ES2230132T3 - Peptido de liberacion de prolactina y su utilizacion en el tratamiento del dolor. - Google Patents
Peptido de liberacion de prolactina y su utilizacion en el tratamiento del dolor.Info
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Abstract
Utilización de un fragmento C-terminal del péptido de liberación de prolactina (PrRP) que presenta la secuencia aminoacídica TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (SEC ID Nº:1) referenciada como PrRP2, para la preparación de un medicamento destinado a tratar el dolor.
Description
Péptido de liberación de prolactina y su
utilización en el tratamiento del dolor.
La presente invención se refiere al uso del
péptido de liberación de prolactina (PrRP) para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento del dolor. Este péptido regula
la presión sanguínea y los mecanismos de dolor, y se expresa en
áreas complementarias con el neuropéptido FF (NPFF). Tanto el
péptido de liberación de prolactina como el neuropéptido FF son
péptidos RF-amida.
El primer péptido RF-amida, el
neuropéptido FF (NPFF) se identificó a partir de cerebro bovino
(Yang et al., 1985) y se localizó en un número limitado de
sistemas neuronales en el sistema nervioso central (CNS) de ratas
(Kivipelto et al., 1989, Panula et al., 1996). Se
constató que el gen de ratas y el bovino eran altamente homólogos
(Vilim et al., 1999), lo cual sugiere que el gen es altamente
conservado. Además de encontrarse en el cerebro, el péptido también
se encuentra en el plasma humano (Sundblom et al., 1996), y
el gen humano (Perry et al., 1997, Vilim et al., 1999)
comparte la estructura básica con el de otros mamíferos. Es sabido
que el NPFF presenta tanto efectos pro-opiodes que
alivian el dolor como efectos de tipo anti-opioide,
dependiendo del lugar de administración y de la dosis, así como
también regula la presión sanguínea (Panula et al.,
1996).
La expresión del gen NPFF estudiada por
hibridación in situ (Vilim et al., 1999) y por
inmunocitoquímica (para una revisión ver Panula et al., 1996)
muestra algunas diferencias: un núcleo hipotalámico central contiene
inmunoreactividad celular del péptido pero no presenta el ARNm del
NPFF. Una explicación a estos resultados consiste en la posibilidad
que existan varios genes que den lugar a péptidos
RF-amida en mamíferos (Panula et al., 1996,
Vilim et al., 1999). Las evidencias obtenidas en estudios
in vivo e in vitro sugieren que el NPFF libera
prolactina en ratas (Aarnisalo et al., 1997). Recientemente,
otro péptido RF-amida de mamíferos se identificó
como péptido de liberación de prolactina (PrRP) y se clonó (Hinuma
et al., 1998). Sin embargo, se ha observado que el efecto
liberador de prolactina de este PrRP clonado es más moderado de lo
que Hinuma et al. creyeron en un principio. A pesar de ello,
el nombre de este péptido, por congruencia, no se ha cambiado en
esta solicitud.
Aunque existen dos breves informes sobre los
sitios de expresión del gen PrRP en el cerebro de ratas utilizando
hibridación in situ (Minami et al., 1999) e
inmunohistoquímica (Chen et al., 1999), los autores no
informaron sobre la distribución en terminaciones nerviosas (sitio
de acción) o sobre el receptor. Además, los autores no sugirieron la
implicación del PrRP o su receptor en la regulación autonómica y el
dolor. Este estudio representa el primer estudio en el que se
describen los sitios de acción y los efectos directos del péptido de
la solicitud sobre el dolor.
La proteína G acoplada al receptor
UHR-1 se identificó como un receptor de función
desconocida a partir del cerebro de rata (Welch et al.,
1995). Un receptor humano relacionado GPR10 se clonó a partir de
tejido humano (Marchese et al., 1995), y se identificó como
un receptor de PrRP acoplado a la ruta del ácido araquidónico
(Hinuma et al., 1998).
Un artículo de Maruyama et al.,
Endocrinology vol. 140(6), pp
2326-2333, describe la distribución del péptido de
liberación de prolactina en el cerebro de ratas utilizando
inmunohistoquímica. Se da más énfasis a los sistemas liberadores de
hormonas del hipotálamo y pituitaria. El artículo no trata de modo
específico los sistemas espinales y del tallo cerebral relacionados
con el dolor y no se incluye ningún dato o referencia que
proporcione evidencias sobre el efecto del PrRP sobre el dolor agudo
o neuropático.
El documento WO 0038704 da a conocer la detección
inmunológica de la proteína PrRP pero no se menciona la utilización
de la proteína en el tratamiento del dolor.
En el documento WO 9960112 se dan a conocer
anticuerpos contra el PrRP20 y se utilizan para el inmunoensayo para
detectar el PrRP20. El documento no incluye ninguna enseñanza o
sugerencia sobre la utilidad de la proteína para el tratamiento del
dolor.
El documento WO 9724434 se refiere al polipéptido
ligando para las proteínas de los receptores acoplados a proteína G
derivados de la pituitaria humana y el páncreas de ratón. El
polipéptido presenta una acción moduladora de la función del sistema
nervioso central pero no se menciona el efecto en el tratamiento del
dolor.
El objetivo de la presente invención consiste en
caracterizar los sitios de expresión del péptido
RF-amida PrRP, y la correspondiente expresión génica
en el sistema nervioso central y periférico para identificar los
sitios en los que la aplicación del péptido o los ligandos del
receptor relacionados modificarán la sensación de dolor agudo
o
crónico.
crónico.
Otro objetivo de la invención consiste en
proporcionar aplicaciones potenciales del péptido PrRP, su fragmento
peptídico C-terminal y el receptor correspondiente
en el desarrollo de tratamientos para los trastornos del cerebro y
del sistema nervioso central.
