CN1344321A - 筛选方法 - Google Patents
筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1344321A CN1344321A CN99816370A CN99816370A CN1344321A CN 1344321 A CN1344321 A CN 1344321A CN 99816370 A CN99816370 A CN 99816370A CN 99816370 A CN99816370 A CN 99816370A CN 1344321 A CN1344321 A CN 1344321A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mch
- slc
- salt
- cell
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/68—Melanocyte-stimulating hormone [MSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
Abstract
本发明提供一种化合物或其盐的筛选方法,筛选的化合物或其盐能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变,其特征包括应用MCH或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐。上面所述本发明的筛选化合物或其盐的方法,即,筛选的化合物或其盐能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变,其特征包括应用MCH或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐。该方法有利于筛选激动剂SLC-1和拮抗剂SLC-1,其中激动剂SLC-1可用于预防·治疗的药物,其中包括除了提高食欲(摄食)的药物外,还有,与微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等有关的药物;而拮抗剂SLC-1可用于预防·治疗的药物,其中包括除了治肥胖病的制剂(药物)、调节食欲(摄食)药物外,还有,与激烈阵痛、强直性子宫收缩、胎儿窒息、子宫破裂、颈管裂伤、早产、普-威综合征等有关的药物。
Description
发明领域
本发明涉及筛选治肥胖病的药物或调节食欲的药物等方法,其特征为,应用孤儿受体蛋白,即SLC-1(FEBS Letters 398,253-258(1996)等)或其盐和MCH[黑色素凝集激素(Melanin Concentrating Hormone)(Endocrinology,vol.125,1660-1665(1989)等)]或其衍生物或其盐。
发明背景
有两种类型的SLC-1,一种是从人的基因组中发现的[FEBS Letters398,253-258(1996)],另一种是从大鼠脑中cDNA文库中发现的[Biochinica etBiophysica Acta 1401,216-220(1998)]。这两种类型的SLC-1是总称为G蛋白偶联型受体蛋白或7跨膜型受体蛋白中的一种,其很多配体不清。
其中分析这些孤儿G蛋白偶联型受体蛋白的配体,一般来说,其方法是只有根据G蛋白偶联型受体蛋白的一级结构的相似性进行推断。但是,有很多孤儿G蛋白偶联型受体蛋白与已知的受体蛋白同源性相差很大,事实上,如果将已知配体的受体蛋白的亚型除外,仅从一级结构的相似性考虑其配体是很难的。另一方面,从基因分析而得到的很多G蛋白偶联型受体中推测还存在很多对应的、未知的配体,迄今为止,得到证实的G蛋白偶联型受体的配体的例子很少,SLC-1的配体存在与否未见报导。
本研究的课题就是确立筛选化合物等的方法,一是要探索针对SLC-1(孤儿G受体蛋白)的配体,二是要应用SLC-1以及其配体。
发明公开
本发明人通过适当的手段使编码SLC-1的cDNA表达,并使用这种表达细胞,测定特异的细胞刺激(信号传导)活性等,将其作为指标,成功地筛选出该受体蛋白能识别作为配体的多肽,并发现该多肽是一种激素MCH(黑色素凝集激素(Melanin Concentrating Hormone)。
本发明人进一步发现,可以筛选一种化合物,该化合物能使活性因子、即MCH或其盐与所述SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化。
又发现,本发明的人型SLC-1的氨基酸序列为一种新的序列,它与现有文献(FEBS Letters 398,253-258(1996)、WO96/18651号)不同。
即,本发明提供,
(1)一种化合物或其盐的筛选方法,该化合物或其盐能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变,其特征包括应用黑色素凝集激素(MCH)或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐。
(2)一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒,该化合物或其盐能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变,其特征为,该试剂盒包含MCH或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐。
(3)这种能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变的化合物或其盐,通过(1)中所述筛选方法或(2)中所述筛选试剂盒而获得。
(4)一种药物,它包含(3)中所述化合物或其盐。
(5)(4)中所述药物,为一种治肥胖病的药物。
(6)一种含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的蛋白质或其盐。
(7)一种DNA,它所具有的碱基,为编码(6)中所述的蛋白质。
(8)(1)中所述筛选方法或(2)中所述筛选试剂盒,其中MCH为一种肽,其肽包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
(9)(1)中所述筛选方法或(2)中所述筛选试剂盒,其中衍生物为一种肽,在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中其肽包含从N末端第5位至第19位的部分序列。
(10)(1)中所述筛选方法或(2)中所述筛选试剂盒,其中衍生物为一种肽,其肽包含由波德栋-亨特试剂(ボルトンハンタ-)所衍生的MCH或由波德栋-亨特试剂(ボルトン-ンタ-)所衍生的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中从N末端第5位至第19位的部分序列。
(11)一种肽或其盐,它包含由波德栋-亨特试剂(ボルトン-ンタ-)所衍生的MCH或由波德栋-亨特试剂(ボル トン-ンタ-)所衍生的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中从N末端第5位至第19位的部分序列,以及
化学式表示。
具体地说,有关本发明的SLC-1,若举出所述公知的SLC-1或其盐等,则有:
(13)SLC-1或其盐的特征为,它们包含与SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列,或
(14)(13)中所述SLC-1或其盐为一种蛋白质,它所包含的氨基酸序列为:SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列中缺失1-30个氨基酸,优选其中缺失1-10个氨基酸,SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列中附加(插入)1-30个氨基酸,优选其中附加(或插入)1-10个氨基酸,或SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列中被其它氨基酸置换1-30个,优选其中置换1-10个氨基酸。
具体地说,有关本发明的MCH,若举出所述公知的MCH或其盐等,则有:(15)MCH或其衍生物或其盐的特征为,它包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列,或
(16)(15)中所述MCH或其衍生物或其盐为肽,这种肽的蛋白质所包含的氨基酸序列为,SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中缺失1-10个氨基酸,优选其中缺失1-5个氨基酸,SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中附加(插入)1-10个氨基酸,优选其中附加(或插入)1-5个氨基酸,或SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中被其它氨基酸置换1-10个,优选其中置换1-5个氨基酸。
附图说明
图1是关于由大鼠脑制备而来的高效液相层析(HPLC)部分,并表示对CHO/SLC-1细胞进行特异性cAMP合成抑制活性的测定结果。
图2表示对参考例1中大鼠脑高效液相层析(HPLC)部分的#34,经过链霉蛋白酶处理之后,cAMP合成抑制活性的变化情况。
图3是关于参考例3中的用ODS层析柱(Develosil ODS-UG-3)纯化的级分,并表示对CHO/SLC-1细胞进行特异性cAMP合成抑制活性的测定结果。
图4是关于能使大鼠SLC-1基因表达的CHO细胞系,并通过原位杂交比较基因表达之量。
图5表示在不同MCH浓度下,CHO/SLC-1细胞的cAMP合成抑制活性。
图6表示在不同MCH浓度下,CHO/SLC-1细胞的花生四烯酸代谢物释放活性。
图7表示通过MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)与GTPγS的结合,并利用其结合检测方法测定其激动剂的活性。
图8表示由非同位素波德栋-亨特试剂(ボルトン-ンタ-)所衍生的衍生物MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)及MCH(5-19)与GTPγS的结合,并利用其结合检测方法测定其激动剂的活性。
图9表示用波德栋-亨特试剂(ボルトン-ンタ-)制备的[125I]标记的MCH(4-19),对细胞膜级分的特异性结合,该细胞膜级分由能使人SLC-1表达的CHO细胞制备而来。
图10表示用波德栋-亨特试剂(ボルトン-ンタ-)制备的[125I]标记的MCH(4-19)之MCH结合抑制活性。
实施发明的最佳方案
在本发明书中所说[基本相同]是指,多肽的活性基本相同,例如,配体(MCH)与受体(SLC-1)结合活性、生理特性等。
下面,进一步详细说明本发明中所使用的SLC-1或其盐(下文,通常简称为SLC-1)以及MCH或其衍生物或其盐(下文,通常简称为MCH)的制造方法。
所述本发明中使用的SLC-1及MCH是来自于人或温血动物(例如,豚鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴子等)以及鱼类等的所有组织(例如,垂体、胰腺、脑、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、副肾、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心脏等)或细胞等的多肽,其中SLC-1可以是任意一种多肽,只要它含有与SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列、而MCH只要含有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列均可。例如,本发明的SLC-1除了上述所说的多肽外,还可以是与SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽并具有基本相同活性的多肽。所述基本相同的活性,例如有配体结合活性、信号传导活性等。所说活性[基本相同]是指,配体结合活性等特性相同。因此,不管配体结合活性大小,多肽分子量的要素如何都不会影响其结合活性。所述本发明的MCH,除了是上述的多肽外,还可以是与SEQ IDNO:2所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽并具有基本相同活性的多肽。所述基本相同的活性,例如有受体结合活性等。所说活性[基本相同]是指,受体结合活性等特性相同。因此,不管受体结合活性大小,多肽分子量的要素如何都不会影响其结合活性。
本说明中的SLC-1及MCH按照惯例肽的标记描述,左端为N末端(氨基端),右端为C末端(羧基端)。例如SEQ ID NO:2、5或11所示多肽其C末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-),但是C末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。所示该酯的R有,例如,C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基;C3-8环烷基包括环戊基和环己基等;C6-12芳基包括苯基和a-萘基等;C7-14芳烷基如苯基-C1-2烷基或a-萘基C1-2烷基,其中苯基-C1-2烷基又如苯甲基、苯乙基、二苯甲基等;a-萘基C1-2烷基又如a-萘甲基等,此外还有通常适用于口服给药的酯如三甲基乙酰氧甲基。
本发明中所使用的SLC-1及MCH之盐可以与生理上可接受的碱(如碱金属)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐,优选生理上可接受的酸加成盐。这类的盐有,与无机酸(例如,盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐,或与有机酸(例如,乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明中所使用的SLC-1及MCH既可根据人或其它温血动物细胞或组织纯化多肽的公知方法(例如,FEBS Letters 398,253-258(1996)、WO96/18651号)来制备,也可以用随后叙述的合成方法制备蛋白质(多肽)。也可通过培养含有随后所述蛋白质(多肽)之编码DNA的转化体来制备。
当从人、温血动物、鱼类等组织或细胞中制备该蛋白质(多肽)时,首先将人或温血动物组织或细胞匀浆,然后用酸、有机溶剂等抽提,通过盐析、透析、凝胶过滤、反向层析、离子交换层析、亲和层析法等多种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。
如上所述,本发明中所使用的SLC-1及MCH可按照公知的蛋白质(多肽)合成方法制备,或可用适当的肽酶切割含有SLC-1和/或MCH的蛋白质(肽)来制备。其蛋白质(肽)的合成法,例如,可以用固相合成法和液相合成法的任意一种。即,当能够构成SLC-1和/或MCH的部分肽或氨基酸与其残余部分缩合,其产物有保护基时,通过除去保护基团可以制备目的蛋白质(肽)。此时的公知缩合方法或除去保护基团方法例如在下列1)-5)中均有描述:
1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti:肽的合成,Interscience Publishers,纽约(1966)
2)Schroeder和Luebke:肽,Academic Press,纽约(1965)
3)泉屋信夫等:多肽合成的基础与实验,丸善公司(1975)
4)矢岛治明和树原俊平:生物化学实验教材1,蛋白质化学IV,205(1977)
5)矢岛治明主编:药物开发续篇,卷14,肽合成,广川书店
还有,反应后将一般的纯化方法如,溶剂抽提法、蒸馏法、柱层析法、液体层析法、重结晶法等进行组合来纯化回收本发明的蛋白质(肽)。通过上述方法得到的蛋白质(肽)若为游离体时,按照公知方法可以适当转换为盐,相反获得其盐时按照公知方法也可以转化为游离体。
为了合成本发明SLC-1及MCH的酰胺物,可以使用可用于酰胺合成的市售的树脂。这类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂,4-甲基二苯甲胺树脂,PAM树脂,4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂,聚丙烯酰胺树脂,4-(2′,4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′,4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时,将那些α-氨基及其侧链上功能基团受到相应保护的氨基酸,在树脂上按目标多肽的序列顺序,用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时,将蛋白质(肽)从树脂上切除下来,同时除去各种保护基团,必要时在高度稀释溶液中实施分子内二硫键形成反应,以获得目标蛋白质(肽)。
进行上述受保护氨基酸的缩合反应时,可使用蛋白质(肽)合成的多种活化试剂,但优选使用碳二亚胺。其碳二亚胺有DCC、N,N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时,直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如,HOBt),或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯,然后添加到树脂上。适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于蛋白质(肽)缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等;卤化烃类如二氯甲烷和氯仿等;醇类如三氟乙醇等;亚砜类如二甲亚砜等;叔胺类如吡啶等、醚类如二恶烷和四氢呋喃等;腈类如乙腈和丙腈等;酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等;以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于肽成键反应的范围中选取,通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5~4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应程度;当所述缩合不充分时,可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时,用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化,以消除对后续反应的可能负影响。
用于该蛋白质(肽)合成时保护初始氨基的保护基团有,例如:Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基,三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基,以及Fmoc。其羧基的保护基团有,例如所述的C1-6烷基、C3-8环烷基、C7-14芳烷基、2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基,苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基以及三苯甲基酰肼基。
丝氨酸以及苏氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C1~6烷酰基如乙酰基,芳酰基如苯甲酰基,以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基。
适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有,例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基。
适于保护组氨酸中咪唑基的基团有,Tos、4-甲氧-2,3,6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
活化原料羧基的有,如对应的酸酐、迭氮基、活化酯[与乙醇(五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟甲基琥珀酰亚酰胺、N-羟甲基酞酰亚胺、HOBt)形成的酯]等。活化原料氨基的有与此对应的磷酸胺。
保护基的去除(脱离)方法有,在Pd-黑或Pd-碳等催化剂的存在下在氢气流中的催化还原反应;通过氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或它们的混合液进行酸的处理;二异丙烯乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的碱处理;通过液氨中的钠还原反应等等。上述酸处理的脱离反应一般在约-20℃~40℃的温度下进行,在酸处理作用中,添加如甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间苯甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1,4-丁二硫醇、1,2-乙二硫醇等阳离子捕集剂是有效的。组氨酸咪唑保护基所用的2,4-二硝基苯基通过硫代苯酚除去,色氨酸吲哚保护基的甲酰基除了所述1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇等存在下经过酸处理而脱离保护之外,也可以通过碱处理如氢氧化钠稀溶液、稀释氨等除去方法。
从公知的基团中适当选择与原料反应无关的官能团的保护及保护基以及其保护基的脱离,从公知方法中适当选择与反应有关的官能团的活化。
