CN1390131A

CN1390131A - 肽的用途

Info

Publication number: CN1390131A
Application number: CN00815719A
Authority: CN
Inventors: 北田千惠子; 松本宽和; 日沼州司
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-11-18
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2003-01-08
Also published as: US20050209151A1; WO2001035984A1; EP1230928A4; KR20020058024A; CA2391872A1; EP1230928A1; AU1415301A

Abstract

本发明的配体和多肽,由于其具有调节CRH分泌作用,因此它可用作CRH分泌调节药物,其药物与CRH分泌相关的各种疾病的改善、预防与治疗有关,其疾病如醛甾酮过少症、低皮质醇血症、继发性及慢性肾上腺皮质机能减退、艾迪生病(怠倦、恶心、色素沉着、性功能降低、脱发、低血压)、肾上腺皮质功能不全、肥胖等。

Description

肽的用途

发明领域

本发明涉及生理活性肽的用途。进一步涉及肾上腺皮质受刺激后分泌的激素调节剂等(CRH)，该调节剂含有针对G蛋白质偶联型受体(以下称为受体)蛋白质的配体或多肽。

发明背景

很多激素或神经递质等通过细胞膜上特异性受体蛋白调节着生物机体的功能。很多这类受体蛋白通过活化它们所偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(以下简称G蛋白)而介导细胞内的信号传递。另外，这些受体具有共同结构，即7个跨膜区，因此总称为G蛋白偶联型受体蛋白或7跨膜型受体蛋白(7TMR)。

其中作为G蛋白偶联型受体蛋白，为众所周知的phGR3(或称为GPR10)基因编码的人型受体蛋白[Genomics，29，335(1995)]及与此相对应的大鼠型受体蛋白UHR-1[Biochem.Biophy.Res.Commun.，209，606(1995)]。

另外，众所周知PrRP[Nature，393，272-276(1998)]作为生理活性肽发挥所述phGR3及UHR-1的配体作用。

PrRP对垂体前叶激素有特异性生乳素释放作用[Nature，393，272-276(1998)，Biochem.Biophy.Res.Commun.第259卷第321-324页(1999)]，但是在脑内PrRP的作用不清。另外下丘脑的激素即促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的内在调节激素至今还不清楚。

发明公开

本发明人经过反复钻研首先制作了2种针对于PrRP识别不同部位的特异单克隆抗体以及高敏感度的PrRP测定系(Sandwich-EIA系)(WO99-60112号)。应用这个测定系对大鼠的PrRP的组织分布调查的结果与以前报道的〔Biochemical and Biophysical Research Communication，257卷264页(1999)〕PrRP除在脑内广泛分布外，在丘脑下部等部位分布较广保持一致。本发明者经过反复钻研，除乎人们的想象，可在脑脊液中检出PrRP的浓度是血液中的5-6倍并发现对CRH释放的调解作用。

即，本发明涉及，

(1)一种促肾上腺皮质激素释放素(CRH)的分泌调节剂，其含有针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐。

(2)上述(1)所述CRH的分泌调节剂，其中针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐为一种多肽或其酰胺或其酯或其盐，它们具有与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。

(3)上述(2)所述促肾上腺皮质激素释放素的分泌调节剂，其中SEQ IDNO：44所示氨基酸序列为SEQ ID NO：3、18或32所表示的氨基酸序列。

(4)上述(2)所述CRH的分泌调节剂，其中SEQ ID NO：45所示氨基酸序列为SEQ ID NO：6、21或35所表示的氨基酸序列。

(5)上述(1)所述CRH的分泌调节剂，其中针对G蛋白偶联型受体蛋白包括与SEQ ID NO：46所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。

(6)上述(1)所述的CRH分泌调解剂是CRH分泌的促进剂。

(7)上述(1)所述的CRH分泌调解剂是醛甾酮过少症，低皮质醇血症，继发性或慢性肾上腺皮质功能低下，艾迪生病(Addison病)，肾上腺功能不全或肥胖症的预防或治疗药物。

(8)一种CRH的分泌调节剂，其中所含有的化合物或其盐能够改变G蛋白偶联型受体蛋白及针对该G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽之间的结合性。

(9)为了制备含有CRH分泌调解作用的药物，使用针对G蛋白偶联型受体蛋白配体肽或酰胺或其酯或其盐，和

(10)一种CRH的分泌调节方法，其特征为，将针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐投药于哺乳动物。

附图说明

图1表明大鼠的脑室内注入PrRP-31表示由SEQ ID NO：32所示氨基酸序列肽的酰胺物。以下同)时血液中ACTH浓度的变化。图中，-○-表示对照溶液(磷酸缓冲盐溶液)，-●-为PrRP-31(1nmol)，-△-为PrRP-31(3nmol)，-■-为PrRP-31(10nmol)。ACTH浓度用测定值±标准差表示。另外，^**表示标准的有意差为1％(n＝6-8)，^*表示标准的有意差为5％(n＝6-8)。

图2表明大鼠的脑室内注入PrRP-31时血液中β-内啡肽浓度的变化。图中-○-表示对照溶液(磷酸缓冲盐溶液)，-●-为PrRP-31(1nmol)，-△-为PrRP-31(3nmol)，-■-为PrRP-31(10nmol)。β-内啡肽浓度用测定值±标准差表示。另外，^*表示标准的有意差为5％(n＝6-8)。

图3表明抗-CRF IgG和正常兔子IgG从颈静脉注入30分钟后，再次给大鼠的脑室内注入PrRP-31时，血液中ACTH浓度的变化。图中，-○-表示给予对照溶液(磷酸缓冲盐溶液)后，给予PrRP-31(10nmol)，-△-为给予正常兔子IgG后，给予PrRP-31(10nmol)，-●-为给予抗-CRF IgG后，给予PrRP-31(10nmol)。

图4表示大鼠经颈静脉注入抗-CRF IgG和正常兔子IgG，30分钟后脑室内注入PrRP-31时，血液中β-内啡肽浓度的变化。图中-○-表示给予对照溶液(磷酸缓冲盐溶液)后，给予PrRP-31(10nmol)，-△-为给予正常兔子IgG后，给予PrRP-31(10nmol)，-●-为给予抗-CRF IgG后，给予PrRP-31(10nmol)。β-内啡肽浓度用测定值±标准差表示。另外，^*表示标准的有意差为5％(n＝6-8)。

图5表明负重游泳时脑脊液中PrRP-31浓度的变化。

图6表明负重游泳时血液中ACTH浓度的变化。ACTH浓度用测定值±标准差表示。另外，^**表示标准的有意差为1％(n＝7-8)。

图7表明从大鼠颈静脉注入α-helicalCRF和生理盐水15分钟后脑室内注入PrRP-31时，血液中ACTH浓度的变化。图中，-●-为给予生理盐水后，给予PrRP-31(10nmol)，-○-表示给予α-helicalCRF后，给予PrRP-31(10nmol)。ACTH浓度用测定值±标准差表示。另外，^**表示标准的有意差为1％(n＝7-8)，^*表示标准的有意差为5％(n＝7-8)。

实施发明的最佳方案

在说明书和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下述例示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，均指L形式。

DNA ：脱氧核糖核酸

cDNA ：互补的脱氧核糖核酸

A ：腺嘌呤

T ：胸腺嘧啶

G ：鸟嘌呤

C ：胞嘧啶

RNA ：核糖核酸

mRNA ：信使核糖核酸

ATP ：腺苷三磷酸

EDTA ：乙二胺四乙酸

SDS ：十二烷基硫酸钠

EIA ：酶免疫测定

Gly或G：甘氨酸

Ala或A：丙氨酸

Val或V：缬氨酸

Leu或L：亮氨酸

Ile或I：异亮氨酸

Ser或S：丝氨酸

Thr或T：苏氨酸

Cys或C：半胱氨酸

Met或M：蛋氨酸

Glu或E：谷氨酸

Asp或D：天冬氨酸

Lys或K：赖氨酸

Arg或R：精氨酸

His或H：组氨酸

Phe或F：苯丙氨酸

Tyr或Y：酪氨酸

Trp或W：色氨酸

Pro或P：脯氨酸

Asn或N：天冬酰胺

Gln或Q：谷氨酰胺

pGlu ：焦谷氨酸

Me ：甲基

Et ：乙基

Bu ：丁基

Ph ：苯基

用下列符号表示本说明书中多次使用的取代基、保护基以及试剂：

BHA ：二苯甲基胺

pMBHA ：对甲基二苯甲基胺

Tos ：对甲苯磺酰基

CHO ：甲酰基

HONB ： N-羟基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亚胺

OcHex ：环己酯

Bzl ：苄基

Cl2-Bzl：二氯苄基

Bom ：苄氧甲基

Z ：苄氧羰基

Br-Z ： 2-溴苄氧羰基

Boc ：叔丁氧基羰基

DCM ：二氯甲烷

HOBt ： 1-羟基苯并三唑

DCC ： N，N′-二环己基碳二亚胺

TFA ：三氟乙酸

DIEA ：二乙丙基乙胺

Fmoc ： N-9-芴基甲氧基羰基

DNP ：二硝基苯酚

Bum ：叔丁氧基甲基

Trt ：三苯甲基

关于本说明书「基本相同」指的是多肽的活性(如配体和受体的结合活性等)或者是多肽的CRH分泌调节作用等(如促进CRH的分泌或抑制CRH分泌作用等)。因此，「基本相同」的氨基酸序列指的是多肽的活性，如配体和受体的结合性(如配体和受体的结合性等)和多肽的CRH分泌调节作用(如促进CRH的分泌或抑制CRH分泌作用等)等只要保持在其活性或作用基本一致(没有显著变化)的情况下允许其氨基酸序列发生变异。