En la invención se observó que el PrRP se expresa
en áreas importantes en la regulación autonómica y el dolor, y que
el PrRP y sus fragmentos C-terminales presentan
efectos potentes útiles en el desarrollo de fármacos.
El receptor de PrRP clonado por PCR (un receptor
acoplado a proteína G que se parece a GPR10 y UHR1, previamente
conocidos como receptores huérfanos) se expresó en la área postrema,
una área importante en la regulación de la presión sanguínea y otras
funciones autonómicas. Se clonó tanto el receptor humano como el de
ratas. Las secuencias de los receptores se presentan en las figuras
12 y 13.
A continuación se describirá la invención en
detalle, haciendo referencia a las figuras, en las que:
La figura 1 muestra la expresión del gen PrRP en
el SNC de ratas en relación al gen del otro péptido
RF-amida, el NPFF, utilizando hibridación in
situ. La parte izquierda muestra la expresión de PrRP, la parte
derecha la expresión de NPFF. A) El ARNm de PrRP está ausente en el
núcleo supraóptico y paraventricular, B) El NPFF se expresa en los
núcleos supraóptico y paraventricular, C) la expresión del ARNm de
PrRP se observa en el núcleo dorsomedial del hipotálamo, D) el ARNm
de NPFF está ausente en la misma área, E) no se detecta una
expresión evidente del ARNm de PrRP en el núcleo rostral del tracto
solitario (NTS), F) se observa una fuerte expresión del ARNm de NPFF
en la misma área, G) la parte comisural caudal del NTS muestra una
fuerte señal del ARNm de PrRP, H) la médula espinal dorsal no
presenta el ARNm de PrRP, I) no se observa expresión del ARNm de
PrRP en el cuerno dorsal de la médula espinal, J) se observa una
fuerte expresión del ARNm del NPFF en el mismo sitio.
La figura 2 es una representación de la
inmunohistoquímica del PrRP en el cerebro de rata utilizando
antisuero C- y N-terminal.
A) Cuerpos celulares del nervio en la parte
comisural del NTS que muestran inmunoreactividad para el extremo
N-terminal del PrRP20. La dorsal está a la
izquierda.
B) Fuerte inmunoreactividad del PrRP en la
eminecia media utilizando un antisuero contra el péptido
C-terminal PrRP8.
C) Las fibras nerviosas en el núcleo del lecho de
la estría medular presentan inmunoreactividad para PrRP.
D) Fibras nerviosas inmunoreactivas para PrRP en
el septum lateral.
E) Fibras nerviosas inmunoreactivas para PrRP en
el núcleo parabranquial medio y lateral.
F) Fibras nerviosas inmunoreactivas para PrRP en
la parte rostral del núcleo del tracto solitario.
G) Fibras nerviosas inmunoreactivas para PrRP en
la sustancia gris periacueductal ventrolateral.
La figura 3 muestra la expresión del ARNm del
receptor de PrRP en el cerebro. A) Se observa una fuerte expresión
del receptor en el núcleo reticular del tálamo y asociada con la
zona periventricular del tercer ventrículo del hipotálamo. B) ARNm
del receptor de PrRP en la pons/medula dorsal, C) una sonda control
muestra la ausencia de señal en una sección correspondiente, D) La
área postrema muestra una fuerte señal del receptor, E) una sonda
control muestra la ausencia de señal en una sección
correspondiente.
La figura 4 muestra la especificidad de la
hibridación in situ del PrRP en dos secciones consecutivas.
A) Se observa una señal fuerte cuando la sección se hibrida con una
sonda antisentido, B) No se observa una señal evidente cuando la
sección se hibrida con una sonda sentido.
La figura 5 es una curva que muestra el efecto de
la administración intratecal de PrRP20 y PrRP8 sobre el dolor
agudo.
A) Efecto del PrRP20 (a dosis de 5 y 10 nmoles) o
su octapéptido C-terminal PrRP8 (a dosis de 10
nmoles) en el tiempo de latencia al retiro de la cola en ratas
normales.
B) Efecto de la morfina y morfina + PrRP20 (5
nmoles) en el tiempo de latencia al retiro de la cola en ratas
normales.
Figura 6. Umbral de retirada del tren posterior
inducido por estimulación mecánica nociva (prueba de la presión de
la pata) tras PrRP20 o solución salina en el tallo cerebral. A) El
PrRP20 (5 nmoles) produjo un aumento significativo en el umbral 10
min después de la inyección en el NTS. El umbral se encontraba al
nivel del control al cabo de 30 min. La solución salina no indujo
ningún cambio en el umbral. *** p<0,005 (Prueba de Turkey; ref:
el umbral correspondiente antes de la inyección del fármaco). B) La
dependencia de dosis del aumento del umbral al cabo de 10 min de la
inyección de PrRP20 en el NTS, CVLM (médula ventrolateral caudal) o
PAG (sustancia gris periacueductal). La solución salina no
presentaba ningún efecto, mientras que el PrRP20 en el NTS producía
un aumento del umbral dependiente de dosis. El incremento del umbral
por el PrRP20 en el PAG presentaba poca significancia, y la
disminución del umbral por el prRP20 en el CVLM presentaba poca
significancia. * p<0,05, *** p<0,005 (ensayo de Turkey; ref:
grupo de la solución salina). C) Umbral a los 10 min después de la
microinyección de solución salina, PrRP8 (0,5 nmoles), PrRP20 (0,5
nmoles) o después del PrRP20 (0,5 nmoles) junto con naloxona (1
mg/kg s.c. 5 min antes de la inyección de PrRP20). Todas las
microinyecciones en el NTS. El PrRP20 produjo un aumento
significativo del umbral que no resultaba revertido por la naloxona.