SLC-1及MCH胺物的其它获得方法有,如首先将羧基末端氨基酸的α-羧基胺基化保护再在氨基侧使肽链增加到所要求的长度,制造2种肽(或氨基酸),一种为该肽链N末端只除去α-氨基保护基,另一种为C末端除去羧基保护基,使这两种肽在所述混合溶剂中缩合。有关缩合反应的详细情况与前述一样。由缩合得到的保护肽经过纯化之后,按照上述方法除去所有的保护基,可以得到粗蛋白(肽)。这种粗蛋白(肽)通过各种纯化的已知方法,进行冻结干燥主要的组分进而得到蛋白质(肽)的胺物。
为获得SLC-1及MCH的酯物,将如羧基末端氨基酸的α-羧基与要求的乙醇类缩合转换为氨基酸酯后,再与蛋白质(肽)的胺物合成一样从而获得蛋白质(肽)的酯物。
作为本发明所使用的衍生物,可为任意的化合物,只要它们能与SLC-1结合的均可:①MCH的部分肽、②构成MCH的氨基酸缺陷的肽、由其它氨基酸附加到构成氨基酸的肽、构成的氨基酸被其它氨基酸置换的肽、或③MCH以及①中所述的部分肽或②中所述的肽被标记的。
具体地说,MCH的部分肽有,包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列从N末端第5位至第19位的部分序列的肽或其酰胺或其酯或其盐等。更具体地说,具有SEQ ID NO:19、20、21、22、23或24所示氨基酸序列的肽或其酰胺或其酯或其盐等。
为了用SLC-1进行随后所述的筛选,尤其优选使用具有SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的肽或其酰胺或其酯或其盐等。
另外,所述的构成MCH的氨基酸缺陷的肽、由其它氨基酸附加到构成氨基酸的肽、构成的氨基酸被其它氨基酸置换的肽为这样一种肽:在SEQID NO:2中缺失1或2个以上(优选1-10个,更优选1个或2个);或者,在其氨基酸序列中附加1或2个以上(优选1-10个,更优选1-5最优选1个或2个);或者,在其氨基酸序列中被其它氨基酸置换1或2个以上(优选1-10个,更优选1-5最优选1个或2个)。
该氨基酸序列中的氨基酸基本为相同的置换物,例如,其氨基酸可以在所属分类特性的范围内选择其它的氨基酸:例如(i)非极性(疏水性)氨基酸包括:丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等。(ii)极性(中性)氨基酸包括:甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等。(iii)带正电荷(碱性)氨基酸包括:精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。(iv)带负电荷(酸性)氨基酸包括:天冬氨酸、谷氨酸等。
但是,上面所说的用其它氨基酸置换或缺失,其缺失置换或缺失的位置优选在构成MCH的氨基酸中不包括Cys的位置。
上面所述MCH以及①中所述的部分肽或②中所述的肽被标记的事项,公知方法有,同位素标记、荧光标记(例如,由荧光素标记的)、生物素标记、酶标记等。
具体地说,例如,通过公知方法可以利用MCH等,该MCH被[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的。尤其是,用波尔栋-亨特试剂(ボルトン一ハンタ一)可以利用根据公知方法制备的MCH或它的衍生物的标记物。
作为该MCH或它的衍生物的标记物其实例为,
(5)[125I]-[N-(3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙酰基)-Leu5]-MCH(5-19)
(7)[125I]-[N-(3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙酰基)-Cys7]-MCH(7-19)其中最优选[125I]-[N-(3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙酰基)-Met4]-MCH(4-19)。
MCH或其衍生物的盐有与所述SLC-1及MCH的盐一样。
编码本发明SLC-1的DNA可以是下面情形的任何一种:其DNA具有编码蛋白质的碱基序列,其蛋白质含有与SEQ ID NO:5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列;而编码本发明MCH的DNA可以是下面情形的任何一种:其DNA具有编码肽的碱基序列,其肽含有与SEQ IDNO:2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。它们可以是基因组DNA、DNA基因文库、前述细胞·组织中的cDNA、前述细胞·组织中的cDNA文库、合成DNA。文库使用的载体包括噬菌体、质粒、粘粒、噬粒等。还有,从所述细胞·组织中制备的RNA组分,用该组分可以直接根据Reverse Transcriptase Polymerase chain Reaction(下文,简称RT-PCR法)进行扩增。
更具体地说,可以使用2种DNA,一种DNA是(1)在严谨条件下,与这样一种DNA序列杂交的DNA,即这样一种DNA序列是它具有编码蛋白质或肽的碱基序列,其蛋白质或肽含有与SEQ ID NO:2、5或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列;另一种DNA是(2)为了简并遗传密码,编码含有同一氨基酸序列的蛋白质或肽,但它不与(1)所具有的序列及由(1)所决定的序列形成杂合体。杂交可以用公知方法或其改良方法实施。其中所述严谨条件是指,例如42℃、50%甲酰胺4×SSPE(1×SSPE=150mMNaCl,10mM NaH2PO4·H2O,1mM EDTA pH7.4)、5×Denhart′s溶液、0.1%SDS。
编码本发明的SLC-1及MCH的DNA可以通过下面遗传工程的方法生产。
作为DNA的克隆方法(克隆化),该DNA完全编码本发明多肽,按照下列方法进行。即,首先合成含有部分本发明SLC-1及MCH的碱基序列的DNA,用该DNA作为引物,再根据公知的PCR法进行完全编码目的DNA的扩增,或者通过与标记物杂交筛选,此标记物是用,例如编码具有SLC-1及MCH的部分或全部的DNA片段或合成DNA,将其DNA片段插入到合适载体中的DNA文库。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等,冷泉港实验室出版社,1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
已经克隆的编码该SLC-1及MCH的DNA,既可单独使用,也可根据目的需要,在用限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在5′端包含ATG作为翻译起始密码子,而在3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可加上合适的合成DNA接头。
含有编码该SLC-1及MCH的DNA的表达载体可通过以下方法生产,例如,(a)从编码本发明的DNA上切下所需DNA片段,(b)将该DNA片段连接到一合适公知载体上的启动子下游。
可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如,pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如,pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如,pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等。本发明所使用的启动子可以是任意启动子,只要它能与所用基因表达宿主匹配。
如果转换的宿主为动物细胞时,分别优选SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子。当宿主为大肠杆菌属的细菌时,优选的启动子有trp启动子、T7启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时,优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时,优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH1启动子、GAL启动子等。在使用昆虫细胞作宿主时,优选多角体蛋白启动子、P10启动子。
表达载体除了上述之外根据需要还可以使用含有增强子、剪接信号、PolyA附加信号、选择标记物、SV40复制起点(以下简称为SV40ori)等的载体。其中选择标记物有二氢叶酸还原酶(以下简称为dhfr)基因[抗氨甲蝶呤(MTX)]、抗氨苄青霉素基因(以下简称为Ampr)、抗新酶素基因(以下简称为Neo、抗G418)等。尤其是用CHO(dhfr)细胞将dhfr基因作为选择标记物时又可以用不含腺嘌呤脱氧核苷来选择目的基因。
又,根据需要在本发明多肽或其部分肽的N-末端加上适合于宿主的信号序列。当宿主为大肠杆菌属细菌时,可以使用pho A信号序列、Omp A信号序列等;当宿主为杆菌属细菌时可以使用α-淀粉酶信号序列、枯草菌素信号序列等;当宿主为酵母菌时可以使用MFα信号序列、SUC2信号序列等;当宿主为动物细胞时可以使用胰岛素信号序列、α-IL信号序列、抗体分子信号序列等。
使用如此构建的、含有编码本发明SLC-1或MCH的DNA载体可以制造转化体。
其宿主有,如大肠杆菌属细菌、杆菌属细菌、酵母菌、昆虫细胞、昆虫、动物细胞等。
具体地说,其大肠杆菌属的例子有大肠杆菌(Eschericha cili)K12DH1[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60卷,160(1968)]、JM103[(Nucleic AcidsResearch),9卷,309(1981)]、JA221[(Joumal of Molecular Biology),120卷,517(1969)]、HB101[Journal of Molecular Biology),41卷,459(1969)]、C600[(Genetics),39卷,440(1954)]等。
其杆菌属有枯草杆菌(Bacills subtilis)MI114[Gene.24卷,255(1983)]、207-21[(Journal of Biochemistry),95卷,87(1984)]等。
其酵母菌有,例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。
昆虫使用的是家蚕的幼虫[前田等.Nature.315卷,592(1982)]。
其昆虫细胞有,例如病毒为AcNPV时从草地夜蛾幼虫(Spodopterafrugiperda cell,Sf)来的细胞系、从粉纹夜蛾中肠(Trichoplusia ni)来的细胞系MG1细胞、从粉纹夜蛾卵(Trichoplusia ni)来的High Five TM细胞、从Mamestrabrassicae来的细胞或从Estigmena acrea来的细胞等。病毒为BmNPV时有来自于蚕细胞系(Bombyx mori N,BmN细胞)等。该Sf细胞,还有如Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞(Vaughu,J.L. et al. In Vivo.13,213-217(1977))等。
动物细胞有,例如猴子细胞COS-7,Vero、中国仓鼠细胞CHO(以下简称为CHO细胞)、dhft基因缺陷中国仓鼠细胞CHO(以下简称为CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠3T3、小鼠骨髓瘤细胞、人HEK293细胞、293细胞、C127细胞、BALB373细胞、Sp-2/O细胞等。
为了转化大肠杆菌属细菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69卷2110(1972)]和[Gene,17卷,107(1982)]描述的方法进行转换。
为了转化杆菌属细菌按照[Molecular and General Genetics,168卷,11(1979)]描述的方法进行转换。
为了转化酵母菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75卷1929(1978)]描述的方法进行转换。
为了转化昆虫细胞或昆虫按照[Bio/Technology.6,47-55(1988)]描述的方法进行转换。
为了转化动物细胞按照[《病毒学》.52卷,456(1973)]苗述的方法进行转换。
受体细胞的载体导入法有,例如脂转染法[Felgner,P.L.et al.Proceedingsof The National Academy of Sciences of The United States of Ameriica,84,7413(1987)]、磷酸钙转染[Graham,F.L.and van der Eb,A.J.Virology,52,456-467(1973)]、电穿孔法[Nuemann,E.et al EMBO J.,1841-845(1982)]等。
由此,可以获得用含有本发明SLC-1或MCH之编码DNA的表达载体转化的转化体。
为使本发明SLC-1或MCH能稳定地进行基因表达采取利用动物细胞进行选择的方法,该方法是通过克隆选择筛选细胞的,即将已导入到上面所述动物细胞的表达载体整合到染色体上。具体地说,就是把上述所说的选择标记作为指标来选择转化体。如此地用选择标记获得的动物细胞,通过重复克隆选择能获得稳定的细胞系,这种细胞系具有高效表达本发明SLC-1或MCH的能力。当用dhfr基因作为选择标记时,培养时的MTX浓度为逐渐上升,通过选择抗耐性的细胞系,在细胞内同时与dhfr基因一起使编码本发明SLC-1或MCH的DNA扩增,也可获得更高效表达的动物细胞系。
在可以进行基因表达的条件下,培养由编码本发明SLC-1或MCH的NDA进行转化的所述转化体,通过生成、积累本发明SLC-1或MCH,可以制造本发明的SLC-1或MCH。
培养宿主为大肠杆菌属细菌、杆菌属细菌的转化体时,其培养基适用于液体培养基,该转化体的发育含有必要的碳源、氮源、无机物以及其它物质。碳源有葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等;氮源有铵盐、硝酸盐、玉米糊、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯提取液等无机或有机物质;无机物有氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。也可以添加酵母提取物、维生素、生长因子等。培养基的pH优选约为5-8。
大肠杆菌属细菌的培养基,优选M9培养基它含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸[米勒,Journal ofExperiments in Molecular Genetics,431-433,Cold SpringHarbor Laboratory,New Youk 1972]。根据需要,为使启动子更能发挥有效作用还可以添加如,3β-吲哚丙烯酸之类的药物。
当宿主为大肠杆菌属细菌时,转化体通常在15-43℃培养,时间约3-24小时,必要时可以通气或搅拌。
当宿主为杆菌属细菌时,转化体通常在30-40℃培养,时间约6-24小时,必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为酵母的转化体时,其培养基有Burkholder基础培养基[Bostian,K.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77卷,4505(1980)]或含有0.5%酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter,G.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81卷,5330(1984)]。培养基的pH优选为约5-8。转化体通常在20-35℃培养,时间约24-72小时,必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为昆虫细胞的转化体时,其培养基可以选用在Grace′s Insecl培养基[Gracc,T.C.C. Nature.195,788(1962)]中适当添加固相化10%牛血清等添加物。培养基的pH优选为约6.2-6.4。转化体通常在27℃培养,时间约3-5夭,必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为动物细胞的转化体时,其培养基包括含有约5-20%的胎牛血清的MEM培养基[Science,122卷.501(1952)]、RPMI1640培养基[TheJoumal of the American Medical Association.199卷,519(1967)]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73卷,1(1950)]等。培养基的pH优选为约6-8。转化体通常在30-40℃培养,时间约15-60小时,必要时可以通气或搅拌。
尤其是,用CHO(dhfr-)细胞及dhfr基因作标记时,优选使用DMEM培养基,它包含经过透析几乎不含胸腺嘧啶的牛胎血清。
为了从上述培养物中分离纯化本发明SLC-1或MCH可以采用以下方法实施。
当从培养菌体或细胞中提取本发明SLC-1或MCH时,最适宜的方法是,培养后通过公知方法收集菌体或细胞,将其悬浮于适当的缓冲液中,通过超声波、溶菌酶和/或反复冻融法等破碎菌体或细胞,经过离心沉淀和过滤得到本发明SLC-1或MCH的粗提取液。缓冲液中也可以加入蛋白变性剂如尿素和/或盐酸胍等,表面活性剂如Triton X-100等(注册商标。下文通常简称为TM)。
当本发明SLC-1或MCH被分泌在培养液中时,结束培养后,按照公知方法离心将菌体或细胞,使它们与上清液分开,收集上清液。
上清或包含在所获抽提物中的本发明SLC-1或MCH可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括:利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等;主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等;利用电荷差异的方法如离子交换层析等;利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等;利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等;利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳或层析聚焦等。
当如此获得的本发明SLC-1或MCH为游离形式时,可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反,当获得的本发明SLC-1或MCH为盐时,可用众所周知的方法或改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。
重组产生的本发明SLC-1或MCH,在纯化前或纯化后,可用相应蛋白修饰酶处理,从而使本发明SLC-1或MCH经适当修饰,部分去除一段蛋白质(肽)。这种蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。另外,为了切下N末端的氨基酸,可以使用公知的埃德曼降解法,该方法根据埃德曼(Edman)试剂(苯异硫氰酸)把末端氨基酸切下来。
如此产生的本发明SLC-1或MCH可以通过酶免疫测定法进行检测,该测定使用了特异性抗原。
下面,关于筛选化合物或其盐的方法和用于筛选化合物或其盐的试剂盒(下文,简化为本发明筛选方法、本发明筛选试剂盒)进行详细阐述,所述化合物或其盐能使MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化,该筛选方法的特征为,其应用MCH或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐;该试剂盒的特征为,其应用MCH或其标记物或其盐以及SLC-1或其盐。
或者使用SLC-1或其盐,或者使用与MCH或它的衍生物或其盐形成的结合测定系(配体-受体测定系),而所述MCH或它的衍生物或其盐是利用了由重组型SLC-1构建的表达系,由此可以筛选上面所述的、能使MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化的化合物(如,肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物等)或其盐。
这种化合物包括,具有SLC-1介导的细胞刺激活性(例如,促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性)的化合物;和不具有该细胞刺激活性的化合物(即SLC-1拮抗剂)。所谓[能使MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化]包含两种情况,一种情况是抑制MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合,另一种情况是促进MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合。
即,本发明提供一种筛选方法,该方法是筛选使本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化的化合物或其盐,其特征为,(i)使SLC-1或其盐同本发明MCH或其衍生物或其盐在接触时,和(ii)使所述的本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐同本发明MCH或其衍生物或其盐及待测化合物在接触时进行两者的比较。
在(i)和(ii)的情况下,本发明筛选方法有以下特征,例如,测定并比较其结合于该SLC-1或其盐的配体量或其细胞刺激活性。
更具体地,本发明提供了:
