DE60015135T2

DE60015135T2 - Prolaktin freisetzendes peptid und verwendung zur behandlung von schmerzen

Info

Publication number: DE60015135T2
Application number: DE60015135T
Authority: DE
Inventors: Aarre Pertti PANULA; Antti Pertovaara; Eija Kalso; Esa Korpi
Original assignee: Juvanita Pharma Ltd Oy
Current assignee: Juvanita Pharma Ltd Oy
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-08-04
Also published as: PT1198477E; EP1198477B1; CA2380573A1; ES2230132T3; JP2003508025A; EP1198477A1; ATE280179T1; WO2001009182A1; DE60015135D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Prolaktin freisetzendem Peptid (PrRP) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schmerzen. Dieses Peptid reguliert Blutdruck und Schmerzmechanismen, und wird in komplementären Bereichen mit Neuropeptid FF (NPFF) exprimiert. Sowohl das Prolaktin freisetzende Peptid als auch das Neuropeptid FF sind RF-Amidpeptide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das erste Säugetier-RF-Amidpeptid Neuropeptid FF (NPFF) wurde im Rinderhirn identifiziert (Yang et al. 1985) und in einer beschränkten Anzahl von neuralen Systemen im Zentralnervensystem (ZNS) der Ratte (Kivipelto et al. 1989, Panula et al. 1996) lokalisiert. Es wurde festgestellt, dass das Gen von Ratte und Rind hochhomolog ist (Vilim et al. 1999), was nahelegt, dass das Gen hochkonserviert ist. Außer im Gehirn ist das Peptid in menschlichem Plasma gefunden worden (Sundblom et al. 1996), und das menschliche Gen (Perry et al. 1997, Vilim et al. 1999) teilt die Grundstruktur mit der von anderen Säugetieren. Es ist bekannt, dass NPFF in Abhängigkeit von der Stelle der Verabreichung und der Dosis sowohl potente proopioidschmerzlindernde Wirkungen als auch antiopioid-ähnliche Wirkungen aufweist, und dass es den Blutdruck reguliert (Panula et al. 1996).
Die Expression des NPFF-Gens, wie unter Anwendung der in situ-Hybridisierung (Vilim et al. 1999) untersucht, und Immunzytochemie (zur Übersicht siehe Panula et al. 1996) zeigen einige Unterschiede: ein zentraler Hypothalamuskern enthält zelluläre Peptidimmunreaktivität, zeigt aber keine NPFF-mRNA. Diese Ergebnisse sind durch die Möglichkeit erklärt worden, dass mehrere Gene RF-Amidpeptide in Säuge tieren entstehen lassen können (Panula et al. 1996, Vilim et al. 1999). Beweis von den in vivo- und in vitro-Untersuchungen legen nahe, dass NPFF in Ratten Prolaktin freisetzt (Aarnisalo et al. 1997). Vor kurzem wurde ein anderes Säugetier-RF-Amidpeptid als Prolaktin freisetzendes Peptid (PrRP) identifiziert und kloniert (Hinuma et al . 1998). Jedoch ist herausgefunden worden, dass die Prolaktin freisetzende Wirkung dieses klonierten PrRP schwächer ist als Hinuma et al. ursprünglich annahmen. Trotzdem ist der Name des Peptids in dieser Anmeldung aus Gründen der Übereinstimmung nicht geändert worden.
Obwohl zwei kurze Berichte über die Expressionsstellen des PrRP-Gens im Rattenhirn unter Anwendung der in situ-Hybridisierung (Minami et al. 1999) und Immunhistochemie (Chen et al. 1999) existieren, berichteten die Autoren nicht über die Verteilung der Nervenenden (Stellen der Wirkung) oder des Rezeptors. Außerdem legten sie die Beteiligung von PrRP und dessen Rezeptor bei der autonomen Regulation und Schmerzen nicht nahe. Diese Untersuchung ist die erste, in der die Stellen der Wirkung und direkte Wirkungen des angewendeten Peptids auf Schmerzen festgestellt wurden.
Der G-Protein gebundene Rezeptor UHR-1 wurde als Rezeptor unbekannter Funktion im Rattenhirn identifiziert (Welch et al. 1995). Ein verwandter menschlicher Rezeptor GPR10 wurde aus menschlichem Gewebe kloniert (Marchese et al. 1995) und als PrRP-Rezeptor identifiziert, der mit dem Arachidonsäure-Stoffwechselweg verbunden ist (Hinuma et al. 1998).
Ein Artikel von Maruyama et al., Endocrinology, Bd. 140(6), S. 2326–2333, beschreibt die Verteilung von Prolaktin freisetzendem Peptid in Rattenhirn unter Anwendung der Immunhistochemie. Nachdrücklich hervorgehoben werden die Hormon freisetzenden Systeme des Hypothalamus und der Hypophyse. Der Artikel spricht die die Schmerzen betreffenden Rückenmarks- und Hirnstammsysteme nicht speziell an, und es sind keine Daten oder Bezüge enthalten, die einen Beweis der Wirkung von PrRP entweder auf akute oder neuropathische Schmerzen liefern.
WO 0038704 offenbart die immunologische Detektion des PrRP-Proteins, aber die Verwendung des Proteins bei der Schmerzbehandlung ist nicht erwähnt.
In WO 9960112 sind Antikörper gegen PrRP20 offenbart und für einen Immunoassay verwendet worden, um PrRP20 zu detektieren. Das Dokument enthält keine Lehre oder keinen Vorschlag zur Brauchbarkeit bei der Schmerzbehandlung des Proteins.
WO 9724434 betrifft den Polypeptid-Liganden für die menschlichen Hypophyse- und Mauspankreas-abgeleiteten G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteine. Das Polypeptid weist eine funktionsmodulierende Wirkung auf das Zentralnervensystem auf, aber es wird keine Wirkung bei der Schmerzbehandlung erwähnt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, die Stellen der Expression des RF-Amidpeptids PrRP und die entsprechende Genexpression in den Zentral- und peripheren Nervensystemen zu charakterisieren, um die Stellen zu identifizieren, an denen die Anwendung des Peptids oder verwandter Rezeptorliganden akute oder chronische Schmerzempfindung modifiziert.
Eine andere Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, mögliche Anwendungen des PrRP-Peptids, seines C-terminalen Peptidfragments und des entsprechenden Rezeptors bei der Entwicklung der Behandlung von Erkrankungen des Gehirns und des Zentralnervensystems bereitzustellen.