El efecto del PrRP8 presentaba poca significancia. En cada
grupo
n=4-10.
n=4-10.
Figura 7. Ejemplo del incremento de la presión
sanguínea evocado por calor y latencia de la retirada del tren
posterior tras la microinyección de PrRP20 (0,5 nmoles) en el CVLM
vs. NTS. A) Antes de la inyección en el CVLM. B) cinco min después
de la inyección en el CVLM. C) Antes de la inyección en el NTS. D)
cinco min después de la inyección en el NTS. Cabe destacar que el
incremento de la presión sanguínea evocado por calor es superior
tras la aplicación de PrRP20 en el CVLM y está acompañado de un
descenso en la latencia de la retirada del tren
posterior.
posterior.
H indica el estímulo de calor (a partir de la
línea base de 35ºC hasta un pico de temperatura de 54ºC). BP indica
la presión sanguínea. W indica la retirada del tren posterior medida
con un dispositivo piezoeléctrico (la flecha indica el inicio de la
retirada). La barra de calibración horizontal representa 5 s, y la
vertical 20 mmHg para las curvas de BP.
Figura 8. A) Latencia de la retirada del tren
posterior evocada por calor tras la microinyección de PrRP20 (0,5
nmoles) o solución salina en el NTS o CVLM. B) Cambio en la línea
base (media arterial) de la presión sanguínea a los 5 y 15 min
después de la inyección de PrRP20 en el NTS o CVLM. C) Incremento
evocado por calor en la presión sanguínea después del PrRP20 en el
NTS o CVLM. En B y C, 0 representa el valor del
pre-fármaco correspondiente. *p<0,05 (ensayo de
Turkey; ref: grupo de la solución salina). n=4 en cada grupo.
Figura 9. Efecto antialodínico del PrR20 en el
NTS y PAG en ratas neuropáticas. A) El PrRP20 en el NTS produjo una
atenuación dependiente de dosis de la alodinia táctil en animales
neuropáticos. Según el ANOVA de Friedman, la antialodinia era
significativa a dosis de 0,5 y 5 nmoles, pero no a la dosis de 0,2
nmoles. B) El PrRP20 en el PAG también produjo una atenuación
significativa de la alodinia táctil a la dosis de 0,5 nmoles, pero
no a la dosis de 0,2 nmoles. n=4-6 en cada
grupo.
La Figura 10 muestra el efecto del PrRP8
administrado por vía intravenosa sobre la presión sanguínea.
A) Efecto del PrRP8 intravenoso (18 \mug/kg)
sobre la presión sanguínea en la rata
B) Efecto del PrRP8 intravenoso (45 \mug/kg)
sobre la presión sanguínea
C) Efecto del PrRP8 intravenoso (90 \mug/kg)
sobre la presión sanguínea
D) Efecto del PrRP8 intravenoso (126 \mug/kg)
sobre la presión sanguínea.
Figura 11. Efecto del PrRP20 inyectado por vía
intravenosa sobre la presión sanguínea.
A) La inyección de solución salina no afectó a la
presión sanguínea de la rata
B) El PrRP20 a una dosis de 220 \mug/kg indujo
un rápido incremento de la presión sanguínea en la misma rata.
La figura 12 muestra la secuencia del receptor de
rata SEC ID NO:2.
La figura 13 muestra la secuencia del receptor
humano SEC ID NO:3.
Los experimentos realizados y descritos en la
presente memoria se realizaron en ratas y ratones. Se cree que la
presencia y expresión del péptido PrRP y su receptor correspondiente
se encuentra en localizaciones similares y presenta funciones
similares en otros mamíferos incluyendo el hombre.
La presente invención se refiere a la observación
de que el PrRP es un regulador central de los mecanismos de dolor y
de las funciones autonómicas. El patrón de expresión del péptido,
con cuerpos celulares nerviosos que expresan inmunoreactividad
tanto del ARNm como del péptido en el NTS (núcleo del tracto
solitario) y la médula ventrolateral, indica que el péptido PrRP se
encuentra en sistemas neurales apropiados. Adicionalmente, las
terminaciones nerviosas que presentaban inmunoreactividad del PrRP
se encontraron en estas áreas, así como también en la área
parabranquial y la sustancia gris periacueductal, lo cual indica
que estas áreas no sólo contienen células capaces de producir el
péptido sino también dianas de su inervación. El receptor de PrRP
también se encontró en una área apropiada para tal función.
Finalmente, la aplicación directa del péptido en estas áreas
inducía efectos analgésicos fuertes (NTS) e hiperalgésicos suaves
(CVLM), indicando directamente el sitio (NTS) del cerebro donde el
PrRP20 genera la analgesia. Además, el PrRP20 presentaba un efecto
antialodínico en animales neuropáticos cuando se administraba en el
NTS o PAG. Además, las mediciones de la presión sanguínea indicaron
que el PrRP20 en el CVLM facilita la respuesta de la presión
sanguínea evocada por calor (un reflejo
somato-autonómico) concomitantemente con la
facilitación de la respuesta de retirada del tren posterior evocada
por calor (un reflejo somatomotor). Estos descubrimientos indican
que el PrRP20 en el CVLM presenta efectos facilitadores sobre el
dolor.
Diferentes efectos indican que están implicados
varios sistemas neurales del interior de la médula, y sugieren que
los efectos pueden estar modulados por interneuronas. La ausencia
de efectos analgésicos en la médula espinal está de acuerdo con la
ausencia de inmunoreactividad del péptido y la ausencia de ARNm de
PrRP. También es una indicación clara de que el mecanismo que
utiliza el PrRP difiere del que utiliza el NPFF.