我们都知道，在氨基酸序列中有关编码多肽氨基酸的置换，欠缺或插入等的变异，一般来说多肽的生理特性和化学特性不会发生大的变化。作为氨基酸置换的例子，置换与被置换的氨基酸的性质相似，一般认为，特性相似性很强的氨基酸之间进行相互置换，其多肽与置换前相比其特性变化很小。

氨基酸根据其特性的相似性规定其分类标准：例如(i)非极性(疏水性)氨基酸包括：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等。(ii)极性(中性)氨基酸包括：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等。(iii)带正电荷(碱性)氨基酸包括：精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。(iv)带负电荷(酸性)氨基酸包括：天冬氨酸、谷氨酸等。

在本说明书中，所研究的氨基酸序列中，作为[基本相同]的置换氨基酸，大多是从氨基酸所属分类中特性类似的其他氨基酸中选出的。

在本发明中，诸如在有置换、缺失或插入等变异的氨基酸序列中没有对原来(无变异)多肽的生理活性或化学特性带来重大(显著)变化的多肽(变异型多肽)被看作是基本与原来(无变异)的多肽相同，而且其变异型多肽的氨基酸序列被看作是基本与原来(无变异)的多肽相同。

构成本发明多肽的氨基酸可为D构型或L构型，若没有特别说明优选L构型。

本发明多肽是一种针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐，也就是说，是一种能够与G蛋白偶联型受体蛋白结合的配体多肽或其酰胺或其酯或其盐，具体实例为，含有与SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽或其酰胺或其酯或其盐(以下，通常简称为配体多肽或多肽)。

其中，所说G蛋白偶联型受体蛋白是一种具有共同结构的、7个跨膜区的受体蛋白，大多数受体蛋白通过活化它们所偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白而介导细胞内的信号传递。

SEQ ID NO：44所示的该氨基酸序列优选SEQ ID NO：3、18或32所示氨基酸序列，尤其优选SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO：45所示的该氨基酸序列优选SEQ ID NO：6、21或35所示氨基酸序列，尤其优选SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。

本发明中的该多肽来自于人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴子等)所有组织(例如，垂体、胰腺、脑、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心脏等)或细胞等的多肽，具体地说，其多肽可以是含有与SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列、优选与SEQ ID NO：3、18或32或者与SEQ ID NO：6、21或35所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。

例如，作为本发明的该配体多肽其实例为，含有SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列、优选含有SEQ ID NO：3、18或32或者SEQ ID NO：6、21或35所示氨基酸序列的多肽等，另外，还含有与SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列、优选含有与SEQ ID NO：3、18或32或者与SEQ ID NO：6、21或35所示氨基酸序列的同源性约为50-99.9％(优选70-99.9％、更优选80-99.9％、最优选90-99.9％)的多肽，并含有与SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列、优选含有与SEQ ID NO：3、18或32或者与SEQ ID NO：6、21或35所示氨基酸序列的活性基本相同的多肽。该活性有，例如受体结合活性、信号传导活性等、该配体多肽所具有的活性多肽的CRH分泌调节作用(如，促进CRH分泌作用，抑制CRH分泌作用)等等。所说活性[基本相同]是指，该受体结合活性多肽的CRH分泌调节作用(如，促进CRH分泌作用，抑制CRH分泌作用)等特性相同。因此，既可认为该受体结合活性大小不明显，该配体多肽分子量的不同又不影响其结合活性。对于人或温血动物属于同一分类属来说，有时由于基本相同的肽其来源种类不同会认为其肽氨基酸序列的差异为非本质性的，作为本发明该多肽也属于这类肽，即，氨基酸序列上的差异为非本质性的。

下面详细说明本发明配体多肽的制造方法和用途。

作为本发明配体多肽，其具体实例有，来自大鼠、牛、人或小鼠的多肽其含有SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列。(另外，在SEQ ID NO：44中第3位的Xaa为Thr或Ala，第5位的Xaa为Arg或Gln，第10位的Xaa为Ile或Thr，第21位的Xaa为Thr或Ala，第22位的Xaa为Gly或Ser，在SEQ ID NO：45中，第10位的Xaa为Thr或Ala，第11位的Xaa为Gly或Ser。)

本发明的该配体多肽还包含下列氨基酸序列的多肽或其酰胺或其酯或其盐：

(i)SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中1-15个氨基酸被其他氨基酸置换，优选1-10个，更优选1-5个、

(ii)SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中缺失1-15个氨基酸，优选1-10个，更优选1-5个、

(iii)SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中附加(插入)1-15个氨基酸，优选1-10个，更优选1-5个、再者，

(iv)上述(i)、(ii)或(iii)中所述组成多肽的氨基酸(尤其是其侧链)被修饰。进一步，本发明的该配体多肽还包含下列氨基酸序列的多肽或其酰胺或其酯或其盐：

(v)SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中1-10个氨基酸被其他氨基酸置换，优选1-5个、

(vi)SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中缺失1-10个氨基酸，优选1-5个、

(vii)SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中附加(插入)1-10个氨基酸，优选1-5个、

(viii)上述(v)、(vi)或(vii)中所述组成多肽的氨基酸(尤其是其侧链)被修饰。本发明的该配体多肽还包含氨基酸序列的多肽或其酰胺或其酯或其盐：

本发明的该配体多肽，通过在其氨基酸序列中记载(i)至(viii)

所述的置换、缺失、附加、修饰等可以导致该配体多肽发生变异(变换)使之成为一种对热或蛋白水解酶稳定的稳定型配体多肽或，成为一种该配体多肽所具有高活性的高活性型配体多肽。本发明的该配体多肽或其酰胺或其酯或其盐也包含这些变异型配体多肽。

在本说明书中，按照惯例肽的标记描述，左端为N末端(氨基端)，右端为C末端(羧基端)。

本发明多肽中氨基酸的修饰之例有，例如，Gln的N端在生物机体内被切割，该Gln成为被焦谷氨酸化。

本发明的多肽，如SEQ ID NO：44或45所示多肽其C末端氨基酸残基的a-羧基通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO^-)，但是C末端氨基酸残基的该羧基也可以为酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)。其中-COOR所示该酯的R有，例如，C_1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基；C_3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C_6-12芳基包括苯基和a-萘基等；苯基-C_1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；C_7-14芳烷基如a-萘基C_1-2烷基，其又如a-萘甲基，或二苯基C_1-2烷基，其又如二苯甲基，此外还有通常适用于口服给药的酯如三甲基乙酰氧甲基。

又，本发明的多肽，如SEQ ID NO：44或45所示多肽，当其C末端以外有羧基或羧酸根时，这些基团被酰胺化或被酯化的多肽也包含在本发明多肽范畴之内。此时的酯基例如与所述C末端氨基酸残基的酯基相同。

作为本发明配体多肽最优选C末端氨基酸残基的羧基为酰胺。其中优选含有SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列的多肽中的SEQ ID NO：3、6、18、21、32或35所示氨基酸序列的多肽(尤其是SEQ ID NO：32或35所示多肽)，其多肽C末端氨基酸残基的羧基为酰胺的多肽。

本发明多肽之盐可以与生理上可接受的碱(如碱金属)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐，优选生理上可接受的酸加成盐。这类的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。

本发明配体多肽，(i)既可通过人或其它温血动物细胞或组织纯化多肽的方法来制备，(ii)又可以用公知的方法制备多肽。(iii)再可通过培养含有随后所述多肽之编码DNA的转化体来制备。

(i)当从人或温血动物组织或细胞中制备该配体多肽时，首先将人或温血动物组织或细胞匀浆，然后用酸等抽提，通过反向层析、离子交换层析、亲和层析法等多种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。

(ii)该配体多肽又可用公知的多肽合成方法制备。其肽的合成法，例如可以用固相合成法和液相合成法的任意一种。即，当能够构成配体多肽的部分肽或氨基酸与其残余部分缩合，其产物有保护基时，通过除去保护基团可以制备目的肽。此时的公知缩合方法或除去保护基团方法例如在下列1)-5)中均有描述：

1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti：肽的合成，Interscience Publishers，纽约(1966)

2)Schroeder和Luebke：肽，Academic Press，纽约(1965)

3)泉屋信夫等：多肽合成的基础与实验，丸善公司(1975)

4)矢岛治明和榊原俊平：生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)

5)矢岛治明主编：药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店

其中(ii)中所述的该配体多肽合成法，可有以下方法。

为了合成本发明配体多肽的酰胺物，可以使用可用于肽合成的树脂，它适合酰胺形式。这类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂，4-甲基二苯甲胺树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂，聚丙烯酰胺树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些α-氨基及其侧链上功能基团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标多肽的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将多肽从树脂上切除下来，同时除去各种保护基团，以获得目标多肽。

进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用多肽合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。其碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。

用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBt)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于肽缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如二氯甲烷和氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；叔胺类如吡啶等、醚类如二恶烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于肽成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应程度；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化，以消除对后续反应的可能负影响。

用于该肽合成时保护初始氨基的保护基团有，例如：Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc。其羧基的保护基团有，例如所述的C_1-6烷基、C_3-8环烷基、C_7-14芳烷基、2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基，苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基以及三苯甲基酰肼基。

丝氨酸以及苏氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C_1～6烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基。

适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有，例如Bzl、Cl₂-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。