Gemäß der Erfindung wurde herausgefunden, dass das PrRP in Bereichen exprimiert wird, die bei der autonomen Regulation und bei Schmerzen wichtig sind, und dass das PrRP und seine C-terminalen Fragmente potente Wirkungen zeigen, die bei der Arzneistoffentwicklung nützlich sind.
Der PCR-klonierte PrRP-Rezeptor (ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der GPR10 und UHR1 ähnelt, die früher als Orphanrezeptoren bekannt waren) wurde in der Area postrema exprimiert, einem Bereich, der für die Regulation des Blutdruckes und anderer autonomer Funktionen relevant ist. Sowohl der menschliche als auch der Rattenrezeptor wurden kloniert. Die Rezeptorsequenzen sind in den 12 und 13 dargestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird jetzt mit Bezug auf die Figuren ausführlich beschrieben, wobei gilt:
1 zeigt die PrRP-Genexpression im ZNS der Ratte im Verhältnis zu dem anderen RF-Amidpeptidgen, NPFF, unter Anwendung der in situ-Hybridisierung. Die linke Seite zeigt die PrRP-, die rechte Seite die NPFF-Expression. A) PrRP-mRNA fehlt am Nucleus supraopticus und Nucleus paraventricularis, B) NPFF ist im Nucleus supraopticus und Nucleus paraventricularis exprimiert. C) PrRP-mRNA-Expression ist im Nucleus dorsomedialis hypothalami erkennbar, D) NPFF-mRNA fehlt in demselben Bereich, E) keine PrRP-mRNA-Expression ist im rostralen Nucleus tractus solitarii (NTS) offensichtlich, F) starke Expression von NPFF-mRNA ist in demselben Bereich erkennbar, G) das kaudale Kommissurenteil des NTS zeigt ein starkes PrRP-mRNA-Signal, H) das dorsale Rückenmark ist ohne PrRPmRNA, I) es ist keine PrRP-mRNA-Expression im dorsalen Horn des Rückenmarks ersichtlich, J) starke NPFF-mRNA-Expression ist in derselben Stelle zu erkennen.
2 ist eine Darstellung der Immunhistochemie von PrRP im Rattengehirn unter Anwendung von C- und N-terminalen Antiseren:
A) Perikarya im Kommissurenteil des NTS, die Immunreaktivität für den N-Terminus von PrRP20 zeigen. Dorsal ist auf der linken Seite.
B) Starke PrRP-Immunreaktivität in der medianen Eminentia unter Verwendung eines Antiserums gegen das C-terminale Peptid PrRP8.
C) Nervenfasern im Bettnucleus der Stria medullaris zeigen die Immunreaktivität auf PrRP.
D) Nervenfasern, immunreaktiv auf PrRP in der seitlichen Scheidewand.
E) Nervenfasern, immunreaktiv auf PrRP im Nucleus parabrachialis lateralis und medialis.
F) Nervenfasern, immunreaktiv auf PrRP im rostralen Teil des Nucleus tractus solitarii.
G) Nervenfasern, immunreaktiv auf PrRP im ventrolateralen zentralen Höhlengrau.
3 zeigt die Expression der PrRP-Rezeptor-mRNA im Gehirn. A) Eine starke Rezeptorexpression ist im Nucleus reticularis thalami erkennbar und ist verbunden mit der Periventrikularzone des dritten Ventrikels im Hypothalamus; B) PrRP-RezeptormRNA in dorsaler Pons/Medulla; C) eine Kontrollsonde zeigt in einem entsprechenden Abschnitt kein Signal; D) die Area postrema zeigt ein starkes Rezeptorsignal; E) eine Kontrollsonde zeigt in einem entsprechenden Abschnitt kein Signal.
4 zeigt die Spezifität der PrRP-in situ-Hybridisierung in zwei aufeinander folgenden Abschnitten. A) ein starkes Signal ist erkennbar, wenn der Abschnitt mit einer Antisense-Sonde hybridisiert wird; B) kein Signal ist erkennbar, wenn der Abschnitt mit einer Sense-Sonde hybridisiert wird.
5 stellt eine Kurve dar, die die Wirkung von intrathekal verabreichtem PrRP20 und PrRP8 bei akuten Schmerzen zeigt:
A) Wirkung von PrRP20 (bei Dosen von 5 und 10 nmol) oder von dessen C-terminalem Oktapeptid PrRP8 (bei einer Dosis von 10 nmol) auf die Latenzzeit des „Tail-flick" in normalen Ratten;
B) Wirkung von Morphin und Morphin + PrRP20 (5 nmol) auf die Latenzzeit des „Tail-flick" in normalen Ratten.
6. Schwelle des Zurückziehens von Hinterextremitäten, induziert durch schädliche mechanische Stimulation (Pfotendrucktest) im Anschluss an PrRP20 oder Kochsalzlösung in den Hirnstamm. A) PrRP20 (5 nmol) erzeugte 10 min nach der Injektion im NTS eine wesentliche Zunahme der Schwelle. Die Schwelle lag innerhalb von 30 min am Kontrollniveau. Kochsalzlösung induzierte keine Änderung in der Schwelle. *** p < 0,005 (Tukey-Test; Bezug: die entsprechende Schwelle vor der Arzneistoffinjektion). B) Die Dosis-Abhängigkeit des Anstiegs der Schwelle 10 min nach Injektion von PrRP20 im NTS, CVLM (kaudalen ventrolateralen Schwanzmedulla) oder im PAG (zentralen Höhlengrau). Kochsalzlösung hatte keine Wirkungen, während PrRP20 im NTS einen dosisabhängigen Anstieg der Schwelle erzeugte. Die Zunahme der Schwelle durch PrRP20 im PAG war von geringer Bedeutung, und auch die Abnahme der Schwelle durch PrRP20 in der CVLM war von geringer Bedeutung. * p < 0,05, *** p < 0,005 (Tukey-Test; Bezug: die Kochsalzlösungsgruppe). C) Schwelle 10 min nach der Mikroinjektion von Kochsalzlösung, PrRP8 (0,5 nmol), PrRP20 (0,5 nmol) oder im Anschluss an PrRP20 (0,5 nmol) zusammen mit Naloxon (1 mg/kg s.c., 5 min vor der PrRP20-Injektion). Alle Mikroinjektionen in den NTS. PrRP20 erzeugten einen wesentlichen Anstieg der Schwelle, der nicht durch Naloxon aufgehoben wurde. Die Wirkung von PrRP8 war von geringer Bedeutung. In jeder Gruppe n=4–10.