El núcleo del tracto solitario y la médula
ventrolateral son importantes para la regulación de la presión
sanguínea. La fuerte inmunoreactividad celular y terminal del PrRP
en estas localizaciones sugiere que la presión sanguínea puede
estar regulada por el PrRP, y la inyección intravenosa directa del
péptido demostró que lo anterior es cierto. Sin embargo, la fuerte
expresión del receptor de PrRP en la área postrema, una área
inmediatamente adyacente al nts e implicada en la regulación
autonómica, sugiere que un péptido producido también en la sangre
puede modular potencialmente las funciones autonómicas a través de
este sitio. Parece que la proteína del receptor se sintetiza en la
área postrema, se transporta a ramificaciones distales, que se
extienden p. ej. al NTS, una estructura candidata para la mediación
de los efectos sobre la presión sanguínea.
Los presentes inventores han observado en esta
solicitud que los genes de péptidos RF-amida (PrRP
y NPFF) se expresan únicamente en áreas restringidas del SNC, y por
lo tanto es probable que sus funciones sean altamente específicas.
Se demuestra por primera vez el gen del péptido
RF-amida de mamíferos PrRP se expresa fuertemente
en la médula y se expresa moderadamente en el hipotálamo, mientras
que todas las otras áreas del cerebro muestran una expresión muy
baja o nula, y las terminaciones nerviosas que contienen el péptido
activo presentan una distribución limitada en áreas relevantes para
la regulación del dolor, funciones autonómicas, regulación hormonal
y funciones límbicas. Más específicamente, el péptido y su receptor
parecen importantes en la regulación de funciones autonómicas
mediadas por mecanismos medulares. Estas funciones incluyen la
presión sanguínea y la regulación coronaria. Por otro lado, el
péptido se encuentra en el hipotálamo, donde está implicado en la
regulación hormonal. Teniendo en cuenta las proyecciones únicas de
los sistemas de péptidos relacionados con RF-amida
desde el hipotálamo a ambas áreas límbicas (amigdala) y médula
(Aarnisalo et al., 1995, Panula et al., 1996) y la
expresión del gen PrRP en este núcleo tal como se muestra en la
presente solicitud, este péptido PrRP que contiene
RF-amida también puede desempeñar funciones
esenciales en las funciones límbicas, incluyendo componentes
emocionales de la alimentación y bebida, y la memoria.
Interesantemente, la expresión de los genes de péptidos
RF-amida se restringía a unos pocos sitios en el
SNC y estos sitios eran complementarios en lugar de solapados: el
NPFF se expresaba fuertemente en el cuerno dorsal de la médula
espinal, mientras que el PrRP no se expresaba en este sitio. En la
médula, el PrRP se encontraba en las partes caudal y comisural del
nts, mientras que el NPFF se limitaba a las partes rostrales del
nts. En el hipotálamo, no se encontró el PrRP en los núcleos
supraóptico y paraventricular, los cuales contenían neuronas que
expresaban el ARNm de NPFF. La área entre el núcleo dorsomedial y
el ventromedial hospedaba un grupo de neuronas que presentaban el
ARNm de PrRP pero no el de NPFF.
El hecho de que los niveles de expresión de los
genes NPFF y PrRP en la periferia sean muy bajos (datos no
mostrados) sugiere que puede ser posible planificar el tratamiento
de trastornos del SNC, especialmente los relacionados con funciones
autonómicas y regulación hormonal, sin efectos secundarios
periféricos importantes.
El sitio principal de expresión del gen PrRP en
la médula oblongata de ratas, el núcleo del tracto solitario
comisural recibe una entrada principal a partir de los nervios
glosofaríngeo y vago, y señales al cerebro anterior, mesencéfalo y
pons, especialmente a células que controlan las funciones
autonómicas y neuroendocrinas. También se encuentra conectado
recíprocamente a grupos de células, las cuales inervan neuronas
simpáticas y preganglionares vagales, creando así un mecanismo
putativo de retroalimentación (Loewi and Spyer, 1990).
El flujo simpático de salida se encuentra
regulado por rutas recíprocas entre el nts, la médula
ventrolateral, los grupos celulares catecolaminérgicos y el núcleo
parabranquial (Loewi and Spyer, 1990). Todas estas áreas contienen
componentes del sistema neuronal del PrRP, lo cual sugiere que el
péptido puede regular funciones simpáticas mediante varios
mecanismos.
Este es el primer informe referente al efecto del
PrRP sobre el dolor en animales normales y neuropáticos. Resulta
particularmente interesante que el efecto se limita al cerebro, y
que los mecanismos espinales no parecen estar implicados. Además,
la aplicación del péptido a otro sitio (CVLM) presenta un efecto
hiperalgésico. La naturaleza específica del sitio de los efectos
sugiere que en la médula pueden operar múltiples mecanismos.
El conjunto de estos resultados indica que los
dos genes que codifican péptidos RF-amida, PrRP y
NPFF, se expresan de forma complementaria en la médula oblongata.
Los sitios cruciales para la regulación del dolor y de las funciones
autonómicas, incluyendo la presión sanguínea, se encuentran
inervados por fibras nerviosas inmunoreactivas para el PrRP, y el
receptor correspondiente también se encuentra en la área postrema,
un sitio regulador importante para las funciones autonómicas. El
tratamiento farmacológico de ratas confirmó que el PrRP y su
octapéptido C-terminal modulan fuertemente la
presión sanguínea, mientras las respuestas de dolor en ratas
únicamente resultan moduladas por la secuencia completa del PrRP20.
