CN101863972B - 色素合成kit配体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及引起色素沉着疾病的色素合成KIT配体的突变物、其编码序列、含有所述编码序列的表达载体及其在制备治疗色素沉着疾病用的药物中的应用。本发明还涉及利用本发明色素合成KIT配体筛选治疗色素沉着用的药物的方法。

Description

色素合成KIT配体及其应用

技术领域

本发明涉及色素合成KIT配体及其应用。具体而言，本发明涉及引起色素沉着疾病的色素合成KIT配体的突变物及其在制备治疗色素沉着疾病用的药物中的应用。

背景技术

家族性进行性色素沉着又名弥漫性色素沉着(FPH)，是一种罕见的先天性遗传病，Chernosky最早报道了一个有两代四个人的FPH家系(Chernosky，M.E.，Anderson，D.E.，Chang，J.P.，Shaw，M.W.，和Romsdahl，M.M.(1971).Familial progressive hyperpigmentation.Arch Dermatol 103，581-591 passim.)。色素沉着出现在一出生或婴儿发育早期，不规则的色素斑随着年龄的增长而出现大小，数量的增加与融汇(Rebora，A.和Parodi，A.(1989).Universal inheritedmelanodyschromatosis：a case of melanosis universalis hereditaria？Arch Dermatol125，1442-1443)。这一过程在儿童期进展很快而在青年期相对较慢，最终导致位于脸部，颈部，躯干，四肢，唇，口腔粘膜及手足相连的密集的色素沉着(Ling，D.B.和Lo，T.(1991).Familial progressive hyperpigmentation：a family study inChina.Br J Dermatol 125，607)。随着1989年Rebora报道了一个意大利色素沉着家系与1991年林等报道了一个中国FPH家系，FPH被确定为常染色体显性遗传病(Rebora等，和Ling，D.B.等，同上)。第一个色素沉着疾病位点于2006年被定位于染色体19p13.1-pter界于D19S593与pter之间约45.58cM的区域(Zhang，C.，Deng，Y.，Chen，X.，Wu，X.，Jin，W.，Li，H.，Yu，C.，Xiong，Y.，Zhou，L.和Chen，Y.(2006).Linkage of a locus determining familial progressivehyperpigmentation(FPH)to chromosome 19p13.1-pter in a Chinese family.Eur JDermatol 16，246-250.)。然而，色素沉着致病基因与发病机理仍不清楚。

KITLG，也叫steel factor、stem cell factor和mast cell growth factor，它可以结合并激活KIT受体，对于皮肤中黑色素细胞祖系的发育和维持起着非常重要的作用(Grichnik，J.M.、Burch，J.A.、Burchette，J.和Shea，C.R.(1998).TheSCF/KIT pathway plays a critical role in the control of normal human melanocytehomeostasis.J Invest Dermatol 111，233-238；Anderson，D.M.、Lyman，S.D.、Baird，A.、Wignall，J.M.、Eisenman，J.、Rauch，C.、March，C.J.、Boswell，H.S.、Gimpel，S.D.、Cosman，D.等，(1990).Molecular cloning of mast cell growth factor，ahematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms.Cell 63，235-243；Copeland，N.G.、Gilbert，D.J.、Cho，B.C.、Donovan，P.J.、Jenkins，N.A.、Cosman，D.、Anderson，D.、Lyman，S.D.和Williams，D.E.(1990).Mast cell growthfactor maps near the steel locus on mouse chromosome 10 and is deleted in anumber of steel alleles.Cell 63，175-183；Russell，E.S.(1979).Hereditary anemiasof the mouse：a review for geneticists.Adv Genet 20，357-459；和Manova，K.、Bachvarova，R.F.、Huang，E.J.、Sanchez，S.、Pronovost，S.M.、Velazquez，E.、McGuire，B.和Besmer，P.(1992).c-kit receptor and ligand expression in postnataldevelopment of the mouse cerebellum suggests a function for c-kit in inhibitoryinterneurons.J Neurosci 12，4663-4676)。KITLG存在两种不同剪切转录本，区别在于是否含有外显子6。其中小转录本不包含6号外显子，编码膜结合形式的KITLG(mKITLG)(Huang，E.J.、Nocka，K.H.、Buck，J.和Besmer，P.(1992).Differential expression and processing of two cell associated forms of the kit-ligand：KL-1 and KL-2.Mol Biol Cell 3，349-362)。而大转录本因为含有6号外显子，从而在其膜外部分出现一个蛋白酶切割位点，该位点即可被细胞表面蛋白酶切割从而产生可溶性的分泌蛋白KITLG(sKITLG)(Flanagan，J.G.、Chan，D.C.和Leder，P.(1991).Transmembrane form of the kit ligand growth factor isdetermined by alternative splicing and is missing in the Sld mutant.Cell 64，1025-1035)。两种形式的KITLG mRNAs翻译出来的未成熟蛋白质N端都包含一个25氨基酸的信号肽，但在成熟的KITLG蛋白中信号肽会被切掉(Anderson等，同上)。