7. Ein Beispiel von durch Wärme hervorgerufener Blutdruckzunahme und Latenz des Zurückziehens von Hinterextremitäten im Anschluss an die Mikroinjektion von PrRP20 (0,5 nmol) in der CVLM gegen NTS. A) Vor Injektion in die CVLM. B) Fünf Minuten nach der Injektion in die CVLM. C) Vor Injektion in den NTS. D) Fünf Minuten nach der Injektion in den NTS. Beachte, dass die durch Wärme hervorgerufene Blutdruckzunahme im Anschluss an PrRP20 in der CVLM höher ist, und dies von einer Abnahme der Latenz des Zurückziehens von Hinterextremitäten begleitet wird.
H zeigt den Wärmestimulus an (von der Basislinie von 35°C zur Peaktemperatur von 54°C). BD zeigt den Blutdruck an. W zeigt das Zurückziehen von Hinterextremitäten an, gemessen mit einer piezoelektrischen Vorrichtung (der Pfeil zeigt den Beginn des Zurückziehens an). Der horizontale Kalibrierungsbalken stellt 5 s dar, und der vertikale Balken 20 mmHg für BD-Kurven.
8.A) Die Latenz des durch Wärme hervorgerufenen Zurückziehens von Hinterextremitäten im Anschluss an die Mikroinjektion von PrRP20 (0,5 nmol) oder Kochsalzlösung im NTS oder CVLM. B) Die Änderung der Basislinie des (mittleren arteriellen) Blutdrucks 5 und 15 min nach der Injektion von PrRP20 im NTS oder CVLM. C) Die durch Wärme hervorgerufene Zunahme des Blutdrucks im Anschluss an PrRP20 im NTS oder CVLM. In B und in C stellt 0 den entsprechenden Vorarzneistoffwert dar. * p < 0,05 (Tukey-Test; Bezug: Kochsalzlösungsgruppe). n=4 in jeder Gruppe.
9. Die antiallodyne Wirkung von PrRP20 im NTS und PAG in neuropathischen Ratten.
A) PrRP20 im NTS erzeugte eine Dosis-abhängige Abschwächung von taktiler Allodynie in neuropathischen Tieren. Gemäß Friedman ANOVA war die Antiallodynie bei Dosen von 0,5 und 5 nmol, nicht aber bei einer Dosis von 0,2 nmol wesentlich. B) PrRP20 im PAG erzeugte auch eine wesentliche Abschwächung der taktilen Allodynie bei einer Dosis von 0,5 nmol, nicht aber bei einer Dosis von 0,2 nmol. n=4–6 in jeder Gruppe.
10 zeigt die Wirkung von intravenös verabreichtem PrRP8 auf den Blutdruck.
A) Wirkung von intravenösem PrRP8 (18 μg/kg) auf den Blutdruck bei der Ratte.
B) Wirkung von intravenösem PrRP8 (45 μg/kg) auf den Blutdruck.
C) Wirkung von intravenösem PrRP8 (90 μg/kg) auf den Blutdruck.
D) Wirkung von intravenösem PrRP8 (126 μg/kg) auf den Blutdruck.
11. Wirkung von intravenös injiziertem PrRP20 auf den Blutdruck.
A) Injektion von Kochsalzlösung beeinflusste den Blutdruck in der Ratte nicht.
B) PrRP20 bei einer Dosis von 220 μg/kg induzierte eine schnelle Zunahme des Blutdruckes in derselben Ratte.
12 zeigt die Rattenrezeptorsequenz SEQ ID NR. 2.
13 zeigt die menschliche Rezeptorsequenz SEQ ID NR. 3.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier durchgeführten und beschriebenen Experimente wurden in der Ratte und Maus durchgeführt. Es wird angenommen, dass die Gegenwart und die Expression des PrRP-Peptids und dessen entsprechender Rezeptor an ähnlichen Orten vorliegen und ähnliche Funktionen in anderen Säugetieren, einschließlich des Menschen, zeigen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Beobachtung, dass PrRP ein zentraler Regulator der Schmerzmechanismen und autonomen Funktionen ist. Das Expressionsmus ter des Peptids mit Perikarya, die sowohl mRNA als auch Peptidimmunreaktivität im NTS (Nucleus tractus solitarii) und der ventrolateralen Medulla exprimieren, zeigen an, dass das PrRP-Peptid in geeigneten neuralen Systemen gefunden wird. Außerdem wurden die Nervenenden, die PrRP-Immunreaktivität zeigen, in diesen Bereichen und in der Area parabrachialis und im zentralen Höhlengrau gefunden, was anzeigt, dass diese Bereiche nicht nur die Zellen enthalten, die in der Lage sind, das Peptid zu produzieren, sondern auch Ziele ihrer Innervation sind. Der PrRP-Rezeptor wurde auch in einem Bereich gefunden, der für eine derartige Funktion geeignet ist. Schließlich induzierte direkte Verabreichung des Peptids in diese Bereiche starke analgetische (NTS) und milde hyperalgetische (CVLM) Wirkungen, was direkt die Stelle (NTS) im Gehirn anzeigt, an der die Analgesie durch PrRP20 erzeugt wird. Außerdem wies PrRP20 eine antiallodyne Wirkung auf neuropathische Tiere auf, wenn es in den NTS oder in das PAG verabreicht wurde. Außerdem zeigten Aufzeichnungen des Blutdruckes an, dass PrRP20 in der CVLM eine durch Wärme hervorgerufene Blutdruckreaktion (ein somatisch-autonomer Reflex) erleichtert, die mit der Erleichterung der durch Wärme hervorgerufenen Reaktion des Zurückziehens von Hinterextremitäten (ein somatomotorischer Reflex) einhergeht. Diese Feststellung zeigt an, dass PrRP20 in der CVLM schmerzerleichternde Wirkungen aufweist.
Verschiedene Wirkungen zeigen an, dass mehrere neurale Systeme innerhalb der Medulla beteiligt sind, und legen nahe, dass die Wirkungen durch Interneurone moduliert werden können. Das Fehlen von analgetischen Wirkungen im Rückenmark steht in Übereinstimmung mit dem Fehlen von Peptidimmunreaktivität und dem Fehlen von PrRP-mRNA. Es stellt auch eine klare Indikation dar, dass sich der Mechanismus, bei dem PrRP verwendet wird, von dem von NPFF unterscheidet.