Por lo tanto los resultandos también sugieren que el octapéptido
C-terminal es suficiente para algunas acciones
farmacológicas, mientras que para otras funciones se necesitan
fragmentos más largos. Además, es probable que sean activas
secuencias más cortas C-terminales del PrRP.
Se observó que la administración del péptido
PrRP20 o su fragmento C-terminal PrRP8
intravenosamente a un animal incrementa la presión sanguínea
arterial. El incremento en la presión sanguínea es importante, por
ejemplo, en el tratamiento de shock y también en otras situaciones
en las que disminuye la presión sanguínea. Esto indica que el
bloqueo de receptores del C-terminal de PrRP en el
sistema nervioso central, especialmente en la médula oblongata, y
periferia es un mecanismo útil en el tratamiento de la presión
sanguínea elevada.
En los experimentos realizados se observó el
péptido PrRP20 intratecal no modulaba el dolor agudo, el dolor
neuropático o la analgesia de morfina, lo cual concuerda con la
ausencia de expresión del gen del péptido y de inmunoreactividad en
la médula espinal. Sin embargo, cuando se administra directamente
en el núcleo del tracto solitario, el péptido presenta un efecto
analgésico potente en la prueba de la presión de la pata. En la
médula ventrolateral, el péptido presentaba un efecto hiperalgésico
suave. En la sustancia gris central el péptido no era eficaz
excepto en animales neuropáticos. Los resultados sugieren que el
PrRP20 presenta efectos específicos de sitio en la analgesia, los
cuales no resultan mimetizados por el péptido
C-terminal más corto PrRP8.
También resulta evidente que una persona que
sufre un trastorno regulado por un receptor localizado en el
sistema nervioso central puede ser tratada administrando a dicha
persona un antagonista o agonista del receptor de PrRP. Los
agonistas y antagonistas del péptido PrRP20 que actúan a través del
receptor correspondiente resultan útiles en el tratamiento de dolor
agudo, dolor inflamatorio y dolor neuropático.
Se pueden proporcionar composiciones terapéuticas
que comprenden el péptido PrRP o sus fragmentos
C-terminales con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Se ha realizado la administración intravenosa de
PrRP o su octapéptido C-terminal a ratas con dosis
de 18-220 \mug/kg para regular la presión
sanguínea, y la administración intratecal con dosis de
0,5-10 nmoles para tratar el dolor. En el caso de
los humanos la dosis por peso es probablemente menor.
Además de la regulación autonómica y sensorial,
los datos de la expresión génica sugieren que el PrRP puede estar
implicado en varias otras funciones. Se ha observado previamente
que la área hipotalámica central entre los núcleos dorsomedial y
ventromedial contiene células inmunoreactivas para péptidos
RF-amida (Kivipelto et al., 1989, 1991).
Estas células envían proyecciones a las áreas límbica y medular,
incluyendo la amigdala y el nts (Aarnisalo y Panula, 1995). Por lo
tanto estas células se encuentran localizadas críticamente en el
hipotálamo para unir los centros reguladores autonómicos medulares
con el sistema límbico (Panula et al., 1996). Es probable que
el PrRP, o un péptido muy relacionado, juegue papeles cruciales en
la regulación de las funciones límbicas.
La expresión del receptor de PrRP en el núcleo
reticular talámico sugiere que un péptido de tipo PrRP puede
regular el "gating" de la información cortical modulando la
entrada talámica al córtex. Esto indicaría que los péptidos
RF-amida, incluyendo el PrRP, aunque no son
prominentes en áreas corticales, pueden participar en la regulación
de funciones superiores incluyendo la atención, estado de alerta y
memoria, y epilepsia, a través de los sistemas talámico y
límbico.
La invención también sugiere que se puede
proporcionar un procedimiento de activación de los receptores de
RF-amida en las células lactotropas para inducir la
liberación de prolactina y desarrollar así ligandos específicos del
receptor utilizando análisis de unión de péptidos
RF-amida sobre las membranas de estas células, o la
liberación de prolactina como ensayo.
También es posible proporcionar procedimientos de
diagnóstico para la identificación de trastornos genéticos que
implican alteraciones de la función nerviosa y hormonal. Los
procedimientos de diagnóstico para los trastornos hormonales y del
SNC, incluyendo los asociados con la reproducción femenina y
lactancia, dolor o regulación autonómica, o fertilidad masculina,
pueden estar basados en la secuencia de la área codificante o
dominio regulador del gen PrRP. Estos procedimientos pueden
utilizar el antisuero específico desarrollado en la presente
invención contra los dominios N- y C-terminal del
PrRP20.
La presente invención se describirá más
detalladamente haciendo referencia a los ejemplos siguientes no
limitativos.
Se utilizaron los cebadores siguientes para
clonar un receptor muy parecido al que se ha descrito que responde
al PrRP en ensayos biológicos:
CGAATTCCTCAGATGACACGCTGACGGTCATATTCT
GGAATTCAGGTGGCCATGACCTCACTGACCCCTGG
Los cebadores se diseñaron a partir de la
secuencia publicada de UHR-1 (Welch et al.,
1995). El receptor clonado de rata (SEC ID Nº 2) presentaba 4 bases
sustituidas resultando en 3 aminoácidos diferentes en comparación
con el receptor descrito previamente (Welch et al., 1995) y
era distinto del receptor de PrRP descrito (Hinuma et al.,
1998). La secuencia humana correspondiente también fue desvelada
(SEC ID Nº 3). El receptor humano clonado presentaba una base
diferente respecto a la secuencia descrita por Hinuma et
al., resultando en una diferencia de un aminoácido (Hinuma et
al., 1998). Las secuencias se muestran en las figuras 12 y
13.