在鱼、蝾螈、鸟类以及哺乳动物中，许多研究都表明KIT和KITLG基因对黑色素细胞的发育和色素的生成都起着至关重要的作用，虽然不同物种中KIT和KITLG的表达情况都不一样。此外，黑色素细胞的存活或增值对KIT/KITLG信号通路的依赖程度也是具有种属特异性的(Huang等，同上；Hultman，K.A.、Bahary，N.、Zon，L.I.和Johnson，S.L.(2007).Gene Duplication ofthe zebrafish kit ligand and partitioning of melanocyte development functions to kitligand a.PLoS Genet 3，e17；Parichy，D.M.、Stigson，M.和Voss，S.R.(1999).Genetic analysis of steel and the PG-M/versican-encoding gene AxPG ascandidates for the white(d)pigmentation mutant in the salamander Ambystomamexicanum.Dev Genes Evol 209，349-356；Wehrle-Haller，B.、Meller，M.和Weston，J.A.(2001).Analysis of melanocyte precursors in Nf1 mutants reveals thatMGF/KIT signaling promotes directed cell migration independent of its function incell survival.Dev Biol 232，471-483)。之前的研究也表明KITLG基因的许多突变对纯合小鼠都是致死的，杂合小鼠则会出现不同程度的皮毛颜色稀释(Rajaraman，S.、Davis，W.S.、Mahakali-Zama，A.、Evans，H.K.、Russell，L.B.和Bedell，M.A.(2002).An allelic series of mutations in the Kit ligand gene ofmice.II.Effects of ethylnitrosourea-induced Kitl point mutations on survival andperipheral blood cells of Kitl(Steel)mice.Genetics 162，341-353；Chui，D.H.、Loyer，B.V.和Russell，E.S.(1976).Steel(S1)mutation in mice：identification ofmutant embryos early in development.Dev Biol 49，300-303；Poole，T.W.和Silvers，W.K.(1979).Capacity of adult steel(SI/SId)and dominant spotting(W/Wv)mouseskin to support melanogenesis.Dev Biol 72，398-400)。转基因小鼠中，特异性地在表皮中表达KITLG能够挽救黑色素细胞的减少症状，进而造成表皮过度色素化(Kunisada等，同上；Kunisada，T.、Lu，S.Z.、Yoshida，H.、Nishikawa，S.、Nishikawa，S.、Mizoguchi，M.、Hayashi，S.、Tyrrell，L.、Williams，D.A.、Wang，X.等(1998).Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis inducedby keratinocyte expression of transgenic stem cell factor.J Exp Med 187，1565-1573)。

在人皮肤中，表皮角质化细胞和内皮细胞都会表达KITLG(Hamann，K.、Haas，N.、Grabbe，J.和Czarnetzki，B.M.(1995).Expression of stem cell factor incutaneous mastocytosis.Br J Dermatol 133，203-208；Morita，E.、Lee，D.G.、Sugiyama，M.和Yamamoto，S.(1994).Expression of c-kit ligand in humankeratinocytes.Arch Dermatol Res 286，273-277；Miyamoto，T.、Sasaguri，Y.、Sasaguri，T.、Azakami，S.、Yasukawa，H.、Kato，S.、Arima，N.、Sugama，K.和Morimatsu，M.(1997).Expression of stem cell factor in human aortic endothelialand smooth muscle cells.Atherosclerosis 129，207-213)。KITLG以及其受体KIT的信号通路对黑色素细胞的增殖和色素的合成都很重要(Halaban，R.、Tyrrell，L.、Longley，J.、Yarden，Y.和Rubin，J.(1993).Pigmentation and proliferation ofhuman melanocytes and the effects of melanocyte-stimulating hormone andultraviolet B light.Ann N Y Acad Sci 680，290-301；Funasaka，Y.、Boulton，T.、Cobb，M.、Yarden，Y.、Fan，B.、Lyman，S.D.、Williams，D.E.、Anderson，D.M.、Zakut，R.、Mishima，Y.等，(1992).c-Kit-kinase induces a cascade of proteintyrosine phosphorylation in normal human melanocytes in response to mast cellgrowth factor and stimulates mitogen-activated protein kinase but isdown-regulated in melanomas.Mol Biol Cell 3，197-209；Hemesath，T.J.、Price，E.R.、Takemoto，C.、Badalian，T.和Fisher，D.E.(1998).MAP kinase links thetranscription factor Microphthalmia to c-Kit signalling in melanocytes.Nature 391，298-301)。将人类皮肤移植到裸鼠中，并在移植的人皮肤中注射可溶性的sKITLG会导致色素沉着，相反，如果注射的是KIT或者KITLG的封闭抗体则会导致黑色素细胞的丧失(Grichnik等，同上)。与此相似，接受KITLG治疗的病人，在其注射KITLG的皮肤区域出现黑色素细胞的增多以及色素沉着(Grichnik，J.M.、Crawford，J.、Jimenez，F.、Kurtzberg，J.、Buchanan，M.、Blackwell，S.、Clark，R.E.、和Hitchcock，M.G.(1995).Human recombinantstem-cell factor induces melanocytic hyperplasia in susceptible patients.J AmAcad Dermatol 33，577-583；Bellet，J.S.、Obadiah，J.M.、Frothingham，B.M.、Kurtzberg，J.和Grichnik，J.M.(2003).A patient with extensive stem cellfactor-induced hyperpigmentation.Cutis 71，149-152)。

本发明人对Ling等报道的中国家系(Ling，D.B.等，同上)进行了全基因组扫描，将致病位点定位于染色体12q21.31-q23.1的区域，随后本发明人在这一区域鉴定了KITLG基因的一个错义突变与FPH相关，由此完成本发明。

发明内容

一方面，本发明涉及一种分离的KITLG蛋白，选自：

(1)如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；和

(2)在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个除第36位氨基酸外的氨基酸且具有SEQ ID NO：2所示蛋白的活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