Der Nucleus tractus solitarii und die ventrolaterale Medulla sind für die Regulation des Blutdruckes wichtig. Starke zelluläre und terminale PrRP-Immunreaktivität an diesen Orten legt nahe, dass der Blutdruck durch PrRP reguliert werden kann, und direkte intravenöse Injektion des Peptids zeigte, dass dies richtig war. Jedoch legt die starke Expression des PrRP-Rezeptors in der Area postrema, einem Bereich unmittelbar neben dem NTS und einbezogen in die autonome Regulation, nahe, dass auch ein im Blut befindliches Peptid möglicherweise autonome Funktionen durch diese Stelle modulieren kann. Es scheint, dass das Rezeptorprotein in der Area postrema produziert und zu distalen Verzweigungen transportiert wird, welche sich z.B. zum NTS erstrecken, einer Kandidatenstruktur zur Vermittlung von Wirkungen auf den Blutdruck.
Hier stellen wir fest, dass die RF-Amidpeptidgene (PrRP und NPFF) in eingeschränkten Bereichen nur des ZNS exprimiert werden, und es deshalb wahrscheinlich ist, dass deren Funktionen hochspezifisch sind. Es wird zum ersten Mal gezeigt, dass das Säuger-RF-Amidpeptidgen PrRP in der Medulla hochexprimiert und im Hypothalamus gemäßigt exprimiert ist, wohingegen fast alle anderen Gehirnbereiche sehr niedrige oder überhaupt keine Expression zeigen, und Nervenenden, die das aktive Peptid enthalten, eine beschränkte Verteilung in Bereichen zeigen, die für die Regulation von Schmerzen, autonomen Funktionen, die hormonelle Regulation und die limbischen Funktionen relevant sind. Genauer scheinen das Peptid und dessen Rezeptor bei der Regulation von autonomen Funktionen wichtig zu sein, die durch Medullarmechanismen vermittelt werden. Diese Funktionen schließen Blutdruck- und Herzregulation ein. Auf der anderen Seite wird das Peptid im Hypothalamus gefunden, wo es in die Hormonregulation einbezogen ist. In Anbetracht der einzigartigen Projektionen von RF-Amid verwandten Peptidsystemen vom Hypothalamus sowohl zu den limbischen Bereichen (Amygdala) als auch zur Medulla (Aarnisalo et al. 1995, Panula et al. 1996) und der Expression des PrRP-Gens in diesem Nucleus, wie hier gezeigt, kann das RF-Amid-enthaltene Peptid PrRP auch wesentliche Rollen bei den limbischen Funktionen spielen, die emotionale Komponenten bei der Nahrungszufuhr und beim Trinken sowie des Gedächtnisses einschließen. Interessanterweise wurde die Expression der RF-Amidpeptidgene auf nur einige Stellen im ZNS beschränkt, und diese waren eher komplementär als überlappend: NPFF wurde im dorsalen Horn des Rückenmarks stark exprimiert, wohingegen PrRP an dieser Stelle fehlte. In der Medulla wurde PrRP in den Kaudal- und Kommissurenteilen des NTS gefunden, wohingegen NPFF auf die rostralen Teile des NTS beschränkt war. Im Hypothalamus wurde kein PrRP im Nucleus supraopticus und Nucleus paraventricularis gefunden, welche NPFF-mRNA exprimierende Neuronen enthielten. Der Bereich zwischen dem Nucleus dorsomedialis und dem Nucleus ventromedialis beherbergte eine Gruppe von Neuronen, welche PrRP-, nicht aber NPFF-mRNA zeigten.
Die Tatsache, dass die Expressionsniveaus der NPFF- und PrRP-Gene in der Peripherie sehr niedrig zu sein scheinen (Daten nicht gezeigt), legt nahe, dass es möglich sein kann, die Behandlung von ZNS-Störungen, besonders solche, die autonome Funktionen und Hormonregulation betreffen, ohne größere periphere Nebenwirkungen zu planen.
Die Hauptstelle der PrRP-Genexpression in der Medulla oblongata der Ratte, der kommissurale Nucleus tractus solitarii, nimmt einen größeren Input vom Glossopharyngeus und Nervus vagus und Signale zum Vorderhirn, das Mesencephalon und Pons, besonders zu Zellen auf, die die autonomen und neuroendokrinen Funktionen regulieren. Sie ist auch reziprok mit Gruppen von Zellen verbunden, welche sympatische und vagal-präganglionäre Neuronen innervieren, wobei folglich ein putativer Feedback-Mechanismus erzeugt wird (Loewi und Spyer 1990).
Der sympatische Ausfluss wird durch reziproke Wege zwischen dem NTS, der ventrolateralen Medulla, den katecholaminergen Zellgruppen und dem Nucleus parabrachialis reguliert (Loewi und Spyer 1990). Alle diese Bereiche enthalten Komponenten des PrRP-Neurosystems, was nahelegt, dass das Peptid sympatische Funktionen durch mehrere Mechanismen regulieren kann.
Dies ist der erste Bericht über die Wirkung von PrRP auf Schmerzen in normalen und neuropathischen Tieren. Es ist besonders interessant, dass die Wirkung auf das Gehirn beschränkt ist und spinale Mechanismen nicht mit einbezogen zu sein scheinen. Außerdem hatte die Anwendung des Peptids auf eine andere Stelle (CVLM) eine hyperalgetische Wirkung. Die Stellen-spezifische Natur der Wirkungen legt nahe, dass mehrfache Mechanismen in der Medulla funktionieren können.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass zwei RF-Amidpeptid-kodierende Gene, PrRP und NPFF, in komplementärer Art und Weise in der Medulla oblongata exprimiert werden. Die entscheidenden Stellen für die Regulation von Schmerzen und autonomen Funktionen, einschließlich des Blutdruckes, werden durch Nervenfasern innerviert, die auf PrRP immunreaktiv sind, und der entsprechende Rezeptor wird auch in der Area postrema gefunden, einer wichtigen regulatorischen Stelle bei autonomen Funktionen. Eine pharmakologische Behandlung von Ratten bestätigte, dass PrRP und dessen C-terminales Oktapeptid den Blutdruck stark modulieren, wohingegen nur das PrRP20 in voller Länge Schmerzreaktionen in Ratten modulierte. Das Ergebnis legt deshalb auch nahe, dass das C-terminale Oktapeptid für einige pharmakologische Tätigkeiten ausreichend ist, wohingegen längere Fragmente für andere Funktionen erforderlich sind. Auch ist es wahrscheinlich, dass kürzere C-terminale Sequenzen von PrRP aktiv sind.