Para la síntesis de ADNc se aisló ARN a partir de
cerebro de rata lactante mediante RNazol B (Tel Test, Inc., TX,
USA). La síntesis de la cadena de ADN complementaria se realizó con
transcriptasa reversa M-MuLV (Pharmacia). Este ADNc
se utilizó como molde en la amplificación por PCR con Dynazyme II
polimerasa (Finzymes) utilizando los cebadores mencionados
anteriormente:
95ºC durante 1 min, 55ºC durante 30 s, 72ºC
durante 30 s y repitiendo durante un total de 30 ciclos.
El programa se realizó a través de un gradiente
de temperatura (T = 58ºC +/- 10ºC) con Mastercycler Gradient Machine
(Eppendorf).
Los péptidos
TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (correspondiente a PrRP20)
(SEC ID Nº:1) y el fragmento C-terminal
GIRPVGRF-NH2 (correspondiente a PrRP8) se
sintetizaron utilizando un sistema en fase sólida, y se purificaron
mediante carreras en serie en HPLC en fase inversa. La pureza se
confirmó a partir de un pico de HPLC único utilizando un análisis
por espectrometría de masas. Los péptidos se acoplaron a
hemocianina de lapa californiana succinilada (KLH; Sigma, St. Louis,
MO) con
1-etil-3,3(dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAC; Sigma) tal como había sido descrito previamente (Panula
et al., 1982) y se produjeron los antisueros en conejos.
Los mismos péptidos también fueron sintetizados
como péptidos con antigenicidad múltiple (MAPs) para facilitar la
producción de anticuerpos. Los MAPs se inyectaron intradérmicamente
a conejos con 500 \mug del conjugado del péptido MAP con 500
\mul del adyuvante completo de Freund. Tras cinco semanas, se
realizó una inyección de refuerzo (300 \mug del conjugado en 500
\mul del adyuvante incompleto de Freund). Se recogieron los
sueros y se ensayó la presencia de anticuerpos contra péptidos de
tipo PrRP utilizando puebas de dot-blot e
inmunocitoquímica utilizando secciones de cerebro a través de áreas
que contienen el ARNm de PrRP. Se generaron antisueros específicos
que reconocían estructuras neuronales en el cerebro y no
proporcionaban tal reacción cuando se preadsorbían con los péptidos
correspondientes.
Los oligonucleótidos para la hibridación in
situ se generaron con un sintetizador de ADN de acuerdo con las
secuencias publicadas de NPFF, PrRP y receptor de PrRP de rata. Las
sondas para NPFF (CAA GCA TTT CTA CCA AAC CTC TGG GGC TGA AAC AAG
AAG GCT GGG TTC CTT CTA y GGG AAG TGA TTT TGC ATG CAG ACA TAT CAC
AGC AGA TGA TGT TAC TTC TT), PrRP (TTG ATA CAG GGG TTC TTGG TCT CCA
TGG AGT GCT GGT GGG CTC GGCC CTG GA), receptor de PrRP relacionado
con GRP10/UHR-1 (TGC GC TCT GGG AAC CGT CGC AGA CAC
ATT GCT CTC TGA AGC CTC TGC ACT y AGC GCC AGC ACT GCA GAT AGA GCC
CAG ATG CCC AGC ACA GCG TAG GCG CTG) se marcaron con desoxiadenosina
5'-\alpha(tio)trifosfato (^{35}S)
(NEG-034H) (DuPont NEN Research products, Boston,
MA, USA) en sus extremos 3' utilizando desoxinucleótido transferasa
terminal (Promega, Madison, WI, USA) según el protocolo del
fabricante. Las purificaciones se realizaron en columnas Sephadex
G-50. Las sondas marcadas con actividades
específicas de 1-2 x 10^{9} cpm/\mug se
guardaron a -20ºC en ditiotreitol (DTT) 10 mM hasta su utilización.
Un sonda oligonucleótidica de 50-mer complementaria
a la cloramfenicol acetiltransferasa de Staphylococcus Aureus
se utilizó como uno de los controles.
El procedimiento utilizado para la hibridación
in situ con sondas oligonucleotídicas ha sido descrito con
anterioridad (Dagerlind et al., 1992) y se utilizó con
modificaciones mínimas. Antes de la hibridación con sondas
oligonucleotídicas, las secciones se dejaron secar al aire a
temperatura ambiente durante 30 min. Los portaobjetos se iluminaron
con luz UV durante 5 min a una distancia de 25 cm para incrementar
la hibridación (Schambra et al., 1994). Las secciones se
hibridaron durante 20-24 h a 45ºC (PrRP), 50ºC
(receptor de PrRP) o 55ºC (NPFF) en una cámara humidificada con 200
\mul de tampón de hibridación que contenía formamida desionizada
al 50%, 4 x SSC (cloruro sódico 0,6 M, citrato sódico 0,06 M), 1 x
solución de Denhardt (0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de
Ficoll, 0,02% de albúmina de suero bovino) 1% de sarcosil
(N-lauroilsarcosina), fosfato sódico 0,02 M (PB; pH
7,0), 10% de dextrano sulfato, 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado (ADNss), 250 \mug/ml de ARN de
transferencia (ARNt), DTT 200 mM y 10^{7} cpm/ml de la sonda
marcada (NPFF, PrRP o receptor de PrRP) o de la sonda control de
cloramfenicol acetiltransferasa de S. aureus. Después de la
hibridación, los portaobjetos se sumergieron en 1 x SSC a
temperatura ambiente, se lavaron brevemente con 1 x SSC a 56ºC y
seguidamente tres veces durante 20 min a 56ºC con 1 x SSC. Se
dejaron enfriar hasta temperatura ambiente en 1 x SSC a 56ºC nuevo
antes de la deshidratación con etanol (una inmersión en agua
destilada y seguidamente 30 seg en cada uno de etanol al 60%, al 80%
y etanol absoluto). Seguidamente las secciones de tejido se
colocaron en Kodak BioMax MR-film durante 10 días y
tras ello se sumergieron en la emulsión Kodak NTB2 y se expusieron
durante 50 días. Como control adicional, junto con la sonda de
cloramfenicol acetiltransferasa de S. Aureus, se realizó una
hibridación competitiva con un exceso de 100 veces del
oligonucleótido de NPFF, PrRP o receptor de PrRP sin marcar en el
tampón de hibridación, para eliminar toda la señal de hibridación
específica. Los portaobjetos representativos de todas las áreas del
cerebro se tiñeron con azul de toluidina o violeta de cresilo para
permitir la identificación de núcleos del cerebro, neuronas.