适于保护组氨酸中咪唑基的基团有，Tos、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。

本发明配体多肽或其酰胺或其酯可为例如，含有与所述SEQ ID NO：44或45所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的多肽，只要有与这种多肽相同的CRH分泌调节作用，即使其氨基酸序列发生变异也无妨碍。这类肽可为，例如SEQ ID NO：44所示氨基酸序列，其中，缺失了1-20个氨基酸序列的肽。具体地优选下列肽，例如，(a)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第2位至第31位的氨基酸序列；(b)其多肽具有SEQ IDNO：44所示氨基酸序列中第3位至第31位的氨基酸序列；(c)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第4位至第31位的氨基酸序列；(d)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第5位至第31位的氨基酸序列；(e)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第6位至第31位的氨基酸序列；(f)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第7位至第31位的氨基酸序列；(g)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第8位至第31位的氨基酸序列；(h)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第9位至第31位的氨基酸序列；(i)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第10位至第31位的氨基酸序列；(j)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第11位至第31位的氨基酸序列；(k)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第12位至第31位的氨基酸序列；(l)其多肽具有SEQ IDNO：44所示氨基酸序列中第13位至第31位的氨基酸序列；(m)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第14位至第31位的氨基酸序列；(n)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第15位至第31位的氨基酸序列；(o)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第16位至第31位的氨基酸序列；(p)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第17位至第31位的氨基酸序列；(q)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第18位至第31位的氨基酸序列；(r)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第19位至第31位的氨基酸序列；(s)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第20位至第31位的氨基酸序列；(t)其多肽具有SEQ ID NO：44所示氨基酸序列中第21位至第31位的氨基酸序列

与其SEQ ID NO：44所示氨基酸序列，莫不如优选SEQ ID NO：3、18或32所示氨基酸序列，其示例与SEQ ID NO：44所示氨基酸序列一样允许有变异。

又，可以从具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列的肽中举出缺失了1-10个氨基酸的氨基酸序列肽之例。具体优选下列肽：例如，(a)其肽具有SEQ IDNO：45所示氨基酸序列中第2位至第20位的氨基酸序列；(b)其肽具有SEQID NO：45所示氨基酸序列中第3位至第20位的氨基酸序列；(c)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第4位至第20位的氨基酸序列；(d)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第5位至第20位的氨基酸序列；(e)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第6位至第20位的氨基酸序列；(f)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第7位至第20位的氨基酸序列；(g)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第8位至第20位的氨基酸序列；(h)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第9位至第20位的氨基酸序列；(i)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第10位至第20位的氨基酸序列；(j)其肽具有SEQ ID NO：45所示氨基酸序列中第11位至第20位的氨基酸序列。

又，作为本发明的配体多肽，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15氨基酸序列含有来源于大鼠全脑或牛丘脑下部的多肽等，关于这些多肽SEQ IDNO：44或45所示氨基酸序列中可以有变异。另外，其中包括SEQ ID NO：44或45所示的氨基酸序列这些多肽可作为多肽的前体。

进一步，作为本发明的配体多肽，除上述外还有SEQ ID NO：4，5，7，8，19，20，22，23，33，34，36，37所示氨基酸序列的多肽等，关于这些配体多肽象SEQ ID NO：45那样所示氨基酸序列中可以有变异。

与其SEQ ID NO：45所示氨基酸序列，莫不如优选于SEQ ID NO：6、21或35所示氨基酸序列，其示例与SEQ ID NO：45所示氨基酸序列一样其氨基酸序列中可以有变异。

本发明的配体多肽可以和其他蛋白质(如机能或性质为众所周知的蛋白质)结合形成结合蛋白。

编码本发明配体多肽的DNA可为任意一种含有编码与本发明SEQ IDNO：44或45所示氨基酸序列相同或基本相同氨基酸序列的多肽的碱基序列。它们可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。用于上述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的RNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增。

更具体地说，编码含有SEQ ID NO：1或15的氨基酸序列并来自大鼠脑部或牛下丘脑多肽的DNA，一般使用SEQ ID NO：2所示碱基序列的DNA等。

此时，在SEQ ID NO：2中第129位的R为G或A，第179位及240位的Y为C或T。当第179位的Y为C时，编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，当第179位的Y为T时，编码SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

编码含有SEQ ID NO：3、4、5、6、7或8所示氨基酸序列并来自牛的多肽的DNA，可以分别使用具有SEQ ID NO：9、10、11、12、13或14所示碱基序列的DNA等。此时，在SEQ ID NO：9、10、11中第63位的R及SEQID NO：12、13、14中第30位的R为G或A。

编码含有SEQ ID NO：16、18、19、20、21、22或23所示氨基酸序列并来自大鼠多肽的DNA，可以分别使用具有SEQ ID NO：17、24、25、26、17、28或29所示碱基序列的DNA等。

编码含有SEQ ID NO：30、32、33、34、35、36或37所示氨基酸序列并来自人的多肽的DNA，可以分别使用具有SEQ ID NO：31、38、39、40、41、42或43所示碱基序列的DNA等。

又，在本发明中编码含有SEQ ID NO：1、15所示氨基酸序列的牛型多肽、SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的大鼠型多肽或SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的人型多肽的DNA，其中优选使用含有部分碱基序列的DNA片段例如6-90个碱基(优选6-60个，更优选9-30个，最优选12-30个)作DNA检测探针。

(iii)关于本发明的多肽，使用下列载体转换体的培养方法可以制造编码本发明多肽的DNA

作为完全编码本发明多肽DNA的克隆方法(克隆化)，按照下列方法进行。即，(1)首先合成含有部分本发明多肽碱基序列的DNA，用该DNA作为引物，再根据公知的PCR法进行完全编码该多肽DNA的扩增，或者(2)通过与标记物杂交筛选，此标记物是用，例如编码具有该配体多肽的部分或全部的DNA片段或合成DNA，标记cDNA或基因组DNA、或将其DNA片段插入到合适载体中的DNA文库。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。

DNA碱基序列的变更，可应用PCR和公知的试剂盒采用ODA-LAPCR，Gapped duplex和Kunkel等自体公知的方法或相类似的方法进行，例如应用Mutan^TM-super Express Km(宝酒造公司)，Mutan^TM-K(宝酒造公司)等。

已经克隆的编码该多肽的DNA，既可单独使用，也可根据目的需要，在用限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可加上合适的合成DNA接头。

含有编码该多肽DNA的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明多肽的DNA上切下所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适公知载体上的启动子下游。

可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等。本发明所使用的启动子可以是任意启动子，只要它能与所用基因表达宿主匹配。

如果转换的宿主为大肠杆菌属的细菌，优选的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子等。在使用动物细胞作为宿主时，分别优选SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子。另外，为了更有效地表达编码目标多肽的基因优选使用增强子。

必要时，可在多肽的N-端加上同宿主匹配的信号序列。在用大肠杆菌属细菌作宿主时，可以使用的信号序列为碱性磷酸酶信号序列、OmpA信号序列等；当用枯草杆菌属的细菌作宿主时，可以使用的信号序列为α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在用酵母作宿主时，可以使用的信号序列为MFα信号序列、SUC2信号序列等；在用动物细胞作宿主时，可以使用的信号序列为胰岛素信号序列、α干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。使用含有编码多肽的DNA序列的构建载体，可获得转化体。

可以使用的宿主的实例有，公知的大肠杆菌属的细菌、枯草杆菌属的细菌、酵母、昆虫以及动物细胞等。

大肠杆菌属的细菌有，大肠杆菌(Escherichia coli)K12 DH1(美国国家科学院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物学杂志，120，517(1978))、HB101(分子生物学杂志，41，459(1969))、C600(遗传学，39，440(1954))等。

枯草杆菌属的细菌有，枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI114(基因，24，255(1983))、207-21(生物化学杂志，95，87(1984))等。

酵母有，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。

昆虫的例子，可以使用家蚕的幼虫(前田等，自然，315，592(1985))。

动物细胞包括猴COS-7细胞、Vero、中华仓鼠细胞CHO、dhfr基因缺陷的中华仓鼠细胞CHO(以下，简称CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠骨髓瘤细胞、人FL细胞等。

大肠杆菌属的细菌可以根据[美国国家科学院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)]中描述的方法进行转化。

枯草杆菌属的细菌可以根据[分子及普通遗传学，168，111(1979)]中描述的方法进行转化。

酵母可以根据[酶学方法，194，182-187(1991)或美国国家科学院院刊.，75，1929(1978)]中描述的方法进行转化。

昆虫细胞可以根据[生物/技术，6，47-55(1988)]中描述的方法进行转化。

动物细胞的转化可以根据[病毒学，52，456(1973)]中描述的方法进行。

由此，可以获得用含有多肽之编码DNA的表达载体转化的转化体。

当培养宿主为大肠杆菌或枯草杆菌的转化体时，用于培养的培养基为液体培养基，该培养基含有转化体生长所必需的物质例如碳源、氮源、无机物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括无机或有机物质如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯抽提物等。无机物又包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，在培养基中也可加入酵母提取液、维生素、促生长因子等。培养基的pH值优选约5-8。

用于培养大肠杆菌属细菌的培养基优选为，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志，431，冷泉港实验室，纽约，1972)。必要时，可以在培养基中加入药物如3β-吲哚基丙烯酸，来有效激活启动子。当用大肠杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约15-43℃培养约3-24小时。必要时，培养物可以进行充气或搅拌。

当用枯草杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约30-40℃培养约6-24小时。必要时，培养物可以进行充气或搅拌。

当用酵母作为宿主时，转化体培养在，例如Burkholder氏基本培养基(Bostian，K.L.等，美国国家科学院院刊，77，4505(1980))上或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培养基(Bitter，GA.等，美国国家科学院院刊，81，5330(1984))上。

优选培养基pH值调节到大约5-8。转化体通常在大约20-35℃培养约24-72小时。必要时，培养物可以进行充气或搅拌。

当用昆虫作为宿主时，转化体培养在，例如Grace’s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％胎牛血清等适当添加剂。优选培养基pH值调节到大约6.2-6.4。转化体通常在大约27℃培养大约3-5天。必要时，培养物可以进行充气或搅拌。