Es wurde festgestellt, dass die intravenöse Verabreichung des Peptids PrRP20 oder dessen C-terminalen Fragments PrRP8 an ein Tier den arteriellen Blutdruck erhöht. Die Zunahme des Blutdruckes ist zum Beispiel bei der Schockbehandlung und auch bei einigen anderen Bedingungen wichtig, bei denen sich der Blutdruck verringert. Dies zeigt auch an, dass die Blockierung von C-terminalen PrRP-Rezeptoren im Zentralnervensystem, besonders in der Medulla oblongata, und der Peripherie ein nützlicher Mechanismus bei der Behandlung von hohem Blutdruck ist.
Bei den durchgeführten Experimenten wurde herausgefunden, dass das intrathekale PrRP20-Peptid akute Schmerzen, neuropathische Schmerzen oder Morphinanalgesie nicht modulierte, was in Übereinstimmung mit dem Fehlen von Peptidgenexpression und Immunreaktivität im Rückenmark steht. Jedoch weist das Peptid, wenn es direkt in den Nucleus tractus solitarii verabreicht wird, eine potente analgetische Wirkung im Pfotendrucktest auf. In der ventrolateralen Medulla zeigte das Peptid eine milde hyperalgetische Wirkung. Im zentralen Höhlengrau war das Peptid unwirksam, ausgenommen in neuropathischen Tieren. Die Ergebnisse legen nahe, dass PrRP20 Stellen-spezifische Wirkungen auf die Analgesie zeigt, welche durch das kürzere C-terminale Peptid PrRP8 nicht nachgeahmt wird.
Es ist auch einleuchtend, dass eine Person, die an einer Krankheit leidet, die durch einen sich im Zentralnervensystem befindenden Rezeptor reguliert wird, durch Verabreichen eines Antagonisten oder Agonisten zum PrRP-Rezeptor an diese Person behandelt werden kann. Die Agonisten und Antagonisten des PrRP20-Peptids, die durch den entsprechenden Rezeptor wirken, sind bei der Behandlung von akuten Schmerzen, Entzündungsschmerzen und neuropathischen Schmerzen nützlich.
Therapeutische Zusammensetzungen können bereitgestellt werden, die das PrRP-Peptid oder dessen C-terminale Fragmente mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten.
Das Verabreichen von PrRP oder dessen C-terminalen Oktapeptid an Ratten ist intravenös mit Dosen von 18–220 μg/kg zum Regulieren des Blutdruckes und intrathekal mit Dosen von 0,5–10 nmol zum Behandeln von Schmerzen durchgeführt worden. Für Menschen sind die Dosen pro Gewicht vermutlich kleiner.
Zusätzlich zur autonomen und sensorischen Regulation legen Genexpressionsdaten nahe, dass PrRP in eine Anzahl anderer Funktionen einbezogen sein kann. Es ist früher festgestellt worden, dass der zentrale Hypothalamusbereich zwischen dem Nucleus dorsomedialis und dem Nucleus ventromedialis Zellen enthält, die für RF-Amidpeptide immunreaktiv sind (Kivipelto et al. 1989,1991). Diese Zellen senden Projektionen sowohl zum limbischen Bereich als auch zum Medullarbereich, einschließlich der Amygdala und NTS (Aarnisalo und Panula 1995). Diese Zellen werden folglich im Hypothalamus kritisch in Position gebracht, um die autonomen regulatorischen Medullarzentren mit dem limbischen System zu verbinden (Panula et al. 1996). Es ist wahrscheinlich, dass PrRP oder ein eng verwandtes Peptid bei der Regulation der limbischen Funktionen entscheidende Rollen spielt.
Expression des PrRP-Rezeptors im Nucleus reticularis thalami legt nahe, dass ein PrRP-ähnliches Peptid die kortikale Informationsauswertung durch Modulieren des Thalamus-Input zum Kortex regulieren kann. Dieses würde anzeigen, dass RF-Amidpeptide, einschließlich PrRP, obwohl nicht hervorstechend in kortikalen Bereichen, bei der Regulation von höheren Funktionen, einschließlich Aufmerksamkeit, Wachsamkeit und Gedächtnis, und Epilepsie durch das Thalamussystem und das limbische System beteiligt sein können.
Die Erfindung legt auch nahe, dass ein Verfahren der Aktivierung von RF-Amid-Rezeptoren in den laktotropen Zellen bereitgestellt werden kann, um Prolaktin-Freisetzung zu induzieren und so Rezeptor-spezifische Liganden unter Verwendung von Bindungsanalysen von RF-Amidpeptiden an Membranen dieser Zellen, oder Prolaktin-Freisetzung als Testassay zu entwickeln.
Es ist auch möglich, Diagnoseverfahren zur Identifizierung von genetischen Erkrankungen bereitzustellen, die mit veränderter Nerven- und Hormonfunktion einhergehen. Die Diagnoseverfahren für Hormon- und ZNS-Erkrankungen, einschließlich solcher, die mit der weiblichen Reproduktion und Laktation, mit Schmerzen oder autonomer Regulation oder männlicher Fertilität verknüpft sind, können auf der Sequenz des Kodierungsbereichs oder der regulatorischen Domäne des PrRP-Gens beruhen. Für diese können die spezifischen Antiseren verwendet werden, die hier gegen die N- und C-terminalen Domänen von PrRP20 entwickelt wurden.
Die Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele weiter beschrieben.
Beispiel 1.
Klonieren eines GPR10/UHR-1-verwandten PrRP-Rezeptors
Die folgenden Primer wurden verwendet, um einen Rezeptor zu klonieren, der dem sehr ähnelt, von dem berichtet wurde, dass er auf PrRP in biologischen Assays reagiert:
Die Primer wurden von der veröffentlichten Sequenz von UHR-1 entworfen (Welch et al., 1995). Der klonierte Rattenrezeptor (SEQ ID NR. 2) wies 4 Basensubstitutionen auf, die 3 Aminosäureunterschiede zur Folge hatten, verglichen mit dem früher berichteten Rezeptor (Welch et al. 1995), und unterschied sich vom berichteten PrRP-Rezeptor (Hinuma et al. 1998). Die entsprechende menschliche Sequenz wurde auch aufgedeckt (SEQ ID NR. 3). Der klonierte menschliche Rezeptor wies einen Einbasenunterschied zu der Sequenz auf, die durch Hinuma et al. beschrieben wurde, der einen Unterschied in einer Aminosäure zur Folge hatte (Hinuma et al., 1998). Die Sequenzen sind in den 12 und 13 gezeigt.
