt, wobei das Abgleichprogramm BLAST eingesetzt wird. Auf diese Weise wurde eine als menschliches TAG ausgedrückte Sequenz identifiziert, die zur Siebung einer Datenbank der ADNC des Mausgehirns dient. Mehrere Klone wurden isoliert und charakterisiert und der längste wurde sequenziert. Folgende Charakteristiken wurden festgestellt:
die isolierten ADNc enthalten eine offene Lesephase von 1197 kodierenden Nukleotiden für ein Polypeptid von 398 Resten. Die Nukleotid- und Proteinsequenzenwerden in 1 dargestellt.
Dieses Protein enthält 4 potentielle Transmembran-Sequenzen und zwei Bereiche P. Es besitzt daher die gleiche allgemeine Struktur, wie die Kanäle TWIK-1, TREK-1 und TASK. Außerdem weist es Sequenzhomologien mit diesen Kanälen auf: etwa 20–25 % Obereinstimmung mit TWIK-1 und TASK und 38 % mit TREK-1. Abgesehen von den Bereichen P, die in allen geklonten Kaliumkanälen vorhanden sind, hat es keine bedeutende Sequenzhomologie mit den Kanälen des Typs Shaker und IRK. Es gehört daher zu der Familie TWIK-1 und seine allernächste Entsprechung ist TREK-1. Diese Verhältnisse treten in 2, im Bereich des Abgleichs der Proteinsequenzen auf sowie in dem Dendrogramm, das aus diesem Abgleich abgeleitet wird. TRAAK und TREK-1 bilden folglich eine strukturelle Unterklasse innerhalb der Familie TWIK-1.
Die Sequenzen der verschiedenen Oligonukleide wurden aus der Sequenz von TRAAK abgeleitet. Diese Oligonukleotide haben durch RT-PCR die Untersuchung der Verteilung eines kodierenden Transkriptes TRAAK in den Geweben der ausgewachsenen Maus ermöglicht. Wie in 3 dargestellt wird TRAAK ausdrücklich in den Nervengeweben ausgedrückt: Großhirn, Kleinhirn, Rückenmark und Netzhaut. Diese Verteilung unterscheidet sich stark von der seiner allernächsten Entsprechung, dem Kanal TREK-1. Letzterer hat eine beinahe ubiquitäre Verteilung und ist sowohl in den reizbaren Geweben als auch in den nicht reizbaren Geweben vorhanden.
Funktionsausdruck von TRAAK
Für die Funktionsuntersuchung wurde die kodierende Sequenz in den Überträger pEXO eingebaut und eine ergänzende ARN (ARNc) wurde durch diese Konstruktion synthetisiert und in die Ovozyten des Xenope injiziert. Für die Expression in den Zellen COS wurde die Sequenz TRAAK in einem Expressionsüberträger unter der Kontrolle eines eukaryoten Promotors subgeklont und in die Zellen transfiziert. Ein nicht vorhandener nicht deaktivierender Strom der Ovozyten und der Kontrollzellen wurde durch die zugewiesene Potentialtechnik gemessen, wie in 4 dargestellt. Die Aktivierung ist augenblicklich und kann nicht gelöst werden, da sie durch die kapazitive Entladung des registrierten Stroms zu Beginn des Potentialsprungs ausgeblendet wird. Das Verhältnis Strom-Potential rektifiziert in der Ausgangsrichtung, wenn die externe Konzentration an K⁺ 2 mM entspricht. Eingangsströme werden festgestellt, wenn die externe Konzentration an K⁺ gestiegen ist. Unabhängig von der Konzentration folgen die Kurven Strom-Potential einwandfrei dem Verhältnis von Goldman-Hodgkin-Katz. Das beweist, dass die Ströme TRAAK nur die Ausrichtung haben, die auf die asymmetrischen Konzentrationen von K⁺ von jeder Seite der Membran zurückzuführen sind und dass TRAAK ein Kanal ist, der nicht von dem Potential abhängig ist. Der Kanal TRAAK ist selektiv mit Kalium. Die Umkehrung des Potentials der Ströme folgt dem Potential des Gleichgewichts von K⁺ und die Änderung durch 10 der Konzentration K⁺ führt zu einer Änderung des Umkehrungswertes des Potentials, der dem Wert entspricht, der durch die Gleichung von Nernst (48.7 +-0,7 mV durch 10, n = 4) vorhergesagt wird.