(1)一种筛选方法,该方法是筛选一种化合物或其盐,该化合物或其盐能使本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化,其特征为,使一标记的本发明MCH或其衍生物或其盐(当使用所述「被标记的MCH等或其盐」作为「MCH的衍生物或其盐」时,无须再标记。以下相同。)同所述SLC-1或其盐接触时,和使一标记的本发明MCH或其衍生物或其盐及待测化合物与SLC-1或其盐接触时,测定并比较同该SLC-1或其盐结合的标记本发明MCH或其衍生物或其盐的量;
(2)一种筛选方法,该方法是筛选一种化合物或其盐,该化合物或其盐能使本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化,其特征为,使一标记的本发明MCH或其衍生物或其盐同含有SLC-1的细胞或该细胞的膜级分接触时,和使一标记的本发明MCH或其衍生物或其盐及待测化合物与含有SLC-1的细胞或该细胞的膜级分接触时,测定并比较同该细胞或该细胞膜级分结合的标记本发明MCH或其衍生物或其盐的量;
(3)一种筛选方法,该方法是筛选一种化合物或其盐,该化合物或其盐能使本发明MCH或其衍生物或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化,其特征为,使一标记的本发明MCH或其衍生物或其盐同,通过培养含有编码SLC-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的SLC-1接触时,和使一标记的本发明MCH或其衍生物或其盐及待测化合物同,通过培养含有编码SLC-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的SLC-1接触时,测定并比较同该SLC-1结合的标记本发明MCH或其衍生物或其盐的量。
(4)一种筛选方法,该方法是筛选一种化合物或其盐,该化合物或其盐能使本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化,其特征为,使能活化SLC-1的化合物(例如,MCH或其衍生物或其盐)同含有SLC-1的细胞接触时,和能使活化SLC-1的化合物及待测化合物与含有SLC-1的细胞接触时,测定并比较SLC-1介导的细胞刺激活性(例如,促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性);以及
(5)一种筛选方法,该方法是筛选一种化合物或其盐,该化合物或其盐能使本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性发生变化,其特征为,使能活化SLC-1的化合物(例如,MCH或其衍生物或其盐)同,通过培养含有编码SLC-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的SLC-1接触时,和能使活化SLC-1的化合物及待测化合物同,通过培养含有编码SLC-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的SLC-1接触时,测定并比较SLC-1介导的细胞刺激活性(例如,促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的降低等的活性)。
下面进一步说明所述筛选方法。
首先,作为用于本发明筛选方法的SLC-1,只要其含有所述SLC-1的均可,但是优选含有SLC-1等的人、温血动物及鱼类脏器的细胞膜级分。然而人的脏器最难获得,因此用于本发明筛选方法的SLC-1等,通过重组体才适用于能大量表达人的SLC-1等。关于人型SLC-1,比较现有文献(FEBSLetters 398,253-258(1996))中的氨基酸序列所示的SLC-1,使用含有SEQ IDNO:11所示氨基酸序列的SLC-1可以进行高敏感度的筛选。
在生产本发明SLC-1时,可使用上述表达方法。
在本发明筛选方法中,当使用含有SLC-1的细胞或该细胞膜级分时,可以按照随后所述方法。
在使用含有SLC-1的细胞时,该细胞可用戊二醛、福尔马林等固定。固定方法可以按照公知的方法实施。
所述含有SLC-1的细胞是指,已表达SLC-1的宿主细胞,而该宿主细胞,包括所述的大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等等。
所述细胞膜级分是指,破碎细胞后,用众所周知的方法获得的含有大量细胞膜的级分。其中细胞破碎法包括,用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica公司产品)破裂、超声破裂、用Frenchpress加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜组分分离主要通过离心力来实现,如分级离心和密度梯度离心。例如,细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(正常为1-10分钟),得到的上清高速(15000-30000rpm)通常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的SLC-1以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。
在含有该SLC-1等的细胞和细胞膜级分中,SLC-1含量优选103-108分子/细胞,更优选105-107分子/细胞。随着表达量的增加,单位细胞膜级分的配体结合活性(比活)增加,因而不但可以构建高敏感筛选体系,而且可以在同一批获得大量的样品。
为了筛选使本发明MCH或其盐与SLC-1等之间的结合特性发生变化的化合物而进行所述的(1)-(3),需要合适的SLC-1级分和标记的本发明配体或有配体活性的化合物(MCH或其衍生物)。所述SLC-1级分优选天然的SLC-1级分,或与其具有同等活性的重组型SLC-1级分。此处术语“同等活性”是指在配体结合活性等同天然SLC-1所拥有的活性等同。作为标记的配体或有配体活性的化合物,有标记的配体或有配体活性的化合物(MCH或其衍生物)等。例如它们用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]等标记。尤其是利用,用试剂通过众所周知的方法而得到的MCH衍生物的标记物。
所述MCH衍生物的标记物的实例包括,例如,所述的(1)-(7)所示化合物。
具体地说,为了筛选使本发明MCH或其盐与SLC-1之间的结合特性发生变化的化合物,首先,将含有SLC-1的细胞或其膜级分悬浮于本方法的相应的缓冲液中,制备标准受体。可以使用任何缓冲液,只要它不干扰配体-受体结合。此类缓冲液有pH值约4-10(优选6-8)的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异结合,可任选在缓冲液中加入表面活性剂如CHAPS、Tween-80TM(Kao-Atlas公司)、毛地黄皂甘或脱氧胆酸。为了抑制蛋白酶对SLC-1或其衍生物的降解,可加入蛋白酶抑制剂如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute公司产品)和胃蛋白酶抑制剂。将一定量(5000-500000cpm)的标记的SLC-1或其衍生物加入到0.01-10ml的受体溶液中,同时还存在有10-4M-10-1μM的待测化合物。为了测定非特异性结合(NSB),需提供一个含有过量未标记的SLC-1或其衍生物反应管。在约0-50℃(优选约4-37℃)反应20分钟-24小时(优选30分钟-3小时)。在反应完成后,反应混合物用玻璃纤维滤纸等过滤,用适量的相同缓冲液洗涤。然后用闪烁计数器或λ-计数仪测定在玻璃纤维滤纸中的残留放射活性。在不存在拮抗物时,从其值(B0)中减去非特异结合值(NSB)而得到的(B0-NSB),作100%时,特异的结合量(B-NSB),可以以有抑制拮抗能力的增补物质进行选择,例如,抑制低于50%的待测化合物。
测定本发明SLC-1和MCH或其衍生物之间的结合方法可以使用BIAcore(Amerham Pharmacia Biotech公司产品)。在这个方法中,按照仪器所附说明书中的氨基结合法将MCH或其衍生物固定于传感器芯片上,在其传感器芯片上以2-20μl/分的流速使磷酸或Tris等的缓冲液通过,磷酸缓冲液包含膜级分I、或膜级分II以及待测化合物,膜级分I或含有SLC-1或含有的SLC-1是从含有SLC-1细胞或含有编码SLC-1的DNA的转化体纯化而来的;膜级分II或含有SLC-1或含有纯化的SLC-1。由于在传感器上MCH或其衍生物与SLC-1结合而使胞质团表面发生共鸣,同时存在的待测化合物也随之变化通过观察这种变化可以筛选使SLC-1和MCH之间的结合改变的化合物。该方法也可同样地进行下述的测定:将SLC-1固定于传感器芯片上,在其传感器上使含有MCH或其衍生物,或含有MCH或其衍生物及待测化合物的磷酸缓冲液或Tris缓冲液通过的方法。待测化合物与上面所述一样。
用于筛选使本发明MCH或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性改变的化合物用所述(4)-(5)的方法进行。可按照众所周知的方法或商品化的分析试剂盒来测定SLC-1介导的细胞刺激活性(例如,促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低的活性)。具体地说,首先,将包含SLC-1的细胞在多孔平板上培养。在筛选之前,先置换新鲜培养基或对细胞无毒的缓冲液,加入待测化合物并保温一定时间,然后提取细胞或回收上清将反应产物用各种方法进行定量。当利用细胞内的分解代谢酶测定作为细胞刺激活性指示剂的物质(例如花生四烯酸)的产生有困难时,可加入该分解代谢酶的抑制剂进行测定。可以检测cAMP产生的抑制活性等活性,作为细胞抑制活性,所述细胞受毛喉素等刺激而导致基本生产量增加。
测定细胞刺激活性而进行筛选时,需要合适的能表达SLC-1的细胞。其细胞优选具有所述重组型SLC-1表达细胞系,SLC-1表达转化体可以是稳定表达系或暂时性表达系。动物细胞可以使用所述的种类。
其中待测化合物包括,例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等。
关于所述配体-受体检测系统,具体地使用下述的检测系统。
(1)受体表达细胞若被受体激动剂刺激的话,细胞内的G蛋白被活化便与GTP结合。这种现象在受体表达细胞的膜级分中也能观察到。通常地,GTP加水分解生成GDP,而在反应液中事先添加GTPγS,则GTPγS与GDP同样结合到G蛋白上,但不加水分解而是保持与含有G蛋白的细胞膜结合的状态。若用标记的GTPγS通过检测残存在细胞膜上的放射性活性可以测定受体激动剂对受体表达细胞刺激的活性。利用该反应,可以测定MCH或其衍生物对SLC-1表达细胞的刺激活性。该方法并不是如所述的(4)-(5)使用含有SLC-1细胞,而是像所述(1)-(3)一样是使用含有SLC-1膜级分的检测法,但是该方法是如所述(4)-(5)测定细胞刺激活性的,在本测定法中,显示对SLC-1膜级分促进GTPγS结合活性的物质是激动剂。具体地说,可根据随后所述实施例9、实施例16以及它们的改良法进行实施。在此,添加MCH或其衍生物,或者添加MCH或其衍生物以及待测化合物,与单独添加MCH或其衍生物进行比较,通过观察GTPγS与SLC-1细胞膜级分产生促进结合活性的变化可以筛选使MCH与SLC-1之间的结合改变的化合物。此时可以选择能显示MCH或其衍生物对SLC-1细胞膜级分促进GTPγS结合活性的化合物作为有拮抗抑制能力的增补物质。另一方面,只仅待测化合物,也可通过观察GTPγS与SLC-1细胞膜级分产生促进结合活性的变化可以筛选激动剂。
下面更具体地叙述有关筛选法的例子。根据下面将要叙述的实施例9或实施例16的方法制备的人或大鼠含有SLC-1的细胞膜级分,用稀释膜的缓冲液(50mM Tris,5mM MgCl2,150mM NaCl,1μMGDP,0.1%BSA pH7.4)稀释该膜级分。稀释度因受体表达的量而不同。将稀释的膜级分各自装入0.2ml的Falcon中,加MCH或其衍生物或者加MCH或其衍生物以及待测化合物,再加[35S]GTPγS使终浓度为200Pm。25℃保温1小时后,再加冰冷却的洗涤缓冲液(50mM Tris,5mM MgCl2,150mM NaCl,0.1%BSA,0.05%CHAPS pH7.4 1.5ml),用玻璃纤维滤纸GF/F过滤。65℃保温30分钟,干燥后用闪烁计数器测定残留在滤纸上的膜级分中[35S]GTPγS放射活性。将只加有MCH或其衍生物实验组的放射活性作为100%,没有加MCH或其衍生物实验组的放射活性作为0%,求出MCH或其衍生物对GTPγS与待测化合物结合促进活性的影响。例如,GTPγS结合促进活性低于50%时,可选择待测化合物作为具有拮抗抑制能力的增补物质。
(2)SLC-1表达细胞由于MCH刺激而使细胞内cAMP的量减少。利用该反应可以测定MCH对SLC-1表达细胞的刺激活性。
只要能够使SLC-1表达的动物细胞,例如对小鼠、大鼠、兔、山羊、牛等进行免疫而获得抗cAMP抗体和125I标记cAMP(均为厂家商品),其细胞中cAMP的产量可以通过这种厂家产品进行测定,当然这种测定也适用于RIA或抗cAMP抗体与标记cAMP组合的EIA。另外,使用针对蛋白A或针对用于产生抗cAMP抗体的动物IgG等的抗体,根据SPA法对抗cAMP抗体进行定量,即SPA法使用含有固相闪烁体珠子和125I标记cAMP(Amerham Pharmacia Biotech制作的试剂盒)。
测定cAMP产生抑制的活性更详细的情况依据下面将要阐述的实施例14及其改进方法。在这个检测体系中,由配体来提高细胞内cAMP水平,该配体应为如毛喉素或降钙素等,它是一种能使细胞内cAMP水平提高的配体,通过添加MCH或其衍生物,或者添加MCH或其衍生物以及待测化合物可以观察到细胞内cAMP水平的变化,这种变化是由于仅仅投药MCH或其衍生物而产生的抑制细胞内cAMP的水平,进而可以筛选能使MCH与SLC-1之间的结合发生变化的化合物。同时,可以选择一种化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。这种化合物通过MCH或其衍生物的刺激显示了对SLC-1表达细胞产生cAMP抑制活性。另外,通过只添加待测化合物来研究cAMP产生抑制活性,由此可以筛选具有激动剂活性的化合物。
下文较详细地阐述筛选方法。以每孔细胞密度为5×104个,将CHO/SLC-1细胞播种于24孔平板上,培养48小时。用含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤(下文,将含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称作反应缓冲液)细胞。然后加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。除去反应缓冲液,加入新的反应缓冲液0.25ml之后,再给细胞添加0.25ml的2μM毛喉素反应缓冲液,该缓冲液已加有1nM的MCH或其衍生物或者1nM的MCH或其衍生物以及待测化合物,37℃下反应24分钟。再加100μl的20%高氯酸停止反应,接着于冰块上放置1小时,进而提取细胞内cAMP。用cAMP EIA试剂盒(AmerhamPharmacia Biotech)测定提取液中的cAMP的量。用毛喉素刺激产生cAMP的量看作100%,而用1nM的MCH或其衍生物产生抑制cAMP的量看作0%,求出待测化合物对由MCH或其衍生物的刺激而产生cAMP抑制活性的影响。待测化合物抑制MCH或其衍生物的活性使cAMP产生活性例如不低于50%可以选择待测化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。
为了测定促进cAMP产生活性,使用上述方法定量在不添加毛喉素而添加待测化合物的CHO/SLC-1细胞中所产生的cAMP。
(3)将含有应答元件(CRE)的DNA,导入ピッカジ-ンベィッック载体或ピッカヅ-ン增强子载体(东洋Ink株式会社生产)的荧光素酶基因上游的多克隆位点上,以此作为CRE-报道基因载体。在转染的CRE-报道基因载体细胞中,随着cAMP的水平提高,进而刺激诱导CRE介导的荧光素酶基因表达和表达后的荧光素酶蛋白质的产生。也就是说,通过测定荧光素酶的活性可以检测细胞内导入CRE-报道基因载体而引起cAMP量的变化。将CRE-报道基因载体转染到SLC-1表达细胞利用这种细胞可以筛选能使MCH与SLC-1的结合发生改变的化合物。具体筛选方法如下。
以每孔为5×103个细胞密度将转染CRE-报道基因的SLC-1表达细胞播种于24孔平板上,培养48小时。用含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤(下文,将含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPESHank′s缓冲液(pH7.4)称作反应缓冲液)细胞。然后加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。除去反应缓冲液,加入新的反应缓冲液0.25ml之后,再给细胞添加0.25ml的2μM毛喉素反应缓冲液,该缓冲液已加有1nM的MCH或其衍生物或者1nM的MCH或其衍生物以及待测化合物,37℃下反应24分钟。用ピッカヅ-ン细胞溶解剂(东洋Ink株式会社生产)使细胞溶解,在溶解液中添加发光基质(东洋Ink株式会社生产)。用发光光度计、闪烁计数器或 计数器测定荧光素酶发出的光。能使MCH与SLC-1的结合发生改变的化合物并产生了影响可以通过比较仅投药MCH或其衍生物来测定荧光素酶发出光的大小。同时,由于MCH或其衍生物的投药而抑制了由于毛喉素刺激而增加发光强度,但可以将能够使这种抑制得到恢复的化合物选作具有抑制拮抗能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物同投药MCH或其衍生物一样由于毛喉素刺激而增加发光强度,进而观察到有同样的抑制作用,由此可以筛选激动剂。
作为报道基因可以使用例如除了荧光素酶还有碱性磷酸酶、氯霉素-乙酰基转移酶或β-半乳糖苷酶。这些报道基因的基因产物酶活性如下所述用厂家的测定试剂盒能简单地测定。例如碱性磷酸酶的活性用和光纯药生产的Lumi-phos 530、氯霉素-乙酰基转移酶(chlormphenicol acetyltransferase)活性用和光纯药生产的FAST CAT Chlormphenicol Acetyltransferase AssayKIT、β-半乳糖苷酶活性用和光纯药生产的AuroraGal-XE测定。
(4)SLC-1表达细胞受到MCH刺激后将花生四烯酸代谢产物释放于细胞外。事先将有放射活性的花生四烯酸摄取细胞内再将该活性释放于细胞外,可以测定其放射活性。测定方法可以根据随后所述实施例6以及其改良方法。添加MCH或其衍生物或者添加MCH或其衍生物以及待测化合物,研究MCH或其衍生物对花生四烯酸代谢产物释放活性的影响,由此可以筛选影响于MCH与SLC-1之间结合的化合物。由于MCH或其衍生物的刺激使花生四烯酸代谢产物释放,抑制这种活性的化合物将作为筛选有拮抗抑制能力的增补物质。另外,仅添加待测化合物,用随后所述改良的实施例6方法研究SLC-1表达细胞释放花生四烯酸代谢产物活性,由此可以筛选具有激动剂活性的化合物。这种筛选化合物的方法通过下面具体阐述。
以每孔为5×104个细胞密度将CHO/SLC-1细胞播种于24孔平板上,培养24小时后,加[3H]花生四烯酸使每孔为0.25μCi。添加[3H]花生四烯酸16小时之后,用含有0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞,各孔添加500μl的缓冲液,该缓冲液含有终浓度为10nM的MCH或其衍生物或者10nM的MCH或其衍生物以及待测化合物,这些化合物溶于含有0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)。以下,将含有0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称作反应缓冲液。37℃下保温60分钟。然后将400μl的反应液加入闪光剂中,用闪光计数器测定释放于反应液中的[3H]花生四烯酸代谢物的产量。将未添加有MCH或其衍生物的反应缓冲液的培养基中[3H]花生四烯酸代谢物的产量看作0%,将添加10nM的MCH或其衍生物的培养基中[3H]花生四烯酸代谢物的产量看作100%,求出待测化合物对MCH或其衍生物与SLC-1之间结合的影响。花生四烯酸代谢产物活性如果低于50%,可以将待测化合物选作具有拮抗抑制能力的增补物质。
(5)SLC-1表达细胞通过MCH刺激使细胞内Ca离子浓度增大,由此可以研究待测化合物对MCH与SLC-1之间结合的影响。
将SCL-1表达细胞播种于灭菌的显微镜用盖玻片,2天后,将培养液置换于悬浮的4mM Fura-2 AM(同仁化学研究所)HBSS,室温放置2小时30分。用HBSS洗涤后,将盖玻片放入比色杯中,用荧光测定仪测定505nm荧光强度比之差,这是在激发波长为340nm及380nm的情况下测定的,同时加入MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待测化合物。这时比较仅投药MCH或其衍生物产生荧光强度的变化,根据测定添加待测化合物而产生的荧光强度的变化可以筛选对MCH和SLC-1之间结合产生影响的化合物。如下所述,还可使用FLIPR(モレキュラ-デバィス公司产品)装置进行筛选。即,细胞悬浮液含有Fluo-3M(同仁化学研究所监制),经过细胞吸收之后,离心,洗涤数次上清液后,将细胞播种于96孔平板之上。放入FLIPR装置中,同Fura-2一样加入MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待测化合物。这时比较仅投药MCH或其衍生物产生荧光强度的变化,根据测定添加待测化合物而观察到的荧光强度的变化可以筛选对MCH和SLC-1之间结合产生影响的化合物。在这些情况下,将由于添加MCH或其衍生物而抑制荧光强度增大的化合物选作具有拮抗抑制能力的增补物质。另一方面,也可根据由于仅添加待测化合物而增大荧光强度来筛选激动剂。