另一方面，本发明涉及编码本发明分离的KITLG蛋白的多核苷酸序列。

在一个优选实施例中，所述多核苷酸序列的核苷酸序列为编码SEQ ID NO：2所示蛋白质的核苷酸序列。

在另一优选实施例中，所示多核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一方面，本发明涉及一种表达载体，该载体含有编码本发明分离的KITLG蛋白的多核苷酸序列。

在一个优选实施例中，所述载体所含的多核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所述的蛋白质。

在另一优选实施例中，所述载体所含的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

再一方面，本发明涉及本发明所述的分离的KITLG蛋白在制备治疗色素沉着用的药物中的用途。

在一个优选实施例中，所述用途包括使用本发明的分离的KITLG蛋白筛选治疗色素沉着用的候选药物。

又一方面，本发明涉及一种筛选治疗色素沉着用的药物的方法，所述方法包括：

(1)提供黑色素细胞，将其分为两组；

(2)用本发明所述的分离的KITLG蛋白处理其中一组细胞，作为对照组；

(3)用本发明所述的分离的KITLG蛋白处理其中另一组细胞，同时加入待测物质进行处理，作为测试组；和

(4)测量并比较对照组和测试组中的色素含量，其中，使测试组的色素含量为对照组的色素含量的70％以下的待测物质为治疗色素沉着的候选药物。

在一个优选实施例中，所述黑色素细胞为人恶性黑色素肿瘤细胞系A375。

在另一优选实施例中，测试组的色素含量为对照组的色素含量的50％以下的待测物质为治疗色素沉着的候选药物。

本发明还涉及人KITLG抗体在制备治疗色素沉着用的药物中的用途。

本发明再一方面还涉及一种用于检测和/或诊断色素沉着疾病的试剂盒，该试剂盒含有用于检测和/或诊断对象的KITLG基因的107位是否发生了突变的试剂，以及任选地指导使用所述试剂进行检测和/或诊断的说明书。

在一个优选实施例中，所述KITLG基因如SEQ ID NO：5所示。

在另一优选实施例中，所述试剂盒含有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物。

本发明再一方面还涉及本发明所述的多核苷酸序列或本发明蛋白质在制备检测和/或诊断色素沉着疾病用的试剂盒中的用途。

本发明还涉及一种用于检测和/或诊断对象是否色素沉着疾病的试剂盒，该试剂盒含有用于检测和/或诊断对象的KITLG蛋白的试剂，以及任选地指导使用所述试剂进行检测和/或诊断的说明书，其中，如果所述KITLG蛋白的第36位氨基酸为S(丝氨酸)，则表明该对象患有色素沉着疾病。所述试剂包括对KITLG蛋白进行表达、测序的试剂。

附图说明

图1显示FPH疾病的一个六代家系。(A)显示IV-1患者表现出典型的FPH临床症状。患者手背(a)，手掌(b)，肢体(c)，颈部(d)，躯干以及脚掌都表现为色素沉着。(B)显示样本的组织学症状。图中所示为同龄的正常人的皮肤切片(a)和患者的色素沉着部位的皮肤切片(b)。皮肤样本切片用苏木精和伊红染色。放大倍数：×10。色素沉着部位的皮肤，黑色素细胞数量以及基底层角质化细胞色素含量明显增加，同时伴随着轻微的黑色素细胞大小增大。(C)显示家系单体型图。微卫星分子标记由上至下为着丝粒-D12S83-D12S326-D12S1708-D12S1667-D12S81-D12S351-D12S101-D12S2081-D12S346-D12S78-端粒。黑色竖条代表携带疾病基因单体型。打问号的表示基因型不能确定，方块代表男性家族成员，圆圈代表女性，黑色代表患者，空白的代表正常。方块和圆圈中存在的斜线表示已故。

图2显示对FPH家系人群中sKITLG的突变分析以及突变体sKITLG对色素合成的影响。(A)显示正常等位基因的测序图，36位密码子(AAT)编码天冬酰胺。(B)显示突变等位基因测序图，图示杂合子c.107A--＞G，导致36位氨基酸由天冬酰胺突变成丝氨酸(AGT)(p.N36S)。(C)显示与野生型sKITLG相比，突变型sKITLGN36S会显著增加A375细胞色素合成含量。(D)显示，A375中sKITLGN36S比sKITLG更能显著提高细胞内酪氨酸酶的活性。

图3A显示考马斯亮蓝染色显示纯化的野生型和突变性KITLG都只有一条清晰明亮的条带。图3B显示免疫印迹也表明纯化出来的蛋白质能被人KITLG抗体识别。

具体实施方式

本发明一方面涉及一种分离的突变KITLG蛋白，其序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还包括术语所述突变KITLG蛋白的类似物。术语“类似物”指具有天然多肽序列和结构，以及相对于天然分子的一个或多个(通常是几个)氨基酸添加、取代(通常性质保守)和/或缺失的化合物，只要修饰不破坏该突变KITLG蛋白的活性。当然，所述一个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失不包括本发明突变KITLG蛋白第36位上的氨基酸突变。制备多肽和突变蛋白的方法是本领域已知的。

特别优选的类似物包括性质上保守的取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的取代将不会对生物活性有重要影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约1 5-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。

因此，本发明的蛋白质包括：(1)如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；和(2)在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个除第36位氨基酸外的氨基酸且具有SEQ ID NO：2所示蛋白的活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