当用动物细胞作为宿主时，转化体培养在，例如含有大约5-20％胎牛血清的MEM培养基(科学，122，501(1952))上、DMEM培养基(病毒学，8，396(1959))上、RPMI 1640培养基(美国医学会杂志，199，519(1967))上、199培养基(Proceeding of the Society f或the Biological Medicine，73，1(1950))上等。优选培养基pH值调节到大约6-8。转化体通常在大约30-40℃培养大约15-60小时。必要时，培养物可以进行充气或搅拌。

可以根据下述方法从上述培养物(培养液以及培养体或培养细胞)中分离纯化多肽。

在培养后，用众所周知的方法收集转化体或细胞，悬浮在一合适的缓冲液中，从中抽提本发明的多肽。然后用众所周知的方法破碎转化体或细胞，如超声处理、溶菌酶处理和/或反复冻溶等，然后离心、过滤，获得本发明多肽的粗提物。此过程的缓冲液可包含蛋白变性剂如尿素或盐酸胍、或表面活性剂如Triton X-100(和光纯药(株)注册商标：下文简化为TM)等。

当多肽分泌在培养液中时，在培养结束后，用众所周知的方法从转化体或细胞中经分离而收集上清。

上清或包含在所获抽提物中的多肽可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括，(1)利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；(2)主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；(3)利用电荷差异的方法如离子交换层析等；(4)利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；(5)利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；(6)利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳或层析聚焦等。

当如此获得的多肽为游离形式时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反，当获得的多肽为盐时，可用众所周知的方法或改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。

重组产生的多肽，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使多肽经适当修饰，部分去除一段多肽。这种蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。由此产生的变异多肽活性，可通过对受体的结合试验和利用特异性抗体的酶免疫分析法测定。

本发明配体多肽还有调节CRH分泌的作用，也就是说，它具有促进和抑制CRH的分泌作用。即本发明配体多肽如同后述的实施例一样，因为具有促进CRH的分泌作用，所以它可用作与CRH分泌不足相关的各种疾病的预防与治疗的药物(包括一般药物和动物药物)。另一方面，本发明配体多肽又与其受体蛋白的亲和性很强，所以若增加投药量，产生对CRH分泌的脱敏作用，同样它也具有抑制CRH的分泌作用。这时，它可用作与CRH分泌过多相关的各种疾病的预防与治疗的药物。

因此，本发明配体多肽，作为CRH分泌促进剂，适用除与CRH分泌相关的各种疾病的改善、预防与治疗的药物外还有镇痛作用，其疾病如，醛甾酮过少症、低皮质醇血症、继发性及慢性肾上腺皮质机能减退、艾迪生病(怠倦、恶心、色素沉着、性功能降低、脱发、低血压)、肾上腺皮质功能不全、肥胖等。

本发明配体多肽，作为抑制CRH分泌的一种药物，适用于CRH分泌相关的各种疾病的改善、预防与治疗的药物，其疾病如，库兴病、库兴综合征(中心性肥胖、满月脸、高血压、紫红色皮肤条纹、多毛)，垂体肿瘤时产生的促肾上腺皮质素释放素(ACTH)、产生CRH的肿瘤，产生醛固酮的肿瘤、醛固酮增多症(原发性、继发性)、原发性低皮质醇血症、先天性肾上腺酶缺乏症、抗紧张、抑郁症、神经性食欲不振、失眠、胃十二指肠溃疡和过敏性肠道综合征等。

本发明配体多肽还为研究CRH分泌的机能而作为一种检查药物，

将本发明配体多肽用作所述一般药物或动物药物使用时，可以按照常规方法实施。例如，必要时加糖衣制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服，或以可注射型制剂如无菌溶液或悬浮在水或其它可药用液体中的悬浮液形式经非胃肠道或滴鼻剂给药。例如，该配体多肽或其盐与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成药剂常用的单位剂型。控制制剂中的活性成分使其在给定范围内获得合适剂量。

可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamono oil和樱桃。当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水溶液来制备药物。

用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水、包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80^TM和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。此外，上述的治疗/预防制剂可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的无菌安瓿中。

如此所获制剂安全、低毒，因此可投药于人或其它哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、黑猩猩等)。

含有CRH分泌调节剂的本发明多肽的剂量依赖于病症等而异，当口服给药时，一般对于醛甾酮过少症患者(体重60kg)来说，一次正常剂量为，大约0.1-100mg，优选大约1.0-50mg，更优选1.0-20mg。当非胃肠道给药时，其一次投药量依赖于给药受体、症状、投药方法等而变，例如以针剂给药时，一般对于醛甾酮过少症患者(体重60kg)来说，剂量为大约0.01-30mg，优选大约0.1-20mg，更优选大约0.1-10mg，优选静脉注射。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

本发明中所使用的G蛋白偶联型受体蛋白(下文，通常简称为受体蛋白)或配体多肽可以依照，例如，WO96/05302或WO97/24436的描述来制备。

作为该受体蛋白质，具体的包括与SEQ ID NO：46所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐等。「基本相同」的氨基酸序列指的是蛋白质的活性，例如与受体和配体(本发明的配体多肽)结合活性保持基本相同状态(无显著的变化)的氨基酸序列，这与在WO96/05302号或WO97/24436号所定义的受体蛋白质意义相同。

作为与SEQ ID NO：46所示氨基酸序列基本相同的序列，例如有SEQ IDNO：48所示氨基酸序列等。

又，作为编码SEQ ID NO：46所示氨基酸序列的DNA碱基序列，有如SEQ ID NO：47所示碱基序列等，作为编码SEQ ID NO：48所示氨基酸序列的DNA碱基序列，有如SEQ ID NO：49所示碱基序列等。

下面，关于CRH分泌调节剂的制备方法及其用途并阐述其分泌调节剂。所述调节剂包括一种化合物或其盐，这种化合物或其盐能够使针对于本发

明受体蛋白的本发明配体多肽和该受体蛋白之间的结合特性发生改变。

上面所述的化合物或其盐中含有促进本发明配体多肽机能(如CRH分泌作用等)的化合物或其盐，及含有抑制本发明配体多肽机能(如CRH分泌作用等)的化合物或其盐。

本发明配体多肽，由于具有调节CRH分泌作用(促进CRH分泌作用、抑制CRH分泌作用等)，所以促进本发明配体多肽的CRH分泌作用等的化合物或其盐，可作为一种促进CRH分泌的药物，除适用于改善、预防与治疗各种疾病外，还有镇痛药的作用，其疾病有，醛甾酮过少症、低皮质醇血症、继发性及慢性肾上腺皮质机能减退、艾迪生病(怠倦、恶心、色素沉着、性功能降低、脱发、低血压)、肾上腺皮质功能不全、肥胖等。另一方面，抑制本发明配体多肽的CRH分泌作用的化合物或其盐，适用于与CRH分泌相关的各种疾病的改善、预防与治疗，其疾病有库兴病(Cushing病)，库兴综合征(中心性肥胖，满月脸，高血压，紫红色皮肤条纹，多毛)，垂体肿瘤时产生的促肾上腺皮质素释放素(ACTH)、产生CRH的肿瘤，产生醛固酮的肿瘤，醛固酮增多症(原发性，激发性)，原发性低皮质醇血症，先天性肾上腺酶缺乏症，抗紧张，抑郁症，神经性食欲不振，失眠，胃十二指肠溃疡和过敏性肠道综合征等

因此，本发明配体多肽是可用于筛选促进或抑制本发明配体多肽机能(如CRH分泌作用等)的化合物或其盐的一种试剂。

所述促进或抑制本发明配体多肽机能的化合物或其盐例如，可通过筛选这样的化合物而获得，其化合物使G蛋白偶联型受体蛋白[如phGR3、UHR-1等(WO96/05302或WO97/24436)]和本发明配体多肽之间的结合特性发生改变。

下面，阐述该筛选方法。

构建G蛋白偶联型受体蛋白[如phGR3、UHR-1等(WO96/05302或WO97/24436)]表达体系，通过使用该表达体系的受体蛋白结合测定系统，更有效地筛选本发明配体多肽和G蛋白偶联型受体蛋白[如phGR3、UHR-1等(WO96/05302或WO97/24436)]之间的结合特性发生变化的化合物(如，肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物等)或其盐。

这种化合物包括：(1)具有G蛋白偶联型受体介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性)的化合物；(2)不具有该细胞刺激活性的化合物(所谓对受体蛋白的拮抗剂)；(3)降低本发明配体多肽和G蛋白偶联型受体蛋白之间的结合能力的化合物等。

即，本发明提供一种筛选方法，该方法是筛选使针对本发明受体蛋白的本发明配体多肽与受体蛋白之间的结合特性发生变化的化合物或其盐，其特征为，(i)使受体蛋白和本发明配体多肽在接触时，和(ii)使受体蛋白和本发明配体多肽及待测化合物在接触时进行比较。

在(i)和(ii)的情况下，本发明筛选方法有以下特征，例如，测定并比较其结合于该受体蛋白的配体量或其细胞刺激活性。

更具体地，本发明提供了：

(1)一种筛选方法，该方法是筛选一种化合物或其盐，该化合物或其盐能使本发明配体多肽与受体蛋白等之间的结合特性发生变化，其特征为，使一标记的本发明配体多肽与受体蛋白接触时，和使一标记的本发明配体多肽及待测化合物与受体蛋白接触时，测定并比较同该受体蛋白结合的标记本发明配体多肽的量；

(2)一种筛选方法，该方法是筛选一种化合物或其盐，该化合物或其盐能使本发明配体多肽与受体蛋白之间的结合特性发生变化，其特征为，使一标记的本发明配体多肽同包含受体蛋白的细胞或该细胞的膜级分接触时，和使一标记的本发明配体多肽及待测化合物同包含本发明受体蛋白的细胞或该细胞的膜级分接触时，测定并比较同该细胞或该细胞的膜级分结合的标记本发明配体多肽的量；