Die Eigenschaften von TRAAK, nicht vorhandene Aktivierungs- und Deaktivierungkinetiken sowie seine Öffnung gegenüber allen Potentialen der Membran sind Merkmale der sogenannten Ableit-Kaliumkanäle. Wie für Kanäle dieser Art vorgesehen, ist die Expression in den Ovozyten mit einer starken Polarisierung verbunden. Das Ruhepause-Potential der Membran reicht von –43 ± 2,4 mV,/n = 7), in den Kontrollovozyten bis –88 ± 1,4 mV, (n = 23) in den transfizierten Ovozyten, ein Wert in der Nähe des Potentials für das Gleichgewicht des Kaliums. TRAAK wurde auch in den transfizierten Zellen COS-M6 erprobt. Auch in diesem System sind die Ströme TRAAK momentan und werden nicht deaktiviert. Die Registrierung der „Patch" in der Konfiguration „outside-out" zeigt die einheitliche Leitfähigkeit von TRAAK gleich 45,5 ± 3,7 pS (n = 10) an.
TREK-1 und TRAAK sind mechanosensible Kanäle.
Es wurde bewiesen, dass die strukturelle Unter-Klasse, die durch die Kanäle K⁺ TREK-1 und TRAAK gebildet wird, durch die Kanäle K⁺' Typ TWIK mit eindeutigen elektrophysiologischen Eigenschaften verbunden ist. Die Kanäle TREK-1 und TRAAK werden nämlich durch eine Spannung aktiviert, die an der Plasmamembran angelegt wird. Diese Spannung wird entweder indirekt durch Änderung der Osmolarität des externen Milieus erreicht und folglich dem Volumen der Zelle oder direkter durch Anwendung eines Unterdrucks in der Registrierungspipette. Es wurden folgenden Eigenschaften festgestellt:
5 beweist, dass die Expression des Kanals TREK-1 in den Ovozyten von Xenope, die in einem hypothonischen Milieu erhalten werden, momentane und nicht deaktivierende Ströme induziert. Wenn die Osmolarität des externen Milieus durch das Hinzufügen von Mannitol gestiegen ist, wird eine starke Abnahme der Amplitude des Stroms TREK-1 festgestellt, was eine Sensibilität des Kanals gegenüber dem Zellvolumen beweist. Der Kanal TASK wird von der Osmolarität des externen Milieus nicht beeinflusst.
6 beweist, dass der Kanal TREK-1 mechanosensibel ist. In den transfizierten COS-Zellen und unter Bedingungen im Ruhezustand kann die Aktivität von TREK-1 in der eingebundenen Zellkonfiguration nicht festgestellt werden, während die Aktivität von TASK unter denselben Bedingungen leicht messbar ist. Ein Unterdruck jedoch, der mit Hilfe der Registrierungspipette an der Membran angewendet wird, löst eine Öffnung des Kanals TREK-1 aus. Eine solche Wirkung wird bei TASK nicht festgestellt. Die Aktivierung von TREK-1, die durch die Spannung induziert wird, wird auch in der Konfiguration „inside-out" erreicht, das heißt, wenn der „Patch" herausgeschnitten ist und dass die Innenseite der Membran wieder mit dem externen Milieu in Kontakt ist. In dieser Konfiguration ist die Aktivität des Kanals auch nicht vorhanden oder sehr gering, wenn man keine Spannung an der Membran anlegt. Die Wirkung der Spannung wird abgestuft und eine Aktivierung, die der Hälfte des Höchstwertes entspricht, wird für einen Quecksilberunterdruck gleich 23 mm festgestellt. Andererseits zeigt die 6h, dass die Aktivierung, die durch die Aufdehnung induziert wird, unabhängig von dem Potential der Membran ist.
7 zeigt außerdem, dass TRAAK ein Kanal ist, der durch die Aufdehnung aktiviert wird. Wenn kein Unterdruck vorhanden ist oder bei niedrigen Werten ist der Kanal TRAAK nicht aktiv. Für höhere Werte ist der Kanal aktiviert und es wird ein Strom registriert. Während der Anwendung des Unterdrucks kann eine Abnahme der Aktivität festgestellt werden, wie in dem Fall von TREK-1.
TREK-1 und TRAAK werden durch die Arachidonsäure und andere mehrfach ungesättigten Fettsäuren aktiviert.