可采用各种方法制备本发明的蛋白质。通常用重组方法制备本发明的蛋白质。可以用标准分子生物学方法制备编码本发明蛋白质的多核苷酸。例如，用重组方法可以获得编码上述分子的多核苷酸序列，例如通过从表达该基因的细胞筛选cDNA和基因组文库，或通过从已知的包括该基因的载体衍生该基因。也可合成而非克隆制备感兴趣的基因。可用适当的特定序列的密码子消化该分子。然后将用标准方法制备的重叠的寡核苷酸装配完整的序列，并装配入完整的编码序列中。参见如Edge(1981)Nature 292：756；Nambair等(1984)Science223：1299；和Jay等(1984)J.Biol.Chem.259：6311。

因此，从携带所需序列的载体可获得具体的核苷酸序列，或用本领域已知的各种寡核苷酸合成方法，如定位诱变和聚合酶链式反应(PCR)，完全或部分合成。参见如Sambrook，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：aLaboratory Manual)，第二版，1989。具体说，获得编码所需序列的核苷酸序列的方法是用常规的自动多核苷酸合成仪制备的退火补集的重叠的合成的寡核苷酸，然后用适当的DNA连接酶连接，并用PVR扩增连接的核苷酸序列。参见如Jayaraman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4084-4088。另外，在本发明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等，(1986)Nature 54：75-82)、先有核苷酸区域的寡核苷酸定向诱变(Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327和Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)和用T4DNA聚合酶进行的酶促补平带缺口的寡核苷酸合成(Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10029-10033)。

一旦制备或分离了编码序列，就可将这些序列克隆入任何合适的载体或复制子中。对本领域技术人员而言，各种克隆载体是已知的，且适当的克隆载体的筛选只是选择问题。合适的载体包括(但并非限制于)：质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或当与适当的控制元件结合时能复制的病毒。

然后将克隆序列置于合适的控制元件的控制下，这取决于用于表达的系统。因此，可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵子的控制下，从而由合适的转化体将感兴趣的DNA序列转录到RNA中。该编码序列可以包含或不包含信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工除去)。参见如美国专利No.4,431,739；4,425,437；4,338,397。

除了控制序列外，可以添加调节序列，从而可以相对于宿主细胞的生长调节序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的，其实例包括那些能导致应答化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)启动或关闭基因表达的调节序列。载体中还可存在其它类型的调节元件。例如，可以使用增强子元件以增加构建物的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBOJ.4：761)；从Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)衍生的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777)；和从人CMV衍生的元件(Boshart等，(1985)Cell 41：521)，如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利No.5,688,688)。表达盒中还可包括在合适的宿主细胞中自主复制的复制起点、一种或多种可选择的标记物、一个或多个限制酶切位点、高拷贝数量的势能和强启动子。

构建表达载体，使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中，与控制序列有关的编码序列的位置和取向使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，结合于控制序列中DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰来实现此目的。例如，在一些情况中可能需要修饰该序列，从而使其连接于适合取向的控制序列，即维持读框。在插入到载体之前，控制序列和其它调节序列可能连接于编码序列。或者，可以将编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制酶切位点的表达载体中。

通过缺失一部分编码感兴趣的多肽的序列、插入序列、和/或替代该序列内的一个或多个核苷酸，可以制备用于分析的本发明蛋白的突变体或类似物。修饰核苷酸序列的方法，如定向诱变等是本领域技术人员所熟知的。参见如Sambrook等，上述；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：448；Geisselsoder等(1987)BioiTechniques 5：786；Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100：468；Dalbie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79：6409。

这种分子可以在各种系统中表达，包括本领域熟知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。

例如，昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员已知的，描述于如Summers和Smith，Texas Aguricultural Experiment Station BulletinNo.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法都是可以试剂盒形式购得的，尤其是Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″试剂盒)。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域熟知的，其描述见如Sambrook等，如上。酵母表达系统也是本领域熟知的，其描述见如《酵母遗传工程》(Yeast GeneticEngineering)(Barr等编辑，1989)Butterworths，London。

许多用于上述系统的适合的宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞系是本领域已知的，其包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖化的细胞系，如(但并非限制于)中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞等。类似地，在本发明的表达构建物中也可使用细菌宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌和链球菌。在本发明中还可用酵母宿主，特别包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、季也蒙氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和yarrowia lipolytica。可与杆状病毒表达系统一起使用的昆虫细胞特别包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。

用本领域熟知的各种基因送递的方法，可将包含感兴趣的核苷酸序列的核酸分子稳定地整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中的稳定的附加型元件上维持。参见如美国专利No.5,399,346。

根据所选用的表达系统和宿主，在表达蛋白质的条件下，培养用如上所述的表达载体转化的宿主细胞制备该分子。然后从宿主细胞分离出表达的蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到培养基中，则直接从培养基纯化产物。如果不是分泌的，则从细胞裂解液分离。适合的培养条件和回收方法的选择都是在本领域技术人员能力之内。

本发明另一方面涉及编码本发明突变的KITLG蛋白的分离的核苷酸序列。在一个具体实施例中，该编码序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还包括与SEQ ID NO：1基本上同源的核苷酸序列。“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50％，优选至少约为75％、更佳至少约为80-85％、尤其佳至少约为90％、最佳至少约为95-98％序列相似性时，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。

通常，“相同性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息，计算两条排列的序列间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，从而可得到相同性百分数。

在同源性和相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.，2：482-489，1981 )。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。

本发明建立同源性百分数的另一方法是使用版权属于爱丁堡大学、由JohnF.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分＝12，间隔延伸罚分＝1，间隔＝6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列同源性”。计算序列间的相同性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的，例如，另一种排列程序是BLAST，使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP：基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http://www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。