(3)一种筛选方法，该方法是筛选一种化合物或其盐，该化合物或其盐能使本发明配体多肽与受体蛋白等之间的结合特性发生变化，其特征为，使一标记的本发明配体多肽同，通过培养含有编码受体蛋白DNA的转化体而表达在细胞膜上的受体蛋白接触时，和使一标记的本发明配体多肽及待测化合物同，通过培养含有编码受体蛋白DNA的转化体而表达在细胞膜上的受体蛋白接触时，测定并比较同该受体蛋白结合的标记本发明配体多肽的量。

下面进一步说明所述筛选方法。

首先作为用于本发明筛选方法的受体蛋白等，只要其含有所述受体蛋白的均可，但是优选含有受体蛋白等的哺乳动物脏器的细胞膜级分。然而人的脏器最难获得，因此用于本发明筛选方法的受体蛋白，通过重组体才适用于能大量表达人的受体蛋白等。

在生产本发明受体蛋白时，可使用上述表达方法，优选在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达所述编码受体蛋白等的DNA。编码部分目的蛋白的DNA片段包括DNA，但不限于互补DNA。例如，可使用基因片段或合成DNA。为了将编码所述受体蛋白的DNA片段导入宿主动物细胞，并高效表达，优选将DNA片段插入具有昆虫宿主的杆状病毒属核多角体病毒(NPV)的多角体启动子、SV40来源的启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、人热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等下游。所表达受体的量和质的检测用众所周知的方法进行，例如，Nambi，P.等在J.Biol.Chem.，267，19555-19559(1992)中描述的方法。

因此，在上述筛选方法中，含有受体蛋白的可以是用众所周知的方法纯化来的、也可以用含有该受体蛋白的细胞或这些细胞的膜级分。

使用含有本发明受体蛋白的细胞进行上述筛选时，这些细胞可用戊二醛、福尔马林等固定。固定可用众所周知的方法进行。

含有受体蛋白的细胞是指表达该受体蛋白的宿主细胞。这类细胞的例子优选大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。

细胞膜级分是指，用众所周知的方法破裂细胞并进行分级分离而制备的含有大量细胞膜的级分。细胞破裂的有效方法包括用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司生产)破裂、超声破裂、用French press加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜组分分离主要通过离心力来实现，如分级离心和密度梯度离心。例如，细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(正常为1-10分钟)，得到的上清高速(15000-30000rpm)通常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的受体蛋白以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。

在含有该受体蛋白等的细胞和细胞膜级分中，受体蛋白含量优选10³-10⁸分子/细胞，更优选10⁵-10⁷分子/细胞。随着表达量的增加，单位细胞膜级分的配体结合活性(比活)增加，因而不但可以构建高敏感筛选体系，而且可以在同一批获得大量的样品。

为了筛选使本发明配体多肽与受体蛋白等之间的结合特性发生变化的化合物，需要合适的受体蛋白质级分和标记的本发明配体多肽。

受体蛋白级分优选天然的受体蛋白级分，或与其具有同等活性的重组受体蛋白级分。此处术语“同等活性”是指在配体结合活性和信号传导作用方面同天然受体蛋白所拥有的活性等同。

作为标记的配体，有标记的配体、类似于标记配体化合物等。例如它们用[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]等标记。

具体地说，为了筛选使本发明配体多肽与受体蛋白等之间的结合特性发生变化的化合物，首先，将含有受体蛋白等的细胞或其膜级分悬浮于本方法的相应的缓冲液中，制备标准受体。可以使用任何缓冲液，只要它不干扰配体-受体结合。此类缓冲液有pH值约4-10(优选6-8)的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异结合，可任选在缓冲液中加入表面活性剂如CHAPS、Tween-80^TM(Kao-Atlas公司)、毛地黄皂甘或脱氧胆酸。为了抑制蛋白酶对受体或配体的降解，可加入蛋白酶抑制剂如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute公司生产)和胃蛋白酶抑制剂。将一定量(5000-500000cpm)的标记的配体加入到0.01-10ml的受体溶液中，同时还存在有10^-4M-10^-10M的待测化合物。为了测定非特异性结合(NSB)，需提供一个含有过量未标记的配体反应管。在约0-50℃(优选约4-37℃)反应20分钟-24小时(优选30分钟-3小时)。在反应完成后，反应混合物用玻璃纤维滤纸等过滤，用适量的相同缓冲液洗涤。然后用液闪仪或λ-计数仪测定在玻璃纤维滤纸中的残留放射活性。在不存在拮抗物时，从其值(B₀)中减去非特异结合值(NSB)而得到的(B₀-NSB)，再乘以100％，此时，特异的结合量(B-NSB)，可以以有抑制拮抗能力的增补物质进行选择，例如，抑制低于50％的待测化合物，即可选择性的抑制本发明的配体多肽的机能(如CRH分泌功能)。

上述用于筛选使本发明配体多肽和受体蛋白等之间的结合特性发生变化的化合物的方法可按照下述进行。用众所周知的方法或商品化的分析试剂盒来测定受体蛋白介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低的活性)。

详细地说，首先，将包含受体蛋白的细胞在多孔平板上培养。在筛选之前，先置换新鲜培养基或对细胞无毒的缓冲液，加入待测化合物并保温一定时间，然后提取细胞或回收上清将反应产物用各种方法进行定量。当利用细胞内的分解代谢酶测定作为细胞刺激活性指示剂的物质(例如花生四烯酸)的产生有困难时，可加入该分解代谢酶的抑制剂进行测定。可以检测cAMP产生的抑制活性等活性，作为细胞抑制活性，所述细胞受毛喉素等刺激而导致基本生产量增加。

测定细胞刺激活性而进行筛选时，需要合适的能表达受体蛋白质的细胞。其细胞优选具有天然型本发明受体蛋白等的细胞系、能够表达所述重组型受体蛋白等的细胞系等。

其中待测化合物包括，例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等，这些化合物为新的或已知的均可。

用于筛选使本发明配体多肽和受体蛋白之间的结合特性发生变化的化合物或其盐的试剂盒中包含，本发明的受体蛋白等、含有本发明的受体蛋白的细胞，或含有本发明的受体蛋白的细胞膜级分。

本发明筛选试剂盒包括如：

1.用于筛选的试剂

(1)用于分析和冲洗的缓冲液

加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma公司)的Hanks’平衡盐溶液(Gibco公司生产)。

溶液用0.45μm孔径滤膜过滤除菌并在4℃贮存。或可以在临用时配制。

(2)G蛋白偶联型受体蛋白标样

将表达受体蛋白的CHO细胞在12孔板上传代培养，每孔5×10⁵细胞，37℃，5％CO₂和95％空气保温培养两天。

(3)标记的配体

用市售[³H]、[¹²⁵I]、[¹⁴C]或[³⁵S]标记本发明配体多肽。

产物以水溶液贮存在4℃或-20℃。溶液在使用时用分析缓冲液稀释到1μM。

(4)配体标准液

将本发明配体溶解于含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma公司)的PBS使之浓度为1mM，-20℃保存。

2分析方法

(1)用于表达本发明受体蛋白的CHO细胞在12孔板上进行培养。在用1ml的用于分析的缓冲液洗涤2次后，每孔加入490μl该缓冲液。

(2)加5μl的10^-3M-10^-10M的待测化合物，向所述系统中加5μl的标记配体，得到的混合液在室温保温1小时。为了测定非特异结合，在所述系统中加5μl的10^-3M的配体而不是待测化合物。

(3)去除孔中的反应混合液，将培养孔洗涤3遍，每次均用1ml的洗涤液。用0.2N NaOH-1％SDS溶解与细胞结合的标记配体，然后与4ml的液闪剂A(和光纯药生产)混合。

(4)用液闪计数器(Beckman公司生产)测定放射性。其最大结合量用下式求得：

PMB＝[(B-NSB)/(B₀-NSB)]×100

PMB：最大结合百分率

B ：加样时的值

NSB：非特异结合量

B₀ ：最大结合量

针对本发明受体蛋白的、使本发明配体多肽和该受体蛋白之间结合特性发生改变的化合物或其盐，将这样化合物或其盐用作前面所述的CRH分泌调节剂时，可以按照常规方法进行实施。例如，必要时加糖衣制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服，或以可注射型制剂如无菌溶液或悬浮在水中或其它可药用液体中的悬浮液形式经非胃肠道或滴鼻剂给药。例如，该配体多肽或其盐与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成药剂常用的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。

用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80(^TM)和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。此外，上述的治疗/预防制剂可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液一般装在合适的无菌的安瓿中。

含有上述化合物或其盐的CRH分泌调节剂的投药剂量依赖于病症等而异，当口服给药时，对于一般的醛甾酮过少症(体重60kg)来说，将具有促进CRH分泌作用的化合物或其盐一次正常剂量，通常约为0.1-100mg，优选约1.0-50mg，更优选1.0-20mg。当非胃肠道给药时，其一次投药量依赖于给药受体、症状、投药方法等而变，例如以针剂给药时，对于一般的醛甾酮过少症(体重60kg)来说，将具有促进CRH分泌作用的化合物或其盐优选静脉注射，剂量为大约0.01-30mg，优选大约0.1-20mg，更优选大约0.1-10mg。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。

下面分别说明本说明书序列表中的各序列编号(SEQ ID NO：)的含意。

[SEQ ID NO：1]

表示来源于牛下丘脑配体多肽整个氨基酸序列的长度。

[SEQ ID NO：2]

表示来源于牛下丘脑配体多肽的整个cDNA碱基序列。

[SEQ ID NO：3]

表示来源于牛下丘脑的配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：1中的第23-53位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：4]