如水母发光蛋白一样随着细胞内Ca离子浓度的增大而发光,首先使这样的蛋白质基因在SLC-1细胞中同时表达,随着细胞内Ca离子浓度的增加,水母发光蛋白与Ca结合形成结合蛋白而发光,利用这个特点,添加MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待测化合物,然后与仅投药MCH或其衍生物进行比较,通过测定添加待测化合物而产生发光强度的变化,可以筛选对MCH和SLC-1之间结合产生影响的化合物。其筛选方法同上,但没有吸收荧光物质的除外。
(6)众所周知,在能够表达受体的细胞中添加受体激动剂,细胞内肌醇三磷酸浓度增大。MCH的刺激观察到SLC-1细胞产生所述的反应,由此可以筛选对MCH和SLC-1之间结合产生影响的化合物。将细胞播种于24孔平板上,给培养第一天的细胞添加肌醇[2-3H](2.5μCi/Well),在培养基中充分清洗培养1天的细胞,然后,再添加MCH或其衍生物或者加入MCH或其衍生物以及待测化合物,之后加10%的高氯酸停止该反应。用1.5M KOH、60mM HEPES溶液中和,再过0.5ml的Aglx8树脂柱(Bio-Rad),用5mMNa2BO3 60mMHCOONH4洗涤,再用闪烁计数器测定用1MHCOONH4 0.1MHCOOH洗脱的放射活性。将未添加有MCH或其衍生物的反应缓冲液的培养基中放射活性看作0%,将添加有MCH或其衍生物的培养基中放射活性看作100%,求出待测化合物对MCH或其衍生物与SLC-1之间结合的影响。肌醇三磷酸产生活性如果低于50%,可以将待测化合物选作具有拮抗抑制能力的增补物质。
(7)将含有佛波酯应答元件(TRE)的DNA,导入ピ ッカヅ-ンベィッック载体或ピッカヅ-ン增强子载体(东洋Ink株式会社生产)的荧光素酶基因上游的多克隆位点上,以此作为TRE-报道基因载体。在转染的TRE-报道基因载体细胞中,随着cAMP的水平提高,进而刺激诱导TRE介导的荧光素酶基因表达和表达后的荧光素酶蛋白质的产生。也就是说,通过测定荧光素酶的活性可以检测细胞内转染TRE-报道基因载体而引起cAMP量的变化。将TRE-报道基因载体转染到SLC-1表达细胞利用这种细胞可以筛选能使MCH与SLC-1的结合发生改变的化合物。具体筛选方法如下。
以每孔为5×103个细胞密度将转染TRE-报道基因的SLC-1表达细胞播种于24孔平板上,培养48小时。用含有0.05%的BSA和20mM的HEPESHank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞。添加10nM的MCH或其衍生物或者添加10nM的MCH或其衍生物以及待测化合物,37℃下反应60分钟。用细胞溶解剂(东洋Ink株式会社生产)使细胞溶解,在溶解液中添加发光基质(东洋Ink株式会社生产)。用光度计、液体闪烁扫描计数器或计数器测定荧光素酶发出的光。能使MCH与SLC-1的结合发生改变的化合物并产生了影响可以通过比较仅投药MCH或其衍生物来测定荧光素酶的发光量。同时,由于MCH或其衍生物的投药使细胞内Ca离子浓度提高进而增加了发光量,但是能够抑制这种增加发光量的化合物,可选作具有拮抗抑制能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物同投药MCH或其衍生物一样观察到发光量的增加,可以筛选激动剂。
作为报道基因可以使用例如除了荧光素酶,还有碱性磷酸酶、氯霉素-乙酰基转移酶或β-半乳糖苷酶。这些报道基因的基因产物酶活性如下所述,用厂家的测定试剂盒能简单地测定。例如碱性磷酸酶的活性用和光纯药生产的Lumi-Phos 530、氯霉素-乙酰基转移酶(chlormphenicolacetyltransferase)活性用和光纯药生产的FAST CAT chlormphenicolAcetyltransferase Assay KIT、β-半乳糖苷酶活性用和光纯药生产的AuroraGal-XE测定。
(8)对MCH产生效应的SLC-1表达细胞由于MAP激酶的激活而观察到了增殖。根据MAP激酶的激活、胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入、细胞数的计测(MTT等)可以检测其增殖情况。由此可以对能够改变MCH或其衍生物与SLC-1结合的化合物进行筛选。
有关MAP激酶活性的检测,是将MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待测化合物添加于细胞内,然后从细胞溶解液中获得抗MAP激酶抗体,经过免疫沉淀法得到MAP激酶级分,再使用例如,和光纯药生产的MAP Kinase Assay Kit和γ-[32P]-ATP很容易检测到MAP激酶活性。有关掺入胸腺嘧啶脱氧核苷活性的检测,首先播种SLC-1表达细胞,将MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待测化合物添加于细胞内,然后加[methyl-3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷,溶解该细胞,根据闪烁计数器的计数来检测掺入细胞内标记胸腺嘧啶脱氧核苷的放射性。
有关SLC-1表达细胞增殖的检测,首先播种表达细胞,再添加MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待测化合物于细胞内,进而添加MTT[(3-4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑嗡溴化物],MTT被细胞吸收后由MTT变为MTT甲臜,用盐酸使MTT甲臜酸化并同异丙醇一起溶解细胞,然后在570nm吸收波长处进行测定,进而检测细胞的增殖情况。
利用掺入的标记胸腺嘧啶脱氧核苷活性来筛选能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物,具体筛选过程如下:
在24孔平板上每孔播种5000个SLC-1表达细胞,培养1天。再在不含血清的培养基中培养2天,使细胞处于饥饿状态。给细胞添加MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待测化合物,培养24小时,再在每个孔里添加0.015MBq的[methyl-3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷,培养6个小时。用PBS洗涤细胞,然后加入甲醇放置10分钟。加5%三氯醋酸放置15分钟后,用蒸馏水将固定的细胞洗涤4次。再用0.3N氢氧化钠溶液溶解细胞,用闪烁计数器测定溶解液中的放射活性。有关检测能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物带来的影响,主要通过:只给药MCH或其衍生物,并比较掺入的胸腺嘧啶脱氧核苷使放射活性增大,这时由于给药MCH或其衍生物而使放射活性增大,但是所述化合物抑制了这种放射活性的增加,进而可以选择该化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物其效果与投药于MCH或其衍生物相同,并观察到放射活性的增加,由此可以进行激动剂的筛选。
(9)若添加MCH于SLC-1表达细胞,K离子通道被激活,细胞内的K离子被释放到细胞外。K离子和同族元素的Rb离子通过与K离子无区别的K离子通道释放到细胞外,因此加入标记的Rb(86Rb)使细胞吸收,然后通过MCH刺激测定释放出来的(86Rb),由此可以检测MCH的作用。利用(86Rb)释放活性来筛选能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物,具体筛选过程如下:
播种于24孔平板上将培养2天的SLC-1表达细胞于含有1mCi/ml培养基中保温2小时。充分洗涤培养基,完全清除细胞外溶液中的86RbCl,添加MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待测化合物,30分钟后回收细胞外溶液,用γ计数器测定放射活性。有关检测能使MCH或其衍生物与SLC-1结合发生改变的化合物带来的影响,主要通过:只给药MCH或其衍生物,并比较由于[86Rb]的释放使放射活性增强,这时由于给药MCH或其衍生物而使放射活性增大,但是所述化合物抑制了这种放射活性的增加,进而可以选择该化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物其效果与投药于MCH或其衍生物相同,并观察到放射活性的增加,由此可以进行激动剂的筛选。
(10)利用Cytosensor装置(モレキュラ-デバィス公司产品)测定由于SLC-1表达细胞与MCH反应而引起细胞外pH(acidification rate)的变化,由此可以测定MCH的活性。用Cytosensor装置测定细胞外pH的变化可以筛选能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物,具体筛选过程如下:
在Cytosensor装置内的胶囊中过夜培养SLC-1表达细胞,其容器中待细胞外pH稳定以后,灌注含有0.1%BSA的RPMIl640培养基(モレキュラ-デバィス公司产品)约2个小时。待pH稳定后,将含有MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物及待测化合物的培养基灌注于细胞之上,由此测定培养基的pH变化。有关检测能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物带来的影响,主要通过:只给药MCH或其衍生物,并比较由于SLC-1表达细胞的细胞外pH变化,这时由于给药MCH或其衍生物而使细胞外pH变化,但是所述化合物抑制了这种放射活性的增加,进而可以选择该化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物其效果与投药于MCH或其衍生物相同,并观察细胞外pH变化,由此可以进行激动剂的筛选。
(11)酵母(Saccharomyces cerevisiae)的单倍体交配型(hapoidα-matingType)(MATα)的性信息素受体STe2与G蛋白Gpal结合,应答于性信息素α-交配因子(mating factor)并激活MAP激酶,以下,Farl(细胞周期停滞、cellcycle arrest)以及转录活化因子Ste12被激活。Ste12诱导各种蛋白质的表达,其蛋白质含有与接合有关的FUS1。另一方面,调节因子Sst2具有抑制以上过程的功能。在这个抑制系统中,形成转导受体基因的酵母,根据受体激动剂的刺激,激活酵母细胞内信号传导系,可以尝试构建受体激动剂与受体之间的反应测定体系,这个体系中利用了刺激结果而产生的增殖等指标[Pausch,M.H.,Tredns in Biotechnology,vol.15,pp.487-494(1997)]。利用如此构建的转导受体基因酵母的体系,可以进行筛选能使MCH与SLC-1之间结合特性发生变化的化合物。
除去编码MATα酵母的Ste2以及Gpal的基因,取而代之的是导入SLC-1基因以及编码Gpal-Gai2结合蛋白的基因。除去编码Far基因以不使细胞周期停滞(cell-cycle arrest),再除去编码Sst的基因,由此可以使应答于MCH的敏感性增强。将合成组氨酸的基因HIS3与FUS1连接而转导FUS1-HIS3基因。这些基因重组的操作过程依照例如,Price等[Price,L.A.et al.,Molecurlar and Cellular Biology,vol.15,PP.6188-6195(1995)]所述的方法,通过将生长释放抑制激素受体2型(SSTR2)基因置换为SLC-1,进而可以简便地进行基因重组。这样所构建的酵母性状改变对SLC-1的配体即MCH敏感度很高,其结果是,激活MAP激酶产生合成组氨酸的酶,在缺乏组氨酸的培养基中可以生长发育。根据这个酵母在缺乏组氨酸的培养基中发育的一个指标,可以观察到对MCH而产生效应的SLC-1表达酵母。下面,阐述筛选能使MCH与SLC-1之间结合特性发生改变的化合物。
如上所述,将性状改变的酵母过夜培养于完全为合成的培养基中即,液体培养基,加入已不含组氨酸的溶解琼脂培养基,其浓度为2×104cell/ml,并播种于9×9cm的角形平板上。琼脂固化后,将浸透有MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物以及待测化合物的灭菌滤纸覆盖于琼脂表面之上,30℃下培养3天。有关检测能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物而带来的影响,主要通过:只给药MCH或其衍生物,并比较由于滤纸周围酵母的生长发育,这时由于给药MCH或其衍生物而使酵母的生长发育,但是所述化合物抑制了这种生长发育,进而可以选择该化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物其效果与投药于MCH或其衍生物相同,并观察酵母的生长发育,由此可以进行激动剂的筛选。还有,事先添加MCH或其衍生物于琼脂培养基中,仅使灭菌的滤纸浸透有待测化合物并进行培养,在整个平板上观察到滤纸周围受到酵母发育的影响,由此也可以研究使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物而带来的影响。
(12)将SLC-1的RNA注入到非洲爪蟾卵母细胞中,若用MCH刺激,细胞内Ca离子浓度增大,产生氯化钙活化流(Calcium-activated chloridecurrent)。进而可以形成膜电位的变化(与K离子浓度梯度变化相同)。根据在由MCH而转导SLC-1非洲爪蟾的卵母细胞中观察到这种反应,由此可以筛选使MCH与SLC-1之间结合给予变化的化合物。
因冷冻而不能活动的雌性非洲爪蟾,从中取出卵母细胞块,将卵块溶于MBS(88mM NaCl,1mM KCl,0.41mM CaCl2,0.33mM Ca(NO3)2,0.82mM MgSO4,2.4mM NaHCO3,10nM HEPES,pH7.4),其中含有胶原酶(0.5mg/ml)待卵块溶化后,于19℃,用150rpm处理1-6个小时。把细胞外溶液换成MBS液,再洗涤3次,用显微操作器将poly(A)+SLC-1cDNA(50ng/50nl)进行显微注射。SLC-1 mRNA或者取自于组织和细胞、或者在体外由质粒转录形成。将SLC-1 mRNA于MBS溶液中20℃下培养3天。将它放入voltage clamp装置的凹处,用林格溶液(Ringer液)冲洗,再将用于固定电位的玻璃微电极、用于测定电位的玻璃微电极插入细胞内,负极置于细胞外。待电位平稳后,用含有MCH或其衍生物、或者MCH或其衍生物以及待测化合物的林格溶液(Ringer液)冲洗,记录电位变化。有关检测能使MCH与SLC-1结合发生改变的化合物而带来的影向,主要通过:只给药MCH或其衍生物,并比较转导SLC-1非洲爪蟾卵母细胞,这时由于给药MCH或其衍生物而引起卵细胞膜电位的变化,但是所述化合物抑制了这种生长发育,进而可以选择该化合物作为具有抑制拮抗能力的增补物质。另一方面,只投药待测化合物其效果与投药于MCH或其衍生物相同,并观察到细胞膜电位的变化,由此可以进行激动剂的筛选。
在这个体系中,也可以导入各种G蛋白基因的poly(A)+RNA,以增大变化量使反应更容易进行测定。如水母发光蛋白在Ca存在的情况下,进行共同注射带有发光性质蛋白基因的poly(A)+RNA,由此可以观察到没有膜电位变化的发光现象也可以测定该反应。
筛选能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变的化合物或其盐的试剂盒包括,SLC-1或其盐、或含有SLC-1的细胞、或者含有SLC-1的细胞膜级分、以及MCH或其衍生物或其盐。
本发明筛选试剂盒包括如:
1.用于筛选的试剂
(1)用于分析和冲洗的缓冲液
加有0.05%牛血清白蛋白(Sigma公司)的Hank’s平衡盐溶液(Gibco公司产品)。
溶液用0.45μm孔径滤膜过滤灭菌并在4℃贮存。或可以在临用时配制。
(2)SLC-1标样
将表达SLC-1的CHO细胞在12孔板上传代培养,每孔5×105细胞,37℃,5%CO2和95%空气保温培养两天。
(3)标记的配体
用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]标记本发明的MCH。
溶于适当的溶剂或缓冲液中,并将其保存在4℃或-20℃。溶液在使用时用分析缓冲液稀释到1μM。
(4)体标准液
将MCH溶解于含有0.1%牛血清白蛋白(Sigma公司)的PBS使之浓度为1mM,-20℃保存。
2分析方法
(1)用于表达SLC-1的CHO细胞在12孔板上进行培养。在用1ml的用于分析的缓冲液洗涤2次后,每孔加入490μl该缓冲液。
(2)加5μl的10-3M-10-10M的待测化合物,向所述系统中加5μl的标记MCH,得到的混合液在室温保温1小时。为了测定非特异结合,在所述系统中加5μl的10-3M的配体(MCH)而不是待测化合物。
(3)除去孔中的反应混合液,将培养孔洗涤3遍,每次均用1ml的洗涤液。用0.2NNaOH-1%SDS溶解与细胞结合的标记配体(MCH),然后与4ml的液闪剂A(和光纯药公司产品)混合。
(4)用闪烁计数器(Beckman公司产品)测定放射性。其最大结合量用下式求得:
PMB=[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
PMB:最大结合百分率
B :加样时的值
NSB:非特异结合量
B0 :最大结合量
利用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐是一种能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合改变(抑制或促进结合)的化合物,具体地说,它们是一种介导SLC-1刺激细胞活性(所谓的SLC-1激动剂)、或者非刺激细胞活性(所谓的SLC-1拮抗剂)的化合物或其盐。所述这种化合物为肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵化合物等,这些化合物有新的或已知的。
评价上面所述的化合物是激动剂还是拮抗剂,其具体方法如(i)或(ii)。
(i)用上面所述(1)-(3)的筛选方法实施的结合测定,得到能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性改变(特别是抑制结合)的化合物,然后测定该化合物介导SLC-1是否具有刺激细胞的活性。若具有细胞刺激活性的化合物或其盐则为SLC-1激动剂,若该化合物不具有细胞刺激活性的化合物或其盐则为SLC-1拮抗剂。
(ii)(a)让待测化合物与含有SLC-1的细胞接触,测定介导上述SLC-1的细胞刺激活性,若有活性的话,则为SLC-1激动剂。(b)让能激活SLC-1的化合物(例如,本发明的多肽或SLC-1激动剂等)与含有SLC-1的细胞接触,同时让能激活SLC-1的化合物以及待测化合物与含有SLC-1的细胞接触,来测定并比较介导SLC-1的细胞刺激活性。能够使由激活SLC-1的化合物而引起细胞刺激活性的改变,若降低细胞刺激活性的化合物或其盐则为SLC-1拮抗剂。
该SLC-1激动剂同MCH或其盐一样对SLC-1具有生理活性,因此,SLC-1激动剂同MCH或其盐一样,安全低毒适用作药物。
相反,SLC-1拮抗剂可以抑制MCH或其盐对SLC-1产生的生理活性,因此,SLC-1拮抗剂可作为抑制该受体活性的一种药物,这种药物既安全又低毒。
MCH或其盐与增进食欲(摄食)作用以及促进催产素分泌作用等有关,因此可以用作增加食欲(摄食)的药物或促进催产素分泌的药物等,用所述筛选方法或筛选试剂盒得到该化合物,其中SLC-1激动剂除了用作增加食欲(摄食)药物外,还可用作如下病症的治疗或预防药物等,如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积、食欲不振如神经性食欲不振等以及伴随着食欲不振的贫血、低蛋白病症等。SLC-1拮抗剂除了用作治肥胖病的制剂(药物)、调节食欲(摄食)不振的制剂外,还用作激烈阵痛、强直性子宫收缩、胎儿窒息、子宫破裂、颈管裂伤、早产、普-威综合征、糖尿病及其合并症(糖尿病性肾病、糖尿病性网膜炎、糖尿病性神经障碍等)、高血压、高血脂、冠状动脉硬化、痛风、呼吸系统疾病(Pickwick综合征、睡眠时无呼吸综合征)、脂肪肝、不孕症、变形性骨关节病等(尤其是治肥胖病的制剂(药物)、调节食欲(摄食)的制剂等)。
用上述筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物之盐可以使用药学上可接受的盐。例如有无机碱形成的盐、有机碱形成的盐、无机酸形成的盐、有机酸形成的盐、碱性或酸性氨基酸形成的盐。
与无机碱形成合适的盐有例如,碱金属盐如钠盐、钾盐等;碱土类金属盐如钙盐、锰盐等;还有铝盐、铵盐等。
与有机碱形成合适的盐有例如,与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺、N,N-二苄基乙二胺等形成的盐等。
与无机酸形成合适的盐有例如,与盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等形成的盐。
与有机酸形成合适的盐有例如,乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸形成的盐等。
与碱性氨基酸形成合适的盐有例如,精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐,与酸性氨基酸形成合适的盐有例如,天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐等。
用本发明筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐用作上述医药产品时,实施方法同所述本发明多肽一样。