或者，在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化的片段的大小，从而测出同源性。在如(对具体的体系所定义的)严格条件下进行的Southern杂交试验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。

当涉及一种多肽时，“分离”意味着所述的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开，或基本不存在其它相同类型的生物大分子。术语“分离”对于核酸是：一种核酸分子，它完全或部分缺乏与其天然结合的序列；或一个序列，因为它天然存在，但具有与其结合的异源序列；或从染色体分离的分子。

本发明又一方面涉及本发明蛋白质的抗体。“抗体”指通过化学或物理方法与感兴趣的多肽专一性结合的分子。因此，本发明的抗体是一种与本发明蛋白特异性结合的分子。本文所用的术语“抗体”包括从多克隆和单克隆制备物获得的抗体，及以下：杂交(嵌合)抗体分子(参见如Winter等(1991)Nature349：293-299；和美国专利No.4,816,567)；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异二聚体，参见如Inbar等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69：2659-2662；和Ehrlich等(1980)Biochem 19：4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(参见如Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；二聚和三聚抗体片段构建物；小抗体(参见如Pack等(1992)Biochem 31：1579-1584；Cumber等(1992)JImmunology 149B：120-126)；人源化抗体分子(参见如Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534-1536；和英国专利申请No.GB 2,276,169，1994年9月21日出版)；和从这些分子获得的任何功能性片段，其中这些片段维持亲本抗体分子的免疫结合性质。

本文所用的术语“单克隆抗体”指具有同源抗体群的抗体组合物。术语不限于抗体种类或来源，也不受其制备方式的限制。因此，该术语包括从小鼠杂交瘤获得的抗体，及用人而不是小鼠杂交瘤获得的人单克隆抗体。参见如Cote等，《单克隆抗体和癌症的治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，1985，第77页。

本发明再一方面包括筛选或预测治疗色素沉着的药物的方法，该方法包括使用本发明的蛋白质处理黑色素细胞，同时加入待测化合物，作为测试组，并以未加入待测化合物而仅加入本发明化合物的试验作为对照组，然后检测两组中的色素含量，其中，能使测试组中的色素含量明显低于对照组中的色素含量的化合物可作为候选的药物。所述“明显低于”通常指测试组中的色素含量是对照组的70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下甚至更低。黑色素细胞可以是本领域常用的任何细胞系，例如恶性黑色素肿瘤细胞系A375。待筛选的化合物可以是抗体，也可以是各种化学物质。

本发明另一方面还涉及本发明蛋白质、多核苷酸序列以及抗体在制备治疗色素沉着用的药物中的应用。因此，本发明包括本发明蛋白质和多核苷酸序列在寻找治疗色素沉着用的药物中的应用。本发明还涉及人KITLG抗体治疗色素沉着用的药物中的用途。所述抗体可以是已知的人KITLG抗体，既可以是野生型KITLG的抗体，也可以是本发明突变型KITLG的抗体。

本发明还包括含有本发明蛋白质和/或核苷酸的试剂盒。任选地，该试剂盒还包括如何使用该蛋白质和/或核苷酸的说明书。

本发明还包括用于检测和/或诊断色素沉着疾病的试剂盒，该试剂盒含有用于检测和/或诊断对象的KITLG基因的107位是否发生了突变的试剂，以及任选地指导使用所述试剂进行检测和/或诊断的说明书。所述试剂通常包括扩增KITLG和对扩增产物进行测序的试剂，包括各种合适的PCR用试剂以及引物。

本发明还包括本发明KITLG基因的如下用途：设计用于检测以确定其107位碱基是否发生了突变的特异性引物或探针。针对已知碱基序列设计特异性探针或引物的方法是本领域周知的。例如可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(上册P607-610)。

因此，用于检测KITLG基因107位是否发生突变的引物和探针也在本发明范围之内。所述引物例如SEQ ID NO：3和4所示。

在本发明中，色素沉着包括家族性进行性色素沉着(FPH)。

本发明还包括含有本发明蛋白质、核苷酸、或所述蛋白质的特异性抗体的组合物。组合物中还可以含有药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的KITLG蛋白的特异性抗体以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

含有本发明核苷酸的表达载体、以及含有所述表达载体的细胞也在本发明范围之内。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

此外，虽然本发明以各个具体实施例的方式进行描述，但是应理解，将各具体实施例中的各具体特征组合起来所得的技术方案也是在本发明的范围之内。

实施例1

本发明研究对象为山东省农村一个具有典型家族性进行性(FPH)色素沉着症状的六代家系。本发明人获得完整的系谱图，鉴定了18个患病的病人(9个男性9个女性)。临床检查发现所有家系病人均表现为单纯的色素沉着无伴发症状(图1)。例如家系图中IV-1的患者，53岁男性，色素沉着发于面部，颈部，躯干与足底相连的部位。无一患者有皮肤癌，疾病的家系传递方式为常染色体显性。本研究经过伦理委员会审批。在家系中共有25人参与了研究，但仅对17人的有效数据进行了连锁分析。外周血采血经过家系成员的同意后进行。DNA抽提用QIAmp血液DNA抽提试剂盒(Qiagen，德国)进行。

采用了覆盖22条染色体平均密度10cM的382个荧光标记微卫星标记引物(连锁分型试剂盒，version 2，Perkin Elmer)对该色素沉着家系进行了全基因组扫描。PCR扩增在10μl体系中按照标准程序(具体如下文所示)进行，使用的仪器是PTC-225 DNA扩增仪(MJ Rearch公司，美国)。PCR产物在ABI377XL DNA测序仪上进行5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。等位片段大小由每个泳道分子大小内标确定(GeneScan 400 HD ROX，Perkin Elmer)，电泳结果用GeneScan 3.0与Genotyper 2.1软件分析(Perkin Elmer)。

基因组DNA突变的鉴定如下：

使用QIAmp DNA Blood Mini Kit提取待测人血样基因组DNA，电泳检测质量。使用以下的引物：

正向：TGAGCATAGCTTGAATGCGT(SEQ ID NO：3)

反向：AGCAGTGGTGTGCAACTAGC(SEQ ID NO：4)

以基因组DNA为模板使用ABI公司的TaqGold高温聚合酶进行PCR扩增，PCR热循环条件是：

高温聚合酶热启动，模板变性：95℃  10分钟

第一轮热循环

95℃  30秒

68℃  45秒

每一次循环降低一度

72℃  2分30秒

循环12次

第二轮热循环

95℃  30秒

56℃  45秒

72℃  30秒

循环35次

72℃  10分钟

反应结束

PCR产物经1.2％琼脂糖电泳检测，用虾碱性磷酸酶(SAP)购自BIOASA公司)及核酸外切酶I(EXOI)购自EPERCENTER公司纯化后用ABI公司的BigDye terminal试剂及3100全自动测序仪测序，

测序引物为：

正向：TGAGCATAGCTTGAATGCGT(SEQ ID NO：3)

反向：AGCAGTGGTGTGCAACTAGC(SEQ ID NO：4)

测序反应条件如下：

模板变性98℃  2分

96℃  20秒

51℃  20秒

60℃  4分

循环25次

电泳分析结果用LINKAGE V5.0软件包进行连锁分析(Lathrop，G.M.和Lalouel，J.M.(1984).Easy calculations of lod scores and genetic risks on smallcomputers.Am J Hum Genet 36，460-465，本文以引用的方式将其内容纳入本文)，设定条件为常染色体显性，疾病等位频率0.0001，等位频率平均分布，完全显性，无性别差异。家系图绘制与单体型构建由Cyrillic v2.0软件(Cyrillic软件，UK)完成。

全基因组扫描将致病基因的候选区域定位于12q，在D12S81位点

＝0.00时两点分析LOD值为4.35(表1)。精细定位分析了附近的其他微卫星标记(D12S83，D12S326，D12S1708，D12S1667，D12S351，D12S101，D12S2081，D12S346，D12S78，表1)进一步确定了该定位区域。同时，其他染色体位点的扫描结果都显示与色素沉着无关。

表1如下所示。

表1：12q21.31-q23.1区域10个微卫星位点与疾病基因两点连锁分析LOD值表

家系单体型分析(家系图绘制与单体型构建由Cyrillic v2.0软件(Cyrillic软件，UK)完成)发现了三个交换位点，第一个是患者IV-1在D12S1667和D12S81之间有一次交换；第二个是患者V-12在D12S1708和D12S1667之间有一次交换；第三个是V-3在D12S101和D12S2081之间有一次交换。以上结果显示FPH致病基因定位于染色体12q21.31-q23.1区域，界于D12S1667和D12S2081之间，约9.09cM。

在以上物理距离内包含有81个已经鉴定的基因，KITLG(GeneID：4254)因为定位于此且有相关功能研究的暗示，候选基因分析针对该基因展开。本发明人先选择V-5患者进行该基因的突变扫描。在对所有外显子与相邻区域的测序中，本发明人发现了外显子2中的一个c.107A→G杂合变化，在家系正常人中是不存在的，这一变化导致了KITLG基因编码蛋白36位氨基酸由天冬氨酸转变成了丝氨酸。在正常人基因组中两条姐妹染色体的等位基因的AATAATGTAAA下划线处均为A，故测序图谱显示一个单峰，而在家族性进性行色素沉着病人的基因组中有一个等位基因的A突变为G，测序图谱显示一个A/G杂合峰(图2A和2B)。这一变化直接导致其编码产物由天冬酰胺(N)突变成丝氨酸(S)，导致病人发生进性行色素沉着。

该变化与所有家系患者共分离，而正常人却不携带，本发明人确定了在NCBI SNP数据库中(dbSNP)c.107A→G这一多态是不存在的。进一步的大规模正常人群验证，在296例中国健康人中未检测到该多态。证实了KITLGN36S为一突变(见SEQ ID NO：5，野生型KITLG的核苷酸序列；和SEQ ID NO：6，野生型KITLG蛋白的氨基酸序列)。

实施例2

FPH病人色素沉着区域的组织取样显示表皮处过度色素化以及基底层色素含量的增加，但是没有发现黑色素细胞的增多(Rebora，A.和Parodi，A.(1989).Universal inherited melanodyschromatosis：a case of melanosis universalishereditaria？Arch Dermatol 125，1442-1443；Ling，D.B.和Lo，T.(1991).Familialprogressive hyperpigmentation：a family study in China.Br J Dermatol 125，607；Zhang，C.、Deng，Y.、Chen，X.、Wu，X.、Jin，W.、Li，H.、Yu，C.、Xiong，Y.、Zhou，L.和Chen，Y.(2006).Linkage of a locus determining familial progressivehyperpigmentation(FPH)to chromosome 19p13.1-pter in a Chinese family.Eur JDermatol 16，246-250；Zanardo，L.、Stolz，W.、Schmitz，G.、Kaminski，W.、Vikkula，M.、Landthaler，M.和Vogt，T.(2004).Progressive hyperpigmentation andgeneralized lentiginosis without associated systemic symptoms：a rare hereditarypigmentation disorder in south-east Germany.Acta Derm Venereol 84，57-60)。为了研究KITLG中p.N36S的突变对色素合成的影响，本发明人在大肠杆菌中表达并纯化可溶性形式存在的野生型sKITLG和突变体sKITLGN36S。考马斯亮蓝染色显示纯化的野生型和突变性KITLG都只有一条清晰明亮的条带(图3A)，并且免疫印迹也表明纯化出来的蛋白质能被人KITLG抗体识别(图3B)。

实施例3

用野生型和突变型sKITLGN36S分别刺激人恶性黑色素肿瘤细胞系A375，然后测定细胞中色素合成含量。

具体而言，A375细胞分别用100ng/ml野生型sKITLG和突变型sKITLGN36S刺激24h，收集细胞，细胞沉淀用含10％DMSO的1N NaOH溶解，80℃孵育2h，12,000×g离心10分钟，上清溶液用TECAN Safire2(USA)测定420nm光吸收值。重组黑色素(sigma)标准品做标准曲线。统计学差异用two-sided Student’s t检验分析。该结果得到4次实验验证。

结果显示野生型和突变型都可以引起A375单个细胞合成的色素含量增加，单细胞合成黑色素的含量从16.2pg(野生型sKITLG)增加到33.9pg(突变型sKITLGN36S)。与野生型sKITLG相比，突变型sKITLGN36S非常显著地增加了单细胞合成色素的含量，高达209％。这表明突变型sKITLGN36S比野生型sKITLG具有更强的刺激色素合成的作用(图2C)。

许多报告证明酪氨酸酶是色素合成的关键因素(Luo，D.、Chen，H.、Searles，G.和Jimbow，K.(1995).Coordinated mRNA expression of c-Kit with tyrosinaseand TRP-1 in melanin pigmentation of normal and malignant human melanocytesand transient activation of tyrosinase by Kit/SCF-R.Melanoma Res 5，303-309；Sriwiriyanont，P.、Ohuchi，A.、Hachiya，A.、Visscher，M.O.和Boissy，R.E.(2006).Interaction between stem cell factor and endothelin-1：effects on melanogenesis inhuman skin xenografts.Lab Invest 86，1115-1125；Cook，A.L.、Chen，W.、Thurber，A.E.、Smit，D.J.、Smith，A.G.、Bladen，T.G.、Brown，D.L.、Duffy，D.L.、Pastorino，L.、Bianchi-Scarra，G.等，(2008).Analysis of Cultured Human Melanocytes Basedon Polymorphisms within the SLC45A2/MATP，SLC24A5/NCKX5，and OCA2/PLoci.J Invest Dermatol 24，24；Tsuchiya，T.、Yamada，K.、Minoura，K.、Miyamoto，K.、Usami，Y.、Kobayashi，T.、Hamada-Sato，N.、Imada，C.和Tsujibo，H.(2008).Purification and determination of the chemical structure of the tyrosinase inhibitorproduced by Trichoderma viride strain H1-7 from a marine environment.BiolPharm Bull 31，1618-1620；Huang，Y.H.、Lee，T.H.、Chan，K.J.、Hsu，F.L.、Wu，Y.C.和Lee，M.H.(2008).Anemonin is a natural bioactive compound that canregulate tyrosinase-related proteins and mRNA in human melanocytes.J DermatolSci 49，115-123)。于是本发明人测定了野生型sKITLG和突变型sKITLGN36S分别刺激A375细胞后酪氨酸酶活性的变化。

具体而言，用与测定黑色素含量相同的方法刺激A375细胞，蛋白浓度用Lowry法(Protein measurement with the Folin phenol reagent，LOWRY OH，ROSEBROUGH NJ，FARR AL，RANDALL RJ.J Biol Chem.1951Nov；193(1)：265-75，本文将其全文以引用的方式参考结合于此)测定，BSA(牛血清白蛋白)作为标准品。每1ml磷酸钠缓冲液(pH7.4，0.1％L-dopa)中加入40μg蛋白，37℃孵育2h，用TECAN Safire2(USA)测定475nm吸收光值。统计学差异用two-sided Student’s t检验分析。重复两次实验得到相同结果。

与之前的结果相符，突变型sKITLGN36S刺激A375细胞后酪氨酸酶活性明显高于野生型sKITLG刺激的细胞(图2D)。所有这些数据表明突变型sKITLGN36S蛋白具有增强色素合成的能力。这个结果也与FPH病人的组织样本显示的基底层色素增加相符合(图1B)。然而，野生型和突变型的sKITLG刺激的A375细胞都没有引起增殖方面的差异(数据未显示)。

实施例4

本实施例阐述了采用本发明蛋白质进行的药物筛选。

测试组：用候选化合物处理的加了本发明突变型sKITLGN36S蛋白的人恶性黑色素肿瘤细胞系A375培养物；

对照组：不用候选物质处理的加了本发明突变型sKITLGN36S蛋白的人恶性黑色素肿瘤细胞系A375培养物。

在处理后适当时间，采用常规方法测定所述细胞的色素含量。如果与对照组相比，测试组中的色素含量为对照组的色素含量的70％以下，则说明该候选物质是潜在的治疗色素沉着的物质。

讨论

FPH很可能是一种异质性疾病(heterogenous disease)，因为C.Zhang等对一个FPH的3代家系进行了全基因组扫描，将相关基因定位在染色体19p13.1-pter界于D19S593与pter之间约45.58cM的区域，但是没有定位到具体的致病基因。在本发明中，本发明人将FPH致病基因定位在染色体12q21.31-q23.1区域，候选基因分析揭示突变型KITLGN36S是该6代FPH家系的关键致病基因。蛋白质功能分析进一步确证了这个观点。

总而言之，本发明证实了KITLG中p.N36S的突变是遗传性FPH的致病基因。结果显示对于色素合成，可溶性突变型sKITLG产生了获得性功能突变，从而导致患者出现色素沉着。这个结论为今后了解FPH疾病中色素沉着的分子机制提供了很好的线索，也为发展有效地干预策略提供理论帮助。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>色素合成KIT配体及其应用

<130>092106

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>822

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgaagaaga cacaaacttg gattctcact tgcatttatc ttcagctgct cctatttaat     60

cctctcgtca aaactgaagg gatctgcagg aatcgtgtga ctaatagtgt aaaagacgtc    120

actaaattgg tggcaaatct tccaaaagac tacatgataa ccctcaaata tgtccccggg    180

atggatgttt tgccaagtca ttgttggata agcgagatgg tagtacaatt gtcagacagc    240

ttgactgatc ttctggacaa gttttcaaat atttctgaag gcttgagtaa ttattccatc    300

atagacaaac ttgtgaatat agtggatgac cttgtggagt gcgtgaaaga aaactcatct    360

aaggatctaa aaaaatcatt caagagccca gaacccaggc tctttactcc tgaagaattc    420

tttagaattt ttaatagatc cattgatgcc ttcaaggact ttgtagtggc atctgaaact    480

agtgattgtg tggtttcttc aacattaagt cctgagaaag attccagagt cagtgtcaca    540

aaaccattta tgttaccccc tgttgcagcc agctccctta ggaatgacag cagtagcagt    600

aataggaagg ccaaaaatcc ccctggagac tccagcctac actgggcagc catggcattg    660

ccagcattgt tttctcttat aattggcttt gcttttggag ccttatactg gaagaagaga    720

cagccaagtc ttacaagggc agttgaaaat atacaaatta atgaagagga taatgagata    780

agtatgttgc aagagaaaga gagagagttt caagaagtgt aa                       822

<210>2

<211>273

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu

1                5                    10                  15

Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg

             20                  25                   30

Val Thr Asn Ser Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro

         35                  40                   45

Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu

    50                   55                   60

Pro Ser His Cys Trp Ile Ser 6lu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser

65                   70                   75                  80

Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser

                 85                  90                   95

Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val

            100                  105                  110

Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys

        115                  120                  125

Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe

    130                  135                  140

Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr

145                  150                 155                  160

Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg

                 165                 170                 175

Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser

            180                  185                  190

Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro

        195                  200                  205

Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe

    210                  215                  220

Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg

225                  230                 235                  240

Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu

                245                  250                  255

Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu

            260                  265                  270

Val

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

tgagcatagc ttgaatgcgt

20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

agcagtggtg tgcaactagc

20

<210>5

<211>822

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

atgaagaaga cacaaacttg gattctcact tgcatttatc ttcagctgct cctatttaat     60

cctctcgtca aaactgaagg gatctgcagg aatcgtgtga ctaataatgt aaaagacgtc    120

actaaattgg tggcaaatct tccaaaagac tacatgataa ccctcaaata tgtccccggg    180

atggatgttt tgccaagtca ttgttggata agcgagatgg tagtacaatt gtcagacagc    240

ttgactgatc ttctggacaa gttttcaaat atttctgaag gcttgagtaa ttattccatc    300

atagacaaac ttgtgaatat agtggatgac cttgtggagt gcgtgaaaga aaactcatct    360

aaggatctaa aaaaatcatt caagagccca gaacccaggc tctttactcc tgaagaattc    420

tttagaattt ttaatagatc cattgatgcc ttcaaggact ttgtagtggc atctgaaact    480

agtgattgtg tggtttcttc aacattaagt cctgagaaag attccagagt cagtgtcaca    540

aaaccattta tgttaccccc tgttgcagcc agctccctta ggaatgacag cagtagcagt    600

aataggaagg ccaaaaatcc ccctggagac tccagcctac actgggcagc catggcattg    660

ccagcattgt tttctcttat aattggcttt gcttttggag ccttatactg gaagaagaga    720

cagccaagtc ttacaagggc agttgaaaat atacaaatta atgaagagga taatgagata    780

agtatgttgc aagagaaaga gagagagttt caagaagtgt aa                       822

<210>6

<211>273

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu

1                5                   10                   15

Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg

            20                   25                   30

Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro

        35                   40                   45

Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu

    50                   55                   60

Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser

65                   70                  75                   80

Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser

                85                   90                   95

Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val

            100                  105                  110

Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys

        115                  120                  125

Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe

    130                  135                  140

Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr

145                  150                 155                  160

Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg

                165                  170                  175

Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser

            180                  185                  190

Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro

        195                  200                  205

Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe

    210                  215                  220

Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg

225                  230                 235                  240

Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu

                245                  250                  255

Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu

            260                  265                  270

Val

Claims (6)

1.一种分离的KITLG蛋白，选自如SEQ ID NO:2所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的分离的KITLG蛋白的多核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的多核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

6.一种用于检测和/或诊断家族性进行性色素沉着的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有用于检测和/或诊断对象的KITLG基因的第107位是否由A突变为G的试剂，以及任选地指导使用所述试剂进行检测和/或诊断的说明书。

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