Los dos genes que codificaban péptidos
RF-amida (NPFF y PrRP) se expresaban en áreas clave
del cerebro que se sabe que están implicadas en la regulación de la
presión sanguínea y funciones coronarias, y en la regulación
hormonal. Específicamente, el PrRP se expresaba en la médula
oblongata dorsal, incluyendo el núcleo del tracto solitario y la
médula ventrolateral, y en el hipotálamo central. El NPFF se
expresaba en el núcleo del tracto solitario, en el núcleo trigémino
espinal y en el núcleo supraóptico y paraventricular del
hipotálamo. El NPFF pero no el PrRP se expresaba en el cuerno dorsal
de la médula espinal.
El receptor de péptidos RF-amida
relacionado con GPR10 se expresaba en el hipotálamo central, núcleo
reticular talámico y médula oblongata, en particular en la área
postrema.
La cuantificación de las películas
autoradiográficas de la hibridación in situ se realizó
digitalizando las imágenes de las películas con un sistema
informático de análisis de imágenes MCID (Imaging Research, St.
Catherines, Ontario, Canadá) y midiendo diferentes áreas del cerebro
en valores píxel en escala de grises. La densidad óptica relativa se
convierte a un valor lineal de escala de grises basado en una curva
de ^{14}C estándar derivada apropiadamente esencialmente tal como
se describe en nuestras publicaciones anteriores (Lintunen et
al., 1998, Vilim et al., 1999).
La inmunocitoquímica se realizó utilizando
antisuero específico contra el C-terminal de los
dos péptidos activos, NPFF y NPSF, presentes en el precursor de
NPFF, y PrRP. Ratas Wistar (250-300 g) macho
normales o tratadas con colchicina fueron sometidas a perfusión con
paraformaldehído al 4% y las secciones del cerebro se procesaron
para la inmunofluorescencia según lo descrito (Kivipelto et
al., 1989). El antisuero primario se diluyó 1:500 - 1:20000, y
se realizaron controles de preadsorción con varios péptidos según
lo descrito con anterioridad (Kivipelto et al., 1989).
Con fines comparativos, los antisueros contra los
péptidos NPFF y NPSK relacionados con el gen NPFF se aplicaron de
modo similar. Los datos para el PrRP se ilustran en la fig.2.
La inmunocitoquímica con anticuerpos contra NPSF,
un péptido RF-amida típico, reveló extensas redes
de fibras y terminales en el núcleo parabranquial lateral, el
núcleo del tracto solitario, la médula ventrolateral, amigdala, el
núcleo del lecho de la estría medular, y varios núcleos
hipotalámicos. El antisuero era específico del
C-terminal, lo cual sugiere que la
inmunolocalización representa un grupo de péptidos relacionados. La
inmunocitoquímica del PrRP verificó los resultados obtenidos para el
ARNm correspondiente por hibridación in situ y confirmó que
los péptidos derivados del gen PrRP se forman y almacenan en áreas
reguladoras clave de la médula. Se observaron neuronas grandes que
presentan una inmunoreactividad fuerte para
TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (PrRP20-ir)
en la parte comisural del núcleo del tracto solitario. Se observó
que las proyecciones de fibras emanaban desde esta área se
extendían en las direcciones anterior y posterior y en la dirección
ventrolateral. Se observaron redes terminales extensas en otras
partes del núcleo del tracto solitario, complejo trigeminal y
varios núcleos de la médula oblongata ventral y lateral, núcleo
parabranquial lateral y medial y sustancia gris periacueductal
ventrolateral. También se observaron cuerpos celulares nerviosos en
la médula ventrolateral y el hipotálamo en el nivel de los núcleos
dorsomedial y ventromedial. También se observaron fibras en varios
sitios hipotalámicos, más notablemente en la eminencia media con el
antisuero orientado al C-terminal, y en las áreas
paraventricular y periventricular e hipotálamo lateral tanto con el
antisuero orientado al C-terminal como el orientado
al N-terminal. De las áreas límbicas, el núcleo del
lecho de la estría terminal y el septum lateral mostraron redes
distintas de fibras. Las redes densas de fibras en las áreas
hipotalámicas paraventricular y lateral indican la implicación del
PrRP en la regulación de la ingestión de alimentos.
Se aplicó el modelo de Kim y Chung tal como se
había descrito anteriormente (Kontinen et al., 1997). Los
animales se anestesiaron con halotano, y se expusieron los nervios
espinales izquierdos L5 y L6, se aislaron y se ataron fuertemente
con hilo de seda 6-0. Las ratas, que desarrollaron
una alodinia mecánica significativa (umbral para la retirada de
pata tras la estimulación mediante filamentos de von Frey con una
fuerza de 4,2 g o inferior), se utilizaron después de dos semanas
de la ligación. Se realizó la canulación intratecal según lo
descrito (Kontinen et al., 1997).