表示来源于牛下丘脑的配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：1中的第23-54位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：5]

表示来源于牛下丘脑的配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：1中的第23-55位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：6]

表示来源于牛下丘脑的配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：1中第34-53位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：7]

表示来源于牛下丘脑的配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：1中第34-54位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：8]

表示来源于牛下丘脑的配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：1中第34-55位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：9]

表示编码来源于牛下丘脑配体多肽(SEQ ID NO：3)DNA的碱基序列。

[SEQ ID NO：10]

表示编码来源于牛下丘脑配体多肽(SEQ ID NO：4)DNA的碱基序列。

[SEQ ID NO：11]

表示编码来源于牛下丘脑配体多肽(SEQ ID NO：5)DNA的碱基序列。

[SEQ ID NO：12]

表示编码来源于牛下丘脑配体多肽(SEQ ID NO：6)DNA的碱基序列。

[SEQ ID NO：13]

表示编码来源于牛下丘脑配体多肽(SEQ ID NO：7)DNA的碱基序列。

[SEQ ID NO：14]

表示编码来源于牛下丘脑配体多肽(SEQ ID NO：8)DNA的碱基序列。

[SEQ ID NO：15]

表示来源于牛的基因组DNA之配体多肽的整个氨基酸序列的长度。

[SEQ ID NO：16]

表示大鼠型配体多肽整个氨基酸序列的长度。

[SEQ ID NO：17]

表示大鼠型配体多肽cDNA的整个碱基序列。

[SEQ ID NO：18]

表示大鼠型配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：16中第22-52位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：19]

表示大鼠型配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：16中第22-53位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：20]

表示大鼠型配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：16中第22-54位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：21]

表示大鼠型配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：16中第33-52位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：22]

表示大鼠型配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：16中第33-53位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：23]

表示大鼠型配体多肽氨基酸的序列。它与SEQ ID NO：16中第33-54位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：24]

表示编码大鼠型配体多肽(SEQ ID NO：18)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：25]

表示编码大鼠型配体多肽(SEQ ID NO：19)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：26]

表示编码大鼠型配体多肽(SEQ ID NO：20)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：27]

表示编码大鼠型配体多肽(SEQ ID NO：21)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：28]

表示编码大鼠型配体多肽(SEQ ID NO：22)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：29]

表示编码大鼠型配体多肽(SEQ ID NO：23)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：30]

表示人型配体多肽整个氨基酸序列的长度。

[SEQ ID NO：31]

表示人型配体多肽cDNA的整个碱基序列。

[SEQ ID NO：32]

表示人型配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：30中第23-53位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：33]

表示人型配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：30中第23-54位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：34]

表示人型配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：30中第23-55位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：35]

表示人型配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：30中第34-53位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：36]

表示人型配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：30中第34-54位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：37]

表示人型配体多肽的氨基酸序列。它与SEQ ID NO：30中第34-55位氨基酸序列相对应。

[SEQ ID NO：38]

表示编码人型配体多肽(SEQ ID NO：32)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：39]

表示编码人型配体多肽(SEQ ID NO：33)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：40]

表示编码人型配体多肽(SEQ ID NO：34)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：41]

表示编码人型配体多肽(SEQ ID NO：35)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：42]

表示编码人型配体多肽(SEQ ID NO：36)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：43]

表示编码人型配体多肽(SEQ ID NO：37)的DNA碱基序列。

[SEQ ID NO：44]

表示本发明配体多肽氨基酸序列。其中，第3位的Xaa为Ala或Thr，第5位的Xaa为Arg或Gln，第10位的Xaa为Ile或Thr，第21位的Xaa为Thr或Ala，第22位的Xaa为Gly或Ser。

[SEQ ID NO：45]

表示本发明配体多肽氨基酸序列。序列中第10位的Xaa为Thr或Ala，第11位的Xaa为Gly或Ser。

[SEQ ID NO：46]

表示本发明配体多肽受体phGR3的氨基酸序列。

[SEQ ID NO：47]

表示DNA碱基序列，该序列编码本发明配体多肽受体phGR3的氨基酸序列。

[SEQ ID NO：48]

表示本发明配体多肽受体UHR-1的氨基酸序列。

[SEQ ID NO：49]

表示DNA碱基序列，该序列编码本发明配体多肽受体UHR-1的氨基酸序列。

具有编码SEQ ID NO：47所示的phGR3氨基酸序列的转导体大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/phGR3自1994年9月27日起保藏于日本国茨城县茨城市东1-1-3通商产业省工业技术院生命工程学工业技术研究所(NIBH)其保藏编号为FERM BP-4807，自1994年9月22日起保藏于日本国大阪府大阪市十三本町2-17-85财团法人发酵研究所(IFO)其保藏编号为IFO 15748。

实施例

用以下实施例，对本发明进行详细说明，但并不限定于本发明范围。

实施例1 PrRP-31(由SEQ ID NO：32所示氨基酸序列构成的肽，该肽为在C末端氨基酸残基的羧基被酰胺化)注入第三脑室后对血浆中促肾上腺皮质素释放素(ACTH)和对β内啡肽浓度的影响。

成熟雄性Wistar大鼠(手术时体重350-380g)用戊巴比妥50mg/kg腹腔内注射麻醉，大鼠的脑部用固定装置固定。切齿用圆头锉从口内线下方3.3mm，暴露颅骨，为了在第三脑室内埋入引管AG-12(内径0.4mm，外径0.5mmEicom)用齿科用钻头钻眼。进一步，其周围4个地方埋入锚凹螺丝。第三脑室上部的位置插入不锈钢的引管AG-12。定位坐标依据Paxinos和Waton(1986)的图谱从口内线起为AP：+7.1mm，L：0.0mm，H：+2.0mm。将引管用瞬间粘着剂和牙科胶接剂以及锚凹螺丝固定于颅骨之上。将不锈钢空插管AD-12(外径0.35mm、Eicom)插入引管内，用锁紧螺帽(Eicom公司)固定。术后，分别饲养大鼠。

引管埋入后约饲养1周，待术后恢复，在大鼠能自由活动的情况下，进行采血手术。用戊巴比妥50mg/kg注入实施所述手术大鼠的腹腔内进行麻醉。在解剖垫的上面将其背部固定，使之左侧颈静脉露出。将聚乙烯管SP35(内径0.5mm、外径0.9mm，夏目制作所)切成约30cm长，用含有200单位/ml肝素的生理盐水将其管装满后，插入颈静脉约4.5cm并固定。管的另一端通过背侧皮下从颈部(背侧)露出。

术后过夜，在投药PrRP-31前30分钟，用1ml容量的注射器和用25号针头(均为Terumo公司)采集400μl血液。为了防止血液凝固，在注射器里事先装入20μl的含有200单位/ml的肝素生理盐水。取下装在大鼠颅骨上的锁紧螺帽和空插管，取而代之，插入不锈钢的微注射插管(内径0.17mm、外径0.35mm，Eicom公司)连接于泰弗龙管(长50cm、内径0.1mm、外径0.35mm，Eicom公司)。微注射插管的长度事先调节成从引管露出于其前端1mm。将泰弗龙管的另一端连接于微注射器泵，将共计10μl的含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)磷酸缓冲生理盐水或溶解有PrRP-31(分别为1，3，10nmol)的0.5％BSA磷酸缓冲生理盐水，以流速为5μl/分注射到第3脑室。注射结束后15分钟，取出微注射插管，再用锁紧螺帽将空插管固定。脑室内注入前15分钟及注入时分别在0，5，15，30，45，60分钟时分别经颈静脉采血700μl。采出的血液用微量高速冷却离心机(MR-150，Tomy Seiko)离心(5,000rpm，10分钟)，回收上清夜(血浆)。根据放射免疫测定法测定血浆中所含的ACTH和β-内啡肽(ACTH：Mitsubishi Kagaku，β-内啡肽：Peninsula公司)。图1和图2表明给予15分钟后的峰值，PrRP-31投药组较对照组的血中ACTH和β-内啡肽的浓度呈上升趋势。

实施例2 CRH抗体对PrRP-31所致血中ACTH和β-内啡肽的浓度上升的活性抑制

和实施例1一样采用成熟雄性Wistar大鼠，分别用抗-CRHIgG(PHOENIX PHARMACEUTICAL公司)和正常兔子的IgG(Pepro Tech EC公司)400μg溶解于含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)磷酸缓冲生理盐水，颈静脉内注射，注射后30分钟再向脑室内注入10nmol的PrRP-31。脑室注入后分别在0，5，15，30，45，60分钟时从颈静脉采血700μl，采集的血液用微量高速冷却离心机(MR-150，Tomy Seiko)离心(5000rpm，10分钟)，回收上清夜(血浆)。根据放射免疫测定法测定血浆中的ACTH和β-内啡肽(ACTH：Mitsubishi Kagaku，β-内啡肽；Peninsula公司)。图3和图4表明抗-CRH IgG投药组较正常兔子IgG投药组PrRP-31的注入可抑制血中ACTH和β-内啡肽浓度的上升。