将本发明通过筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐用作所述医药产品使用时,可以按照常规方法实施。例如,必要时加糖衣或肠溶性糖衣制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服,或以可注射型制剂如无菌溶液或悬浮在水或其它可药用液体中的悬浮液形式经非胃肠道给药。例如,该化合物或其盐与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成药剂常用的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。
可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括,粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶;赋形剂如结晶纤维素;膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸;润滑剂如硬脂酸镁;甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精;加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当单位剂型为胶囊形式时,可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物,例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体,如注射用的水溶液来制备药物。
用于注射的液体介质之例包括,生理盐水、包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氮化钠等)的等渗溶液,并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油,它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。
此外,也可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的无菌安瓿中。
如此所获制剂安全、低毒,因此可投药于人或其它哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、黑猩猩等)。
本发明用筛选方法或筛选试剂盒得到化合物或其盐的给药剂量视病症情况而定,当口服给药时,一般成年人(体重60kg),一次正常剂量为,大约0.1-1000mg,优选大约1.0-300mg,更优选3.0-50mg。当非胃肠道给药时,其一次投药量视给药对象、受体器官、症状、投药方法等情况而定,例如以针剂给药时,一般成年人肥胖症患者(体重60kg),SLC拮抗剂的剂量为大约0.01-30mg,优选大约0.1-20mg,更优选大约0.1-10mg,优选静脉注射给药。对于其它动物种类,可以按每60kg体重换算相应的给药剂量。
在说明书和附图中,碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码,如下例所示。对于有光学异构体的氨基酸,除非特别说明,均指L形式。
DNA:脱氧核糖核酸
cDNA:互补的脱氧核糖核酸
A :腺嘌呤
T :胸腺嘧啶
G :鸟嘌呤
C :胞嘧啶
Y :胸腺嘧啶或胞嘧啶
N :胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤
R :腺嘌呤或鸟嘌呤
M :胞嘧啶或腺嘌呤
W :胸腺嘧啶或腺嘌呤
S :胞嘧啶或鸟嘌呤
RNA :核糖核酸
mRNA :信使核糖核酸
dATP :脱氧腺苷三磷酸
dTTP :脱氧胸腺嘧啶三磷酸
dGTP :脱氧鸟苷三磷酸
dCTP :脱氧胞嘧啶三磷酸
ATP :腺苷三磷酸
EDTA :乙二胺四乙酸
SDS :十二烷基硫酸钠
TFA :三氟乙酸
EIA :酶免疫测定
Gly或G:甘氨酸
Ala或A:丙氨酸
Val或V:缬氨酸
Leu或L:亮氨酸
Ile或I:异亮氨酸
Ser或S:丝氨酸
Thr或T:苏氨酸
Cys或C:半胱氨酸
Met或M:蛋氨酸
Glu或E:谷氨酸
Asp或D:天冬氨酸
Lys或K:赖氨酸
Arg或R:精氨酸
His或H:组氨酸
Phe或F:苯丙氨酸
Tyr或Y:酪氨酸
Trp或W:色氨酸
Pro或P:脯氨酸
Asn或N:天冬酰胺
Gln或Q:谷氨酰胺
pGlu :焦谷氨酸
Me :甲基
Et :乙基
Bu :丁基
Ph :苯基
TC :四氢噻唑-4(R)-羧基酰胺基
Bom :苄氧甲基
NMP :N-甲基-2-吡咯烷酮
PAM :苯乙酰胺甲基
用下列符号表示本说明书中多次使用的取代基、保护基以及试剂:
Tos :对甲苯磺酰基
HONB :N-羟基-5-降冰片烯基-2,3-二羧基亚胺
Bzl :苄基
Z :苄氧羰基
Br-Z :2-溴苄氧羰基
Cl-Z :2-氯苄氧羰基
Boc :叔丁氧基羰基
HOBt :1-羟基苯并三唑
DCC :N,N′-二环己基碳二亚胺
TFA :三氟乙酸
Fmoc :N-9-芴基甲氧基羰基
DNP :二硝基苯酚
Bum :叔丁氧基甲基
Trt :三苯甲基
BSA :牛血清白蛋白
CHAPS :3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯
PMSF :苯甲基磺酰氟
E64 :(L-3-反-羧基环氧乙烷-2-羰基)L-亮氨酰-胍基丁胺
GDP :鸟苷-5′-二磷酸
MEMα :极限必需培养基
Fura-2AM:1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-恶唑)-5-苯并呋喃]-2-(2-氨基-5-甲苯氧基)-乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸戊乙酰氧基甲酯
HBSS :Hank′s平衡盐溶液
Fluo-3AM:1-[2-氨基-5-(2,7-二氯-6-羟基-3-氧基-9-占吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲苯氧基)-乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸戊乙酰氧基甲酯
HEPES :2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙烷磺酸
MeBzl :4-甲基苄基
NMP :N-甲基-2-吡咯烷酮
本说明书的序列表中的序列编号分别表示如下。
[SEQ ID NO:1]
表示由大鼠脑纯化而来的SLC-1的配体多肽,并从其多肽N末端序列分析中得到的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:2]
由大鼠脑纯化而来的SLC-1的配体多肽并鉴定为大鼠MCH,表示其氨基酸序列。
[SEQ ID NO:3]
表示合成DNA,此DNA用于筛选编码大鼠SLC-1的cDNA。
[SEQ ID NO:4]
表示合成DNA,此DNA用于筛选编码大鼠SLC-1的cDNA。
[SEQ ID NO:5]
表示大鼠SLC-1的全部氨基酸序列。
[SEQ ID NO:6]
表示大鼠SLC-1cDNA全部碱基序列,其5′端附加Sal I识别序列,3′端附加Spe I识别序列。
[SEQ ID NO:7]
表示核糖核酸探针(riboprobe),用于在大鼠SLC-1表达每个CHO克隆细胞中,测定SLC-1的mRNA表达水平。
[SEQ ID NO:8]
表示为获得编码人SLC-1的cDNA而使用的合成DNA。
[SEQ ID NO:9]
表示为编码人SLC-1的双链cDNA而使用的引物。
[SEQ ID NO:10]
表示编码人SLC-1的cDNA全部碱基序列。
[SEQ ID NO:11]
表示人SLC-1的全部氨基酸序列。
[SEQ ID NO:12]
表示合成DNA,此DNA用于筛选编码人SLC-1(S)的cDNA。
[SEQ ID NO:13]
表示合成DNA,此DNA用于筛选编码人SLC-1(S)的cDNA。
[SEQ ID NO:14]
表示合成DNA,此DNA用于筛选编码人SLC-1(L)的cDNA。
[SEQ ID NO:15]
表示合成DNA,此DNA用于筛选编码人SLC-1(L)的cDNA。
[SEQ ID NO:16]
表示人SLC-1(S)的全部碱基序列,其5′端附加Sal I识别序列,3′端附加Spe I识别序列。
[SEQ ID NO:17]
表示人SLC-1(L)cDNA的全部碱基序列,其5′端附加Sal I识别序列,3′端附加Spe I识别序列。
[SEQ ID NO:18]
表示核糖核酸探针(riboprobe),用于在人SLC-1(S)表达每个CHO克隆细胞以及人SLC-1(L)表达每个CHO克隆细胞中,测定SLC-1的mRNA表达水平。
[SEQ ID NO:19]
表示Des-Asp1-MCH(MCH(2-19))的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:20]
表示Des-[Asp1、Phe2]-MCH(MCH(3-19))的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:21]
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3]-MCH(MCH(4-19))的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:22]
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4]-MCH(MCH(5-19))的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:23]
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4、Leu5]-MCH(MCH(6-19))的氨基酸序列。
[SEQ ID NO:24]
表示Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4、Leu5、Arg6]-MCH(MCH(7-19))的氨基酸序列。
在实施例8中得到的SEQ ID NO:11所示碱基序列的DNA,由包含编码该DNA的质粒转化的转化体Escherichia coli DH10B/phSLClL8于1999年2月1日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH),其保藏编号为FERM BP-6632,于1999年1月21日保藏于财团法人发酵研究所(IFO),其保藏编号为16254。
实施例
用以下实施例和参考例,详细说明本发明,但并不限定于本发明范围。
参考例1
特异抑制大鼠脑提取物中CHO/SLC-1细胞cAMP的合成并对其抑制活性的检测
用下述方法制备大鼠脑提取物的高效液相层析(HPLC)组分。从ちャ-ルズリバ-公司购入100只Wistar大鼠(雄性、8周龄),取其脑,立刻放入煮沸的0.81蒸馏水中,煮沸10分钟。煮沸后直接用冰冷却,加48ml乙酸使终浓度为1.0M,用Poiytron匀浆器(20,000rpm、6分钟)破碎组织细胞。离心破碎液(8,000rpm、30分钟)取上清液,于沉淀加0.811.0M乙酸,再次用Polytron匀浆器破碎,离心破碎液(8,000rpm、30分钟)取上清液。于沉淀加0.81的1.0M乙酸,再次用Polytron匀浆器破碎,彻夜搅拌,然后离心(8,000rpm、30分钟)获得上清液。缓慢地,在4℃下于上清液滴下2倍的冷丙酮,然后将第一次离心得到的上清液彻夜搅拌,将第二次离心得到的上清液搅拌4小时。加丙酮,将提取液离心(8,000rpm、30分钟)除去沉淀,上清液通过蒸发器减压蒸馏丙酮。给不含丙酮的提取液加等量的二乙醚,用分液漏斗将含有脂类物质的醚层分离回收水层。脱脂醚提取液通过蒸发器减压浓缩将醚完全除去。将浓缩液用玻璃纤维滤纸(ァドバンテック、DP70(直径90mm))过滤,将滤液加样到C18(YMC、YMCgel ODS-AM 120-S50)玻璃层析柱(直径20mm×240mm)。用300ml的1.0M乙酸洗涤该层析柱之后,用含有0.1%三氟乙酸的60%乙肼300ml洗脱。洗脱液减压浓缩除去溶剂后,冷冻干燥。将冷冻干燥物约0.24g溶解于5mlDMSO,加45ml的1.0M乙酸,此为制备好的大鼠脑提取物样品。将大鼠脑提取物样品加样用1.0M乙酸平衡的SP-Sephadex-C25层析柱(Amerham Pharmacia Biotech、凝胶体积:100ml)上,用50ml的1.0M乙酸洗涤,然后,依次得到100ml的2.0M吡啶洗脱组分和100ml的2.0M吡啶乙酸洗脱组分。再将2.0M吡啶乙酸洗脱液减压浓缩除去溶剂后,将浓缩液冻干。将约100mg的冻干粉溶解于10%乙肼,它含有10ml的0.1%三氟乙酸,加样到HPLC的C18(TOSOTSKgel ODS-80Ts(直径21.5×300mm))层析柱上,此层析柱是根据乙肼浓度梯度洗脱法而制备的,其中乙肼自10%至60%并包含0.1%三氟乙酸。将各组分减压,干燥形成粉末,其残渣用0.1ml的二甲亚砜(DMSO)溶解。
以每孔为5×104个细胞密度将实施例4制作的CHO/SLC-1细胞以及模拟(mock)CHO细胞播种于24孔平板上,培养48小时。将细胞用含有0.2mM 3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤(以下,将0.2mM 3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称为反应缓冲液)。然后,加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。再除去反应缓冲液,给细胞加新的反应缓冲液0.25ml,然后再添加HPLC组分和含有2μM毛喉素的0.25ml反应缓冲液,于37℃反应24分钟。加100μl的20%高氯酸停止反应,置于冰上1个小时,提取细胞内的cAMP。用cAMP免疫测定试剂盒(AmerhamPharmacia Biotech)测定提取液中的cAMP。其结果在组分编号33,34,35中检测出CHO/SLC-1细胞显示其特异的cAMP合成抑制活性(图1)。图1中,cAMP合成抑制活性是这样表示的:自添加含毛喉素的反应缓冲液时细胞内cAMP之量减去添加反应缓冲液时细胞内cAMP的量作为100%,自加有HPLC组分时细胞内cAMP之量减去添加反应缓冲液时细胞内cAMP的量作为0%。
参考例2 对大鼠脑提取物中大鼠SLC-1表达CHO细胞显示其特异的cAMP合成抑制活性及其活性物质即蛋白酶的失活
用蛋白分解酶即蛋白酶(Sigma,protease Type XIV(P5147))处理HPLC组分34,该组分具有对参考例1 CHO/SLC-1细胞产生cAMP合成抑制活性,并研究其活性物质是否为蛋白性物质。
在100μl的0.2M乙酸胺中加入所述大鼠脑提取物HPLC组分(#34)2μg。再加3μg的蛋白酶于37℃保温2个小时,然后于沸水中加热10分钟使蛋白酶失活。再加0.05mg的BSA以及含有0.05mg的CHAPS蒸馏水2ml使之冻结干燥。为了研究蛋白酶本身或者研究蛋白酶受加热及冻干的影响,同样地只加热处理蛋白酶,或者只加热处理HPLC组分以及蛋白酶,然后再加HPLC组分,进行冻结干燥。每个冻结干燥的试验材料用含有2μM毛喉素的反应缓冲液溶解,根据参考例1所示的方法测定CHO/SLC-1细胞cAMP合成抑制活性。其结果于图2所示。对大鼠脑提取物中大鼠SLC-1表达CHO细胞显示特异的cAMP合成抑制活性其活性物质因蛋白酶而完全失活,因此这种活性物质显示了蛋白或者肽的特性。
参考例3 大鼠脑中大鼠SLC-1/CHO细胞显示其特异的cAMP合成抑制活性并对其活性物质的制备
以下具体阐述自大鼠脑制备的SLC-1/CHO细胞显示其特异的cAMP合成抑制活性及其活性物质的典型实例。
如下所述,制备参考例1中具有活性组分33。对其活性组分进行减压浓缩除去溶剂,冻干。将其溶于含有10%乙肼的10mM甲酸胺(pH 5.25)5ml,加样阳离子交换柱(ト-ソ-TSKgel CM-22SW(直径4.6mm×150mm)),然后按照自10mM至500mM的甲酸胺(pH 5.25)浓度梯度将活性物质洗脱下来。该甲酸胺含有10%乙肼。其有活性的在甲酸胺320mM附近被回收。在20ml的活性组分中加入含有0.1%三氟乙酸的2.5ml的10%乙肼,给二苯基-柱(セパレ-ッョングル-プ,Vydac 219-TP54)加样后,然后按照自27.5%mM至42.5%并含有0.1%三氟乙酸的乙肼浓度梯度将活性物质洗脱下来。其有活性的在乙肼31.3%附近出现。给0.96ml的活性组分加含有0.1%三氟乙酸的4.4ml的10%乙肼,加样于ODS柱(野村化学,Develosil ODS-UG-3)上,然后按照自27.5%mM至42.5%的、并含有0.1%三氟乙酸的乙肼浓度梯度将活性物质洗脱下来。在每个洗脱液的峰值收集。其活性在乙肼36.8%附近出现一个峰值(图3)。
参考例4 由大鼠脑制备的大鼠SLC-1表达CHO细胞显示其特异的cAMP合成抑制活性并对其活性物质鉴定为大鼠MCH
由实施例3中制备的SLC-1/CHO细胞,对其中特异地显示cAMP合成抑制活性物质的结构进行了分析。本活性物质如参考例2所示推测为蛋白或肽,因此利用含有活性最高峰值的洗脱液根据Sigam公司的产品LF3400,进行蛋白质测序分析了氨基酸末端序列。分析结果是,得到SEQ IDNO:1所示的序列。在第7个残基和第16个残基处检测出在序列分析反应中由Cys残基而形成的脱水丙氨酸的PTH衍生物,并确定为Cys。此序列与大鼠黑色素凝集激素(melanin-concentrating hormone,MCH)的N末端第16个残基氨基酸序列相同。因此本活性物质根据JEOL HX110质谱分析测定时发现它与大鼠MCH分子量几乎相同并在质荷比(m/z)2387.3处观察到信号,推测该活性物质的氨基酸序列为大鼠MCH的序列(SEQ ID NO:2)。另外,关于参考例3得到的活性组分34及35进行合成反应获得活性物质,证明两者的活性均为大鼠的MCH。进一步将从ペニンスラ公司购入的大鼠MCH根据实施例5所叙述的方法对大鼠SLC-1表达细胞进行cAMP合成抑制活性的测定,其中显示了其剂量依赖于抑制活性的特点,本活性物质被证明为大鼠MCH。
实施例1 根据采用大鼠脑cDNA的PCR法进行大鼠SLC-1受体cDNA的扩增
以大鼠脑poly(A)+RNA(ク口-ンテック公司)为模板,使用随机引物进行反转录反应进行该反转录时使用了宝酒造产品RNA PCR ver.2试剂盒的试剂。再以该反转录的产物为模板根据PCR法用SEQ ID NO:3及4的合成DNA引物进行扩增。通过合成DNA引物构建扩增了受体蛋白翻译区基因。此时在5′端及3′端各自附加限制性内切酶的识别序列,例如在基因的5′端附加识别限制性内切酶Sal I位点的碱基序列,在3′端附加识别限制性内切酶Spe I位点的碱基序列。上述反应溶液包括cDNA模板5μl、合成DNA引物各0.4μM、0.25mM dNTPs、pfu(ストラタヅ-ン公司产品)DNA聚合酶0.5μl及酶缓冲液,总体积为50μl。扩增周期使用热循环仪(Perkin-Elmer公司产品)94℃60秒加热后,以94℃60秒、60℃30秒、72℃150秒扩增35个循环,最后于72℃反应10分钟。通过0.8%琼脂糖电泳及溴乙锭染色确认扩增的产物。
实施例2 将上述PCR产物亚克隆至质粒载体并通过对已插入的cDNA区的碱基序列解码来确定扩增cDNA的序列
将实施例1的PCR产物用0.8%低熔点琼脂糖凝胶分离,将染色带用刀片切下后,切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩,回收这些DNA。按PCR-Script TMAmp SK(+)克隆试剂盒(ストラタヅ-ン公司产品)说明书将回收的DNA亚克隆到质粒载体PCR-Script Amp SK(+)。再导入大肠杆菌(Escherichia coli)XL-1 Blue(ストラタヅ-ッ公司产品),经过转化后,携带所述插入cDNA片段的克隆在含氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂平板上进行筛选。用灭菌牙签挑取白色的克隆,得到转化体大肠杆菌E.coli XL-1 Blue/大鼠SLC-1。得到的克隆在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上过夜培养,用QIAprep8mini prep(Quiagen公司产品)制备质粒DNA。取一份该DNA用Sal I以及Spe I切割以检验插入受体cDNA片段的大小。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Terminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin-Elmer公司产品)进行测序,用荧光自动序列分析仪解读该DNA的密码。分析所得3个克隆序列时,证实所有的序列与报道的编码大鼠SLC-1蛋白质(SEQ ID NO:5)基因序列相一致,即在其cDNA序列的5′端区附加Sal I识别序列,在其3′端区附加Spe I识别序列(SEQ ID NO:6)。
实施例3 建立能表达大鼠SLC-1的CHO细胞
在实施例2已确定了大鼠脑SLC-1的全长氨基酸序列并将编码此氨基酸序列的基因导入到附有Sal I识别序列的5′端区、附有Spe I识别序列的3′端区质粒上,进而用该质粒转化的E.coli克隆,再用Plasmid midi试剂盒(Quiagen公司)建立质粒。用限制性内切酶Sal I及Spe I切割插入部分。插入DNA电泳后,用刀片从琼脂糖凝胶切割下来,切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩,回收这些DNA。将这段插入DNA重组到用于表达动物细胞的载体质粒pAKKO-111H(与Hinuma,S.et al.Biochim.Biophys.Acta,Vol.1219,PP.251-259(1994)发表的pAKKO1.11H载体质粒一样)上,该载体质粒用限制性内切酶Sal I及Spe I切割,再使用T4连接酶(宝酒造公司产品)进行连接反应,建立了用于表达蛋白的质粒pAKKO-SLC-1。