Los resultados de las inyecciones intratecales se
presentan en la figura 5. En la figura se puede observar que el
PrRP intratecal no presentaba un efecto sobre el dolor en este
modelo. El PrRP20 en el NTS así como en el PAG presentaban un
efecto antialodínico significativo en animales neuropáticos (Fig.
9).
La respuesta de retiro de la cola inducida por
calor se determinó utilizando un dispositivo de calor radiante. EL
haz de calor se dirigió a la cola y se midió el tiempo de retiro de
la cola.
La administración intratecal de PrRP reveló que
los péptidos resultaban ineficaces a nivel de la médula espinal. En
ratas normales, no se observaron efectos antinociceptivos
significativos (ensayo del retiro de la cola) con el PrRP o su
fragmento octapéptido C-terminal a dosis de 0,5, 5 ó
10 nmoles (fig. 5A). Una dosis i.t. de 5 nmoles no modificó
significativamente el efecto antinociceptivo de la morfina (fig.
5B). En ratas neuropáticas, dosis i.t. de 5 ó 10 nmoles del
octapéptido C-terminal no alteró la alodinia por
frío o la alodinia mecánica. La inyección del péptido PrRP20 en el
NTS indujo una fuerte antinocicepción tras la estimulación
mecánica. El efecto era evidente 5 minutos después de la
administración, máximo <20 min (fig.6). El PrRP8 resultaba
ineficaz en el NTS (fig. 6). En la médula ventrolateral (CVLM), una
inyección similar de PrRP20 indujo una hiperalgesia suave (fig.
6B). En la sustancia gris periacueductal el péptido resultaba
ineficaz cuando se ensayaba en animales sanos (fig. 6B). El efecto
antinociceptivo inducido por inyecciones intracerebrales del
fármaco se ensayó en animales sanos utilizando la prueba de la
presión en la pata tal como se había descrito previamente (Wei et
al., 1998). La técnica de las inyecciones intracerebrales del
fármaco se ha descrito detalladamente en otros documentos (Wei
et al., 1998). El ensayo de la alodinia táctil se realizó
utilizando series de microfilamentos calibrados tal como se había
descrito previamente (Wei et al., 1998).
La administración del péptido en la sustancia
gris central de ratas neuropáticas presentaba un efecto
antialodínico (fig. 9B). En el NTS, el PrRP20 también presentaba un
efecto antialodínico dependiente de dosis en animales neuropáticos
(fig. 9A).
Las ratas se anestesiaron con pentobarbitona y se
dispusieron en un marco estereotáxico estándar. Para las
microinyecciones del fármaco en el CVLM o PAG se dispuso una cánula
guía en el tallo cerebral. Para las mediciones de la retirada del
tren posterior, se adhirió un dispositivo piezoeléctrico al tren
posterior. Para medir la presión sanguínea media, se dispuso un
catéter intraarterial en la arteria carótida y se conectó a un
transductor de la presión sanguínea calibrado (Harvard Apparatus
Inc.). El estímulo de calor nocivo (52ºC de 5 s de duración) se
aplicó desde un termoestimulador de contacto controlado por
retroalimentación (LTS3, Thermal Devices Inc.) a la piel glabra de
la pata posterior. Las respuestas se midieron en un osciloscopio de
almacenamiento digital.
La presión sanguínea basal, el aumento de la
presión sanguínea evocado por calor y la latencia de la retirada
del miembro evocada por calor se midieron antes de las inyecciones
del fármaco y a varios intervalos después de las inyecciones del
fármaco. Las mediciones de la presión sanguínea indicaron que el
PrRP20 en el CVLM facilita la respuesta de la presión sanguínea
evocada por calor (un reflejo somato-autonómico)
concomitantemente con la facilitación de la respuesta de retirada
del tren posterior evocada por calor (un reflejo somatomotor). Este
resultado presentado en las figs 7 y 8 indica que el PrRP20 en el
CVLM presenta efectos facilitadores sobre el dolor.
Las ratas se anestesiaron con uretano o
isoflurano y se canuló la vena y la arteria femoral. Se utilizó el
sistema de medición de Grass después de conectar el manómetro al
tubo arterial. Los péptidos TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2
(correspondiente a PrP20) y el fragmento C-terminal
GIRPVGRF-NH2 (correspondiente a PrRP8) se
inyectaron intravenosamente, y se midió la presión sanguínea
arterial.
Los resultados se muestran en las figuras 10 y
11. La inyección intravenosa del PrRP20 a una dosis de 220
\mug/kg (fig. 11) o su fragmento octapéptido
C-terminal PrRP8 a dosis de 18-126
\mug/kg (fig. 10) indujeron un incremento claro de la presión
sanguínea arterial (máximo de 70 o 60 mmHg en presión sistólica y 40
y 30 en presión diastólica, respectivamente), y un incremento en el
ritmo cardíaco (30-50 bpm, desde 360 a
390-420 lpm). En los mismos animales, la solución
salina no produjo ningún efecto (fig. 11A) y la fenilefrina indujo
una aumento claro de la presión.
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Pro Asp Ile Asn Pro AIa Trp Tyr Ala Gly
Arg Gly Ile Arg Pro}
\sac{Vat Gly Arg Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1122
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<212> DNA
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<213> Rat
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
Claims (2)
1. Utilización de un fragmento
C-terminal del péptido de liberación de prolactina
(PrRP) que presenta la secuencia aminoacídica
TPDINPAWYAGRGIRPVGRF-NH2 (SEC ID Nº:1) referenciada
como PrRP2, para la preparación de un medicamento destinado a tratar
el dolor.
2. Utilización de la reivindicación 1, en el que
dicho dolor es dolor agudo o dolor neuropático.
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