实施例3 PrRP-31对机体应激的影响

本发明人认为由于应激负重作用使PrRP-31从产生PrRP细胞或含有PrRP-31的神经末梢中分泌出来，从而提高了机体的PrRP-31含量，并测定了负重游泳时脑脊髓液中PrRP-31的浓度。雄性Wistar大鼠(体重200-220g)，将其放入应激笼(W265×L95×H200mm，夏目制作所)内后，将其放入水中(25℃)至颈下使其游泳产生负重。游泳开始后0，0.5，1，2，4，6，8小时将大鼠从水中捞出，用戊巴比妥50mg/kg腹腔内注入麻醉。依据Chou，R.B.的大槽穿刺法(J.Pharmacol.Exp.Ther.，219：42-48，1981)采集脑脊液。即，大鼠俯卧位在睡眠下切开头皮，进一步逐层切开肌肉。从头盖骨交界处向背中侧约2mm，用连接与1ml的注射器(Terumo)的翼状针(25G，Terumo)穿刺，针尖进入5mm深度时，拔除注射器。针刺入后有透明的脑脊液溢出。确定有脑脊液溜出后，立即用瞬间粘接剂将针固定，脑脊液标本的采集时间约10分钟。当管内有血液混入时，停止脑脊液的采集并用止血钳闭死管腔，并将脑脊髓液装入有2mM EDTA，300KIU/ml aprotinin(ベ-リンガ-マンハイム山之内)和最终浓度为0.05％的CHAPS(和光纯药)微量离心管内。采集的脑脊液冰冷却下保存，在4℃下经13,000rpm×5分钟离心后，取其上清液并给予冷冻。脑脊髓液中的PrRP-31浓度用我们制作的2种类型特异的克隆抗体高敏感度测定系(WO99-60112号)测定，它与我们制作的PrRP-31识别部位不同。脑脊髓液中PrRP-31浓度(平均值±标准差)正常值是0.92±0.10fmol/ml，在水中负重游泳0.5和1小时后分别是2.90±0.25fmol/ml和2.60±0.25fmol/ml，统计学上有意义高值是p＜0.01，n＝7，图5表明其脑脊液中的浓度随时间延长而减小。另外，图6表明在水中负重游泳时用放射免疫测定法(三菱化学)测定的血中ACTH浓度，峰值在0.5小时，其后的峰值随时间延长而减小，脑脊液中PrRP-31浓度的变化与血中ACTH浓度的变化相同。

实施例4 CRH拮抗剂对PrRP-31所致血中ACTH的浓度上升的活性抑制

与实施例1一样采用成熟雄性Wistar大鼠，CRH受体拮抗剂是采用0.5ml生理盐水溶解的α-helical CRF(Peninsula Laboratories Europe公司)2mg经颈静脉注入。对照组采用0.5ml生理盐水经颈静脉注入。两组均在经颈静脉注入后15分钟向脑室内注入10nmol的PrRP-31。脑室内注入后分别在0，10，20，30，45，60分钟从颈静脉采血400μl，血液用微量高速离心机(MR-150，Tomy Seiko)离心(5000rpm，10分钟)后，回收上清夜(血浆)。依据放射免疫测定法测定血浆中ACTH的含量(ACTH：Mitsubishi Kagaku)。图7表明α-helical CRF给药组较生理盐水给药组脑室内注入PrRP-31可有意义的抑制血中ACTH的浓度上升。

试剂例1

将50mg本发明配体多肽溶于日本药典规定的注射用蒸馏水(50ml)之后，加日本药典所述的注射用蒸馏水至100ml。本溶液在灭菌条件下过滤，再各自取1ml本溶液在灭菌条件下注入到注射用小药瓶中冷冻干燥密封。

试剂例2

将100mg本发明配体多肽溶于日本药典规定的注射用蒸馏水(50ml)之后，加日本药典所述的注射用蒸馏水至100ml。本溶液在灭菌条件下过滤，再各自取1ml本溶液在灭菌条件下注入到注射用小药瓶中冷冻干燥密封。

工业利用

本发明配体多肽具有调节CRH分泌的作用(促进和抑制CRH的分泌)。即本发明配体多肽，因为具有促进CRH的分泌作用，所以它可用作与分泌功能不全相关的各种疾病的预防与治疗的药物。另一方面，本发明配体多肽又与其受体蛋白的亲和性很强，所以若增加CRH给药量则产生对CRH分泌的脱敏作用(desensitization)，其结果导致它又具有抑制CRH的分泌作用。这时，它可用作与CRH分泌过多相关的各种疾病的预防与治疗的药物。

因此，本发明配体多肽，作为促进CRH分泌的一种药物，适用于与CRH分泌相关的各种疾病的预防与治疗，其疾病如醛甾酮过少症、低皮质醇血症、继发性及慢性肾上腺皮质机能减退、艾迪生病(怠倦、恶心、色素沉着、性功能降低、脱发、低血压)、肾上腺皮质功能不全以及肥胖症等，此外，该配体多肽还用作镇痛药。

另一方面，本发明配体多肽，还作为抑制CRH分泌的一种药物，适用于与CRH分泌相关的各种疾病的改善、预防与治疗，其疾病如，库兴病、库兴综合症(中心性肥胖、满月脸、高血压、紫红色皮肤条纹、多毛)、促肾上腺皮质素(ACTH)产生的垂体肿瘤、CRH产生的肿瘤、醛甾酮过少产生的肿瘤、醛甾酮过少症(原发性、继发性)、抗原发性皮质醇症、先天性肾上腺酶缺乏症、抗紧张、忧郁症、神经性食欲不振、失眠、胃·十二指肠溃疡以及过敏性肠综合症等。

本发明配体多肽还为研究CRH分泌的机能而作为一种检查药物。

序列表<110>武田药品工业株式会社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>肽的用途<130>2671WOOP<150>JP 11-327900<151>1999-11-18<150>JP 12-297073<151>2000-09-26<160>49<210>1<211>98<212>PRT<213>牛<400>1Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile

20 25 30Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg

35 40 45Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Pro Gly Asp Gly Pro

50 55 60Arg Pro Gly Pro Arg Arg Val Pro Ala Cys Phe Arg Leu Glu Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro Ser Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Thr Ala Gln Leu Val

85 90 95Gln Glu

98<210>2<211>294<212>DNA<213>牛<400>2atgaaggcgg tgggggcctg gctcctctgc ctgctgctgc tgggcctggc cctgcagggg 60gctgccagca gagcccacca gcactccatg gagatccgca cccccgacat cggccctgcc 120tggtacgcrg gccgtgggat ccggcccgtg ggccgcttcg gccggcgaag agctgcccyg 180ggggacggac ccaggcctgg cccccggcgt gtgccggcct gcttccgcct ggaaggcggy 240gctgagccct cccgagccct cccggggcgg ctgacggccc agctggtcca ggaa 294<210>3<211>31<212>PRT<213>牛<400>3Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe

20 25 30 31<210>4<211>32<212>PRT<213>牛<400>4Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly

20 25 30 32<210>5<211>33<212>PRT<213>牛<400>5Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly

20 25 30Arg33<210>6<211>20<212>PRT<213>牛<400>6Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe

20<210>7<211>21<212>PRT<213>牛<400>7Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly

20 21<210>8<21l>22<212>PRT<213>牛<400>8Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg

20 22<210>9<211>93<212>DNA<213>牛<400>9agcagagccc accagcactc catggagatc cgcacccccg acatcaaccc tgcctggtac 60gcrggccgtg ggatccggcc cgtgggccgc ttc 93<210>10<211>96<212>DNA<213>牛<400>10agcagagccc accagcactc catggagatc cgcacccccg acatcaaccc tgcctggtac 60gcrggccgtg ggatccggcc cgtgggccgc ttcggc 96<210>11<211>99<212>DNA<213>牛<400>11agcagagccc accagcactc catggagatc cgcacccccg acatcaaccc tgcctggtac 60gcrggccgtg ggatccggcc cgtgggccgc ttcggccgg 99<210>12<211>60<212>DNA<213>牛<400>12acccccgaca tcaaccctgc ctggtacgcr ggccgtggga tccggcccgt gggccgcttc 60<210>13<211>63<212>DNA<213>牛<400>13acccccgaca tcaaccctgc ctggtacgcr ggccgtggga tccggcccgt gggccgcttc 60ggc 63<210>14<211>66<212>DNA<213>牛<400>14acccccgaca tcaaccctgc ctggtacgcr ggccgtggga tccggcccgt gggccgcttc 60ggccgg 66<210>15<211>98<212>PRT<213>牛<400>15Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile

20 25 30Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg

35 40 45Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Leu Gly Asp Gly Pro

85 90 95Gln Glu

98<210>16<211>83<212>PRT<213>大鼠<400>16Met Ala Leu Lys Thr Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val1 5 10 15Leu Pro Gly Ala Ser Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg

20 25 30Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro

35 40 45Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Pro Arg Asp Val Thr Gly

50 55 60Leu Gly Gln Leu Ser Cys Leu Pro Leu Asp Gly Arg Thr Lys Phe Ser65 70 75 80Gln Arg Gly

83<210>17<211>249<212>DNA<213>大鼠<400>17atggccctga agacgtggct tctgtgcttg ctgctgctaa gcttggtcct cccaggggct 60tccagccgag cccaccagca ctccatggag acaagaaccc ctgatatcaa tcctgcctgg 120tacacgggcc gcgggatcag gcctgtgggc cgcttcggca ggagaagggc aaccccgagg 180gatgtcactg gacttggcca actcagctgc ctcccactgg atggacgcac caagttctct 240cagcgtgga 249<210>18<211>31<212>PRT<213>大鼠<400>18Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe

20 25 30 31<210>19<211>32<212>PRT<213>大鼠<400>19Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly

20 25 30 32<210>20<211>33<212>PRT<213>大鼠<400>20Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly

20 25 30Arg33<210>21<211>20<212>PRT<213>大鼠<400>21Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe

20<210>22<211>21<212>PRT<213>大鼠<400>22Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly

20 21<210>23<211>22<212>PRT<213>大鼠<400>23Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly Arg

20 22<210>24<211>93<212>DNA<213>大鼠<400>24agccgagccc accagcactc catggagaca agaacccctg atatcaatcc tgcctggtac 60acgggccgcg ggatcaggcc tgtgggccgc ttc 93<210>25<211>96<212>DNA<213>大鼠<400>25agccgagccc accagcactc catggagaca agaacccctg atatcaatcc tgcctggtac 60acgggccgcg ggatcaggcc tgtgggccgc ttcggc 96<210>26<211>99<212>DNA<213>大鼠<400>26agccgagccc accagcactc catggagaca agaacccctg atatcaatcc tgcctggtac 60acgggccgcg ggatcaggcc tgtgggccgc ttcggcagg 99<210>27<211>60<212>DNA<213>大鼠<400>27acccctgata tcaatcctgc ctggtacacg ggccgcggga tcaggcctgt gggccgcttc 60<210>28<211>63<212>DNA<213>大鼠<400>28acccctgata tcaatcctgc ctggtacacg ggccgcggga tcaggcctgt gggccgcttc 60ggc 63<210>29<211>66<212>DNA<213>大鼠<400>29acccctgata tcaatcctgc ctggtacacg ggccgcggga tcaggcctgt gggccgcttc 60ggcagg 66<210>30<211>87<212>PRT<213><400>30Met Lys Val Leu Arg Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Met Leu Gly Leu1 5 10 15Ala Leu Arg Gly Ala Ala Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile

20 25 30Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg

35 40 45Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro

50 55 60Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Leu Thr Cys Phe Pro Leu Glu Gly Gly65 70 75 80Ala Met Ser Ser Gln Asp Gly

85 87<210>31<211>261<212>DNA<213>人<400>31atgaaggtgc tgagggcctg gctcctgtgc ctgctgatgc tgggcctggc cctgcgggga 60gctgcaagtc gtacccatcg gcactccatg gagatccgca cccctgacat caatcctgcc 120tggtacgcca gtcgcgggat caggcctgtg ggccgcttcg gtcggaggag ggcaaccctg 180ggggacgtcc ccaagcctgg cctgcgaccc cggctgacct gcttccccct ggaaggcggt 240gctatgtcgt cccaggatgg c 261<210>32<211>31<212>PRT<213>人<400>32Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe

20 25 30 31<210>33<211>32<212>PRT<213>人<400>33Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly

20 25 30 32<210>34<211>33<212>PRT<213>人<400>34Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asnl 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly

20 25 30Arg33<210>35<211>20<212>PRT<213>人<400>35Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe

20<210>36<211>21<212>PRT<213>人<400>36Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe Gly

20 2l<210>37<211>22<212>PRT<213>人<400>37Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe G1y Arg

20 22<210>38<211>93<212>DNA<213>人<400>38agtcgtaccc atcggcactc catggagatc cgcacccctg acatcaatcc tgcctggtac 60gccagtcgcg ggatcaggcc tgtgggccgc ttc 93<210>39<211>96<212>DNA<213>人<400>39agtcgtaccc atcggcactc catggagatc cgcacccctg acatcaatcc tgcctggtac 60gccagtcgcg ggatcaggcc tgtgggccgc ttcggt 96<210>40<211>99<212>DNA<213>人<400>40agtcgtaccc atcggcactc catggagatc cgcacccctg acatcaatcc tgcctggtac 60gccagtcgcg ggatcaggcc tgtgggccgc ttcggtcgg 99<210>41<211>60<212>DNA<213>人<400>41acccctgaca tcaatcctgc ctggtacgcc agtcgcggga tcaggcctgt gggccgcttc 60<210>42<211>63<212>DNA<213>人<400>42acccctgaca tcaatcctgc ctggtacgcc agtcgcggga tcaggcctgt gggccgcttc 60ggt 63<210>43<211>66<212>DNA<213>人<400>43acccctgaca tcaatcctgc ctggtacgcc agtcgcggga tcaggcctgt gggccgcttc 60ggtcgg 66<210>44<211>31<212>PRT<213>未知<220><221><223>第3位的Xaa为Thr或Ala，第5位的Xaa为Arg或Gln，第10位的Xaa为Ile或Thr，第21位的Xaa为Thr或Ala，第22位的Xaa为Gly或Ser。<400>44Ser Arg Xaa His Xaa His Ser Met Glu Xaa Arg Thr Pro Asp Ile Asn1 5 10 15Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe

20 25 30 31<210>45<211>20<212>PRT<213>未知<220><221><223>第10位的Xaa为Thr或Ala，第11位的Xaa为Gly或Ser。<400>45Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro1 5 10 15Val Gly Arg Phe

20<210>46<211>370<212>PRT<213>人<400>46Met Ala Ser Ser Thr Thr Arg Gly Pro Arg Val Ser Asp Leu Phe Ser1 5 10 15Gly Leu Pro Pro Ala Val Thr Thr Pro Ala Asn Gln Ser Ala Glu Ala

20 25 30Ser Ala Gly Asn Gly Ser Val Ala Gly Ala Asp Ala Pro Ala Val Thr

35 40 45Pro Phe Gln Ser Leu Gln Leu Val His Gln Leu Lys Glv Leu Ile Val

50 55 60Leu Leu Tyr Ser Val Val Val Val Val Gly Leu Val Gly Asn Cys Leu65 70 75 80Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn

85 90 95Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala

100 105 110Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val

115 120 125Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr

130 135 140Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr145 150 155 160Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser

165 170 175Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu

180 185 190Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val

195 200 205Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu

210 215 220Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val225 230 235 240Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val

245 250 255Val Pro Gly Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg

260 265 270Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val Phe Ala

275 280 285Val Cys Trp Leu Pro Leu His Val Phe Asn Leu Leu Arg Asp Leu Asp

290 295 300Pro His Ala Ile Asp Pro Tyr Ala Phe Gly Leu Val Gln Leu Leu Cys305 310 315 320His Trp Leu Ala Met Ser Ser Ala Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Ala

325 330 335Trp Leu His Asp Ser Phe Arg Glu Glu Leu Arg Lys Leu Leu Val Ala

340 345 350Trp Pro Arg Lys Ile Ala Pro His Gly Gln Asn Met Thr Val Ser Val

355 360 365Val Ile

370<210>47<211>1110<212>DNA<213>人<400>47atggcctcat cgaccactcg gggccccagg gtttctgact tattttctgg gctgccgccg 60gcggtcacaa ctcccgccaa ccagagcgca gaggcctcgg cgggcaacgg gtcggtggct 120ggcgcggacg ctccagccgt cacgcccttc cagagcctgc agctggtgca tcagctgaag 180gggctgatcg tgctgctcta cagcgtcgtg gtggtcgtgg ggctggtggg caactgcctg 240ctggtgctgg tgatcgcgcg ggtgcgccgg ctgcacaacg tgacgaactt cctcatcggc 300aacctggcct tgtccgacgt gctcatgtgc accgcctgcg tgccgctcac gctggcctat 360gccttcgagc cacgcggctg ggtgttcggc ggcggcctgt gccacctggt cttcttcctg 420cagccggtca ccgtctatgt gtcggtgttc acgctcacca ccatcgcagt ggaccgctac 480gtcgtgctgg tgcacccgct gaggcggcgc atctcgctgc gcctcagcgc ctacgctgtg 540ctggccatct gggcgctgtc cgcggtgctg gcgctgcccg ccgccgtgca cacctatcac 600gtggagctca agccgcacga cgtgcgcctc tgcgaggagt tctggggctc ccaggagcgc 660cagcgccagc tctacgcctg ggggctgctg ctggtcacct acctgctccc tctgctggtc 720atcctcctgt cttacgtccg ggtgtcagtg aagctccgca accgcgtggt gccgggctgc 780gtgacccaga gccaggccga ctgggaccgc gctcggcgcc ggcgcacctt ctgcttgctg 840gtggtggtcg tggtggtgtt cgccgtctgc tggctgccgc tgcacgtctt caacctgctg 900cgggacctcg acccccacgc catcgaccct tacgcctttg ggctggtgca gctgctctgc 960cactggctcg ccatgagttc ggcctgctac aaccccttca tctacgcctg gctgcacgac 1020agcttccgcg aggagctgcg caaactgttg gtcgcttggc cccgcaagat agccccccat 1080ggccagaata tgaccgtcag cgtggtcatc 1110<210>48<211>370<212>prt<213>大鼠<400>48met thr ser leu pro pro gly thr thr gly asp pro asp leu phe ser1 5 10 15gly pro ser pro ala gly ser thr pro ala asn gln ser ala glu ala

20 25 30ser glu ser asn val ser ala thr val pro arg ala ala ala val thr

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275 280 285leu cys trp leu pro leu his ile phe asn leu leu arg asp leu asp

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Claims

1、一种促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，其中包含针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐。

2、权利要求1所述促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，其中针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐是一种多肽或其酰胺或其酯或其盐，它们包含与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。

3、权利要求2所述促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，其中SEQ IDNO：44所示氨基酸序列为SEQ ID NO：3、18或32所表示的氨基酸序列。

4、权利要求2所述促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，其中SEQ IDNO：45所示氨基酸序列为SEQ ID NO：6、21或35所表示的氨基酸序列。

5、权利要求1所述促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，其中G蛋白偶联型受体蛋白包含与SEQ ID NO：46所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。

6、权利要求1所述促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，它是一种促肾上腺皮质素释放素的分泌促进剂。

7、权利要求1所述促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，它是用于治疗或预防醛甾酮过少症、低皮质醇血症、继发性或慢性肾上腺皮质机能减退、艾迪生病、肾上腺功能不全、肥胖症的药物。

8、一种促肾上腺皮质素释放素的分泌调节剂，其中包含具有改变G蛋白偶联型受体蛋白与针对这个G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽之间的结合特性的化合物或其盐。

9、针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐在制备具有促肾上腺皮质素释放素分泌调节作用的药物中的应用。

10、一种促肾上腺皮质素释放素分泌调节的方法，其特征为，将针对G蛋白偶联型受体蛋白的配体肽或其酰胺或其酯或其盐投药于哺乳动物。