Die Aktivierung der Kanäle TREK-1 und TRAAK durch mechanische Aufdehnung der Membran wird durch die Anwendung der Arachidonsäure und durch die Anwendung anderer mehrfach ungesättigter Fettsäuren nachgeahmt, aber nicht durch die Anwendung von gesättigten Fettsäuren. Folgende Eigenschaften wurden festgestellt:
8 beweist, dass TREK-1 durch die Arachidonsäure (AA) aktiviert wurde. Die Anwendung der AA auf Kontrollzellen (CD8) hat keinen Einfluss. Die Aktivierungen, die durch Aufdehnung der Membran erreicht werden und durch Anwendung der AA sind ähnlich in Bezug auf die Amplitude aber sind nicht hinzufügbar. Die beiden Arten der Aktivierung werden in der angehängten Zellenkonfiguration zurückgehalten. Wenn die Registrierungspipette die AA enthält, induziert die Exzision des „Patch" in der Konfiguration „Inside-out" auf reproduzierbare Art und Weise eine starke Erhöhung der Aktivität von TREK-1. Auf die gleiche Art und Weise ist die Amplitude der Aktivierung, die durch einen Unterdruck induziert wurde, der in der Registrierungspipette angewendet wurde, größer, wenn der „Patch" exzidiert wurde. Schließlich wurde festgestellt, dass in der gesamten Zelle die interne AA TREK-1 nicht aktiviert. Wenn die Zelle dialysiert für Zeiträume wurde, die genau 30 Minuten andauern, findet keine Aktivierung des Kanals durch die interne AA statt, obwohl die Aktivierung einige Sekunden nach der Anwendung von AA in dem externen Milieu festgestellt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die AA TREK-1 nur aktiviert, wenn er auf der Außenseite der Membran angewendet wird.
9 beweist, dass der Kanal TRAAK durch die AA aktiviert wird und zwar auf die gleiche Art und Weise, wie TREK-1. Die Aktivierung ist umkehrbar und hängt von der angewendeten Konzentration ab. Diese Aktivierung wird auch in der Konfiguration „Outside-out" festgestellt. Die Aktivierung von TRAAK durch die AA wird nicht angekündigt, wenn die Infusion von AA eine Mischung von Hemmstoffen des Stoffwechsels der AA enthält (nordihydrogualaretische Säure für die Lipoxygenase, Indomethazin für die Cyclooxygenase, Clotrimazol für die Epoxygenase und ETYA, das alle Stoffwechselwege der AA, alle 10 mM hemmt). Unter diesen Bedingungen beträgt die Erhöhung des Stroms, der durch AA induziert wird, 6,6+–0,5 Mal (n = 3Xbei +50 mV). Eine Erhöhung von 1,7 ± 0,4 Mal (n = 3) des Kalium-Grundstroms kann nach der Verabreichung eines Hemmstoffcocktails ohne AA festgestellt werden. Dieses Ergebnis beweist, dass die Aktivierung durch die AA keine Umwandlung der AA in Eicosanoide erfordert.
9 beweist auch, dass die Fettsäuren, mit Ausnahme der AA den Kanal aktivieren. Diese Aktivierung ist für die mehrfach ungesättigten Fettsäuren spezifisch und wird mit Ölsäuren (C189), Linolsäuren (C189, 12), Linolensäuren (C18Δ9, 12, 15) Eicosapentaenssäuren (EPA, C20Δ5, 8, 11, 14, 17) und Docosohexaensäuren (DOHA, C20Δ4, 7, 10, 13, 16, 19) bei einer Konzentration von 10 mM festgestellt. Die gesättigten Säuren, wie zum Beispiel die Palmitinsäuren (C16), Stearinsäuren (C18) und Arachinsäure (C20) sind wirkungslos. Die Derivate der AA und der Docosohexaensäure, wo die Carbonsäurefunktion durch eine Alkoholfunktion (AA-OH) oder Methylester (AA-ME, DOHA-ME) ersetzt wird, sind ebenfalls nicht aktiv auf TRAAK. Die Wirkung der AA auf TRAAK ist auch auf den Zellen feststellbar, die sowohl vorläufig als auch stabil transfiziert wurden (es wurden 3 Linien mit stabilen Zellen getestet).
Schließlich beweist 9, dass die Wirkung der Aktivierung durch AA spezifisch für TREK-1 und TRAAK ist. Es wird keine Wirkung desselben Typs auf den Kanälen TWIK-1 und TASK festgestellt.
In den Ovozyten ist TRAAK unempfindlich gegenüber Wirkstoffen, die klassische Kaliumkanäle, wie zum Beispiel Tetraethylammonium (TEA, 1 mM), 4-Aminopyridin (4-AP, 1 mM) und Chinin (100 mM) blockieren. Umgekehrt blockiert Ba²⁺ (1 mM) 58,7 ± 4,6 %, n = 5 des Stroms TRAAK bei +40 mV.
Die Kanäle TREK-1 und TRAAK werden durch einen neuroprotektiven Wirkstoff, dem Riluzol, aktiviert
Riluzol ist ein neuroprotektiver Wirkstoff, der zur Verlängerung der Lebensdauer von Kranken eingesetzt wird, die an amyotropher Lateralsklerose erkrankt sind. 10 beweist, dass dieser pharmakologische Wirkstoff ein Öffner der Kanäle TREK-1 und TRAAK ist. TREK-1 und TRAAK sind die ersten Ionkanäle, deren Aktivität durch Riluzol stimuliert wird.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Gereinigtes Protein, einen durch mehrfach ungesättigte Fettsäuren, vor allem die Arachidonsäure und das Riluzol, aktivierten mechanisch sensiblen Kaliumkanal ausbildend, dessen Aminosäuresequenz in der als Anlage beigefügten Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID No:1 dargestellt ist.
Poly- oder monoklonale Antikörper, die gegen mindestens ein Protein gerichtet sind, die einen Ionenkanal nach Anspruch 1 ausbilden.
Gereinigtes Nukleinsäuremolekül, das eine für ein Protein nach Anspruch 1 kodierende Nukleinsequenz aufweist oder von ihr gebildet wird.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, die Sequenz zwischen den Nukleotiden 284 und 1477 der in der als Anlage beigefügten Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID No:1 dargestellten Sequenz aufweisend oder ihre komplementäre Sequenz.
Vektor, mindestens ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3 oder 4 aufweisend.
Verfahren zur Herstellung eines Eiweißes, das einen Kaliumkanal nach Anspruch 1 ausbildet, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht: – ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3 oder 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5 in eine Wirtszelle zu transferieren, – die besagte Wirtszelle unter solchen Bedingungen zu kultivieren, welche die Herstellung des den besagten Kaliumkanal ausbildenden Proteins erlauben, – die besagten Kanäle ausbildenden Proteine mit allen geeigneten Mitteln zu isolieren.
Verfahren zur Expression eines Kaliumkanals nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht: – ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3 oder 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5 in eine Wirtszelle zu transferieren, – die besagte Wirtszelle unter solchen Bedingungen zu kultivieren, welche die Herstellung der besagten Kaliumkanäle erlauben.
Nicht menschliche Wirtszelle, die nach einem Verfahren nach Anspruch 7 gewonnen werden kann.
Verfahren zur Auslese von Substanzen, welche die Aktivität mechanisch sensibler Kaliumkanäle, die von den mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach Anspruch 1 aktiviert wurden, modulieren können, dadurch gekennzeichnet, dass variable Mengen einer zu testenden Substanz mit Zelle nach Anspruch 7 in Kontakt gebracht und dann mit allen geeigneten Mitteln die eventuellen Wirkungen der besagten Substanz auf die Strömungen der besagten Kanäle messen werden.
Verfahren nach Anspruch 9, angewendet auf die Auslese von Substanzen, die Krankheiten des Nervensystems beim Menschen oder Tier vorbeugen oder behandeln können.
Verfahren nach Anspruch 10, angewendet auf die Auslese von Substanzen, die Neurodegenerationen vorbeugen oder behandeln können.
Verfahren nach Anspruch 11, angewendet auf die Auslese von Substanzen, die mit Ischämien oder Anoxien verbundenen Neurodegenerationen vorbeugen oder behandeln können.
Pharmazeutische Zusammensetzung, mindestens ein einen Kaliumkanal nach Anspruch 1 ausbildendes Protein aufweisend, oder einen Antikörper nach Anspruch 2, oder ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 3 oder 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte aktive Prinzip mit einem physiologisch akzeptablen Überträger verbunden ist.