培养由pAKKO-SLC-1转化形成的转化体E.coliDH5( ト-ョ-ボ-),然后用Plasmid midi试剂盒(Quiagen公司)建立pAKKO-SLC-1的质粒DNA。用CellPhect转染试剂盒(Amerham Pharmacia Biotech公司产品)按照所附说明书将其导入到CHO-dhfr-细胞。将10μg的质粒DNA与磷酸钾形成协同沉淀悬浮液,加入到在24小时前已播种5×105或1×106个CHO-dhfr-细胞的玻璃皿(10cm)上。在含有10%胎牛血清的MEMα培养基上培养1天之后,传代培养,在选择性培养基即含有10%透析胎牛血清而不含核酸MEMα培养基上培养。在选择培养基上能够表达SLC-1的CHO细胞逐渐增殖形成菌落,即选择菌落转化细胞中克隆56。
实施例4 筛选具有高效表达水平的全部大鼠SLC-1受体蛋白mRNA的CHO/SLC-1细胞系
用Cytostar T Plate(Amerham Pharmacia Biotech公司产品)按照所附说明书,将实施例3构建的CHO/SLC-1细胞系克隆56再将其全部大鼠SLC-1受体蛋白mRNA的表达水平进行测定。将CHO/SLC-1细胞系每个克隆以2.5×104个细胞密度播种于Cytostar T Plate的每个孔内,培养24小时,然后用10%的福尔马林固定液固定。每孔添加0.25%的Triton X-100以提高细胞的通透性,然后加标记的35S SEQ ID NO:7的核糖核酸探针(riboprobe)使之杂交。各孔内加20mg/ml RNaseA,消化游离的核糖核酸探针(riboprobe),充分洗涤平板,然后用Topcounter测定已杂交的riboprobe放射活性。放射活性高的细胞系其mRNA的表达水平高。在以下实验中使用了3个mRNA表达水平高的克隆(#3,6及44),尤其选择了克隆编号44(图4)。
实施例5 通过MCH的刺激来检测能表达大鼠SLC-1CHO细胞的cAMP合成抑制活性
将合成的MCH(ペニンスラ公司产品)稀释为不同浓度,用下述方法来检测能表达大鼠SLC-1CHO细胞的cAMP合成抑制活性。以每孔为5×104个细胞密度将实施例4选择好的CHO/SLC-1细胞播种于24孔平板上,培养48小时。用含有0.2mM 3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞(以下,将0.2mM 3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称为反应缓冲液)。然后,加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。再除去反应缓冲液,换新的反应缓冲液0.25ml,然后再添加各种浓度的MCH和含有2μM毛喉素的0.25ml反应缓冲液,于37℃反应24分钟。加100μl的20%高氯酸停止反应,置于冰上1个小时,提取细胞内的cAMP。用cAMP免疫测定试剂金(Amerham Pharmacia Biotech)测定提取液中的cAMP。在0.1mMMCH的浓度下,其结果明显地使细胞内cAMP水平降低,若增加肽浓度,则细胞内cAMP的量随着用量增加而减少(图5)。图中,cAMP合成抑制活性是这样表示的:自添加含毛喉素的反应缓冲液时细胞内cAMP之量减去添加反应缓冲液时细胞内cAMP的量作为100%,自加有MCH时细胞内cAMP之量减去添加反应缓冲液时细胞内cAMP的量作为0%。
实施例6 由MCH引起表达大鼠SLC-1的CHO细胞释放花生四烯酸代谢物及其活性
由不同浓度的合成MCH(公司产品)显示对能表达大鼠SLC-1的CHO细胞释放花生四烯酸代谢物及其活性,根据以下方法进行测定。以每孔为5×104个细胞密度将实施例4选择好的CHO/SLC-1细胞播种于24孔平板上,培养24小时,然后添加[3H]花生四烯酸使每孔为0.25μCi。16个小时后,用0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞,各孔内添加500μl的不同浓度的合成大鼠MCH,该合成MCH溶于0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)。以下将0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称为反应缓冲液。在37℃下保温60分钟,然后将400μl的反应液加入到闪光剂中,[3H]花生四烯酸代谢物释放到反应液中,用闪烁计数器测定[3H]花生四烯酸代谢物的量。在合成大鼠MCH3nM的浓度下释放花生四烯酸代谢物明显,若增加肽浓度,则培养基中花生四烯酸代谢物的量随着用量增加而增加释放(图6)。图中,花生四烯酸代谢物释放活性是这样表示的:没有添加合成大鼠MCH反应缓冲液而释放于培养基中产生的[3H]花生四烯酸代谢物的量作为100%时,而添加合成大鼠MCH反应缓冲液而释放于培养基中产生的[3H]花生四烯酸代谢物的量用相对值表示。
实施例7 分离人SLC-1的cDNA质粒
按照Genetrapper cDNA positive selection system(GIBCOBRL公司产品)说明书的要求,使用噬菌体F1核酸内切酶将来自人胎儿脑的cDNA(SUPERSCRIPTTM cDNA Library,GIBCOBRL公司产品)切割形成切口,再用大肠杆菌核酸外切酶III消化,故得到一条人胎儿脑的cDNA文库链。
根据Kolakowski Jr.等(Kolakowski Jr.,et al(1996)FEBS Lett.Vol.398,PP.253-258)的报告制备了SEQ ID NO:8的合成寡核苷酸(相当于accessionNo.U71092的1434-1451),在其3′末端用脱氧核苷酰末端转移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase)附加biotin(生物素)-14-dCTP得到生物素寡核苷酸。反应液的组成及反应时间均按照说明书的要求进行。
在95℃下使4μg的一条人胎儿脑cDNA文库链保温1分钟之后,在冰上迅速冷却,加20ng的生物素寡核苷酸,在37℃下用杂交缓冲液杂交1个小时。再加链亲和素珠,用MAGNA-SEP Magnetic PaaarticleSepparator(GIBCOBRL公司产品),分离与生物素寡核苷酸杂交的一条人胎儿脑的cDNA文库链,根据Kolakowski Jr.等的报告(Kolakowski Jr.,etal(1996)FEBS Lett.Vol.398,PP.253-258)制备了SEQ ID NO:9的合成寡核苷酸(相当于accession No.U71092的1011-1028),将50ng的该合成寡核苷酸作为引物,按照说明书的要求合成其互补链,则得到双链的质粒。
实施例8 测定经分离得到的含有人SLC-1 cDNA质粒的碱基序列
用电穿孔法将实施例7得到的质粒导入到ELECTROMAXTM DH10BTMCells内进行转化,之后携带所述插入cDNA片段的克隆在含氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂平板上进行筛选。用灭菌牙签挑取白色的克隆,继续进行分离,得到转化体大肠杆菌E.coli DH10B/hSLC-1。得到的克隆在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上过夜培养,用QIA prep8mini prep(Quiagen公司产品)制备纯化的质粒DNA。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(TeriminatorCycle Sequencing Kit)(Perkin-Elmer公司产品)进行测序,用荧光自动序列分析仪解读该DNA的密码。得到SEQ ID NO:10的序列。用该序列编码氨基酸序列(SEQ ID NO:11)与Lakaye等报道(Lakaye,B.et al.(1998)Biochem.Biophys.Acta,.vol.1401,PP.216-220)的人SLC-1氨基酸序列有差异,他们推测的序列为:以含有人SLC-1序列的染色体DNA序列(accessionNo.Z86090)为基础,根据大鼠SLC-1序列而推导出来的。同时编码得到的氨基酸序列还显示了在推导序列上又进一步在69或64位氨基酸的上游,有一个起始密码子ATG存在于mRNA之上。经过含有编码这样序列的DNA质粒的转化而形成转化体Escherichia coli DH10B/phSLClL8,并将该转化体保藏于IFO及NIBH。
实施例9 测定MCH诱导的、与能表达大鼠SLC-1的CHO细胞膜级分结合的GTPγS结合活性
用以下方法测定由MCH诱导的、与能表达大鼠SLC-1的CHO细胞膜级分结合的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate结合促进活性。首先说明膜级分的制备方法。加10ml的匀浆缓冲液(10mM NaHCO3,5mM EDTA,0.5mM PMSF,1μg/ml pepstatin,4μg/ml E64,20μg/ml leupeptin)于1×108个CHO/SLC-1细胞,用Polytron(12,000rpm,1分钟)匀浆器破碎细胞。离心细胞破碎液(1,000g,15分钟)获得上清液。再将这个上清液超速离心(Beckman Type 30转子,30,000rpm,1小时)得到能表达大鼠SLC-1的CHO细胞膜级分的沉淀物。
GTPγS结合活性的测定如下进行。用稀释缓冲液(50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.4),5mM MgCl2,150mM NaCl,1μM GDP)稀释能表达大鼠SLC-1的CHO细胞膜级分,制备蛋白质浓度为30mg/ml的测定用细胞膜级分溶液,向测定用细胞膜级分溶液中加入2μl的51.5nM浓度的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate(NEN公司产品)和2μl的各种浓度的MCH(ペニンスラ公司产品),在25℃下其混合液保温1个小时。用滤膜过滤混合液,进一步用洗涤缓冲液1.5ml(50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4),5mM MgCl2,1mMEDTA,0.1%BSA)冲洗滤膜2次,然后用液闪计数器测定滤膜的放射活性。MCH随着其浓度的增加使结合到膜级分的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate的量增大。另外约在0.5nM浓度的MCH达到了最大的结合为50%。
实施例10 根据使用来自人胎儿脑cDNA的PCR法对人SLC-1cDNA进行扩增
根据基因捕获法而克隆的含有人SLC-1DNA序列的质粒,以该质粒为模板,根据PCR法,使用SEQ ID NO:12及13的合成DNA引物和SEQ IDNO:14及15的合成DNA引物分别进行扩增。将前者扩增的DNA命名为人SLC-1(S),后者扩增的DNA命名为人SLC-1(L)。合成DNA引物构建用于扩增受体蛋白翻译区基因,但是为了在基因的5′端区附加有限制性内切酶Sal I识别序列,在其3′端区附加有限制性内切酶Spe I识别序列,而分别在5′端区和3′端区附加限制性内切酶的识别序列。增的人SLC-1(S)反应液的组成为,含有人SLC-1DNA序列的质粒模板为5μl,合成DNA引物各为0.4mM,dNTPs为0.2mM,pfuDNA聚合酶为0.5μl,以及酶缓冲液,总反应体积为50μl。扩增周期使用热循环仪(Perkin-Elmer公司产品)94℃60秒加热后,以94℃60秒、57℃60秒、72℃150秒扩增25个循环,最后于72℃保温10分钟。扩增的人SLC-1(L)反应液的组成为,含有人SLC-1DNA序列的质粒模板为5μl,合成DNA引物各为0.4mM,dNTPs为0.2mM,pfuDNA聚合酶为0.5μl,以及酶缓冲液,总反应体积为50μl。扩增周期使用热循环仪(Perkin-Elmer公司产品)94℃60秒加热后,以94℃60秒、60℃60秒、72℃3分扩增25个循环,最后于72℃保温10分钟。扩增产物要在0.8%琼脂糖凝胶电泳之后,根据溴乙锭染色进行确定。
实施例11 将上述PCR产物亚克隆至质粒载体并通过插入cDNA区的碱基序列解码来确定扩增cDNA的序列
将实施例10的PCR产物用0.8%低熔点琼脂糖凝胶分离,将染色带用刀片割下后,切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩,回收这些DNA。按PCR-Script TMAmp SK(+)克隆试剂盒(ストラタヅ-ン公司产品)说明书将回收的DNA亚克隆到质粒载体PCR-Script Amp SK(+)。再导入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞(competent cell)(ト-ョ-ボ-公司产品),经过转化后,携带所述插入cDNA片段的克隆在含氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基上进行筛选。用灭菌牙签挑取白色的克隆,得到人SLC-1(S)转化体大肠杆菌E.coli DH5α/hSLC-1(S)和人SLC-1(L)转化体大肠杆菌E.coli DH5α/hSLC-1(L)。得到的克隆在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上过夜培养,用QIA prep8 mini prep(Quiagen公司产品)制备质粒DNA。取一份该DNA用Sal I以及Spe I切割以检验插入受体cDNA片段的大小。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Terminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin-Elmer公司产品)进行测序,用荧光自动序列分析仪解读该DNA的密码。分析所得克隆序列时,证实与两种DNA序列(SEQ ID NO:16及17)相一致,即SEQ ID NO:16的DNA序列是以人SLC-1基因为模板,用SEQ ID NO:12及13的合成DNA引物扩增而成,SEQ ID NO:17的DNA序列是以人SLC-1基因为模板,用SEQ ID NO:14及15的合成DNA引物扩增而成。
实施例12建立能表达人SLC-1(S)的CHO细胞和表达人SLC-1(L)的CHO细胞
在实施例11中已确定人SLC-1(S)和SLC-1(L)序列,该序列被导入到质粒上,根据质粒转化形成的转化体E.coli,用Plasmid midi试剂盒(Quiagen公司),对克隆转化体E.coli建立质粒。用限制性内切酶Sal I及Spe I切割插入部分。该插入DNA电泳后,用刀片从琼脂糖凝胶切割下来,切碎用苯酚、苯酚·氯仿抽提以及乙醇沉淀浓缩,回收DNA。将插入DNA重组到用于表达动物细胞的载体质粒pAKKO-111H(与Hinuma,S.et al.Biochim.Biophys.Acta,Vol.1219,pp.251-259(1994)发表的pAKKO1.11H载体质粒一样)上,用T4连接酶(宝酒造公司产品)进行连接反应,建立了用于表达蛋白的质粒pAKKO-hSLC-1(S)和pAKKO-hSLC-1(L)。
培养由pAKKO-hSLC-1(S)和pAKKO-hSLC-1(L)转化形成的转化体E.coli DH5α(ト-ョ-ボ-),然后用Plasmid midi试剂金(Quiagen公司产品)制备pAKKO-hSLC-1(S)和pAKKO-hSLC-1(L)的质粒DNA。用CellPhect转染试剂盒(Amerham Pharmacia Biotech公司产品)按照所附说明书将质粒DNA导入到CHO dhfr-细胞。将10μg的质粒DNA与磷酸钙形成协同沉淀悬浮液,加入到在24小时前已播种5×105或1×106个CHO dhfr-细胞的玻璃皿(10cm)上。在含有10%胎牛血清的MEMα培养基上培养1天之后,传代培养,在选择性培养基即含有10%透析胎牛血清而不含核酸的MEMα培养基上培养。在选择培养基上含有人SLC-1(S)基因和含有人SLC-1(L)的CHO细胞逐渐增殖,将这两种细胞转化形成转化细胞菌落,即各自选择菌落克隆56和菌落克隆61。
实施例13 筛选具有高效表达水平的人SLC-1(S)和人SLC-1(L)mRNA的基因转导细胞系
用Cytostar T Plate(Amerham Pharmacia Biotech公司产品)按照所附说明书,将实施例12构建的CHO/hSLC-1(S)细胞系克隆56以及构建的CHO/hSLC-1(L)细胞系克隆61的mRNA表达水平如下进行测定。将CHO/hSLC-1(S)细胞系及CHO/hSLC-1(L)细胞系每种克隆以2.5×104个细胞密度播种于Cytostar T Plate的每个孔内,培养24小时,然后用10%的福尔马林固定液固定。每孔添加0.25%的Triton X-100以提高细胞的通透性,加35S标记的SEQ ID NO:18的核糖核酸探针(riboprobe)使之杂交。各孔内加20mg/ml RNaseA,消化游离的核糖核酸探针(riboprobe),充分洗涤平板,然后用Topcounter测定杂合体riboprobe放射活性。放射活性高的细胞系其mRNA的表达水平高。
实施例14 通过MCH的刺激来检测能表达人SLC-1的CHO细胞中的cAMP合成抑制活性
将合成的MCH(ペニンスラ公司产品)稀释为各种浓度,用下述方法来检测能表达人SLC-1的CHO细胞中cAMP合成抑制活性。以每孔为5×104个细胞密度将实施13选择好的能表达人SLC-1的CHO细胞即CHO/hSLC-1(S)细胞系或CHO/hSLC-1(L)细胞系播种于24孔平板上,培养48小时。用含有0.2mM 3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞(以下,将含有0.2mM 3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05%的BSA和20mM的HEPES Han k′s缓冲液(pH7.4)称为反应缓冲液)。然后,加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。除去反应缓冲液,更换新反应缓冲液0.25ml,然后再添加各种浓度的MCH和含有2μM毛喉素的0.25ml反应缓冲液,于37℃使之反应24分钟。加100μl的20%高氯酸停止反应,置于冰上1个小时,提取细胞内的cAMP。用cAMP免疫测定试剂盒(AmerhamPharmacia Biotech)测定提取液中的cAMP。其结果是,随着MCH浓度的增大,却使能表达人SLC-1的细胞内cAMP水平降低。
实施例15 由MCH引起的、能表达人SLC-1的CHO细胞释放花生四烯酸代谢物的活性
由不同浓度的合成MCH(ペニンスラ公司产品)显示对能表达人SLC-1的CHO细胞释放花生四烯酸代谢物的活性,根据以下方法进行测定。以每孔为5×104个细胞密度将实施例13选择的能表达人SLC-1的CHO细胞即CHO/hSLC-1(S)细胞系或CHO/hSLC-1(L)细胞系播种于24孔平板上,培养24小时,然后添加[3H]花生四烯酸使每孔为0.25μCi。16个小时后,用0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞,各孔内添加500μl的每种浓度的合成MCH,该合成MCH已溶于0.05%的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)。在37℃下保温60分钟,然后将400μl的反应液加入到闪光剂中,[3H]花生四烯酸代谢物释放到反应液中,用闪烁计数器测定[3H]花生四烯酸代谢物的量。其结果是,合成的MCH依赖于使用量的情况,从而显示能表达人SLC-1的细胞释放花生四烯酸代谢物的活性。
实施例16 测定与能表达人SLC-1的CHO细胞膜级分结合的GTPγS结合活性
用以下方法制备能表达人SLC-1的CHO细胞膜级分。使能表达人SLC-1的CHO细胞(1×108个)浮游于磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中,该盐水包含5mM EDTA(乙二胺四乙酸),离心。给细胞切片加10ml的匀浆缓冲液(10mMNaHCO3、5mM EDTA、pH7.5),用Polytron(12,000rpm,1分钟)匀浆器匀浆。以400×g离心15分钟,上清液再用100,000×g离心1个小时得到膜组分的沉淀物。将该沉淀物悬浮于2ml的测定缓冲液[50mM Tris-盐酸(pH7.5)、1mM EDTA、0.1%的BSA(牛血清白蛋白)、10mM MgCl2、100mMNaCl、1mM GDP(鸟苷5′-二磷酸)、0.25mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、1μg/ml胃蛋白抑制素、20μg/ml亮肽素、10μg/ml磷酰胺],用100,000×g离心1个小时。将回收的膜组分沉淀物再次悬浮于20ml的测定缓冲液中,分注后于-80℃保存,使用时,解冻后再用。
GTPγS结合活性的测定如下进行。在聚丙烯性96孔平板上分注用分析缓冲液稀释的能表达人SLC-1的CHO细胞膜级分173μl,然后同时添加2μ1的、溶解了不同浓度的MCH(Bachem公司产品)以及[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate(第一化学药品公司产品)25μl(细胞膜终浓度为20μg/ml、[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate终浓度为0.33nM)。在25℃下其反应液保温1个小时,边搅拌边反应,然后用玻璃过滤膜(GF-C)吸引过滤,再用300μl(50mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5))冲洗3次。向玻璃过滤膜加50μl的液闪剂,用液闪计数器测定留在滤膜上的放射活性。
MCH随着其浓度的增加使结合到膜级分的[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate的量增大。另外该膜级分的ED50值为0.2nM。