Für die DNA-Synthese wurde RNS aus dem Hirn von Milch absondernden Ratten durch RNazol B isoliert (Tel Test, Inc., TX, USA). Die Synthese der komplementären DNA wurde mit M-MuLV-Reversetranscriptase (Pharmacia) durchgeführt. Diese cDNA wurde als Matrize in der PCR-Amplifikation durch Dynazyme II-Polymerase (Finzymes) mit den vorstehend erwähnten Primern verwendet:
1 min lang 95°C, 30 s lang 55°C, 30 s lang 72°C und über eine Gesamtanzahl von 30 Zyklen wiederholt.
Das Programm wurde über einen Temperaturgradienten laufen gelassen (T= 58°C ± 10°C) mit einer Mastercycler Gradient Maschine (Eppendorf).
Beispiel 2.
Herstellung von Antikörpern gegen PrRP
Die Peptide TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (entsprechend PrRP20) (SEQ ID NR. 1) und das C-terminale Fragment GIRPVGRF-NH2 (entsprechend PrRP8) wurden unter Verwendung des Festphasensystems synthetisiert und durch serielle Reversed-Phase-HPLC-Durchläufe gereinigt. Die Reinheit wurde aus einem HPLC-Einzelpeak unter Verwendung der massenspektrometrischen Analyse bestätigt. Sie wurden mit 1-Ethyl-3,3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC; Sigma) an succinyliertes Hämocyanin der Napfschnecke gekoppelt (KLH; Sigma, St. Louis, MO), wie früher beschrieben (Panula et al. 1982), und Antiseren wurden in Kaninchen produziert.
Dieselben Peptide wurden auch als Mehrfachantigenpeptide (MAPs) synthetisiert, um die Antikörperproduktion zu erleichtern. Die MAPs wurden Kaninchen zusammen mit 500 μg des MAP-Peptid-Konjugats und mit 500 μl Freunds vollständigem Adjuvans (Freund's complete adjuvant) intradermal injiziert. Nach fünf Wochen wurde eine Auffrischungsinjektion gegeben (300 μg Konjugat in 500 μl Freund's vollständigem Adjuvans). Seren wurden gesammelt und unter Verwendung von Dot-Blot-Tests und Immunzytochemie unter Verwendung von Gehirnschnitten durch Bereiche, die PrRP-mRNA enthalten, auf Gegenwart von Antikörpern gegen PrRP-ähnliche Pepti de getestet. Spezifische Antiseren, welche neurale Strukturen im Gehirn erkannten und keine derartige Reaktion ergaben, wenn sie mit entsprechenden Peptiden präadsorbiert wurden, wurden erzeugt.
Beispiel 3.
In situ-Hybridisierungssonden
Oligonukleotide für die in situ-Hybridisierung wurden mit einem DNA-Synthesizer gemäß den veröffentlichten Sequenzen von NPFF, PrRP und PrRP-Rezeptor der Ratte erzeugt. Die Sonden NPFF (CAA GCA TTT CTA CCA AAC CTC TGG GGC TGA AAC AAG AAG GCT GGG TTC CTT CTA und GGG AAG TGA TTT TGC ATG CAG ACA TAT CAC AGC AGA TGA TGT TAC TTC TT), PrRP (TTG ATA CAG GGG TTC TTGG TCT CCA TGG AGT GCT GGT GGG CTC GGCC CTG GA), GRP10/UHR-1-verwandter PrRP-Rezeptor (TGC GC TCT GGG AAC CGT CGC AGA CAC ATT GCT CTC TGA AGC CTC TGC ACT und AGC GCC AGC ACT GCA GAT AGA GCC CAG ATG CCC AGC ACA GCG TAG GCG CTG) wurden mit Desoxyadenosin-5'-α(-thio)triphosphat-(35S) (NEG-034H) (DuPont NEN Research products, Boston, MA, USA) an deren 3'-Enden unter Verwendung der terminalen Desoxynukleotidtransferase (Promega, Madison, WI, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert. Die Reinigungen wurden an Sephadex G-50-Säulen durchgeführt. Die markierten Sonden mit spezifischen Aktivitäten von 1–2 × 10⁹ cpm/μg wurden bis zur Verwendung bei –20°C in 10 mM Dithiotreitol (DTT) gelagert. Eine 50-mer-Oligonukleotid-Sonde, die komplementär zur Chloramphenicolacetyltransferase von Staphylococcus aureus ist, wurde als eine der Kontrollen verwendet.
Beispiel 4.
In situ-Hybridisierung
Das Verfahren, das für eine in situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden verwendet wurde, ist vorstehend beschrieben worden (Dagerlind et al., 1992) und wurde mit kleineren Änderungen angewendet. Vor der Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden wurden die Schnitte 30 min lang bei Raumtemperatur an der Luft trocknen gelassen.
Die Objektträger wurden 5 min lang in einem Abstand von 25 cm mit UV-Licht belichtet, um die Hybridisierung zu erhöhen (Schambra et al., 1994). Die Schnitte wurden 20–24 h lang bei 45°C (PrRP), 50°C (PrRP-Rezeptor) oder 55°C (NPFF) in einer Befeuchtungskammer mit 200 μl Hybridisierungspuffer hybridisiert, der 50% deionisiertes Formamid, 4× SSC (0,6 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumzitrat), 1 × Denhardt's-Lösung (0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinderserumalbumin), 1 % Sarcosyl-(N-lauroylsarcosin), 0,02 M Natriumphosphat (PB; pH-Wert 7,0), 10% Dextransulfat, 500 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA (ssDNA), 250 μg/ml Transfer-RNA (tRNA), 200 mM DTT und 107 cpm/ml der markierten Sonde (NPFF, PrRP oder PrRP-Rezeptor) oder Chloramphenicolacetyltransferase von Staphylococcus aureus als Kontrollsonde enthielt. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger bei Raumtemperatur in 1 × SSC eingetaucht, kurz mit 1 × SSC bei 56°C und dann dreimal 20 min lang bei 56°C in 1 × SSC gewaschen. Sie wurden bei 56°C in frischem 1 × SSC auf Raumtemperatur abgekühlt, bevor sie mit Ethanol dehydratisiert wurden (ein Eintauchen in destilliertes Wasser und dann jeweils 30 s lang in 60%, 80% und absoluten Ethanol). Die Gewebeschnitte wurden dann 10 Tage lang auf Kodak BioMax MR-Film gelegt und danach in Kodak NTB2-Emulsion eingetaucht und der Emulsion 50 Tage lang ausgesetzt. Als zusätzliche Kontrolle zusammen mit der Chloramphenicolacetyltransferase von Staphylococcus aureus als Sonde wurde eine kompetitive Hybridisierung mit einem 100fachen Überschuss an nicht markiertem NPFF-, PrRP- oder PrRP-Rezeptoroligonukleotid im Hybridisierungspuffer durchgeführt, um jedes spezifische Hybridisierungsignal aufzuheben. Repräsentative Objektträger von allen Gehirnbereichen wurden mit Toluidinblau oder Cresylviolett gefärbt, um eine Identifizierung von Gehirnnuclei, Neuronen, zu erlauben.
