CN1149286C - G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途 - Google Patents

G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1149286C
CN1149286C CNB961993820A CN96199382A CN1149286C CN 1149286 C CN1149286 C CN 1149286C CN B961993820 A CNB961993820 A CN B961993820A CN 96199382 A CN96199382 A CN 96199382A CN 1149286 C CN1149286 C CN 1149286C
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
aminoacid sequence
protein
amino
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB961993820A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1207126A (zh
Inventor
日沼州司
羽畑祐吾
川俣裕二
细谷昌树
藤井亮
福住昌司
北田千惠子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of CN1207126A publication Critical patent/CN1207126A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1149286C publication Critical patent/CN1149286C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本发明涉及人垂体-和小鼠胰腺-来源的G蛋白-偶联受体蛋白的配体多肽。该配体多肽和编码该配体多肽的DNA可以用于(1)开发药物，例如垂体功能调节剂、中枢神经系统调节剂、胰腺功能调节剂，和(2)开发利用重组受体蛋白的表达和筛选药物候选化合物的受体结合测定系统。尤其是，通过利用按照本发明的重组G蛋白-偶联受体蛋白的表达的受体结合测定系统，可以筛选对人和其它温血动物特异性的兴奋剂和拮抗剂，并且所获得的兴奋剂或拮抗剂可以用作各种疾病的治疗和预防剂。

Description

G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途
技术领域
本发明涉及G蛋白偶联受体蛋白的新配体多肽和包含编码该配体的DNA的DNA。
发明背景
许多激素和神经递质通过细胞膜上的特异性受体介导生物学功能。许多这些受体通过活化偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(在下文有时主要称为G蛋白)自愿承担信号的胞内转导，并且具有包含7个跨膜结构域的共同结构。因而，这些受体统称为G蛋白偶联受体或者7-跨膜受体。
通过G蛋白偶联受体调节由这些激素和神经递质介导的生物学功能的一种途径是下丘脑-垂体系统。因而，下丘脑激素(垂体释放因子)控制着垂体激素从下丘脑分泌，并且通过释放到循环中的垂体激素调节靶细胞或器官的功能。这种途径对生物体进行重要的功能调节，例如，生殖、发育、代谢和个体生长的调节。正反馈或负反馈机制控制着垂体激素的分泌，该机制包含从所说的靶内分泌腺分泌下丘脑激素和外周激素。存在于下丘脑的不同受体蛋白在下丘脑-垂体系统的调节方面起着重要的作用。
同时，这些激素和因子以及它们的受体没有定位在下丘脑-垂体系统中，而是广泛地分布于脑中。这一点为大家所熟知。因而，人们怀疑，在中枢神经系统中这种被称作下丘脑激素的物质正作为神经递质或神经调质而起作用。另外，这种物质也分布在外周组织中并且被认为在各自组织中发挥着重要的作用。
胰腺通过分泌胰高血糖素和胰岛素以及消化液在糖代谢方面起着决定性作用。胰腺的β细胞分泌胰岛素，而主要是葡萄糖刺激它的分泌。然而，β细胞具有不同的受体，并且除葡萄糖以及肽激素(例如galanine、促生长素抑制素、肠抑胃肽、胰高血糖素、amyrin等)外；糖(如甘露糖等)；氨基酸和神经递质外，胰岛素的分泌受许多因子的控制，这一点为大家所熟知。
迄今可用于鉴定所说的蛋白偶联受体配基的仅有的方法是从G蛋白偶联受体蛋白初级结构的同源性估计。
近来通过对新阿片样肽的研究，已经报道把编码受体蛋白(其受体蛋白的配基是未知的)，例如，孤独G蛋白偶联受体蛋白(ReinSheid，R，K，等科学，270，792-794，1995，Menular，J-C，等，自然377，532-535，1995)的cDNA插入到动物细胞中去。然而，鉴于已知的G蛋白偶联受体蛋白和组织分布的相似性，在这些情况下，人们很容易预料配体应该属于阿片样肽家族。许多年前就开始了通过阿片样物质受体对生物体起作用的物质领域的研究和开发，并且已经开发出不同的拮抗剂和兴奋剂。在人工合成的复合物中，选择出受体的拮抗剂，用它作为探针，在受体cDNA转染的细胞中确定出该受体的表达。
然后，进行对与兴奋剂相似的细胞外信号转导激活物的研究，纯化所发现的激活物，并且测定出其配体的结构。然而，当孤独受体与已知的G蛋白偶联受体蛋白的同源性很低时，预测其配体非常困难。
在下丘脑、中枢神经系统和胰腺的β细胞中表达的孤独G蛋白偶联受体的配体被认为对开发药物非常有用，但是到目前为止，还没有阐明它们的结构与功能。
发明的描述
通过利用合适的方法，并且利用特异细胞刺激活性(例如作为指示器的单-转导活性)的测量方法，使用其中已经表达出编码孤独蛋白偶联受体蛋白的cDNA的细胞，本发明的发明人成功地筛选出了一种多肽，所说的受体蛋白识别其为配体。
此外，发明人发现，能够筛选一种化合物，该化合物能够改变这一配体(其是所说受体蛋白的一种活化因子)的结合活性。
因而本发明涉及(1)一种包含SEQ ID NO：73所代表的氨基酸序列的多肽或其实质上的等同物，或其酰胺或酯，或其盐。
(2)如上文(1)所描述的多肽，它包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65或SEQ ID NO：66所代表的氨基酸序列。
(3)如上文(1)所描述的多肽，它包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：59所代表的氨基酸序列。
(4)一种如上文(1)所描述的多肽的部分肽，其酰胺或酯，或其盐。
(5)一种包含具有编码如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽的核苷酸序列的DNA的DNA。
(6)如上文(5)所描述的DNA，它包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72所代表的核苷酸序列。
(7)一种包含如上文(5)所描述的DNA的重组载体。
(8)一种携带如上文(5)所描述的DNA或如上文(7)所描述的重组载体的转化体。
(9)一种产生如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽的方法，它包括培养如上文(8)所描述的转化体。
(10)一种药物组合物，该组合物包含如上文(1)所描述的多肽，其酰胺或酯，或其药学上可以接受的盐。
(11)一种药物组合物，该组合物包含如上文(4)所描述的部分肽，其酰胺或酯，或其药学上可以接受的盐。
(12)一种药物组合物，该组合物包含如上文(5)所描述的DNA。
(13)如上文(10)，(11)或(12)所描述的药物组合物，它是垂体功能调制剂。
(14)如上文(10)，(11)，或(12)所描述的药物组合物，它是中枢神经系统功能调制剂。
(15)如上文(10)，(11)，或(12)所描述的药物组合物，它是胰功能调制剂。
(16)一种抗体，该抗体抗如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽。
(17)一种筛选化合物的方法，所说的化合物能够改变如上文(1)所描述的多肽或上文(4)所描述的部分肽与受体蛋白的结合活性，所说的受体蛋白包含SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列或其部分肽或其实质上的等同物，或其盐，这种方法包括在以下二者之间进行比较：(i)将所说的如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽与包SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列或其部分肽或其实质上的等同物，或其盐的受体蛋白相接触的至少一种情况，和(ii)将所说的如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽以及待试样品与包含SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列或其部分肽或其实质上的等同物，或其盐的受体蛋白相接触的至少一种情况。
(18)一种筛选化合物的试剂盒，所说的化合物能够改变如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽与受体蛋白的结合活性，所说的受体蛋白包含SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列或其部分肽或其实质上的等同物，或其盐。
(19)一种化合物，该化合物能够改变如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽与受体蛋白的结合活性，所说的受体蛋白包含SEQ IDNO：21所代表的氨基酸序列或其部分肽或其实质上的等同物，或其盐。
(20)一种识别作为配体的如上文(1)所描述的多肽或如上文(4)所描述的部分肽的G蛋白偶联受体蛋白或其盐。
本发明进一步提供了：
(21)如上文(1)所描述的多肽，或其酰胺或酯或其盐，它包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：73的氨基酸序列，其中1到15个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基，更优选的是1到5个氨基酸残基)从SEQ IDNO：73的氨基酸序列缺失的氨基酸序列，其中1到80个氨基酸残基(优选的是1到50个氨基酸残基，更优选的是1到10个氨基酸残基)被添加到SEQID NO：73的氨基酸序列上的氨基酸序列，其中1到15个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基，更优选的是1到5个氨基酸残基)从SEQ IDNO：73的氨基酸序列上被一种或多种其它氨基酸残基取代的氨基酸序列。
(22)如上文(1)所描述的多肽，它包含一个氨基酸序列，其中SEQ IDNO：74的肽被添加到包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的多肽的N-末端上。
(23)如上文(1)所描述的多肽，它来源于牛，大鼠或人；和
(24)如上文(10)，(11)，或(12)所描述的药物组合物，它是下列疾病的治疗和/或预防剂：痴呆症、抑郁症(忧郁症)、运动过度(小脑疾病)综合症，意识紊乱症、忧虑综合症、精神分裂症、恐惧症、生长激素分泌疾病、暴食症、贪食症、血胆甾醇过多症、甘油酯醇过多症、血脂过多症促乳素过多症、糖尿病、癌、胰腺炎、肾部疾病、特纳氏综合症、神经官能症、风温性关节炎、棘伤害症、瞬时人脑缺血症、肌萎缩横向硬化症、急性心肌梗塞、脊髓小脑退化症、骨折、创伤。特应性皮炎、骨质疏松、气喘、癫痫、不育和/或乳汁减少症。
参照按照本发明的G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽，本发明特别提供了(25)如(20)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐。所说的蛋白包含SEQID NO：19所代表的氨基酸序列或其实质上的等同物或/和SEQ ID NO：20所代表的氨基酸序列或其实质上的等同物；
(26)如上文(25)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，所说的蛋白包含SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列或其实质上的等同物；
(27)如上文(25)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，所说的蛋白包含SEQ ID NO：22所代表的氨基酸序列或其实质上的等同物；
(28)如上文(25)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，所说的蛋白包含SEQ ID NO：23所代表的氨基酸序列或其实质上的等同物；
(29)如上文(25)-(28)所描述的任一G蛋白偶联受体蛋白的部分肽或其盐；
(30)一种包含具有编码上文(25)所描述的G蛋白偶联受体蛋白的核苷酸序列的DNA的DNA；
(31)一种包含具有编码上文(26)所描述的G蛋白偶联受体蛋白的核苷酸序列的DNA的DNA；
(32)一种包含具有编码上文(27)所描述的G蛋白偶联受体蛋白的核苷酸序列的DNA的DNA；
(33)一种包含具有编码上文(28)所描述的G蛋白偶联受体蛋白的核苷酸序列的DNA的DNA；
(34)如上文(30)所描述的DNA，它包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列或SEQ ID NO：25的核苷酸序列；
(35)如上文(31)所描述的DNA，它包含SEQ ID NO：26的核苷酸序列；
(36)如上文(31)所描述的DNA，它包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列；
(37)如上文(31)所描述的DNA，它包含SEQ ID NO：28的核苷酸序列；
(38)一种包含如上文(30)-(33)所描述的任一DNA的重组载体；
(39)一种携带上文(38)所描述的重组载体的转化体；
(40)一种产生上文(28)所描述的G蛋白联受体蛋白或其盐的方法，该方法包括培养(39)的转化体，以便在其转化体的细胞膜上生成所说的G蛋白偶联受体蛋白。
(41)一种上文(25)-(28)所描述的任-G蛋白偶联受体蛋白或其盐，或上文(29)所描述的部分肽或其盐的抗体。
更具体地说，G蛋白偶联受体蛋白涉及：
(42)如上文(25)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，其中所说的蛋白它包含的(i)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：19的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)从SEQ ID NO：19的氨基酸序列缺失的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)被添加到SEQ ID NO：19的氨基酸序列上的氨基酸序列，和其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)在SEQ IDNO：19的氨基酸序列上被一种或多种其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列和/或(ii)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)从SEQ ID NO：20的氨基酸序列缺失的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)被添加到SEQ ID NO：20的氨基酸序列上的氨基酸序列，和其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)在SEQ ID NO：20的氨基酸序列上被一种或多种其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(43)如上文(26)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，其中所说的蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：21的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)从SEQ ID NO：21的氨基酸序列缺失的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)被添加到SEQ ID NO：21的氨基酸序列上的氨基酸序列，和其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)在SEQ ID NO：21的氨基酸序列上被一种或多种其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(44)如上文(27)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，其中所说的蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)从SEQ ID NO：22的氨基酸序列缺失的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)被添加到SEQ ID NO：22的氨基酸序列上的氨基酸序列，和其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)在SEQ ID NO：22的氨基酸序列上被一种或多种其它氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(45)如上文(26)所描述的G蛋白偶联受体蛋白或其盐，其中所说的蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：23的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)从SEQ ID NO：23的氨基酸序列缺失的氨基酸序列，其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)被添加到SEQ ID NO：23的氨基酸序列上的氨基酸序列，和其中1到30个氨基酸残基(优选的是1到10个氨基酸残基)在SEQ ID NO：23的氨基酸序列上被一种或多种其它氨基酸残基取代的氨基酸序列：
这里所使用的术语“实质上的等同物”意思是所说蛋白质的活性(例如所说的配体和所说的受体的结合活性)和物理特性实质上相同。氨基酸的取代，缺失或插入有时在多肽的物理和化学特性上不产生根本的变化。其中，包含取代、缺失或插入的多肽将被认为与缺乏取代、缺失或插入的多肽是实质上的等同物。在所说的序列上的一个氨基酸的实质上等同的取代基可以是选自所说的氨基酸所说类别的其它成员。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
附图简要描述
图1显示了人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段的核苷酸序列和该核苷酸序列编码的氨基酸，这条cDNA片段包含在cDNA克隆，p19P2中，它是使用人垂体来源的cDNA通过PCR而分离出来的。测序所使用的引物是-21M13。划线区相当于合成引物。
图2显示了人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段的核苷酸序列和该核苷酸序列编码的氨基酸，这条cDNA片段包含在cDNA克隆，p19P2中，它是使用人垂体来源的cDNA通过PCR而分离出来的。测序所使用的引物M13 RV-N(Takara)。划线区相当于合成引物。
图3显示人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段编码的蛋白和部分疏水图，该cDNA片段包含在p19P2中，p19P2是按照图1所显示的氨基酸序列构建的。
图4显示了人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段编码的蛋白的部分疏水图，该cDNA片段包含在p19P2中，p19P2是按照图2所显示的氨基酸序列构建的。
图5是比较一种蛋白质的部分氨基酸序列与所说的已知G蛋白偶联受体蛋白S12863的图，所说的蛋白质是由图1和图2所示的包含在p19P2中的人垂体G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段编码的。阴影区表示相同的区域。p19P2的1到9氨基酸序列相当于图1的1到99氨基酸序列，以及156到230氨基酸序列相当于图2的1到68氨基酸序列。
图6显示了MIN6来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段的核苷酸序列和该核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该cDNA片段以MIN6来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段的核苷酸序列为基础，后者包含在cDNA克隆pG3-2和pG1-10中，它是使用MIN6来源的cDNA通过pCR分离出来的。划线区相当于合成引物。
图7是比较图6所显示的由MIN6来源的G蛋白偶联受体蛋白pG3-2/pG1-10编码的部分氨基酸序列与图1和图2所显示的p19P2编码的蛋白的部分氨基酸序列的图。阴影区相当于相同区域。p19P2编码的蛋白的1到99氨基酸序列相当于图1的1到99氨基酸序列，并且156到233氨基酸序列相当于图2的1到68氨基酸序列。pG3-2/pG1-10编码的蛋白的1到233氨基酸序列相当于图6的1到233氨基酸序列。
图8是根据图6所显示的部分氨基酸序列构建的MIN6来源的G蛋白偶联受体蛋白的部分疏水性图。
图9显示了人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白cDNA的完整核苷酸序列和该核苷酸序列所编码的氨基酸序列，这段受体蛋白cDNA包含在cDNA克隆phGR3中，它是使用插入进p19p2的DNA片段作为探针通过噬斑杂交方法从人垂体来源的CNDA文库中分离出来的。
图10显示了人垂体mRNA的Northern印迹的结果，该mRNA与放射性同位素标记的人垂体cDNA克隆phRH3杂交。
图11显示了人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白cDNA编码的蛋白的疏水性图，该cDNA包含在phGR3中，它是根据图9所显示的氨基酸序列构建的。
图12显示了MIN6来源的蛋白偶联受体蛋白的cDNA片段的核苷酸序列和该苷核酸序列所编码的氨基酸序列，这条cDNA片段包含在cDNA克隆p5S38中，它是使用MIN6来源的cDNA通过pCR分离出来的。下划线区相当于合成引物。
图13显示了比较图12所显示的p5S38编码的MIN6来源的G蛋白偶联受体蛋白的部分氨基酸序列与图1和图2所显示的包含在p19p2中的cDNA片段编码的G蛋白偶联受体蛋白的部分氨基酸序列以及图6所显示的pG33-2和pG1-10中所包含的cDNA片段的核苷酸序列所衍生的核苷酸序列编码的G蛋白偶联受体蛋白的部分氨基酸序列的图。阴影区表示相同的区域。p5S38编码的蛋白的1到144氨基酸序列相当于图12的1到144氨基酸序列，p19p2编码的蛋白的1到99氨基酸序列相当于图1的1到99氨基酸序列，并且156到233氨基酸序列相当于图2的1到68氨基酸序列。pG3-2/pG1-10编码的蛋白的1到223氨基酸序列相当于图6的1到233氨基酸序列。
图14显示了MIN6来源的G蛋白偶联受体蛋白的cDNA编码的蛋白质的部分疏水性图，该受体蛋白cDNA包含在p5S38中，它是根据表12所显示的部分氨基酸序列构建的。
图15显示了下列分析的结果，进行RT-PCR，以证实mRNA在pMKKO-19P2所转染的CHO细胞中的表达。泳道1-7表示为了比较使用pMKKO-19P2的系列稀释液，进行PCR并且通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳分析这些反应混合物所得到的结果。所说的稀释液即作为模板的质粒的10μl/ml母液(泳道1)，1/2稀释液(泳道2)，1/4稀释液(泳道3)，1/64稀释液(泳道4)，1/256稀释液(泳道5)，1/1024稀释液(泳道6)，和1/4096稀释液(泳道7)。泳道8-1是使用从CHO-19p2细胞系制备的cDNA(作为模板)的1/10稀释液(泳道8)，1/100稀释液(泳道9)，1/1000稀释液(泳道10)，进行PCR并且使这些反应混合物各自进行电泳后所得到的结果。泳道11是使用没有反转录酶下进行cDNA的合成所得到模板进行PCR并且使PCR产物进行电泳而得到的。泳道12和13是使用从模拟CHO细胞分别在有和没有添加反转录酶下分别制备的cDNA作为模板通过进行PCR并且使这些各自的反应产物进行电泳而得到的。M代表DNA大小标记。两边的泳道是通过电泳1μlλ/sty I消化(Nippon基因)而得到的，右边第二条泳道是用1μlφ/x174/Hinc II消化(Nippon基因)得而到的。箭头标记指示了约400bp PCR扩增的带的位置。
图16显示了从在鼠整脑中提取的粗制配体肽组分促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的活性。花生四烯酸代谢物释放活性表示为在粗制配体多肽组分存在下所释放的[3H]花生四烯酸代谢物总量的％(规定在0.05％BAS-HABB存在下所释放的[3H]花生四烯酸代谢物总量为100％)。用30％CH3CN组分检测促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。
图17显示了从牛下丘脑中提取的粗制配体肽组分促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞分存在下释放的活性。花生四烯酸代谢物释放活性表示为在粗制配体多肽组分存在下所释放的[3H]花生四烯酸代谢物总量的％(规定在0.05％BAS-HABB存在下所释放的[3H]花生四烯酸代谢物总量为100％)。用30％CH3CN组分(正如来自大鼠整脑中的粗制配体多肽组分一样)检测促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。
图18显示了用反相层析柱C18 218 TP 5415所纯化的组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。来源S的活性组分在C18 218 TP 5415上进行分级分离。因而，以1ml/min的流速用20％-30％CH3CN/0.1％TFA/H2O浓度梯度进行层析，以1ml组分收集洗脱液，并且将每一组分冻干。然后测定每一组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的活性。结果是，所说的活性物被分成3部分(按洗脱顺序，指定为p-1，p-2，和p-3)。
图19显示了用反相层析柱二苯基219 TP 5415所纯化的组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。C18 218 TP5415的活性组分在二苯基219TP5415上分离。以1ml/min的流速用22％-25％CH3CN/0.1％TFA/H2O浓度梯度进行层析，以1ml组分收集洗脱液，并且将每一组分冻干。然后测定每一组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的活性。结果是，所说的活性物会聚成单一的峰。
图20显示了用反相层析柱URPC C2/C18 SC 2.1/10所纯化的组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。二苯基219TP 5415的峰值活性组分在URPC C2/C18 SC 2.1/10上分离。以100ml/min的流速用22％-35％CH3CN/0.1％TFA/H2O浓度梯度进行层析，以100μl组分收集洗脱液，并且将每一组分都冻干。然后测定每一组分特异地地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的活性。结果发现所说的活性物为明显的单一物质(肽)的两个峰。
图21显示了用反相层析柱μPRC C2/C18 SC 2.1/10所纯化的p-2组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞释放的活性。以1ml/min的流速用22％-25％CH3CN/0.1％TFA/H2O浓度梯度进行层析，以1ml组分收集洗脱液，并且将每一组分冻干。然后测定每一组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的活性。结果是，所说的活性p-2组分特异地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。以100μl/min的流速用21.5％-23.0％CH3CN/0.1％TFA/H2O浓度梯度进行层析，以100μl组分收集洗脱液，并且将每一组分冻干。然后测定每一组分特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的活性。结果发现所说的活性物为明显单一物质(肽)的一个峰。
图22显示了牛下丘脑配体多肽cDNA片段的核苷酸序列和该核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该核苷酸序列来源于特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的牛下丘脑来源的配体多肽cDNA片段，它包含在cDNA克隆中，其是使用牛下丘脑来源的cDNA通过PCR分离的。箭头标记所指的区域相当于合成引物。
图23显示了牛下丘脑配体多肽cDNA片段的核苷酸序列和该核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该核苷酸序列来源于特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞中释放的牛下丘脑来源的配体多肽cDNA片段，它包含在cDNA克隆中，其是使用牛下丘脑来源的cDNA通过PCR分离的。箭头标记所指的区域相当于合成引物。
图24显示了牛下丘脑配体多肽(特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞释放)的氨基酸序列(a)和(b)以及SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：44所限定的配体多肽的全编码区的cDNA序列。
图25显示了合成配体多肽特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性。合成肽以10-3M的终浓度溶解在脱气的dH2O中，并且0.05％BSA-HBSS稀释成浓度为10-12M-10-6M。当稀释液添加到细胞中时，花生四烯酸代谢物释放活性以在上清液中测定的释放的[3H]花生四烯酸代谢物的放射活性表示。结果发现19p2-31特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性是浓度依赖性的。
图26显示了合成配体多肽(19p2-L31(0))特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞释放的浓度依赖性活性。合成肽以10-3M的终浓度溶解在脱气的dH2O中，并且0.05％BSA-HBSS稀释成浓度为10-12M-10-6M。当稀释液添加到细胞中时，花生四烯酸代谢物释放活性以在上清液中测定的释放的[3H]花生四烯酸代谢物的放射活性表示。结果发现19p2-31(0)特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性是剂量依赖性的。
图27显示了合成配体多肽19p2-L20特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞释放的浓度依赖性活性。合成肽以10-3M的终浓度溶解在脱气的dH2O中，并且0.05％BSA-HBSS稀释成浓度为10-12M-10-6M。当稀释液添加到细胞中时，花生四烯酸代谢物释放活性以在上清液中测定的释放的[3H]花生四烯酸代谢物的放射活性表示。结果发现19p2-20特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19p2细胞系中释放的活性是剂量依赖性的。
图28显示了用限制性酶BamHI(B)和SalI(s)消化的从牛基因组文库克隆的噬菌体DNA片段的1.2％琼脂糖凝胶电泳图谱。作为DNA大小标记(M)，使用λ噬菌体DNA的StyI消化物。在泳道B，检测到来源于载体的两条带的位置在第一(19，329bp)和第二(7，743bp)标记带之间，以及来源于插入片段的3带在第三(6，223bp)和第五(3，472bp)带之间。在泳道S，同样检测到来源于载体的两条带，但是由于插入片段带的重叠，上面的带比泳道B的带更宽一些。
图29显示了从牛基因组DNA所解码的编码区各处的核苷酸序列，第1到3个碱基(ATG)相当于翻译起始密码子，并且第767到第769个碱基(TAA)相当于翻译终止密码子。
图30显示了从牛基因组DNA所推定的编码区各处的核苷酸序列(基因组)与通过PCR克隆的牛cDNA的核苷酸序列(cDNA)的比较。相同的序列区用阴影指示出。至于第101到第572区，在cDNA的核苷酸序列中没有相应的区，表明是一个内含子。
图31显示了从牛基因组DNA所解码的编码区各处的核苷酸序列消除内含子后所编码的氨基酸序列的翻译。
图32显示了大鼠配体多肽的全长氨基酸序列和编码全编码区的cDNA序列。
图33显示了牛配体多肽的氨基酸序列与编码牛多肽和大鼠多肽的DNA的核苷酸序列。箭头标志标明了与合成引物相一致的区域。
图34显示了人配体多肽的全长氨基酸序列和编码全编码区的cDNA序列。
图35显示了在牛配体多肽，大鼠配体多肽和人配体多肽的翻译区中氨基酸序列的比较。
图36显示了对活细胞的受体结合实验的结果，其中在实验中使用了放射性碘化配休多肽。
图37显示了通过配体多肽测定花生四烯酸代谢物从CHO-19p2-9和CHO-UHR1释放的结果。
图38显示了在大鼠的脑和组织的离散区中RT-PCR定量测定UHR-1mRNA的结果。
图39显示了在大鼠的脑和组织的离散区中RT-PCR定量测定配体多肽mRNA结果。
图40显示了在血浆胰岛素浓缩液中配体多肽对葡萄糖诱导增加的作用，它通过放射免疫分析来测定。
图41显示了通过给小鼠施用10nmol配体多肽测量运动性的结果。(a)涉及自发运动性和(b)涉及用后腿站立。
图42显示了给小鼠施用1nmol配体多肽测量运动性的结果。(a)涉及自发运动性和(b)涉及用后腿站立。
图43显示了给小鼠施用0.1nmol配体多肽测量运动性的结果。(a)涉及自发运动性和(b)涉及用后腿站立。
图44显示了给小鼠施用0.01nmol配体多肽测量运动性的结果。(a)涉及自发运动性和(b)涉及用后腿站立。
图45显示了当所说的配体多肽被施用到小鼠侧室时测定体温的结果。在施用3mg/kg.S.C剂量的利血平15小时后再施用配体多肽。
图46阐明了微注射套管以20℃角插入最后区的图。
图47显示给在鼠最后区注射配体多肽后测量直接和平均血压的典型实例。测量是在非麻醉的情况下以1μl/min的速度注射10nmol配体多肽后进行的。
图48显示了用戊巴比妥麻醉后给大鼠第三心室施用50nmol配体多肽时测量的血浆中生长激素(GH)的结果。
图49显示了给自由活动的大鼠第三心室施用50nmol配体多肽后，血浆中GH分泌的变化。
配体多肽或PBS被施用到第三心室，在10分钟后有意识地给大鼠静脉施用5μg/kg的GHRH。正好在静脉注射GHRH后在动脉施用(时间0和10、20、30、40和60分钟)之前测量GH水平。
在图49中，单星标记星号显示p＜0.05，双星标记星号显示p＜0.01。
图50显示了配体多肽血清与吸光度之间的关系。
图51显示了抗配体多肽多克隆抗体对花生四烯酸代谢物的释放的抑制作用。
图52显示了编码UHR-1的cDNA序列，它在PAKKO-UHR1-7上构建。
实施本发明的最佳方式
按照本发明的配体多肽是能够结合G蛋白偶联受体蛋白质，并包含由SEQ ID NO：73或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列或其部分肽，或其酰胺或酯或其盐的多肽。在SEQ ID NO：73中，第10位的Xaa是丙氨酸或苏氨酸；第11位的Xaa是甘氨酸或丝氨酸；第21个位置的Xaa是H、甘氨酸或GlyArg。
现在详尽描述上述的配体多肽、其酰胺或酯或其盐(下文有时简称为配体多肽或多肽)的产生方法以及该多肽的用途。
本发明的上述配体多肽包括来源于人和其它温血动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴子等)的任何组织(例如垂体、胰腺、人脑、肾、肝、性腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺脏、消化道、血管、心脏等)或细胞，并包含由SEQ ID NO：73或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列的任何多肽。例如，除包含SEQ ID NO：73氨基酸序列的蛋白质外，本发明的配体多肽包括包含某些氨基酸序列的蛋白质，所说的氨基酸序列与SEQ ID NO：73氨基酸序列的同源性为约50-99.9％，优选地为70-99.9％，更优选地为80-99.9％，尤其优选地为90-99.9％，并具有与包含SEQ ID NO：73氨基酸序列的蛋白质性质上实际上等同的活性。术语“实质上等同”意味着受体连接活性、信号转导活性及其类似活性的性质是等同的。因此，即使存在程度上的差别(如受体连接活性的强度和多肽的分子量)也是允许的。
更具体地说，本发明的配体多肽包含来源于大鼠整个大脑、牛下丘脑或人整个大脑的并包含SEQ ID NO：73氨基酸序列的多肽。此外，本发明的配体多肽包括某些多肽，这些多肽含有实质上等同的多肽(如其中1-15，优选地1-10，更优选地1-5个氨基酸残基从SEQ ID NO：73氨基酸序列缺失的多肽、其中1-80，优选地1-50，更优选地1-10个氨基酸残基加至SEQID NO：73氨基酸序列中的多肽或其中1-15，优选地1-10，更优选地1-5个氨基酸残基由一个或更多其它氨基酸残基取代的多肽)。
SEQ ID NO：73氨基酸序列包含SEQ ID NO：8、9、10、50、51、52、64、65或66。与包含SEQ ID NO：73氨基酸序列的多肽实质上等同的多肽是包含SEQ ID NO：1、3、4、5、6、7、44、45、47、48、49、59、61、62或63氨基酸序列的多肽。
其中，优选的是包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的多肽和包含某些氨基酸序列的多肽，其中，所说的氨基酸序列是SEQ ID NO：74肽加至包含SEQ ID NO：73氨基酸序列的多肽的N-末端构成的。
此外，本发明的多肽或部分肽包括其中谷氨酰胺N端侧在体内切割形成焦谷酰胺肽的那些多肽或肽。
本说明书中描述的肽，按照肽说明的惯例，左末端是N-末端(氨基末端)，右末端是C-末端(羧基末端)。通常，当SEQ ID NO：73多肽的C-末端是羧基(-COOH)或羧酸盐(-COO-)时，它可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)形式。酯残基R包括C1-6烷基(如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基等)、C3-8环烷基(如环戊基、环已基等)、C6-12芳基(如苯基、α-萘基等)和C7-14烷基(如苯-C1-2烷基(例如苄基、苯乙基、二苯基甲醇基等)或α-萘C1-2烷基(例如α-萘甲基等))。此外，酯可以是广泛用于口服的新戊酰氧甲基酯。当SEQID NO：73多肽在除C-末端的任何位置具有羧基或羧酸盐基时，对应的酰胺或酯也包含在本发明的多肽概念中。以上刚提及的酯包括描述的C-末端酯。
本发明优选的配体多肽是C-末端酰胺化的肽。尤其优选的是C-末端酰胺化的包含SEQ ID NO：5、8、47、50、61或64的氨基酸序列的多肽。
本发明的多肽盐包括生理学上可接受的碱(例如碱金属或酸(如有机的或无机酸))盐，优选地是生理学上可接受的酸加成盐。这类盐的例子是它的无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸或硫酸等)盐和它的有机酸(例如乙酸、蚁甲酸、丙酰酸、富马酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸或苯磺酸等)盐。
本发明的配体多肽或其酰胺或酯或盐可以通过纯化技术从包含人在内的温血动物组织或细胞产生，或如下文描述通过肽合成产生。此外，还可以如下文描述通过培养携带编码多肽的DNA的转化体产生。
在从人或其它温血动物的组织或细胞产生配体多肽时，可通过一种方法纯化和分离，此方法包括使人或其它温血动物的组织或细胞均匀，提取匀浆(例如用酸)，并且通过结合使用各种层析方法(如反相层析、离子交换层析、亲和层析等)抽提。
如上述的，本发明的配体多肽可通过本来已知的肽合成方法产生。用于肽合成的方法可以是任意有固相合成法和液相合成法。因此，目标肽可以通过缩合部分肽或能够以其残基部分构成蛋白质的氨基酸产生，当产物有保护基时，脱去保护基，由此，可产生所需的肽。已知的用于缩合和脱保护的方法包括在下列文献(1)-(5)中描述的方法。
(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，肽合成，纽约国际科学出版社，1966。
(2)Schroeder和Luebke，肽，纽约学院出版社，1965。
(3)Nobuo Izumiya等，肽合成的原理和实验，Maruzen，1975。
(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara，生化实验系列1，蛋白质化学IV，205，1977。
(5)Haruaki Yajima(编者)，药物延续的发展，14，肽合成，HirokawaShoten。
反应后，可通过结合使用常规的纯化技术(如溶剂萃取、柱层析、液相层析以及重结晶)纯化和分离蛋白质。如上述的分离的蛋白质是游离化合物时，可通过已知的方法把它转化为适合的盐。相反，当分离的产物是盐时，可用已知方法把它转化为游离肽。
酰胺多肽可通过利用适于酰胺化的肽合成树脂获得。树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲基胺树脂、氨乙基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基苯甲基乙酰氨甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2’，4’-二甲氧苯基-羟甲基)苯氧基树脂、4-(2’，4’-二甲氧苯基-Fmoc氨乙基)苯氧基树脂等。利用这类树脂时，按照目标肽的序列，利用各种本身已知的缩合技术，在树脂上缩合氨基酸，其中该氨基酸的α-氨基基团和侧链的功能基已适当的保护。在系列反应的最后，从树脂除去肽或保护肽，除去保护性基团以获得目标多肽。
为缩合上述的保护氨基酸，可利用各种肽合成激活剂，但碳化二亚胺化合物是尤其合适的。碳化二亚胺包括DCC、N，N’-二异丙基碳化二亚胺和N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺。为用这类试剂活化，把外消旋抑制剂添加剂(例如HOBt)和保护氨基酸直接加至树脂，或把预先活化的保护氨基酸作为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯加至树脂。用于活化保护氨基酸或用树脂缩合的溶剂可从已知的对肽缩合反应有用的那些溶剂中适当地选择。例如，N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷、三氯甲烷、氯仿、三氟乙醇、二甲基亚砜、DMF、吡啶、二氧六环、甲叉氯化物、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它们的适合混合物可提及。反应温度可选自迄今已知的利于肽键形成的范围，通常选自约-20℃至50℃的范围。活化的氨基酸衍生物通常以1.5-4倍过量的比例使用。如果利用茚三酮反应通过检验发现缩合不充分，可重复进行缩合反应以达到充分缩合而无须除去保护基。如果重复缩合仍不能提供足够的缩合度，未反应的氨基可用乙酐或乙酰味唑乙酰化。
用于开始物质氨基酸的氨基保护基包括Z、Boc、三-戊氧羰基、异冰片羰基、4-甲氧苄基羰基、C1-Z、Br-Z、金钢烷氧羰基、三氟乙酰、苯甲基、甲酰基、2-硝基苯亚氧硫基、二苯基亚磷酸噻吨基或Fmoc。可利用的羧基保护基包括但不限于上述的C1-6烷基、C3-8环烷基和C7-14烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧苯甲酰、4-氯苯基、苯酰基、苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基和三苯甲游基酰肼基。
丝氨酸和苏氨酸的羟基可以通过酯化或醚化保护。适于所说的酯化的基团包括碳衍生的基团(如较低的烷酰基团(例如乙酰基等)、芳酰基团(例如苯甲酰基等)、苄氧羰基以及乙氧基羰基。适于所说的醚化的基团包括苄基、四氢吡喃基和叔丁基。
用于酪氨酸的酚羟基的保护性基团包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z及三-丁基。
用于组氨酸的组咪唑的保护基包括Tos、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
起始氨基酸的活化的羧基基团包括对应的酸酐、叠氮化物和活化的酯，例如醇(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟丁二酰亚胺、N-羟基苯二甲酰亚胺、HOBt等)酯。开始氨基酸的活化的氨基基团包括对应的六甲基磷酰胺。
用于除去保护性基团的方法包括：在催化剂(如钯黑或钯-碳)存在时，利用氢气催化还原；用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这类酸的混合物的酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪的碱处理；在液态氨中用金属钠还原。利用上述酸处理的消除反应通常可以在-20℃至40℃进行，并可加入阳离子受体(如茴香醚、酚、苯甲硫醚、间甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁烷二巯基化物、1，2-乙烷二巯基化物)以利于进行。用于保护组氨酸咪唑基的2，4-二硝苯基可通过用苯硫酚处理除去，而用于保护色氨酸吲哚基的甲酰基通过用稀释的氢氧化钠溶液或稀释的氨水的碱处理除去，在1，2-乙烷二巯基化物、1，4-丁烷二巯基化物存在时也可用上述的酸处理除去。
用于保护不该参与起始物质反应的官能团的方法、可利用的保护性基团、除去保护性基团的方法以及活化将参与反应的官能团的方法都可恰当的从已知的基团与方法中选择。
获得酰胺形式的多肽的另一种方法包括：首先，酰胺化C端氨基酸的α-羧基，然后，向N端侧延伸肽链直到达到所要求的链长度，然后有选择地使C端肽的α-氨基和将形成目标多肽残基的氨基酸或肽的α-羧基脱保护，并缩合为两种片段，其α-氨基和侧链官能团已用上述的适合保护剂在混合溶剂(如上文描述)中保护。这种缩合反应的参数可与上文描述的相同。通过缩合获得的保护肽中，所有的保护性基团都可用上述的方法除去以获得所要求的粗制肽。这种粗制肽可通过已知的纯化方法纯化，冷冻干燥主要组分以提供酰胺化的目标多肽。
为获得多肽酯，把C端氨基酸的α-羧基与所需的乙醇缩合以获得氨基酸酯，然后接着进行上述的产生酰胺的过程。
本发明的配体多肽的部分肽、其酰胺或酯或其盐可以是与具有SEQ IDNO：73氨基酸序列或实质上与它等同的序列的多肽有相同活性(例如垂体功能调节活性、中枢神经系统功能调节活性或胰功能调节活性)的任何肽。作为这类肽，可以是已经描述的肽，其中1-15个氨基酸残基从上述的SEQ IDNO：73氨基酸序列缺失。具体地说，具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第2-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第3-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第4-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第5-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第6-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第7-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第8-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第9-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第10-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第11-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第12-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第13-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第14-21位置的氨基酸序列的肽、具有对应于SEQ ID NO：73氨基酸序列第15-21位置的氨基酸序列的肽可作为优选的例子描述。此外，具有SEQ ID NO：74氨基酸序列的肽也是优选的。
配体多肽或其部分肽可用作制备抗配体多肽抗体的抗原。作为抗原的多肽包括N-末端肽、C-末端肽或不同于上述的配体多肽或其部分肽的肽中心部分。具体地说，还包括SEQ ID NO：92、93或94的部分肽。
部分肽可以是包含各个结构域的肽或分子内包含许多结构域的肽。
本说明书中描述的部分肽可以是C-末端以酰胺键(-CONH2)或酯键(-COOR)结尾的肽。这里酯包括上述多肽的相同酯。当部分肽在除C-末端外的任何位置具有羧基或羧酸盐基时，这时这类基团或组分已酰胺化或酯化，这种情况也在本发明的部分肽范围之内。在这里酯可以是与上述的C-末端酯相同的酯。
本发明的配体多肽或其部分肽可以是融合蛋白质的形式，这些蛋白质与功能或性质已知的蛋白质融合。
这类本发明的配体多肽的部分肽的盐可以是与上述的多肽盐相同的盐。
本发明的配体多肽的部分肽、其酰胺或酯或其盐可通过与所述的用于多肽的相同的合成方法或以合适的肽酶裂解本发明的多肽产生。
编码本发明的配体多肽或其部分肽的DNA可以是包含编码某些多肽的核苷酸序列的任意DNA，所述的多肽具有SEQ ID NO：73的氨基酸序列或实质上与它等同的序列。此外，所说的DNA可以是基因组DNA、基因组DNA文库、组织或细胞来源的cDNA、组织或细胞来源的cDNA文库以及合成DNA的任一种。如文库的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒的任一种。此外，它可通过RT-PCR方法，利用可从组织或细胞制备的RNA片断直接扩增。
更具体地说，作为编码多肽(来源于大鼠整个大脑或牛下丘脑并包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：44的氨基酸序列)的DNA，包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA可作为例子说明。SEQ ID NO：2中，129位置的R代表G或A，179和240位置的Y代表C或T。当179位置的Y是C时，编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列，当179位置的Y是T时，编码SEQ IDNO：44的氨基酸序列。
作为编码多肽(牛来源的，并包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9或10的氨基酸序列)的DNA，包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17或18的核苷酸序列的DNA可以作为例子说明。这里，SEQID NO：11、13、14或15的63位的R和ID NO：12、16、17或18的29位的R代表G或A。
作为编码鼠来源的、SEQ ID NO：45、47、48、49、50、51或52的多肽的DNA，包含SEQ ID NO：46、53、54、55、56、57或58的核苷酸序列的DNA可以作为例子说明。
此外，作为编码人来源的、SEQ ID NO：59、61、62、63、64、65或66的肽的DNA，包含SEQ ID NO：60、67、68、69、70、71或72的核苷酸序列的DNA可以作为例子说明。
编码牛来源的、包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：44的氨基酸序列的多肽的DNA、编码鼠衍生的、包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的多肽的DNA或编码人来源的、包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的多肽的DNA中，包含6-90，优选地6-60，更优选地9-30，尤其优选地有12-30的部分核苷酸序列的DNA片段也可方便地作为DNA探针。
编码本发明的配体多肽或其部分肽的DNA可通过下列遗传工程方法产生。
全部编码本发明的多肽或部分肽的DNA可通过利用具有多肽或部分肽的部分核苷酸序列的合成DNA引物的PCR扩增或通过利用在适合载体中插入的并以DNA片段标记的DNA杂交克隆，其中用于标记的DNA片段包含人类来源的多肽或合成DNA的部分或全部区域。典型地，杂交可通过分子克隆(第二版，J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)中所描述的方法进行。利用市售的文库时，可遵循伴随的手册中给出的指导。
编码多肽或部分肽的克隆DNA可直接利用，或用限制性内切酶消化后或加入接头后利用，取决于目的。这种DNA在5’末端具有作为翻译起始密码子的ATG，并可在3’末端具有作为终止密码子的TAA、TGA或TAG。翻译起始密码子和终止密码子可借助适合的DNA衔接子加入。
多肽或部分肽的表达载体可通过例如(a)从编码本发明的多肽或部分肽的DNA中切割靶DNA片段，(b)与适合的表达载体中启动子下游侧的靶DNA片段连接产生。
载体可包括来源于大肠杆菌(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)的质粒、来源于枯草杆菌(例如，pUB110、pTPS、pC194等)的质粒、来源于酵母(例如，pSH19、pSH1S等)的质粒、噬菌体(如λ-噬菌体)以及动物病毒(如逆转录病毒、牛痘病毒和杆状病毒)。
按照本发明，任何启动子只要它与用于表达基因的宿主细胞是相容的，都可以利用。当用于转化的宿主是大肠杆菌时，启动子优选地的是trp启动子、lac启动子、recA启动子、λpL启动子、Ipp启动子等。当转化的宿主是杆菌属时，启动子优选地是SPO1启动子、SP02启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时，启动子优选地是PH05启动子、PCK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当宿主是动物细胞时，启动子包括SV40-衍生的启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SRaG启动子等。增强子可有效地用于表达。
此外，如果需要，把与宿主相容的信号序列加至多肽或其部分肽的N端侧。当宿主是大肠杆菌时，可利用的信号序列可包括碱性磷酸酶信号序列、OmpA信号序列等。当宿主是杆菌属时，它们可包括α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等。当宿主是酵母时，它们可包括冬青茶因子信号序列、转化酶信号序列等。当宿主是动物细胞时，它们可包括胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
转化体或转染子通过利用这样构建的载体产生，此载体携带编码本发明的多肽或部分肽的DNA。宿主可以是例如，希氏杆菌属微生物、杆菌属微生物、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。希氏杆菌属与杆菌属微生物的例子包括大肠杆菌K12.DH1[美国国家科学院学报，第60卷，160(1968)]，JM103[核酸研究，第9卷，309(1981)]，JA221[分子生物学杂志，第120卷，517(1978)]，HB101[分子生物学杂志，第41卷，459(1969)]，C600[遗传学，第39卷，440(1954)]等。杆菌属微生物的例子是例如枯草杆菌MI114[基因，第24卷，255(1983)]，207-21[生物化学杂志，第95卷，76(1984)]等。
酵母可以是例如，Saccharomvces cerevisiae AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。昆虫可包括蚕(家蚕幼虫)[Maeda等，自然，第315卷，592(1985)]等。宿主动物细胞可以是，例如，猴来源的细胞系、COS-7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞系(CHO细胞)、DHFR基因缺失的中国仓鼠细胞系(dhfr-CHO细胞)、小鼠L细胞、小鼠骨髓瘤细胞、人FL等。
依赖于所利用的宿主细胞，利用适合于这类细胞的标准技术完成转化。埃希氏杆菌属微生物的转化可依据如已公开的方法(例如，美国国家科学院学报，第69卷，2110(1972)，基因，第17卷，107(1982)等)进行。杆菌属微生物的转化可依据如已公开的方法(例如，普通分子遗传学，第168卷，111(1979)等)进行。酵母的转化可依据已公开的方法(例如，美国国家科学院学报，第75卷，1929(1978)等)进行。昆虫细胞可依据已公开的方法(例如，生物学/技术，6，47-55，1988)转化。动物细胞可用已公开的方法(例如，病毒学，第52卷，456，1973等)转化。转化体或转染子(其中隐含携带编码多肽或其部分肽的DNA的表达载体)按照前述的技术产生。
其中宿主是埃希氏菌属或杆菌属微生物的转化体(转染子)的培养，可在适合的液体培养基中进行。培养基可包含对于转化体生长必须的碳源、氮源、矿物质等。碳源可包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源可包括有机或无机物质(如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、豆饼、土豆提取物等。矿物质的例子可包括氯化钙、二氢磷酸钠、氯化镁等。也允许加入酵母、维生素、促生长因子等。要求培养基的pH在约5-约8。
优选地，埃希氏菌属微生物培养基是例如包含葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志)，431-433，纽约冷泉港实验室，1972。如果需要，培养基可补充药物(如3β-吲哚丙烯酸)以改进启动子的效率。在埃希氏菌属宿主情况下，通常培养在约15℃-43℃进行约3-24小时。如果需要，可进行通气和搅拌。在杆菌属宿主的情况下，培养通常在约30℃-40℃进行约6-24小时。如果需要，也可进行通气和搅拌。在转化体情况下(其中宿主是酵母)，所用的培养基可包括：例如，Burkholder基本培养基[Bostian，K.L.等，美国国家科学院学报，第77卷，4505(1980)]、包含0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter，G.A.等，美国国家科学院学报，第81卷，5330(1984)]等。优选的，把培养基的pH值调整到约5-约8。培养通常在约20℃-35℃进行约24-72小时。如果需要，可应用通气和搅拌。在转化体情况下(其中宿主是昆虫)，所利用的培养基可包括由适当的加入添加剂(如钝化(或固定化)的10％牛血清和与Grace’s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))类似的物质)获得的培养基。优选的是，把培养基的pH值调整到约6.2-6.4。培养通常在约27℃下进行约3-5天。如果需要，可应用通气和搅拌。在转化体的情况下(其中宿主是动物细胞)，所利用的培养基可包括包含例如约5-20％的胎牛血清的MEM培养基[科学，第122卷，501(1952)]、DMEM培养基[病毒学，第8卷，396(1959)]、RPMI 1640培养基[美国医学学会杂志，第199卷，519(1967)]、199培养基[生物医药科学论文集，第73卷，1(1950)]等。优选的是pH值在约6-约8。培养通常在约30-40℃进行约15-60小时。如果需要，可应用培养基交换、通气以及搅拌。
从上述培养物中分离和纯化多肽或部分肽可按照下文所述的方法进行。
为了从培养的微生物或细胞中提取多肽或部分肽，培养后把微生物或细胞用已知的方法收集，悬浮在适合的缓冲液中，用超声波、溶菌酶和/或冰冻以及解冻等破裂，然后，多肽或部分肽的粗提物通过离心或过滤获得。可应用其它常规的提取或分离方法。缓冲液可包含蛋白质变性剂(如尿素或盐酸胍)或表面活性剂(如Triton X-100)(注册商标，下文常称作“TM”)。
在多肽或部分肽分泌进入培养基的情况下，培养结束后，把上清液从微生物或细胞中分离，用广泛已知的方法收集产生的上清液。包含多肽或部分肽的培养物上清液和抽提物可通过适当的结合使用广泛已知的分离和纯化方法纯化。广泛已知的分离和纯化方法可包括：利用溶解性的种种方法(如利用溶剂的盐析或沉降)、主要利用分子大小或分子量差别的方法(如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、利用电荷差别的方法(如离子交换层析)、利用特异性亲和性的方法(如亲和层析)、利用疏水性质差别的方法(如反相高效液相层析)以及利用等电点差别的方法(如等电点电泳或层析聚焦)等。
在这样获得的多肽或部分肽是游离形式的情况下，游离蛋白质可用已知的方法或与其类似的方法转化为盐。反之亦然，在这样获得的多肽或部分肽是盐形式的情况下，蛋白质盐可用已知的方法或与其类似的方法转化为游离形式或其任何其它盐。
由转化体产生的多肽或部分肽可任意修饰，多肽可在纯化之前或之后通过适合的修饰蛋白质的酶作用部分除去。修饰蛋白质的酶可包括：胰蛋白胰凝乳蛋白酶、精氨酸内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。这样形成的多肽或部分肽活性可通过与受体偶联(或结合)的试验或通过利用特异性抗体的酶免疫测定(酶联免疫测定)测定。
编码本发明的配体多肽、配体多肽或其部分肽的DNA可用于(1)合成G蛋白偶联受体蛋白质的部分或全长配体，(2)对本发明的配体多肽或其部分肽的生理学活性的研究，(3)制备合成寡核苷酸探针或PCR引物，(4)获得编码G蛋白偶联受体蛋白质和前体蛋白质配体的cDNA，(5)利用重组体受体蛋白质的表达，以开发结合受体测定系统和筛选候选的药用活性化合物，(6)获得抗体和抗血清，(7)利用所说的抗体或抗血清，开发诊断剂，(8)开发药物(如垂体功能调节剂、中枢神经系统功能调节剂和胰功能调节剂)，(9)基因治疗等用途。
尤其如在下文中描述的，利用重组体G蛋白偶联受体蛋白质的表达，通过使用结合受体测定系统，可筛选出对(包括人类)温血动物特异的G蛋白偶联的受体的兴奋剂或拮抗剂，这类兴奋剂和拮抗剂可用作预防和治疗各种疾病的试剂。
此外，参考上述(8)，本发明的配体多肽、其部分肽或编码它们之一的DNA作为一种低毒性的安全药物组合物是有用的，因为它可作为配体由垂体、中央神经系和胰β细胞中表达的G蛋白偶联受体蛋白质识别。本发明的配体多肽、其部分肽或编码它们之一的DNA与垂体功能、中枢神经系统功能和胰功能调节相联，因此可用作治疗和预防痴呆[如老年性痴呆、脑血管痴呆(由于脑血管紊乱的痴呆)、与种系退化退行性疾病相联的痴呆(如阿耳茨海默氏疾病、帕金森病、Pick’s疾病、Huntington’s疾病等)、由传染病(例如，延迟病毒感染，如C-J疾病)引起的痴呆、与内分泌、代谢以及中毒病(例如甲状腺机能亢进减退、VB12缺乏、酒精中毒及各种药物、金属或有机化合物的中毒)相联的痴呆、与瘤原性疾病(如脑瘤)相联的、由于损伤疾病(例如慢性硬膜下血肿)引起的痴呆]、抑郁(忧郁症)、多动(脑过小)综合征、意识障碍、忧虑综合征、精神分裂症、恐怖、生长激素分泌疾病(例如巨人症、肢端巨大等)、多食症、贪食症、高胆甾醇血、高甘油酯、高血脂、泌乳刺激素过多、糖尿病(例如糖尿病并发症、糖尿病肾病、糖尿病神经病、糖尿病视网膜病等)、癌症(例如乳房癌、淋巴白血病、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等)、胰腺炎、肾病(例如铬肾部衰竭、肾炎等)、特纳氏综合症、神经官能症、风湿性关节炎、脊柱损伤、暂时性脑局部缺血、肌萎缩横向硬化、急性心肌梗塞、髓小脑退化、骨折、创伤、特应性皮炎、骨质疏松、气喘、癫痫、不育或乳汁减少的药物组合物。此外，它们也可用作手术后营养状态和/或血管增压改善剂。
如上述的，当本发明的多肽、其部分肽或编码它们之一的DNA用作药物组合物时，可用常规方法利用。例如，它可以药片(需要时可以糖包被)、胶囊、酏剂、微胶囊等形式口服施用，或以可注射制剂的形式(如无菌溶液和水或其它药学上可接受的液体中的悬浮液)非口服施用。这些制剂可通过以生理学上可接受的载体、调味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、粘合剂等，以通常可接受的药物制造方式要求的单位剂量，混合多肽、其部分肽或编码它们之一的DNA产生。这些制剂中的有效成分含量是固定的，因此，可获得规定范围内的适当剂量。
在药片、囊等可混合的添加剂包括：粘合剂(如胶凝、玉米淀粉、西黄著胶和阿拉伯胶)、赋形剂(如晶体纤维素)、膨胀剂(如玉米淀粉、明胶和藻酸)、润滑剂(如硬脂酸镁)、甜味剂(如蔗糖、乳糖和糖精)以及调味剂(如薄荷、akamono油和樱桃)。当单位剂量形式是胶囊时，上述物质还可惨合液态载体(如油和脂肪)。用于注射的无菌组合物可通过普通的药物制造方法(如在用于注射的载体(如水)中溶解或悬浮有效成分、天然存在的植物油(如芝麻油和椰子油等))制备。
用于注射的含水液体包括：包含葡萄糖和其它辅助剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠)的生理盐水和等渗溶液，并可与适当的分解辅助物(如醇(例如乙醇、多元醇(例如丙二醇和聚乙烯乙二醇)、非离子型表面活性剂(例如聚山梨酸酯80(TM)和HCO-50等)结合使用。油状液体包括芝麻油和大豆油，并可与分解辅助物(如苄基苯酸钠和苯甲醇)结合使用。此外，上述物质也可用缓冲液(例如磷酸缓冲液以及乙酸钠缓冲液)、缓解剂(例如氯化苯甲烃铵、普鲁卡因盐酸盐)、稳定剂(例如人血清蛋白、聚乙烯乙二醇)、防腐剂(例如苯甲醇、酚)、抗氧剂等制备。这样制备的可注射液体通常以适当的安瓿包装。因为这样获得的制剂是安全而低毒性的，它可施用于例如人或温血哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、野兔、小鸡、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴子、狒狒、黑猩猩)。
所述的多肽、其部分肽或编码它们之一的DNA的口服剂量取决于症状等，通常是每天每个成年人(重量60千克)约0.1-100mg，优选地为1.0-50mg，更优选地1.0-20mg。非口服时，有益的是：以静脉内注射施用可注射制剂形式的多肽、其部分肽或编码它们之一的DNA，取决于施用的目的、靶器官、症状、施用的方法等，对成年人(重量60千克)每次以约0.01-30mg，优选地约0.1-20mg，更优选地约0.1-10mg的日剂量。对于其它动物物种，可以以每60千克重量转化的相应的量施用。
本发明的上述配体多肽的G蛋白偶联受体蛋白质可以是来源于人和其它温血动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴子等)的各种组织(如脑下垂体、胰腺、人脑、肾、肝、性腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺脏、消化道、血管、心脏等)，并包含SEQ ID NO：19、20、21、22或23的氨基酸序列或实质上与它们等同的氨基酸序列的任何G蛋白偶联受体蛋白质。因此，本发明的G蛋白偶联受体蛋白质包括除包含SEQID NO：19、20、21、22或23的蛋白质外的那些蛋白质，这些蛋白质包含与SEQ ID NO：19、20、21、22或23的氨基酸序列有约90-99.9％同源性的氨基酸序列，并具有与包含SEQ ID NO：19、20、21、22或23的氨基酸序列的蛋白质实质上等同的活性。这些蛋白质所具有的活性可包括配体结合活性和信号转导活性。术语“实质上等同”意味着：配体结合活性与其类似物的性质是相同的。因此，即使存在程度上的差别(如配体结合活性的强度和受体蛋白质的分子量)也是允许的。
更具体地说，G蛋白偶联受体蛋白质包括：人垂体来源的G蛋白偶联的受体(该受体蛋白质包含SEQ ID NO：19或/和SEQ ID NO：20的氨基酸序列)、小鼠胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质(该受体蛋白质包含SEQ IDNO：22的氨基酸序列)以及小鼠胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质(该受体蛋白质包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列)。如包含SEQ ID NO：19或/和SEQ ID NO：20的氨基酸序列的人胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质包括包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的人胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质。G蛋白偶联受体蛋白质还包括：其中1-30个氨基酸残基，优选地1-10个氨基酸残基从SEQ ID NO：19、20、21、22或23的氨基酸序列缺失的蛋白质、其中1-30个氨基酸残基，优选地1-10个氨基酸残基添加至SEQID NO：19、20、21、22或23的氨基酸序列的蛋白质、其中SEQ IDNO：19、20、21、22或23的氨基酸序列的1-30个氨基酸残基，优选地1-10个氨基酸残基由一个或更多其它氨基酸残基取代的蛋白质。
这里，包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或实质上与它等同的氨基酸序列的蛋白质包含人胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质全长氨基酸序列。包含SEQ ID NO：19或/和SEQ ID NO：20的氨基酸序列或实质上与它等同的氨基酸序列的蛋白质可以是包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或实质上与它等同的氨基酸序列的蛋白质的部分肽。包含SEQ ID NO：22或/和SEQID NO：23的氨基酸序列或实质上与它等同的氨基酸序列的蛋白质是来源于小鼠胰腺的G蛋白偶联受体蛋白质，但由于它的氨基酸序列十分类似于SEQ ID NO：19或/和SEQ ID NO：20的氨基酸序列(参见，实施例8，尤其图13)，包含SEQ ID NO：22或/和SEQ ID NO：23的氨基酸序列或实质上与它等同的氨基酸序列的蛋白质也列入所说的包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或实质上与其等同的氨基酸序列的蛋白质的部分肽类。
因此，上述的包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列或实质上与其等同的氨基酸序列的蛋白质或蛋白质的部分肽或它们的盐(将在下文描述)包括包含SEQ ID NO：19、20、22或23的氨基酸序列或实质上与其等同的氨基酸序列的蛋白质或其盐。
此外，G蛋白偶联受体蛋白质包括：其中N端蛋氨酸已以保护性基团(例如C1-6酰基，如甲酰基或乙酰基)保护的蛋白质、其中N端侧的谷氨酸在体内切开以形成焦谷酰胺的蛋白质、其中侧链的任何相关组分氨基酸已以适合的保护性基团(例如C1-6酰基，如甲酰基或乙酰基)保护的蛋白质以及复合蛋白质(如可用于连接到糖链的糖蛋白)。
G蛋白偶联受体蛋白质包括所述的配体多肽的同类盐。
G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或其部分肽可由本来已知的纯化技术或如上述的通过培养携带编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的转化体，从人或其它温血动物的组织或细胞产生。它也可按照上述的多肽合成方法产生。
例如，G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽可包括：包含G蛋白偶联受体蛋白质胞外部分的片段，即，暴露在细胞膜外的位点。部分肽的例子是包含某些区域的片段，所述区域如在G蛋白偶联受体蛋白质的疏水图分析中分析的，如图3、图4、图8、图11或图14中显示的，是胞外区域(亲水区域)。此外，也可利用包含部分疏水区域的片段。当单独包含各个结构域的肽可利用时，包含许多结构域的肽也可利用。
G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽的盐可以是与提到的配体多肽盐相同的盐。
编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA可以是包含编码G蛋白偶联受体蛋白质的核苷酸序列的任一DNA，其中，G蛋白偶联受体蛋白质包含SEQID NO：19、20、21、22或23的氨基酸序列或实质上与其等同的氨基酸序列。它也可是基因组DNA、基因组DNA文库、组织或细胞衍生的cDNA、组织或细胞来源的cDNA文库以及合成DNA的任一种。这类文库的载体可包括噬菌体、质粒、粘粒以及phargimide。此外，利用从组织或细胞制备的RNA组分，可通过RT-PCR方法，进行直接扩增。
更具体地说，编码人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白质(包含SEQ IDNO：19氨基酸序列)的DNA包括包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列的DNA。编码人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白质(包含SEQ ID NO：20氨基酸序列)的DNA包括包含SEQ ID NO：25的核苷酸序列的DNA。编码人垂体来源的G蛋白偶联受体蛋白质(包含SEQ ID NO：21氨基酸序列)的DNA包括包含SEQ ID NO：26的核苷酸序列的DNA。编码小鼠胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质(包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列)的DNA包括包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的DNA。编码小鼠胰腺来源的G蛋白偶联受体蛋白质(包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列)的DNA包括包含SEQID NO：28的核苷酸序列的DNA。
完全克隆编码G蛋白偶联受体蛋白质、载体、启动子、宿主细胞的DNA的方法、转化的方法、培养转化体的方法或分离纯化G蛋白偶联受体蛋白质的方法可包括与有关配体多肽所提及的相同的一种方法。
更具体地说，在实施例5中获得的质粒phGR3(在下文描述)以限制性内切酶SalI消化，分离编码hGR3的全长cDNA的翻译框架。自动环化抑制的SalI消化后，将这种框架易连接到例如用于动物细胞的、已以BAP(细菌碱性磷酸酶)处理的表达载体pAKKO-111上。连接反应完成后，部分反应混合物用于例如大肠杆菌DH5的转染。在获得的转化体中，其中编码hGR3的cDNA已在与启动子(如SRa，预先已插入表达载体)有关的前方插入的转化体通过以限制酶切割后作图或通过核苷酸测序选择，质粒DNA以生产规模制备。
这样构建的表达载体DNA利用通过磷酸钙方法、脂质体方法或类似方法把基因引入动物细胞的试剂盒，引入CHO dhfr-细胞，以产生高G蛋白偶联受体蛋白质(hGR3)的表达CHO细胞系。
产生的CHO细胞在37℃下，在无核酸的筛选培养基中，在CO2温箱中，利用5％CO2培养1-4天，以获得G蛋白偶联受体蛋白质(hGR3)。
从上述的CHO细胞，利用通过偶合抗G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的抗体到一种支持体制备的亲和柱或通过偶合G蛋白偶联受体蛋白质的配体制备的亲和柱，纯化G蛋白偶联受体蛋白质。
这样形成的G蛋白偶联受体蛋白质的活性可通过试验与配体的结合或利用特异性抗体通过酶免疫分析法测定。
G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽和编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA可用于：1)测定G蛋白偶联受体蛋白质的配体，2)获得抗体和抗血清，3)构建表达重组体受体蛋白质的系统，4)利用上述开发的系统，开发受体结合系统和筛选药物候选化合物。5)基于有类似或类同结构的配体和受体的比较设计药物，6)制备基因分析探针，并制备PCR引物7)基因操作治疗。
尤其可能的是：通过受体结合测定系统(利用表达重组体G蛋白偶联受体蛋白质系统)，筛选对温血动物(如人类)特异的G蛋白偶联的受体兴奋剂或拮抗剂。这样筛选或特征化的兴奋剂或拮抗剂使各种应用(包括预防和/或治疗各种疾病)成为可能。
以下描述的是本发明的配体多肽、G蛋白偶联受体蛋白质的配体多肽、编码配体多肽的DNA、编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA和其抗体的用途。
(1)测定G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法
G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或其盐作为研究或测定所说的G蛋白偶联受体蛋白质配体的试剂是有用的。
按照本发明，提供了测定G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，该方法包括将待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触，并测定待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的结合量、细胞刺激活性等。
待试化合物不仅可包括已知的配体(如血管紧张素、盘舌蟾素、canavinoids、胰酶分泌素、谷氨酰胺、血清紧张素、褪黑激素、神经肽Y、0pioids、嘌呤、后叶加压素、催产素、VIP(血管活性肠和相关的肽)、生长激素释放抑制因子、多巴胺、胃动素、淀粉不溶素、舒缓激肽、CGRP(降钙素基因相关的肽)、白三烯、胰酶、前列腺素、血栓烷、腺苷、肾上腺素、α-和β-化学促活(如IL-8、GROα、GROβ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIPla、MIP-1P、RANTES等))；内皮细胞素、肠抑胃素、组(织)胺、神经降压素、TRH、胰多肽、良姜素、它们的修饰衍生物、其类似物、其族的肢体和类似物，而且包括人或温血动物(如小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊以及猴子等)的组织提取液、细胞培养液上清液等。例如，所说的组织提取液、所说的细胞培养液上清液等加至用于测定细胞刺激活性等的G蛋白偶联受体蛋白质中，并依赖于测定分馏，因此，最后可测定和获得单一配体。
在本发明的特定的实施方案中，所说的测定配体的方法包括：在G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或其盐存在时或在受体结合测定系统(其中构建和利用重组体受体蛋白质的表达系统)中，测定样品(包含化合物或其盐)是否能够刺激靶细胞(包含与G蛋白偶联受体蛋白质结合的所说化合物)，并测定受体介导的细胞的刺激活性等的方法。所说的细胞刺激活性(可测量)的例子包括促进或抑制生物反应，例如花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、胞内cGMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低等，优选的是花生四烯酸的释放。所说的能够通过与G蛋白偶联受体蛋白质的结合刺激细胞的化合物或其盐的例子包括肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物等。
在本发明的更特定的实施方案中，所说的筛选、鉴定配体的方法包括：
1)筛选G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，该方法包括使标记的待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或其部分肽或其盐接触，并测定标记的、与所说的蛋白质或其盐或所说的部分肽或其盐结合的待试化合物量；
2)筛选G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，该方法包括使标记的待试化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说的细胞膜组分接触，并测定标记的、与所说的细胞或所说的膜组分结合的待试化合物量；
3)筛选G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，该方法包括使标记的待试化合物与通过培养携带编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的转化体在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触，并测定标记的、与所说的蛋白质偶联受体蛋白质结合的待试化合物量；
4)筛选G蛋白偶联受体蛋白质的配体的方法，该方法包括使待试化合物与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触，并通过G蛋白偶联受体蛋白质，测定细胞刺激活性，例如生物学反应的促进或抑制活性，如花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、胞内cGMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低等；
5)筛选G蛋白偶联受体蛋白质配体的方法，该方法包括使待试化合物与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质编码的DNA的转化体在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触，并通过G蛋白偶联受体蛋白质测定至少一种细胞刺激活性，例如，生理学反应的促进或抑制活性，如花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、胞内cGMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低等。
以下描述的是筛选、鉴定配体方法的特定说明。
首先，用于测定配体的方法的G蛋白偶联受体蛋白质可以包括任何物质，只要其包含G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或其盐的任何物质，尽管优选的是：在动物细胞中表达大量G蛋白偶联受体蛋白质。
在产生G蛋白偶联受体蛋白质中，可利用上述方法，并通过在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达编码所说的蛋白质的DNA进行。关于编码特殊区域(如胞外表位、胞外结构域等)的DNA片段，可以使用互补DNA，尽管对其的表达方法不限于此。例如，也可利用基因片段或合成DNA。
为把编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA片段导入宿主动物细胞并有效地表达它，优选的是：把所说的DNA片段掺入来源于核型多角体病毒(属于杆状病毒)的多角体启动子、来源于SV40的启动子、来源于逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、人热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等的下游侧。对表达的受体的数量和质量的检验可通过本领域技术人员本来已知的方法或基于本发明公开的与它类似的方法进行。例如，它们可用出版物中所述的方法(如Nambi，P等：生化学会杂志，第267卷，19555-19559(1992)页)进行。
因此，为了测定配体，包含G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的物质可包括包含G蛋白偶联受体蛋白质(该受体蛋白质通过本领域技术人员本来已知的方法或与它类似的方法纯化)、所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽片段、包含所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、包含所说蛋白质的细胞膜组分等产物。
当包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞用于配体的测定方法时，所说细胞可以用包括戊二醛、甲醛等的结合剂固定化。固定化可通过本领域技术人员本来已知的方法或与它类似的方法进行。
包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是表达G蛋白偶联受体蛋白质的宿主细胞。所说宿主细胞的例子是微生物(如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等)。
细胞膜组分是在破裂细胞后，通过本领域技术人员本来已知的方法或与它类似的方法制备的富含膜的组分。细胞破裂的例子可包括利用Potter-Elvehiem匀浆器挤压细胞的方法、通过韦林氏搅切器或Kinematica由制造的Polytron的破裂、通过超声波的破裂、通过利用法国弗氏压碎器或类似的仪器提供压力同时从小喷嘴爆裂的破裂等。在细胞膜的化学分离中，主要利用借助于离心力的化学分离法(如分次的离心分离和密度梯度离心分离)。例如，破裂的细胞液以低速(500rpm-3,000rpm)离心短时间(通常约一至十分钟)，上清液通常以高速(15,000rpm-30,000rom)进一步离心30分钟至两小时，产生的沉淀用作膜组分。所说的膜组分包含许多表达的G蛋白偶联受体蛋白质和许多膜组分(如来源于细胞的磷脂和膜蛋白)。
在包含所说的G蛋白偶联受体蛋白质的膜组分细胞中，G蛋白偶联受体蛋白质的量优选地是每个细胞103-108个分子，更优选地，每细胞105-107个分子。顺便说的是，表达的量越多，每个膜组分的配体结合活性(特异性活性)越大，由此，构建高度敏感的筛选系统成为可能，此外，此系统允许：在许多相同的样品内，测定大量的样品。
在进行上述的方法1)到3)(其中，测定能够与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体)时，适合的G蛋白偶联的受体组分和标记的待试化合物是必需的。G蛋白偶联的受体组分优选地是天然存在(天然型)的G蛋白偶联的受体、具有与天然型相同活性的重组体G蛋白偶联的受体。这里，如上所述，术语“活性等同于”意味着等同的配体结合活性等。
标记的待试化合物的适合的例子包括上述的以[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的待试化合物。
具体地说，能够和G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体的测定进行如下：
第一，把包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜组分悬浮在用于测定的适合的缓冲液中，以制备进行测定与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体的方法的受体样品。缓冲液可包括任何缓冲液(如pH4-10的Tris-HCL缓冲液或磷酸缓冲液，优选地，为pH6-8的缓冲液等)，只要不抑制配体与受体的结合。此外，表面活性剂(如CHAPS、Tween 80TM(Kao-Atlas，日本)、毛地黄皂苷、脱氧胆酸盐等)和各种蛋白质(如牛血清清蛋白(BSA)、明胶、牛奶衍生物等)可以以降低非特异结合的目的加至缓冲液。此外，蛋白酶抑制剂(如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(由肽实验室制造)、胃酶抑制剂等)可以抑制受体和配体由蛋白酶分解的目的加入。以预测定(或一定)量(5,000cpm-500,000cpm)的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的待试化合物共存于0.01ml-10ml所说的受体溶液中。为知道非特异性的结合量(NSB)，也制备了其中大量过量的非标记待试化合物加入的反应试管。反应在0-50℃下进行，优选地，在4-37℃下进行20分钟-24小时，优选地，30分钟至三小时。反应后，通过玻璃纤维过滤器或类似的滤器过滤，以适合量的相同缓冲液洗涤，玻璃纤维过滤器中余下的放射性借助于液体闪烁计数器或γ计数器测量。其中，通过全部结合量(B)中减去非特异结合量(NSB)得到的计数(B-NSB)大于0cpm的待试化合物鉴定为G蛋白偶联受体蛋白质的配体。
在进行上述方法4)到5)(其中，测定能够与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体)时，由G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性(例如花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低、G蛋白的活化、细胞普及等)可通过已知的方法或通过利用市售的测量试剂盒测定。更具体地说，首先在多孔平板或类似物上培养包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞。
在进行配体的测定时，实验前，以不显示对细胞的毒性的新鲜培养基或适合的缓冲液取代原培养基，并在适合条件下温育，足够时间后，向其中加入待试化合物等。然后，提取细胞，或回收上清液液体，并通过各种方法，测定产物。当鉴定物质(如花生四烯酸等，由于细胞中包含的分解酶，该物质成为细胞刺激活性的索引)的产生团难时，可通过加入所说的分解酶抑制剂进行。关于活性(如对cAMP产生的抑制作用)，可作为对其基础产量由毛喉素或其类似物增加的细胞产生的抑制作用检测。
用于与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体的测定方法的试剂盒包括G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽、包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞膜组分等。
用于测定配体的试剂盒的例子如下：
1.用于测定配体的试剂。
1)测定缓冲液和洗涤缓冲液。
其中0.05％的牛血清清蛋白(由Sigma制造)加至Hanks平衡盐溶液(由Gibco制造)的缓冲产物。
这种产物可用通过具有0.45μm孔大小的膜滤器过滤灭菌，并在4℃下保存或可根据用途配制。
2)G蛋白偶联受体蛋白质样品。
表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞在12-孔平板上，以5×105细胞/孔的速率继代培养，并在37℃下潮湿的5％CO2/95％空气大气中培养两天以制备样品。
3)标记的待试化合物。
以市售的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记或以适合的方法标记的化合物。
水溶液状态的产物在4℃或-20℃保存，利用时，以缓冲液稀释为1μM以用于测定。在待试化合物几乎不能溶于水中的情况下，可把它溶解在有机溶剂(如二甲基甲酰胺、DMSO、甲醇和类似物)中。
4)未标记的待试化合物。
与标记的化合物相同的化合物，以100-1,000倍浓度的浓缩状态制备。
2.测定方法
1)在12孔组织培养平板中培养表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞，用1ml缓冲液洗涤两次以用于测定，然后，把用于测定的490μl缓冲液加至每个孔。
2)加入5μl标记的待试化合物，并使混合物在室温反应一小时。为测定非特性结合的量，加入5μl未标记的待试化合物。
3)从每孔中除去反应溶液，并以用于测定的1ml缓冲液洗涤孔三次。把与细胞结合的标记的待试化合物溶解在0.2N NaOH-1％SDS中，并用4ml的液体闪烁器(由WAKO Pure Chemical，日本，制造)混合。
4)放射性利用液体闪烁计数器(如由Beckmann制造的液体闪烁计数器)测定。
(2)G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽缺乏病的预防和治疗剂
如果G蛋白偶联受体蛋白质的配体通过前述的方法(1)出现，配体或编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA可赖于所说配体的作用，用作处理所说G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽缺乏病的预防和/或治疗剂。
例如，当有患者由于体内G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽减少，其配体生理学行为(例如垂体功能调节行为、中枢神经系统功能调节行为或胰作用调节行为)不能具有，可增加所说患者脑细胞中的G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽的量，因此，配体作用可通过如下所述完全达到：
(a)对患者施用编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA以表达它；或
(b)把编码G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽的DNA插入到所说患者的脑细胞或类似处。因此，编码G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽的DNA可用作安全而毒性较小的G蛋白偶联受体蛋白质或配体多肽损乏病的预防和治疗剂。
当上述的DNA用作上述的试剂时，所说的DNA可单独利用，或把它插入到适合的载体(如逆转录病毒载体、腺病毒载体、与腺病毒载体相关的病毒载体等)中后利用，其后，把产物载体作为药物组合物，按照与利用编码配体多肽或其部分肽的DNA方法相同的常规方法处理。
(3)G蛋白偶联受体蛋白质的配体多肽的定量测定
与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽或其盐有结合特性的配体多肽能够在体内以高灵敏度定量测定G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽或其盐。
例如，这种定量测定可通过与竞争性分析结合进行。这样，待测样品与配体多肽接触以使所说样品中G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的浓度可测定。在定量测定的实施方案中，下列1)和2)中描述的方案或与其类似的方法可利用：
1)Hiroshi Irie(编者)：“放射免疫测定”(Kodansha，日本，1974)；和
2)Hiroshi Irie(编者)：“放射免疫测定，第二系列”(Kodansha，日本，1979)。
(4)筛选改变配体多肽、其部分肽或其盐(下文有时简称为配体或配体多肽)与G蛋白偶联受体蛋白质的结合活性的化合物
可利用G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽或其盐。另外，构建重组G蛋白偶联受体蛋白质的表达系统，并利用所说的表达系统，使用受体结合测定系统。在这些测定系统中，筛选能改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物(如肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提物、动物组织提取物等)或其盐是可能的。这类化合物包括显示G蛋白偶联的受体介导的细胞刺激活性(例如生理学反应的促进活性或抑制活性，包括花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、胞内cGMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的S活化、pH值的降低、G蛋白的活化、细胞的扩散等)的化合物、所谓的“G蛋白偶联的受体兴奋剂”、由这类细胞刺激活性释放的化合物、所谓的“G蛋白偶联的受体拮抗剂”等。术语“改变配体多肽的结合活性”包括两种情况，即抑制配体的结合和促进配体结合两种情况。
因此，本发明提供了筛选能改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐的结合活性的化合物的方法，其特征在于比较下列两种情况：
(i)其中配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或其部分肽或其盐接触的情况；
(ii)其中配体与G蛋白偶联受体蛋白质或盐或部分肽或其盐和所说待试化合物的混合物接触的情况。
在所说的筛选方法中，本发明的一个有特色的特征在于：与所说G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽键合的配体量、配体的细胞刺激活性等分别在下列两种情况下测定，(i)配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触的情况，(ii)配体多肽和待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触，然后并将两者比较。
在本发明的一个特定的实施方案中，提供了下列方法：
1)筛选能改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，当标记的配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触时，以及当标记的配体多肽和待试化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触时，测定并比较与所说的蛋白质或其部分肽或其盐键合的标记配体多肽的量；
2)筛选能改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，当标记的配体多肽与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或与所说细胞的膜组分接触时，以及当标记的配体多肽和待试化合物与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或与所说细胞的膜组分接触时，测定并比较与所说蛋白质或其部分肽或其盐键合的标记配体多肽的量；
3)筛选能改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，当标记的配体多肽与通过培养携带编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的转化体在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时，以及当标记的配体多肽和待试化合物与通过培养携带编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的转化体在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时，测定并比较与所说的G蛋白偶联受体蛋白质键合的标记配体多肽的量；
4)筛选能改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合的化合物或其盐的方法，其特征在于，当活化G蛋白偶联受体蛋白质的化合物(例如本发明的配体多肽等)与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触时，及当活化G蛋白偶联受体蛋白质的化合物和待试化合物与包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触时，测定并比较产生的G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性(例如生理学反应的促进活性或抑制活性，包括花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、胞内cGMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低，G蛋白的活化、细胞的扩散等)；
5)筛选能改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物或其盐的方法，其特征在于，当活化G蛋白偶联受体蛋白质的化合物(例如本发明的配体多肽等)与通过培养携带编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的转化体在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时，以及当活化G蛋白偶联受体蛋白质的化合物和待试化合物与通过培养携带编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA的转化体在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时，测定并比较产生的G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性，例如生理学反应的抑制活性或促进活性(如花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的释放、胞内cAMP的产生、胞内cGMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低、G蛋白的活化以及细胞的扩散等)。
筛选G蛋白偶联的受体兴奋剂或拮抗剂必须首先通过利用来源于大鼠或类似物的，包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、组织或细胞膜组分获得候选化合物(初级筛选)，然后，确保候选化合物真正抑制人G蛋白偶联受体蛋白质和配体的结合(次级筛选)。其它受体蛋白质不可避免地存在，当利用细胞、组织或细胞膜组分时，它们内在地使筛选所需的受体蛋白质的兴奋剂或拮抗剂困难。然而，通过利用人来源的G蛋白偶联受体蛋白质，没必要进行初级筛选，因此，有效地筛选改变配体和G蛋白偶联的受体间结合活性的化合物是可能的。另外，估测筛选的化合物是否为G蛋白偶联的受体兴奋剂或G蛋白偶联的受体拮抗剂是可能的。
给出筛选方法的具体说明如下。
第一，关于用于本发明的筛选方法的G蛋白偶联受体蛋白质，虽然利用哺乳动物器官的膜组分是优选的，然而，只要含有G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的任何产物都可利用。然而，人器官是极端稀少的，因此，大量利用重组技术表达的G蛋白偶联受体蛋白质是适合于筛选的。
在G蛋白偶联受体蛋白质的生产中，可利用上述方法。
当包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜组分用于筛选方法时，上述方法可利用。
在进行上述方法1)-3)以筛选能够改变配体和G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物时，适合的G蛋白偶联的受体组分和标记的配体多肽是必要的。关于G蛋白偶联的受体组分，优选的是：利用天然存在的G蛋白偶联的受体(天然型G蛋白偶联的受体)或具有与天然型G蛋白偶联的受体等同活性的重组型G蛋白偶联的受体组分。这里术语“等同活性”意味着相同的配体结合活性或实质上等同的配体结合活性。
关于标记的配体，利用标记的配体、标记的amalogized配体化合物等是可能的。例如，可利用以[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的配体和其它标记的物质。
具体地说，首先，把包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜组分悬浮在缓冲液中以制备的受体样品，这种缓冲液在进行筛选能够改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物时，适合于测定方法。关于缓冲液，任何不抑制配体和受体结合的缓冲液(如pH4-10，优选地，pH6-8的Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液)都可利用。
此外，表面活性剂(如CHAPS、Tween 80TM(Kao-Atlas，日本)、毛地黄皂苷、脱氧胆酸盐等)和/或各种蛋白质(如牛血清清蛋白(BSA)、明胶等)可以以减少非特异性结合的目的加至缓冲液。此外，蛋白酶抑制剂(如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(由肽实验室制造，日本)、胃酶抑制剂等可以以抑制蛋白酶分解受体和配体的目的加入。把一定量(5,000cpm-500,000cpm)的标记配体加至0.01ml-10ml所说的受体溶液，同时，与10-4M-10-10M的待试化合物共存。为测定非特异性的结合量(NSB)，也制备了其中大量过量的非标记待试化合物加入的反应试管。
反应在0-50℃下进行，优选地，在4-37℃下进行20分钟至24小时，优选地，30分钟至三小时。反应后，通过玻璃纤维过滤器、滤纸或类似的滤器过滤，以适合量的相同缓冲液洗涤，玻璃纤维过滤器中余下的放射性借助于液体闪烁计数器或γ计数器测定。例如，假设，通过从全部结合量(B0)中减去非特异结合量(NSB)得到的计数(B0-NSB)(其中，不存在拮抗物质)设定为100％，其中，从全部结合量(B)中减去非特异结合量(NSB)获得的特异性结合量(B-NSB)小于50％的待试化合物可选为本发明的G蛋白偶联受体蛋白质的候选配体。
在进行上述方法4)-5)以筛选能够改变配体和G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物时，G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性，例如生理学反应的促进活性或抑制活性(如花生四烯酸的释放、乙酰胆碱的释放、胞内Ca2+的增加、胞内cAMP的产生、肌醇磷酸的产生、膜电位的变化、胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的活化、pH值的降低、G蛋白的活化以及细胞的增殖等)可通过已知的方法或通过利用市售的测量试剂盒测定。更具体地说，首先在多孔板或类似物上培养包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞。
在进行筛选时，事先以对新鲜培养基或细胞不显示毒性的适合缓冲液取代，加入待试化合物等，在适当的条件下温育规定的时间。提取产生的细胞，或回收上清液液体，通过各种方法测定产物，优选地是定量测定。当鉴定指示物(例如花生四烯酸等，是一种由于细胞中包含的分解酶的存在而产生的细胞刺激活性的指示物)的产生困难时，可通过加入所说的分解酶的抑制剂进行测定。关于活性(如对cAMP产生的抑制作用)，可作为对细胞中cAMP产生(其基本产量已由毛喉素或类似物增加)的抑制作用检测。
在通过测定细胞刺激活性进行筛选时，其中适合的G蛋白偶联受体蛋白质表达的细胞是必要的。优选的表达G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是包含天然存在的G蛋白偶联受体蛋白质(天然型G蛋白偶联受体蛋白质)的细胞系或株(例如小鼠胰β细胞系、MIN6等、表达上述的重组型G蛋白偶联受体蛋白质的细胞系或株等)。
待试化合物的例子包括肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞抽提物、植物提取液、动物组织提取液、血清、血液、体液等。那些化合物可以是新的或已知的。
用于筛选能够改变配体和G蛋白偶联受体蛋白质或其盐结合活性的化合物的试剂盒包含G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽或包含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或其细胞膜组分。
筛选试剂盒的例子包括如下：
1.测定配体的试剂。
1)测定缓冲液以及洗涤缓冲液。
其中0.05％的牛血清清蛋白(由Sigma制造)加至Hanks平衡盐溶液(由Gibco制造)的产物。
这可通过具有0.45μm孔大小的膜滤器的过滤灭菌，并在4℃下保存或按照用途制备。
2)G蛋白偶联受体蛋白质样品。
把其中G蛋白偶联受体蛋白质表达的CHO细胞在12孔平板上以5×105细胞/孔的速率继代培养，并在37℃下，5％CO2以及95％空气大气中培养两天以制备样品。
3)标记配体。
以市售的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的配体。
水溶液态的产物在4℃或-20℃保存；利用时，以缓冲液稀释为1μM以用于测定。
4)标准的配体溶液。
把配体溶解在包含0.1％牛血清清蛋白的PBS(由Sigma制造)中使其为1mM，并在-20℃保存。
2.测定方法。
1)在12孔组织培养平板上培养CHO细胞以表达G蛋白偶联受体蛋白质。表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞以1ml的测定缓冲液洗涤两次。然后，向每孔加入490μl测定缓冲液。
2)加入5μl 10-3-10-10的待试化合物溶液，然后，加入5μl标记配体，并使之在室温下反应一小时。为了知道非特异性的结合量，加入5μl10-3M的配体替代待试化合物。
3)把反应溶液从孔除去，此乳以1ml测定缓冲液洗涤三次。把与细胞结合的标记配体溶解在0.2N NaOH-1％SDS中，并与4ml的液态闪烁器A(如由日本Wako Pure Chemical制造)混合。
4)利用液体闪烁计数器(例如由Beckmann制造)测定放射性，PMB(最大结合的百分数)由下列方程式计算：
PMB＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
PMB：最大结合百分数
B：加入样品时的值
NSB：非特异性结合
B0：最大结合
由筛选方法或筛选试剂盒获得的化合物或其盐是能够改变配体多肽与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性的化合物，其中，化合物阻止或促进键合，具体地说，它是具有由G蛋白偶联的受体或其盐介导的细胞刺激活性的化合物，即所谓的“G蛋白偶联的受体刺激剂”，或没有所说的刺激活性的化合物，即所谓的“G蛋白偶联的受体拮抗剂”。所说的化合物的例子是肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产品等，且化合物可以是新的或已知的。
所说的G蛋白偶联受体兴奋剂与G蛋白偶联受体蛋白质配体具有相同的生理学作用，因此，根据所说的配体活性，它作为一种安全而毒性较小的药物组合物是有用的。
另一方面，所说的G蛋白偶联的受体拮抗剂能够抑制G蛋白偶联受体蛋白质配体的生理学活性，因此，它作为一种抑制所说的配体活性的安全而毒性较小的药物组合物是有用的。
本发明的配体多肽涉及垂体功能调节作用、中枢神经系统功能调节作用或胰功能调节作用。因此，上述兴奋剂或拮抗剂可用作痴呆[如老年性痴呆、脑血管痴呆(由于脑血管紊乱的痴呆)、与种系退化退行性疾病相联的痴呆(如阿耳茨海默氏疾病、帕金森病、Pick’s疾病、Huntington’s疾病等)、由传染病(例如，延迟病毒感染，如C-J疾病)引起的痴呆、与内分泌、代谢以及中毒病(例如甲状腺机能亢进减退、VB12缺乏、酒精中毒及各种药物、金属或有机化合物的中毒)相联的痴呆、与瘤原性疾病(如脑瘤)相联的痴呆、由于损伤疾病(例如慢性硬膜下血肿)引起的痴呆]、抑郁(忧郁症)、多动(脑过小)综合征、意识障碍、忧虑综合征、精神分裂症、恐怖、生长激素分泌疾病(例如巨人症、肢端巨大等)、多食症、贪食症、高胆甾醇血、高甘油酯、高血脂、泌乳刺激素过多、低血糖、垂体机能紊乱、垂体性侏儒、糖尿病(例如糖尿病并发症、糖尿病肾病、糖尿病神经病、糖尿病视网膜病等)、癌症(例如乳房癌、淋巴白血病、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等)、胰腺炎、肾病(例如铬肾部衰竭、肾炎等)、特纳氏综合症、神经官能症、风湿性关节炎、脊柱损伤、暂时性脑局部缺血、肌萎缩横向硬化、急性心肌梗塞、髓小脑退化、骨折、创伤、特应性皮炎、骨质疏松、气喘、癫痫、不育或乳汁减少的治疗和/或预防剂。此外，兴奋剂或拮抗剂也可用作催眠镇静剂、手术后营养状态和/或血管增压或减压改善剂。
因此，当通过筛选方法或通过筛选试剂盒获得的化合物或其盐用作药物组合物时，可应用常规方法，该方法与利用上述配体多肽作为药物组合物的方法相同。
(5)抗配体多肽或G蛋白偶联受体蛋白质的抗体或抗血清的产生。
抗配体多肽或G蛋白偶联受体蛋白质的抗体(如多克隆抗体、单克隆抗体)或抗血清可利用配体多肽或G蛋白偶联受体蛋白质作为抗原，通过本领域技术人员已知的产生抗体或抗血清本身的方法或类似的方法产生。例如，多克隆抗体可用如下给出的方法产生。
[多克隆抗体的制备]
把上述的作为抗原的多肽或蛋白质偶联到载体蛋白上。例如，载体蛋白质可以是牛甲状腺球蛋白、牛血清清蛋白、牛γ-球蛋白、血青素或弗氏完全佐剂(Difco)。
抗原蛋白质和载体蛋白质间的偶联反应可通过已知的方法进行。用于偶联反应的试剂包括但不限于戊二醛和水溶性碳化二亚胺。抗原蛋白质与载体蛋白质的适合比为约1∶1至约1∶10，至于反应pH值，当反应在约中性进行时，尤其在pH约6-8的范围进行时，在许多情况下获得了令人满意的结果。许多情况下，反应时间优选地为约2-6小时，更优选地约1-12小时。把这样获得的缀合物在约0-18℃以常规方式对水透析，并冰冻保存，或者可以也可以不冷冻干燥并保存。
为产生多克隆抗体，把以上文描述的方式产生的免疫原接种给温血动物。可用于这一目的温血动物包括哺乳动物的温血动物(例如野兔、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、马、猪等)和鸟物种(例如小鸡、鸽、鸭、鹅、鹌鹑等)。关于以免疫原接种温血动物的方法，免疫原的接种物的量可为恰够抗体产生。例如，所需的抗体可在许多实例中，通过在1ml盐水中以弗氏完全佐剂乳化1mg免疫原，并以4周的间隔在兔的后部和后肢爪垫皮下注射乳剂5次产生。为收获在温血动物(例如野兔)中产生的抗体，通常在最后接种剂量后第7天至第12天内，从耳静脉提取血液，并离心以回收抗血清。为了纯化，通常利用载体(每一抗原肽已偶联)使抗血清亲和层析，回收吸附的组分以提供多克隆抗体。
单克隆抗体可通过下列方法产生。
[单克隆抗体的制备]
(a)制备产生单克隆抗体的细胞。
配体多肽或G蛋白偶联受体蛋白质单独或与载体或稀释剂一起施用于温血动物(施用至可能产生抗体的位点)。为了增加抗体的施用产率，可施用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。施用通常每两至六周进行一次，共两至十次。可适用的温血动物的例子是猴子、野兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊和小鸡，优选的是利用小鼠和大鼠。
在制备产生单克隆抗体的细胞中，其中抗体滴度标明的动物选自以抗原免疫的温血动物(例如小鼠)，然后，从最后免疫的两至五天后，收集脾或淋巴结，其中包含的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以给出产生单克隆抗体的杂交瘤。例如，抗血清中的抗体滴度的测定可通过标记的配体多肽或标记的G蛋白偶联受体蛋白质与抗血清反应(稍后将论及)，接着通过测定标记试剂与抗体的结合活性进行。例如，融合操作可用Koehler和Milstein的方法进行(自然，256，495，1975)。融合加速器的例子是聚乙烯乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选的是利用PEG。
骨髓瘤细胞的例子是NS-l、P3U1、SP2/0、AP-1等，优选的是利用P3U1。优选的，利用的产生抗体的细胞(脾细胞)的量与骨髓瘤细胞的量的融合比在约1∶1-20∶1范围内。当在约10-80％的浓度中加入PEG(优选地，PEG1000-PEG6000)，接着在20-40℃(优选地，在30-37℃)培养一至十分钟时，可进行有效的细胞融合。
可用各种方法以筛选产生抗配体多肽的抗体或抗G蛋白质偶联的受体的抗体的杂交瘤。例如，把杂交瘤培养物的上清液加至配体多肽的抗原或G蛋白质偶联受体蛋白质的抗原直接或以载体吸附的固相(例如微型板)，然后，把以放射性物质、酶或类似物标记的抗免疫球蛋白的抗体(当用于细胞融合的细胞是小鼠细胞时，利用抗小鼠免疫球蛋白的抗体)或蛋白质A加入，然后，检测固相上结合的抗配体多肽的单克隆抗体或抗G蛋白质偶联的受体的单克隆抗体；或把杂交瘤培养物的上清液加至吸附抗免疫球蛋白或蛋白质A的固相，然后，把以放射性物质标记的配体多肽或G蛋白偶联的受体或酶加入，检测与固相键合的抗配体多肽或抗G蛋白质偶联的受体单克隆抗体。
产生抗配体多肽的单克隆抗体或抗G蛋白质偶联的受体的单克隆抗体的杂交瘤的选择和克隆可通过为本领域技术人员已知的方法或类似方法进行。通常，在包含HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)的动物细胞培养基中进行。关于培养基，为了选择，为了克隆及生长，只要杂交瘤能够在其中生长的任何培养基都可利用。培养基的例子是包含1-20％(优选地10-20％)胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基(日本Dainippon药物有限公司)、包含1-20％胎牛血清的GIT培养基(Wako纯化化学，日本)和用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101；Nissui Seiyaku，日本)。培养温度通常是20-40℃，优选地，约37℃。培养时间通常是五天到三周，优选地，一至两周。培养通常在5％二氧化碳气体中进行。杂交瘤培养物上清液的抗体滴度可通过与上述的测定抗血清中抗配体多肽或抗G蛋白质偶联的受体的抗体滴度的相同方式测定。
(b)单克隆抗体的纯化。
如分离/纯化常规的多克隆抗体，分离/纯化抗配体多肽的单克隆抗体或抗G蛋白偶联的受体的单克隆抗体可用分离/纯化免疫球蛋白的方法进行，这些方法包括：如盐析、用醇沉淀、等电沉淀、电泳、利用离子交换剂(如DEAE)的吸附/无吸附、超速离心、凝胶过滤、特定的纯化方法(其中，通过以活性吸附剂(如结合抗原的固相、蛋白质A或蛋白质G)处理和解离键只收集抗体，由此获得抗体)。
由前述的方法(a)或(b)产生的配体多肽抗体或G蛋白偶联的受体抗体能够特异性地识别配体多肽或G蛋白偶联的受体，因此，可用于定量测定试液样品中的配体多肽或G蛋白偶联的受体，特别可用于通过夹心免疫测定的定量测定。
这样，本发明提供了下列方法，例如：
(i)定量测定试液样品中配体多肽或G蛋白偶联的受体的方法，该方法包括：
(a)使试液样品和标记的配体多肽或标记的G蛋白偶联的受体与抗体(与配体多肽或G蛋白偶联的受体反应)进行竞争性反应。
(b)测定标记的配体多肽或标记的G蛋白偶联的受体与所说抗体结合的比率；
(ii)定量测定试液样品中的配体多肽或G蛋白偶联的受体的方法，该方法包括：
(a)使试液样品与固定在不溶性载体上的抗体和标记的抗体同时或连续的反应，和
(b)测定不溶性载体上标记试剂的活性
其中，一种抗体能够识别配体多肽或G蛋白偶联的受体的N端区域，而另一种抗体能够识别配体多肽或G蛋白偶联的受体的C端区域。
当利用本发明的能够识别配体多肽或G蛋白偶联的受体的单克隆抗体(下文可称作“抗配体多肽或抗G蛋白质偶联的受体的抗体”)时，可测定配体多肽或G蛋白偶联的受体，此外，也可借助于组织染色等检测。对于这类目的，可利用抗体分子本身，或也可利用抗体分子的F(ab′)2，Fab’或Fab组分。对于利用本发明抗体的测定方法没有任何特殊的限制，只要涉及其中抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量取决于或对应于抗原的量的任何测定方法都可利用，例如，要测定的液态样品中配体多肽或G蛋白偶联的受体等的量，通过化学或物理方法检测，然后，利用由包含已知抗原量的标准溶液制备的标准曲线计算。例如，肾分析法(nephrometry)、竞争性方法、免疫法以及夹心方法是适宜利用的，在灵敏度和特异性方面，本文稍后将描述的夹心方法是特别优选的。
用于利用标记物质的测定方法中的标记试剂的例子是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、胶体、磁性物质等。放射性同位素的例子是[125I]、[131I]、[3H]和[14C]；酶优选的例子是那些稳定的且具有大的比活性的酶，如β-半乳糖甙酶、β-糖苷酶、碱磷酸酶、过氧化物酶以及苹果酸脱氢酶；荧光物质的例子是荧光胺、异硫氰酸荧光素等；发光物质的例子是鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、硝基双-N-甲基吖啶等。此外，生物素-抗生物素蛋白系统也可用于抗体或抗原与标记试剂的结合。
在抗原或抗体的不溶(固定)化中，可利用物理吸附，或也可利用通常用于蛋白质或酶的不溶或固定化的化学结合。载体的例子是不溶性霉菌多糖类(如琼脂糖、葡聚糖以及纤维素)、合成树脂(如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷)、玻璃等。
在夹心(或两部位)方法中，使试液与不溶性抗配体多肽或抗G蛋白偶联的受体的抗体反应(第一反应)，然后，使试液与标记的抗配体多肽或抗G蛋白偶联的受体的抗体反应(第二反应)，并测定不溶性载体上标记试剂的活性，因此，载体上试液中配体多肽或G蛋白偶联的受体的量可测定。第一反应和第二反应可逆转进行，或同时进行，或以一定间隔进行。标记试剂的类型和不溶性(固定)方法可与本文已论及的那些相同。在借助于夹心方法的免疫测定中，并非总是必要的是：用于标记的抗体与用于固相的抗体是同一类型或同一物种，但为了改进测定的灵敏度等的目的，也可利用两种或更多种抗体混合物。
在用本发明的夹心方法的测定配体多肽或G蛋白偶联的受体的方法中，用于第一反应和第二反应的优选的抗配体多肽抗体或抗G蛋白偶联的受体的抗体是结合到配体多肽或G蛋白偶联的受体的位点互不相同的抗体。因此，用于第一反应的抗体和用于第二反应的抗体是：其中用于第二反应的抗体识别配体多肽或G蛋白偶联的受体的C端区域，识别除C端区域外其它位置(例如识别N端区域)的抗体，优选地用于第一反应。
本发明的抗配体多肽的抗体或抗G蛋白偶联的受体的抗体可用于除夹心方法外的测定系统(如竞争性方法、免疫法以及肾分析法)。在竞争性方法中，使试液中的抗原和标记的抗原以竞争性方式与抗体反应，然后，分离未反应的标记抗原(F)和与抗体结合的标记抗原(B)(即B/F分离)，测定标记的任何B和F的量，以测定试液中抗原的量。关于用于这类反应的方法，有液相方法(其中，可溶性抗体用作抗体，B/F分离通过聚乙烯乙二醇、上述抗体的第二抗体等进行)和固相方法(其中，固定的抗体用作第一抗体，或当固定的抗体用作第二抗体时，可溶性抗体用作为第一抗体。
在免疫法中，使试液中的抗原和固定的抗原与一定量的标记抗体进行竞争性反应，接着分为固相和液相；或使试液中的抗原和过量的标记抗体反应，然后，把固定化的抗原加入以使未反应的标记抗体与固相结合，并分为固相和液相。此后，测定任何相的标记物的量以测定试液中抗原的量。
在肾分析法中，测定不溶性沉淀的量，该沉淀是作为凝胶中和溶液中抗原-抗体反应的结果产生的。即使当试液中的抗原量小并且仅获得小量的沉淀时，也可以合适地使用利用激光散射的激光肾分析法。
在使用那些免疫学测量法(免疫测定法)的各种测量本发明的方法中，不需要为此建立任何特定的条件和进行特定的操作等。就各种方法的常规条件与操作，考虑本领域技术人员的技术因素，可以建立配体多肽或G蛋白-偶联受体的一个测量系统(测定系统)。那些常规的技术手段的详细内容可以参照各种综述，参考书等。它们是例如Hiroshi Irie(编者)：＂放射免疫测定＂(Kodansha，日本，1974)；Hiroshi Irie(编者)：＂放射免疫测定；第二系列＂(Kodansha，日本，1979)；Eiji Ishikawa等(编者)：＂酶免疫测定＂(Igaku Shoin，日本，1978)；Eiji Ishikawa等(编者)：＂酶免疫测定＂(第二版)(Igaku Shoin，日本，1982)；Eiji Ishikawa等(编者)：＂酶免疫测定＂(第三版)(Igaku Shoin，日本，1987)；＂酶学中的方法＂Vol.70(免疫化学技术(A部分))；同上，Vol.73(免疫化学技术(B部分))；同上。Vol.74(免疫化学技术(C部分))；同上，Vol.84(免疫化学技术(D部分：选择免疫测定))；同上，Vol92(免疫化学技术(E部分：单克隆抗体和一般免疫测定方法))；同上，Vol121(免疫化学技术(I部分I：杂交瘤技术和单克隆抗体))(学院出版社)等等。
这样，现在可以用本发明的抗-配体多肽或抗-G蛋白-偶联受体抗体以高精度测定配体多肽或G蛋白-偶联受体蛋白的量。
在本申请的说明书和附图中，用于表示碱基(核苷酸)，氨基酸等的缩写是由生化命名IUPAC-IUB委员会推荐的那些和本领域常用的那些。它们的例子在以下给出。可能有旋光异构的氨基酸是指L形的，除非有其它说明。
DNA：脱氧核糖核酸
cDNA：互补脱氧核糖核酸
A：腺嘌呤
T：胸腺嘧啶
G：鸟嘌呤
C：胞嘧啶
RNA：核糖核酸
mRNA：信使核糖核酸
dATP：脱氧腺苷三磷酸
dTTP：脱氧胸苷三磷酸
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸
dCTP：脱氧胞苷三磷酸
ATP：腺苷三磷酸
EDTA：乙二胺四乙酸
SDS：十二烷磺酸钠酶
EIA：酶免疫测定
  G，Gly：甘氨酸(或甘氨酰)
  A，Ala：丙氨酸(或丙氨酰)
V，Val：缬氨酸(或缬氨酰)
L，Leu：亮氨酸(或亮氨酰)
I，Ile：异亮氨酸(或异亮氨酰)
S，Ser：丝氨酸(或丝氨酰)
T，Thr：苏氨酸(或苏氨酰)
C，Cys：半胱氨酸(或半胱氨酰)
M，Met：甲硫氨酸(或甲硫氨酰)
E，Glu：谷氨酸(或谷氨酰)
D，Asp：天门冬氨酸(或天门冬氨酰)
K，Lys：赖氨酸(或赖氨酰)
R，Arg：精氨酸(或精氨酰)
H，His：组氨酸(或组氨酰)
F，Phe：苯基丙氨酸(或苯基丙氨酰)
Y，Tyr：酪氨酸(或酪氨酰)
W，Trp：色氨酸(或色氨酰)
P，Pro：脯氨酸(或脯氨酰)
N，Asn：天冬酰胺(或天冬酰胺酰)
Q，Gin：谷酰胺(或谷酰胺酰)
pGlu：焦谷氨酸(或焦谷氨酰)
Me：甲基
Et：乙基
Bu：丁基
Ph：苯基
TC：噻唑烷基-4(R)-羧酰胺
在本说明书中，取代，保护基以及通常使用的试剂由下列缩写表示：
BHA：二苯甲基胺
pMBKA：p-甲基二苯甲胺
Tos：p-甲苯磺酰
CHO：甲酰基
HONB：N-羟基-5-降冰片烯-2，3-联羧基亚胺
OcHex：环已基酯
Bzl：苄基
Bom：苄氧甲基
Br-Z：2-溴苯氧羰基
Boc：叔-丁氧羰基
DCM：二氯甲烷
HOBt：1-羟基苯并三唑
DCC：N，N-二环己基碳化二亚胺
TFA：三氟乙酸
DIEA：二异丙基乙酰胺
Fmoc：N-9-芴基甲氧羰基
DNP：二硝基苯基
Bum：叔-丁氧甲基
Trt：三苯甲基
说明书序列表中的各SEQ ID NO指下列序列：
[SEQ ID NO：1]是由在pBOV3中所包含的互补DNA编码的牛垂体-来源的配体多肽的完整的氨基酸序列。
[SEQ ID NO：2]是牛垂体-来源的配体多肽cDNA的完整的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：3]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列，其由P-3组分的N端序列的纯化和分析获得。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第23-51位。
[SEQ ID NO：4]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列，其由P-2组分的N端序列的纯化和分析获得。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34-52位。
[SEQ ID NO：5]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第23-53位。
[SEQ ID NO：6]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第23-54位。
[SEQ ID NO：7]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第23-55位。
[SEQ ID NO：8]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34-53位。
[SEQ ID NO：9]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34-54位。
[SEQ ID NO：10]是牛垂体-来源的配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第34-55位。
[SEQ ID NO：11]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：3)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：12]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：4)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：13]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：5)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：14]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：6)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：15]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：7)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：16]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：8)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：17]是编码牛垂体所衍生的配体多肽(SEQ ID NO：9)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：18]是编码牛垂体-来源的配体多肽(SEQ ID NO：10)的DNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：19]是由在p19P2中所包含的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段编码的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白的部分氨基酸序列。
[SEQ ID NO：20]是由在p19P2中包含的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段编码的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白的部分氨基酸序列。
[SEQ ID NO：21]是由在phGR3中包含的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA编码的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白的完整的氨基酸序列。
[SEQ ID NO：22]是由小鼠胰β-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段编码的小鼠胰P-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白的部分氨基酸序列，所说的cDNA片段具有基于各自在pG3-2和pG1-10中所包含的小鼠胰β-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段的核苷酸序列衍生的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。
[SEQ ID NO：23]是由p5S38编码的小鼠胰β-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白的部分氨基酸序列。
[SEQ ID NO：24]是在p19P2中包含的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段的核苷酸序列。
[SEQ ID N：25]是在p19P2中包含的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：26]是在phGR3中包含的人垂体-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA的完整的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：27]是小鼠胰β-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA的核苷酸序列，所说的cDNA片段是基于各自在pG3-2和pG1-10中所包含的小鼠胰β-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA片段的核苷酸序列衍生的。
[SEQ ID NO：28]是在p5S38中包含的小鼠胰β-细胞系MIN6-来源的G蛋白-偶联受体蛋白cDNA的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：29]是用于筛选编码G蛋白-偶联受体蛋白的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：30]是用于筛选编码G蛋白-偶联受体蛋白的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：31]是用于筛选编码G蛋白-偶联受体蛋白的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：32]是用于筛选编码G蛋白-偶联受体蛋白的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：33]是用于筛选编码G蛋白-偶联受体蛋白的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：34]是用于筛选编码G蛋白-偶联受体蛋白的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：35]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用P5-l表示。
[SEQ ID NO：36]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用P3-1表示。
[SEQ ID NO：37]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用P3-2表示。
[SEQ ID NO：38]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用PE表示。
[SEQ ID NO：39]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用PDN表示。
[SEQ ID NO：40]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用FB表示。
[SEQ ID NO：41]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用FC表示。
[SEQ ID NO：42]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用BOVF表示。
[SEQ ID NO：43]是用于筛选编码牛垂体-来源的配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用BOVR表示。
[SEQ ID NO：44]是牛基因组-来源的配体多肽的完整的氨基酸序列。
[SEQ ID NO：45]是由在pRAV3中所包含的cDNA编码的大鼠型配体多肽的完整的氨基酸序列。
[SEQ ID NO：46]是大鼠型配体多肽cDNA的完整的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：47]是大鼠型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于
SEQ ID NO：45的氨基酸序列的第22-52位。
[SEQ ID NO：48]是大鼠型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：45的氨基酸序列的第22-53位。
[SEQ ID NO：49]是大鼠型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：45的氨基酸序列的第22-54位。
[SEQ ID NO：50]是大鼠型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：45的氨基酸序列的第33-52位。
[SEQ ID NO：51]是大鼠型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：45的氨基酸序列的第33-53位。
[SEQ ID NO：52]是大鼠型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于对SEQ ID N0.45的氨基酸序列的第33-54位。
[SEQ ID NO：53]是编码SEQ ID NO：47的大鼠型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：54]是编码SEQ ID NO：48的大鼠型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：55]是编码SEQ ID NO：49的大鼠型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：56]是编码SEQ ID NO：50的大鼠型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：57]是编码SEQ ID NO：51的大鼠型配体多肽的核苷酸序列。
[SEP ID NO：58]是编码SEQ ID NO：52的大鼠型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：59]是由包含在pHOB7中的cDNA编码的人类型配体多肽的完整的氨基酸序列。
[SEQ ID NO：60]是人类型配体多肽cDNA的完整的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：61]是人类型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：59的氨基酸序列的第23-53位。
[SEQ ID NO：62]是人类型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：59的氨基酸序列的第23-54位。
[SEQ ID NO：63]是人类型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：59的氨基酸序列的第23-55位。
[SEQ ID NO：64]是人类型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：59的氨基酸序列的第34-53位。
[SEQ ID NO：65]是人类型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：59的氨基酸序列的第34-54位。
[SEQ ID NO：66]是人类型配体多肽的氨基酸序列。该氨基酸序列相应于SEQ ID NO：59的氨基酸序列的第34-55位。
[SEQ ID NO：67]是编码SEQ ID NO：61的人类型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：68]是编码SEQ ID NO：62的人类型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：69]是编码SEQ ID NO：63的人类型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：70]是编码SEQ ID NO：64的人类型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：71]是编码SEQ ID NO：65的人类型配体多肽的核苷酸序列。
[SEE ID NO：72]是编码SEQ ID NO：66的人类型配体多肽的核苷酸序列。
[SEQ ID NO：73]是配体多肽的部分氨基酸序列，其中10位的Xaa是丙氨酸或苏氨酸，11位的Xaa是甘氨酸或丝氨酸，21位的Xaa是H，甘氨酸或甘氨酸精氨酸。
[SEQ ID NO：74]是配体多肽的部分氨基酸序列，其中3位的Xaa是丙氨酸或苏氨酸，5位的Xaa是谷氨酰胺或精氨酸，10位的Xaa是异亮氨酸或苏氨酸。
[SEQ ID NO：75]是用于筛选编码大鼠型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用RA表示。
[SEQ ID NO：76]是用于筛选编码大鼠型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用RC表示。
[SEQ ID NO：77]是用于筛选编码大鼠型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用rF表示。
[SEQ ID NO：78]是用于筛选编码大鼠型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用rR表示。
[SEQ ID NO：79]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用R1表示。
[SEQ ID NO：80]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用R3表示。
[SEQ ID NO：81]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用R4表示。
[SEQ ID NO：82]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用HA表示。
[SEQ ID NO：83]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用HE表示。
[SEP ID NO：84]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用HE表示。
[SEQ ID NO：85]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用HF表示。
[SEQ ID NO：86]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用5H表示。
[SEQ ID NO：87]是用于筛选编码人类型配体多肽的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用3HN表示。
[SEQ ID NO：88]是用于筛选编码大鼠型G蛋白-偶联受体蛋白(UHR-1)的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用rRECF表示。
[SEQ ID NO：89]是用于筛选编码大鼠型G蛋白-偶联受体蛋白(UHR-1)的cDNA的合成DNA引物，其中的引物用rRECR表示。
[SEQ ID NO：90]是用于G3PDH，UHR-1和配体扩增的合成DNA，其中的引物用r19F表示。
[SEQ ID NO：91]是用于G3PDH，UHR-1和配体扩增的合成DNA，其中的引物用r19F表示。
[SEQ ID NO：92]是用于抗原的配体多肽的N端肽。(肽-I)
[SEQ ID NO：93]是用于抗原配体多肽的C端肽。(肽-II)
[SEQ ID NO：94]在用于抗原的配体多肽中的中央部分的肽。(肽-III)
[SEQ ID NO：95]是用于筛选编码大鼠型G蛋白-偶联受体蛋白(UHR-1)的cDNA的合成DNA引物。
[SEQ ID NO：96]是用于筛选编码大鼠型G蛋白-偶联受体蛋白(UHR-1)的cDNA的合成DNA引物。
在本文以下的实施例2中获得的转化体大肠杆菌(指定为INVαF’/p19P2)按照布达佩斯条约于1994年8月9日保藏在日本国际贸易和工业部工业科学和技术机构的国立生物科学和人体技术研究所(NIBH)，保藏号为FERM BP-4776。该菌株也于1994年8月22日保藏在日本大阪发酵研究所(IFO)，保藏号为IFO 15739。
在本文以下的实施例4中获得的转化体大肠杆菌(指定为INVαF’/pG3-2)按照布达佩斯条约于1994年8月9日保藏在NIBH，保藏号为FERM BP-4775。该菌株也于1994年8月22日保藏在IFO，保藏号为IFO 15740。
在本文以下的实施例5中获得的转化体大肠杆菌(指定为JM109/phGR3)按照布达佩斯条约于1994年9月27日保藏在NIBH，保藏号为FERM BP-4808。该菌株也于1994年9月22日保藏在IFO，保藏号为IFO 15748。
在本文以下的实施例8中获得的转化体大肠杆菌(指定为JM109/p5S38)按照布达佩斯条约于1994年10月27日保藏在NIBH，保藏号为FERMBP-4856。该菌株也于1994年10月25日保藏在IFO，保藏号为IFO15745。
在本文以下的实施例20中获得的转化体大肠杆菌(指定为JM109/pBOV3)按照布达佩斯条约于1996年2月13日保藏在NIBH，保藏号为FERM BP-5391。该菌株也于1996年1月25日保藏在IFO，保藏号为IFO 15910。
在本文以下的实施例29中获得的转化体大肠杆菌(指定为JM109/pRAV3)按照布达佩斯条约于1996年9月12日保藏在NIBH，保藏号为FERM BP-5665。该菌株也于1996年9月3日保藏在IFO，保藏号为IFO 16012。
在本文以下的实施例32中获得的转化体大肠杆菌(指定为JM109/pHOV7)按照布达佩斯条约于1996年9月12日保藏在NIBH，保藏号为FERM BP-5666。该菌株也于1996年9月5日保藏在IFO，保藏号为IFO 16013。
[工业应用]
本发明的生物活性物质(即配体多肽或其酰胺或酯，或其盐，其部分肽)或编码所说的配体多肽的DNA具有对各种组织或内部器官(例如，除垂体、中枢神经系统或胰腺之外，心脏、肺脏、肝、脾、胸腺、肾、肾上腺、骨骼肌、睾丸等)的功能调节活性，并且作为医药有用。此外，所说的物质对兴奋剂或G蛋白-偶联受体蛋白拮抗剂的筛选来说有用。可以由这样的筛选获得的化合物也具有对上述组织或内部器官的功能调节活性，并且作为医药有用。
实施例
以下描述的是本发明的实施例，提供这些实施例仅为了说明性目的，并不用来限制本发明的范围。
[参考实施例1]制备扩增DNA(其编码G-蛋白偶联受体蛋白)的合成DNA引物
比较编码下列各种蛋白质的对应或邻近第一个跨膜结构域的已知氨基酸序列的脱氧核糖核苷酸序列：来源于人的TRH受体蛋白质(HTRHR)，来源于人的RANTES受体蛋白质(L10918，HUMRANTES)，来源于人伯基特氏淋巴瘤的未知配体受体蛋白质(X68149，HSBLR1A)，来源于人的促生长素抑制素受体蛋白质(L14856，HUMSOMAT)，来源于鼠的κ-阿片样受体蛋白质(U02083，RNU02083)，来源于鼠的κ-阿片样受体蛋白质(U00442，U00442)，来源于人的神经调节肽B受体蛋白质(M73482，HUMNMBR)，来源于人的毒蝇碱性乙酰胆碱受体蛋白质(X15266，HSHM4)，来源于鼠的肾上腺素α1B受体蛋白质(L08609，RATAADRE01)，来源于人的促生长素抑制素3受体蛋白质(M96738，HUMSSTR3X)，来源于人的C5a受体蛋白质(HUMC5AAR)，来源于人的未知配体受体蛋白质(HUMRDC1A)，来源于人的未知的配体受体蛋白质(M84605，HUMOPIODRE)以及来源于鼠的肾上腺素α2B受体蛋白质(M91466，RATA2BAR)。其结果是发现了高度同源的区域或部分。
此外，比较编码下列蛋白质的对应或邻近第六个跨膜结构域的已知氨基酸序列的脱氧核糖核苷酸序列：来源于鼠的的未知的配体受体蛋白质(M80481，MUSGIR)，来源于人的铃蟾抗菌肽受体蛋白质(L08893，HUMBOMB3S)，来源于人的腺苷维生素A2受体蛋白质(S46950，S46950)，来源于鼠的未知的配体受体蛋白质(D21061，MUSGPCR)，来源于鼠的TRH受体蛋白质(S43387，543387)，来源于鼠的神经调节肽κ受体蛋白质(J05189，RATNEURA)，来源于鼠的腺苷A1受体蛋白质(M69045，RATA1ARA)，来源于人的神经激肽A受体蛋白质(M57414，HUMNEKAR)，来源于鼠的腺苷A3受体蛋白质(M94152，DATADENREC)，来源于人的促生长素抑制素1受体蛋白质(M81829，HUMSRI1A)，来源于人的神经激肽3受体蛋白质(S86390，S86371S4)，来源于鼠的未知的配体受体蛋白质(X61496，RNCGPCR)，来源于人的促生长素抑制素4受体蛋白质(L07061，HUMSSTR4Z)和来源于鼠的GnRH受体蛋白质(M31670，RATGNRHA)。其结果是发现了高度同源的区域或部分。
在前面括号中提到的缩写是标识符(参考编号)，该标识符是在通过利用DNASIS基因/蛋白质测序数据库(CD019，Hitachi软件工程，日本)检索GenBank/EMBL数据库时所指示的，并且通常称其为＂入藏号＂或“登录名”。然而，HTRHR是在编号为304797/1993的日本专利出版物(EPA638645)中出现的序列。
具体地说，依据与编码大量受体蛋白的cDNA一致的碱基区来渗入混合的碱基，以尽可能提高与许多受体cDNA的碱基序列一致性(即使在其他区域)。基于这些序列，可制备合成的简并DNA，其具有与同源的核苷酸序列互补的核苷酸序列(由SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30表示)。
[合成DNA]
5′-CGTGG(G或C)C(A或C)T(G或C)(G或C)
TGGGCAAC(A，G，C或T)(C或T)CCTG-3′(SEQ ID NO：29)
5′-GT(A，G，C或T)G(A或T)(A或G)(A或G)GGCA
(A，G，C或T)CCAGCAGA(G或T)GGCAAA-3′(SEQ ID NO：30)
括号表示可掺入不同碱基，从而在引物制备中产生若干种寡核苷酸。换句话说，上述DNA括号内的核苷酸，在合成期内在若干不同碱基混合物存在时掺入。
[实施例1]利用来源于人垂体的cDNA通过pCR扩增受体cDNA将来源于人垂体的cDNA(QuickClone，CLONTECH实验室，Inc.)作为模板，运用参考实施例1合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液成分包含分别为1μM的合成DNA引物(SEQ：5′引物序列和3′引物序列)，1ng模板cDNA，0.25mM dNTP，1μl的Taq DNA聚合酶和酶试剂盒所附的缓冲液，使反应液总量为100μl。扩增循环包括95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟。利用热循环仪(Perkin-Elmer公司)重复30次。在加入Taq DNA聚合酶之前，混合余下的反应液并在95℃加热5分钟，然后在65℃加热5分钟。通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色证实扩增产物。
[实施例2]PCR产物亚克隆进质粒载体及筛选新的候选受体克隆(其通过解码插入cDNA区域的核苷酸序列而获得)
通过0.8％低熔点琼脂糖凝胶分离PCR产物，用剃刀片从凝胶中取出带部分，并加热熔化，然后用酚抽提，并用乙醇沉淀来回收DNA。根据TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)的方案，将回收DNA亚克隆到质粒载体，PCR TMII(TM代表注册商标)中。将重组载体导入大肠杆菌INVαF′感受态细胞(Invitrogen公司)中制备转化体。然后，通过含氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基选择具有插入cDNA片段的转化体克隆。用灭菌牙签只挑取白颜色的转化体克隆以获得转化体大肠杆菌INVαF′/p19P2。
在含有氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养克隆个体，并且用自动质粒提取仪(Kurabo公司，日本)处理以制备质粒DNA。将这样制备的DNA等分试样用EcoRI来切割，从而证实插入的cDNA片段的长短。余下的DNA等分试样进一步用核糖核酸酶处理，用苯酚/三氯甲烷抽提，然后用乙醇沉淀来浓缩。利用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)进行测序，用荧光自动测序仪来破译该DNA，然后利用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)读取所获得的核苷酸序列的数据。下划线部分表示与合成引物对应的区域。
根据已确定的核苷酸序列[SEQ ID NO：24和25(这里，已确定的核苷酸序列是其下划线部分分别从图1或图2的序列缺失的核苷酸序列)]进行同源性检索。
结果，获悉插入质粒(p19P2，其由转化体大肠杆菌INVcLF/p19P2携带)的cDNA片段编译了一种新的G-蛋白偶联受体蛋白质。为了进一步确认这一事实，利用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)将核苷酸序列转化成氨基酸序列[SEQ ID NO：19和20]，根据疏水性标记[图3和4]进行同源性检索，在氨基酸序列水平上找出与神经肽Y受体蛋白质[图5]有关的同源性。
[实施例3]制备得自小鼠胰β-细胞株(MIN6)的Poly(A)+RNA组分及合成cDNA
根据胍硫氰酸方法(Kaplan B.B.等，生物化学杂志，183，181-184(1979)制备得自小鼠胰β-细胞株即MIN6(Jun-ichi Miyazaki等，内分泌学，Vol.127，NO.1，p.126-132)的总RNA，然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司)制备Poly(A)+RNA组分。接下来，向5μg Poly(A)+RNA组分加入随机DNA六聚体(BRL公司)作为引物，将所形成的混合液在MMLV逆转录酶试剂盒的缓冲液中与小鼠莫洛尼氏白血病毒(MMLV)逆转录酶(BRL公司)反应以合成互补DNA。用苯酚/三氯甲烷抽提反应产物，用乙醇来沉淀，然后将其溶于30μl TE缓冲液(pH为8.0的10mMTris-HCL，pH为8.0的1mM乙二胺四乙酸)。
[实施例4]利用来源于MIN6的cDNA通过PCR扩增受体cDNA和测序
将上述实施例3的由小鼠胰β-细胞株即MIN6制备的5μL cDNA作为模板，并在与实施例1中相同条件下，利用参考实施例1合成的DNA引物进行PCR扩增。以与实施例2相同的方式，将PCR最终产物亚克隆进质粒载体pCRTMII而获得质粒pG3-2。用质粒pG3-2转染大肠杆菌INVαF′而获得转化的大肠杆菌INVαF′/pG3-2。
将由小鼠胰P-细胞株即MIN6制备的5μL cDNA作为模板，并在与实施例1中相同的条件下，利用在Libert F.等，＂科学，244：569-572，1989＂报导的两个DNA引物进行PCR扩增，上述引物即下列序列描述的筒并合成引物：
5′-CTGTG(C或T)G(C或T)(G或C)AT(C或T)GCIIT
(G或T)GA(C或T)(A或C)G(G或C)TAC-3′(SEQ ID NO：31)
其中I代表肌苷；下列序列描述的简并合成引物：
5′-A(G或T)G(A或T)AG(A或T)AGGGCAGCCAGCAGAI(G或C)(A
或G)(C或T)GAA-3′(SEQ ID NO：32)
其中I代表肌苷的。以与实施例2中描述的相同方式，将PCR最终产物亚克隆进质粒载体pCRTMII而获得质粒pG1-10。
用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)确定核苷酸序列(测序)，以荧光自动测序仪(ABI公司)破译该DNA，并用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析所获得的核苷酸序列的数据。
图6显示了的来源于小鼠胰β-细胞株即MIN6的编码G-蛋白偶联受体蛋白的DNA(SEQ ID NO：27)和氨基酸序列(SEQ ID NO：22)，该氨基酸序列是依据转化体大肠杆菌INVαF′/pG3-2所携带的质粒pG3-2和pG1-10的分离DNA编码的。下划线部分表示与合成引物对应的区域。
根据已测定的核苷酸顺序[图6]进行同源性检索。其结果是，获悉G-蛋白偶联受体蛋白是由所得cDNA片段编码的。为进一步确认这一事实，利用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)将核苷酸序列转化成为氨基酸序列[图6]，然后进行疏水性标记以确定六个疏水区[图8]的存在。此外，若将氨基酸序列与实施例2中获得的p19P2进行比较，则发现高度同源性(如[图73]中所示)。结果，它强有力地说明：由pG3-2和pG1-10编码的G-蛋白偶联受体蛋白所识别的配体，与由p19P2编码的G-蛋白偶联受体蛋白所识别的配体是相同的，尽管来源于不同动物物种的由pG3-2和pG1-10编码的与由p19P2编码的受体蛋白质是不同的。
[实施例5]包含来源于人垂体cDNA文库的编码受体蛋白的完整编码区的cDNA的克隆
采用Clontech公司运用(λgt11噬菌体载体(CLONTECH实验室，Inc.；CLH L1139b)构建的DNA文库作为来源于人垂体cDNA文库。用作为人垂体来源的互补DNA文库。将人垂体的cDNA文库(2×106pfu(噬斑形成单位))与硫酸镁处理的大肠杆菌Y1090混合，然后37℃培育15分钟，接着加入0.5％琼脂糖(Pharmacia公司)LB。将大肠杆菌铺在1.5％琼脂(Wako-Junyaku公司)LB平板(含有50(g/ml的氨苄青霉素)上。将硝化纤维素滤器放置在噬斑形成的平板上，则噬斑转移到滤膜上。用碱使滤膜变性，并在80℃加热3小时以固定脱氧核糖核酸。
将滤膜与此处如下的探针在42℃一定缓冲液中培育过夜进行杂交，包含50％甲酰胺，5×SSPE(20×SSPE(pH7.4)的缓冲液是3M NaCl，0.2MNaH2PO4H2O，25mM乙二胺四乙酸)，5×Denhardt′s溶液(Nippon基因，日本)，0.1％SDS和100μg/ml鲑精DNA。
所用探针是用EcoRI切割插入p19P2质粒中的DNA片段而获得的(该质粒是按实施例2而获得的)，接着将[32P]dCTP(Dupont公司)掺入随机抗原性DNA标记试剂盒(Amasham公司)中而进行回收和标记。
用2×SSC(20×SSC是3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)和0.1％SDS在55℃洗脱1小时，然后用放射自显影法在-80℃检测杂交噬斑。
此筛选中，检测到三个单噬斑有杂交信号。每一DNA由此三个克隆制备。将EcoRI水解的脱氧核糖核酸进行琼脂糖电泳，并利用与筛选中相同的探针通过Southen印迹进行分析。分别在0.7kb，0.8kb和2.0kb处识别出杂交带。在它们中，选择与2.0kb带(hGR3)对应的DNA片段。将具杂交尺寸，来源于λhGR3 EcoRI所切的片段亚克隆到质粒(pUC18)的EcoRI位点，然后用该质粒转染大肠杆菌JM109获得大肠杆菌转化体JM109/phGR3。根据由实施例2所示的核苷酸序列而推出的限制性内切酶图谱，制备质粒phGR3的限制性内切酶图谱。结果，获知该质粒携带编码受体蛋白的整个DNA，该DNA可由实施例2所示的编码受体蛋白的DNA所预计。
[实施例6]来源于人垂体受体蛋白cDNA的测序
在插入质粒phGR3(实施例5所获得的)的这些EcoRI片段中，将从EcoRI到NheI约为1330bp的核苷酸序列(其被认为是编码受体区域)进行测序。准确地说，为分析核苷酸序列，利用存在于EcoRI片段中的限制性内切酶位点，使不必要的部分被移走或使必要的片段亚克隆以制备模板质粒。
用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)来测定核苷酸序列(测序)，用荧光自动测序仪(ABI公司)破译该DNA，然后用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)分析所获得的核苷酸序列的数据。
图9表示紧接着EcoRI位点到NheI位点由phGR3编码的核苷酸序列。编码来源于人垂体的受体蛋白的DNA的核苷酸序列与从第118到第1227位核苷酸之间的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)[图9]相符合。由所说核苷酸序列编码的受体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
[实施例7]与编码来源于人垂体的受体蛋白的phGR3 Northern杂交
做Northern印迹，是为了在信使核糖核酸水平上检测垂体中由phGR3编码的来源于人垂体受体蛋白质(该蛋白质是实施例5中所获得的)的表达。把人垂体mRNA(2.5(g，Clontech公司)作为模板mRNA，把与实施例5相同的探针作为探针。用尼龙膜(Pall Biodyne，美国)作为Northern印迹的滤膜，并根据“分子克隆”(冷泉港实验室出版社，1989)讲述的方法用印迹滤膜进行信使核糖核酸迁移与吸附操作。
将上述滤膜与探针在42℃一定缓冲液(含有50％甲酰胺，5×SSPE，5×Denhardt′s溶液，0.1％SDS和100μg/ml鲑鱼精子DNA)中隔夜温育进行杂交。用0.1×SSC和0.1％SDS在50℃洗脱滤膜，接着在空气中干燥，之后将滤膜在-80℃暴露在X射线胶片(XAR5，KODAK)下达三天之久。该结果如图10所示，从结果中可以认为：由phGR3编码的受体基因在人垂体中被表达。
[实施例8]通过PCR利用来源于MIN6的cDNA扩增受体cDNA并测序
在与实施例1相同的条件下，运用由鼠胰β-细胞株(即在实施例3中所述的MIN6)制备的5μ1cDNA作为模板，并用实施例4中据Libert F.等，＂科学，244：569-572，1989＂所述而合成的两个DNA引物进行PCR扩增。此引物中的一个具有如下序列：
5′-CTGTG(C或T)G(C或T)(G或C)AT(C或T)GCI IT(G或T)GA(C或T)(A或C)G(G或C)TAC-3′(SEQ ID NO：31)其中I是肌苷；另一个合成引物具有下列序列：5′-A(G或T)G(A或T)AG(A或T)AGGGCAGCCAGCAGAI(G或C)(A或G(C或T)GAA-3′(SEQ ID NO：32)
其中I是肌苷。最终的PCR产物以与实施例2中相同的方式亚克隆到质粒载体pCRTMII中而获得质粒p5S38。用质粒p5S38转染大肠杆菌JM109得到转化体大肠杆菌JM109/p5S38。
用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(ABI公司)测定核苷酸序列(测序)，用荧光自动测序仪(ABI公司)破译DNA，并用DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)阅读所获得的核苷酸序列的数据。
图12所示的是来源于小鼠胰β-细胞株即MIN6的编码G蛋白偶联受体的DNA(SEQ ID NO：28)和由基于质粒p5S38的核苷酸序列的分离的DNA编码的氨基酸序列(SEW ID NO：23)。下划线部分代表与合成引物对应的区域。
根据已确定的核苷酸序列[图12]进行同源性检索。结果是，可以确认一种G蛋白偶联受体蛋白质是由所获得的cDNA片段编码的。为进一步确认这一事实，通过DNASIS(Hitachi系统工程公司，日本)将核苷酸序列转化成为氨基酸序列[图12]，同时运用疏水性作图以确定四个疏水区域[图14]的存在。此外，通过比较那些由在实施例4中所得的pG3-2和由在实施例2中所得的p19P2编码的氨基酸序列，发现其具有高度同源性并在图13中显示。结果是，明显表明来源于鼠胰β-细胞株即MIN6由p5S38编码的G-蛋白偶联受体蛋白与来源于人垂体由p19P2编码的G-蛋白偶联受体蛋白识别相同的配体，尽管源于不同动物物种的由p5S38编码的和由p19P2编码的受体蛋白不相同。还明显表明来源于鼠胰β-细胞株即MIN6由p5S38编码的G-蛋白偶联受体蛋白与来源于鼠胰β-细胞株MIN6由pG3-2和pG1-10编码的G-蛋白偶联受体蛋白也识别相同的配体，并且它们彼此是类似的受体蛋白(即所谓的“亚型”)。
[实施例9]制备表达phGR3的CHO细胞
将含有编码人垂体受体蛋白全长氨基酸序列的cDNA的质粒phGR3(实施例5)用限制性内切酶Nco I水解，并进行琼脂糖凝胶电泳而回收约1kb的片段。所回收的片段用DNA平端试剂盒(Takara Shuzo公司，日本)平端化；同时，增加SalI接头，用SalI处理并插入到pUC119的SalI位点中而得到质粒S10。接着，用SalI与SacII处理S10来制备(含有N端编码区)的约700 bp的一段片段。然后，用SacII和Nhe I从phGR3中切除(包含含有起始和终止密码子的C端编码区)的约700bp的另一段片段。将这两段片段加入动物细胞表达载体质粒pAKKO-111H(与pAKKO1.11H等同的载体质粒在生物化学生物物理学报，Hinuma，S.等，1219 251-259，1994中描述)并进行连接反应以构建一个全长的受体蛋白质表达质粒pAKKO-19P2。
培育用pAKKO-19p2转染的大肠杆菌并同时用QUIAGEN Maxi大量制备pAKKO-19P2质粒DNA。将质粒DNA的20μg部分溶解于1ml无菌PBS中，并转入基因转移小瓶(Wako纯化化学有限公司)，将溶液充分旋涡以形成核糖体。在加入前立即铺入新鲜培养基并于24小时前在每直径10cm的皿上以1×106进行传代培养的CHOdhfr-细胞中加入125μl的上述核糖体并进行过夜培养。再经过在新鲜培养基上一天的培养，将培养基换成筛选培养基后再进一步培育一天。为有效筛选转化体。细胞以低浓度进行传代培养，只挑取在筛选培养基上生长的细胞构建在CHO细胞系CHO-19P2中表达的全长受体蛋白。
[实施例10]全长受体蛋白质在CHO-19P2细胞系中在转录水平上的表达量的证实
根据试剂盒手册运用FastTrack试剂盒(Invitrogen)用pAKKO-19P2转染CHO细胞并用模拟CHO细胞制备poly(A)+RNA。通过RNA PCR试剂盒(Takara Shuzo，公司，日本)运用0.02μg上述poly(A)+RNA合成cDNA。所用的引物种类是随机9聚体，同时反应混合物总量是40μl。逆转录酶反应混合物用作为合成cDNA的负对照。第一，在30℃温育反应混合物10分钟以在一定程度上进行扩增反应。接着，将其在42℃温育30分钟以便让逆转录作用反应进行。通过在99℃加热5分钟灭活酶，同时将反应体系在5℃冷却5分钟。
完成逆转录反应后，回收部分反应混合物并在用蒸馏水稀释后，用苯酚/氯仿抽提，再用二乙醚进一步抽提。抽提物用乙醇沉淀并用预定量的蒸馏水溶解该沉淀以作为DNA样品，连续稀释此cDNA溶液和质粒DNA(pAKKO-19P2)并用全长受体蛋白的特殊引物进行PCR扩增。根据编码全长受体蛋白的碱基序列而制备的引物序列是5′端为CTGACTTATTTTCTGGGCTGCCGC(SEQ ID NO：33)；3′端为AACACCGACACATAGACGGTGACC(SEQ ID NO：34)。
在100μl体系中进行PCR反应需分别加入1μM的各引物，0.5μl的Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo公司，日本)，相应酶的反应缓冲液和dNTPs，以及10μl模板DNA(cDNA和质粒溶液)。首先，将反应混合物在94℃加热2分钟以使模板DNA充分变性，并于95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×60秒循环25次。反应完成后，用10μl的反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，并进行扩增产物的检测和定量比较。结果是，检测到来自编码全长受体蛋白的cDNA序列可预言的大小约(400bp)的pCR产物[图15]。在用逆转录酶转录系统的产物作为模板的PCR反应混合物泳道上，没有发现任何特异性带，故排除其是来自CHO细胞基因组DNA所衍生的PCR产物的可能性。此外，在模拟细胞的泳道中也没有发现任何特异性带。因此，可确认产物不是来自最初在CHO细胞中表达的mRNA[图15]。
[实施例11]检测大鼠整个脑抽提物特异性促进CHO-19P2细胞释放花生四烯酸代谢物的活性
用下列方法由大鼠整个脑制备粗肽组分。处死后，立即取出大鼠整个脑，并用液氮冻结，然后在-80℃下存储。将冻结的大鼠整个脑20g(相当于10只大鼠的)仔细分好并80ml蒸馏水煮沸10分钟。将煮过的组织用冰冷却后，在1.0M的终浓度时加入4.7ml乙酸，并用Polytron将混合物混合均匀(20,000rpm，6min.)。匀浆过夜摇动培养，接着便离心(10,000rpm，20min.)分离出上清液。沉淀在40ml 1.0M乙酸中混匀，再次离心以回收上清液。将上清液集中，用3体积丙酮稀释，在冰上放置30分钟，然后离心(10,000rpm，20min.)以回收上清液。蒸发回收的上清液以挥发丙酮。向所形成的无丙酮的浓缩物中加入2体积0.05％三氟乙酸(TFA)/H2O，使此混合物流过反相C18柱(Prep C18 125埃Millipore)。当完成上清液此操作后，以0.05％TFA/H2O洗脱柱，然后以10％，20％，30％，40％，50％，及60％CH3CN/0.05％TFA/H2O进行梯度洗脱。该组分各分成10等分并冻干。将其来源相当于大鼠整个脑的干燥样品溶解在20μL二甲基亚矾(DMSO)中，并悬浮在1ml Hank平衡的盐溶液(HBSS)(其被补充了0.05％牛血清清蛋白(BSA))中从而制备粗肽组分。
将表达全长受体蛋白的CHO细胞和模拟细胞植入24孔的平板中(0.5×105个细胞/孔)，并培养24小时。接着，在终浓度为0.25μCi/孔时加入[3H]花生四烯酸。加入[3H]花生四烯酸16小时后，以0.05％BSA-HBSS冲洗细胞，并加入上述粗肽组分(400μl/孔)。将混合物在37℃培育30分钟，然后将300μl部分反应混合物加入至4ml闪烁器中，用闪烁计数器检测释放至反应混合物中的花生四烯酸代谢物的量。结果，在洗脱物的30％的CH3CN组分中可检测到对CHO细胞(CHO-19P2)表达的全长受体蛋白质特异性的花生四烯酸代谢物释放活性[图16]。
[实施例12]检测牛下丘脑抽提物特异性地促进CHO-19P2细胞释放花生烯酸代谢物的活性
按与实施例11相同的方式从360g(等同于一头动物的脑量)牛脑(包含下丘脑)组织制备粗肽。每0.05个动物的干燥肽样品溶解在40μl的DMSO中，并悬浮在2ml的0.05％BSA-HBSS中，而花生四烯酸代谢物释放活性按在实施例11中相同的方式检测。结果是，从C18柱(粗牛下丘脑肽组分已装入其中)用30％CH3CN洗脱所得的组分中检测到特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞系释放的活性。
[实施例13]从牛下丘脑中通过纯化制备特异性地促进CHO-19P2细胞释放花生四烯酸代谢物的活性(肽)
现在叙述用于制备从牛下丘脑中通过纯化而得到特异性地促进CHO-19P2细胞系释放花生四烯酸代谢物的活性(肽)的典型方法。将冻结的牛脑组织样品(包含下丘脑)4.0千克(相当于80只动物的)放置在8.0L蒸馏水中，煮沸20分钟。在冰上冷却后，终浓度为1.0M时加入540ml乙酸，并用Polytron(10,000rpm，12min.)将混合物混合均匀。匀浆摇动过夜，然后离心(9,500rpm，20min.)并回收上清液。使沉淀物悬浮在4.0L 1.0M乙酸中，然后用Polytron混匀并再次离心回收进一步的上清液。集中上清液，在0.05％终浓度时加入TFA。使混合物流过装入玻璃柱中的反相C18(Prep C18 125埃，160ml；Millipore)。加完后，以320ml 0.05％TFA/H2O洗脱柱，并以10％，30％，50％CH3CN/0.05％TFA/H2O三种梯度进行梯度洗脱。向30％CH3CN/0.05％TFA/H2O组分中加入2L20mM CH3COONH4/H2O，并使混合物流过阳离子交换柱HiPrep CM-琼脂糖FF(Pharmacia)。在以20mM CH3COONH4/10％CH3CN/H2O洗脱后，用100mM，200mM，500mM，1000mMCH3COONH4/10％CH3CN/H2O四种梯度进行梯度洗脱。在200mMCH3COONH4/10％CH3CN/H2O组分中，检测出了CHO-19P2特异性促进花生四烯酸代谢物释放的活性肽。因此用3体积丙酮稀释该组分，离心去蛋白质，然后在蒸发器中浓缩。浓缩的组分中加入TFA(终浓度0.1％)，然后以乙酸调整混合物至pH4，并使3ml该混合物流过反相柱RESOURCERPC(Pharmacia)。以15％-30％浓度梯度的CH3CN进行洗脱。结果在19％-21％CH3CN组分中，检测出了特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞系释放的活性肽。将从RESOURCE RPC洗脱下的活性组分冻干，以DMSO溶解，悬浮在50mM MES pH5.0/10％CH3CN中，并加至1ml阳离子交换柱RESOURCE S中。以0M-0.7M浓度梯度的NaCl洗脱。结果在0.32 M-0.46M NaCl组分中，检测出了特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞系释放的活性肽。将从RESOURCE S洗脱下的活性物冻干，以DMSO溶解，使之悬浮在0.1％TFA/H2O中，并加至反相柱C18 218TP5415(Vydac)中，然后以20％-30％浓度梯度的CH3CN洗脱。结果，在22.5％，23％，23.5％CH3CN这三种组分中，检测出了特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞系释放的活性肽(这三个活性组分分别指定为p-1，P-2，和P-3[图18])。此三个活性组分中，将23.5％CH3CN组分(P-3)冻干，以DMSO溶解，悬浮在0.1％TFA/H2O中，并且加至反相柱联苯219TP5415(Vydac)，然后以22％-25％梯度的CH3CN洗脱。结果，在由23％CH3CN获得的洗脱峰值时回收，则收集到特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞系释放的活性肽[图19]。将来自反相柱联苯219TP5415的峰值活性组分冻干，以DMSO溶解，悬浮在0.1％TFA/H2O中，并加至反相柱μRPC C2/C18 SC2.1/10(Pharmacia)，然后以22％-23.5％梯度的CH3CN洗脱。结果在以23.0％和23.2％CH3CN洗脱的两个峰值中，检测出了特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞系释放的活性肽[图20]。
[实施例14]测定具有特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放活性的肽(由牛下丘脑纯化制备)的氨基酸序列
测定具特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放活性的肽(P-3)(如实施例13由牛下丘脑中通过纯化制备)的氨基酸序列。将来自反相μRPC C2/C18 SC 2.1/10的峰值活性组分冻干，然后以20μL 70％CH3CN溶解，并用肽测序仪(ABI.491)分析氨基酸序列。结果获得由SEQ IDNO：3定义的序列。但是，仅仅分析氨基酸序列不能测定第7和第19位氨基酸。
[实施例15]从牛下丘脑中通过纯化制备特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放的活性物质(肽)
在实施例13中以Vydac C18 218TP5415所获得的三个活性组分中，进一步纯化以23.0％CH3CN洗脱的活性组分(P-2)。将这一活性组分冻干，以DMSO溶解，悬浮在0.1％TFA/dH2O中，并加至反相柱二苯基219TP5415(Vydac)中，然后以21.0％-24.0％梯度的CH3CN洗脱。结果在以21.9％CH3CN洗脱的峰值中，检测出特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放的活性物质。将这一组分冻干，以DMSO溶解，悬浮在0.1％TFA/dH2O中，并加至反相μRPC C2/C18 SC2.1/10(Pharmacia)中，然后以21.5％-23.0％梯度的CH3CN洗脱。结果在以22.0％CH3CN洗脱的峰值中，汇聚了特异性促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放的活性物质[图21]。
[实施例16]测定由牛下丘脑通过纯化而得到的肽的氨基酸序列(该肽为特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放的肽)
测定具有特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细胞释放活性的肽(P-2)(如实施例15由牛下丘脑中通过纯化制备)的氨基酸序列。将来自反相柱μRPC C2/C18 SC 2.1/10的峰值活性组分冻干，然后以20μL 70％CH3CN溶解，并用肽测序仪(ABI.492)分析氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。[实施例17]制备来自牛下丘脑的poly(A)+RNA组分及合成cDNA组分
利用同源基因(Nippon基因)，从相当牛下丘脑的动物脑量制备总RNA。然后，利用Fast Track(Invitrogen)制备Poly(A)+RNA组分。从每1μg该poly(A)+RNA组分中，根据手册利用3′RACE系统(GIBCO BRL)和Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成cDNA，并且将cDNA分别溶解在20和10μL中。
[实施例18]获得编码实施例14中制备的氨基酸序列的cDNA
为了获得编码包含实施例14中制备的氨基酸序列的多肽的cDNA，首先尝试了获得编码SEP ID NO：1的碱基序列。这样，合成了引物P5-1(SEQID NO：35)，P3-1(SEQ ID NO：36)，以及P3-2(SEP ID NO：37)。(在序列表中，I代表肌苷)。用实施例17的3′RACE制备的0.5μlcDNA作为模板及EXTaq(Takara Shuzo公司，日本)作为DNA聚合酶，在终浓度为200nM时分别加入2.5μl伴随缓冲液，200μM伴随dNTP，以及引物P5-1和引物P3-1，最后加水至25μL，94℃加热一分钟之后，将98℃×10秒，50℃×30秒，68℃×10秒的循环重复30次。用tricine-EDTA缓冲液稀释这一反应混合物至1/50，然后以2.5μl稀释液为模板，用P5-1和P3-2为引物，该反应以与上述相同的方法另外进行。用Gene Amp 9600(PerkinElmer)作为热循环仪。将扩增产物进行4％琼脂糖电泳，并进行溴化乙锭染色，切下约70bp的带使之受热融化，酚抽提，然后用乙醇沉淀。根据TA克隆试剂盒(Invitrogen)手册，将回收的DNA亚克隆进质粒载体PCRTMII。然后将载体导入大肠杆菌JM109，使相应的转化体在含氨卡青霉素的LB培养基中培养。根据染色终止子循环测序试剂盒(ABI)手册，使以自动质粒抽提器(Kurabo)获得的质粒反应，并用荧光自动DNA测序仪(ABI)来破译。结果，获得了图22所示的序列，且其被确认为SEQ ID NO：1编码的部分碱基序列。
[实施例19]用实施例18中制备的序列通过RACE获得具生物活性的多肽cDNA
第一，为进行5′末端序列的扩增(5′RACE)，先通过在图22中所显示的序列合成pE(SEQ ID NO：38)和PDN(SEQ ID NO：39)这两个引物。用实施例17中的Marathon cDNA扩增试剂盒制备的cDNA用tricine-EDTA缓冲液稀释100倍。接着，按与实施例2相同的方式，用2.5μl的稀释液制备反应混合物并将引物pE和衔接子引物AP1的相应试剂盒结合，然后在94℃作用1分钟，再经98℃×10秒和68℃×5分钟循环30次。将反应体系用tricine-EDTA缓冲液进一步稀释50倍，并取2.5μl的稀释液作为模板和改变AP1和PDN的引物组合，于94℃进行反应1分钟，接着94℃1分钟、98℃×10秒和72℃×5分钟，循环4次，98℃×10秒和72℃×5分钟，循环4次，98℃×10秒和68℃×5分钟，循环26次。扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳并用溴化乙锭染色，切取所得的约150bp的带，然后用离心过滤管(Millipore)离心过滤，用酚抽提并用乙醇沉淀。根据TA克隆试剂盒(Invitrogen)手册将回收DNA亚克隆到质粒载体PCRTMII中。再将载体导入大肠杆菌JM109并培育所得转化体，同时对所插入的cDNA片段的序列按实施例18所述进行分析。结果是，所得的序列在图23中显示。根据该序列，可合成引物FB(SEQ ID NO：40)和FG(SEQID NO：41)并克隆3′序列(3′RACE)。用与5′RACE等量的相同模板和引物FC与相应的衔接子引物AP1的组合进行PCR反应，在94℃作用1分钟，然后98℃×10秒和72℃×5分钟，循环5次，98℃×10秒和70℃×5分钟，循环5次，98℃×10秒和68℃×5分钟，循环25次。接着，用在tricine-EDTA缓冲液中稀释50倍的2.5μl反应混合物作为模板，和引物FB与相应的引物AP2组合，其进一步反应在94℃作用1分钟，然后在98℃×10秒和72℃×5分钟，循环4次，98℃×10秒和70℃×5分钟，循环4次，98℃×10秒和68℃×5分钟，循环27次。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色，切取所得的约400bp的带，象在5′RACE中那样回收DNA。将该DNA片段亚克隆到质粒载体PCRTMII中后再导入大肠杆菌JM109，并分析在所得的转化体中插入的cDNA片段的序列。从5′RACE和3′RACE的结果建立由SEQ IDNO：1限定的编码生物活性多肽完整编码区的DNA序列[图24]。这样，在图24(a)和(b)中，碱基34是G，碱基184是T或C，碱基245是T或C。
在图24中所示的cDNA是编码含98个氨基酸多肽的cDNA。比较氨基酸在1-22位点含有一簇疏水氨基酸的事实和如在实施例14中所示的活性肽N端区在23-位点以丝氨酸起始的事实可确定1-22氨基酸代表一段分泌信号序列。另一方面，发现在多肽54-57位点中的甘氨酸精氨酸精氨酸精氨酸序列是存在于生物活性肽分裂事件中的典型氨基酸序列基元。在此分裂基元的情况中，由于甘氨酸的存在，可确知产物肽的C-末端经常被酰胺化。
实施例14的P-3 N端序列数据和实施例16的P-2 N端序列数据与该GlyArgArgArg序列结合表明至少从由该cDNA编码的多肽切取的相同生物活性肽是由SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，及SEQ ID NO：10限定的。
[实施例20]通过PCR获得含来源于牛的生物活性多肽cDNA完整编码区的DNA片段
用由在实施例17中的Marathon cDNA扩增试剂盒制备的cDNA作为模板，构建含生物活性多肽cDNA完整编码区的DNA片段。首先，根据在实施例19中阐明的cDNA序列，分别合成两个引物，其具有由SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43定义的碱基序列。BOVF5′-GTGTCGACGAATGAAGGCGGTGGGGGCCTGGC-3′(SEQ ID NO：42)BOVR(24聚体)5′-AGGCTCCCGCTGTTATTCC TGGAC-3′(SEQ ID NO：43)
BOVF含有生物活性多肽cDNA的起始密码子，并且是相当于具添加的限制性内切酶SalI位点的-2-+22(起始密码子ATG的A被计算作为1)的有义序列。另一方面，BOVR是相当于含有生物活性多肽cDNA终止密码子的+285-+309的反义序列。
PCR按以下进行。以tricine-EDTA缓冲液将cDNA稀释100倍，该cDNA如实施例17中利用Marathon cDNA扩增试剂盒而制备，然后用2.5μl稀释液，如在实施例2中的方法制备反应混合物，并且加热94℃×1分钟，98×10秒、72℃×5分钟循环三次，98×10秒、70℃×10分钟循环三次，然后98℃×10秒、68℃×5分钟循环27次。将扩增产物进行2％琼脂糖电泳及溴化乙锭染色，并切取约320bp的带。回收该DNA，并如实施例3将其亚克隆到质粒载体pCRTMII中。将载体导入大肠杆菌JM109以提供转化体大肠杆菌JM109/pBOV3。然后分析插入转化体中cDNA片段的序列。结果，证实该DNA片段是含有生物活性多肽cDNA的全长编码区片段。
[实施例21]合成Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Tbr-pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2(19P2-L31)1)合成Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Ser(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-z)-Ala-Glv-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-树脂
肽合成仪(应用生物系统430A)的反应器装有0.71g(0.5mmole)市售的对-甲基-BHA树脂(应用生物系统，当前Perkin Elmer)。在用DCM润湿后，用HOBt/DCC方法活化初始氨基酸Boc-Phe并引至对-甲基-BHA树脂。用50％TFA/DCM处理树脂以除去Boc，使氨基游离并以DIEA中和。对该氨基用HOBt/DCC方法缩合下一个氨基酸Boc-Arg(Tos)。在用茚三酮检验证实无未反应的氨基功能团后，进行Boc-Gly，Boc-Val，Boc-Pro，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ile，Boc-Gly，Boc-Arg(Tos)，Boc-Gly，Boc-Ala，Boc-Tyr(Br-Z)。Boc-Ala，Boc-Tyr(Br-Z)的顺序缩合。用茚三酮检验发现Boc-Ala，Boc-Tyr(Br-Z)的缩合反应不完全，使其重新缩合以完成反应。干燥树脂并撤去一半树脂。其余部分，连续地缩合及重新缩合Boc-Trp(CHO)，Boc-Ala，Boc-Pro，Boc-Asn，Boc-Ile，Boc-Asp(OcHex)，Boc-Pro，Boc-Thr(Bzl)，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ile，Boc-Glu(OcHex)，Boc-Met，Boc-Ser(Bzl)，Boc-His(Bom)，Boc-Gln，Boc-His(Bom)，Boc-Ala，Boc-Arg(Tos)，Boc-Ser(Bzl)直到通过茚三酮检验确认反应完全。在引入19P2-L31整个氨基酸序列之后，用50％TFA/DCM处理树脂以除去树脂上的Boc基，然后干燥，产生1.28g树脂肽。2)合成Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2(19P2-L31)
在特氟隆氢氟化物反应器中，1)中所获得的树脂与3.8g p-甲酚，1ml1，4-二硫丁酮，10ml氢氟化物在0℃反应60分钟。在减压下蒸发掉氢氟化物和二硫丁酮，用100ml二乙氨醚稀释残余物，摇动，通过玻璃滤器过滤，干燥滤膜上组分。该组分悬浮在50ml 50％醋酸/H2O中，并摇动以抽提肽。在树脂分离后，在减压下收集抽提物约5ml，进行葡聚糖凝胶G-25(2×90cm)层析。用50％醋酸/H2O进行研制，收集114ml-181ml组分并冻干以回收290mg含有19P2-L31的白粉。将该粉经反相柱LiChroprepRP-18(Merck)纯化，并进行0.1％TFA/H2O和含1％TFA的30％丙酮腈/H2O的梯度洗脱再次纯化。收集用约25％乙腈洗脱的组分，冻干，产生71mg白粉。
质谱(M+H)+3574.645
HPLC洗脱时间  18.2分钟
柱条件
柱：    Wakosil 5C18(4.6×100mm)
洗脱液：A(0.1％TFA/H2O)
        B(含0.1％TFA的50％乙腈/H2O)
        从A到B的线型梯度洗脱(25min.)
流速：  1.0ml/min.
[实施例22]合成Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met(O)-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2(19P2-L31(O))
在20ml 5％醋酸/H2O中溶解6mg合成的19P2-L31，并仅用40μl 30％H2O2有选择地氧化Met。在反应完成后，将反应混合物经反相柱LiChroprep RP-1S(Merck)纯化，产生5.8mg目标肽。
质谱(M+H)+3590.531
HPLC洗脱时间  17.9分钟
柱条件
  柱：    Wakosil 5C18(4.6×100mm)
  洗脱液：A(0.1％TFA/H2O)
          B(含0.1％TFA的50％乙腈/H2O)
          从A到B的线型梯度洗脱(25min.)
  流速：  1.0ml/min.
[实施例23]合成Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2(19P2-L20)
对实施例21-1)中对Boc-Tyr(Br-Z)进行缩合的树脂，以相同的方式进行进一步连续缩合Boc-Trp(CHO)，Boc-Ala，Boc-Pro，Boc-Asn，Boc-Ile，Boc-Asp(OcHex)，Boc-Pro，Boc-Thr(Bzl)以提供1.14g Boc-Thr(Bzl)-pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-树脂。以与实施例21-2)相同的方式用氢氟化物处理这一树脂及用柱纯化产生60mg白色粉。
质谱(M+H)+   2242.149
HPLC洗脱时间  10.4分钟
柱条件
  柱：    Wakosil 5C18(4.6×100mm)
  洗脱液：A(含0.1％TFA的15％乙腈/H2O)
          B(含0.1％TFA的45％乙腈/H2O)
          从A到B的线型梯度洗脱(25min.)
  流速：  1.0ml/min.
[实施例24]合成肽(19P2-L31)花生四烯酸代谢物释放活性的检测
在实施例21中合成的肽(19P2-L31)特异性地促进花生四烯酸代谢物从
CHO-19P2细胞释放的活性以与实施例11相同的方式鉴定。将合成肽溶
解在脱气蒸馏水中至浓度为10-3M，并用0.05％的BSA-HBSS稀释，再用
[3H]花生四烯酸代谢物的量作为指示剂，鉴定在各种浓度下促进花生四烯
酸代谢物从CHO-19P2细胞释放的活性。结果是，在10-12M和10-6M的
范围内发现浓度依赖性花生四烯酸代谢物释放活性[图25]。将花生四烯酸
代谢物的释放活性肽19P2-L31(O)(如在实施例22中  合成的19P2-L31产
物)与19P2-L31相比较，发现19P2-L31(O)的活性等同于19P2-L31的活
性，这可以从图26看出。
[实施例25]检测合成肽(19PZ-L20)的花生四烯酸代谢物释放活性
如在实施例23中合成的天然肽P-2的合成等量物(lgp2-L20)特异性地
促进CHO-19P2细胞释放花生四烯酸代谢物的活性按实施例11的方法进
行测定。这样，将合成肽溶解在脱气蒸馏水中至终浓度为10-3M，并用0.05
％的BAS-HBSS连续稀释该溶液。用[3H]花生四烯酸代谢物的量作为指
示剂，鉴定在各种浓度下特异性地促进花生四烯酸代谢物从CHO-19P2细
胞释放的活性。
结果是，在10-12M和10-6M的范围内检测到浓度依赖性花生四烯酸
代谢物释放活性，其几乎与19P2-L31[图27]的程度相同。
[实施例26]牛基因组DNA编码区碱基序列的分析
用限制性内切酶EcoRI水解pBOV3，经凝胶电泳分级分离后，回收
相应于cDNA片段的DNA以制备探针。通过multiprime DNA标记试剂
盒(Amersham)用32P标记该DNA。将用克隆载体EMBL3 SP6/T7和大
肠杆菌K802(作为宿主)构建的牛基因组文库(Clontech BL1015j)的2.0×106个噬菌体接种到LB琼脂平板，并培育过夜以形成噬斑。将噬斑转移到硝化纤维素滤膜上，经碱性修饰及中和后加热(80℃，2小时)灭活DNA。将该滤膜与标记探针在50％的甲酰胺-杂交缓冲液(50％甲酰胺，5×Denhardt溶液，4×SSPE，0.1mg/ml的热变性鲑精DNA，0.1％SDS)中42℃一起温育过夜以进行杂交。经此杂交后，用2×SSC，0.1％SDS在室温洗脱滤膜1.5小时，并在55℃用相同缓冲液中进一步洗脱30分钟。用在-80℃的致敏筛选暴露4天后，在柯达X-射线胶卷(X-OMATTMAR)进行与探针杂交的克隆。胶卷冲出后，将其与平板位置比较并回收已杂交的噬菌体。接着，以相同的方式重复铺板和杂交以克隆噬菌体。
用平板裂解物法大规模制备克隆的噬菌体，并提取噬菌体DNA。接着，在限制性内切酶SalI与BamHI的酶切位点酶切载体克隆位点的两末端，并通过凝胶电泳检测来源于牛基因组DNA的插入片段[图28]。结果是，在BamHI酶切的情况下，检测到除噬菌体带外的3个片段。在SalI酶切的情况下，检测到一条重复噬菌体带的带。SalI的酶切片段被认为为全长，为了将其亚克隆到质粒载体中，用BAP(来源于大肠杆菌的碱性磷酸酶)处理的质粒载体pUC18(Pharmacia)连接并导入大肠杆菌JM109。以生产规模，由该微生物制备插入了基因组来源的SalI片段的质粒DNA，其编码区附近的碱基序列用Perkin Elmer应用生物系统370A荧光测序仪和相同制造商的试剂盒进行分析。结果是，获得在图29中所示的序列。由于其来源于基因组DNA，与cDNA的编码区比较表明该编码区被一个472bp的内含子分为两个[图30]。图31和SEQ ID NO：44代表从这一牛基因组编码区预测的氨基酸序列(排除内含子区)。
[实施例27]制备大鼠延髓poly(A+)RNA组分和合成cDNA
利用Isogen(日本基因)制备poly(A+)RNA组分，用FastTrack(Invitrogen)从大鼠延髓脊部区制备完整RNA。每5μg的poly(A+)RNA中加入引物随机DNA六聚体(BRL)并用Moloney小鼠白血病逆转录酶(BRL)及其相应的缓冲液，合成互补DNA。用乙醇沉淀反应产物，再溶解到12μl的DW中。此外，用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)根据手册从1μg的该poly(A+)RNA合成cDNA，并将其溶解在10μl的DW中。
[实施例28]通过RACE获得大鼠生物活性多肽cDNA
为了获得大鼠生物活性多肽cDNA的完整编码区，用与获得牛cDNA的相同的方式进行实验。首先，用与实施例18相同的引物P5-1(SEQ ID NO：35)和P3-1(SEQ ID NO：36)作为引物，并以用引物随机DNA六聚体(BRL)和Moloney小鼠白血病逆转录酶(BRL)按实施例27合成的互补DNA作为模板，进行PCR。反应体系由1.25μl模板cDNA，200μM的dNTP，1μM的每一引物，作为DNA聚合酶的ExTaq(Takara Shtzo公司，日本)，以及2.5μl的相应缓冲液组成，用水补足使总量为25μl。反应进行条件是94℃1分钟，接着98℃×10秒，50℃×30秒及72℃×5秒，循环40次，而且将反应混合物在72℃静置20秒。所用的热循环仪是GeneAmp2400(Perkin Elmer)。将扩增产物于4％琼脂糖中进行电泳，并用溴化乙锭染色后，切取约为80bp的带。接着，按实施例19描述的方式回收DNA，将其亚克隆到质粒载体pCRTMII中，并导入大肠杆菌JM109，再对所插入的cDNA片段进行测序。结果是，获得大鼠生物活性多肽的部分序列。根据该序列，合成两个引物，命名为RA(SEQ ID NO：75)(为3′RACE制备)和RC(SEQ ID NO：76)(为5′RACE制备)，并进行3′RACE和5′RACE。
RA：5′-CARCAYTCCATGGAGACAAGAACCCC-3′
(此处R代表A或G；Y代表T或G)(SEQ ID NO：75)RC：5′-TACCAGGCAGGATTGATACAGGGG-3′(SEQ ID NO：76)
将用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontecb)按实施例27合成的模板用相应的tricine-EDTA缓冲液稀释40倍，取2.5μl作为模板。RA和衔接子AP1相应试剂盒作为3′RACE引物，而RC和AP1作为5′RACE引物。按上述相同方式制备反应混合物。反应条件是94℃1分钟，98℃×10秒，72℃×45秒，循环3次，98℃×10秒，70℃×45秒，循环3次，98℃×10秒，68℃×45秒，循环40次。结果是，从3′RACE获得约400bp的带及从5′RACE获得约400bp和250bp的带。以与上述相同的方式回收这些带并将其用作进行反应的模板和引物，用染色终止子循环测序试剂盒(ABI)进行测序。结果是，从被认为是5′非编码区的区域可获得至poly(A)的序列。
[实施例29]通过PCR获得大鼠生物活性多肽的全长cDNA
根据实施例28中获得的序列，合成两引物，即rF(其为含有起始密码子的引物(SEQ ID NO：77))与rR(其为从终止密码子开始的3′端的引物(SEQID NO：78))，以便扩增含有全长cDNA的片段。
rF：5′-GGCATCATCCAGGAAGACG GAGCAT-3’(SEQ ID NO：77)
rR：5′-AGCAGAGGAGAGGGAGGGT AGAGGA-3’(SEQ ID NO：78)
将实施例27中用Moloney小鼠白血病逆转录酶制备的cDNA作为模板并运用ExTaq(Takara Shuzo公司，日本)，重复循环95℃×30秒，68℃×60秒40次进行PCR。将该扩增产物进行琼脂糖电泳及溴化乙锭染色，然后取约350bp的带。如实施例19中，回收此DNA，亚克隆到质粒载体pCRTMII，然后导入大肠杆菌JM109。从转化体中提取质粒，并检测碱基序列。结果，获得具有大鼠生物活性多肽的全长cDNA的大肠杆菌JM 109/pRAV3[图32]。
[实施例30]合成来自人整个脑的poly(A+)RNA组分的cDNA
从1μg人整个脑的中，根据手册用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成cDNA，并溶解在10μl中。此外，向5μg相同的poly(A+)RNA组分中加入随机DNA六聚体(BRL)作为引物，并利用Moloney小鼠白血病逆转录酶(BRL)和伴随的缓冲液，合成互补DNA。用乙醇沉淀反应产物，然后溶解在30μl TE中。
[实施例31]通过RACE获得人生物活性多肽的cDNA
从实施例28构建的大鼠生物活性多肽的氨基酸序列[图33]中，选择保存很好的大鼠和牛多肽区域，并合成下列3个引物：R1(SEQ ID NO：79)，R3(SEQ ID NO：80)，R4(SEQ ID NO：81)。然后，利用人cDNA作为模板由PCR扩增它们两侧的区域。参考图33，牛.aa表示牛多肽的氨基酸序列，牛.seq表示编码牛多肽的DNA碱基序列，大鼠.seq表示编码大鼠多肽的DNA碱基序列。
R1：5′-ACGTGGCTTCTGTGCTTGCTGC-3’(SEQ ID NO：79)
R3：5′-GCCTGATCCCGCGGCCCGTGTACCA-3’(SEQ ID NO：80)
R4：5′-TTGCCCTTCTCCTGCCGAAGCGGCCC-3’(SEQ ID NO：81)
以tricine-EDTA缓冲液将实施例30中利用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)制备的cDNA稀释30倍，用0.25μl该稀释液作为模板。反应混合物组成是：200μM dNTP，各0.2μM R1和R4引物，Taq起始抗体(Clontech)与DNA聚合酶ExTaq(Takara Shuzo公司，日本)50:50的混合物，0.25μl伴随缓冲液，以及使总量为25μl的足够量的水。反应条件是94℃×1分钟，接下来98℃×10秒，68℃×40秒，循环42次，然后72℃放置1分钟。接着，利用1μl的在tricine-EDTA缓冲液中的上述反应混合物的100倍稀释液作为模板，制备相同的反应混合物，除了引物组合改为R1与R3，按94℃×1分钟与循环98℃×10秒，68℃×40秒重复25次的顺序进行PCR。将扩增产物进行4％琼脂糖电泳和溴化乙锭染色。结果，获得预计的约130bp的带。该带以与实施例28相同的方式回收，并用所回收的片段作为模板，以染色终止子循环测序试剂盒(ABI)进行测序。结果，获得人生物活性多肽的部分序列。因此，根据该序列，合成3′RACE的引物HA(SEQ ID NO：82)和HB(SEQ ID NO：83)及合成5′RACE的引物HE(SEQ ID NO：84)和HF(SEQ ID NO：85)，则进行3′与5′RACE。
HA：5′-GGCGGGGGCTGCAAGTCGTACCCATCG-3′(SEQ IDNO：82)
HB：5′-CGGCACTCCATGGAGATCCGCACCCCT-3′(SEQ IDNO：83)
HE：5′-CAGGCAGGATTGATGTCAGGGGTGCGG-3′(SEQID NO：84)
HF：5′-CATGGAGTGCCGATGGGTACGACTTGC-3′(SEQ IDNO：85)
以在tricine-EDTA缓冲液中在实施例30中制备的cDNA的20倍稀释液作为模板。对于初始PCR，以上述相同的方式制备反应混合物，除了以HA和衔接引物AP1用于3′RACE及HF和AP1用于5′RACE外。反应顺序是94℃×1分钟，循环98℃×10秒，72℃×35秒5次，循环98℃×10秒，70℃×35秒5次，循环98℃×10秒，68℃×35秒40次。然后，利用1μl的在tricine-EDTA缓冲液中的该反应混合物的100倍稀释液作为模板，与第一PCR相同的循环进行第二步PCR。但是，以引物HB和AP1用于3′RACE或引物HF和AP2用于5′RACE，以KlenTaq(Clontech)作为DNA聚合酶及伴随缓冲液，来制备反应混合物。结果，从3′RACE获得约250bp的带，从5′-RACE获得约150bp带。将这些带用上述相同的方法，并利用它们与以前获得的部分序列相结合进行测序，从推定为人生物活性多肽的polyA的5′非编码区的区域中获得该序列。
[实施例32]通过PCR获得人生物活性多肽全长cDNA
根据在实施例31中获得序列，合成两引物5H(SEQ ID NO：86)和3HN(SEQ ID NO：87)，用于扩增含有全长cDNA的片段。
5H：5′-GGCCTCCTCGGAGGAGCCAAGGGATGA-3′(SEQ IDNO：86)
3HN：5′-GGGAAAGGAGCCCGAAGGAGAGGAGAG-3′(SEQ IDNO：87)
利用2.5μl实施例30中利用Moloney小鼠白血病逆转录酶(BRL)制备的cDNA作为模板，及用Klen Taq DNA聚合酶(Clontech)制备反应混合物，按94℃×1分钟，循环98℃×10秒，68℃×30秒40次的顺序进行PCR反应。回收所获得的约360bp的片段，以与实施例29相同的方式亚克隆(以pCRTM2.1作为载体)。回收该质粒，并检测碱基序列。结果，获得含有人生物活性多肽全长cDNA的大肠杆菌JM109/pHOV7[图343]。关于翻译区的氨基酸序列，将该人类生物活性多肽和实施例20中所显示的牛多肽或实施例29中的大鼠多肽之间进行比较[图35]。
[实施例33]
从大鼠下丘脑交叉上核克隆孤独G-蛋白偶联受体UHR-1，并且已报导了它的核苷酸顺序(生化和生物物理学研究通信，vol.209，No.2，pp606-613，1995.，Genbank入藏号：S77867)。由UHR-1编码的蛋白质显示出与由hGR编码的蛋白质391.6％超过359个氨基酸的相同性，因而人们认为UHR-1是hGR3的相似物。为确认这点，如下述，我们克隆了UHR-1编码区的cDNA，并且构建了稳定表达UHR-1的CHO细胞。利用FastTrackTM试剂盒(Invitrogen公司)从大鼠垂体前叶制备Poly(A)+RNA)，并用Takara RNA PCR试剂盒(Takara)从0.2μg该物质合成cDNA。将cDNA溶解在10μl蒸馏水中，并为下列PCR作模板。为了分离UHR-1 cDNA，根据提交到Genbank(入藏号：577867)的UHR-1序列，合成下面两个引物，即5′-GTTCACAG(GTCGAC)ATGACCTCAC-3′[SEQ ID NO：95](UHF)，和5′-CTCAGA(GCTAGC)AGAGTGTCATCAG-3′[SEQ ID NO：96](UHR)。在这些引物中，GTCGAC和GCTAGC分别表示SalI与NheI位点。将ExTaq(Takara)与相等量的Taq起始抗体(Clontech实验室，Inc.)混合以阻止非特定产物和引物二聚体的扩增。通过加入5μl与Ex Taq相应的缓冲液，4μl dNTPs，1μl Ex Taq与Taq起始抗体的混合液，以及每50μM的引物各1μl，从而制备反应混合物。用蒸馏水稀释cDNA到1/15，并在反应混合物中加入等分试样(5μl)。PCR条件如下：95℃变性2分钟，接着95℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟，循环27次，循环后于72℃放置7分钟。
以1.2％琼脂糖凝胶分离PCR产物，并用溴化乙锭染色。用剃刀片将含有约1.1kbp带的琼脂糖凝胶片段切取下来，并用Ultra Free滤器(微孔)过滤。洗脱液以酚：三氯甲烷提取，然后用乙醇沉淀。用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)将扩增的DNA亚克隆到pCRTMII中，并导入大肠杆菌JM109感受态细胞。转化体用含氨苄青霉素，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，和X-gal(5-溴代-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的培养基进行选择。在含氨苄青霉素的LB培养基中培养克隆个体，并用自动质粒提取仪(Kurabo)处理克隆个体以分别制备质粒脱氧核糖核酸。用ABI棱柱染色终止子循环测序试剂盒FS(Perkin-Elmer)及ABI自动测序仪进行测序。在图52中，画线部分表明与引物序列部分对应的序列。双画线的碱基表示与已报导的序列数据相比较的替换碱基，一种此取代伴随从289Leu(CTC)到289Val(GTC)氨基酸的替换。这样构建了含有UHR-1 cDNA片段的质粒pCRII-UHR-1。
如下制备UHR-1 cDNA表达质粒。首先，用NheI和SalI酶解pCRII-UHR-1。以1.2％琼脂糖凝胶通过电泳分离约1.1kbp的反应产生的片段，并如上述将其沉淀。然后用连接系统(Takara)，将该DNA片段连接到pAKKO-111H的NheI-SalI位点处。将所形成的表达质粒pAKKO-UHR-1导入大肠杆菌JM109。
在含有10％胎牛血清的α-MEM培养基的直径10cm的有盖培养皿中，以细胞数量为1×106的密度，37℃下培育CHO dhfr-细胞24小时。利用Gene transfer(Nippon Gene)通过脂质体方法将表达质粒(20μg)导入细胞。导入操作24小时后，换新鲜培养基。额外培育24小时后，将培养基改为选择培养基，即含10％的透析胎牛血清的无核苷α-MEM。一直培养直到获得在选择培养基上生长的细胞。这样建立高度表达UHR-1的CHO-UHR-1。
[实施例34]19P2-L31的放射性碘化和受体结合实验
19P2-L31用[125I]-Bolton-Hunter试剂(NEN.Dupont；NEX-120)按如下所述碘化。两百微升[125I]-Bolton-Hunter试剂用氮气在500μl离心管中干燥。干燥试剂用2μl乙腈溶解，接着与4ml的50mM磷酸缓冲液(pH8.0)和4μl的3×10-4M19P2-L31混合。混合物在室温培育40分钟，再加入5μl的1.0M甘氨酸终止反应。所有反应混合物用300μl的18％乙腈稀释，并注射到反相HPLC柱TSK凝胶ODS-80TM(4，6×100mm；TOSO)上。该碘化的19P2-L31以每分钟1ml的流速用在0.1％三氟乙酸中18至32.4％乙腈浓度的线型梯度洗脱。收集碘化的19P2-L31的峰组分并用两倍体积的50mM Tris-HCl(pH7.5)(含有0.1％BSA和0.05％CHAPS的量)稀释，然后在-20℃储存。
受体结合实验用[125]-19P2-L31按如下所述完成。作为受体表达细胞的CHO-19P2-9CHO和CHO-19P2的单克隆CHO-UHR-1用于该实验。CHO-19P2-9细胞是用96-孔微型板作为克隆通过超稀释技术从CHO-19P2细胞中选出的(其表明19P2-L31更强的花生四烯酸代谢物释放促进反应)。模拟CHO细胞是作为对照，其仅由表达载体pAKKO转化。在培养瓶中培养的这些细胞(为培养组织)用5mM EDTA/PBS收获，并重新悬浮(以每毫升0.5×107个细胞)在含0.05％BSA和0.05％CHAPS的HBSS中。总体积为100μl的细胞悬液在室温用200pM[125I]-19P2-L31培育2.5小时。反应混合物用2ml预冷缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5含5mM乙二胺四乙酸，0.05％BSA，和0.05％CHAPS)稀释，并立即经玻璃过滤器GF/F(Whattman)过滤，该过滤器用含0.3％聚乙烯亚胺的缓冲液预湿。该玻璃过滤器可以进行γ-记数。非特异性结合在200nM非标记19P2-L31存在下测定。
[图36]显示用[125I]-19P2-L31在活细胞上的受体结合实验。
[125I]-19P2-L31的特异性结合分别用表达hGR3和大鼠同源UHR-1的CHO细胞上检测。实验在三份中完成。这些结果表明由hGR3和UHR-1编码的蛋白质可作为19P2-L31的特异性受体起作用。
[实施例35]通过19P2-L31从CHO-19P2-9和CHO-UHR1中释放花生四烯酸代谢物
如在实施例11中所描述的，测量在CHO-19P2-9、CHO-UHR1和模拟CHO中花生四烯酸代谢物的释放活性。
[图37]显示，19P2-L31对CHO-19P2-9和CHO-UHR1的花生四烯酸代谢物释放活性。
在表达大鼠同族UHR1的CHO细胞中，如同CHO-19P2-9来检测花生四烯酸代谢物的释放活性。实验操作完全相同。这些结果表明，由UHR-1编码的此蛋白质与hGR3一样其功能是特异性受体。
[实施例36]通过RT-PCR定量测定大鼠19P2配体和大鼠UHR-1mRNA，BBRC，209，606-613，1995)
(1)从大鼠组织制备poly(A)+RNA和合成cDNA。
从大鼠的某种组织中(Wister品系，雄性，8周大)，通过与同源基因(Nippon基因)进行匀浆接着进行寡(dT)-纤维素层析(Pharmacia)，分离出poly(A)+RNA。利用脱氧核糖核酸酶I(扩增等级，GibcoBRL)处理1μgpoly(A)+RNA，以除去基因组DNA的污染。在65℃加入25mM乙二胺四乙酸溶液使脱氧核糖核酸酶I失活。然后，在40μl的反应混合物(该反应混合物含有10mM Tris-HCl(pH8.3)，2.5mM随机六聚体(Takara)，0.4mM每种dNTP，10U AMV逆转录酶XL(Takara))中，使RNA(160毫微克)进行逆转录。将该样品在30℃培育10分钟，接着42℃一小时，然后99℃5分钟以停止反应。用乙醇沉淀来纯化反应混合物，然后用tricine-EDTA缓冲液稀释该cDNA至40μl(对应于4毫微克poly(A)+RNA/μl)。
(2)构建阳性对照质粒载体
借助于RT-PCR，从大鼠垂体肿瘤细胞系中分离大鼠脱氢甘油-3-磷酸-脱氢酶(G3PDH)和大鼠UHR-1 cDNA。由FastTrack(Invitrogen)制备GH3的Poly(A)+RNA，并如实施例36(1)合成cDNA。用于扩增的寡核苷酸引物如下：大鼠G3PDH扩增引物组(Clontech)，rRECF(5′-CCTGCTGGCCATTCTCCTG TCTTAC-3′)(SEQ ID NO：88)和rRECR(5′-GGGTCCAGGTCCCGCAGAA GGTTGA-3′)(SEQ ID NO：89)(UHR-1的)。用TA克隆试剂盒(Invitrogen)亚克隆从GH3扩增大的片段。将重组体载体导入大肠杆菌JMl09。将转化体克隆在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，以Quiagen质粒Midi试剂盒(Quiagen)制备该质粒DNA。从保藏的大肠杆菌JM109/pRAV3中制备大鼠配体多肽的质粒。
(3)定量测定RT-PCR
用蒸馏水稀释上述(1)和(2)所制备cDNA和质粒DNA至足够浓度，并用作为定量RT-PCR的模板。利用人G3PDH扩增引物(Clontech)，rRECF和rRECR，以及r19F(5′-GAAGACGGAGCATGGCCCTGAAGAC-3′)(SEQ ID NO：91)和r19R(5′-GGCAGCTGAGTTGGCCAAGTCCAGT-3′)(SEQ ID NO：91)，分别扩增G3PDH，UHR-1，以及配体多肽cDNA片段。每一反应样品含有100μM dNTP混合物，各200nM的每一引物，4μl模板DNA，0.25μl50x KlenTaq DNA聚合酶混合物(Clontech)，和2.5μl对应于KenTaq DNA聚合酶混合物的缓冲液，最后体积为25μl。G3PDH的PCR条件如下：94℃变性1分钟，接着98℃10秒，65℃20秒，72℃40秒，循环26次。UHR-1和配体多肽的PCR条件如下：94℃变性1分钟，接着98℃10秒，68℃25秒，循环34次。将份量为5μl的每种RT-PCR产物，以4％Nusieve 3:1琼脂糖凝胶(F.M.C.)电泳来分离，并进行溴化乙锭染色。利用光密度测定法(现代美国生物技术)对该带进行定量测定。
图38和39分别显示，在组织中测量UHR-1和配体多肽信使核糖核酸的表达水平的结果。在所有检验的组织中，检测UHR-1和配体多肽信使核糖核酸。在垂体中检测出UHR-1 mRNA得到高水平的表达，在人脑中得到中等水平的表达，然而在除肾上腺外的外周组织中表达很差。配体多肽信使核糖核酸主要在人脑的下丘脑和延髓中表达，并且在肺脏，胸腺，胰腺，肾，肾上腺腺，以及睾丸中得到比较高水平的表达。这些结果表明，各种组织中的UHR-1与配体多肽，在调节功能中充当重要的角色。
[实施例37]在血浆胰岛素浓度下19P2-L31对诱导葡萄糖增加的影响
通过皮下注射戊巴比妥(65mg/kg)，麻醉雄性Wistar大鼠(8-10w)。通过大剂量注射，在颈静脉中引入葡萄糖(86mg/大鼠)或者葡萄糖和19P2-L31(675pmol，2.25nmol，6.75nmol和67.5nmol/大鼠)。从对侧静脉回收血液样品。以放射免疫测定试剂盒(Amersham)检测血浆胰岛素浓度。
注入675pmol，2.25nmol，和6.75nmol剂量的19P2-L31，则在血浆胰岛素浓度下，注射2分钟后部分阻止诱导葡萄糖的急剧增加(第一阶段)，注射6分钟后部分阻止其缓慢增加(第二阶段)。在剂量为67.5nmol时，它在胰岛素浓度下完全阻止第一和第二阶段的增加[图40]。
[实施例38]配体多肽对小鼠运动性的效应
研究向鼠侧脑室施用19P1-L31对运动性的影响。将成熟ICR雄性小鼠(操作时的重量：约35g)固定在立体定位器上面，在腹膜内注射50mg/kg的戊巴比妥，使之麻醉。暴露出上述小鼠的头骨，然后用带齿钻孔机钻个洞以便导管进入左侧脑室。将用于药物注射到左侧脑室的不锈钢导管的尖端插入AP：+0.6mm(从前卤点开始)，L：左侧1mm和H：-1mm(从硬膜物质开始)的位置。以粘合剂将导管固定在头骨上。将用导管灌输的小鼠如以上描述的予以饲养，并在此操作至少3天后进行行为分析。
让每只小鼠在一个有照明(光照：  6-18点钟)的，隔音的，透明的丙烯酸笼子(24×37)内，测量运动性(诸如自发运动性和用后腿站立)。自来水和实验室中国狗是有效的随意食水动物饲养。借助于Supermex(Muromachi Kikai)测量运动性。在下午2:30±30钟注入药物和PBS。注入时，将不锈钢微注射小管(30G，长度：6mm)插入到导管中。微注射小管用特氟隆管子与微型微量注射器泵连接，以2μl/min的速度注射PBS或溶解PBS中的肽持续2分钟。在注射结束的2分多钟后，撤掉微注射小管，然后测量运动性。
结果以平均±S.E.M表示。研究者用t检验来检测从用肽处理的小鼠与注射PBS对照小鼠所得的数据之间的差异显著性。对于该分析目的，假定P＜0.05为最小限度的显著水平。
如[图41]所显示的，施用10nmol 19P2-L31，在注射70-105分钟后引起了自发运动性的显著增加。用后腿站立行为也显示出显著差异。当施用1nmol的19P2-L31没有造成自发运动性统计上的显著变化时，用后腿站立行为在注射的仅仅105分钟后显示显著的减弱[图42]。施用0.1nmol19P2-L31，在注射后的25分钟，40分钟和70分钟造成显著增加。在那种情况下，用后腿站立行为显示出与自发运动性同样地增加趋势，然而不具统计上的显著性[图43]。施用0.01nmol 19P2-L31，在注射的20分钟，和40分钟后造成显著增加。在那种情况下，用后腿站立行为显示与自发运动性同样地增加趋势，然而不具统计上的显著性[图44]。
[实施例39]配体多肽在小鼠中对利血平诱导的降温的影响
成熟ICR雄性小鼠(操作重量：约35g)施用戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，固定在立体定位器上。暴露所述的该小鼠头骨，接着，用牙齿打孔器在其上钻孔以便造管术引导至左侧心室。将不锈钢引导套管(24G，长度：5mm)的尖端(用于向侧心室注射药物)插入到AP位置：+0.6mm(自前囟点)，L：左1mm和H：-1mm(自硬膜物质)。引导套管用粘合剂固定在头骨上。固定套管的小鼠按前述予以安置，并在手术至少3天后用作体温测量。利血平(Apoplon；Daiichi Pharmaceutical)按3mg/kg，s.c.的剂量配给小鼠，并在15小时后，将每只小鼠放入笼中进行测量。接着将不锈钢微注射小管(30G，长度：6mm)插入到引导套管中。用特氟隆管子连接微注射小管与微量注射器泵，并以每分钟1μl的速度持续2分钟向其注射PBS或溶解在PBS中的肽。注射结束后过2分钟去除微注射小管，接着测量在直肠中的温度。
用+S.E.M.平均值表示结果。研究者用t检验来确定用肽处理的小鼠和用注射PBS处理的对照组之间值的差异显著性。根据该分析的目的，假定P＜0.05为显著水平的最低限。
如在[图45]中显示的，在注射10nmol的19P2-L31后，已用利血平降低的体温显著增加(与注射PBS的对照组相比较)。在施用肽后45分钟体温增加达到最大值。另一方面，在实验期间，注射1nmol的19P2-L31组与注射PBS的对照之间没有任何统计学的显著性差异。
[实施例40]配体多肽在大鼠中对血压的影响
发明者探讨了注射19P2-L31到延髓鳃后区对血压的影响。成年雄性Wistar大鼠(操作体重：约300g)用50mg/kg i.p的戊巴比妥麻醉，并将每只动物在大鼠脑立体定位器上固定。门齿棒从耳间线降低至3.3mm。暴露头骨，并用牙齿打孔器在头骨上打孔以植入引导小管。此外，在钻孔周围的两个位置中埋入锚螺丝。以如下方式插入不锈钢引导小管，AG-12(内部直经0.4mm，外部直径0.5mm，EICOM)，它的引导末端位于鳃后区的上面一部分中。为此目的，引导小管从前方以20°的角度垂直插入(图46；然而，注意图片显示的微注射小管比该引导小管长1.0mm)。 参考Paxinos和Watson(1986)的图谱，立体定位坐标是AP：-6.0mm(自耳间线)，L：0.0mM和H：+1.5mm(自耳间线)。导管用即时粘合剂，牙齿粘合剂以及锚件在头骨得到保护。将不锈钢仿制小管，AD-12(外经0.35mm，EICOM)插入到导管中，并用螺母在原位固定住(EICOM)。然后，将大鼠在单独的笼中喂养。
植入导管经喂养术后复原一周，进行另一个手术在鼠清醒状态下测量血压。上述大鼠用50mg/kg i.p的戊巴比妥麻醉，并在剖尸垫上固定脊骨部位，暴露左股动脉。将聚乙烯管，SP35(内经0.5mm，外经0.9mm，Natsume Seisakusho)切成约60cm长，并用200U/ml含肝磷脂的盐水充满。将该管插入股动脉约2.5cm深处，并在原位固定。该管的自由末端从背部皮肤下穿过，并暴露在颈部区(背侧面)。
术后过夜，将聚乙烯管与转导物(Spectramed)连接，并测量血压。在血压读数稳定后，从大鼠头骨移去螺母和仿制管；并插入不锈钢微注射管(内经0.17mm，外经0.35mm，EICOM)代替，该注射管与特氟隆管子(50cm长内经0.1mm，外经0.4mm，EICDM)连接。预先调节微注射管的长度以便其尖端可从导管延伸1mm(图46)。特氟隆管的一端与微量注射器泵连接，并向postrema区注射PBS或溶解在PBS中的19P2-L31，注射总量为2μl。
血压测量后，拆除注射19P2-L31的微注射管并用另一个注射染色液(Evans Blue)的微注射管替代。如注射19P2-L31一样的以每分钟1.0μl的相同流速灌输约2分钟。过约3分钟后，去除微注射管。将大鼠去头，迅速将脑移出并冰冻。将脑是在恒冷箱上切连续的额切面，并确认灌入的染色位置。
上述实验的结果表明进入延髓鳃后区的10nmol的19P2-L31导致血压的上升。直接和平均血压的典型实例在图47中显示。
[实施例41]配体多肽对血浆垂体激素水平的影响
发明人探讨了在第三脑室施用19P2-L31对血浆中垂体激素水平的影响。成年雄性Wistar大鼠(手术体重：290-350g)用50mg/kg i.p.的戊巴比妥麻醉，每只大鼠在脑立体定位器上固定。将门齿棒放置在低于耳间线的3.3mm处。暴露头骨，并用牙齿打孔器在其上转孔以植入导管。此外，在转孔周围的一个位置埋入锚定螺丝。将不锈钢导管，AG-12(内经0.4mm，外经0.5mm，EICOM)以如下方式插入，即其尖端位于第三脑室的上部。参考Paxinos和Watson(1986)的图谱，立体定位坐标是AP：+7.2mm(自耳间线)，L：0.0mm和H：+2.0mm(自耳间线)。导管用即时粘合剂，牙齿粘合剂和锚件固定。将不锈钢仿制管，AD-12(外经0.35mm，EICOM)穿过导管，并用螺母在原位固定(EICOM)。手术后，将大鼠放入单独的笼中，并在实验开始前至少复原3天。
将术后大鼠用50g/kg i.p.的戊巴比妥麻醉，并在背位固定。在两侧颈静脉暴露后，用1ml结核菌素注射器和24-G针(均来自Termo)汲取400μl血液。为防止凝血，注射器用含200U/ml肝素的20μl盐水充满。将螺母和仿制管从大鼠头骨去除；并用与特氟隆管(50cm长，内经0.1mm，外经0.4mm，EICOM)连接的不锈钢微注射管(内经0.17mm，外经0.35mm，EICOM)插入替代。预先调整微注射管的长度以便其尖端从导管中伸出1mm。特氟隆管的一端与微量注射器泵连接，并以2.5μl/min的流速注射PBS或溶解在PBS中的19P2-L31到第三脑室，注入总量为10μl。输注下列物质后静置1分钟后，去除微注射管并恢复仿制管，用螺母在原位固定。在开始向心室内施用前立即或施用起始10、20、30、40及60分钟后，从颈静脉各汲取400μl的部分血液。每一血样用高速微型冷冻离心机(MR-150，Tommy Seiko)离心(5,000rpm，10分钟)，并回收上清液(血浆)。在血浆中的垂体激素[催乳素，促黄体激素(LH)，促肾上腺皮质激素(ACTH)，促甲状腺激素(TSH)，和生长激素(GH)]的量分别用放射免疫分析测定。
用平均+S.E.M.表示结果。为检测在用溶解于PBS中的19P2-L31处理的组和用PBS单独处理的对照组之间的显著性差异，采用t检验进行。根据双尾检验，假设P＜0.05为最低限的显著水平。如图48中所示，血浆生长激素水平在施用50nmol的19P2-L31入第三脑室后20分钟，与对照组相比较，其含量显著减少。在施用后10、30和40分钟也发现减少趋势但变化不具有统计显著性。施用60分钟后，与对照组没有任何区别。血浆促乳素，LH，ACTH，以及TSH都不具有显著变化。
[实施例42]在自由运动大鼠中配体多肽对血浆生长激素(GH)水平的影响
将成熟雄性Wistar大鼠用50mg/kg戊巴比妥i.p进行麻醉，同时，如同在实施例41中，将不锈钢小导管AG-12(内径0.4mm，外径0.5mm，EICOM)以其尖端位于第三脑室上面的部分位置时插入。在操作后，将这些大鼠装入单个笼子中，并且为复原饲养至少3天，然后将充满含肝素(200U/ml)的盐水的小管(长30cm，内径0.5mm，外径0.9mm，NatsumeSeisakusho)，在戊巴比妥麻醉下从右侧颈静脉插入到右心房中。保持大鼠过夜以完全从麻醉中苏醒，然后转移到透明的丙烯酸笼子(30cm×30cm×35cm)中。将带有24-G针1ml的结核菌素注射器(都通过Termo)连接到插入右心房的小管上，并抽取300μl血液。为防止凝血，预先使注射器充满20μl含有200U/ml肝素的盐水。将与特氟隆管(长50cm，内径0.1mm，外径0.4mm，EICOM)连接的不锈钢微型微注射小管(内径0.17mm，外径0.35mm，EICOM)插入到位于第三脑室的导管中。预先调整微型微注射小管的长度，以便它的尖端从导管延伸1mm。将特氟隆管的一个末端与微型微量注射器泵相连接，并以2.5μl/min的流速将总量为10μl的任何PBS或在PBS中所溶解的19P2-L31注射到第三脑室。在注药给第三脑室起始10分钟后，将5μg/kg的GHRH-生理盐水由进入第三脑室的小管而注入。在施药给脑室起始之前的即刻和GHRH施用之后的10，20，30，40，和60分钟，从颈静脉抽取300μl部分血液。将每一血样进行离心(5,000rpm，10min)并回收上清液(血浆)。由放射免疫分析法测定血浆中生长激素的浓度。
结果以平均±S.E.M表示。为检验用PBS所溶解的19P2-L31处理组与只用PBS处理的对照组之间的显著性差异，使用t检验。根据两种所跟踪的检验，假定P＜0.05为最低限度的显著水平。如图49所显示的，施用5μg/kg GHRH提高血浆生长激素水平。然而，若施用50nmol 19P2-L31到第三脑室，则明显抑制GHRH诱导的血浆生长激素的上升。
[实施例43]制备兔抗牛19P-L31抗体
将合成的含有部分19P2-L31序列的肽[肽I：SRAHQHSMEIRTPDC(SEQ ID NO：92)，肽II：CAWYAGRGIRPVGRFNH2(SEQ ID NO：93)，肽III：CEIRTPDINPAWYAG(SEQ ID NO：94)]按照标准方法与KLH连结。将溶解在盐水中的每一肽缀合物(600μg为一条肽)与弗氏完全佐剂混合，同时所形成的乳剂分别皮下注射到三只兔(NZW，雄性，2.5千克)。在如第一次注射相同剂量的缀合物与弗氏不完全佐剂的情况下，每隔三周总共进行三次超免疫检查。抗体效价检测如下：在最后的免疫法后两周，分别从这些免疫野兔的静脉中获取血液样品。在37℃培育1小时后，将血液样品在4℃保持过夜。借助于离心制备血清。将每一稀释合适的血清样品(100μl)引入到96个孔的微量培养板中，该微量培养板预先覆盖羊的抗兔IgG(Fc)抗体，然后将微量培养板在4℃培育16小时。撤走血清，将辣根过氧化物酶(HRP)结合的肽I，II，以及III分别加至孔，然后在室温下培育微量培养板4小时。撤走肽后，通过增加底物完成显色反应。加入100μl终止反应液终止反应，同时测量每一孔在450毫微米的吸收值。如图50中所显示，从免疫后的兔所获得的血清样品显示出分别与这些HRP结合的肽的结合活性。然而，在免疫前制备的血清中没有发现结合活性。这些结果表明兔接收免疫分别产生了抗肽I，II，III的抗体。为了制备纯化的IgG抗体组分，将从免疫的兔所获得的血清用硫酸铵沉淀。所形成的沉淀以硼酸盐缓冲液溶解，然后用相同的缓冲液进行透析。将这样获得的分别与肽I和19P2-L31连结的IgG组分流过亲和性柱。在用硼酸盐缓冲液洗涤，接着用乙酸盐缓冲液(100mM，pH4.5)洗涤之后，，将结合在柱上的抗体用甘氨酸缓冲液(200mM，pH2.0)洗脱下来。在以1M Tris中和后，这些洗脱液分别用作纯化抗体。
[实施例44]抗体对由19P2-L31引起的花生四烯酸代谢物释放的抑制性活性
对如实施例43的描述制备的纯化抗体进行其抑制性活性(抑制由19P2-L31引起的花生四烯酸代谢物的释放)检验。将如图51中的说明稀释的抗体与19P2-L31(5×10-10M)混合，在室温下1小时，然后如实施例11中描述的检查花生四烯酸代谢物的释放。如图51中所显示的，在抗肽II抗体中检测出最高抑制性活性。
[制备实施例1]
将五十毫克在实施例2l中所获得的化合物溶解在50ml日本药典的蒸馏水中以便注射，此外增加用于注射的日本药典的蒸馏水至100ml。将所形成的溶液在无菌条件下过滤，并将每1ml的滤液装入药水瓶用来注射，在无菌条件下使其冻干及密封。
[制备例子2]
将一百毫克在实施例21中获得的化合物溶解在50ml日本药典的蒸馏水中以便注射，此外增加用于注射的日本药典的蒸馏水至100ml。将所形成的溶液在无菌条件下过滤，并将每1ml的滤液装入药水瓶用来注射，在无菌条件下使其冻干及密封。
[评价本发明的配体多肽的生理活性]
上述实施例37-41显示出：局部施用的配体多肽引起自发运动性和用后腿站立行为的提高，体温和血压的升高，以及血浆生长激素浓度的减少。这些有关生理活性的研究结果是当配体多肽作用于中枢神经系统时发生的各种显著生理变化的第一证明。
由于本发明的配体多肽(包括其盐)作用于恒温动物的中枢神经系统(例如：大鼠，小鼠，豚鼠，小鸡，野兔，狗，猪，牛，绵羊，猴子，及人)引起各种生理上的变化，因此说明配体与其盐有改变颅内神经系统与内分泌系统的性质。
若将19P2-L31施用到小鼠的侧脑室，则发现活性的增加量在0.01-10nmol的水平上。这一事实显示：配体多肽通过中枢神经系统的G-蛋白偶联受体触发运动系统的变化。人们也被发现，施用该肽到小鼠的侧脑室导致体温的升高，而施用到大鼠的延髓区的鳃后导致血压的升高。这些作用类似已知的中央刺激物(例如：苯异丙胺，可卡因，甲基芬尼素，等等)的生理作用。因此，这表明：大体上，配体多肽或者其盐从神经末梢囊泡中释放生物胺(多巴胺，去甲肾上腺素，血清紧张素)(Michio Yuzuru和TakeoYoshikawa，医学科学， 42，535-536，1991)。
此外，当19P2-L31注射到大鼠第三脑室时，血浆生长激素水平受到抑制。该发现表明此肽在下丘脑起作用，并与经下丘垂体系统的垂体激素分泌相联系。该肽也可能直接作用于垂体而抑制生长激素的释放。来自垂体生长激素调节分泌的生长激素释放激素(GHRH)和促生长素抑制素均存在于第三脑室的附近之中(Masahiro Tohyama等，Kagakuteki ShinkeikinoKaibogaku(化学神经解剖学)，167-216，1987)。因此，表明19P2-L31调节这些物质的释放。
上述事实表明配体多肽是调节自控神经系统的在中枢神经系统起作用的肽。该肽及其受体的mRNA在下丘脑和延髓中高水平表达的事实也表明配体多肽牵涉到自控神经系统的调节作用。实际上，自控神经外围的超中心是延髓和下丘脑，此处具有的交感神经系统和副交感神经系统一起在神经调节和体液调节中起着重要的作用。
上述研究结果表明配体多肽和配体多肽兴奋剂或其盐的有效性，即引起自发运动性的增强的中枢神经系统刺激物的有效性。由此，该肽可以用作各种疾病的预防和/或治疗药物，如老年痴呆症，脑血管痴呆症(因为脑血管紊乱产生的痴呆)，与种系退化退行性(phylodegenerative retroplastic)疾病有关的痴呆(例如：Alzheimer氏病，帕金森氏病，Pick氏病，Huntington氏病等等)，由传染病引起的痴呆(例如：延迟病毒感染如Creutzfelt-Jakob病)，与内分泌、代谢和中毒性疾病有关的痴呆(例如：甲状腺机能减退，维生素B12缺乏症，酒精中毒及因为各种药物、金属或有机化合物的中毒)，与肿瘤疾病有关的痴呆(例如：人脑肿瘤)，因损伤性疾病的痴呆(例如：慢性硬膜下血肿)，抑郁(忧郁症)，运动综合症(microencephalo-pathy)，或意识紊乱。另一方面，19P2配体的拮抗剂或盐作为中枢神经系统抑制药是有价值的，例如，可以用作抗精神病的药物，抗Huntigton氏病的药物，抗忧虑药物或催眠止痛药。
注射配体多肽到延髓的鳃后区可明显地提高血压。因此，配体多肽或配体多肽拮抗剂，或其盐，可作为有价值的升压药物。另一方面，配体多肽拮抗剂或其盐可作为有价值的抑压药物。
发现当配体多肽作用于下丘脑时，血浆生长激素水平受到抑制。生长激素的过多分泌触发巨大发育和肢端肥大症巨大发育(Katamasu等，内分泌综合症，78-80，1993；Hiroi等，内分泌综合症，149-151，1993)。因此，配体多肽或配体多肽拮抗剂，或其盐，可以用作巨大发育和肢端肥大症巨大发育的预防和/或治疗药物。此外，生长激素促进葡萄糖从肝释放，并抑制肌肉和脂肪组织从血液摄取葡萄糖，从而导致血糖过多和糖尿病，[EijiKobayashi，Naibumpi Gensho(内分泌现象)，1980]。实际上，生长激素在糖尿病患者中分泌提高(Hiroshi Kiyono，内分泌学和代谢疾病385-402，1994)。因此，配体多肽或配体多肽拮抗剂，或其盐，例如可以用作糖尿病的预防和/或治疗药物。
另一方面，配体多肽拮抗剂促进生长激素的分泌。因此，配体多肽拮抗剂或其盐可用作为预防和/或治疗导致抑制生长激素水平的垂体症，垂体性侏儒症以及低血糖垂体机能紊乱的药物。此外，生长激素和由生长激素分泌的胰岛素样生长因子在横向硬化肌萎缩、骨质疏松、肾虚以及改善手术后的营养状态中有效(Shizume等，内分泌综合征，84-87，1993；NikkeiBio-Annal  96，453-454，1996；Tobiume等，临床内分泌学，44，1205-1214，1996)。因此，配体多肽拮抗剂或其盐可以用作预防和/或治疗这些疾病的药物。
                       序列表(1)一般信息：
 (i)申请人：
      (A)名称：Takeda化学工业有限公司
      (B)街道：1-1，Doshomachi 4-chome，Chuo-ku
      (C)城市：大阪
      (D)州：大阪
      (E)国家：日本
      (F)邮区代码(ZIP)：541
 (ii)发明名称：多肽，其产生方法和用途
 (iii)序列数：94
 (iv)计算机可读形式：
      (A)介质类型：
      (B)计算机：
      (C)操作系统：
      (D)软件：
 (v)当前申请的数据：
      申请号：(2)SEQ ID NO：1的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：98
      (B)类型：氨基酸
      (C)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1.
Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile
             20                  25                  30
Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg
         35                  40                  45
Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Pro Gly Asp Gly Pro
     50                  55                  60
Arg Pro Gly Pro Arg Arg Val Pro Ala Cys Phe Arg Leu Glu Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro Ser Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Thr Ala Gln Leu Val
                 85                  90                  95
Gln Glu(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
    (A)长度：294
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(xi)特征
    (C)鉴定方法：S
(x)序列描述：SEQ ID NO：2：ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GCTCCTCTGC CTGCTGCTGC TGGGCCTGGC CCTGCAGGGG    60GCTGCCAGCA GAGCCCACCA GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCCGACAT CAACCCTGCC    120TGGTACGCRG GCCGTGGGAT CCGGCCCGTG GGCCGCTTCG GCCGGCGAAG AGCTGCCCYG    180GGGGACGGAC CCAGGCCTGG CCCCCCDCGT GTGCCGGCCT GCTTCCGCCT GGAAGGCGGY    240GCTGAGCCCT CCCGAGCCCT CCCGGGGCGG CTGACGGCCC AGCTGGTCCA GGAA          294
(2)SEQ ID NO：3的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：29
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
  1               5                  10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly
             20                  25(2)SEQ ID NO：4的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：19
      (B)类型：氨基酸
      (C)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro
  1               5                  10                  15
Val Gly Arg
         19(2)SEQ ID NO：5的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：31
      (B)类型：氨基酸
      (C)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
  1               5                  10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe
             20                  25                  30(2)SEQ ID NO：6的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：32
      (B)类型：氨基酸
      (C)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
  1               5                  10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly
             20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：7的信息：
     (i)序列特征：
           (A)长度：33
           (B)类型：氨基酸
           (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Ser Arg Ala His Gin His Ser Met Glu Iie Arg Thr Pro Asp Ile Asn
  1               5                  10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly
             20                  25                  30
Arg
33
(2)SEQ ID NO：8的信息：
     (i)序列特征：
           (A)长度：20
           (B)类型：氨基酸
           (C)拓扑结构：线性
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro
  1               5                  10                  15
Val Gly Arg Phe
             20
(2)SEQ ID NO：9的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：21
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro
  1               5                  10                  15
Val Gly Arg Phe Gly
             20(2)SEQ ID NO：10的信息：
 (i)序列特征：
        (A)长度：22
        (B)类型：氨基酸
        (C)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Thr Pro Asp ILe Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro
  1               5                  10                  15
Val Gly Arg Phe Gly Arg
             20(2)SEQ ID NO：11的信息：
 (i)序列特征：
        (A)长度：87
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC  60
GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGC                                      87(2)SEQ ID NO：12的信息：
 (i)序列特征：
        (A)长度：57
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
  (ii)分子类型：cDNA
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGC    57(2)SEQ ID NO：13的信息：
 (i)序列特征：
        (A)长度：93
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC   60
GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTC                                93(2)SEQ ID NO：14的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：96
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC   60
GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTCGGC                             96(2)SEQ ID NO：15的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：99
      (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC    60
GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTCGGCCGG                           99(2)SEQ ID NO：16的信息：
 (i)序列特征：
        (A)长度：60
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC  60(2)SEQ ID NO：17的信息：
 (i)序列特征：
       (A)长度：63
       (B)类型：核酸
       (C)链型：双链
       (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC  60
GGC                                                                63(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
      (A)长度：66
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：cDNA
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC  60
GGCCGG                                                             66(2)SEQ ID NO：19的信息：
 (i)序列特征：
       (A)长度：91
       (B)类型：氨基酸
       (C)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn
  1               5                  10                  15
Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala
             20                  25                  30
Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val
         35                  40                  45
Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr
     50                  55                  60
Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr
 65                  70                  75                  80
Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile
                 85                  90(2)SEQ ID NO：20的信息：
 (i)序列特征：
      (A)长度：59
      (B)类型：氨基酸
      (C)拓扑结构：线型
 (ii)分子类型：肽
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val Ile Leu Leu
 1               5                   10                  15
Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val Val Pro Gly
             20                  25                  30
Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg Arg Arg Arg
         35                  40                  45
Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val
     50                  55
(2)SEQ ID NO：21的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：370
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Met Ala Ser Ser Thr Thr Arg Gly Pro Arg Val Ser Asp Leu Phe Ser
 1               5                   10                  15
Gly Leu Pro Pro Ala Val Thr Thr Pro Ala Asn Gln Ser Ala Glu Ala
             20                  25                  30
Ser Ala Gly Asn Gly Ser Val Ala Gly Ala Asp Ala Pro Ala Val Thr
         35                  40                  45
Pro Phe Gln Ser Leu Gln Leu Val His Gln Leu Lys Gly Leu Ile Val
     50                  55                  60
Leu Leu Tyr Ser Val Val Val Val Val Gly Leu Val Gly Asn Cys Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn
                 85                  90                  95
Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala
            100                 105                 110
Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val
        115                 120                 125
Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr
    130                 135                 140
Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser
                165                 170                 175
Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu
            180                 185                 190
Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val
        195                 200                 205
Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu
    210                 215                 220
Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val
225                 230                 235                 240
Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val
                245                 250                 255
Val Pro Gly Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg
            260                 265                 270
Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val Phe Ala
        275                 280                 285
Val Cys Trp Leu Pro Leu His Val Phe Asn Leu Leu Arg Asp Leu Asp
    290                 295                 300
Pro His Ala Ile Asp Pro Tyr Ala Phe Gly Leu Val Gln Leu Leu Cys
305                 310                 315                 320
His Trp Leu Ala Met Ser Ser Ala Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Ala
                325                 330                 335
Trp Leu His Asp Ser Phe Arg Glu Glu Leu Arg Lys Leu Leu Val Ala
            340                 345                 350
Trp Pro Arg Lys Ile Ala Pro His Gly Gln Asn Met Thr Val Ser Val
        355                 360                 365
Val Ile
370
(2)SEQ ID NO：22的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：206
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu Tyr Asn Val Thr Asn
 1               5                   10                  15
Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala
             20                  25                  30
Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val
         35                  40                  45
Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Ala Val Thr
     50                  55                  60
Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr
 65                  70                  75                  80
Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser
                 85                  90                  95
Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Val Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val
        115                 120                 125
Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu
    130                 135                 140
Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Leu Ser Tyr Ala Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val
                165                 170                 175
Val Pro Gly Arg Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val
        195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：23的信息：
    (i)序列特征：
          (A)长度：126
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser
 1               5                   10                  15
Ala Tyr Ala Val Leu Gly Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu
             20                  25                  30
Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val
         35                  40                  45
Ser Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Ile
     50                  55                  60
Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Gly Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala
 65                  70                  75                  80
Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val
                 85                  90                  95
Val Pro Gly Ser Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg
            100                 105                 110
Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val
        115                 120                 125
(2)SEQ ID NO：24的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：273
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC    60
AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT    120
GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG    180
CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGGTAC    240
GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATC                                 273
(2)SEQ ID NO：25的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：177
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
GGCCTGCTGC TGGTCACCTA CCTGCTCCCT CTGCTGGTCA TCCTCCTGTC TTACGTCCGG    60
GTGTCAGTGA AGCTCCGCAA CCGCGTGGTG CCGGGCTGCG TGACCCAGAG CCAGGCCGAC   120
TGGGACCGCG CTCGGCGCCG GCGCACCTTC TGCTTGCTGG TGGTGGTCGT GGTGGTG      177
(2)SEQ ID NO：26的信息：
    (i)序列特征：
           (A)长度：1110
           (B)类型：核酸
           (C)链型：双链
           (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
           (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
ATGGCCTCAT CGACCACTCG GGGCCCCAGG GTTTCTGACT TATTTTCTGG GCTGCCGCCG  60
GCGGTCACAA CTCCCGCCAA CCAGAGCGCA GAGGCCTCGG CGGGCAACGG GTCGGTGGCT  120
GGCGCGGACG CTCCAGCCGT CACGCCCTTC CAGAGCCTGC AGCTGGTGCA TCAGCTGAAG  180
GGGCTGATCG TGCTGCTCTA CAGCGTCGTG GTGGTCGTGG GGCTGGTGGG CAACTGCCTG  240
CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC  300
AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT  360
GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG  420
CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGCTAC  480
GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATCTCGCTGC GCCTCAGCGC CTACGCTGTG  540
CTGGCCATCT GGGCGCTGTC CGCGGTGCTG GCGCTGCCCG CCGCCGTGCA CACCTATCAC  600
GTGGAGCTCA AGCCGCACGA CGTGCGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC CCAGGAGCGC  660
CAGCGCCAGC TCTACGCCTG GGGGCTGCTG CTGGTCACCT ACCTGCTCCC TCTGCTGGTC  720
ATCCTCCTGT CTTACGTCCG GGTGTCAGTG AAGCTCCGCA ACCGCGTGGT GCCGGGCTGC   780
GTGACCCAGA GCCAGGCCGA CTGGGACCGC GCTCGGCGCC GGCGCACCTT CTGCTTGCTG   840
GTGGTGGTCG TGGTGGTGTT CGCCGTCTGC TGGCTGCCGC TGCACGTCTT CAACCTGCTG   900
CGGGACCTCG ACCCCCACGC CATCGACCCT TACGCCTTTG GGCTGGTGCA GCTGCTCTGC   960
CACTGGCTCG CCATGAGTTC GGCCTGCTAC AACCCCTTCA TCTACGCCTG GCTGCACGAC   1020
AGCTTCCGCG AGGAGCTGCG CAAACTGTTG GTCGCTTGGC CCCGCAAGAT AGCCCCCCAT   1080
GGCCAGAATA TGACCGTCAG CGTGGTCATC                                    1110
(2)SEQ ID NO：27的信息：
      (i)序列特征：
         (A)长度：618
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
      (ii)分子类型：cDNA
      (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
      (xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGTACAACG TGACGAATTT CCTCATCGGC    60
AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT    120
GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG    180
CAGGCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGCTAC    240
GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATCTCGCTGC GCCTCAGCGC CTACGCTGTG    300
CTGGCCATCT GGGTGCTGTC CGCGGTGCTG GCGCTGCCCG CCGCCGTGCA CACCTATCAC    360
GTGGAGCTCA AGCCGCACGA CGTGCGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC CCAGGAGCGC    420
CAGCGCCAGC TCTACGCCTG GGGGCTGCTG CTGGTCACCT ACCTGCTCCC TCTGCTGGTC    480
ATCCTCCTGT CTTACGCCCG GGTGTCAGTG AAGCTCCGCA ACCGCGTGGT GCCGGGCCGC    540
GTGACCCAGA GCCAGGCCGA CTGGGACCGC GCTCGGCGCC GGCGCACCTT CTGCTTGCTG    600
GTGGTGGTCG TGGTGGTG                                                  618
(2)SEQ ID NO：28的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：378
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
            (D)拓扑结构：线型
       (ii)分子类型：cDNA
       (ix)特征
            (C)鉴定方法：S
       (xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
GTGGTTCTGG TGCACCCGCT ACGTCGGCGC ATTTCACTGA GGCTCAGCGC CTACGCGGTG     60
CTGGGCATCT GGGCTCTATC TGCAGTGCTG GCGCTGCCGG CCGCGGTGCA CACCTACCAT     120
GTGGAGCTCA AGCCCCACGA CGTGAGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC GCAGGAGCGC     180
CAACGCCAGA TCTACGCCTG GGGGCTGCTT CTGGGCACCT ATTTGCTCCC CCTGCTGGCC     240
ATCCTCCTGT CTTACGTACG GGTGTCAGTG AAGCTGAGGA ACCGCGTGGT GCCTGGCAGC     300
GTGACCCAGA GTCAAGCTGA CTGGGACCGA GCGCGTCGCC GCCGCACTTT CTGTCTGCTG     360
GTGGTGGTGG TGGTAGTG                                                   378
(2)SEQ ID NO：29的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：25
          (B)类型：核酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：其它核酸
                   合成DNA
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG       25
(2)SEQ ID NO：30的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：27
          (B)类型：核酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：其它核酸
                   合成DNA
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA                                 27
(2)SEQ ID NO：3l的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：27
          (B)类型：核酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：其它核酸
                   合成DNA
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：3l：
CTGTGYGYSA TYGCNNTKGA YMGSTAC      27
(2)SEQ ID NO：32的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：29
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
AKGWAGWAGG GCAGCCAGCA GANSRYGAA      29
(2)SEQ ID NO：33的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：24
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
CTGACTTATT TTGTGGGCTG CCGC              24
(2)SEQ ID NO：34的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：24
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
AACACCGACA CATAGACGGT GACC          24
(2)SEQ ID NO：35的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：20
          (B)类型：核酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：其它核酸
                   合成DNA
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：35：
 GCICAYCARC AYTGYATGGA     20
 (2)SEQ ID NO：36的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：26
          (B)类型：核酸
          (C)链型：单链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：其它核酸
                   合成DNA
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
CCIACGGGIC KDATGGGIGK GCCIGC              26
(2)SEQ ID NO：37的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：26
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
 ACGGGCCKDA TGCCICKGCC IGCRTA       26
(2)SEQ ID NO：38的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：20
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：38：
CCGGCGTACC AGGCAGGGTT          20
(2)SEQ ID NO：39的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：28
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
AGGCAGGGTT GATGTCGGGG GTGCGGAT          28
(2)SEQ ID NO：40的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：27
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
CTGCCAGCAG AGCCCACCAG CACTCCA    27
(2)SEQ ID NO：41的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：27
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
GTGGGGGCCT GGCTCCTCTG CCTGCTG    27
(2)SEQ ID N0：42的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：42：
GTGTGGAGGA ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GC       32
(2)SEQ ID NO：43的信息：
    (i)序列特征：
    (A)长度：24
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：43：
AGGCTCCCGCTGTTATTCCT GGAC    24
(2)SEQ ID NO：44的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：98
        (B)类型：氨基酸
        (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：44：
Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu
 1               5                   10                  15
Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile
             20                  25                  30
Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg
         35                  40                  45
Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Leu Gly Asp Gly Pro
     50                  55                  60
Arg Pro Gly Pro Arg Arg Val Pro Ala Cys Phe Arg Leu Glu Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro Ser Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Thr Ala Gln Leu Val
                 85                  90                  95
Gln Glu
(2)SEQ ID NO：45的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：83
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：45：
Met Ala Leu Lys Thr Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val
 1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Ala Ser Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg
             20                  25                  30
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro
         35                  40                  45
Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Pro Arg Asp Val Thr Gly
     50                  55                  60
Leu Gly Gln Leu Ser Cys Leu Pro Leu Asp Gly Arg Thr Lys Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Gln Arg Gly
(2)SEQ ID NO：46的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：249
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：46：
ATGGCCCTGA AGACGTGGCT TCTGTGCTTG CTGCTGCTAA GCTTGGTCCT CCCAGGGGCT   60
TCCAGCCGAG CCCACCAGCA CTCCATGGAG ACAAGAACCC CTGATATCAA TCCTGCCTGG   120
TACACGGGCC GCGGGATCAG GCCTGTGGGC CGCTTCGGCA GGAGAAGGGC AACCCCGAGG   180
GATGTCACTG GACTTGGCCA ACTCAGCTGC CTCCCACTGG ATGGACGCAC CAAGTTCTCT   240
CAGCGTGGA                                                           249
(2)SEQ ID NO：47的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：31
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：47：
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn
 1               5                   10                  15
Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe
             20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：48的信息：
      (i)序列特征：
           (A)长度：32
           (B)类型：氨基酸
           (C)拓扑结构：线型
      (ii)分子类型：肽
      (xi)序列描述：SEQ ID NO：48：
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile ASn
 1               5                   10                  15
Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly
             20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：49的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：33
        (B)类型：氨基酸
        (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：49：
Ser Arg AlaHis Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn
 1              5                   10                  15
Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly
             20                  25                  30
Arg
(2)SEQ ID NO：50的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：20
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：50：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe
20
(2)SEQ ID NO：51的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：21
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：51：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe Gly
             20
(2)SEQ ID NO：52的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：22
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Iie Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe Gly Arg
             20
(2)SEQ ID NO：53的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：93
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：53：
AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC    60
ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTC                                 93
(2)SEQ ID NO：54的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：96
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：54：
AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC    60
ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGC                              96
(2)SEQ ID NO：55的信息：
(i)序列特征：
     (A)长度：99
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征
     (C)鉴定方法：S
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：
AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC    60
ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGCAGG                           99
(2)SEQ ID NO：56的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：60
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：56：
ACCCCTGATA TCAATCCTGC CTGGTACACG GGCCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC     60
(2)SEQ ID NO：57的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：63
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
        (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：57：
ACCCCTGATA TCAATCCTGC CTGGTACACG GGCCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC      60
GGC                                                                    63
(2)SEQ ID NO：58的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：66
         (B)类型：核酸
         (C)链型：双链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
         (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：58：
ACCCCTGATA TCAATCCTGC CTGGTACACG GGCCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC       60
GGCAGG                                                                  66
(2)SEQ ID NO：59的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：87
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：59：
Met Lys Val Leu Arg Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Met Leu Gly Leu
 1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Gly Ala Ala Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile
             20                  25                  30
Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg
         35                  40                  45
Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro
     50                  55                  60
Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Leu Thr Cys Phe Pro Leu Glu Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Ala Met Ser Ser Gln Asp Gly
               85
(2)SEQ ID NO：60的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：261
          (B)类型：核酸
          (C)链型：双链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
          (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：60：
ATGAAGGTGC TGAGGGCCTG GCTCCTGTGC CTGCTGATGC TGGGCCTGGC CCTGCGGGGA    60
GCTGCAAGTC GTACCCATCG GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCTGACAT CAATCCTGCC    120
TGGTACGCCA GTCGCGGGAT CAGGCCTGTG GGCCGCTTCG GTCGGAGGAG GGCAACCCTG    180
GGGGACGTCC CCAAGCCTGG CCTGCGACCC CGGCTGACCT GCTTCCCCCT GGAAGGCGGT    240
GCTATGTCGT CCCAGGATGG  C                                             261
(2)SEQ ID NO：61的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：31
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：61：
Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
 1               5                   10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe
             20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：62的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：32
          (B)类型：氨基酸
     (C)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：
Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
 1               5                   10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly
             20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：63的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：33
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：63：
Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn
 1               5                   10                  15
Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly
             20                  25                  30
Arg
(2)SEQ ID NO：64的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：20
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：64：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe
            20
(2)SEQ ID NO：65的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：21
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：65：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe Gly
             20
(2)SEQ ID NO：66的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：22
          (B)类型：氨基酸
          (C)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：肽
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：66：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe Gly Arg
             20
(2)SEQ ID NO：67的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：93
          (B)类型：核酸
          (C)链型：双链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
          (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：67：
AGTGGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC    60
GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTC                                 93
(2)SEQ ID NO：68的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：96
          (B)类型：核酸
          (C)链型：双链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
          (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：68：
AGTCGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC    60
GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGT                              96
(2)SEQ ID NO：69的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：99
          (B)类型：核酸
          (C)链型：双链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
          (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：69：
AGTCGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC    60
GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGTCGG                           99
(2)SEQ ID NO：70的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：60
          (B)类型：核酸
          (C)链型：双链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
          (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：70：
ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC    60
(2)SEQ ID NO：71的信息：
     (i)序列特征：
          (A)长度：63
          (B)类型：核酸
          (C)链型：双链
          (D)拓扑结构：线型
     (ii)分子类型：cDNA
     (ix)特征
          (C)鉴定方法：S
     (xi)序列描述：SEQ ID NO：71：
ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC      60
GGT                                                                    63
(2)SEQ ID NO：72的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：66
        (B)类型：核酸
        (C)链型：双链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：cDNA
    (ix)特征
        (C)鉴定方法：S
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：72：
ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC     60
GGTCGG                                                                66
(2)SEQ ID NO：73的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：21
        (B)类型：氨基酸
        (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (ix)特征：10位的Xaa是Ala或者Thr。
              11位的Xaa是Gly或者Ser。
              21位的Xaa是H，Gly或者GlyArg。
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：73：
Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro
 1               5                   10                  15
Val Gly Arg Phe Xaa
             20
(2)SEQ ID NO：74的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度： 11
        (B)类型：氨基酸
        (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (ix)特征：3位的Xaa是Ala或者Thr。
              5位的Xaa是Gln或者Arg。
              10位的Xaa是Ile或者Thr。
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：74：
Ser Arg Xaa His Xaa His Ser Met Glu Xaa Arg
 1               5                   10
(2)SEQ ID NO：75的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：26
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
             (D)拓扑结构：线型
         (ii)分子类型：其它核酸
                       合成DNA
         (xi)序列描述：SEQ ID NO：75：
CARCAYTCCA TGGAGACAAG AACCCC    26
(2)SEQ ID NO：76的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：24
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：76：
TACCAGGCAG GATTGATACA GGGG   24
(2)SEQ ID NO：77的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：77：
GGCATCATCC AGGAAGACGG AGCAT  25
(2)SEQ ID NO：78的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：78：
AGGAGAGGAG AGGGAGGGTA GAGGA  25
(2)SEQ ID NO：79的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：22
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：79：
ACGTGGCTTC TGTGCTTGCT GC   22
(2)SEQ ID NO：80的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：80：
GCCTGATCCC GCGGCCCGTG TACCA  25
(2)SEQ ID NO：81的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：26
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：81：
TTGCCCTTCT CCTGCCGAAG CGGCCC     26
(2)SEQ ID NO：82的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：27
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：82：
GGCGGGGGCT GCAAGTCGTA CCCATCG    27
(2)SEQ ID NO：83的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：27
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：83：
CGGCACTCCA TGGAGATCCG CACCCCT   27
(2)SEQ ID NO：84的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：27
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：84：
CAGGCAGGAT TGATGTCAGG GGTGCGG  27
(2)SEQ ID NO：85的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：27
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：85：
CATGGAGTGC CGATGGGTAC GACTTGC  27
(2)SEQ ID NO：86的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：27
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：86：
GGCCTCCTCG GAGGAGCCAA GGGATGA    27
(2)SEQ ID NO：87的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：27
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：87：
GGGAAAGGAG CCCGAAGGAG AGGAGAG  27
(2)SEQ ID NO：88的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：25
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：88：
CCTGCTGGCC ATTCTCCTGT CTTAC    25
(2)SEQ ID NO：89的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：25
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：89：
GGGTCCAGGT CCCGCAGAAG GTTGA    25
(2)SEQ ID NO：90的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：25
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：90：
GAAGACGGAG CATGGCCCTG AAGAC    25
(2)SEQ ID NO：91的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：25
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：91：
GGCAGCTGAG TTGGCCAAGT CCAGT    25
(2)SEQ ID NO：92的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：15
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：92：
Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Cys
 1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：93的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：15
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：93：
Cys Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe
 1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：94的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：15
         (B)类型：氨基酸
         (C)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：94：
Cys Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly
 1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：95的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：24
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：95：
GTTCACAGGT CGACATGACC TCAC        24
(2)SEQ ID NO：96的信息：
    (i)序列特征：
         (A)长度：25
         (B)类型：核酸
         (C)链型：单链
         (D)拓扑结构：线型
    (ii)分子类型：其它核酸
                  合成DNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：96：
CTCAGAGCTA GCAGAGTGTC ATCAG           25

Claims (20)

1.一种多肽或其酰胺或酯或者其盐，所说的多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：73所代表的氨基酸序列，1-5个氨基酸残基由SEQ IDNO：73中缺失的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：73所示氨基酸序列上的氨基酸序列，和1-5个氨基酸残基从SEQ ID NO：73所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列；并且该多肽能够与包含SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列的受体蛋白相结合。
2.如权利要求1所要求的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66所代表的氨基酸序列。
3.如权利要求1所要求的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：59所代表的氨基酸序列。
4.一种DNA，该DNA包含具有编码权利要求1所要求的多肽的核苷酸序列的DNA。
5.如权利要求4所要求的DNA，该DNA包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72所示的核苷酸序列。
6.一种重组体载体，该载体包含权利要求4所要求的DNA。
7.一种宿主细胞，该宿主细胞携带权利要求4所要求的DNA或权利要求6所要求的重组载体。
8.一种用于产生权利要求1所要求的多肽的方法，该方法包括培养权利要求7所要求的宿主细胞。
9.一种药物组合物，该组合物包含权利要求1所要求的多肽，其酰胺或酯，或其药学上可接受的盐。
10.一种药物组合物，该组合物包含权利要求4所要求的DNA。
11.如权利要求9或10所要求的药物组合物，该组合物是垂体功能调节剂。
12.如权利要求9或10所要求的药物组合物，该组合物是中枢神经系统功能调节剂。
13.如权利要求9或10所要求的药物组合物，该组合物是胰功能调节剂。
14.一种抗体，该抗体抗权利要求1所要求的多肽。
15.一种筛选能够改变权利要求1所述多肽与一种受体蛋白或其盐的结合活性的化合物的方法，所述受体蛋白能够与具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列的多肽相结合，并且包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列，1-30个氨基酸残基由SEQ ID NO：21中缺失的氨基酸序列，1-30个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上的氨基酸序列，和1-30个氨基酸残基从SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列；该方法包括将以下情况进行比较：(1)其中将权利要求1所述多肽和所述受体蛋白或其盐可接触的至少一种情形；和(2)其中将权利要求1所述多肽与待检测样品一起与所述受体蛋白或其盐相接触的至少一种情形。
16.如权利要求15所要求的方法，其中所述受体蛋白包含选自下组的氨基酸序列：1-10个氨基酸残基由SEQ ID NO：21中缺失的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基从SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列。
17.用于筛选能够改变权利要求1所述多肽与受体蛋白或其盐的结合活性的化合物的试剂盒，所述受体蛋白能够与具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列的多肽相结合，并且包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列，1-30个氨基酸残基由SEQ ID NO：21中缺失的氨基酸序列，1-30个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上的氨基酸序列，和1-30个氨基酸残基从SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列。
18.如权利要求17所要求的试剂盒，其中所述受体蛋白包含选自下组的氨基酸序列：1-10个氨基酸残基由SEQ ID NO：21中缺失的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基从SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列。
19.能够改变权利要求1所要求的多肽与受体蛋白或其盐的结合活性的化合物，所述受体蛋白能够与具有SEQ ID NO：73所示氨基酸序列的多肽相结合，并且包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：21所代表的氨基酸序列，1-30个氨基酸残基由SEQ ID NO：21中缺失的氨基酸序列，1-30个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上的氨基酸序列，和1-30个氨基酸残基从SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列；该化合物是通过权利要求15所要求的筛选方法或采用权利要求17所要求的筛选试剂盒获得的。
20.如权利要求19所要求的化合物，其中所述受体蛋白包含选自下组的氨基酸序列：1-10个氨基酸残基由SEQ ID NO：21中缺失的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基被添加到SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上的氨基酸序列，1-10个氨基酸残基从SEQ ID NO：21所示氨基酸序列上被一或多个其它氨基酸残基所取代的氨基酸序列。
CNB961993820A 1995-12-28 1996-12-26 G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途 Expired - Fee Related CN1149286C (zh)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP343371/1995 1995-12-28
JP343371/95 1995-12-28
JP34337195 1995-12-28
JP59419/1996 1996-03-15
JP5941996 1996-03-15
JP59419/96 1996-03-15
JP211805/96 1996-08-12
JP21180596 1996-08-12
JP211805/1996 1996-08-12
JP246573/1996 1996-09-18
JP246573/96 1996-09-18
JP24657396 1996-09-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1207126A CN1207126A (zh) 1999-02-03
CN1149286C true CN1149286C (zh) 2004-05-12

Family

ID=27463762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB961993820A Expired - Fee Related CN1149286C (zh) 1995-12-28 1996-12-26 G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途

Country Status (8)

Country Link
US (3) US6228984B1 (zh)
EP (1) EP0870020B1 (zh)
CN (1) CN1149286C (zh)
AT (1) ATE335818T1 (zh)
AU (1) AU1208497A (zh)
CA (1) CA2239299A1 (zh)
DE (1) DE69636437T2 (zh)
WO (1) WO1997024436A2 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69636437T2 (de) * 1995-12-28 2007-03-15 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Ligand polypeptide für hypophyse g-protein gekoppeltes rezeptor-protein, deren herstellung und anwendung
AU7081798A (en) * 1997-04-28 1998-11-24 Takeda Chemical Industries Ltd. Ligand polypeptide for the g protein-coupled receptor from human pituitary glands
EP1001989A1 (en) * 1997-06-23 2000-05-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Prolactin secretion modulator
EP0887417A3 (en) * 1997-06-27 1999-01-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing a 19P2 ligand by cleavage of a fusion protein containing it
US20030006192A1 (en) * 1998-02-23 2003-01-09 Irving Wainer Immobilized G-protein coupled receptors on liquid chromatography stationary phases and use thereof for on-line screening
AU3733199A (en) 1998-05-21 1999-12-06 Takeda Chemical Industries Ltd. Antibodies and utilization thereof
EP1122313A4 (en) * 1998-10-08 2005-06-08 Takeda Chemical Industries Ltd NEW G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR PROTEIN AND ITS DNA
US7192723B2 (en) 1998-11-13 2007-03-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited G protein-coupled receptor protein, its DNA and ligand thereof
WO2000029441A1 (fr) * 1998-11-13 2000-05-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g, son adn et son ligand
JP2000191696A (ja) * 1998-12-25 2000-07-11 Takeda Chem Ind Ltd ペプチドの用途
ATE280179T1 (de) * 1999-08-03 2004-11-15 Juvantia Pharma Ltd Oy Prolaktin freisetzendes peptid und verwendung zur behandlung von schmerzen
EP1207201A4 (en) * 1999-08-27 2003-03-12 Takeda Chemical Industries Ltd PROTEIN G-COUPLED RECEPTOR AND CORRESPONDING DNA
WO2001016298A1 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Smithkline Beecham Corporation Cloning of mouse gpr10 receptor
AU1415301A (en) * 1999-11-18 2001-05-30 Takeda Chemical Industries Ltd. Use of peptide
CA2401946A1 (en) * 2000-03-06 2001-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Rfrp-containing prolactin secretion regulatory agent
US6884596B2 (en) 2000-04-28 2005-04-26 The Regents Of The University Of California Screening and therapeutic methods for promoting wakefulness and sleep
US6383764B1 (en) 2000-04-28 2002-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying compounds for controlling absence seizures in a mammal relating to prolactin-releasing peptide(PrRP)
JP2003252801A (ja) * 2002-02-27 2003-09-10 Japan Science & Technology Corp 下垂体特異的遺伝子の使用法
WO2003080099A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g-protein coupled receptor 10 (gpr10)
KR101170840B1 (ko) * 2003-05-29 2012-08-03 샤이어 엘엘씨 남용 방지성 암페타민 화합물
AU2003272814A1 (en) 2003-10-02 2005-05-19 Ibrahim Al-Habdan Peptide for promoting healing of fractures
US20080254042A1 (en) * 2004-09-15 2008-10-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Novel Use of Prrp and Receptor Thereof
CH714402A1 (fr) * 2017-12-04 2019-06-14 Fond Luc Montagnier Procédé de détection de la présence d'un élément biochimique.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5284746A (en) * 1990-02-08 1994-02-08 Zymogenetics, Inc. Methods of producing hybrid G protein-coupled receptors
IT1252444B (it) * 1990-09-07 1995-06-16 Enichem Spa Metodo per l'identificazione e/o l'isolamento di geni che codificano per recettori di membrana.
US5279957A (en) * 1992-04-30 1994-01-18 Washington University cDNA encoding human phospholipase A2 polypeptide
US5556744A (en) * 1992-05-29 1996-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients
US5474766A (en) * 1992-12-18 1995-12-12 Washington University Methods and compositions for inhibition of hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator
CA2195768A1 (en) * 1994-08-11 1996-02-22 Shuji Hinuma G protein coupled receptor protein, production, and use thereof
US5534699A (en) * 1995-07-26 1996-07-09 National Electrostatics Corp. Device for separating and recombining charged particle beams
DE69636437T2 (de) * 1995-12-28 2007-03-15 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Ligand polypeptide für hypophyse g-protein gekoppeltes rezeptor-protein, deren herstellung und anwendung

Also Published As

Publication number Publication date
CA2239299A1 (en) 1997-07-10
DE69636437T2 (de) 2007-03-15
US6228984B1 (en) 2001-05-08
AU1208497A (en) 1997-07-28
WO1997024436A3 (en) 1997-09-12
EP0870020A2 (en) 1998-10-14
DE69636437D1 (de) 2006-09-21
US20050170461A1 (en) 2005-08-04
EP0870020B1 (en) 2006-08-09
US6794491B1 (en) 2004-09-21
CN1207126A (zh) 1999-02-03
ATE335818T1 (de) 2006-09-15
WO1997024436A2 (en) 1997-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1149286C (zh) G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途
CN1101854C (zh) G蛋白偶联受体蛋白质及其产生方法和用途
CN1310945C (zh) 人g蛋白偶联受体的内源形式和非内源形式
CN1283228A (zh) 多肽、其生产方法及应用
CN1173033C (zh) Tnf/ngf超家族受体和可溶性寡聚tnf/ngf超家族受体的调节剂
Bogerd et al. Two gonadotropin-releasing hormone receptors in the African catfish: no differences in ligand selectivity, but differences in tissue distribution
CN1324405A (zh) 新型g蛋白偶联型受体蛋白、dna及其配体
CN1419563A (zh) 肽衍生物
CN101035806A (zh) 新的糊精家族多肽－6（afp－6）类似物和制备和使用它们的方法
CA2116489A1 (en) Pacap receptor protein, method for preparing said protein and use thereof
CN1165147A (zh) 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体蛋白质，其生产和应用
CN1328568A (zh) 肽衍生物
CN1344321A (zh) 筛选方法
CN1341123A (zh) 新型g蛋白偶联型受体蛋白及其dna
CN1333786A (zh) 新的g蛋白偶联型受体蛋白、其dna及其配体
CN1615439A (zh) 编码g蛋白偶联受体的基因及其使用方法
CN1633498A (zh) 新型胰岛素/胰岛素样生长因子/松弛素家族多肽及其dna
CN1286976C (zh) α/β－干扰素结合蛋白,制法及用途
WO1998058962A1 (en) Prolactin secretion modulator
CN1359421A (zh) 新型多肽及其dna
JP4306816B2 (ja) 新規生理活性物質、その製造法および用途
WO2000058462A1 (fr) Nouvelles proteines de recepteur couplees aux proteines de liaison a la guanosine triphosphate (gtp), bg3
CN1334741A (zh) 肽的用途
US6881545B1 (en) Polypeptides, their production and use
CN1390131A (zh) 肽的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20040512

Termination date: 20101226