实施例17 通过手工埃德曼降解法来制备MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)(SEQ ID NO:19-24)
将0.1mg的MCH(Sigma公司产品)溶于30μl的50%吡啶中,再加1μl的异硫氰酸苯酯(和光纯药公司产品),置换氮之后,45℃下保温。每隔10分钟搅拌一次经过1个小时的时候停止保温,在氮气流下干燥使之固化。再次溶解于20μl的乙醇中,氮气流下减压蒸馏溶剂,干燥使之固化。将反应产物苯基硫代氨基甲酰衍生物溶于20μl的三氟乙酸(和光纯药公司产品)置换氮45℃下保温20分钟,把肽的氨基酸末端切割为苯胺基噻唑啉衍生物。在氮气流下除去三氟乙酸,之后加30μl的水和100μl的醋酸正丁酯,用醋酸正丁酯萃取并除去过剩的试剂和苯胺基噻唑啉衍生物。反复3次进行醋酸正丁酯萃取。氨基末端减少了1个残基即MCH(2-19),将包含该MCH(2-19)的水相于氮气流下减压干燥使之固化。
由于只进行了1次这样的分解过程,得到氨基末端仅缺少1个残基的MCH(2-19)。将同样的分解过程反复进行2、3、4、5、6次,则分别得到N末端氨基逐次缺少1个残基,从而得到MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)。
把上面分解反应得到的MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)依照下面纯化方法,根据质谱分析和氨基酸分析来确定构造。下面有关MCH(4-19)详细阐述,但其它的衍生物几乎用同样的操作过程。表1显示了MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)的分析值。
表1 MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)及MCH(7-19)的质谱分析值和氨基酸分析值
构 造 | 质谱(M+H)+分析值(理论值)化学组成式 | 氨基酸分析值 |
MCH(2-19) | (2272.1)C101H156N29O23S4 | D1.90(1),E2.28(1),P1.32(1),G2.33(1),V1.76(2),Cn.d(1),M0.46(2),L2.0(2),Y0.50(1),F0.93(1),R1.98(3) |
MCH(3-19) | (2125.0)C92H147N28O22S4 | D1.01(1),E1.05(1),P1.25(1),G1.02(1)V1.9(2),C0.30(1),M1.37(2),L2.0(2),Y0.20(1),R2.94(3) |
MCH(4-19) | (2010.0)C88H142N27O19S4 | E1.04(1),P1.12(1),G1.02(1),V1.88(2)C0.34(1),M1.42(2),L2.0(2),Y0.23(1)R2.93(3) |
MCH(5-19) | (1878.9)C83H133N26O18S3 | E1.51(1),P0.69(1),G2.16(1),V1.27(2)Cn.d.(1),M0.38(1),L2.0(2),Y0.18(1),R1.80(3) |
MCH(6-19) | (1765.9)C77H122N25O17S3 | E0.69(1),P0.79(1),G0.70(1),V1.21(2)C0.15(1),M0.50(1),L1.0(1),Y0.20(1),R1.84(3) |
MCH(7-19) | 1609.2(1508.8)C71H110N21O16S3 | E0.90(1),P0.62(1),G1.03(1),V1.05(2)C0.07(1),M0.33(1),L1.0(1),Y0.15(1),R1.04(2) |
下面用HPLC纯化MCH(4-19)。首先以流速300μl/min将A液(0.1%三氟乙酸)过柱,该柱为Spheri-5 RP-18反相高效液体用层析柱(ブラゥンリ-公司产品,2.1mm×30mm),于25℃下平衡柱子,使反应物溶于270μl的0.1%三氟乙酸,1次上样50μl柱,然后保持300μ1/min的流速,30分钟后使B液(0.1%三氟乙酸/70%乙肼)浓度提高到70%。将洗脱液置于210nm的波长下进行监测,手工收集吸收峰。在17.1分处洗脱出MCH(4-19)。再浓缩干燥并将MCH(4-19)集中一个试管里,再溶解100μl的DMSO。
质谱分析所使用的仪器为日本电子JMS-HX110,根据LSIMS法进行。即在探针芯片上1μl的3-硝基苯醇和甘油以3∶2组成矩阵与1μl的标样混合,输入离子源。将铯离子加速为15kV并进行照射,再将产生的正二次离子加速为10kV插入检测器。
为了进行氨基酸分析加水分解,取5μl的标样于玻璃管内,减压干燥,装入反应瓶内,其瓶的底部有200μl的6N共沸盐酸(ピァス公司产品,Sequenal Grade),用Waters公司产品Pico-Tag工作台(ヮ-クステ-ッョン),按照Waters公司推荐的方法除气,110℃保温24小时。
用真空泵真空抽气除去反应瓶中的盐酸,再用150μl的20mM盐酸稀释试验材料,将其注入分析瓶内,插入氨基酸分析仪提供100μl用于分析。氨基酸分析采用日立L-8500高速氨基酸分析仪,按照荧光分析法进行分析,其荧光分析法将邻苯二甲醛试剂(和光纯药公司产品)用于衍生化反应。荧光分析用缓冲液的制备法、反应液的制备法、分析条件均按照L-8500氨基酸分析仪操作说明书实施。当以亮氨酸为基准时测定的摩尔比如表1所示。
另外,MCH或MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)也可根据实施例24至实施例28所阐述的固相合成法合成。
实施例18 由非同位素波德栋-亨特试剂(ボルトン-ハンタ-试剂)进行的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)衍生化
由非同位素波德栋-亨特试剂(ボルトン-ハンタ-试剂)对MCH及在实施例17中得到的MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)进行衍生化。下面以MCH(4-19)为例阐述其衍生化过程。
1nmol的MCH(4-19)溶于二甲基磺酰胺50μl,再加入非同位素波德栋-亨特试剂(ボルトン-ハンタ-试剂)即[3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙酸N-琥珀酰亚胺](和光纯药公司产品)100nmol以及N,N-二异丙基乙胺(和光纯药公司产品)100nmol,使之在37℃反应4个小时。
在该混合物中加入含有0.1%三氟乙酸的450μl的10%乙肼,用HPLC纯化。层析柱条件如下。柱子为Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm),流速为1.0ml/min。洗脱液用含有0.1%三氟乙酸的乙肼溶液,乙肼溶液浓度2分钟内保持10%,5分时则达到20%,20分时则达到50%。由非同位素波德栋-亨特试剂(ボルトン-ハンタ-试剂)衍生化的MCH(4-19)形成衍生物即[N-(3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙基)-Met4]-MCH(4-19)在22.9分时洗脱,手工收集。关于MCH或MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)及MCH(6-19)通过同样方法在氨基酸N末端的氨基上导入3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙基衍生化,用HPLC收集。将这些衍生物如实施例17所阐述的方法加酸分解,进行氨基酸分析。其结果如表2所示。
表2 衍生化的MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)的氨基酸分析值
构造 | 氨基酸分析值(残基数) |
衍生化MCH(2-19) | D1.01(1),E1.05(1),P0.86(1),G1.09(1),V1.69(2),Cn.d.(1),M1.01(2),L2.0(2),Y0.27(1),F0.90(1),R2.59(3) |
衍生化MCH(3-19) | D1.20(1),E1.58(1),P1.12(1),G2.07(1),V1.60(2),Cn.d.(1),M0.94(2),L2.0(2),Y0.19(1),R2.24(3) |
衍生化MCH(4-19) | E1.09(1),P1.46(1),G1.09(1),V1.83(2),Cn.d.(1),M1.14(2),L2.0(2),Y0.27(1),R2.78(3) |
衍生化MCH(5-19) | E1.10(1),P0.90(1),G1.34(1),V1.55(2),Cn.d.(1),M0.32(1),L2.0(2),Y0.32(1),R2.28(3) |
实施例19 制备放射性同位素标记的MCH(4-19)
在实施例17中制备得到MCH的氨基酸N末端3个残基缺陷体即MCH(4-19),用非同位素波德栋-亨特试剂法进行放射性同位素标记。在试管中溶于苯的[125I]-非同位素波德栋-亨特试剂[3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙酸N-琥珀酰亚胺]9.25MBq(0.11nmol)(NENラィフサィェンスプ口ダクッ公司产品81.4TBq,与其充入干燥氮气,蒸馏苯。向试管中添加18μl的150mM磷酸缓冲液(pH7.5)和溶于1.5μl的二甲基亚砜2.3hmol MCH(4-19)以及0.5μl的二甲基亚砜,再充分混和。将混合液于37℃下保温2小时,然后用反相HPLC收集。非同位素波德栋-亨特试剂衍生化形成MCH(4-19)放射性衍生物即[125I]-[N-(3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙基-Met4)-MCH(4-19)(结构式已在上面的(4)中叙述)。[125I]-[N-(3-(4-羟基-3-碘代苯基)丙基-Met4)-MCH(4-19)从ODS(ト-ソ-ODS-80TM(4.6×150mm))柱上在乙肼浓度为43.6%附近洗脱。
同样,根据[125I]-非同位素波德栋-亨特试剂在N末端的氨基上导入[125I]-3-(4-羟基-3-碘代苯基)-丙基可以合成MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)的放射性同位素衍生物((1)-(3)、(5)-(7))。
实施例20 制备放射性碘标记的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)
同位素标记的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)如下将氨基酸序列中的Tyr13标记放射性碘,从而可以制备。关于MCH(4-19)已经举例说明,用同样方法可以合成放射性碘标记的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)。
在25μl的0.4M乙酸钠(pH5.6)中溶解5μgMCH(4-19),对此加入200ng的乳过氧化物酶(和光纯药公司产品),再加1mCi的[125I]碘化钠(AmerhamPharmacia Biotech)和200ng的过氧化氢(10μl)。室温静止10分钟。再加200ng的过氧化氢(10μl),静止10分钟。根据HPLC法纯化,其柱为TSKgelODS-80Ts(4.6mm×25cm,ト-ソ-),从而得到[125I]标记的MCH(4-19)。
实施例21 利用MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)与GTPγS结合测定法进行激动剂活性的测定
根据以下方法制备能表达大鼠SLC-1的CHO细胞膜级分。使能表达大鼠SLC-1的CHO细胞(1×108个)浮游在含有5mM EDTA(乙二胺四乙酸)的磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中,离心。加10ml的匀浆缓冲液(10mMNaHCO3,5mM EDTA,pH7.5),用Polytron匀浆器破碎细胞。以400×g15分钟离心,将上清液再以100,000×g,离心1小时,获得细胞膜级分的沉淀物。将该膜级分悬浮于2ml的测定缓冲液(50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5),1mM EDTA,0.1%BSA(牛血清白蛋白),10mM MgCl2,100mM NaCl,1μM GDP(鸟苷-5′-二磷酸),0.25mM PMSF(苯甲基磺酰氟),1μg/ml胃蛋白抑制素,20μg/ml亮肽素,10μg/ml磷酰胺),以100,000×g速度离心1小时。将回收的沉淀物膜级分再次悬浮于20ml的测定缓冲液中,分注后于-80℃保存,使用时。解冻后再用。
MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)的激动剂活性的测定如下。先用测定缓冲液稀释能表达大鼠SLC-1的CHO细胞膜级分,取其173μl分注到聚丙烯性96孔平板上。然后同时添加用DMSO稀释成不同浓度的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)、MCH(5-19)、MCH(6-19)以及MCH(7-19)它们各自为2μl以及25μl的[35S]Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate(第一化学药品公司产品)(细胞膜终浓度为20μg/ml,[35S]-Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate终浓度为0.33nM)。在25℃下将混合液搅拌1个小时,用玻璃过滤膜(GF-C)吸引过滤,再用300μl的洗涤液(50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5))洗涤3次。在玻璃过滤膜上添加50μl的液闪剂,用液闪计数器测定残留的放射活性。
MCH(6-19)及MCH(7-19)的激动剂活性与MCH比较时,各自比MCH低10倍及200倍,而MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)几乎与MCH具有同等大小的活性。
实施例22 由非同位素波德栋-亨特试剂衍生的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)与GTPγS结合,利用结合测定对激动剂活性进行测定
实施例18中得到的非同位素波德栋-亨特试剂衍生的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)的激动剂活性同实施例21一样利用GTPγS结合测定进行分析。
分析证明所衍生形成的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)与MCH一样随着配体浓度的增加,结合到能表达人SLC-1的CHO细胞膜级分的[35S]Guanosine 5′-(γ-thio)triphosphate结合量增大,通过由非同位素波德栋-亨特试剂衍生形成的不同浓度MCH具有激动剂活性(图8)。图中,BH-MCH、BH-MCH(2-19)、BH-MCH(3-19)、BH-MCH(4-19)以及BH-MCH(5-19)分别表示由非同位素波德栋-亨特试剂衍生形成的MCH、MCH(2-19)、MCH(3-19)、MCH(4-19)以及MCH(5-19)。
实施例23 用非同位素波德栋-亨特试剂制备的[125I]-标记MCH(4-19)受体结合实验
用实施例19中所用非同位素波德栋-亨特试剂制备的[125I]-标记的MCH(4-19)(化学结构式如所述(4))及从能表达人SLC-1的CHO细胞制备膜级分来进行受体结合实验。
用测定缓冲液(25mM Tris-盐酸,1mM EDTA(乙二胺四乙酸),0.1%BSA(牛血清白蛋白),0.25mM PMSF(苯甲基磺酰氟),1μg/ml胃蛋白抑制素,20μg/ml亮肽素,10μg/ml磷酰胺,pH7.5),将实施例16制备的能表达人SLC-1的CHO细胞的膜级分稀释为不同浓度,然后在96孔平板上各自注入173μl。为了测定最大结合(TB),将2μl的DMSO和25μl的100pM[125I]-标记MCH(4-19),又,为了测定非特异结合(NSB),将100μM MCH的DMSO 2μl和25μl的100pM[125I]-标记MCH(4-19)加入到膜级分溶液中。25℃反应60分钟,使用经过聚乙烯亚胺处理的沃特曼玻璃过滤膜(GF-C)吸引过滤。之后,用γ-计数器测定残留于滤纸上的[125I]-标记MCH(4-19)放射活性。如图9所示证明了[125I]-标记MCH(4-19)特异结合(SB)依赖于膜级分的浓度。
设膜级分的浓度为2.5μg/ml,从抑制率(%)中求出MCH的50%抑制浓度(IC50值)时,IC50值为0.2nM(图10)。
用能表达大鼠SLC-1的CHO细胞的膜级分和[125I]-标记MCH(4-19)同样可以进行结合实验。
实施例24 MCH(Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制备
将市售Boc-Val-OCH2PAM树脂(0.77mmol/g树脂)0.5mmol分放入肽合成仪ABI 430A的反应罐中,按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次将Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Phe、Boc-Asp (OcHex)导入该树脂,获得按要求保护的肽树脂。将得到的该树脂0.6g与2g的p-甲酚、1.2ml的1,4丁二硫醇一起于无水氟化氢10ml中,0℃搅拌60分钟,减压蒸馏氟化氢,其中加入二乙醚,过滤沉淀。加50%乙酸溶液并抽提,除去不溶部分,充分浓缩抽提液,上样G-25柱(2.0×80cm),该柱Sephadex(商品名)用50%乙酸溶液充填,用同一溶剂展样,收集主要级分,上样反相层析柱(2.6×60cm),其柱用LiChroprep(商品名)RP-18充填,用0.1%TFA水溶液200ml洗涤,进行线性密度梯度洗脱,其中洗脱液使用了0.1%TFA水溶液300ml和含0.1%TFA的40%乙腈溶液300ml,收集主要级分进行浓缩。将该浓缩部分溶解于约4ml乙酸中,再用蒸馏水稀释到240ml后,再用铵水调整pH,使pH为7.5,缓慢充气搅拌。用HPLC进行追踪反应,证明SH体肽的峰值已变化SS体后,加乙酸将溶液的pH调整为3,上样所述LiChroprep(商品名)RP-18柱。用0.1%TFA水溶液200ml洗柱,然后进行线性密度梯度洗脱,其中使用了0.1%TFA水溶液300ml和含0.1%TFA的40%乙腈溶液300ml,收集主要级分,冻干得到目的肽。
质谱(M+H)+2387.3(理论值2387.9)
HPLC洗脱时间:20.9分钟
柱条件:
柱子:Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)
洗脱剂:按A/B=20/80-80/20进行线性密度梯度洗脱,其中A液为含0.1%TFA的10%乙腈溶液,B液为含0.1%TFA的60%乙腈溶液(20分钟)
流速:1.0ml/min
实施例25 Des-Asp1-MCH(MCH(2-19)、Phe-Asp-Met-Leu-ArgCys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制备
将市售Boc-Val-OCH2PAM树脂(0.77 mmol/g树脂)0.5mmo1分放入肽合成仪ABI 430A的反应罐中,按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次将Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Phe导入该树脂,获得按要求保护的肽树脂。用实施例24的方法将该树脂去除保护基,再进行环化作用并纯化从而获得目的肽。
质谱(M+H)+2272.3(理论值2272.1)
HPLC洗脱时间:20.6分钟
柱条件:
柱子:Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)
洗脱剂:按A/B=20/80-80/20进行线性密度梯度洗脱,其中A液为含0.1%TFA的10%乙腈溶液,B液为含0.1%TFA的60%乙腈溶液(20分钟)
流速:1.0ml/min
实施例26 Des-[Asp1、Phe2]-MCH(MCH(3-19)、Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制备
将市售Boc-Val-OCH2PAM树脂(0.77mmol/g树脂)0.5mmol分放入肽合成仪ABI 430A的反应罐中,按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次将Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Asp(OcHex)导入该树脂,获得按要求保护的肽树脂。用实施例24的方法将该树脂去除保护基,再进行环化作用并纯化从而获得目的肽。
质谱(M+H)+2124.8(理论值2125.0)
HPLC洗脱时间:19.2分钟
柱条件:
柱子:Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)
洗脱剂:按A/B=20/80-80/20进行线性密度梯度洗脱,其中A液为含0.1%TFA的10%乙腈,B液为含0.1%TFA的60%乙腈(20分钟)
流速:1.0ml/min
实施例27 Des-[Asp1、Phe2、Asp3]-MCH(MCH(4-19)、Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)的制备