Die beiden Gene, die die RF-Amidpeptidgene (NPFF und PrRP) kodieren, wurden in Schlüsselbereichen des Gehirns exprimiert, von denen bekannt ist, dass sie in die Regulation von Blutdruck- und Herzfunktionen sowie der hormonellen Regulation einbezogen sind. Genauer wurde PrRP in der dorsalen Medulla oblongata, die den Nucleus tractus solitarii und die ventrolaterale Medulla einschließt, und im zentralen Hypothalamus exprimiert. NPFF wurde im Nucleus tractus solitarii, im Nucleus spinalis trigemini und im Nucleus supraopticus und Nucleus paraventrikularis hypothalami exprimiert. NPFF, nicht aber PrRP, wurde im dorsalen Horn des Rückenmarks exprimiert.
Der Rezeptor für RF-Amidpeptide, die mit GPR10 verwandt sind, wurde im zentralen Hypothalamus, im Nucleus reticularis thalami und in der Medulla oblongata, insbesondere in der Area postrema exprimiert.
Beispiel 5.
Bildanalyse
Die Quantifizierung der autoradiographischen in situ-Hybridisierungsfilme wurde durch Digitalisieren der Filmbilder mit einem computer-gestützten MCID-Bild-Analysesystem (Imaging Research, St. Catherines, Ontario, Kanada) und durch Messen verschiedener Gehirnbereiche in Grauskalapixelwerten durchgeführt. Die relative optische Dichte wurde in einen linearen Grauskalawert, bezogen auf eine geeignet abgeleitete ¹⁴C-Standardkurve, umgewandelt, im Wesentlichen wie in unseren früheren Berichten beschrieben (Lintunen et al. 1998, Vilim et al. 1999).
Beispiel 6.
Immunzytochemie
Immunhistochemie wurde unter Verwendung spezifischer Antiseren gegen die C-Termini der beiden aktiven Peptide, NPFF und NPSF, das in der NPFF-Vorstufe vorlag, und PrRP durchgeführt. Normale oder Colchicin-behandelte männliche Wistar-Ratten (250–300 g) wurden mit 4% Paraformaldehyd durchtränkt, und Gehirnschnitte wurden zur Immunfluoreszenz, wie beschrieben (Kivipelto et al., 1989), verarbeitet. Primärantiseren wurden 1:500 – 1:20.000 verdünnt, und Präadsorptionskontrollen mit mehreren Peptiden wurden durchgeführt, wie früher beschrieben (Kivipelto et al., 1989).
Zum Vergleich wurden Antiseren gegen die NPFF-Gen-verwandten Peptide NPFF und NPSF ähnlich angewendet. Die Daten für PrRP sind in 2 veranschaulicht.
Immunzytochemie mit Antikörpern gegen NPSF, einem typischen RF-Amidpeptid, zeigten umfangreiche Faser- und terminale Netzwerke in dem Nucleus parabrachialis lateralis, dem Nucleus tractus solitarii, der ventrolateralen Medulla, der Amygdala, dem Bettnucleus der Stria medullaris und mehreren Hypothalamusnuclei. Das Antiserum war C-Terminus-spezifisch, was nahelegt, dass die Immunlokalisation eine Gruppe von verwandten Peptiden darstellt. Die Immunzytochemie von PrRP verifizierte die Ergebnisse, die für entsprechende mRNA mit in situ-Hybridisierung erhalten wurden, und bestätigten, dass die PrRP-Gen-verwandten Peptide in regulatorischen Schlüsselbereichen der Medulla erzeugt und gespeichert werden. Große Neuronen, die eine starke TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2-Immunreaktivität (PrRP20-ir) zeigten, waren im Kommissurenteil des Nucleus tractus solitarii erkennbar. Es war sichtbar, dass sich Faserprojektionen, die von diesem Bereich ausgehen, zu vorhergehenden und nachfolgenden Richtungen und zur ventrolateralen Richtung erstrecken. Umfangreiche terminale Netzwerke waren in anderen Teilen des Nucleus tractus solitarii, Trigeminalkomplexes und mehreren Nuclei der ventralen und lateralen Medulla oblongata, des Nucleus parabrachialis lateralis und medialis und dem ventrolateralen zentralen Höhlengrau erkennbar. Perikarya waren auch in der ventrolateralen Medulla und dem Hypothalamus auf der Ebene des Nucleus dorsomedialis und des Nucleus ventromedialis zu sehen. Fasern waren auch in mehreren Hypothalamusstellen, vornehmlich in der Eminentia medialis, mit dem C-Terminus-orientierten Antiserum, und in den paraventrikularen und periventrikularen Bereichen und dem lateralen Hypothalamus sowohl mit dem C-Terminus- als auch dem N Terminus-orientierten Antiserum zu erkennen. Von den limbischen Bereichen zeigten der Bettnucleus der Stria terminalis und die seitliche Scheidewand eindeutige Fasernetzwerke. Dichte Fasernetzwerke in den paraventrikularen und lateralen Hypothalamus-Bereichen zeigen die Einbeziehung von PrRP in die Regulation der Nahrungsmittelaufnahme.
Beispiel 7.
Neuropathisches Schmerzmodell
Das Modell von Kim und Chung wurde angewendet, wie früher beschrieben (Kontinen et al. 1997). Die Tiere wurden mit Halothan betäubt, und die linken Rückenmarksnerven L5 und L6 wurden exponiert, isoliert und mit 6–0 Seidenfaden fest verbunden. Ratten, welche eine wesentliche mechanische Allodynie (Schwelle für das Zurückziehen der Pfote nach von Frey-Haarstimulierung mit der Kraft von 4,2 g oder weniger) nach zwei Wochen von der Ligierung entwickelten, wurden verwendet. Das intrathekale Einführen der Kanüle wurde durchgeführt, wie beschrieben (Kontinen et al. 1997).
Die Ergebnisse der intrathekalen Injektionen sind in 5 dargestellt. Aus der Figur ist ersichtlich, dass intrathekales PrRP keine Wirkung auf den Schmerz in diesem Modell hatte. PrRP20 im NTS und auch im PAG hatte eine wesentliche antiallodyne Wirkung in neuropathischen Tieren (9).
Beispiel 8.
Testen von Analgesie und Allodynie
Die durch Wärme induzierte Reaktion des „Tail-flick" wurde unter Verwendung einer Strahlungswärmevorrichtung bestimmt. Der Wärmestrahl wurde auf den Schwanz gerichtet und die Zeit des „Tail-flick" wurde notiert.
Die intrathekale Verabreichung von PrRP zeigte, dass die Peptide auf der Ebene des Rückenmarks unwirksam waren. In normalen Ratten gab es keine wesentlichen Antinozizeptorwirkungen (Tail-flick-Test) entweder mit PrRP oder dessen C-terminalen Oktapeptidfragment bei Dosen von 0,5, 5 oder 10 nmol (5A). Eine i.t.-Dosis von 5 nmol änderte die Antinozizeptorwirkung des Morphins nicht erheblich (5B). In neuropathischen Ratten änderten i.t.-Dosen von 5 oder 10 nmol des C-terminalen Oktapeptids die Kälteallodynie oder mechanische Allodynie nicht. Injektion des PrRP20-Peptids in den NTS induzierte eine starke Antinozizeption nach mechani scher Stimulation. Die Wirkung war 5 min nach der Verabreichung offensichtlich, maximal < 20 min (6). PrRP8 war bei NTS unwirksam (6). In der ventrolateralen Medulla (CVLM) induzierte eine ähnliche Injektion von PrRP20 eine milde Hyperalgesie (6B). Im zentralen Höhlengrau war das Peptid unwirksam, wenn es in gesunden Tieren getestet wurde (6B). Die Antinozizeptorwirkung, die durch intrazerebrale Arzneistoffinjektionen induziert wurde, wurde in gesunden Tieren unter Anwendung des Pfotendrucktests getestet, wie früher beschrieben (Wei et al., 1998). Die Technik der intrazerebralen Arzneistoffinjektionen ist anderswo ausführlich beschrieben (Wei et al. 1998). Das Testen der taktilen Allodynie wurde unter Verwendung einer Reihe von kalibrierten Monofilamenten durchgeführt, wie früher beschrieben (Wei et al., 1998).
Die Verabreichung des Peptids in das zentrale Höhlengrau neuropathischer Ratten hatte eine antiallodyne Wirkung (9B). Auch im NTS hatte PrRP20 eine dosisabhängige antiallodyne Wirkung in neuropathischen Tieren (9A).
Beispiel 9.
Blutdruckaufzeichnungen nach intrazerebralen Injektionen
Ratten wurden mit Pentobarbiton betäubt und in einen stereotaktischen Standardrahmen eingebracht. Für Mikroinjektionen des Arzneistoffs in die CVLM oder in das PAG wurde eine Führungskanüle in den Hirnstamm gelegt. Zur Aufzeichnung des Zurückziehens der Hinterextremitäten wurde eine piezoelektrische Vorrichtung an die Hinterextremitäten geklebt. Zur Aufzeichnung des mittleren Blutdruckes wurde ein intraarterieller Katheter in die Karotis eingebracht, und er wurde an einen kalibrierten Blutdruckmesswandler angeschlossen (Harvard Apparatus Inc.). Die schädlichen Wärmestimuli (52°C mit einer Dauer von 5 s) wurden von einem Feedback-regulierten Kontaktthermostimulator (LTS3, Thermal Devices Inc.) auf die kahle Haut der Hinterpfote aufgebracht. Die Reaktionen wurden auf einem Digitalspeicheroszilloskop aufgezeichnet.
Der basale Blutdruck, die durch Wärme hervorgerufene Blutdruckzunahme und die Latenz des durch Wärme hervorgerufenen Zurückziehens der Hinterextremitäten wurden vor den Arzneistoffinjektionen und bei verschiedenen Abständen im Anschluss an die Arzneistoffinjektionen aufgezeichnet. Die Aufzeichnungen des Blutdruckes zeigten an, dass PrRP20 in der CVLM die durch Wärme hervorgerufene Blutdruckreaktion (ein somatisch-autonomer Reflex) erleichtert, die mit der Erleichterung der durch Wärme hervorgerufenen Reaktion des Zurückziehens von Hinterextremitäten (ein somatomotorischer Reflex) einhergeht. Diese Feststellung, die in den 7 und 8 dargestellt ist, zeigt an, dass PrRP20 in der CVLM schmerzerleichternde Wirkungen aufweist.
Beispiel 10.
Blutdruckmessungen nach i.v.-Injektionen
Ratten wurden mit Urethan oder Isofluran betäubt, und in die Oberschenkelvene und -arterie wurden Kanülen eingebracht. Das Grass-Aufzeichnungssystem wurde verwendet, nachdem das Druckmessgerät mit der arteriellen Leitung verbunden worden war. Die Peptide TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (gemäß PrP20) und das C-terminale Fragment GIRPVGRF-NH2 (gemäß PrRP8) wurden intravenös injiziert, und der arterielle Blutdruck wurde überwacht.
Die Ergebnisse sind in den 10 und 11 gezeigt. Die intravenöse Injektion von PrRP20 bei einer Dosis von 220 μg/kg (11) oder dessen C-terminales Oktapeptidfragment PrRP8 bei Dosen von 18–126 μg/kg (10) induzierte eine klare Zunahme des arteriellen Blutdruckes (maximal 70 oder 60 mmHg beim systolischen beziehungsweise 40 und 30 beim diastolischen Druck) und Zunahme der Herzfrequenz (30–50 bpm, von 360 auf 390–420 bpm). Bei denselben Tieren war Kochsalzlösung ohne eine Wirkung (11A), und Phenylephrin induzierte eine klare Zunahme des Drucks.
Sequenzprotokoll
Veröffentlichungen

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Claims

Verwendung eines C-terminalen Fragments des Prolaktin freisetzenden Peptids (PrRP) mit der Aminosäuresequenz TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (SEQ ID NR. 1), bezeichnet als PrRP20, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schmerzen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Schmerzen akute Schmerzen oder neuropathische Schmerzen sind.