将市售Boc-Val-OCH2PAM树脂(0.77 mmol/g树脂)0.5mmol分放入肽合成仪ABI 430A的反应罐中,按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次将Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu、Boc-Met导入该树脂,获得按要求保护的肽树脂。用实施例24的方法将该树脂去除保护基,再进行环化作用并纯化从而获得目的肽。
质谱(M+H)+2009.9(理论值2010.0)
HPLC洗脱时间:17.9分钟
柱条件:
柱子:Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)
洗脱剂:按A/B=20/80-80/20进行线性密度梯度洗脱,其中A液为含0.1%TFA的10%乙腈溶液,B液为含0.1%TFA的60%乙腈溶液(20分钟)
流速:1.0ml/min
实施例28 Des-[Asp1、Phe2、Asp3、Met4]-MCH(MCH(5-19)、Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH)的制备
将市售Boc-Val-OCH2PAM树脂(0.77 mmol/g树脂)0.5mmol分放入肽合成仪ABI 430A的反应罐中,按照Boc-strategy肽合成法(NMP-HOBt)依次将Boc-Gln、Boc-Trp(CHO)、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Try(Br-Z)、Boc-Val、Boc-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Leu、Boc-Met、Boc-Cys(MeBzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Leu导入该树脂,获得按要求保护的肽树脂。用实施例24的方法将该树脂去除保护基,再环化并纯化从而获得目的肽。
质谱(M+H)+1878.9(理论值1878.9)
HPLC洗脱时间:17.4分钟
柱条件:
柱子:Wakosil-II 5C18HG(4.6×150mm)
洗脱剂:按A/B=20/80-80/20进行线性密度梯度洗脱,其中A液为含0.1%TFA的10%乙腈溶液,B液为含0.1%TFA的60%乙腈溶液(20分钟)
流速:1.0ml/min
(非主题序列表)
SEQ ID NO:1
有关其它序列:第7和第16位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:2
有关其它序列:第7和第16位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:19
有关其它序列:第6和第15位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:20
有关其它序列:第5和第14位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:21
有关其它序列:第4和第13位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:22
有关其它序列:第3和第12位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:23
有关其它序列:第2和第11位2个Cys残基形成分子内二硫键。
SEQ ID NO:24
有关其它序列:第1和第10位2个Cys残基形成分子内二硫键。
工业利用
使MCH或其衍生物或其盐和SLC-1或其盐之间的结合特性改变的化合物或其盐的筛选方法,其特征为,该筛选方法使用本发明MCH或其衍生物或其盐及SLC-1或其盐,适用于筛选SLC-1激动剂和SLC-1拮抗剂,该激动剂可以用作治疗或预防药物等如,除了促进食欲(摄食)药物外,还有微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、剖腹产、人工流产、乳汁淤积等;而拮抗剂可以用作治疗或预防药物等如,除了治肥胖病的制剂(药物)、促进食欲(摄食)药物外,还有过强阵痛、强直性子宫收缩、胎儿窒息、子宫破裂、颈管裂伤、早产、普-威综合征等。
Claims (12)
1.一种化合物或其盐的筛选方法,该化合物或其盐能使黑色素凝集激素(MCH)或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变,其特征包括应用MCH或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐。
2.一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒,该化合物或其盐能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变,其特征为,试剂盒包含MCH或其衍生物或其盐以及SLC-1或其盐。
3.这种能使MCH或其盐与SLC-1或其盐之间的结合特性发生改变的化合物或其盐,通过权利要求1所述筛选方法或权利要求2所述筛选试剂盒获得。
4.一种药物,它包含权利要求3所述化合物或其盐。
5.权利要求4所述药物,为一种治肥胖病的药物。
6.一种含有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的蛋白质或其盐。
7.一种DNA,它所具有的碱基,为编码权利要求6所述的蛋白质。
8.权利要求1所述筛选方法或权利要求2所述筛选试剂盒,其中MCH为一种肽,其肽包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
9.权利要求1所述筛选方法或权利要求2所述筛选试剂盒,其中衍生物为一种肽,在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中其肽包含从N末端第5位至第19位的序列。
10.权利要求1所述筛选方法或权利要求2所述筛选试剂盒,其中衍生物为一种肽,其肽包含通过波德栋-亨特试剂衍生形成的MCH或通过波德栋-亨特试剂衍生形成的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中从N末端第5位至第19位的序列。
11.一种肽或其盐,它包含通过波德栋-亨特试剂衍生形成的MCH或通过波德栋-亨特试剂衍生形成的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中从N末端第5位至第19位的序列。
12.一种化合物或其盐,它用化学式表示。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP374454/98 | 1998-12-28 | ||
JP37445498 | 1998-12-28 | ||
JP12268899 | 1999-04-28 | ||
JP122688/99 | 1999-04-28 | ||
JP249300/99 | 1999-09-02 | ||
JP24930099 | 1999-09-02 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1344321A true CN1344321A (zh) | 2002-04-10 |
Family
ID=27314502
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN99816370A Pending CN1344321A (zh) | 1998-12-28 | 1999-12-27 | 筛选方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6991908B1 (zh) |
EP (1) | EP1143000B1 (zh) |
KR (1) | KR20020008111A (zh) |
CN (1) | CN1344321A (zh) |
AT (1) | ATE354098T1 (zh) |
AU (1) | AU1802000A (zh) |
CA (1) | CA2356412A1 (zh) |
DE (1) | DE69935159T2 (zh) |
WO (1) | WO2000040725A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111443209A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-07-24 | 中国中医科学院医学实验中心 | 一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法 |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6221613B1 (en) | 1998-12-31 | 2001-04-24 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human melanin concentrating hormone receptor (MCH1) and uses thereof |
CA2372980A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-23 | Astrazeneca Ab | Assays for agonists, agonists and inverse agonists of melanin concentrating hormone (mch) binding to the somatostatin-like receptor (slc-1) |
CA2378917A1 (en) * | 1999-07-14 | 2001-01-25 | Merck & Co., Inc. | Melanin-concentrating hormone receptor |
ATE479429T1 (de) * | 2000-04-28 | 2010-09-15 | Takeda Pharmaceutical | Antagonisten des melanin-konzentrierenden hormons |
AU2001269440A1 (en) | 2000-07-05 | 2002-01-14 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Method for screening mch receptor antagonist/agonist |
JP4780365B2 (ja) * | 2000-07-05 | 2011-09-28 | 武田薬品工業株式会社 | Mch受容体アンタゴニスト・アゴニストのスクリーニング方法 |
US7078484B2 (en) | 2001-04-19 | 2006-07-18 | Neurogen Corporation | Melanin concentrating hormone receptors |
US7078187B2 (en) | 2001-04-19 | 2006-07-18 | Neurogen Corporation | Melanin concentrating hormone receptors |
US6809104B2 (en) | 2001-05-04 | 2004-10-26 | Tularik Inc. | Fused heterocyclic compounds |
CN1330651C (zh) | 2002-11-06 | 2007-08-08 | 安姆根有限公司 | 稠合杂环化合物 |
JP2007502287A (ja) | 2003-08-13 | 2007-02-08 | アムジェン インコーポレイテッド | メラニン凝集ホルモン受容体アンタゴニスト |
JPWO2008001778A1 (ja) | 2006-06-27 | 2009-11-26 | 武田薬品工業株式会社 | 遺伝子改変動物およびその用途 |
US12008266B2 (en) | 2010-09-15 | 2024-06-11 | Pure Storage, Inc. | Efficient read by reconstruction |
US11614893B2 (en) | 2010-09-15 | 2023-03-28 | Pure Storage, Inc. | Optimizing storage device access based on latency |
KR20160101706A (ko) * | 2015-02-17 | 2016-08-25 | 싸이퍼롬, 인코퍼레이티드 | 자궁수축억제제 부작용 방지를 위한 개인별 단백질 손상 정보 기반의 자궁수축억제제 선택 방법 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5049655A (en) * | 1989-03-22 | 1991-09-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Melanin-concentrating hormones |
JPH06511386A (ja) * | 1991-10-01 | 1994-12-22 | アメリカ合衆国 | リガンドおよびリガンドのアンタゴニストを同定する方法 |
FR2687680A1 (fr) * | 1992-02-20 | 1993-08-27 | Centre Nat Rech Scient | Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. |
JPH08193099A (ja) * | 1994-11-14 | 1996-07-30 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規g蛋白質共役型レセプター蛋白質、その製造法および用途 |
WO1996018651A1 (en) | 1994-12-16 | 1996-06-20 | Smithkline Beecham Corporation | Human somatostatin-like receptor |
US5849708A (en) * | 1995-06-06 | 1998-12-15 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Promotion of eating behavior |
EP0848060A3 (en) | 1996-12-11 | 2000-02-02 | Smithkline Beecham Corporation | Novel human 11CB splice variant |
US20020038007A1 (en) * | 1996-12-11 | 2002-03-28 | Ames Robert S. | Method of finding agonist and antagonist to human 11cb splice variant |
DK0965041T3 (da) * | 1997-04-14 | 2009-05-25 | Arena Pharm Inc | Fremgangsmåde til identifikation af modulatorer af celleoverflade-membranreceptorer, som kan anvendes til behandling af sygdomme |
AU7688298A (en) * | 1997-05-23 | 1998-12-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Spirocyclopropyl fluorenes as melatonergic agents |
JP2001525178A (ja) | 1997-12-03 | 2001-12-11 | スミスクライン ビーチャム コーポレーション | ヒト11cbスプライス変異体に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索方法 |
US6221613B1 (en) * | 1998-12-31 | 2001-04-24 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human melanin concentrating hormone receptor (MCH1) and uses thereof |
-
1999
- 1999-12-27 WO PCT/JP1999/007336 patent/WO2000040725A1/ja active IP Right Grant
- 1999-12-27 US US09/869,540 patent/US6991908B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-27 AU AU18020/00A patent/AU1802000A/en not_active Abandoned
- 1999-12-27 EP EP99961418A patent/EP1143000B1/en not_active Revoked
- 1999-12-27 CA CA002356412A patent/CA2356412A1/en not_active Abandoned
- 1999-12-27 KR KR1020017008291A patent/KR20020008111A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-12-27 CN CN99816370A patent/CN1344321A/zh active Pending
- 1999-12-27 AT AT99961418T patent/ATE354098T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-12-27 DE DE69935159T patent/DE69935159T2/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111443209A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-07-24 | 中国中医科学院医学实验中心 | 一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法 |
CN111443209B (zh) * | 2020-03-26 | 2022-12-20 | 中国中医科学院医学实验中心 | 一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1143000A1 (en) | 2001-10-10 |
DE69935159D1 (de) | 2007-03-29 |
US6991908B1 (en) | 2006-01-31 |
EP1143000B1 (en) | 2007-02-14 |
EP1143000A4 (en) | 2005-01-12 |
DE69935159T2 (de) | 2007-10-25 |
WO2000040725A1 (en) | 2000-07-13 |
CA2356412A1 (en) | 2000-07-13 |
ATE354098T1 (de) | 2007-03-15 |
KR20020008111A (ko) | 2002-01-29 |
AU1802000A (en) | 2000-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1310945C (zh) | 人g蛋白偶联受体的内源形式和非内源形式 | |
CN1344321A (zh) | 筛选方法 | |
CN1034080C (zh) | 胰岛素类似物的制备方法 | |
CN1183158C (zh) | Exendin类似物,其制备方法及含有它们的药物制剂 | |
CN1283228A (zh) | 多肽、其生产方法及应用 | |
CN1149286C (zh) | G蛋白偶联受体蛋白的配体多肽及其生产方法和用途 | |
CN1324405A (zh) | 新型g蛋白偶联型受体蛋白、dna及其配体 | |
CN1419563A (zh) | 肽衍生物 | |
CN1871256A (zh) | 泪脂质运载蛋白的突变蛋白 | |
CN1176947C (zh) | 用于治疗骨质疏松症的甲状旁腺激素类似物 | |
CN1293096C (zh) | 合成甲状旁腺素类似物和甲状旁腺素相关肽的方法 | |
CN1328568A (zh) | 肽衍生物 | |
CN1615148A (zh) | 用于对iap抑制卡斯蛋白酶进行去阻遏的方法及组合物 | |
CN1165147A (zh) | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体蛋白质,其生产和应用 | |
CN1116305C (zh) | 肽衍生物 | |
CN1341123A (zh) | 新型g蛋白偶联型受体蛋白及其dna | |
CN1297566C (zh) | 编码新rg1多肽的dna | |
CN1333786A (zh) | 新的g蛋白偶联型受体蛋白、其dna及其配体 | |
CN1170933C (zh) | 促胃动素同系物 | |
CN1200000C (zh) | 促生长素抑制素类似物 | |
CN1390255A (zh) | 与疾病相关的基因用途 | |
CN1733918A (zh) | 促胃动素同系物 | |
CN1633498A (zh) | 新型胰岛素/胰岛素样生长因子/松弛素家族多肽及其dna | |
CN1296384C (zh) | 具有preptin功能的肽 | |
CN1397019A (zh) | 筛选方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |