WO2000040725A1 - Screening method - Google Patents

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WO2000040725A1
WO2000040725A1 PCT/JP1999/007336 JP9907336W WO0040725A1 WO 2000040725 A1 WO2000040725 A1 WO 2000040725A1 JP 9907336 W JP9907336 W JP 9907336W WO 0040725 A1 WO0040725 A1 WO 0040725A1
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mch
slc
salt
cells
derivative
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PCT/JP1999/007336
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Masaaki Mori
Yukio Shimomura
Shiro Takekawa
Tsukasa Sugo
Yoshihiro Ishibashi
Chieko Kitada
Nobuhiro Suzuki
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • Y10S436/808—Automated or kit

Definitions

  • the present invention relates to orphan receptor protein SLC-1 (such as FEBS Letters 398 (1996) 253-258) or a salt thereof and MCH (melanin concentrating hormone; Endocrinology, vol. 125, 1660-1665 ( 1989)) or a derivative thereof or a salt thereof, and a method for screening an antiobesity drug or an appetite preparation drug.
  • SLC-1 such as FEBS Letters 398 (1996) 253-258
  • MCH melanin concentrating hormone; Endocrinology, vol. 125, 1660-1665 ( 1989)
  • a derivative thereof or a salt thereof a method for screening an antiobesity drug or an appetite preparation drug.
  • Human SLC-1 found from the human genome (FEBS Letters 398 (1996) 253-258) and rat SLC-1 found from rat brain cDNA library 1 (Biochimica et Biophysica Acta 1401 (1998) 216-220) are collectively referred to as G protein-coupled receptors or seven transmembrane receptors, and many of the so-called orphan G protein-coupled receptor proteins whose ligands are unknown are known. It is a kind.
  • the challenge is to search for a ligand for SLC-1 which is an orphan receptor protein, and to establish a screening method for SLC-1 and compounds characterized by using the ligand. Disclosure of the invention
  • the inventors of the present invention used a cell in which cDNA encoding SLC-1 was expressed by an appropriate means, and measured the specific cell stimulation (signal transduction) activity as an index. Successfully screened for a polypeptide recognizing that the polypeptide was recognized as MCH (Melanin Concentrating Hormone).
  • MCH Melanin Concentrating Hormone
  • the present inventors have found that it is possible to screen for a compound that alters the binding between the activator MCH or a salt thereof and the above-mentioned SLC-1 or a salt thereof.
  • amino acid sequence of the human SLC-1 of the present invention was found to be a novel sequence different from that previously reported (FEBS Letters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651). ,
  • MCH melanin-concentrating hormone
  • kit (3) a compound that alters the binding between MCH or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof, which can be obtained using the screening method described in (1) above or the screening kit described in (2) above; Its salt,
  • a medicament comprising the compound according to (3) or a salt thereof.
  • DNA comprising DNA having a nucleotide sequence encoding the protein according to (6) above,
  • the derivative is the fifth to the 19th partial sequence from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 derived from MCH induced by Bolton-Han-Yuichi reagent or Bolton-Hunter reagent.
  • the SLC-1 in the present invention specifically includes the above-mentioned known SLC-1 or a salt thereof, and the like.
  • SLC-1 or a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11; or
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in which 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids have been added (or inserted) to the amino acid sequence represented by 11, or SEQ ID NO: 5 or No. 11 is a protein containing an amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence represented by 11 are substituted with another amino acid.
  • SLC-1 or a salt thereof described in (13) above is mentioned.
  • the MCH in the present invention specifically, not only the above-mentioned known MCH or a salt thereof and the like can be mentioned, but also
  • MCH or a derivative thereof or a salt thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; or
  • FIG. 1 shows the results of measuring the CH0 / SLC-1 cell-specific cAMP synthesis inhibitory activity of an HPLC fraction prepared from rat brain.
  • FIG. 2 shows the behavior of rat brain HPLC fraction # 34 in Reference Example 1 in response to pronase treatment of cAMP synthesis inhibitory activity.
  • FIG. 3 shows the results obtained by measuring the cAMP synthesis-inhibitory activity specific to CH0 / SLC-1 cells for the fraction purified by the 0DS column (Develos I0DS-UG-3) in Reference Example 3.
  • FIG. 4 shows a comparison of the gene expression levels of the rat SLC-1 gene-expressing CH0 cell line by in situ hybridization.
  • FIG. 5 shows cAMP synthesis inhibitory activity of various concentrations of MCH on CH0 / SLC-1 cells.
  • FIG. 6 shows the arachidonic acid metabolite release activity of various concentrations of MCH on CH0 / SLC-1 cells.
  • Figure 7 shows MCH, MCH (2-1 9), MCH (3-1 9), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-1 9), and ⁇ 11 (7 -19) 6? The result of measuring agonist activity using 7 ⁇ binding atsee is shown.
  • Figure 8 shows the GTP-S binding proteins of MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19) and MCH (5-19) derivatized with a non-isotopic Bolton-Hunter reagent. The result of measuring the agonist activity using the assay is shown.
  • FIG. 9 shows the specific binding of [
  • Figure 1 0 is fabricated using the Porton one Han evening first reagent [ '25 1] - signs MCH (4-19) 4 shows the binding inhibitory activity of MCH against MCH.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION “substantially the same” refers to an activity of a polypeptide or the like, for example, a binding activity between a ligand (MCH) and a receptor (SLC-1), a physiological property. Etc. mean substantially the same.
  • SLC-1 or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as SLC-1) and MCH or a derivative thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as MCH) used in the present invention will be described. This will be described in more detail below.
  • SLC-1 and MCH used in the present invention include humans, warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, pigs, sheep, sheep, monkeys, etc.) and all tissues such as fish (eg, pituitary gland, Polypeptide derived from kidney, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, heart, etc.) May be any polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11, and MCH. There may be.
  • warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, pigs, sheep, sheep, monkeys, etc.
  • tissues eg, pituitary gland, Polypeptide derived from kidney, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung,
  • the SCL-1 of the present invention includes, in addition to the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11, etc., as well as the polypeptide represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11
  • polypeptides include polypeptides having substantially the same activity as the polypeptide containing the amino acid sequence.
  • substantially equivalent activities include, for example, ligand binding activity and signal transduction activity.
  • “Substantially the same quality” means that the ligand binding activity and the like are substantially the same. Therefore, the strength and strength of the ligand binding activity and the like, and the quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • the MCH of the present invention includes, in addition to a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like, a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 refraining the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like.
  • Examples include polypeptides having substantially the same activity as the polypeptide.
  • Examples of substantially the same activity include receptor binding activity.
  • the term “substantially the same” means that the receptor binding activity and the like are the same in nature. Therefore, quantitative factors such as the strength of the receptor binding activity and the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • SLC-1 and MCH are N-terminal (amino terminal) at the left end and C-terminal (carboxyl terminal) at the right end in accordance with the convention of peptide notation.
  • a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 11 usually has a carboxyl group (-C00H) or carboxylate (-C00-) at the C-terminus. although, C-terminal, an amide (-C0NH 2) or an ester - or an (C00R).
  • R of the ester such as methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl or ⁇ such as n- butyl - e alkyl group, Shikurobe pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, phenyl, alpha - naphthyl C 6, such as Le - 1 2 Ariru group, benzyl, phenethyl, full Eniru C Bok 2 alkyl such as benzhydryl, or alpha - such as naphthylmethyl alpha - Nafuchiru C Bok; ⁇ other C 1 4 Ararukiru group such as an alkyl, Examples include pivaloyloxymethyl groups commonly used as oral esters.
  • salts with physiologically acceptable bases for example, alkali metals and the like
  • acids organic acids and inorganic acids
  • Preferred acid addition salts are: Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, me
  • SLC-1 and MCH used in the present invention can be obtained by a method according to a known method (eg, the method described in FEBS Letters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651), 0
  • the polypeptide can be produced by a method of purifying a polypeptide from a tissue or cells of a warm-blooded animal, or can be produced according to a protein (peptide) synthesis method described later. Alternatively, it can be produced by culturing a transformant containing DNA encoding a protein (peptide) described below.
  • the SLC-1 and MCH used in the present invention can be prepared by a known method for synthesizing a protein (peptide) or by combining SLC-1 and a protein (peptide) containing Z or MCH with an appropriate peptide. It can be manufactured by cutting with ze.
  • a method for synthesizing a protein (peptide) for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid capable of constituting SL C-1 and Z or MCH is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is removed to thereby obtain the target protein (peptide).
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • proteins (peptides) can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction 'distillation' column chromatography ⁇ liquid chromatography ⁇ recrystallization.
  • solvent extraction 'distillation' column chromatography ⁇ liquid chromatography ⁇ recrystallization When the protein (peptide) obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method. Conversely, when the protein (peptide) is obtained in a salt form, it can be converted to a free form by a known method. Can be converted.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxy resin.
  • Methylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc aminoethyl) Phenoxy resin and the like can be given.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the desired peptide according to various condensation methods known per se.
  • the protein (peptide) is cleaved from the resin and at the same time, various protecting groups are removed, and if necessary, an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein (peptide).
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • carpoimides include DCC, ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarbodiimide, ⁇ -ethyl- ⁇ '-(3-dimethylaminopropyl) carbopimide.
  • protected amino acids may be added directly to the resin along with racemization inhibitors (e.g., H0BT, H00BT, etc.) or pre-protected as symmetrical anhydrides or ⁇ 0 ⁇ esters or H00BT esters Amino j 0
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein (peptide) condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or An appropriate mixture of these is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be used for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about 120 T: to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4 times excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, benzoyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CuZ, Br-Z Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tertiary butyl group.
  • the protecting group of Fueno Ichiru hydroxyl group of tyrosine for example Bz l, C l 2 -Bz K
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Activated forms of the raw propyloxyl group include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, and activated esters [alcohols (eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenolimide, and ester with H0BT).
  • the activated amino group of the raw material includes, for example, the corresponding phosphoric amide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon in a stream of hydrogen, as well as anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, and trifluorosulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd black or Pd carbon in a stream of hydrogen
  • Examples include acid treatment with an acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of 120 to 40 ° C.
  • a cation scavenger such as 1,4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol and 1,4-butane described above.
  • deprotection by acid treatment in the presence of dithiol and the like it is also removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of SLC-1 and MCH As another method for obtaining an amide form of SLC-1 and MCH, first, after amidating the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl-terminal amino acid, extending the peptide chain to the amino group side to a desired chain length, A peptide was prepared by removing only the protecting group of the amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain, and a peptide (or amino acid) was prepared by removing only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus. Condensate in a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein (peptide) can be obtained. The crude protein (peptide) is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein (peptide).
  • the desired protein ( ⁇ ) is obtained in the same manner as the protein (peptide) amide form. Ester) can be obtained.
  • the derivatives of MCH used in the present invention include (1) a partial peptide of MCH, (2) a peptide in which the constituent amino acids of MCH have been deleted, a peptide in which other amino acids have been added to the constituent amino acids, and a constituent amino acid that has been substituted with another amino acid. Peptide, or ,.
  • Any compound may be used as long as it has an ability to bind to SLC-1 such as MCH, a partial peptide described in (1) above, or a peptide labeled in (2) described above.
  • the MCH partial peptide include a peptide containing the 5th to 19th partial sequences from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amide or ester thereof, or a salt thereof. And so on. More specifically, it has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24 Peptides, their amides, their esters or their salts, and the like.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof is particularly preferably used.
  • Examples of the peptide in which the constituent amino acids of MCH have been deleted, the peptide in which another amino acid has been added to the constituent amino acids, and the peptide in which the constituent amino acids have been substituted with other amino acids include one or more of SEQ ID NO: 2. (Preferably about 1 to 10, more preferably several (one or two)) amino acids are deleted, or one or more amino acids are added to the amino acid sequence (preferably 1 to 10 About one, more preferably about 1 to 5, more preferably several (1 or 2) amino acids, or one or more amino acids (preferably 1 to 1) in the amino acid sequence. Peptides in which about 0, more preferably about 1 to 5, and still more preferably several (1 or 2) amino acids have been substituted with other amino acids.
  • Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence may be selected, for example, from other amino acids of the class to which the amino acid belongs.
  • Non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, iso-isocyanate, norin, proline, phenylalanine, tributofan, and methionine.
  • Polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glumic acid.
  • the position at which the above-mentioned other amino acid is deleted or substituted is preferably a position other than Cys in the constituent amino acids of MCH.
  • the peptide described in (1) or the peptide described in (2) is labeled, isotope-labeled or fluorescent-labeled (for example, fluorescent labeling with fluorescein, etc.) by a method known per se. , Biotinylated, enzyme-labeled, and the like.
  • MCH labeled with [H], [I], [C], [S] or the like by a known method can be used.
  • an MCH or derivative thereof prepared by a known method using a Bolton-Hunter reagent can also be used.
  • Examples of the salt of MCH or a derivative thereof include those similar to the salts of SLC-1 and MCH described above.
  • the DNA encoding SLC-1 used in the present invention includes a nucleotide coding for a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11.
  • the DNA containing the DNA having the sequence, and the DNA encoding the MCH used in the present invention include bases encoding a peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Any DNA may be used as long as it contains DNA having a sequence. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described tissue / cell, cDNA library derived from the aforementioned tissue / cell, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the above-described tissue / cell.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • (1) contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11 under stringent conditions Containing a DNA having a nucleotide sequence encoding a protein or peptide to be hybridized to a sequence having a DNA j ⁇
  • DNA encoding SLC-1 or MCH used in the present invention can also be produced by the following genetic engineering techniques.
  • a PCR method known per se using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of SLC-1 or MCH of the present invention is used.
  • Selection can be carried out by hybridization with the A fragment or the one labeled with synthetic DNA.
  • the hybridization is performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • a commercially available library it is performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the cloned DNA encoding SLC-1 or MCH used in the present invention can be used as it is, or digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired, if desired.
  • the DNA is translated to its 5 'end. , n
  • the expression vector of SLC-1 or MCH used in the present invention is, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding SLC-1 or MCH used in the present invention; Is ligated downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, TP5, pC194
  • Plasmids eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as phage lambda
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus and the like are used.
  • the promoter used may be any promoter that is appropriate for the host used for the expression of the gene.
  • the promoter derived from SV40 the retrovirus promoter, the metamouth thionein promoter, the human shock promoter, the cytomegalovirus promoter, and the SRa promoter are used. Evening is available.
  • the host is a genus Escherichia, Trp promoter — overnight, T7 promoter overnight, lac promoter overnight, recA promoter, ⁇ PL promoter, 1 pp promoter overnight, etc., and the host is Bacillus If the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter, etc.If the host is yeast, it is SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. One day and one night is preferred. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 peptide, and the like are preferable. i 9
  • an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. may be used. be able to.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene (methotrexate (MTX) resistance) and ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ) And a neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) etc.
  • DHFR gene when used as a selection marker using CHO (dh fr-) cells, thymidine is used.
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the N-terminal side of the polypeptide or its partial peptide. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, hoA- If the host is a Bacillus genus, such as the signal sequence and the O-A signal sequence, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence If the host is an animal cell, for example, the mating factor a (MFH) ⁇ signal sequence, the signal sequence of the inbell, the signal sequence, etc., if the host is an yeast, for example, the insulin signal sequence. 0, interferon 'signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
  • MMH mating factor a
  • a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia, a bacterium belonging to the genus Bacillus, a yeast, an insect or an insect cell, an animal cell and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12, DH1 [Processings of the National Academy of Sciences, Prosl. Acad. Sci. USA), Vol. 60, 160 (1968)], JM 103 , (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], JA 221 [Journal of Molecular Biology], 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal 'ob' More Kiyura 'biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. are used.
  • Bacillus spp. include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984)].
  • yeast for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell) and Trichoplusia
  • MG1 cells derived from the midgut HighFive cells derived from Trichoplusiani eggs, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used.
  • viruses When the virus is BmNPV, a cell line derived from silkworm (Bombyx mori N; BmN cell) is used.
  • Sf cell examples include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell [Vaughn, JL et al., In Vitro, Vol. 13, pp. 213-217 (1977) )] Etc. are used.
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CH O (dhir-CHO cells), mouse L cells, mouse 3T3 cells, mouse myeoma cells, Human HEK293 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells 2 j
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 can be used to transform Escherichia species. Vol., 2110 (1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
  • transformation of Bacillus sp. For example, Molecular & General Genetics, 1 68, 1 1
  • Transformation of insect cells or insects is performed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology, Vol. 52, 456 (1973).
  • Methods for introducing the expression vector into cells include, for example, the lipofection method (Feigner, PL et al. Processings 'ob The National' Academy 'ob' Sciences 'ob' the 'SA' (Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America), 84, 7413 (1987)], calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology, 52, 456] — 467 (1973)], electroporation [Nuemann, E. et al., Embo's Journal (EMB0 II.), 1, 841-845 (1982)].
  • the lipofection method Fraigner, PL et al. Processings 'ob The National' Academy 'ob' Sciences 'ob' the 'SA' (Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America)
  • calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology, 52, 456]
  • the SLC-1 or MCH used in the present invention is encoded.
  • a transformant transformed with the expression vector containing DNA is obtained.
  • the above-described expression vector introduced into animal cells is incorporated into a chromosome.
  • a stable animal cell line having a high expression ability of SLC-1 or MCH used in the present invention is obtained by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained using the selectable marker as described above. be able to.
  • the culture is performed by gradually increasing the MTX concentration and a resistant strain is selected, whereby the SLC-1 or MCH used in the present invention can be encoded together with the dhfr gene.
  • the DNA to be expressed can be amplified intracellularly to obtain a more highly expressed animal cell strain.
  • the above transformant is cultured under conditions in which DNA encoding SLC-1 or MCH used in the present invention can be expressed, and SLC-1 or MCH used in the present invention is produced and accumulated.
  • the SLC-1 or MCH used in the present invention can be produced.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Inorganic or organic substances such as liquids, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing Escherichia bacteria for example, glucose, M9 medium containing amino acids [MiUer, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 43 1-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 ] Is preferred. If necessary, an agent such as 33-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an insect cell, the culture medium may be Grace's Insect Medium (Grace, TC, Nature, 195, 788 (1962)). Those to which additives are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • MEM medium containing 5-20% fetal bovine serum (Science, 122, 501 (1952)), DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, Volume 199, 519 (1967)], 199 Medium [Proceding of the American Society] * The 'Biological Medicine' (Proceeding of the Society for The Biological Medicine), 73, 1 (1950)] is used.
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • DMEM medium containing dialysed fetal serum containing almost no thymidine.
  • the SLC-1 or MCH used in the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated. After disrupting the cells or cells by lysozyme and / or freeze-thawing, a method of obtaining a crude extract of SLC-1 or MCH used in the present invention by centrifugation or filtration may be appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark, sometimes abbreviated as TM).
  • SLC-1 or MCH used in the present invention When SLC-1 or MCH used in the present invention is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • the purification of SLC-1 or MCH can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Methods that use differences in charge methods that use differences in charge, such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinities, such as affinity chromatography, and differences in hydrophobicity, such as reverse-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method using the difference between isoelectric points such as isoelectric focusing electrophoresis and chromatofocusing.
  • SLC-1 or MCH used in the present invention When the thus obtained SLC-1 or MCH used in the present invention is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained in a salt form, Can be converted into a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the SLC-1 or MCH used in the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified before or after purification by the action of an appropriate protein-modifying enzyme, or the protein (peptide) can be modified. It can also be partially removed.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • a known Edman method using Edman reagent phenylisothiocyanate
  • the presence of the thus generated SLC-1 or MCH used in the present invention can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody or the like.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property between MCH or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof (hereinafter, abbreviated to a screening method of the present invention and a screening kit of the present invention) Is described in detail below.
  • a compound eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.
  • Such compounds include cell stimulatory activity via SLC_1 (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation Compounds having an activity of promoting or suppressing intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, lowering of pH, etc. (ie, SLC-1 agonist) and compounds having no such cell stimulating activity (That is, SLC-1 anniversary gonist).
  • SLC_1 eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation
  • SLC-1 agonist e.g, SLC-1 agonist
  • Changing the binding between MCH or its salt and SLC-1 or its salt means that it inhibits the binding of MCH or its salt to SLC-1 or its salt and
  • the present invention relates to (i) a case where MCH or a derivative thereof or a salt thereof is brought into contact with SLC-1 or a salt thereof, and (ii) a case where MCH or a derivative thereof is contacted with the above-mentioned SLC-1 or a salt thereof. Or a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between MCH or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof, which is compared with the case of contacting the salt with a test compound. I do.
  • SLC-1 a compound that activates SLC-1
  • a compound that activates SLC-1 for example, MCH or a derivative thereof or a salt thereof
  • SLC-1 mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, Intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Activity that promotes or suppresses pH decrease, etc.
  • a compound that activates SLC-1 (for example, MCH or a derivative thereof or a salt thereof) is transformed into SLC-1 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SLC-1.
  • a compound that activates SLC-1 and a test compound are brought into contact with SLC-1 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding SLC-1.
  • SLC-1 mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential Fluctuations, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, and activities that promote or suppress pH reduction, etc.
  • MCH or its salts SLC-1 mediated cell stimulating activity
  • the SLC-1 used in the screening method of the present invention Any substance may be used as long as it contains LC-11, but membrane fractions of organs such as humans, warm blooded animals, and fish are preferred. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, SLC-1 and the like, which are expressed in large amounts using recombinants, are suitable for screening.
  • the human-type SLC-1 has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 compared to the SLC-1 represented by the amino acid sequence of a previously reported report (eg, FEBS Letters 398 (1996) 253-258). Use of the contained SLC-1 enables highly sensitive screening.
  • the cells When cells containing SLC-1 are used, the cells may be immobilized with dataraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing SLC-1 refers to a host cell expressing SLC-1.
  • Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • the membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a ring blender or polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, pressing the cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, etc. Crushing by eruption.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000 to 30000 rpm) for 30 min. Centrifuge for 2 minutes to 2 hours The resulting precipitate is the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed SLC-1 and many membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of SLC-1 in the cells or membrane fraction containing the SLC-1 is preferably 10 to 10 molecules, and more preferably 10 to 10 molecules per cell.
  • the 3: 1 fraction is preferably a natural SLC-1 fraction or a recombinant SLC-1 fraction having the same activity.
  • the equivalent activity indicates equivalent ligand binding activity and the like.
  • the labeled ligand or the compound having ligand activity includes a labeled ligand or ligand.
  • MCH or its derivatives Compounds having activity (MCH or its derivatives) and the like are used.
  • a ligand (MCH or a derivative thereof) labeled with ['H], [I], [C], [S] or the like can be used.
  • MCH derivative prepared by a known method using Bolton-Hunter reagent.
  • Specific examples of the labeled MCH derivative include, for example, the compounds represented by the above (1) to (7).
  • a compound that alters the binding between (3! ⁇ Or a salt thereof and 3 (-1) first, cells containing SLC-1 or a membrane fraction of the cells are subjected to Prepare a sample of the receptor by suspending it in a buffer suitable for screening, including a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8), a ligand such as Tris-HCl buffer, and a receptor buffer.
  • a buffer suitable for screening including a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8), a ligand such as Tris-HCl buffer, and a receptor buffer.
  • Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding of. Also, non-specific binding
  • Surfactants such as CHAPS, Tween-80 (Kao-Ichi Atlas), digitonin, and deoxycholate can be added to the buffer to reduce the amount of water.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide sutin is added to suppress the degradation of SLC-1 or MCH or its derivative by protease. You can also.
  • a fixed amount (5000 cpm to 5000 Ocpm) of labeled MCH or a derivative thereof is added to 0.0 lm 1 to 10 ml of the receptor solution, and 10 to 10 xM test compound is simultaneously allowed to coexist.
  • the specific binding amount (B-NSB) is, for example, 50%.
  • % Of the test compound can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • BI Acore manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
  • MCH or a derivative thereof is immobilized on a sensor chip by an amino coupling method according to a protocol attached to a device, and a cell containing SLC-1 or a trait containing DNA encoding SLC-1 is obtained.
  • SLC-1 or membrane fraction containing SLC-1 purified from the converter, or membrane fraction containing purified SLC-1 or SLC-1 and buffer such as phosphate buffer or Tris buffer containing test compound Liquid is applied on the sensor chip every minute. Pass through at H1 flow rate.
  • cell stimulating activity via SLC-1 for example, arachidone
  • Acid release for example, arachidone
  • acetylcholine release for example, acetylcholine release
  • intracellular Ca release for example, cell stimulating activity via SLC-1 (for example, arachidone) Acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphatase production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH Activity that promotes or suppresses the decrease, etc.)
  • SLC-1 for example, arachidone
  • the cells Prior to screening, the cells were exchanged for fresh media or a suitable buffer that was not toxic to cells, test compounds were added, and the cells were incubated for a certain period of time.
  • the product is quantified according to the respective method.
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • SLC-1 Expression cells are required.
  • the cells expressing the SLC-1 of the present invention the above-mentioned recombinant SLC-1-expressing cell line and the like are desirable.
  • the SLC-11-expressing cell as a transformant may be a stable expression strain or a transient expression strain. The same kind of animal cells as described above are used.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • G protein in the cell is activated and GTP is bound. This phenomenon is also observed in the membrane fraction of receptor-expressing cells. Normally, GTP is hydrolyzed and changes to GDP, but if GTPaS is added to the reaction solution at this time, GTPaS binds to G protein like GTP, but is not hydrolyzed Thus, the state of binding to the cell membrane containing G protein is maintained.
  • the activity of stimulating the receptor-expressing cells of the receptor agonist can be measured by measuring the radioactivity remaining on the cell membrane. Using this reaction, the stimulatory activity of MCH or its derivative on SLC-11-expressing cells can be measured.
  • This method does not use cells containing SLC-1 as described in 1 to 4 above, but is an Atsey method using a membrane fraction containing SLC-11 as in 1 to 3.
  • the cell stimulating activity is measured.
  • a substance exhibiting GTP rS binding promoting activity to the SLC-1 membrane fraction is an agonist.
  • this is carried out according to Examples 9 and 16 to be described later and a method analogous thereto.
  • the addition of MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof, and a test compound was compared with the administration of MCH or a derivative thereof alone to show a change in the activity of promoting GTPaS binding to the SLC-1 cell membrane fraction.
  • MC by observing Compounds that change the binding between H and SLC-1 can be screened.
  • a compound exhibiting an activity of suppressing the activity of promoting the GTPrS binding to the SLC-1 cell membrane fraction by MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the activity of promoting GTP-AS binding to the SLC-1 cell membrane fraction.
  • the cell membrane fraction containing human or rat SLC-1 prepared by the method described in Example 9 or Example 16 described below was combined with a membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, 1 mM). Dilute with L GDP, 0.1% BSA pH 7.4).
  • the dilution ratio depends on the expression level of the receptor. This is dispensed in 0.2 ml aliquots into Falcon2053, and MCH or its derivative or MCH or its derivative and the test compound are added. Further, [ 35 S] GTPTS is added to a final concentration of 200 M.
  • the quantitation variable by SPA method have a certain anti-cAMP antibody protein A is the use of the beads and 125 1-labeled cAMP scintillant containing fixed using such antibodies to such animal IgG used in the anti-cAMP antibody production Noh (using a kit from Amersham Fulmasia Biotech).
  • the inhibition of cAMP production is specifically carried out by Example 14 described later and a method analogous thereto.
  • the intracellular cAMP level is increased by a ligand such as forskolin or calcitonin that increases the intracellular cAMP level, and MCH or a derivative thereof, or MCH or a derivative thereof and a test compound are added.
  • Changes in the suppression of intracellular cAMP levels by single administration of MCH or a derivative thereof can be screened for compounds that alter the binding between MCH and SLC_1.
  • a compound exhibiting an activity of inhibiting the activity of suppressing the cAMP production of SLC-1 expressing cells by MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • a compound showing agonist activity can be screened by adding only the test compound and examining the cAMP production inhibitory activity.
  • the screening method is described more specifically below. Inoculate CH0 / SLC-1 cells in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well, and culture for 48 hours. Wash cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, 0.23 1 ⁇ sobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES) The Hank's buffer (pH 7.4) containing is called a reaction buffer.) Then add 0.5 ml of reaction buffer and keep incubator for 30 minutes.
  • the amount of cAMP produced by forskolin stimulation was taken as 100%, and the amount of cAMP inhibited by the addition of 1 nM MCH or its derivative was taken as 0%. Calculate the impact.
  • a test compound that inhibits the activity of MCH or a derivative thereof and has a cAMP production activity of, for example, 50% or more can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • cAMP produced by adding a test compound to CH0 / SLC-1 cells without adding forskolin is quantified by the above method.
  • DNA containing a CRE (cAMP response element) is inserted into a multicloning site upstream of the Luciferase gene of Pitka Gene Basic Vector 1 or Pitka Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.). Is a CRE-reporter gene vector.
  • stimulation with increased cAMP induces CRE-mediated luciferase gene expression and subsequent luciferase protein production. That is, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of cAMP in the CRE-reporter gene vector-introduced cells.
  • a cell obtained by transfecting a CRE-repo overnight gene vector into an SLC-1 expressing cell a compound that changes the binding between MCH and SLC-1 can be screened. The specific screening method is described below.
  • CRE-repo overnight transfected SLC-1 expressing cells are seeded in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / we11 and cultured for 48 hours. Wash cells with Hanks buffer ( ⁇ 7.4) containing 0.2 mM 3 -isobutyl-methyl xanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereafter, 0.2 mM 3-isobutyl-methyl xanthine and 0.05 % Hanks buffer (PH7.4) containing BSA and 20 mM HEPES is called the reaction buffer). That Then, add 0.5 ml of reaction buffer and incubate in the incubator for 30 minutes.
  • reaction buffer After removing the reaction buffer and adding a new 0.25 ml reaction buffer to the cells, add 1 nM MCH or its derivative or 1 nM MCH or its derivative and test compound and 2 M forskolin. Add 0.25 ml of the reaction buffer to the cells and incubate at 37 ° C for 24 minutes. Lyse the cells with a cell lysing agent for Pitka Gene (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) and add a luminescent substrate (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) to the lysate. Luminescence from luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter.
  • the effect of a compound that alters the binding between MCH and SLC-1 can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with that obtained when MCH or a derivative thereof is administered alone.
  • the administration of MCH or a derivative thereof suppresses an increase in the amount of luminescence due to forskolin stimulation, and a compound that reverses this suppression can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • it is also possible to screen for agonists by administering only the test compound and observing the same suppression of the amount of luminescence increased by forskolin stimulation as that of MCH or a derivative thereof.
  • alkaline phosphatase As the repo overnight gene, other than luciferase, for example, alkaline phosphatase, chloramphenic acid acetyltransferase or -galactosidase can also be used.
  • the enzymatic activities of the gene products of these repo overnight genes can be easily measured using a commercially available measurement kit as follows.
  • Alkaline phosphatase activity can be measured, for example, by Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • chloramphenicol acetyl transferase activity can be measured by, for example, FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTi.
  • the ⁇ -karak-sidase activity can be measured by, for example, Aurora Gate XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • SLC-1 expressing cells excrete arachidonic acid metabolites as a result of MCH stimulation discharge.
  • arachidonic acid having radioactivity By introducing arachidonic acid having radioactivity into cells in advance, this activity can be measured by measuring radioactivity released outside the cells. The measurement is carried out according to Example 6 described later and a method analogous thereto.
  • MCH or its derivative or MCH or its derivative and a test compound the effect of MCH or its derivative on the release of arachidonic acid metabolites was examined to determine the binding between MCH and SLC-11. Screening for compounds that have an effect can be performed.
  • a compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • CH0 / SLC-1 cells are seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 eel 1 / wel 1, cultured for 24 hours, and [3 ⁇ 4] arachidonic acid is added at 0.25 Ci / well. [3 ⁇ 4] Sixteen hours after the addition of arachidonic acid, the cells were washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, and each well was washed with Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES. )), Add 500 nM of MCH or its derivative or a buffer containing 10 nM of MCH or its derivative and the test compound.
  • Hanks buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES is referred to as a reaction buffer. After incubating at 37 ° C for 60 minutes, 400 l of the reaction solution is added overnight, and the amount of [3 ⁇ 4] arachidonic acid metabolite released in the reaction solution is measured by a scintillation counter. The amount of [ ⁇ ⁇ ] arachidonic acid metabolite in the medium from the reaction buffer without MCH or its derivative added, and [] arachidonic acid metabolite in the medium when 10 nM MCH or its derivative was added Of the test compound on the binding of SLC-1 to MCH or its derivative with 100% Is calculated.
  • a test compound having a arachidonic acid metabolite-producing activity of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • SLC-1 expressing cells are stimulated by MCH to increase intracellular Ca concentration.
  • the effect of the test compound on the binding between MCH and SLC-1 can be examined.
  • the SLC-1 expressing cells were seeded on a sterile microscope glass cover. Two days later, the culture solution was replaced with HBSS containing 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories) and incubated at room temperature for 2 hours. Leave for a minute. After washing with HBSS, set a cover glass on the cuvette, and use a fluorimeter to measure the fluorescence intensity of 505 nm at the excitation wavelength of 340 nm and 380 nm when MCH or its derivative or MCH or its derivative and the test compound are added. Measure the increase in ratio.
  • HBSS containing 4 mM Fura-2 AM (Dojindo Laboratories)
  • DNA containing TRE is Vector or Pitka Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) into the multiple cloning site upstream of the luciferase gene, and use this as the TRE-repo overnight gene vector.
  • TRE-reporter gene vector stimulation with intracellular Ca elevation induces TRE-mediated luciferase gene expression and subsequent luciferase protein production. That is, by measuring the luciferase activity, it is possible to detect a change in the amount of calcium in the cells into which the TRE-1 reporter gene vector has been introduced.
  • the specific method of screening for a compound that alters the binding between MCH and SLC-1 using cells obtained by transfecting a TRE-reporter gene vector into SLC_1-expressing cells is described below.
  • TRE-reporter gene-introduced SLC-1 expressing cells are seeded at 5 ⁇ 10 3 cells / well in a 24-well plate and cultured for 48 hours. After washing the cells with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES, add 10 nM MCH or its derivative, or 10 nM MCH or its derivative and the test compound, and add 37 ° C. Incubate at C for 60 minutes. The cells are lysed with a cell lysing agent for Pitka Gene (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.), and a luminescent substrate (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) is added to the lysate.
  • a cell lysing agent for Pitka Gene Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.
  • a luminescent substrate Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.
  • Luminescence from luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter.
  • the effect of a compound that alters the binding between MCH or a derivative thereof and SLC-11 can be measured by comparing the amount of luminescence by luciferase with the case where MCH or a derivative thereof is administered alone.
  • administration of MCH or a derivative thereof increases the amount of luminescence due to an increase in intracellular Ca.
  • a compound that suppresses this increase can be selected as a candidate substance having an antagonistic ability.
  • screening of agonists can be performed by administering only the test compound and observing an increase in the amount of luminescence similar to that of MCH or a derivative thereof.
  • reporter genes other than Luciferase, for example, Evening, chloramphenicol acetyltransferase or i3-galactosidase can also be used.
  • the enzymatic activities of the gene products of these repo overnight genes can be easily measured using a commercially available assay kit as follows.
  • Alkaline phosphatase activity was measured by, for example, Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and chloramphenicol acetyl transferase activity was measured by, for example, FAST CAT chrola manufactured by Wako Pure Chemical Industries henicol Acetyl transferase Assay Kit (The lJT3-calactosidase activity can be measured by, for example, Aurora Gate XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • MAP kinase activation Proliferation of SLC-1 expressing cells in response to MCH is observed by MAP kinase activation. This proliferation can be measured by MAP kinase activity, thymidine incorporation, and cell count (such as MTT). This can be used to screen for compounds that alter the bond between SLC-1 and MCH or its derivatives.
  • MAP kinase activity was determined by adding MCH or its derivative or MCH or its derivative and a test compound to cells, and obtaining a MAP kinase fraction from the cell lysate by immunoprecipitation using an anti-MAP kinase antibody. It can be easily measured using MAP Kinase Assay Kit manufactured by Kojun Pharma and A- [ 32 P] -ATP.
  • MTT 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5- diphenyl-2H-tetrazolium bromide
  • MTT formazan which has been taken up into cells and changed in MTT, has been acidified with hydrochloric acid. It can also be measured by lysing the cells with propanol and measuring the absorbance at 570 nm.
  • the effect of a compound that alters the binding between MCH and SLC-1 can be measured by comparing the increase in radioactivity due to incorporation of thymidine with that when MCH or a derivative thereof is administered alone.
  • a compound that suppresses an increase in radioactivity due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing an increase in radioactivity similar to that of MCH or a derivative thereof.
  • a compound that suppresses an increase in radioactivity due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • an agonist can be screened by administering only a test compound and observing an increase in radioactivity similar to that of MCH or a derivative thereof.
  • the activity of MCH is measured by measuring the extracellular pH (acidification rate), which changes in response to MCH in SLC-1 expressing cells, using a Cyto sensor device, Molecular Tepa, IS. Can be measured.
  • a specific screening method for a compound that changes the binding between MCH and SLC-1 by measuring the change in extracellular pH using a Cytosensor apparatus is described below.
  • SLC-1 expressing cells are cultured overnight in a capsule for Cyto sensor device, set in the chamber of the device, and RPMI1640 medium containing 0.1% BSA for about 2 hours until the extracellular pH is stabilized (Molecular Device) Perfuse. After the pH is stabilized, the pH change of the medium caused by perfusing the medium containing MCH or a derivative thereof or MCH or a derivative thereof and a test compound onto the cells is measured. The effect of a compound that alters the binding between MCH and SLC-1 can be measured by comparing the extracellular pH change of SLC-11-expressing cells with MCH or its derivative alone. At this time, compounds that suppress the extracellular pH change due to the administration of MCH or a derivative thereof have a competitive inhibition ability. ⁇
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the same extracellular changes as those of MC or its derivatives.
  • Sex pheromone receptor STe2 of yeast Sacharomyces cerevisiae caploid ⁇ -mating Type (MAT o;;) is coupled with G protein Gpal, and When activated, Farl (cell-cycle arrest) and the transcriptional activator Stel2 are activated, and Stel2 induces the expression of various proteins including FUS1 involved in conjugation.
  • a yeast into which a receptor gene has been introduced is produced, a signal transduction system in yeast cells is activated by receptor agonist stimulation, and the resulting index such as proliferation is used. Attempts have been made to measure the reaction between the receptor agonist and the receptor (Pausch, MH, Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)). Utilizing yeast system for MCH and SL C-1 Screening of compounds that alter the bond can be performed.
  • 3 ⁇ 41 ⁇ 2D0 Remove the gene encoding yeast 5162 ⁇ ⁇ 1 and replace it with the SLC-1 gene and the gene encoding the Gpa2 Gai2 fusion protein.
  • the gene encoding Far is removed so that no eel cycle arrest occurs, and the sensitivity of response to MCH is improved by removing the gene encoding Sst.
  • the FUS1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1 is introduced.
  • the above-described genetic recombination operation is performed, for example, by the method described in the report of Price et al. (Price, LA et al., Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)).
  • the transformed yeast thus constructed reacts with high sensitivity to SLC_1 ligand MCH, which results in activation of MAP kinase and synthesis of histidine biosynthetic enzyme. As a result, they can grow on a histidine-deficient medium. Using this, it is possible to observe the response of yeast expressing SLC-1 by MCH using the growth of yeast in a histidine-deficient medium as an index.
  • the following describes a method for screening compounds that alter the binding between MCH and SLC-1.
  • the transformed yeast prepared as described above is cultured overnight in a liquid medium of a complete synthetic medium, and added to a lysed agar medium from which histidine has been removed at a concentration of 2 ⁇ 10 4 cells / ml. Sow to After the agar has solidified, place sterile filter paper impregnated with MCH or its derivative or MCH or its derivative and the test compound on the agar surface, and incubate at 30 ° C for 3 days. The effect of a compound that alters the binding between MCH or its derivative and SLC-11 can be measured by comparing the growth of the yeast around the filter paper with the case where MCH or its derivative is administered alone.
  • a compound that inhibits the growth of yeast due to the administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the growth of yeast similar to MCH or its derivatives.
  • add MCH or its derivative to the agar medium in advance incubate only the test compound on the sterilized filter paper, and observe that the growth of yeast on the entire surface of the petri dish is affected around the filter paper.
  • the effects of compounds that alter the binding between MCH and SLC-1 can be investigated.
  • SLC-1 mRNA may be prepared from tissues or cells or transcribed from plasmids in vitro. Incubate this at 20 ° C for 3 days in MBS solution. This is placed in the cavity of the voltage cla device immediately flowing the Ringer solution, and a glass microelectrode for fixing potential and a glass microelectrode for measuring potential are inserted into the cell, and the (-) electrode is placed outside the cell . When the potential stabilizes, flow the Ringer solution containing MCH or its derivative or MCH or its derivative and the test compound, and record the potential change.
  • the effect of a compound that alters the binding between MCH and SLC-1 is measured by comparing the change in cell membrane potential of SLC-1-transfected Xenopus oocytes with MCH or its derivative alone. be able to.
  • a compound that suppresses a change in cell membrane potential due to administration of MCH or a derivative thereof can be selected as a candidate substance having a competitive inhibition ability.
  • agonists can be screened by administering only the test compound and observing the change in cell membrane potential similar to that of MCH or its derivative.
  • poly (A) + RNA of various G protein genes can be introduced so that the reaction can be easily measured by increasing the amount of change.
  • this reaction can be measured by observing luminescence instead of membrane potential change.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding between MCH or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof includes SLC-1 or a salt thereof. It contains cells containing LC-1 or the membrane fraction of cells containing SLC-1, and MCH or its derivatives or salts thereof.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent
  • the solution dissolved in an appropriate solvent or buffer is stored at 4 ° C or -20 DC, and diluted to 1 with a measuring buffer before use.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or the screening kit of the present invention include: Or a compound that alters (inhibits or promotes the binding) the bond between 31 ⁇ (:-1 or a salt thereof and 31 ⁇ (: 1) or a salt thereof.
  • a compound or a salt thereof having cell stimulating activity via SLC-1 So-called SLC-1 agonist
  • a compound having no such stimulatory activity such as peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, and fermentation products.
  • SLC-1 So-called SLC-1 agonist
  • SLC-11 antagonist a compound having no such stimulatory activity
  • These compounds may be new compounds or may be known compounds.
  • the specific method of evaluating whether the compound is an SLC-1 agonist or an antagonist may be according to the following (i) or (ii).
  • test compound is brought into contact with cells containing SLC-1, and the cell stimulating activity via SLC-1 is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is SLC-1 agonist.
  • a compound that activates SLC-1 eg, the polypeptide of the present invention or SLC-1 agonist
  • a compound that activates SLC-1 And SLC-1 mediated cell stimulating activity when the test compound and the test compound are brought into contact with cells containing SLC-1 are measured and compared.
  • the compound or its salt capable of decreasing the cell stimulating activity by the compound activating SLC-1 is SLC-1 antagonist.
  • the SLC-1 agonist has the same activity as the physiological activity of MCH or a salt thereof on SLC-1 and is therefore useful as a safe and low-toxic drug like MCH or a salt thereof.
  • SLC_1 antagonists can suppress the physiological activity of MCH or a salt thereof on SLC-1, and thus are useful as safe and low-toxic drugs for suppressing the receptor activity.
  • MCH or a salt thereof is involved in an appetite (feeding) promoting action and oxytocin secretion promoting action, it can be used as an appetite (feeding) enhancer or oxytocin secretion promoting agent.
  • 3-1 agonist can be used as an appetite (feeding) enhancer, as well as weak labor, flaccid hemorrhage, before and after placental delivery, uterine remodeling failure, It can be used as a preventive and remedy for anesthesia such as cesarean section, abortion, milk stagnation, anorexia nervosa, and associated anemia and hypoproteinemia.
  • salts with inorganic bases examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and salts with basic or acidic amino acids.
  • Suitable examples of the salt with an inorganic base include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, and aluminum salt and ammonium salt.
  • the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, jenoanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. Salts with silamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And salts with acids and the like.
  • Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, and olutinine.
  • Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, and the like. .
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out according to a conventional method.
  • aseptic with oral or water or other pharmaceutically acceptable liquid as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. coated with sugar coating or enteric coating as needed It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • it is produced by mixing the compound or a salt thereof with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a generally accepted unit dosage form. be able to.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection are formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. be able to.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). Agents such as alcohols (eg ethanol), polyalcohols (eg propylene glycol, polyethylene) Glycol), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 (TM), HCO-50) and the like.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage Agents eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans and mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, egrets, higgs, bushes, sea lions, cats, dogs, monkeys, chimpanzees) Can be administered.
  • mammals eg, mice, rats, guinea pigs, egrets, higgs, bushes, sea lions, cats, dogs, monkeys, chimpanzees
  • the dose of a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention varies depending on symptoms and the like.
  • oral administration generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), It is about 0.1 to 1000 mg, preferably about 1.0 to 300 mg, more preferably about 3.0 to 50 mg per day.
  • the single dose varies depending on the target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • an adult obese patient with a body weight of 6 Ok
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-I UB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • Ma When an amino acid may have an optical isomer, the L-form shall be indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • a s n or N Ashafukino
  • BBSSAA Serum albumin
  • Fu ra— 2 AM [6-amino-2- (5-carboxy-2-year-old xazolyl) -5-benzofuranyloxy] -2- (2-amino-5-methylphenoxy) -ethane-N, ⁇ , ⁇ ' , ⁇ '-Four vinegar
  • HBS S Hanks balanced salt solution
  • F 1 u 0-3 AM [2-amino-5- (2,7-dichro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl) phenoxy (2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N, N, ⁇ ', ⁇ '-tetraacetic acid penacetoxymethyl ester
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence obtained from the result of N-terminal amino acid sequence analysis of a ligand peptide for SLC-1 purified from rat brain.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a ligand peptide for SLC-1 purified from rat brain identified as rat MCH.
  • Rat SLC-1 expression The lipoprobe (riboprobe) used to measure the expression level of SLC-lmRNA in each clone of CH0 cells is shown.
  • FIG. 2 shows a synthetic DNA used to obtain cDNA encoding human SLC-1.
  • the riboprobe used to measure the expression level of SIX-lmRNA in each clone of human SLC-S) expressing CH0 cells and human SLC-1 (L) expressing CH0 cells is shown.
  • a transformant Escherichia coli DH10B / phSLClL8 obtained by the plasmid containing the DNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 obtained in Example 8 was produced on February 1, 1999 by the Ministry of International Trade and Industry. Deposited with the National Institute of Bioscience and Biotechnology (NI BH) under the deposit number FERM BP-6632 and deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) as the deposit number IF ⁇ 1 6254 from January 21, 1999. ing.
  • NI BH National Institute of Bioscience and Biotechnology
  • IF ⁇ Fermentation Research Institute
  • Reference Example 1 Detection of an activity contained in rat brain extract that specifically suppresses cAMP synthesis in CHO / SLC-1 cells
  • High performance liquid chromatography (HPLC) fraction of rat brain extract was prepared by the method described below.
  • the mixture was ice-cooled, and 48 ml of acetic acid was added to a final concentration of 1.0 M, followed by crushing using a polytron (20,000 ⁇ m, 6 minutes).
  • the lysate was centrifuged (8,000 ⁇ m, 30 minutes), and the supernatant was collected.
  • 1.0 M acetic acid (0.81) was added. 30 minutes) and the supernatant was collected.
  • the column After washing the column with 300 ml of 1.0 M acetic acid, the column was eluted with 300 ml of 60% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid. After the eluate was concentrated under reduced pressure and the solvent was distilled off, the concentrate was freeze-dried. Dissolve approximately 0.24 g of the lyophilized product in 5 ml of DMS0, then 1.0 M 45 ml of acetic acid was added to obtain a rat brain extract.
  • a rat brain extract was added to an SP-Sephadex C-25 column (Amersham Pharmacia Biotech, gel volume: 100 ml) equilibrated with L0M acetic acid, washed with 50 ml of 1.0 M acetic acid, and then washed with 2.0 ml of pyridine. A 100 ml eluted fraction and a 2. GM pyridine / diacid 100 ml eluted fraction were sequentially obtained. The 1.0 M pyridine / acetic acid eluate was concentrated under reduced pressure, the solvent was distilled off, and the concentrate was freeze-dried.
  • the CH0 / SLC-1 cells and mock CH0 cells prepared in Example 4 were seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured for 48 hours.
  • the cells were washed with Hanks buffer ( ⁇ 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 HEPES) Hank's buffer (PH7.4) is called the reaction buffer.)
  • Hank's buffer PH7.4
  • 0.5 ml of a reaction buffer was added, and the mixture was kept warm in an incubator for 30 minutes.
  • cAMP synthesis inhibitory activity is defined as 100% of the amount obtained by subtracting the amount of intracellular cAMP when adding a reaction buffer from the amount of intracellular cAMP when an application buffer containing forskolin is added.
  • Addition of HPLC fractions (1 liter of a 100-fold dilution of each fraction in DMSO was added) The amount obtained by subtracting the amount of intracellular cAMP when the reaction buffer was added from the amount of intracellular cAMP was expressed as%.
  • Reference Example 2 Inactivation by rat pronase of an active substance that specifically inhibits cAMP synthesis on rat SLC-1 expressing CH0 cells in rat brain extract
  • HPLC fraction 34 which showed cAMP synthesis inhibitory activity against CH0 / SLC-1 cells in Reference Example 1, was treated with pronase (Sigma, protease Type XIV (P5147)), a proteolytic enzyme. was examined for gender.
  • the above rat brain extract HPLC fraction (# 34) 21 was added to 0.2 M ammonium acetate 100 1, pronase 3 / g was added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours, and then added to boiling water. For 10 minutes to inactivate pronase. To this, 2 ml of distilled water containing 0.05 mg of BSA and 0.05 mg of CHAPS was added, followed by freeze-drying. In order to examine the effect of pronase itself or heating and lyophilization, heat treatment of pronase only, HPLC fraction only, and pronase only followed by HPLC fractionation followed by the same treatment Lyophilized.
  • the mixture was concentrated to remove the solvent and freeze-dried. This was dissolved in 5 ml of 10 mM ammonium formate ( ⁇ 5.25) containing 10% acetonitrile, added to a cation exchange column (Toso, TSKgel CM-2SW (4.6 ⁇ 150 mm)), and then added to 10% acetonitrile.
  • the active substance was eluted with a concentration gradient from niM to 500 mM ammonium formate (pH 5.25). The activity was recovered around 320 mM ammonium formate.
  • rat MCH A signal was observed at m / z 2387.3, which was almost identical to the molecular weight of rat MCH as measured by a mass spectrometer, and the sequence of rat MCH (SEQ ID NO: 2) was determined as the deduced amino acid sequence of the active substance.
  • Active fractions 34 and 35 obtained in Reference Example 3 were also produced to obtain active substances, and it was confirmed that each of the active fractions was rat MCH.
  • rat MCH purchased from Peninsula showed a dose-dependent inhibitory activity on rat SLC-1 expressing cells in the cAMP production inhibitory activity performed by the method described in Example 5, was confirmed to be rat MCH.
  • Example 1 Amplification of rat SLC-1 receptor cDNA by PCR using rat brain cDNA
  • RNA (Clonetech) derived from rat brain was used as type I, and a reverse transcription reaction was performed using a random primer.
  • the reverse transcription reaction the reagent of the evening RNA PCR ver. 2 kit was used.
  • the reverse transcription product was used as type I, and amplification was performed by PCR using the synthetic DNA primers of SEQ ID NOS: 3 and 4.
  • the synthetic DNA primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified.At this time, a nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme SalI was added to the 5 'side of the gene, and Recognition sequences for the respective restriction enzymes were added to the 5 'and 3' sides so that the nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme Spe I was added to the 3 'side.
  • the composition of the reaction mixture was as follows: 0.4 ⁇ M each of cDNA type 5K synthetic DNA primers, 0.25 mM dNTPs, pfu (Stratagene) DNA polymerase 0.5 / l, and the buffer provided with the enzyme. The total reaction amount was 50.
  • the cycle for amplification was performed using a thermocycler (Pakkin Elma Co., Ltd.). After heating at 94 ° C for 60 seconds, 94 ° C for 60 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 second The 50-second cycle was repeated 35 times, and the reaction was finally performed at 72 ° C for 10 minutes. Confirmation of the amplification product is performed by ethidium bromide staining after electrophoresis on 0.8% agarose gel.
  • Example 2 Subcloning of PCR product into plasmid vector and insertion Confirmation of amplified cDNA sequence by decoding base sequence of cDNA portion
  • the reaction product after the PCR performed in Example 1 was separated using a 0.8% low-melting point agarose gel, and the band was cut out with a force razor, followed by fragmentation, phenol extraction, phenol / cloth form extraction, The DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR-Script Amp SKO according to the procedure of the PCR-Script TM Amp SKC) Cloning Kit (Stratagene). This was introduced into Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene), transformed, and clones containing the cDNA insert were selected on LB agar medium containing ampicillin and X-ga1, and the white was selected.
  • the full-length amino acid sequence of rat brain-derived SLC-1 whose sequence was confirmed in Example 2 was coded, and a SalI recognition sequence was added on the 5 'side, and a SpeI recognition sequence was added on the 3' side.
  • Remains Plasmids were prepared from E. coli clones transformed with the transfected plasmids using Plasmid Midi Kit (Qiagen) and cut with restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out the insert. After electrophoresis, the insert DNA was cut out from the agarose gel with a force razor, and then recovered by fragmentation, phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and ethanol precipitation.
  • This insert DNA was digested with Sal I and Spe I and vector plasmid pAKKO-111H for animal cell expression (Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)).
  • pAKKO1.11H the same plasmid was used and T4 ligation (Takara Shuzo) was used to ligate to construct a plasmid pAKKO-SIX-1 for protein expression.
  • plasmid DNA of pAKKO-SIX-1 was prepared using Plasmid Midi Kit (Qiagen). This was introduced into CHOdMr-cells using CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol. 10 g of DNA was used as a coprecipitation suspension with calcium phosphate, and added to a 10 cm dish in which 5 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 s CHO dhfr cells had been seeded 24 hours before.
  • the expression level of the full-length rat SLC-1 receptor Yuichi protein mRNA of 56 clones of the CH0 / SLC-1 strain established in Example 3 was determined according to the attached protocol as follows. Was measured as follows. Inoculate 2.5 to 10 4 clones of each strain of CH0 / SLC-1 strain on each wel 1 of Cytostar T Plate and culture for 24 hours. After feeding, the cells were fixed with 10% formalin. 0.25% Triton X in each well - after raising the permeability of the cells by adding 100, 35 S labeled SEQ ID NO: 7 of the riboprobe was Haiburidizu added.
  • Free riboprobe was digested by adding 20 mg / nil of RNaseA to each wel, the plate was washed well, and the radioactivity of the hybridized riboprobe was measured with a Topcounter. Strain with higher radioactivity has higher mRNA expression level. Three clones with high mRNA expression levels (# 3, 6 and 44) were used in the following experiments, but especially clone number 44 was mainly used (FIG. 4).
  • Example 5 Inhibitory activity of cAMP synthesis on rat SLC-1 expressing CH0 cells by MCH The inhibitory activity of cCH synthesis on rat SLC-1 expressing CH0 cells by diluting synthetic MCH (Peninsula) at various concentrations is shown below. Measured by the method.
  • the CH0 / SLC-1 cells selected in Example 4 were seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 eel 1 / wel 1 and cultured for 48 hours.
  • the cells were washed with Hanks buffer (PH7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter, containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES) Hanks buffer (pH 7.4) is called the reaction buffer.)
  • Hanks buffer pH 7.4
  • 0.5 ml of reaction buffer was added, and the mixture was kept in the incubator for 30 minutes.
  • the cAMP synthesis inhibitory activity is defined as MCH assuming that the amount of intracellular cAMP when the reaction buffer was added was subtracted from the amount of intracellular cAMP when the reaction buffer containing forskolin was added was 100%.
  • the amount of cAMP in cells when adding The amount obtained by subtracting the intracellular cAMP amount when the reaction buffer was added from the above was expressed as%.
  • Example 6 Activity of releasing arachidonic acid metabolites induced by MCH on rat SLC-1 expressing CH0 cells
  • the arachidonic acid metabolite release activity of various concentrations of synthetic MCH (Peninsula) on rat SLC-1-expressing CH0 cells was measured by the following method.
  • the CH0 / SLC-1 cells selected in Example 4 were seeded at 5 ⁇ 10 4 eel 1 / wel 1 on a 24-well plate, cultured for 24 hours, and [3 ⁇ 4] arachidonic acid was added at 0.25 Ci / well. .
  • the A single-stranded human fetal brain-derived cDNA library was prepared by digestion with S. cerevisiae exonuclease III.
  • Biotinylated oligonucleotides were prepared by addition using Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. The composition of the reaction solution and the reaction time were in accordance with the manual.
  • a complementary strand was synthesized according to the manual using 50 ng of the synthetic oligonucleotide of SEQ ID NO: 9 (corresponding to 101 to 1028 of accession No. U71092) according to the manual. This was a single-stranded plasmid.
  • Example 8 Determination of nucleotide sequence of plasmid containing isolated human SLC-1 cDNA
  • the clone having the cDNA insert was selected in an LB agar medium containing ampicillin and X-gal. Only white clones were picked and isolated with a sterilized toothpick to obtain a transformant ⁇ coli. DHlOB / hSLC-1. Each clone was cultured in an LB medium containing ampicillin, and the plasmid DNA was purified using QIA prep8 mini prep (Qiagen). The reaction for base sequence determination was performed using DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (Hikinkinma Co., Ltd.) and read using a fluorescent automatic sequencer.
  • SEQ ID NO: 10 The sequence shown in 10 was obtained.
  • the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence obtained here (SEQ ID NO: 11) is reported by Lakaye et al. (Lakaye, B. et al. (1998) Biochem. Biophys. Acta, vol. 1401, pp. 216).
  • SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence obtained here (SEQ ID NO: 11) is reported by Lakaye et al. (Lakaye, B. et al. (1998) Biochem. Biophys. Acta, vol. 1401, pp. 216).
  • -220 the human SLC-1 amino acid sequence estimated as a sequence deduced from rat SLC-1 based on the human chromosomal DNA sequence (accession number: Z86090) containing the human SLC-1 sequence. Is different, indicating that ATG, the start codon, is present on the mRNA further 69 and 64 amino acids upstream of the
  • the activity of MCH to promote the binding of S] -Guanosine 5 '-( ⁇ -thio) triphosphate to rat SLC-1 expression CH0 cell membrane fraction was measured by the following method. First, the method for preparing the membrane fraction is described. 1 X 10 8 cells of CH0 / SLC 1 10 ml homogenate buffer to the cells - (. LOmM NaHC0 3, 5mM EDTA, 0.5mM PMSF, l g / inl pepstatin, 4 g / ml E64, 20 fig / ml leupeptin) added And crushed using a Polytron (12,000 rpm, 1 minute).
  • the cell lysate was centrifuged (1, 000 g, 15 minutes) to obtain a supernatant. Next, the supernatant was subjected to ultracentrifugation (Beckman Type 30, one night, 30,000 rpm, 1 hour), and the obtained precipitate was used as a rat SLC-1 expression CH0 cell membrane fraction.
  • Rat SLC-1 expression CH0 cell membrane fraction was diluted with membrane dilution buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, M GDP) for use in Atsushi with a protein concentration of 30 mg / ml.
  • membrane dilution buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCl, M GDP
  • Example 10 Amplification of human SLC-lcDNA by PCR using cDNA derived from human fetal brain Plasmid containing the human SLC-1 DNA sequence cloned by the gene trap method was designated as type II, and SEQ ID NOS: 12 and 13 Amplification by PCR was performed using the synthetic DNA primers of SEQ ID NOS: 14 and 15, respectively.
  • the former amplified DNA was named human SLC-1 (S)
  • the latter amplified DNA was named human SLC-1 (L).
  • the synthetic DNA primer was constructed so that the gene in the region translated into the receptor protein was amplified.
  • the composition of the reaction solution for human SLC-1 (S) amplification was as follows: Plasmid I type 5 ⁇ S containing the human SLC-1 DNA sequence, synthetic DNA primers each 0.4 0.2, 0.2 mM dNTPs, pfu DNA polymerase 0 ⁇ 5 ⁇ ⁇ 1 And the buffer attached to the enzyme, the total reaction volume was 50 ⁇ 1.
  • the cycle for amplification is a thermal cycler (PerkinElmer), and after heating at 94 ° C for 60 seconds, 94 ° C for 60 seconds, 57 ° C for 60 seconds, 72 ° C for The 150-second cycle was repeated 25 times, and finally kept at 72 ° C for 10 minutes.
  • the composition of the reaction mixture for the amplification of human SLC-II was as follows: plasmid II containing human SIX-1 DNA sequence, type 5 l ⁇ ⁇ , synthetic DM primers 0.4 / iM each, 0.2 mM dNTPs, pfu DNA polymerase 0.5 / i 1 And the buffer provided with the enzyme, the total reaction volume was 50 tl.
  • the cycle for amplification was carried out using a thermal cycler (PerkinElmer) 94. After heating at C ⁇ 60 seconds, a cycle of 94 ° C ⁇ 60 seconds, 60 ° C ⁇ 60 seconds, 72 ° C ⁇ 3 minutes was repeated 25 times, and finally, the temperature was kept at 72 ° C ⁇ 10 minutes. Confirmation of amplification products was performed by ethidium bromide staining after 0.8% agarose gel electrophoresis.
  • Example 11 1 Subcloning of PCR Product into Plasmid Vector and Insertion Confirmation of Amplified cDNA Sequence by Decoding Base Sequence of cDNA Portion
  • the reaction product after the PCR performed in Example 10 was separated using a 0.8% low-melting point agarose gel, and the band was cut out with a force razor, followed by fragmentation, phenol extraction, phenol / cloth form extraction, The DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR-Script Amp SKO according to the prescription of PCR-Script TM Amp SK ( + ) Cloning Kit (Stratagene). This was introduced into Escherichia coli DH5a competent cell (Toyo-Ibo), transformed, and clones containing the cDNA insert were selected on LB agar medium containing ampicillin and X-gal.
  • Example 12 Preparation of human SLC-1 (S) -expressing CHO cells and human SLC-1 (L) -expressing CH0 cells
  • Human SLC-1 (S) whose sequence was confirmed in Example 11 and human SIX- Plasmids were prepared from 11 clones transformed with the plasmid into which 1 (L) had been introduced using Plasmid Midi Kit (Qiagen), and cut with restriction enzymes Sal I and Spe I to cut out the insert. After the electrophoresis, the insert DNA was cut out from the agarose gel with a force razor, and then recovered by performing fragmentation, phenol extraction, phenol-close-form extraction, and ethanol precipitation.
  • UAK described in pAKKO-llllHOlinuma, S. et al. Biochim.
  • 10 ⁇ g of DNA was prepared as a coprecipitation suspension with calcium phosphate, and added to a 10 cm dish in which 5 ⁇ 10 5 or 1 ⁇ 10 6 CHO dhf ⁇ cells were seeded 24 hours before. After culturing for 1 day in ⁇ medium containing 10% fetal bovine serum, the cells were subcultured and cultured in a selective medium, nucleic acid-free medium containing 10% dialyzed fetal serum. 56 clones of transformed cells that are human SLC-1 (S) transfected CH0 cells and 61 clones of transformed cells that are transgenic CH0 cells transfected with human SLC-L) was selected.
  • S human SLC-1
  • Example 13 Selection of Transgenic Cell Lines with High Expression of Human SLC-1 (S) and Human SLC-1 (L) mRNA
  • S Human SLC-1
  • L Human SLC-1
  • mRNA expression levels of 56 clones of the CHO / hSLC-1 (S) strain and 61 clones of the CHO / hSLC-1 (L) strain established in Example 12 were determined using Cytostar T Plate (Amersham Pharmacia Biotech). It was used and measured as follows according to the attached protocol. Each clone of the CHO / hSLC-1 (S) strain and the CHO / hSLC-1 (X) strain was inoculated into each well of the Cytostar T Plate at 2.5 ⁇ 10 4 and cultured for 24 hours, and then cultured with 10% formalin. Cells were fixed.
  • the human SLC-1 expressing CH0 cells selected in Example 13 CH0 / hSLC-l (S) strain or CHO / hSLC-1 (L) strain were placed in a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well. Seeded and cultured for 48 hours.
  • the cells were washed with Hanks buffer containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES — (PH7.4) (hereinafter, 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES were Hank's buffer (pH 7.4) is referred to as reaction buffer.) Thereafter, 0.5 ml of a reaction buffer was added, and the mixture was kept in an incubator for 30 minutes.
  • reaction buffer containing various amounts of MCH and 2 M forskolin After removing the reaction buffer and adding a new 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 0.25 ml of reaction buffer containing various amounts of MCH and 2 M forskolin to the cells and incubate at 37 ° C. The reaction was performed for 24 minutes. The reaction was stopped by adding 100 ⁇ 1 20% perchloric acid, and then left on ice for 1 hour to extract intracellular cAMP. The amount of cAMP in the extract was measured using a cAMP EIA kit (Amersham Pharmacia Biotech). As a result, MCH dose-dependently increased the intracellular cAMP of human SLC-1 expressing cells. 7 o
  • Example 15 Arachidonic acid metabolite release activity induced by 5 MCH on human SLC-1 expressing CH0 cells
  • the arachidonic acid metabolite releasing activities of various concentrations of synthetic MCH (Peninsula) on human SLC-1-expressing CH0 cells were measured by the following method.
  • the CHO / hSLC-1 (S) strain or the CHO / hSLC-1 (L) strain, which is the human SLC-1 expressing CH0 cell selected in Example 13 was seeded on a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well. After culturing for 24 hours, [3 ⁇ 4] arachidonic acid was added at 0.25 Ci / well.
  • Toba Ffa 10 mM NaHC0 3, 5 mM EDTA, H 7.5
  • Toba Ffa 10 mM NaHC0 3, 5 mM EDTA, H 7.5
  • the supernatant obtained by centrifugation at 400Xg for 15 minutes was further centrifuged at 100, OOOXg for 1 hour to obtain a membrane fraction precipitate.
  • the precipitate was washed with 2 ml of Atsushi buffer [50 mM Tris-HCK pH 7.5], 1 mM EDTA, 0.1% BSA (Pseudo Serum Albumin), 10 mM MgCl 2 , 100 mM NaC and ImM GDP (guanosine 5'- Diphosphate ⁇ g
  • GTP rS binding activity was measured as follows. After dispensing 173 n1 of human SLC-1 expressing CH0 cell membrane fraction 173 n1 diluted in Atsushi buffer into a 96-well plate made of polypropylene, DMS0 solution containing various concentrations of MCH (manufactured by Bachem) was dissolved. 2, and [ 35 S] -Guanos ine 5 '-(r-thio) triphosphate (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) 25 (final cell membrane concentration: 20 g / ml, [ 35 S] -Guanos ine 5 '-(r-thio) triphosphate final concentration: 0.33nM).
  • MCH is dose-dependently binds to human SLC 1 expressing CH0 cell membrane fraction [35 S] - Guanosine 5 ' ( ⁇ - thio) triphosphate amount increased the. Also, ED 5 of MCH against human SLC-1 expressing CH0 cell membrane fraction. The value was 0.2 nM.
  • Example 17 MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) by manual Edman decomposition ( Preparation of SEQ ID NO: 1 9-24)
  • the peptide was dissolved in fluoracetic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and replaced with nitrogen and incubated at 45 ° C for 20 minutes to cleave the amino-terminal amino acid of the peptide as an anilinothiazolinone derivative. After removing trifluoroacetic acid with a nitrogen stream, 30 ⁇ 1 of water and 1001 of n-butyl acetate were added, and excess reagent and ananilinothiazolinone derivative were extracted and removed with n-butyl acetate. The extraction with n-butyl acetate was repeated three times. The aqueous phase containing MCH (2-19) in which the amino terminus was shortened by one residue was evaporated to dryness under a stream of nitrogen and then under reduced pressure.
  • MCH (2-19) in which only one amino terminal residue was deleted was obtained.
  • MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6--19) and ⁇ CH (7-19) obtained by the above decomposition reaction was purified as follows, and its structure was confirmed by mass spectrometry and amino acid analysis. MCH (4-19) will be described in detail below, but similar operations were performed for other derivatives. Table 1 shows the analysis values of the obtained MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19). Indicated.
  • reaction solution 0.1 (Trifluoroacetic acid / 70% acetonitrile)
  • concentration was increased to 70%.
  • the eluate was monitored by absorbance at 210 nm, and the peak was manually collected.
  • MCH (4-19) eluted at 17.1 minutes.
  • the MCH (4-19) collected in one test tube was concentrated to dryness and dissolved in 100 ⁇ 1 DMS0.
  • Mass spectrometry was performed by the LSIMS method using JEOL JMS-HX110. That is, a matrix consisting of 11: 3-nitrobenzyl alcohol and glycerol in a ratio of 3: 2 and a sample of 11 were mixed and introduced into an ion source. Cesium ions accelerated to 15 kV were irradiated, and the generated positive secondary ions were accelerated to 10 kV and guided to the detector.
  • sample 5 ⁇ 1 was dried in a glass tube under reduced pressure, placed in a reaction vial, and 6 N azeotropic hydrochloric acid (Pierce, Sequenal Grade) 2001 was placed at the bottom of the reaction tube.
  • 6 N azeotropic hydrochloric acid Pieris, Sequenal Grade 2001 was placed at the bottom of the reaction tube.
  • degassing was performed according to the method recommended by Warners, and the temperature was kept at 110 ° (:, keeping for 24 hours.
  • the sample was diluted with 1 mM 20 mM hydrochloric acid, injected into an analysis vial, set in an amino acid analyzer, and subjected to analysis 100.
  • Amino acid analysis was performed using ortho-phthalate using a Hitachi L-8500 high-speed amino acid analyzer.
  • the aldehyde reagent (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was analyzed by the fluorescence analysis method used in the derivatization reaction.
  • the preparation method of the buffer for the fluorescence analysis, the preparation method of the reaction solution, and the analysis conditions were described in the handling instructions of the L-8500 amino acid analyzer. book The molar ratio of the measured value when a reference. Leucine in accordance with the description are as shown in Table 1.
  • MCH or MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19) and H (5-19) It can also be prepared by the solid phase synthesis method described in Example 24 to Example 28.
  • Non-isotopic boron-hunters of MCH and MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19) and MCH (6-19) obtained in Example 17 Derivatization with reagents was performed. The following is an example of derivatization of MCH (4-19).
  • the reaction mixture was added with 10% acetonitrile 1 containing 0.1% trifluoroacetic acid and purified by HPLC. Chromatography conditions are as follows. The column was a Wakosiito II 5C18HG (4.6 x 150 mm) and the flow rate was 1.0 ml per minute. Elution was performed using acetonitrile water containing 0.1% trifluoroacetic acid, keeping the concentration of acetonitrile at 10% for 2 minutes, increasing the concentration to 20% in 5 minutes, and then increasing to 50% in 20 minutes.
  • MCH (4-19) which is a 3-residue N-terminal amino acid deletion of MCH prepared in Example 17, was labeled with radioisotope by the Bolton-Hanner method.
  • Bolton-Hanner method Are dissolved in benzene in the tube [125 1] - Bolton one Hunter reagent (3- (4-hydroxy - 3-tio one Zadoff Eniru) propionic acid N- Sukushinimijiru) 9.25 MBq (0.11 nmol) (NEN Rye off (Science Products, 81.4 TBq / mmol) was sprayed with dry nitrogen gas to distill off benzene.
  • MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) are as follows: the Tyr 13 in the amino acid sequence can also be generated turned into radiant Yodo.
  • MCH (4-19) is exemplified, but MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and MCH (7-19) are obtained by the same method. -19) can be produced.
  • Example 2 1 MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19), MCH (5-19), MCH (6-19) and 3 ⁇ 41 (3 ⁇ 4 (7-19) Measurement of agonist activity using binding assay
  • Rat SLC-1 expression CH0 cell membrane fraction was prepared by the following method. 5 mM EDTAschreibar
  • Rat SLC-1 expressing CH0 cells (1 ⁇ 10 s ) were suspended in phosphate buffered saline (pH 7.4) supplemented with (mintetraacetic acid), and centrifuged. Homoji sulfonate buffer foremost pellet cells (10 mM NaHC0 3, 5 mM EDTA, pH 7.5) was added 10 ml, and homogenized using a Porito Ron homogenizer. The supernatant obtained by centrifugation at 400 X g for 15 minutes was further centrifuged at 100, OOOX g for 1 hour to obtain a membrane fraction precipitate.
  • the precipitate was added to 2 ml of Atsushi buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1% BSA (pserum serum albumin), 10 mM MgCl 2 , 100 mM NaCK 1 M GDP (guanosine) 5'-diphosphate), 0.25 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride), 1 fig / ml peptide, 20 / g / ml leptin, 10 g / ml phosphoramidone , 100, OOOXg for 1 hour.
  • the membrane fraction recovered as a precipitate was resuspended in 20 ml of Atsushi buffer, dispensed, stored at -80 ° C, and thawed before use.
  • Rat SLC-1 expressing CH0 cell membrane fraction 1731 diluted with Atsushi buffer was dispensed into a 96-well plate made of polypropylene, and then MCH diluted with DMS0 solution to various concentrations.
  • MCH MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19) and 1 MCH (5-19) derivatized with the non-isotopic Bolton-Hunter reagent obtained in Example 18.
  • the agonist activity was measured using GTPrS binding assay in the same manner as in Example 21.
  • Derivatized MCH, MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4-19) and MCH (5-19) were dose-dependent in a similar manner to MCH in a human SLC-1 expressing CH0 cell membrane fraction.
  • the cell membrane fraction prepared from human SLC-1 expressing CH0 cells according to Example 16 was subjected to an assay buffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.1 mM
  • Boc-Va 0CH 2 -PAM resin (0.77 fractions 1 / g resin) 0.5 mmol portion is put into the reaction soda of peptide synthesizer ABI 430A, and Boc- strategy (NMP-HOBt) Boc-Gln, Boc-Trp (CHO), Boc-Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Va1, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp (OcHex), Boc-Phe, Boc-Asp (OcHex) To obtain the desired protected peptide resin.
  • the reaction was monitored by HPLC, and after confirming that all the peaks of the SH-form peptide changed to the SS-form, acetic acid was added to adjust the pH of the solution to 3, and the solution was adsorbed to the above LiChroprep (trade name) RP-18 column. . After washing the column with 200 ml of 0.1% TFA water, a linear gradient elution was performed using 300 ml of 0.1% TFA water and 300 ml of 50% acetonitrile water containing 0.1% TFA, and the main fractions were collected and lyophilized. To obtain the desired peptide.
  • Example 2 7 Des- [Asp ', Phe 2 , Asp 3 ] -MCH (MCH (4-19), Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-G 1 y-Arg-V 1-Ty r- Production of Arg-Pro-Cys-T ⁇ -G1n-Va1)
  • Boc-Vat OCH Factory PAM resin (0.77 ol / g resin) 0.5 mmol portion is put into the reaction soda of peptide synthesizer ABI 430A, and Boc-Gln, Boc-Boc-strategy (NMP-HOBt) peptide synthesis method is used.
  • Trp (CHO), Boc-Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg (Tos), Boc-Gly, Boc-Leu , Boc-Met, Boc-Cys (MeBzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, and Boc-Met are introduced in this order to obtain the desired protected peptide resin.
  • This resin is subjected to deprotection, cyclization and purification in the same manner as in Example 24 to obtain the desired peptide.
  • a sulfide bond is formed.
  • a compound or a compound thereof which changes the binding property between MCH or a derivative thereof or a salt thereof and SLC-1 or a salt thereof characterized by using the MCH or a derivative thereof or a salt thereof and the SLC-1 or a salt thereof of the present invention.
  • Salt screening methods include appetite (feeding) enhancers, as well as prophylactic and therapeutic agents for weak labor, lax hemorrhage, before and after placenta delivery, uterine remodeling failure, cesarean section, artificial abortion, and milk stasis.
  • SLC-1 agonist anti-obesity agent (drug), appetite (feeding) regulator, etc.
  • drug anti-obesity agent
  • appetite (feeding) regulator etc.
  • SLC-1 agonist anti-obesity agent
  • drug drug
  • appetite (feeding) regulator etc.
  • SLC-1 antagonists which can be used as a preventive or therapeutic agent for Prader-Willi syndrome and the like.

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Description

明 細 書
スクリーニング方法 技術分野
本発明は、 ォーファンレセプ夕一蛋白質である SLC— 1 (FEBS Letters 398 (1996) 253-258など） またはその塩と MCH (メラニン凝集ホルモン； Melanin Concentrat ing Hormone (Endocrinology, vol.125, 1660-1665 (1989)など) も しくはその誘導体またはその塩を用いることを特徴とする抗肥満薬または食欲 調製薬などのスクリーニング方法などに関する。 背景技術
ヒトゲノムから見出されたヒ卜型 S L C— 1 (FEBS Letters 398 (1996) 253-258) およびラッ卜の脳の c DN Aライブラリ一から見出されたラット型 S LC一 1 (Biochimica et Biophysica Acta 1401 (1998) 216-220) は G蛋白質 共役型レセプ夕一あるいは 7回膜貫通型レセプターと総称されるものであり、 数多くの、 リガンドが不明ないわゆるォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋 白質の一種である。
これらォ一ファン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質のリガンドを決定する一 般的な手段としては、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の一次構造上の類似性 から推定するしかなかった。 しかし、 多くのォーファン G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質は既知のレセプ夕一とのホモロジ一が低いものが多く、 実際は既知 リガンドのレセプターサブタイプである場合を除いては一次構造上の類似性だ けでそのリガンドを推定することは困難であった。 一方、 遺伝子解析から多く のォーファン G蛋白質共役型レセプターが見つかつていることから対応する未 知のリガンドがまだ数多く存在していることが推定されているが、 これまで実 0
際にォ一ファン G蛋白質共役型レセプターのリガンドを同定した例は数少なく 、 SLC- 1についてもそのリガンドの存在は報告されていない。
ォ一ファンレセプ夕一蛋白質である SLC— 1に対するリガンドの探索と、 S L C— 1およびそのリガンドを用いることを特徴とする化合物などのスクリ 一二ング方法の確立が課題とされている。 発明の開示
本発明者らは、 SLC— 1をコードする cDN Aを適当な手段で発現させた 細胞を用い、 特異的な細胞刺激 （シグナル伝達） 活性の測定等を指標に、 該レ セプタ一蛋白質がリガンドとして認識するポリペプチドをスクリーニングする ことに成功し、 該ポリペプチドが MCH (メラニン凝集ホルモン； Melanin Concentrating Hormone) でめること 兒出した。
さらに、 本発明者らは、 該活性因子である MCHまたはその塩と上記 S LC - 1またはその塩との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうこ とができることを見いだした。
また、 本発明のヒト型 SLC— 1のアミノ酸配列は、 既報 （FEBS Letters 398 (1996) 253-258、 WO 96/18651号） とは異なる新規な配列であることを見出した すなわち、 本発明は、
(1) メラニン凝集ホルモン（MCH)もしくはその誘導体またはその塩および SLC— 1またはその塩を用いることを特徴とする MCHまたはその塩と S L C- 1またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(2) MCHもしくはその誘導体またはその塩および SLC— 1またはその塩 を含有することを特徵とする MCHまたはその塩と SLC— 1またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、 (3) 上記 （1) 記載のスクリーニング方法または上記 （2) 記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 MCHまたはその塩と SLC— 1または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(4) 上記 （3) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
(5) 抗肥満薬である上記 （4) 記載の医薬、
(6) 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ の塩、
(7) 上記 （6) 記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する DN Aを含 有する DNA、
(8) MCHが配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するペプチドである上記 （1) 記載のスクリ一ニン グ方法または上記 （2) 記載のスクリーニング用キット、
(9) 誘導体が配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N末端から第 5番目な いし第 19番目の部分配列を含有するペプチドである上記 （1) 記載のスクリ 一二ング方法または上記 （2) 記載のスクリーニング用キット、
(10) 誘導体がボルトンハン夕一試薬により誘導された MCHまたはボルト ンハンター試薬により誘導された配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N末 端から第 5番目ないし第 19番目の部分配列を含有するペプチドである上記 （ 1) 記載のスクリーニング方法または上記 （2) 記載のスクリーニング用キッ 卜、
(1 1) ボルトンハンター試薬により誘導された MCHまたはボルトンハン夕 —試薬により誘導された配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N末端から第 5番目ないし第 19番目の部分配列を含有するペプチドまたはその塩、 および
(12) 式 ,
rp-Gln-Val-OH
Figure imgf000006_0001
で表される化合物またはその塩などを提供するものである。
本発明における SLC— 1関して、 具体的には、 上述の公知の SLC— 1ま たはその塩などがあげられるのみならず、
(13) 配列番号： 5または配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする S L C— 1 またはその塩、 または
(14) 配列番号： 5または配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列中の 1 個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10個以下のアミノ酸が欠失したアミ ノ酸配列、 配列番号： 5または配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列に 1 個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10個以下のアミノ酸が付加した （ま たは挿入された） アミノ酸配列、 あるいは配列番号： 5または配列番号： 1 1 で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10 個以下のァミノ酸が他のァミノ酸で置換されたァミノ酸配列を含有する夕ンパ ク質である上記 （13) 記載の SLC— 1またはその塩などがあげられる。 また、 本発明における MCHに関して、 具体的には、 上述の公知の MCHま たはその塩などがあげられるのみならず、
(15) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有することを特徴とする MCHもしくはその誘導体または その塩、 または
(16) タンパク質が、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 10個以下、 好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列 、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列に 1個以上 10個以下、 好ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 あるいは配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 1 0個以下、 好 ましくは 1個以上 5個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ酸配 列を含有するペプチドである上記 （1 5 ) 項記載の M C Hもしくはその誘導体 またはその塩などがあげられる。 図面の簡単な説明
図 1はラット脳から調製した HPLCフラクションについて CH0/SLC-1細胞特異 的な cAMP合成抑制活性を測定した結果を示す。
図 2は参考例 1中のラット脳 HPLCフラクション #34の cAMP合成抑制活性のプ ロナーゼ処理に対する挙動を示す。
図 3は参考例 3中の 0DSカラム （Deve l os i l 0DS- UG- 3) で精製した画分につい て CH0/SLC- 1細胞に特異的な cAMP合成抑制活性を測定した結果を示す。
図 4はラット SLC- 1遺伝子発現 CH0細胞株について i n s i t uハイブリダィゼーシ ヨンによる遺伝子発現量の比較を示す。
図 5は種々の濃度の MCHの CH0/SLC-1細胞に対する cAMP合成抑制活性を示す。 図 6は種々の濃度の MCHの CH0/SLC- 1細胞に対するァラキドン酸代謝物放出活 性を示す。
図 7は MCH、 MCH (2-1 9)、 MCH (3-1 9) , MCH (4- 1 9)、 MCH (5- 19)、 MCH (6-1 9)およ び ^11 (7-19)の6了？7^バィンディングアツセィを用いたァゴニスト活性を測定 した結果を示す。
図 8は非アイソトープボルトン一ハンター試薬によつて誘導体化された MCH、 MCH (2-19) , MCH (3-19) MCH (4- 19)および MCH (5- 19)の GTPァ Sバインディングァ ッセィを用いたァゴニスト活性を測定した結果を示す。
図 9はボルトン一ハンター試薬を用いて作製した [| 251] -標識 MCH (4-19)のヒ ト SLC-1発現 CH0細胞から調製した細胞膜画分に対する特異的結合を示す。
図 1 0はポルトン一ハン夕一試薬を用いて作製した ['251] -標識 MCH (4- 19)に 対する MCHの結合阻害活性を示す。 発明を実施するための最良の形態 本明細書において、 「実質的に同一」 とはポリペプチドなどの活性、 例えば 、 リガンド （MCH) と受容体 （SLC— 1) の結合活性、 生理的な特性など が、 実質的に同じことを意味する。
本発明で用いられる SL C— 1またはその塩 （以下、 単に SLC— 1と略称 する場合がある） および MCHもしくはその誘導体またはその塩 （以下、 単に MCHと略称する場合がある） の製造法を以下にさらに詳細に説明する。
本発明で用いられる SLC— 1および MCHとしては、 ヒト、 温血動物 （例 えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） および 魚類などのあらゆる組織 （たとえば、 下垂体、 塍臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺 、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など） または細胞などに由来するポリペプチドであって、 3 じー 1としては、 配列 番号： 5または配列番号： 1 1、 MCHとしては配列番号： 2で表わされるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドであれば如何なるものであってもよい。 例えば、 本発明の SCL— 1として は、 配列番号： 5または配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列を含有する ポリペプチドなどの他に、 配列番号： 5または配列番号： 1 1で表わされるァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリべプチ ドなどがあげられる。 実質的に同質の活性としては、 例えばリガンド結合活性 、 シグナル伝達活性などがあげられる。 実質的に同質とは、 リガンド結合活性 などが性質的に同質であることを示す。 したがって、 リガンド結合活性の強さ などの強弱、 ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 本 発明の MCHとしては、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を含有するポ リペプチドなどの他に、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を含有するポ „
リペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどがあげられる。 実 質的に同質の活性としては、 例えばレセプ夕一結合活性などがあげられる。 実 質的に同質とは、 レセプター結合活性などが性質的に同質であることを示す。 したがって、 レセプ夕一結合活性の強さなどの強弱、 ポリペプチドの分子量な どの量的要素は異なっていてもよい。
本明細書における S L C— 1および M C Hはべプチド標記の慣例に従って左 端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 例え ば、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配 列などを含有するポリペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （- C00H)または カルボキシレート（-C00— )であるが、 C末端がアミド （-C0NH2)またはエステル (- C00R)であってもよい。 エステルの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n— プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの ^— eアルキル基、 シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 フエニル、 α —ナフチ ルなどの C 6— 1 2ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリルなどのフ ェニルー C卜2アルキル、もしくは α —ナフチルメチルなどの α —ナフチルー C 卜；^アルキルなどの C 1 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用さ れるピバロイルォキシメチル基などがあげられる。
本発明で用いられる S L C— 1および M C Hの塩としては、 生理学的に許容 される塩基 （例えばアルカリ金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用い られるが、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩 としては例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸 、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられる S L C— 1および M C Hは、公知の方法（例、 FEBS Le t ters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651号記載の方法） に準じた方法、 即ち、 ヒトゃ 0
温血動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方法によって製造する こともできるし、 後述のタンパク質 （ペプチド） 合成法に準じて製造すること もできる。 また、 後述するタンパク質 （ペプチド） をコードする DNAを含有 する形質転換体を培養することによつても製造することができる。
ヒト、 温血動物、 魚類などの組織または細胞から製造する場合、 ヒト、 温血 動物、 魚類などの組織または細胞をホモジナイズした後、 酸、 有機溶媒などで 抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどのク 口マトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明で用いられる SLC— 1および MCHは、 自体公知の タンパク質 （ペプチド） の合成法に従って、 あるいは SLC— 1および Zまた は MCHを含有するタンパク質 （ペプチド） を適当なぺプチダ一ゼで切断する ことによって製造することができる。 タンパク質 （ペプチド） の合成法として は、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 SL C— 1および Zまたは M C Hを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残 余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することに より目的のタンパク質 （ペプチド） を製造することができる。 公知の縮合方法 や保護基の脱離としては例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法があげられる。
① M. Bodanszky および A. Ondetti , ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV, 205 、 （1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14卷 ペプチド合成 広川書店 „
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 '蒸留 'カラムクロマト グラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせてタンパク質 (ペプチド） を精製単離することができる。 上記方法で得られるタンパク質 （ ペプチド） が遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換するこ とができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換す ることができる。
S L C— 1および M C Hのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド 合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメ チル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル 樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリ ルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメ チル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 （2 ' , 4 ' -ジメトキシフエニル— Fmoc アミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を 用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするぺ プチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質 （ペプチド） を切り出すと同時に各種保護基 を除去し、 必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実 施し、 目的のタンパク質 （ペプチド） を取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質 （ペプチド） 合 成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類がよい。 カルポジイミド類としては DCC、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルボジィ ミド、 Ν-ェチル -Ν' - (3-ジメチルァミノプロピル） カルポジイミドなどがあげら れる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0BT、 H00BTなど )とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは Η0ΒΤエステルあるいは H00BTエステルとしてあらかじめ保護されたァミノ j 0
酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。 保護されたアミノ酸 の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 （ペプチド） 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 たとえ ば N， N—ジメチルホルムアミド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N -メチ ルピロリ ドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン 化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホ キシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサン、 テ トラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなど の二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適 宜の混合物などが用いられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用され ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 T：〜 5 0 °Cの範囲 から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5ないし 4倍過 剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場 合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合 を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化し て、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 Boc、 夕一シャリ 一ペンチルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4ーメ卜キシ ベンジルォキシカルボニル、 C卜 Z、 Br-Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 ト リフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二 ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどがあげられる。 カルボキシル基 の保護基としては、 たとえば Rとして上記した アルキル基、 C 3— 8シクロ アルキル基、 C 7 _ 1 4ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4一二トロべンジ ル、 4—メトキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジ ルォキシカルボニルヒドラジド、 夕一シャリーブトキシカルボニルヒドラジド ^ 、
、 トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化 によって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァ セチル基などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジ ルォキシカルボニル基、 エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基な どがあげられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基 、 テトラヒドロピラニル基、 ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフエノ一ル性水酸基の保護基としては、 たとえば Bz l、 C l 2 -Bz K
2—二トロベンジル、 Br- Z、 夕一シャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 Tos、 4 -メトキシ- 2， 3， 6-トリ メチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Tr t、 Fmoc などがあげられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペン夕クロ口フエノー リレ、 2, 4, 5 -トリクロ口フエノール、 2, 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロ キシフ夕ルイミド、 H0BT) とのエステル] などがあげられる。 原料のアミノ基 の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミドがあげられる。 保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触 媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナト リウムによる還元などもあげられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 2 0 ：〜 4 0 °Cの温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール 、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイ ド、 1
1, 4-ブタンジチオール、 1, 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加 が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4- ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファンの インドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1, 2-エタンジチオール 、 1, 4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化 ナトリゥム、 希アンモニアなどによるアル力リ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手 段から適宜選択しうる。
S L C— 1および M C Hのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボ キシル末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化した後、 アミノ基側にぺ プチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端のひーァミノ基 の保護基のみを除いたペプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除い たペプチド （またはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような 混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合 により得られた保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を 除去し、 所望の粗タンパク質 （ペプチド） を得ることができる。 この粗タンパ ク質 （ペプチド） は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾 燥することで所望のタンパク質 （ペプチド） のアミド体を得ることができる。
S L C - 1および M C Hのエステル体を得るにはカルポキシ末端アミノ酸の ひ一カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後 、 タンパク質 （ペプチド） のアミド体と同様にして所望のタンパク質 （ぺプチ ド） のエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる M C Hの誘導体としては、 ① M C Hの部分ペプチド、 ② M C Hの構成アミノ酸が欠失したペプチド、 構成アミノ酸に他のアミノ酸が付 加したペプチド、 構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチド、 または ,。
③ M C H、 上記①記載の部分べプチドまたは②に記載のぺプチドが標識化され たものなど、 S L C— 1との結合能を有するものであれば何れのものであって もよい。
M C Hの部分ペプチドとして具体的には、 配列番号： 2で表されるアミノ酸 配列の N末端から第 5番目ないし第 1 9番目の部分配列を含有するペプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。 より 具体的には、 配列番号： 1 9、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 2、 配列番号： 2 3または配列番号： 2 4で表わされるアミノ酸配列を有す るペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげ られる。
さらに、 S L C— 1を用いて後述のスクリーニングを行う場合に、 特に好ま しくは配列番号： 2 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩が好ましく用いられる。
また、 M C Hの構成アミノ酸が欠失したペプチド、 構成アミノ酸に他のアミ ノ酸が付加したペプチド、 構成アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたペプチド としては、 配列番号： 2中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度 、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失し、 または、 そ のアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ま しくは 1〜5個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が 付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは 1〜5個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたペプチドなどがあげられる。 該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、 たとえばそ のアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができ うる。 非極性 （疎水性） アミノ酸としては、 ァラニン、 ロイシン、 イソ口イシ ン、 ノ リン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン、 メチォニンなど j 4
があげられる。 極性 （中性） アミノ酸としてはグリシン、 セリン、 スレオニン 、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどがあげられる。 陽電 荷をもつ （塩基性） アミノ酸としてはアルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどが あげられる。 負電荷をもつ （酸性） アミノ酸としては、 ァスパラギン酸、 グル 夕ミン酸などがあげられる。
但し、 上記する他のアミノ酸が欠失、 置換する位置としては、 MCHの構成 アミノ酸中、 Cy s以外の位置であることが好ましい。
MCH、 上記①記載のペプチドまたは②に記載のペプチドが標識化されたも のとしては、 自体公知の方法で、 アイソトープラベル化されたもの、 蛍光標識 されたもの （例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標識） 、 ピオチン化され たもの、 酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、 例えば公知の方法によって、 〔 H〕 、 〔 I〕 、 〔 C〕 、 [ S〕 などで標識された MCHなどを利用することができる。 特に、 ボルト ンーハンター試薬を用いて公知の方法で調製した MCHまたはその誘導体の標 識体を利用することもできる。
該 MCHまたはその誘導体の標識体の具体例としては、 例えば、
(1) [125I] -[N- (3 - (4-ヒドロキシ -3 -ョードフエニル）プロピオ二ル）- Asp'] - MCH
Figure imgf000016_0001
(2) [125I] - [N- (3-(4-ヒドロキシ- 3-ョードフエエル）プロピオ二ル）- Phe2]- MCH (2-19)
Phe - Asp Met - Leu - Arg- Cys - Met - Leu - Gly- Arg - Va卜 Tyr - Arg - Pro - Cys - Trp - Gin - Vaト OH (3) [125I] -[N-(3- (4-ヒドロキシ- 3-ョ一ドフエニル）プロピオ二ル）- Asp3]' MCH(3-19) n- Va卜 OH
Figure imgf000017_0001
(4) [125I] _[N- (3- (4 -ヒドロキシ _3 -ョ一ドフエニル）プロピオニル） - Met4]' MCH(4-19) n-Va卜 OH
Figure imgf000017_0002
(5) [l25I] -[N- (3- (4-ヒドロキシ -3-ョ一ドフエニル）プロピオ二ル)- Leu5]' MCH(5- 19) n-Val-OH
Figure imgf000017_0003
(6) [125I] - [N- (3- (4-ヒドロキシ- 3-ョードフエニル）プロピオニル) -Arg6]. MCH(6-19)
Arg-Cys- et-Leu-Gl -Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-QH
Figure imgf000017_0004
(7) [125I] - [N- (3- (4-ヒドロキシ- 3-ョードフエニル）プロピオ二ル)- Cys7]. MCH(7-19) , -
1 D
Figure imgf000018_0001
などがあげられる。
なかでも、 特に [Ι25Ι] -[N- (3- (4-ヒドロキシ- 3-ョードフエニル）プロピオ二 ル） -Met4] -MCH (4-19)が好ましく用いられる。
MCHもしくはその誘導体の塩としては、 上記の SLC— 1および MCHの 塩と同様のものなどがあげられる。
本発明で用いられる SLC— 1をコードする DNAとしては、 配列番号： 5 または配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ一ドする塩基配列を有する DNAを 含有する DNA、 本発明で用いられる MCHをコードする DNAとしては、 配 列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するペプチドをコードする塩基配列を有する D N Aを含有する D N Aであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNA ライブラリ一、 前記した組織 ·細胞由来の cDNA、 前記した組織 ·細胞由来 の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用 するベクタ一はバクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドな どいずれであってもよい。 また、 前記した組織 ·細胞より RN A画分を調製し たものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下 、 RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
より具体的には、 （1)ストリンジェン卜な条件下で、 配列番号： 2、 配列番 号： 5または配列番号： 1 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペプチドをコードする塩基 配列を有する D N Aを含有する D N Aの有する配列とハイプリダイズする D N j飞
A、 （2)遺伝コードの縮重のため、 配列番号： 2、 配列番号： 5または配列番号 ： 1 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するタンパク質またはペプチドをコードする塩基配列を有する DN Aを 含有する DNAの有する配列および（1)に定められている配列とハイプリッド 形成しないが、 同一アミノ酸配列をもつタンパク質またはペプチドをコードす る DNAなどが用いられる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法ある いはそれに準じた方法に従って行うことができる。 上記ストリンジェントな条 件としては、 例えば 42° (：、 50%ホルムアミド、 4XSSPE(1 XSSPE = 150mM NaCl, lOmM NaH2P04-H„0, Im EDTA pH7.4), 5Xデンハート溶液、 0 . 1 %SDSである。
本発明で用いられる S L C— 1または MCHをコ一ドする DNAは以下の遺 伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明の S L C— 1または MCHを完全にコードする DN Aのクローニング の手段としては、 本発明の S LC— 1または MCHの部分塩基配列を有する合 成 DNAプライマーを用いて自体公知の P CR法によって前記 DNAライブラ リ一等から目的とする DN Aを増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込ん だ D N Aを例えば S L C— 1または M C Hをコードする塩基配列の一部あるい は全領域を有する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハ ィブリダイゼ一シヨンによって選別することができる。 ハイブリダイゼーショ ンの方法は、 例えば Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行われる。 また 、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従つ て行う。
クローン化された本発明で用いられる SLC— 1または MCHをコードする DNAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リン カーを付加したりして使用することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻 , n
訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとし ての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コド ンゃ翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプタ一を用いて付加することも できる。
本発明で用いられる SLC— 1または MCHの発現ベクターは、 例えば、 （ ィ） 本発明で用いられる S L C— 1または MCHをコードする DN Aから目的 とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現べクタ一中の プロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR 322, p BR 3 25, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0, TP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 用いられ るプロモー夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ 一夕一であればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 S V 40由来のプロモ一 夕一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモ一夕一、 ヒ一 卜ショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 SRaプロモ 一夕一などが利用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 Tr pプロモ —夕一、 T 7プロモ一夕一、 l a cプロモ一夕一、 r e cAプロモーター、 λ PLプロモーター、 1 p pプロモー夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場 合は、 SPOlプロモー夕一、 SPO 2プロモーター、 p e nPプロモ一夕一 など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモータ一、 ADH 1プロモータ一、 GALプロモ一夕一などが好 ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プ 口モー夕一などが好ましい。 i 9
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下 、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いるこ とができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp 1 "と略称する場合がある） 、 ネオマ イシン耐性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐性） 等が あげられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて D H F R遺伝子を選択 マ一カーとして使用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドまたはそ の部分ペプチドの N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は 、 hoA - シグナル配列、 O即 A · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌で ある場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列な どが、 宿主が酵母である場合は、 メイティングファクター a (MFひ） · シグナ ル配列、 インベル夕一ゼ · シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には 、 例えばィンシュリン · シグナル配列、 0；—インターフェロン ' シグナル配列 、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された S L C— 1または MCHをコードする DNAを含 有するベクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫また は昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 ェシエリヒア ' コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ.ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Pro atl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック 'ァシッズ ' リサ ーチ， （Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1981)〕 ， J A 221 〔ジャーナル'ォブ ·モレキュラー'バイォロジ一（Journal of Molecular Biology ) 〕 ， 120巻， 5 17 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル 'ォブ 'モレ キユラ一 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネテ イツクス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス 'サチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナ ル 'ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 ( 1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH 22 R , NA 87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 20 B— 12などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) , 315卷， 592 (1985)〕 。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia の
ΤΜ
中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusianiの卵由来の HighFive 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711 ) 、 S f 21細胞 〔以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン 'ヴィ トロ （in Vitro) ， 1 3巻， 213— 217頁 （1977年） 〕 などが用いられる。
動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞， Vero細胞， チャイニーズ ハムスター細胞 CHO， DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH O (dh i r—CHO細胞） ， マウス L細胞， マウス 3T3細胞、 マウスミエ口 —マ細胞， ヒト HEK293細胞、 ヒト FL細胞、 293細胞、 C 127細胞 2 j
、 BALB 3T3細胞、 S p— 2/0細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ · ザ .ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ 一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2 1 10 (1 972)やジ一ン (Gene) ， 1 7巻， 107 (1 982)などに記載の方法に従って行なわれる。 バチルス属菌を形質転換するには、 たとえばモレキュラー *アンド 'ジエネ ラル ·ジェネティ■ックス (Molecular & General Genetics) , 1 68巻， 1 1
1 (1979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル 'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ'ォブ'ザ 'ュ一エスェ一 （Proc. Natl.
Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1929 (1 978)に記載の方法に従って行な われる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえばバイオ テクノロジ一 （ Bio/Technology) , 6巻， 47— 55頁 （1 988年） などに記載の方法に従つ て行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえばヴイロロジ一 （Virology) , 52巻 ， 456 (1 973)に記載の方法に従って行なわれる。
発現べクタ一の細胞への導入方法としては、 例えば、 リポフエクシヨン法 〔 Feigner, P. L. et al. プロシ一ジングズ 'ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー ·ォブ 'サイェンジィズ 'ォブ 'ザ 'ュ一エスエー（Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America) ， 84巻， 741 3 頁 （1987年） 〕 、 リン酸カルシウム法 [Graham, F. L. and van der Eb， A. J.ヴイロロジ一 （Virology) , 52巻， 456— 467頁 （1 973年） 〕 、 電気穿孔法 〔Nuemann， E. et al. ェンボ 'ジャーナル （EMB0 〗.） ， 1巻， 8 41— 845頁 （1982年） 〕 等があげられる。
このようにして、 本発明で用いられる S LC— 1または MCHをコードする DN Aを含有する発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。 なお、 動物細胞を用いて、 本発明で用いられる SLC— 1または MCHを安 定に発現させる方法としては、 上記の動物細胞に導入された発現べクタ一が染 色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。 具体的 には、 上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。 さらに、 この ように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選 択を行なうことにより本発明で用いられる SLC— 1または MCHの高発現能 を有する安定な動物細胞株を得ることができる。 また、 dh i r遺伝子を選択 マーカーとして用いた場合、 MTX濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択 することにより、 dh f r遺伝子とともに、 本発明で用いられる SLC— 1ま たは MCHをコードする DNAを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細 胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明で用いられる S LC— 1または MCHをコードす る DN Aが発現可能な条件下で培養し、 本発明で用いられる SLC— 1または MCHを生成、 蓄積せしめることによって、 本発明で用いられる S LC— 1ま たは M C Hを製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 たとえばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 たとえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチ一プ' リカ一 、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機また は有機物質、 無機物としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどがあげられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進 因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （MiUer) ， ジャーナル 'ォブ'ェクスペリメン ッ ·イン ·モレキュラー · ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 43 1—433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 972] が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせ るために、 たとえば 3 3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが できる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜43°Cで約 3〜24時 間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 「プロシージングズ •ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ 一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980) 〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 「プロシ一ジ ングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ · ザ.ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1巻， 5330 ( 1 984) 〕 があげられる。 培地の ρΗは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培 養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌 を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. ，ネイチヤー (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動 化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3 〜5日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 2 ^
5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻 , 501 ( 1 952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8巻， 3 96 (1959)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ 'ザ 'アメリカ ン ·メディ力 レ ·ァソシェ——シヨン (The Journal of The American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング' ォブ'ザ.ソサイエティ ·フォ一 *ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of The Society for The Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 な どが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜 40°Cで約 15〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に CHO (dhfr— ) 細胞および dhfr遺伝子を選択マーカ一として用いる場 合には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培地を 用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明で用いられる SLC— 1または MCHを分離精製する には、 例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明で用いられる SLC— 1または MCHを培養菌体あるいは細胞から抽 出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適 当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによつ て菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過により本発明で用いられ る S L C— 1または MCHの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。 緩衝液 の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、 トリトン X— 100 ( 登録商標。 以下、 TMと省略することがある。 ） などの界面活性剤が含まれて いてもよい。
培養液中に本発明で用いられる S L C— 1または MCHが分泌される場合に は、 培養終了後、 自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清 を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明で用 いられる S LC— 1または MCHの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に 組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩 析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過 法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量 の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用す る方法、 ァフイエティ一クロマトグラフィ一などの特異的親和性を利用する方 法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電 点電気泳動法ゃクロマトフオーカシングなどの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
かくして得られる本発明で用いられる SLC— 1または MCHが遊離体で得 られた場合には、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換 することができ、 逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準 じる方法により、 遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明で用いられる S LC— 1または MCHを、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修 飾を加えたり、 タンパク質 （ペプチド） を部分的に除去することもできる。 蛋 白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルェン ドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。 ま た N末端アミノ酸を欠失させるためには、 エドマン（Edman)試薬 （フエニルイソ チオシァネート） を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
かくして生成する本発明で用いられる SLC— 1または MCHの存在は特異 抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定することができる。
(2) MCHもしくはその誘導体またはその塩および SLC— 1またはその塩 を用いることを特徴とする MCHまたはその塩と S LC— 1またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法または M C Hも しくはその標識体またはその塩および SLC— 1またはその塩を用いることを 2 g
特徴とする MCHまたはその塩と SLC— 1またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット （以下、 本発明のスクリー ニング方法、 本発明のスクリーニング用キットと略記する） について以下に詳 述する。
SLC— 1またはその塩を用いるか、 または組換え型 SLC— 1の発現系を 構築し、 該発現系を用いた MCHもしくはその誘導体またはその塩との結合ァ ッセィ系 （リガンド ·レセプターアツセィ系） を用いることによって、 MCH またはその塩と S L C— 1またはその塩との結合性を変化させる化合物 （例え ば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 SLC_ 1を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca 遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を有する化合物 （即ち SLC— 1ァゴニスト） と該細胞刺激 活性を有しない化合物 （即ち SLC— 1アン夕ゴニスト） などが含まれる。 「 MCHまたはその塩と SLC— 1またはその塩との結合性を変化させる」 とは 、 MCHまたはその塩と SLC— 1またはその塩との結合を阻害する場合とリ ガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、 本発明は、 （ i) S LC— 1またはその塩に、 MCHもしくはそ の誘導体またはその塩を接触させた場合と （ii) 上記した SLC— 1またはそ の塩に、 MCHもしくはその誘導体またはその塩および試験化合物を接触させ た場合との比較を行なうことを特徴とする MCHまたはその塩と SLC— 1ま たはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法 を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i) 上記した SLC— 1または 2 ^
その塩に、 MCHもしくはその誘導体またはその塩を接触させた場合と （ii) 上記した SLC— 1またはその塩に、 MCHもしくはその誘導体またはその塩 および試験化合物を接触させた場合における、 例えば該 SLC— 1またはその 塩に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較する。
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
①標識した MCHもしくはその誘導体またはその塩 （ 「MCHの誘導体または その塩」 として、 上記の 「MCH等が標識化されたものまたはその塩」 を用い る場合には、 更に標識する必要はない。 以下同じ。 ） を、 上記した SLC— 1 またはその塩に接触させた場合と、 標識した MCHもしくはその誘導体または その塩および試験化合物を SLC— 1またはその塩に接触させた場合における 、 標識した MCHもしくはその誘導体またはその塩の該 SLC— 1またはその 塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする MCHまたはその塩と S LC— 1またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ —ニング方法、
②標識した MCHもしくはその誘導体またはその塩を、 SLC— 1を含有する 細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識した MCHもしくはその 誘導体またはその塩および試験化合物を SLC— 1を含有する細胞または該細 胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した MCHもしくはその誘導体ま たはその塩の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを 特徴とする MCHまたはその塩と SLC— 1との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法、
③標識した MCHもしくはその誘導体またはその塩を、 SLC— 1をコードす る DN Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した S LC- 1に接触させた場合と、 標識した MCHもしくはその誘導体またはその 塩および試験化合物を SLC— 1をコードする DNAを含有する形質転換体を 培養することによつて細胞膜上に発現した S L C— 1に接触させた場合におけ る、 標識した MCHもしくはその誘導体またはその塩の SLC— 1に対する結 合量を測定し、 比較することを特徴とする MCHまたはその塩と SLC— 1と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④ SLC— 1を活性化する化合物 （例えば、 MCHもしくはその誘導体または その塩） を SLC— 1を含有する細胞に接触させた場合と、 3 。ー 1を活性 化する化合物および試験化合物を SLC— 1を含有する細胞に接触させた場合 における、 SLC— 1を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 Ca 遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など ) を測定し、 比較することを特徴とする MCHまたはその塩と S L C— 1との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤ SLC— 1を活性化する化合物 （例えば、 MCHもしくはその誘導体または その塩など） を SLC— 1をコードする DNAを含有する形質転換体を培養す ることによって細胞膜上に発現した SLC— 1に接触させた場合と、 SLC— 1を活性化する化合物および試験化合物を、 SLC— 1をコードする DN Aを 含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した S L C— 1に 接触させた場合における、 SLC— 1を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑 制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする MCHまたはその塩と SLC- 1との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法 などである。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる SLC— 1としては、 上記の S LC一 1を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 ヒト、 温血動 物、 魚類などの臓器の膜画分などが好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器 は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させた SLC— 1などが適している。 特にヒト型 S LC— 1については、 既報 （FEBS Letters 398 (1996) 253 - 258など） のァミノ 酸配列で表される S LC— 1に比べ、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列 を含有する S LC— 1を用いることにより、 感度のよいスクリーニングが可能と なる。
SLC- 1を製造するには、 前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 S LC— 1を含有する細胞あるいは 該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
SLC— 1を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホ ルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って 行うことができる。
SLC— 1を含有する細胞としては、 S LC— 1を発現した宿主細胞をいう 力 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞 などがあげられる。
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem 型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングプレンダ一やポリトロン (Kinematica社製） による破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加 圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる 。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜 3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高 速 （ 15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得 られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した SLC— 1と細胞由来 のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該 S L C— 1を含有する細胞や膜画分中の S LC- 1の量は、 1細胞当たり 10 〜10 分子であるのが好ましく、 10 〜10 分子であるのが好適であ る。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高 くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口 ットで大量の試料を測定できるようになる。
MCHまたはその塩と S LC— 1との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングする前記の①〜③を実施するためには、 適当な SLC— 1画分と、 標識 したリガンドまたはリガンド活性を有する化合物 （M C Hもしくはその誘導体 ) が用いられる。 3 じー 1画分としては、 天然型の SLC— 1画分か、 また はそれと同等の活性を有する組換え型 S L C— 1画分などが望ましい。 ここで 、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性などを示す。 標識したリガンドま たはリガンド活性を有する化合物としては、 標識したリガンドまたはリガンド
3 活性を有する化合物 （MCHまたはその誘導体） などが用いられる。 例えば 〔' H〕 、 〔 I〕 、 〔 C〕 、 〔 S〕 などで標識されたリガンド （MCHま たはその誘導体） などを利用することができる。 特に、 ボルトン—ハンター試 薬を用いて公知の方法で調製した M C Hの誘導体の標識体を利用することもで さる。
MCH誘導体の標識体の具体例としては、 例えば、 上記の （1) 〜 （7) で 表される化合物などがあげられる。
具体的には、 (3!^またはその塩と3し( — 1との結合性を変化させる化合 物のスクリーニングを行うには、 まず SLC— 1を含有する細胞または細胞の 膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプタ 一標品を調製する。 バッファ一には、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩酸バッファ一などのリガンドとレセプ夕一と 01
の結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合
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を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n— 80 (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えること もできる。 さらに、 プロテアーゼによる SLC— 1や MCHもしくはその誘導 体の分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所 製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 lm 1〜 10m lの該レセプター溶液に、 一定量 （5000 c pm〜5000 O O c pm) の標識した MCHもしくはその誘導体を添加し、 同時に 10 〜 10 xMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るため に大過剰の未標識の MCHもしくはその誘導体を加えた反応チューブも用意す る。 反応は 0°Cから 50°C、 望ましくは 4°Cから 37°Cで 20分から 24時間 、 望ましくは 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適 量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シ ンチレーションカウンターまたはァーカウンターで計測する。 拮抗する物質が ない場合のカウント（B。） から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （ B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が例えば 50 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することが できる。
また、 SLC— 1と MCHもしくはその誘導体との結合を測定する方法とし て、 B I Ac o r e (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） を用いること もできる。 この方法では、 MCHもしくはその誘導体を装置に添付のプロトコ ルに従ったァミノカツプリング法によってセンサ一チップに固定し、 S L C— 1を含有する細胞または S L C— 1をコードする DNAを含有する形質変換体 から精製した SLC— 1または SLC— 1を含む膜画分、 あるいは精製した S LC- 1または SLC— 1を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッフ ァ一またはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサ一チップ上を毎分.2— 20 H 1の流量で通過させる。 センサーチップ上の MCHもしくはその誘導体と S LC一 1とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存す る試験化合物が変化させることを観察することによって SLC— 1と MCHと の結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。 この方法 は、 SLC— 1をセンサーチップに固定し、 MCHもしくはその誘導体または M C Hもしくはその誘導体および試験化合物を含むリン酸バッファ一またはト リスバッファーなどの緩衝液をセンサ一チップ上を通過させる方法を用いても 同様に測定することができる。 試験化合物としては、 上記と同様のものなどが あげられる。
MCHまたはその塩と S LC— 1またはその塩との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングする前記の④〜⑤の方法を実施するためには、 SLC— 1 を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 Ca 遊離、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または 市販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 SL C一 1を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 スクリーニング を行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当な バッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした 後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に 従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など ) の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素 に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑 制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大さ せておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリ一ニングを行なうには、 適当な S L C— 1を 発現した細胞が必要である。 本発明の SLC— 1を発現した細胞としては、 前 述の組換え型 S L C— 1発現細胞株などが望ましい。 形質転換体である S L C 一 1発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。 また、 動物細胞の 種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげ られる。
上記のリガンド ' レセプ夕一アツセィ系について、 さらに具体的に記載する と以下のようなアツセィ系が用いられる。
(1) 受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の G夕 ンパクが活性化されて G T Pが結合する。 この現象は受容体発現細胞の膜画分 においても観察される。 通常、 GTPは加水分解されて G DPへと変化するが 、 このとき反応液中に GTPァ Sを添加しておくと GTPァ Sは GTPと同様 に Gタンパクに結合するが、 加水分解されずに Gタンパクを含む細胞膜に結合 した状態が維持される。 標識した GTPァ Sを用いると細胞膜に残存した放射 活性を測定することによって受容体ァゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測 定することができる。 この反応を利用して MCHもしくはその誘導体の S L C 一 1発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。 この方法は、 前記④ 〜⑤のように SLC— 1を含む細胞を用いるものではなく、 ①〜③のように S LC一 1を含む膜画分を用いるアツセィ法であるが、 ④〜⑤のように細胞刺激 活性を測定するものであり、 本測定法において SLC— 1膜画分への GTP r S結合促進活性を示す物質はァゴニストである。 具体的には、 後述の実施例 9 、 実施例 16およびそれらに準じた方法により行われる。 ここにおいて、 MC Hもしくはその誘導体あるいは MCHもしくはその誘導体および試験化合物を 添加し、 MCHもしくはその誘導体の単独投与に比べて SLC— 1細胞膜画分 への G T Pァ S結合促進活性に変化が生じることを観察することによって M C Hと S L C— 1との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングすることがで きる。 このとき、 MCHもしくはその誘導体による S LC— 1細胞膜画分への GTP r S結合促進活性を抑制する活性を示す化合物を拮抗阻害能力のある候 補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 S L C - 1細胞膜画分への GTPァ S結合促進活性を観察することによりァゴニスト のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。 後述の実施例 9または実施例 1 6に述べた方法によって調製したヒトまたはラット S LC— 1を含む細胞膜画分を、 膜希釈緩衝液 （50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 L GDP, 0.1% BSA pH 7.4) で希釈する。 希釈率は、 受容体の発現量により 異なる。 これを Falcon2053に 0.2mlずつ分注し、 MCHもしくはその誘導体ある いは MCHもしくはその誘導体および試験化合物を加え、 さらに終濃度 200 M となるように [35S]GTPTSを加える。 25°Cで 1時間保温した後、 氷冷した洗浄用緩 衝液 (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.1% BSA , 0.05% CHAPS pH 7.4 1.5ml) を加えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65° (：、 30分保温して乾燥後 、液体シンチレーシヨンカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した [35S]GTP TSの放射活性を測定する。 MCHもしくはその誘導体のみを加えた実験区の放 射活性を 100%、 MCHもしくはその誘導体を加えなかった実験区の放射活性を 0%とし、 MCHもしくはその誘導体による GTPァ S結合促進活性に対する試 験化合物の影響を算出する。 GTPァ S結合促進活性が例えば 5 0 %以下にな る試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
(2) S LC— 1発現細胞は MCH刺激によって細胞内 cAMP量が減少する。 こ の反応を利用して M C Hの S L C— 1発現細胞に対する刺激活性を測定するこ とができる。
S L C— 1を発現させた種々の動物細胞の cAMP産生量はマウス、 ラット、 ゥ サギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と1251標識 cAMP (ともに巿 販品） を使用することによつ TRIASるいは抗 cAMP抗体と標識 cAMPとを組み合わ せた他の EIA系でも測定することができる。 また抗 cAMP抗体を protein Aあるい は抗 cAMP抗体産生に用いた動物の IgGなどに対する抗体などを使用して固定し たシンチラントを含むビーズと1251標識 cAMPとを使用する SPA法による定量も可 能である （アマシャムフアルマシアバイオテク製のキットを使用する） 。
cAMP産生抑制のアツセィは、 具体的には後述の実施例 14およびそれに準じ た方法により行われる。 この系において、 フオルスコリンまたは calcitoninな ど細胞内 c AMP量を増加させるようなリガンドなどによつて細胞内 c AMP量を上昇 させ、 MCHもしくはその誘導体または M C Hもしくはその誘導体および試験 化合物を添加することによって MCHもしくはその誘導体の単独投与による細 胞内 cAMP量の抑制が変化することを観察し、 MCHと SLC_ 1の結合を変化 させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。 このとき、 MCHもし くはその誘導体による S LC- 1発現細胞の cAMP産生抑制活性を阻害する活性 を示す化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一 方、 試験化合物のみを添加して cAMP産生抑制活性を調べることによりァゴニス ト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
スクリーニング法をより具体的に以下に記載する。 CH0/SLC-1細胞を 24穴プレ 一卜に 5 X 104 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.2mM 3—イソブ チル—メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 (pH7.4)で洗浄する （以下、 0.2 3一^ Γソブチル―メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4)を、 反応用バッファーと呼 ぶ） 。 その後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反 応用バッファーを除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 2 Mフオルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファーに 1 nMの MCHもしくはそ の誘導体あるいは 1 nMの MCHもしくはその誘導体および試験化合物を添加し たものを細胞に加え、 37 Cで 24分間反応させる。 100 1の 20過塩素酸を加 えて反応を停止させ、 次に氷上で 1時間置くことにより細胞内 cA Pを抽出する 。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアバイオテク ) を用いて測定する。 フォルスコリン刺激によって産生された cAMP量を 100%と し、 1 nMの M C Hもしくはその誘導体の添加によって抑制された cAMP量を 0%と して、 M C Hもしくはその誘導体による cAMP産生抑制活性に対する試験化合物 の影響を算出する。 M C Hもしくはその誘導体の活性を阻害して cAMP産生活性 が例えば 5 0 %以上になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選 択することができる。
cAMP産生促進活性を測定するには、 フオルスコリンを添加せずに CH0/SLC- 1細 胞に試験化合物を添加して産生された cAMPを上記の方法で定量する。
( 3 ) CRE (cAMP response element) を含む D NAを、 ピツカジーン ベイシ ックベクタ一またはピツカジーン ェンハンサ一ベクター （東洋インキ製造 （ 株） ） のルシフェラ一ゼ遺伝子上流のマルチクロ一ニングサイトに揷入し、 こ れを CRE—レポーター遺伝子ベクターとする。 CRE—レポーター遺伝子ベクター をトランスフエクシヨンした細胞において、 cAMP上昇を伴う刺激は、 CREを介 したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の 産生を誘導する。 つまり、 ルシフェラ一ゼ活性を測定することにより、 CRE— レポ一ター遺伝子べクタ一導入細胞内の cAMP量の変動を検出することができる 。 CRE—レポ一夕一遺伝子ベクターを S L C— 1発現細胞にトランスフエクショ ンした細胞を利用して M C Hと S L C— 1の結合を変化させる化合物のスクリ —ニングを行なうことができる。 具体的なスクリーニング法を以下に記す。
CRE—レポ一夕一遺伝子導入 S L C— 1発現細胞を 24穴プレー卜に 5 x 103 cel l /we 11で播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3 —イソプチルーメチル キサンチンと 0. 05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（ρΗ7· 4)で洗浄 する （以下、 0. 2mM 3—イソブチルーメチルキサンチンと 0. 05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（PH7. 4)を、 反応用バッファーと呼ぶ） 。 その 後 0.5mlの反応用バッファ一を加えて 3 0分間培養器で保温する。 反応用バッフ ァ一を除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 1 nMの MC Hもしくはその誘導体あるいは 1 nMの M C Hもしくはその誘導体および試験化 合物と 2 Mフオルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファ一を細胞に加え、 3 7°Cで 24分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製 造 （株） ） で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する 。 ルシフェラーゼによる発光は、 ルミノメ一夕一、 液体シンチレーシヨンカウ ン夕一またはトップカウンタ一により測定する。 MCHと S LC— 1の結合を 変化させる化合物の影響はルシフェラーゼによる発光量を MCHもしくはその 誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定することができる。 このとき、 MCHもしくはその誘導体の投与によりフォルスコリン刺激による 発光量の増加が抑制されるが、 この抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力の ある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 フオルスコリン刺激によって上昇した発光量の MCHもしくはその誘導体と同 様な抑制を観察することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともで さる。
レポ一夕一遺伝子として、 ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファ 夕一ゼ、 クロラムフエニコ一ル ァセチルトランスフェラーゼあるいは —ガ ラクトシダ一ゼを用いることもできる。 これらのレポ一夕一遺伝子の遺伝子産 物の酵素活性は以下のように市販の測定キッ卜を用いて容易に測定することが できる。 アルカリフォスファタ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530に よって、 ク ロラムフエ二コール ァセチル ト ランスフェラーゼ （ chloramphenicol acetyl transferase) 活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTiこよって、 β—カラク -シター ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEによって測定することができる。
(4) S LC— 1発現細胞は MCH刺激の結果ァラキドン酸代謝物を細胞外に 放出する。 あらかじめ、 放射活性を有するァラキドン酸を細胞に取り込ませて おくことによって、 この活性を細胞外に放出された放射活性を測定することに よって測定することができる。 測定は、 後述の実施例 6およびそれに準じた方 法により行われる。 このとさ、 MCHもしくはその誘導体あるいは MCHもし くはその誘導体および試験化合物を添加して、 MCHもしくはその誘導体のァ ラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、 MCHと SLC 一 1の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。 こ のとき、 MCHもしくはその誘導体によるァラキドン酸代謝物放出活性を阻害 する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 また 、 試験化合物のみを添加し、 SLC— 1発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活 性を後述の実施例 6に準じた方法で調べることによりァゴニスト活性を示す化 合物のスクリーニングを行なうこともできる。 MCHと SLC— 1の結合に影 響を与える化合物のスクリーニング法より具体的に以下に述べる。
CH0/SLC- 1細胞を 24穴プレートに 5 x 104 eel 1/wel 1で播種し、 24時間培養後、 [¾]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加する。 [¾]ァラキドン酸添加 16時間後、 細胞を 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（pH7.4)で 洗浄し、 各 wellに 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（pH7.4)に 溶解した終濃度 10 nMの MCHもしくはその誘導体あるいは 10 nMの MCHもし くはその誘導体および試験化合物を含むバッファ一 500 を添加する。 以降、 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4)を反応用バッファ一 と呼ぶ。 37°Cで 60分間インキュベートした後に、 反応液 400 lをシンチレ一夕 一に加え、反応液中に遊離した [¾]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーシヨン カウンタ一により測定する。 MCHもしくはその誘導体の非添加反応バッファ 一による培地中の [¾]ァラキドン酸代謝物の量を とし、 10 nMの MCHもしく はその誘導体を添加したときの培地中の [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 100%と して試験化合物の M C Hもしくはその誘導体と S L C— 1の結合に対する影響 を算出する。 ァラキドン酸代謝物産生活性が例えば 50%以下になる試験化合 物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
(5) SLC— 1発現細胞を MCHによって刺激することによって細胞内の Ca 濃度が上昇する。 これを利用することによって MCHと SLC— 1の結合に対 する試験化合物の影響を調べることができる。
SLC— 1発現細胞を、 滅菌した顕微鏡用カバ一グラス上に播き、 2日後、 培養液を 4 mM Fura-2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBSSに置換し、 室温で 2 時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュベットにカバーグラスをセットし、 蛍 光測定器で、 MCHもしくはその誘導体あるいは MCHもしくはその誘導体お よび試験化合物を加えたときの励起波長 340nm及び 380nmでの 505nmの蛍光強度 の比の上昇を測定する。 このとき、 MCHもしくはその誘導体を単独で投与し たときに比べて試験化合物の添加によって生じる蛍光強度の変化を測定するこ とにより MCHと SLC— 1の結合に対して影響を与える化合物のスクリ一二 ングを行なうことができる。 また、 以下のように FLIPR (モレキュラーデバイス 社製） を使うこともできる。 すなわち、 細胞縣濁液に Fluo- 3 AM (同仁化学研究 所製） を添加し、 細胞に取り込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 96 穴プレートに細胞を播く。 FLIPR装置にセットし、 Fura- 2の場合と同様に MCH もしくはその誘導体あるいは M C Hもしくはその誘導体および試験化合物を加 え、 M C Hもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添 加によって観測される蛍光強度が変化することを測定することにより、 MCH もしくはその誘導体と S L C— 1の結合に対して影響を与える化合物のスクリ 一二ングを行なうことができる。 これらにおいて、 MCHもしくはその誘導体 による蛍光強度の上昇を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として 選択することができる。 一方、 試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を 観察することによってァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
S L C— 1発現細胞に aequorinなどのように細胞内 Caイオンの上昇によって 発光するようなタンパク質の遺伝子を共発現させておき、 細胞内 Caイオン濃度 の上昇によつて aequor i nが Ca結合型となり発光することを利用して、 M C Hも しくはその誘導体あるいは M C Hもしくはその誘導体および試験化合物を加え 、 M C Hもしくはその誘導体を単独で投与したときに比べて試験化合物の添加 によって観測される発光強度が変化することを測定することにより、 MCHと SLC- 1の結合に対して影響を与える化合物のスクリーニングを行なうこと ができる。 方法は、 蛍光物質を取り込ませないこと以外は上記と同様である。
(6) 受容体を発現する細胞に受容体ァゴニス卜を添加すると、 細胞内イノシ トール三リン酸濃度が上昇することが知られている。 MCHによって生じる S LC一 1細胞におけるこの反応を観察することにより MCHと SLC— 1の結 合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうことができる。 24穴プレ —卜に播いて 1日目の細胞に myo-[2-¾] inositol (2.5マイクロ Ci/wel 1)を添加 した培地中で 1日培養した細胞を、 よく洗浄後、 MCHもしくはその誘導体あ るいは M C Hもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後、 10%過塩素酸 を加え反応を止める。 1.5 M KOH, 60mM HEPES溶液で中和し、 0.5ml の AGlx8樹 脂 (Bio- Rad)を詰めたカラムに通し、 5mM Na2B03 60mM HC00NH4で洗浄した後、 1M HC00NH4 0.1M HC00Hで溶出した放射活性を液体シンチレ一ションカウンタ 一で測定する。 M C Hもしくはその誘導体の非添加反応バッファ一による培地 中の放射活性を 0%とし、 MCHもしくはその誘導体を添加したときのたときの 培地中の放射活性を 100%として試験化合物の M C Hもしくはその誘導体と S L C一 1の結合に対する影響を算出する。 イノシトール三リン酸産生活性が例え ば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択する ことができる。 一方、 試験化合物のみの添加によるイノシトール三リン酸産生 上昇を観察することによってァゴニストのスクリーニングを行なうこともでき る。
(7) TRE (TPA response element) を含む DNAを、 ピツカジーン ベイシッ クベクターまたはピツカジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株 ) ) のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、 これ を TRE—レポ一夕一遺伝子べクタ一とする。 TRE—レポーター遺伝子ベクターを トランスフエクションした細胞において、 細胞内 Ca上昇を伴う刺激は、 TREを 介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質 の産生を誘導する。 つまり、 ルシフェラ一ゼ活性を測定することにより、 TRE 一レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出すること ができる。 TRE—レポーター遺伝子ベクターを SLC_ 1発現細胞にトランス フエクションした細胞を利用した MCHと S LC— 1の結合を変化させる化合 物の具体的なスクリーニング法を以下に記す。
TRE—レポーター遺伝子導入 S LC— 1発現細胞を 24穴プレートに 5 x 103 cell/wellで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハ ンクスバッファ一（PH7.4)で洗浄した後、 10 nMの MCHもしくはその誘導体あ るいは 10 nMの MCHもしくはその誘導体および試験化合物を添加し、 37°Cで 60分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株 ) ) で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシ フェラ一ゼによる発光は、 ルミノメ一ター、 液体シンチレ一シヨンカウンター またはトップカウンタ一により測定する。 MCHもしくはその誘導体と SLC 一 1の結合を変化させる化合物の影響は、 ルシフヱラーゼによる発光量を MC Hもしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定する ことができる。 このとき、 MCHもしくはその誘導体の投与により細胞内 Caの 上昇によって発光量が増加するが、 この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力 のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し 、 MCHもしくはその誘導体と同様な発光量の増加を観察することによりァゴ 二ストのスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラ一ゼ以外に例えばアル力リフォスファ 夕一ゼ、 クロラムフエ二コール ァセチルトランスフェラ一ゼあるいは i3—ガ ラクトシダーゼを用いることもできる。 これらのレポ一夕一遺伝子の遺伝子産 物の酵素活性は以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することが できる。 アルカリフォスファタ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530に よって、 クロラムフエ二コール ァセチルトランスフェラーゼ （ chlora即 henicol acetyl transferase) 活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrola即 henicol Acetyl transferase Assay Kit(lJ T 3—カラクトシター ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEによって測定することができる。
(8) MCHに応答した S L C— 1発現細胞は MAP kinase活性化によって増殖 が観察される。 この増殖を MAP kinase活性、 チミジン取り込み、 細胞数測定 （ MTTなど） によって測定することができる。 これを利用して MCHもしくはその 誘導体と S L C— 1の結合を変化させる化合物のスクリ一ニングを行なうこと ができる。
MAP kinase活性は、 MCHもしくはその誘導体あるいは MCHもしくはその 誘導体および試験化合物を細胞に添加した後、 細胞溶解液から抗 MAP kinase抗 体を用いた免疫沈降によって MAP kinase分画を得た後、 例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Ki tとァ- [32P] -ATPを使用して容易に測定できる。 チミジン取り込 み活性は、 SLC- 1発現細胞を播き、 MCHもしくはその誘導体あるいは MCHも しくはその誘導体および試験化合物を添加した後、 [methy卜3 H]-チミジンを加え 、 その後、 細胞内に取り込まれた標識チミジンの放射活性を細胞を溶解して液 体シンチレーシヨンカウンターで計数することによって測定することができる
SLC— 1発現細胞の増殖は、 発現細胞を播き、 MCHもしくはその誘導体 あるいは M C Hもしくはその誘導体および試験化合物を添加した後に MTT (3 - (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazol ium bromide) を添カロ し、 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを塩酸酸性としたィソ プロパノールで細胞を溶解した後、 570 nmの吸収を測定することによつても測 定できる。
MCHと SLC— 1の結合を変化させる化合物の、 標識チミジン取り込み活 性を利用した具体的なスクリーニング法を以下に記す。
SLC— 1発現細胞を 24穴プレートにゥエル当たり 5000個まき一日間 培養する。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にする。 MCHもしくはその誘導体あるいは MCHもしくはその誘導体および試験化合 物を細胞に添加して 24時間培養した後、 [methy卜3 H] チミジンをゥエル当たり 0. 015MBQ添加し 6時間培養する。 細胞を PBSで洗った後、 メタノー ルを添加して 10分間放置する。 次に 5%トリクロ口酢酸を添加して 15分間 放置後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水酸化ナトリウム溶液 で細胞を溶解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウン夕一で測 定する。 MCHと S LC— 1の結合を変化させる化合物の影響は、 チミジン取 り込みによる放射活性の上昇を MCHもしくはその誘導体を単独で投与した場 合と比較することによって測定することができる。 このとき、 MCHもしくは その誘導体の投与による放射活性の増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のあ る候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 M CHもしくはその誘導体と同様な放射活性の増加を観察することによりァゴニ ス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
(9) SLC— 1発現細胞に MCHを添加すると、 K channelが活性化し、 細胞 内にある Kイオンが、 細胞外に流出する。 Kイオンと同族元素である Rbイオンは 、 Kイオンと区別無く K channelを通って細胞外に流出するので、 細胞に標識 Rb ([86Rb])を添加して取り込ませておいた後、 MCHの刺激によって流出する [8¾b]の流れを測定することで MCHの作用を測定できる。 MCHと SLC— 1 の結合を変化させる化合物の、 [8¾b]流出活性を利用した具体的なスクリ一ニン グ法を以下に記す。 24穴にまいて 2日後の SLC— 1発現細胞を lmCi/ml の86 RbClを含む培 地中で 2時間保温する。 培地をよく洗浄し、 外液中の86 RbClを完全に除く。 MC Hもしくはその誘導体あるいは MC Hもしくはその誘導体および試験化合物を 細胞に添加して 30分後の外液を回収し、 ァカウン夕一で放射活性を測定する 。 MCHもしくはその誘導体と SLC— 1の結合を変化させる化合物の影響は 、 [8¾b]流出による放射活性の上昇を MCHもしくはその誘導体を単独で投与し た場合と比較することによって測定することができる。 このとき、 MCHもし くはその誘導体の投与による放射活性の上昇を抑制する化合物を拮抗阻害能力 のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し 、 MCHもしくはその誘導体と同様な放射活性の上昇を観察することによりァ ゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
( 1 0 ) S L C— 1発現細胞が MCHに反応して変化する細胞外の pH ( acidification rate) を Cyto s e n s o r装置 、モレキュラーテパ、ィス社) を使用して測定することによって、 MCHの活性を測定することができる。 C y to s e n s o r装置を利用した、 細胞外 p H変化の測定をすることによる M C Hと S L C— 1の結合を変化させる化合物の具体的なスクリ一二ング法を以 下に記す。
SLC— 1発現細胞を Cyto s e n s o r装置用のカプセル内で終夜培養 し、 装置のチャンバ一にセットして細胞外 pHが安定するまで約 2時間 0.1% BSA を含む RPMI1640培地 （モレキユラ一デバイス社製） を灌流させる。 pHが安定 した後、 MCHもしくはその誘導体あるいは MCHもしくはその誘導体および 試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させることによって生じる培地の PH変化 を測定する。 MCHと SLC— 1の結合を変化させる化合物の影響は、 SLC 一 1発現細胞の細胞外 P H変化を M C Hもしくはその誘導体を単独で投与した 場合と比較することによって測定することができる。 このとき、 MCHもしく はその誘導体の投与による細胞外 PH変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力の λ 「
45
ある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 M C Ηもしくはその誘導体と同様な細胞外 Ρ Η変化を観察することによりァゴ ニストのスクリーニングを行なうこともできる。
(1 1) 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) c aploid α-mat ing Type (MAT o; ; の性フェロモン受容体 STe2は G蛋白 Gpalとカップルしており、 性フェロモンひ - mating factorに応答して MAP kinaseを活性化し、 以下、 Farl (cell-cycle arrest) および転写活性化因子 Stel2が活性化される。 Stel2は接合に関与する FUS1を含む種々の蛋白の発現を誘導する。 一方、 制御因子 Sst2は以上の過程に 抑制的に機能する。 この系において、 受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、 受容体ァゴニスト刺激によって酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、 その 結果生じる増殖などの指標を用いた、 受容体ァゴニストと受容体との反応の測 定系の試みが行なわれている （Pausch, M. H. , Trends in Biotechnology, vol. 15, pp. 487-494 (1997)) 。 このような受容体遺伝子導入酵母の系を利用して MCHおよび S L C- 1の結合を変化させる化合物のスクリ一ニングを行なう ことができる。
¾½丁0；酵母の5162ぉょび¾^1をコ一ドする遺伝子を除去し、 代わりに S LC— 1遺伝子および Gpa卜 Gai2融合蛋白をコードする遺伝子を導入する。 Farをコー ドする遺伝子を除去して eel卜 cycle arrestが生じないようにし、 また、 Sstを コードする遺伝子を除去することによって MCHに対する応答の感度を向上さ せておく。 さらに、 FUS1にヒスチジン生合成遺伝子 HIS3をつなげた FUS1- HIS3遺 伝子を導入する。 以上の遺伝子組換え操作は例えば、 Priceら （Price, L. A. et al. , Molecular and Cellular Biology, vol. 15, pp. 6188-6195 (1995)) の 報告に記載の方法において、 ソマトス夕チン受容体タイプ 2 (SSTR2) 遺伝子を SLC- 1に置き換えて実施することによって容易に行なうことができる。 こ うして構築された形質変換酵母は S L C _ 1のリガンドである MCHに高感度 で反応し、 その結果 MAPキナーゼの活性化が起きてヒスチジン生合成酵素が合成 されるようになって、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。 これを利用して 、 ヒスチジン欠乏培地での酵母の生育を指標として MCHによる SLC— 1発 現酵母の応答を観察することができる。 以下に MCHおよび SLC— 1の結合 を変化させる化合物のスクリーニング法を述べる。
上記のようにして作製された形質変換酵母を完全合成培地の液体培地で終夜 培養し、 2 X 104 cell/mlの濃度でヒスチジンを除去した溶解寒天培地に加え、 9 X 9 cmの角形シャーレに播く。 寒天が固化した後、 MCHもしくはその誘導体 あるいは M C Hもしくはその誘導体および試験化合物をしみこませた滅菌濾紙 を寒天表面におき、 30°Cで 3日間培養する。 MCHもしくはその誘導体と S L C一 1の結合を変化させる化合物の影響は、 濾紙の周囲の酵母の生育を MCH もしくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定するこ とができる。 このとき、 MCHもしくはその誘導体の投与による酵母の生育を 抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを投与し、 MCHもしくはその誘導体と同様な酵母の生 育を観察することによりァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。 また、 あらかじめ、 寒天培地に MCHもしくはその誘導体を添加しておいて滅 菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて培養し、 シャーレ全面での酵母の生育 が濾紙の周囲で影響を受けることを観察することによつても MCHと S LC— 1の結合を変化させる化合物の影響を調べることができる。
(12) SLC- 1遺伝子 RN Aをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、 MCHによって刺激すると細胞内 Caイオン濃度が上昇して、 calcium- activated chloride currentが生じる。 これを膜電位の変化としてとらえることが出来る (Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様） 。 MCHによって生じる SLC— 1導入アフリカッメガエル卵母細胞におけるこの反応を観察することにより M CHと SLC— 1の結合に影響を与える化合物のスクリーニングを行なうこと ができる。 ,
47
氷冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵母細胞 塊を， MB S液 （88mM NaCl, ImM KC1, 0.41mM CaCl2, 0.33mM Ca(N03) 2, 0.82iM MgS04> 2.4mM NaHC03, lOmM HEPES, pH7.4) に溶かしたコラーゲナーゼ（0.5mg/ml) で卵塊がほぐれるまで 1 9°C、 1-6時間、 150rpmで処理する。 外液を MBS液に 置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピュレータ一で poly(A)+ SLC-1 cRNA (50ng/50nl)をマイクロインジェクションする。 SLC— 1 mRNAは、 組織や細 胞から調製しても、 プラスミドから in vitroで転写してもよい。 これを MBS液中 で 20°Cで 3日培養する。 これを Ringer液を流している voltage cla即装置のく ぼみに置き、 電位固定用ガラス微小電極、 電位測定用ガラス微小電極を細胞内 に刺入し、 （-)極は、 細胞外に置く。 電位が安定したら、 MCHもしくはその誘 導体または M C Hもしくはその誘導体および試験化合物を含む Ri nger液を流し て電位変化を記録する。 MCHと SLC— 1の結合を変化させる化合物の影響 は、 SLC— 1導入アフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を MCHも しくはその誘導体を単独で投与した場合と比較することによって測定すること ができる。 このとき、 MCHもしくはその誘導体の投与による細胞膜電位変化 を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる 。 一方、 試験化合物のみを投与し、 MCHもしくはその誘導体と同様な細胞膜 電位変化を観察することによりァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともで さる。
この系において、 反応を変化量を増大して測定しやすいように各種の Gタン パク質遺伝子の poly(A) + RNAを導入することもできる。 また aequorinのような Ca 存在下で発光を生じるようなタンパクの遺伝子の P0ly(A)+ RNAを共インジェク シヨンすることにより膜電位変化ではなく発光を観察してこの反応を測定する こともできる。
MCHまたはその塩と S LC— 1またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング用キットは、 SLC— 1またはその塩、 S LC— 1を含有する細胞、 あるいは SLC— 1を含有する細胞の膜画分、 およ び MCHもしくはその誘導体またはその塩を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものがあげられる。 1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② SLC— 1標品
S LC— 1を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 10 個 Z穴で 継代し、 37°C、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
〔 H〕 、 〔 I〕 、 〔 C〕 、 〔 S〕 などで標識した MCH。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4°Cあるいは— 20DCにて保存し 、 用時に測定用緩衝液にて 1 に希釈する。
④リガンド標準液
MCHを 0. 1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImMと なるように溶解し、 — 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した SLC— 1を発現させた細胞を、 測 定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加え る。
② 10 〜10 Mの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した MCHを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験 化合物のかわりに 10 Mのリガンド （MCH) を 5/x l加えておく。 ③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンド （MCH) を 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4mlの液 体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、
Figure imgf000051_0001
またはその塩と31^(：— 1またはその塩との 結合を変化させる （結合を阻害あるいは促進する） 化合物であり、 具体的には SLC— 1を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩 （いわゆる SL C— 1ァゴニスト） 、 あるいは該刺激活性を有しない化合物 （いわゆる SLC 一 1アン夕ゴニスト） である。 該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新 規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記 S L C— 1ァゴニス卜であるかアンタゴニストであるかの具体的な評価 方法は以下の （ i) または （ii) に従えばよい。
( i ) 前記①〜③のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィ を行い、 MCHまたはその塩と S LC— 1またはその塩との結合性を変化させ る （特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した SLC— 1 を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する 化合物またはその塩は SLC— 1ァゴニストであり、 該活性を有しない化合物 「 n
50
またはその塩は S LC— 1アン夕ゴニストである。
(ii) (a)試験化合物を SLC— 1を含有する細胞に接触させ、 上記 SLC— 1 を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩 は S L C— 1ァゴニストである。
(b) SLC— 1を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまたは S LC- 1ァゴニストなど） を S L C— 1を含有する細胞に接触させた場合と、 SLC- 1を活性化する化合物および試験化合物を S LC- 1を含有する細胞 に接触させた場合における、 SLC— 1を介した細胞刺激活性を測定し、 比較 する。 S L C— 1を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合 物またはその塩は SLC— 1アン夕ゴニストである。
該 S L C— 1ァゴニストは、 S L C - 1に対する MCHまたはその塩が有す る生理活性と同様の作用を有しているので、 MCHまたはその塩と同様に安全 で低毒性な医薬として有用である。
逆に、 S LC_ 1アン夕ゴニストは、 SLC— 1に対する MCHまたはその 塩が有する生理活性を抑制することができるので、 該レセプター活性を抑制す る安全で低毒性な医薬として有用である。
MCHまたはその塩は食欲 （摂食） 増進作用およびォキシトシン分泌促進作 用などに関与していることから、 食欲 （摂食） 増進剤またはォキシトシン分泌 促進剤などとして用いることができるため、 上記のスクリーニング方法または スクリーニング用キットを用いて得られる化合物のうち、 3乙0— 1ァゴニス トは食欲 （摂食） 増進剤として用いることができる他、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞、 神経 性食欲不振症などの食欲不振およびそれに伴う貧血、 低蛋白症などの予防 ·治 療薬などとして用いることができ、 SLC— 1アン夕ゴニストは抗肥満剤 (薬） 、 食欲 （摂食） 調節剤などとして用いることができる他、 過強陣痛、 強直性子 宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 類菅裂傷、 早産、 Prader-Willi症候群、 糖尿病お よびその合併症 （糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経障害など） 、 高血圧、 高脂血症、 冠状動脈硬化症、 痛風、 呼吸器疾患 （P i ckwi ck症候群、 睡 眠時無呼吸症候群） 、 脂肪肝、 不妊症、 変形性骨関節症など （特に抗肥満剤 （ 薬） 、 食欲 （摂食） 調節剤など） の予防 ·治療薬などとして用いることができ る。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物の塩としては、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる。 例え ば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性 または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩など のアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩 、 ならびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチル ァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジェ夕 ノールァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキ シルァミン、 N， N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩などがあげら れる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸 などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタ ンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 ォ ルチニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えば ァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キッ卜を用いて得られ _ 0
0 L
る化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 上記の本発明のポリ ぺプチドを医薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キッ卜を用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 常套手段に従って実 施することができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるい は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液 剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩 を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態で混和することによって製 造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当 な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶 性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などの ような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖また はサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよ うな香味剤などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記 タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射の ための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油 などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実 施にしたがつて処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウ ムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえば エタノール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルべ一ト 80 (™) 、 HCO- 50) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油など があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと 併用してもよい。
また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化 剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば 、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベ ンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調 製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩の投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の 場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1か ら 1000mg、 好ましくは約 1. 0から 300mg、 より好ましくは約 3. 0から 50mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対 象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 たとえば注射剤の形 では成人の肥満症患者 （体重 6 O k として） への投与においては、 SLCァ ン夕ゴ二ストを一日につき約 0. 01から 3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1 から 20mg程度、 より好ましくは約 0. 1から 1 Omg程度を静脈注射によ り投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した 量を投与することができる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あ るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 ま たアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示 すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
Y チミンまたはシ卜シン
N チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R アデニンまたはグァニン
M シトシンまたはアデニン
W チミンまたはアデニン
S シ卜シンまたはグァニン
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP '三リン酸
EDTA ン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
TFA トリフルォロ酢酸
E I A ェンザィムィムノアッセィ
G 1 yまたは G ダリ A 1 aまた〖ま A フニン
V a 1よたは V ：ハリノ
、 ，、 ，
L e uよたは L ： ロインノ
I 1 eまたは I ：っ ゾ口 ンノ
S e rまたは S ：セリ ノ
T h rま 7こは T ：スレ才ーノ
C y sまたは C ： ンス " "ィノ
M e tまたは M ： メチォニン
G 1 uまたは E ： グル夕ミン酸
As pまたは D
L y sまたは K » リ "*
A r gまたは R ：アルギニン
H l sまたは H
' ヒスチンノ
P h eまたは F ： フェニ^!レアラニン
T y rまたは Y ：チロンン
T r pまたは W ： 卜リフ卜ファノ
P r oま/こは P ： ノロリノ
A s nまたは N ：ァスハフキノ
l nまた f y ：ク レタ ノ
P Lr 1 u . ヒ□クノレタ ^
Me ：メチル基
Et ：ェチル基
Bu ：ブチル基
Ph ： フエニル基
TC ：チアゾリジン 4 (R) カルボキサミド基 Bom ：ベンジルォキシメチル NMP ： N—メチルピロリドン
PAM ： フエニルァセトアミドメチル
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
To s ： p—トルエンスルフォニル
HONB ： N—ヒドロキシー 5—ノルポルネン一 2, 3—ジカル ポキシイミド
B z 1
Z ベンジルォキシカルポニル
BB rr -ZZ ： 2 - C 1一 Z 2—
Figure imgf000058_0001
B o c t一ブチルォキシカルボニル
HOBt 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
DCC TTFFAA ： トリフルォロ酢酸
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
DNP ジニトロフエニル
Bum 夕ーシャリ一ブトキシメチル
T r t 卜 Uチル
BBSSAA ：ゥシ血清アルブミン
CHAP S 3— [ (3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ] ― 1一プロパンスルホナー卜
PMSF ： フエ二ルメチルスルホニルフルオリド
E 64 ： (L_ 3— trans—カルボキォキシラン一 2—カルボ二 ル） L—口イシルーァグマチン
GDP ：グアノシン一 5，—二リン酸 r n
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Fu r a— 2 AM ：卜 [6-ァミノ- 2- (5 -カルボキシ- 2 -才キサゾリル) - 5-ベ ンゾフラニロキシ] -2 -（2-ァミノ- 5メチルフエノキシ） -ェタン- N, Ν， Ν', Ν'-四酢 HBS S ：ハンクス平衡塩液
F 1 u 0 - 3 AM ：卜 [2 -アミノ- 5-(2, 7 -ジクロ口- 6 -ヒドロキシ- 3 -ォキシ - 9 -キサンテニル）フエノキシ (2 -ァミノ- 5-メチルフエノキシ）ェタン- N, N, Ν', Ν'-四酢酸ペン夕ァセトキシメチルエステル
HE PES : 2— [4一 （2—ヒドロキシェチル） 一 1—ピペラジニ ル]エタンスルホン酸
Me B z 1 : 4—メチルベンジル
NMP ： N—メチルピロリドン
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ラット脳から精製された SLC-1に対するリガンドペプチドの N末端アミノ酸配列 解析の結果から得られたアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ラット MCHとして同定されたラット脳から精製された SLC- 1に対するリガン ドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ラット SLC- 1をコ一ドする cMAのスクリ一エングに使用した合成 DNAを示す。 〔配列番号： 4〕
ラット SLC- 1をコードする cDNAのスクリ一二ングに使用した合成 DNAを示す。 〔配列番号： 5〕
ラット SLC - 1の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕 5 o
5'側に Sal I認識配列が付加され、 また 3'側に Spe I認識配列が付加されたラット SLC-1 cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ラッ卜 SLC-1発現 CH0細胞の各クローンにおける SLC-lmRNAの発現量を測定する ために使用したリポプローブ （riboprobe) を示す。
〔配列番号： 8〕
ヒト SLC-1をコードする cDNAを取得するために使用した合成 DNAを示す。
〔配列番号： 9〕
ヒト SLC- 1をコードする cDNAを 2本鎖にするために使用したプライマ一を示す。 〔配列番号： 1 0〕
ヒト SLC- 1をコ一ドする cDNA全塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
ヒト SLC - 1の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
ヒト SLC- 1 (S)をコードする cDNAのスクリ一ニングに使用した合成 DNAを示す。 〔配列番号： 1 3〕
ヒト SLC- 1 (S)をコ一ドする cDNAのスクリーニングに使用した合成 DNAを示す。 〔配列番号： 1 4〕
ヒト SLC-1 (L)をコ一ドする cMAのスクリーニングに使用した合成 DNAを示す。 〔配列番号： 1 5〕
ヒト SLC- 1 (L)をコードする cDNAのスクリーニングに使用した合成 DNAを示す。 〔配列番号： 1 6〕
5'側に Sal I認識配列が付加され、 また 3'側に Spe I認識配列が付加されたヒト SLC-1 (S) cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
5'側に Sal I認識配列が付加され、 また 3'側に Spe I認識配列が付加されたヒト SLC-1 (L) cDNAの全塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
ヒト SLC- S) 発現 CH0細胞およびヒト SLC- 1 (L) 発現 CH0細胞の各クローンにお ける SIX- lmRNAの発現量を測定するために使用したリボプローブ （riboprobe) を示す。
〔配列番号： 1 9〕
Des-Asp1 -MCH (MCH (2- 19) )のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 20〕
Des-[Asp', Phe2] - MCH (MCH (3 - 19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
Des-[Asp', Phe2, Asp3] -MCH (MCH(4- 19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
Des-[Asp', Phe2, Asp3, Met4] -MCH (MCH(5-19))のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
Des-[Asp', Phe2, Asp3, Met4, Leu5] -MCH (MCH(6- 19))のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 24〕
Des-[Asp', Phe2, Asp3, Met4, Leu5, Arg6] -MCH (MCH (7 - 19))のアミノ酸配列を示 す。
実施例 8で得られた配列番号： 1 1で表される塩基配列をコードする DNAを含 むプラスミドによる形質転換体 Escherichia coli DH10B/phSLClL8は、 1 99 9年 2月 1日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6632として、 1 999年 1月 2 1日から財団 法人 ·発酵研究所 （ I F〇） に寄託番号 I F〇 1 6254として寄託されて いる。 実施例 _ Λ
o U
以下に実施例および参考例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。 参考例 1 ラット脳抽出物に含まれ、 CHO/ SLC- 1細胞の cAMP合成を特異的に抑 制する活性の検出
ラット脳抽出物の高速液体クロマトグラフィー （HPLC) フラクションを以下 に述べる方法で調製した。 チャールズリバ一 （株） より購入した、 1 0 0匹の ウィスターラット （雄、 8週令） 力、ら脳を取り出し、 直ぐに沸騰した蒸留水 0. 81 に投じて 10分間煮沸した。 煮沸後、 直ちに氷冷し、 48 mlの酢酸を加えて終濃度 1. 0 Mとし、 ポリトロン （20, 000 卬 m、 6分間） を用いて破碎した。 破砕液を遠 心 (8, 000 卬 m、 30分） して上清を取り、 沈殿には 1. 0 M酢酸 0. 8 1を加えて再度 ポリトロンによって破砕し、 遠心 （8， 000 rpm、 30分） して上清を取った。 沈殿 には 1. 0 M酢酸 0. 8 1を加えて再度ポリトロンによって破砕しー晚攪拌した後、 遠心 （8, 000 rpm, 30分） して上清を得た。 上清に 2倍量の冷アセトンを 4°Cで ゆっくり滴下した後、 1回目の遠心によって得た上清については一晩攪拌し、 2回目の遠心によって得た上清については 4時間攪拌した。 アセトンを加えた 抽出液は遠心 （8， 000 rpm、 30分） して沈殿を除き、 得られた上清からエバポレ 一ターによって減圧下にアセトンを溜去した。 アセトンを除いた抽出液に等量 のジェチルエーテルを加え、 分液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離 して水層を回収した。 エーテル脱脂した抽出液はエバポレーターによって減圧 化に濃縮してエーテルを完全に除去した。 濃縮液をガラス繊維濾紙 （アドバン テック、 DP70 (90 龍 ）） で濾過し、 濾液をガラス製カラム （20Ι Ι Φ χ 240 mm ) に充填した C18 (ヮイエムシ一、 YMCgel ODS-AM 120-S50) カラムに添加した 。 カラムを 1. 0 M酢酸 300 mlで洗浄後、 0. 1 %トリフルォロ酢酸を含む 60 %ァセ トニトリル 300 mlで溶出した。 溶出液を減圧化に濃縮して溶媒を溜去した後、 濃縮液を凍結乾燥した。凍結乾燥品約 0. 24 gを 5m 1 の DMS0に溶解し、次に 1. 0 M 酢酸 45m 1を加えてラット脳抽出標品とした。 ラット脳抽出標品を L 0 M酢酸で 平衡化した SP- Sephadex C- 25カラム （アマシャムフアルマシアバイオテク、 ゲ ル体積： 100ml) に添加し、 1.0 M酢酸 50mlで洗浄した後、 2.0Mピリジン 100ml溶 出画分と 2. GMピリジン ·齚酸 100ml溶出画分を順次得た。 1.0Mピリジン ·酢酸溶 出液を減圧化に濃縮して溶媒を溜去した後、 濃縮液を凍結乾燥した。 凍結乾燥 品約 lOOmgを 10 mlの 0.1%トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリルに溶解し 、 C18カラム （I ^一リー、 TSKgel ODS- 80TS (21.5 χ 300腿）） を用いた 10%か ら 60%の 0.1%トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリルの濃度勾配溶出法によ る HPLCにかけた。 各分画を減圧化に濃縮 ·乾固し、 残渣を 0.2 mlのジメチルス ルフォキシド （DMS0) で溶解した。
実施例 4で作製した CH0/SLC- 1細胞および mock CH0細胞を 24穴プレートに 5 x 104 cell/wellで播種し、 48時間培養した。 細胞を 0.2mM 3—イソブチルーメチ ルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（ρΗ7.4)で洗 浄した （以下、 0.2mM 3—イソブチル—メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20 HEPESを含むハンクスバッファー（PH7.4)を、 反応用バッファ一と呼ぶ） 。 その 後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温した。 反応用バッフ ァーを除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 HP LCフ ラクションと 2 フォルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加 え、 3 7 °Cで 24分間反応させた。 100 /1の 20%過塩素酸を加えて反応を停止さ せ、 次に氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMPを抽出した。 抽出液中の cAMP 量は、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアバイオテク） を用いて測定し た。 その結果、 分画番号 33, 34, 35に CH0/SLC- 1細胞特異的な cAMP合成抑制活性が 検出された （図 1) 。 図 1中、 cAMP合成抑制活性は、 フオルスコリンを含む反 応用バッファーを添加したときの細胞内 cAMP量から反応用バッファ一を添加し たときの細胞内 cAMP量を減じた量を 100%として、 HPLCフラクション （各フラク シヨンを DMSOで 1 00倍希釈した溶液を 1 l添加した） を加えたときの細 胞内 cAMP量から反応用バッファーを添加したときの細胞内 cAMP量を減じた量を %として表わした。 参考例 2 ラット脳抽出物中のラット SLC- 1発現 CH0細胞に対して特異的に cAMP 合成抑制活性示す活性物質のプロナーゼによる失活
参考例 1で CH0/SLC-1細胞に対する cAMP合成抑制活性を示した HPLC分画 34を 蛋白分解酵素であるプロナーゼ （S i gma, pro tease Type XIV (P5147) ) で処理 し、 活性物質が蛋白性であるかを調べた。
上記ラット脳抽出物 HPLC分画 （# 34) 2 1を 0. 2 M酢酸アンモニゥム 100 1 に加え、 これにプロナ一ゼ 3 / gを添加して 37°Cで 2時間インキュベートした後 、 沸騰水中で 10分間加熱してプロナーゼを失活させた。 これに BSA 0. 05mgおよ び CHAPS 0. 05 mgを含む蒸留水 2 mlを加えてから凍結乾燥した。 プロナ一ゼその ものあるいは加熱および凍結乾燥の影響を調べるため、 プロナーゼのみ、 HPLC 分画のみおよびプロナ一ゼのみを加熱処理した後に HPL C分画を加えたものにつ いても同様に処理して凍結乾燥した。 凍結乾燥した各試料を 2 Mフオルスコリ ンを含む反応用バッファー溶解し、 参考例 1に示す方法によつて CH0/SLC- 1細胞 に添加して cAMP合成抑制活性を測定した。 結果を図 2に示した。 ラット脳抽出 物中の CH0/SLC- 1細胞に対する cAMP合成抑制活性を示す活性物質はプロナーゼ によって完全に失活したことからこの物質が蛋白もしくはべプチドであること が示された。 参考例 3 ラット脳からのラット SLC- 1/CH0細胞に対して特異的に cAMP合成抑 制活性を示す活性物質の精製
CH0/SLC-1細胞に対して特異的に cAMP合成抑制活性を示す活性物質をラット 脳から精製した代表例を以下に具体的に述べる。
参考例 1で活性を認めた分画 33を以下のように精製した。 活性分画を減圧下 66
に濃縮して溶媒を除いた後、 凍結乾燥した。 これを 10%ァセトニトリルを含む 10 mMギ酸アンモニゥム（ρΗ 5.25)5mlに溶解し、 陽イオン交換カラム （トーソー 、 TSKgel CM-2SW (4.6 ππηφ χ 150 mm)) に添加した後、 10%ァセトニトリルを 含む 10 niMから 500 mMのギ酸アンモニゥム（pH 5.25)の濃度勾配によって活性物 質を溶出した。 活性はギ酸アンモニゥム 320 mM付近に回収された。 活性分画 2ml に 0.1%トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリル 2.5mlを加え、 ジフエニル カラム （セパレ一シヨングループ、 Vydac 219- TP54) に添加した後、 0.1%トリ フルォロ酢酸を含む 27.5%から 42.5%のァセトニトリルの濃度勾配によって溶 出した。 活性はァセ卜二トリル 31.3%付近に出現した。 活性分画 0.96mlに 0.1% トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリル 4.4mlを加え、 0DSカラム （野村化 学、 Develosil ODS- UG- 3) に添加した後、 0.1 %トリフルォロ酢酸を含む 27.5% から 42.5%のァセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。 溶出液はピーク毎 に手動で分取した。 活性はァセトニトリル 36.8%付近 （フラクション No. 16) に単一ピークとして出現した。 （図 3) 。 参考例 4 ラット脳から精製されたラット SLC-1発現 CH0細胞に対して特異的に cAMP合成抑制活性を示す活性物質のラット MCHとしての同定
参考例 3で精製されたラット SLC- 1発現 CH0細胞に対して特異的に cAMP合成抑 制活性を示す活性物質の構造解析を行なった。 本活性物質は参考例 2に示すよ うに蛋白またはペプチドであることが推定されていたので、 活性ピークを含む 溶出液を用いてベックマン社 LF3400 Protein Sequencerによるァミノ末端アミ ノ酸配列分析を行なった。 分析の結果、 配列番号： 1に示す配列が得られた。 7 残基目 と 16残基目には配列分析の反応中に Cys残基から生成した dehydroalanineの PTH誘導体が検出され、 Cysであると決定された。 この配列は ラットメラニン凝集ホルモン（melanin- concentrating hormone, MCH)の N末端か ら 16残基までのアミノ酸配列に一致した。 そこで本活性物質を JE0L HX110によ T JP99/07336
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る質量分析計によって測定したところラット MCHの分子量とほぼ一致する m/z 2387. 3にシグナルが観察されたことから、 活性物質の推定アミノ酸配列として ラット MCHの配列 （配列番号： 2 ) が決定された。 なお、 参考例 3で得られた活 性分画 34および 35についても生成を行なって活性物質を得たが、 いずれの活性 もラット MCHであることが確認された。 さらに、 ぺニンスラ社から購入したラッ ト MCHはラット SLC- 1発現細胞に対し、 実施例 5に述べる方法で行なった cAMP産 生抑制活性のアツセィにおいて用量依存的に抑制活性を示し、 本活性物質がラ ット MCHであることが確認された。 実施例 1 ラット脳由来 cDNAを用いた PCR法によるラット SLC- 1 受容体 cDNAの 増幅
ラット脳由来 po l y (A) +RNA (クローンテック社） を铸型とし、 ランダムブラ イマ一を用いて逆転写反応を行なった。 逆転写反応は、 夕カラ RNA PCR ver. 2 キットの試薬を使用した。 次にこの逆転写生成物を铸型として用い、 配列番号 ： 3および 4の合成 DNAプライマ一を用いて PCR法による増幅を行なった。 合成 DNAプライマーは受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構 築したが、 その際に遺伝子の 5'側に制限酵素 Sa l Iの認識する塩基配列が付加さ れ、 また 3'側に制限酵素 Spe Iの認識する塩基配列が付加されるように、 5'側お よび 3'側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。 反応液の組成は、 cDNA 铸型 5 K 合成 DNAプライマ一各 0. 4 M、 0. 25 mM dNTPs、 p f u (ストラタジ一 ン社） DNAポリメラ一ゼ 0. 5 / lおよび酵素に付属のバッファーで、 総反応量は 50 とした。 増幅のためのサイクルはサ一マルサイクラ一 （パ一キンエルマ 一社） を用い、 94°C · 60秒の加熱の後、 94°C · 60秒、 60°C · 30秒、 72°C · 1 50秒 のサイクルを 35回繰り返し、最後に 72°Cで 1 0分間反応させた。 増幅産物の確認は 、 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動の後、 ェチジゥムブロマイド染色によって行な つ†こ。 実施例 2 PCR産物のプラスミ ドベクタ一へのサブクローニングおよび挿入 cDNA部分の塩基配列の解読による増幅 cDNA配列の確認
実施例 1で行なった PCR後の反応産物は 0.8 %の低融点ァガロースゲルを用 いて分離し、 バンドの部分を力ミソリで切り出した後、 細片化、 フエノール抽 出、 フエノール ·クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行なって DNAを回収した 。 PCR-Script™ Amp SKC)クローニングキット （ストラタジーン社） の処方に従 レ 、 回収した DNAをプラスミドベクター pCR- Script Amp SKOへサブクローニン グした。 これをェシエリヒア コリ (Escherichia coli) XL- 1 Blue (ストラタ ジーン） に導入して形質転換した後、 cDNA挿入断片を持つクローンをアンピシ リンおよび X- ga 1を含む LB寒天培地中で選択し、 白色を呈するクローンのみを滅 菌したつま楊枝を用いて分離し、 形質転換体 E. coli XL- 1 Blue/ラッ卜 SIX- 1を 得た。 個々のクロ一ンをアンピシリンを含む LB培地でー晚培養し、 QIA prep8 mini prep (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを調製した。 調製した DNAの一 部を用いて制限酵素 Sal Iおよび Spe Iによる切断を行ない、 挿入されている受 容体 cDNA断片の大きさを確認した。 塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パ一キンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光 式自動シーケンサーを用いて解読した。 得られた 3クローンの配列を解析し全て の配列が報告されているラット SLC-1タンパク質 （配列番号： 5) をコードする cDNA配列 (Lakaye, B. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1401, pp. 216-220 (1998), accession No. AF08650) の 5'側に Sal I認識配列が付加し、 3'側に Spe I 認識配列が付加した遺伝子配列と一致することを確認した （配列番号： 6) 。 実施例 3 ラッ卜 SLC- 1発現 CH0細胞の作製
実施例 2で配列が確認されたラット脳由来の SLC-1の全長アミノ酸配列をコ ードし、 5'側に Sal I認識配列が付加し、 また 3'側に Spe I認識配列を付加した遺 伝子が導入されたプラスミドによって形質転換された coliのクローンより Plasmid Midi Kit (キアゲン社） を用いてプラスミドを調製し、 制限酵素 Sal I および Spe Iで切断してインサート部分を切り出した。 インサート DNAは電気泳 動後、 ァガロースゲルから力ミソリで切り出し、 次に細片化、 フエノール抽出 、 フエノール ·クロロホルム抽出、 エタノール沈殿を行なって回収した。 この インサート DNAを Sal Iおよび Spe Iで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミ ド pAKKO— 111H (Hinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)記載の pAKKOl.11Hと同一のベクタープラスミド） に加え、 T4ラ ィゲース （宝酒造） を用いてライゲ一シヨンを行ない、 蛋白発現用プラスミド pAKKO- SIX- 1を構築した。
pAKKO- SLC-1で形質転換した E. coli DH5 (ト一ョーポ一） を培養後、 Plasmid Midi Kit (キアゲン社） を用いて pAKKO- SIX- 1のプラスミド DNAを調製した。 こ れを CellPhect Transfection Kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社） を 用い添付のプロトコルに従って CHOdMr—細胞に導入した。 10 gの DNAをリン酸 カルシウムとの共沈懸濁液とし、 24時間前に 5 X 105または 1 X 10s個の CHO dhfr 細胞を播種した 10 cmシャーレに添加した。 10%ゥシ胎児血清を含む ΜΕΜα培地 で 1日間培養した後、 継代し、 選択培地である 10%透析ゥシ胎児血清を含む核酸 不含 MEM α培地で培養した。選択培地中で増殖してくる SIX- 1発現 CH0細胞である 形質転換細胞のコロニー 56クローンを選択した。 実施例 4 全長ラット SIX- 1レセプ夕一蛋白質 mRNAの発現量の高い CH0/ SLC-1細 胞株の選択
実施例 3で樹立された CH0/ SLC-1株 56クローンの全長ラット SLC- 1レセプ夕一 蛋白質 mRNAの発現量を Cytostar T Plate (アマシャムフアルマシアバイオテク 社） を用い、 添付のプロトコルに従って以下のように測定した。 CH0/ SLC- 1株 の各クローンを Cytostar T Plateの各 wel 1に 2· 5 χ 104個ずつ播種して 24時間培 養した後、 10%ホルマリンによって細胞を固定した。 各 wellに 0.25% Triton X - 100を添加して細胞の透過性をあげた後、 35Sラベルした配列番号： 7の riboprobeを加えてハイブリダィズさせた。 20 mg/nilの RNaseAを各 wel 1に加えて 遊離の riboprobeを消化し、 プレートをよく洗浄した後、 ハイブリダィズした riboprobeの放射活性を Topcounterで測定した。放射活性の高い株が mRNA発現量 が高い。 mRNA発現量の高い 3クローン （#3, 6および 44) を以下の実験に用いたが 、 特にクロ一ン番号 44を主に用いた （図 4) 。 実施例 5 MCHによるラッ卜 SLC- 1発現 CH0細胞に対する cAMP合成抑制活性 合成 MCH (ぺニンスラ社） を種々の濃度に希釈し、 ラット SLC- 1発現 CH0細胞に 対する cAMP合成抑制活性を以下に示す方法で測定した。 実施例 4で選択した CH0/SLC- 1細胞を 24穴プレートに 5 x 104 eel 1/wel 1で播種し、 48時間培養した。 細胞を 0.2mM 3—イソブチルーメチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを 含むハンクスバッファ一（PH7.4)で洗浄した （以下、 0.2mM 3—イソプチル— メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4) を、 反応用バッファーと呼ぶ） 。 その後 0.5mlの反応用バッファ一を加えて 30 分間培養器で保温した。 反応用バッファ一を除き、 新たに 0.25mlの反応用バッ ファーを細胞に加えた後、 種々の量の MCHと 2 Mフォルスコリンを含む 0.25mlの 反応用バッファ一を細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させた。 100 xlの 20%過塩素 酸を加えて反応を停止させ、 次に氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMPを抽 出した。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアバイ ォテク） を用いて測定した。その結果、 MCHは 0. InMの濃度で明らかに細胞内 cAMP 量を低下させ、 さらにペプチド濃度を増やすと容量依存的に細胞内 cAMP量は減 少した （図 5) 。 図中、 cAMP合成抑制活性は、 フオルスコリンを含む反応用バ ッファーを添加したときの細胞内 c AMP量から反応用バッファーを添加したとき の細胞内 cAMP量を減じた量を 100%として、 MCHを加えたときの細胞内 cAMP量か ら反応用バッファーを添加したときの細胞内 cAMP量を減じた量を％として表わ した。 実施例 6 MCHがラッ卜 SLC- 1発現 CH0細胞に対して惹起するァラキドン酸代謝 物放出活性
種々の濃度の合成 MCH (ぺニンスラ社） が示すラット SLC- 1発現 CH0細胞に対す るァラキドン酸代謝物放出活性を以下の方法により測定した。 実施例 4で選択 した CH0/SLC- 1細胞を 24穴プレートに 5 X 104 eel 1/wel 1で播種し、 24時間培養後 、 [¾]ァラキドン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加した。 [¾]ァラキドン酸添 加 16時間後、 細胞を 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（pH7.4) で洗浄し、 各 wellに 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一（pH7.4) に溶解した種々の濃度の合成ラット MCH500 〖を添加した。 以降、 0.05% BSA と 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（PH7.4)を反応バッファーと呼ぶ。 37°C で 60分間インキュベートした後に、 反応液 400 xlをシンチレ一夕一に加え、 反 応液中に遊離した [¾]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーシヨンカウンター により測定した。 合成ラット MCH3nM濃度で明らかなァラキドン酸代謝物放出が 起こり、 さらにべプチド濃度を増やすと容量依存的にァラキドン酸代謝物が培 地中に放出された （図 6) 。 図中、 ァラキドン酸代謝物放出活性は、 合成ラッ ト MCH非添加反応ノ ッファーによる培地中の [¾]ァラキドン酸代謝物の量を 10 0 %としたときの、 合成ラット MCH添加反応バッファーによる培地中の [¾]ァラ キドン酸代謝物の量の相対値で示した。 実施例 7 ヒト SIX- 1 cDNAを含むプラスミドの単離
ヒ卜胎児脳由来 cDNA library (SUPERSCRIPT™ cDNA Library ;GIBC0BRL社）を、 Genetrapper cDNA positive selection system (GIBCOBRL社）のマニュアルに従 つて 、 ファージ F1 エンドヌクレア一ゼを用いて、 DNAに nickを入れた後、 ェ シエリヒア コリ ェキソヌクレアーゼ IIIで消化することにより、 1本鎖ヒト 胎児脳由来 cDNA libraryを調製した。
Kolakowski Jr.ら (Kolakowski Jr. , et al (1996) FEBS Lett. Vol. 398, pp.
253-258) の報告に基づいて作製した配列番号： 8の合成オリゴヌクレオチド （ accession No. U71092の 1434- 1451に相当） の 3'末端に biot in- 14- dCTPを
Terminal Deoxynucleotidyl Transferaseを用いて付加し、 biotin化オリゴヌク レオチドを調製した。 反応液の組成、 反応時間はマニュアルに従った。
1本鎖ヒト胎児脳由来 cDNA library 4 gを 95°Cで 1分保温した後、 氷上で急冷 し、 biotin化オリゴヌクレオチド 20 ngを加え、 37°Cで 1時間、 添付ハイブリダ ィゼ一シヨンバッファーでハイブリダィズした。 ストレプトアビジンビーズを 加え、 MAGNA-SEP Magnetic Particle Separator (GIBCOBRL社）を用いて、 biotin 化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした 1本鎖ヒト胎児脳由来 cDNAを単離 し、 Kolakowski Jr. らの報告 (Kolakowski Jr. , et al (1996) FEBS Lett. Vol.
398, pp. 253-258) に基づいて作製した配列番号： 9の合成オリゴヌクレオチ ド （accession No. U71092の 101卜 1028に相当） 50ngをプライマ一にしてマニュ アルに従って相補鎖を合成し、 2本鎖プラスミドとした。 実施例 8 単離したヒト SLC- 1 cDNAを含むプラスミドの塩基配列の決定
実施例 7で得られたプラスミドを ELECTR0MAXTMDH10B™Cellsにエレクトロポレ ーシヨン法で導入して形質転換した後、 cDNA挿入断片を持つクローンをアンピ シリン及び X-galを含む LB寒天培地中で選択し、 白色を呈するクローンのみを滅 菌したつま楊枝でつついて分離し、 形質転換体 ^ coli. DHlOB/hSLC- 1を得た。 個々のクローンをアンピシリンを含む LB培地でー晚培養し、 Q I A prep8 m i n i prep (キアゲン社）を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応 は、 DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit ひ 一キンエルマ一社） を用い て行ない、 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読した。 その結果、 配列番号： 1 0に示す配列が得られた。 ここに得られた塩基配列がコードするアミノ酸配 列 (配列番号： 1 1) は、 Lakayeらの報告 (Lakaye, B. et al. (1998) Biochem. Biophys. Acta, vol. 1401, pp. 216-220) において、 ヒト SLC - 1の配列を含む ヒト染色体 DNA配列 (accession number:Z86090) をもとにしてラット SLC- 1から 類推された配列として推定されていたヒ卜 SLC- 1アミノ酸配列とは異なってお り、 推定配列のさらに 69及び 64アミノ酸上流に開始コドンである ATGが mRNA上で 存在することを示している。 この配列をコードする DNAを含むプラスミドによる 形質転換体 Escherichia coli DH10B/phSLClL8を I FOおよび N I BHに寄託し た。 実施例 9 MCHが誘起する、 ラット SLC- 1発現 CH0細胞膜画分への GTPァ S結合 活性の測定
MCHのラット SLC-1発現 CH0細胞膜画分に対する S]- Guanosine 5'- (τ - thio) triphosphateの結合促進活性を以下の方法により測定した。最初に膜画分 の調製法を記載する。 1 X 108個の CH0/SLC- 1細胞に 10mlのホモジネートバッファ ― (lOmM NaHC03, 5mM EDTA, 0.5mM PMSF, l. g/inl pepstatin, 4 g/ml E64, 20 fig/ml leupeptin)添加し、 ポリトロン （12, 000 rpm、 1分間） を用いて破碎し た。 細胞破砕液を遠心 （l， 000 g, 15分間） して上清を得た。 次にこの上清を超 遠心分離 （Beckman Type 30口一夕一、 30, 000 rpm, 1時間） し、 得られた沈殿 物をラット SLC- 1発現 CH0細胞膜画分とした。
GTPァ S結合活性の測定は以下の通りである。 ラット SLC- 1発現 CH0細胞膜 画分を膜希釈緩衝液 (50mM卜リス塩酸緩衝液 (pH 7.4), 5mM MgCl2, 150mM NaCl, M GDP) で希釈して、 タンパク質濃度 30 mg/mlのアツセィ用細胞膜画分溶液 をつくる。 アツセィ用膜画分溶液 に、 51.5nM濃度の [35S]- Guanos ine 5' -（ ァ-thio) triphosphate (NEN社） を 2 w 1と種々の濃度の MCH (ぺニンスラ社）を 2 1添加し、 この混合液を 2 5 °Cで一時間保温した。 混合液をフィルタ一濾過し、 さらにフィルタ一を洗浄用バッファー （50mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.4), 5mM MgCl2, ImM EDTA, 0.1¾ BSA) 1.5mlで 2回洗浄した後、 フィル夕一の放射活性を 液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。 MCHは、 用量依存的に、 膜画分に 結合する [ ]- Guanos ine 5，-（r-thio) triphosphate量を増大させた。 また、 約 0.5nM濃度の MCHは、 最大結合の 50 %の結合を誘起した。 実施例 10 ヒト胎児脳由来 cDNAを用いた PCR法によるヒ卜 SLC- lcDNAの増幅 ジーントラップ法によりクローニングされたヒト SLC- 1 D N A配列を含むプ ラスミドを铸型とし、 配列番号： 12および 1 3の合成 DNAプライマーと配列番 号： 14および 1 5の合成 DNAプライマーを用いて PCR法による増幅をそれぞれ 行なった。 前者の増幅 DNAをヒト SLC-l(S)と、 後者の増幅 DNAをヒト SLC - 1 (L)と命名した。合成 DNAプライマ一は受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が 増幅されるように構築したが、 その際に遺伝子の 5'側に制限酵素 Sal Iの認識す る塩基配列が付加され、 また 3'側に制限酵素 Spe Iの認識する塩基配列が付加さ れるように、 5'側および 3'側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。 ヒト SLC-1 (S)増幅の反応液の組成は、 ヒト SLC- 1DNA配列を含むプラスミド铸型 5 βΙ、 合成 DNAプライマ一各 0.4 Μ、 0.2 mM dNTPs, pfuDNAポリメラ一ゼ 0· 5 \ι 1 および酵素に付属のバッファ一で、 総反応量は 50 ^1とした。 増幅のためのサ イクルはサ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） を用い、 94°C · 60秒の加 熱の後、 94°C · 60秒、 57°C · 60秒、 72°C · 150秒のサイクルを 25回繰り返し、 最 後に 72°C*10分保温した。また、 ヒト SLC- ΐ )増幅の反応液の組成は、ヒト SIX- 1 DNA配列を含むプラスミド铸型 5 ιι\, 合成 DMプライマー各 0.4/iM、 0.2 mM dNTPs、 pfuDNAポリメラ一ゼ 0.5 /i 1および酵素に付属のバッファーで、 総反応 量は 50 tlとした。 増幅のためのサイクルはサ一マルサイクラ一 （パーキンェ ルマ一社） を用い、 94。C · 60秒の加熱の後、 94°C · 60秒、 60°C · 60秒、 72°C · 3分のサイクルを 25回繰り返し、 最後に 72°C · 10分保温した。 増幅産物の確認 は、 0.8%ァガロースゲル電気泳動の後、 ェチジゥムブロマイド染色によって行 なった。 実施例 1 1 PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび揷入 cDNA部分の塩基配列の解読による増幅 cDNA配列の確認
実施例 1 0で行なった PCR後の反応産物は 0.8 %の低融点ァガロースゲルを 用いて分離し、 バンドの部分を力ミソリで切り出した後、 細片化、 フエノール 抽出、 フエノール ·クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行なって DNAを回収し た。 PCR- Script™ Amp SK(+)クロ一ニングキット （ストラタジーン社） の処方に 従い、 回収した DNAをプラスミドベクター pCR- Script Amp SKOへサブクロー二 ングした。これをェシエリヒア コリ（Escherichia col i)DH5a competent cell (トーョ一ボー） に導入して形質転換した後、 cDNA挿入断片を持つクローンを アンピシリンおよび X- galを含む LB寒天培地中で選択し、 白色を呈するクローン のみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、 ヒト SLC- 1 (S)の形質転換体 E. coli DH5a/hSLC- 1(S)とヒト SLC- 1 ( の形質転換体 E. col i DH5ひ/ hSLC-1 (L)を得た 。 個々のクローンをアンピシリンを含む LB培地でー晚培養し、 QIA prep8 mini prep (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを調製した。 調製した DNAの一部を 用いて制限酵素 Sal Iおよび Spe Iによる切断を行ない、 揷入されている受容体 cDNA断片の大きさを確認した。 塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行ない、 蛍光 式自動シーケンサ一を用いて解読した。 得られたクローンの配列は、 ヒト SLC- 1 遺伝子を铸型として配列番号： 12および 1 3の合成 DNAプライマ一で増幅され るべき DNA配列 （配列番号： 16) およびヒト SLC-1遺伝子を铸型として配列 番号： 14および 1 5の合成 DNAプライマーで増幅されるべき DNA配列 （配列 番号： 1 7) にそれぞれ一致した。 実施例 1 2 ヒト SLC- 1 (S)発現 CHO細胞およびヒ卜 SLC-1 (L)発現 CH0細胞の作製 実施例 1 1で配列が確認されたヒト SLC-1 (S)と、 ヒト SIX- 1 (L)が導入された プラスミドによって形質転換された 11のクローンより Plasmid Midi Kit ( キアゲン社） を用いてプラスミドを調製し、 制限酵素 Sal Iおよび Spe Iで切断 してインサート部分を切り出した。 インサート DNAは電気泳動後、 ァガロースゲ ルから力ミソリで切り出し、 次に細片化、 フエノール抽出、 フエノール 'クロ 口ホルム抽出、 エタノール沈殿を行なって回収した。 このインサート DNAを Sal I および Spe Iで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミド pAKKO- lllHOlinuma, S. et al. Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1219, pp. 251-259 (1994)記載の pAKKOl. UHと同一のベクタ一プラスミド） に加え、 T4ライゲ一ス （宝酒造） を 用いてライゲ一ションを行ない、 蛋白発現用プラスミ ド pAKKO- hSLC- 1(S)と pAKKO-hSLC-1 (L)を構築した。
pAKKO-hSLC-1 (S)および pAKKO- hSLC- 1 (L)で形質転換した^ _ coH DH5 (トー ョーボー) を培養後、 PlasmidMidi Kit (キアゲン社) を用いて pAKKO- hSLC- 1 (S) と pAKKO- hSLC- 1 (L)のプラスミド DNAを調製した。これを Cel lPhect Transiect ion Kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社） を用い添付のプロトコルに従って CHOdhfr細胞に導入した。 10 xgの DNAをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし 、 24時間前に 5 X 105または 1 X 106個の CHO dhf Γ細胞を播種した 10 cmシャーレ に添加した。 10%ゥシ胎児血清を含む ΜΕΜα培地で 1日間培養した後、 継代し、 選択培地である 10%透析ゥシ胎児血清を含む核酸不含 ΜΕΜο;培地で培養した。 選 択培地中で増殖してくるヒト SLC- 1(S) 遺伝子導入 CH0細胞である形質転換細胞 のコロニー 56クローンおよび、 ヒト SLC- L) 遺伝子導入 CH0細胞である形質転 換細胞のコロニー 61クローンを選択した。 実施例 1 3 ヒト SLC- 1 (S)およびヒト SLC-1 (L) mRNAの発現量の高い遺伝子導入 細胞株の選択 実施例 1 2で樹立された CHO/hSLC-1 (S)株 56クローンおよび CHO/hSLC- 1 (L) 株 61クローンの mRNAの発現量を Cytostar T Plate (アマシャムフアルマシアバ ィォテク社） を用い、 添付のプロトコルに従って以下のように測定した。 CHO/hSLC- 1 (S)株および CHO/hSLC-1 (X) 株の各クローンを Cytos tar T Plateの各 wellに 2.5 x 104個ずつ播種して 24時間培養した後、 10%ホルマリンによって細 胞を固定した。 各 wellに 0.25% Triton X- 100を添加して細胞の透過性をあげた 後、 3 ラベルした配列番号： 1 8の riboprobeを加えてハイブリダィズさせた。 20 mg/mlの RNaseAを各 wellに加えて遊離の riboprobeを消化し、 プレートをよく 洗浄した後、 ハイブリダイズした r i boprobeの放射活性を Tope oun t erで測定した 。 放射活性の高い株が mRNA発現量が高い。 実施例 1 4 MCHによるヒト SLC- 1発現 CH0細胞に対する cAMP合成抑制活性 合成 MCH (ぺニンスラ社） を種々の濃度に希釈し、 ヒト SLC- 1発現 CH0細胞に対 する cAMP合成抑制活性を以下に示す方法で測定した。 実施例 1 3で選択したヒ ト SLC-1発現 CH0細胞である CH0/hSLC-l (S)株あるいは CHO/hSLC-1 (L)株を 24穴プ レートに 5 X 104 cell/wellで播種し、 48時間培養した。 細胞を 0.2mM 3—イソ ブチルーメチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファ — (PH7.4)で洗浄した （以下、 0.2mM 3—イソブチル—メチルキサンチンと 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4)を、 反応用バッファ —と呼ぶ） 。 その後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 3 0分間培養器で保温し た。 反応用バッファーを除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え た後、 種々の量の MCHと 2 Mフォルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファ一を 細胞に加え、 3 7°Cで 24分間反応させた。 100^1の 20%過塩素酸を加えて反応 を停止させ、 次に氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMPを抽出した。 抽出液 中の cAMP量は、 cAMP EIAキット （アマシャムフアルマシアバイオテク） を用い て測定した。 その結果、 MCHは用量依存的にヒト SLC- 1発現細胞の細胞内 cAMP 7 o
量を低下させた。 実施例 1 5 MCHがヒ卜 SLC-1発現 CH0細胞に対して惹起するァラキドン酸代 謝物放出活性
種々の濃度の合成 MCH (ぺニンスラ社） が示すヒト SLC-1発現 CH0細胞に対 するァラキドン酸代謝物放出活性を以下の方法により測定した。 実施例 1 3で 選択したヒ卜 SLC- 1発現 CH0細胞である CHO/hSLC-1 (S)株あるいは CHO/hSLC- 1 (L) 株を 24穴プレートに 5 X 104 cell/wellで播種し、 24時間培養後、 [¾]ァラキド ン酸を 0.25 Ci/wellとなるよう添加した。 [¾]ァラキドン酸添加 16時間後、細 胞を 0.05%BSAと 20mMHEPESを含むハンクスバッファ一（pH7.4)で洗浄し、 各 well に 0.05% BSAと 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4)に溶解した種々の 濃度の合成 MCH500 1を添加した。 37°Cで 60分間インキュベートした後に、 反応液 400 1をシンチレ一夕一に加え、 反応液中に遊離した [¾]ァラキドン酸 代謝物の量をシンチレ一シヨンカウンタ一により測定した。 その結果、 合成 M CHは容量依存的にヒ卜 SLC-1発現細胞に対してァラキドン酸代謝物放出活性 を示した。 実験例 16 ヒト SLC- 1発現 CH0細胞膜画分を用いた GTPrS結合活性の測定 ヒト SIX- 1発現 CH0細胞膜画分を以下の方法により調製した。 5 mM EDTA (ェチ レンジアミン四酢酸）を添加したリン酸緩衝生理食塩水 （PH 7.4) にヒト SLC - 1 発現 CH0細胞（lxlO8個）を浮遊させ、遠心した。細胞のペレツ卜にホモジネ一トバ ッファー（10 mM NaHC03 、 5 mM EDTA, H 7.5)を 10 ml加え、 ポリトロンホモジ ナイザーを用いてホモジネートした。 400Xgで 15分間遠心して得られた上清を さらに 100, OOOXgで 1時間遠心し、 膜画分の沈澱物を得た。 この沈澱物を 2 mlの アツセィバッファー [50 mM Tris-HCKpH 7.5)、 1 mM EDTA, 0.1% BSA (ゥシ血 清アルブミン）、 10 mM MgCl2、 100 mM NaCし ImM GDP (グアノシン 5' -二リン酸 飞 g
) 、 0.25 mM PMSF (フエ二ルメチルスルホニルフルオライド）、 1 /ml ぺプス 夕チン、 20 ^ /ml ロイぺプチン、 10 g/ml フォスフオラミドン]に懸濁し、 100， OOOXgで 1時間遠心した。 沈澱物として回収された膜画分を再び 20 nilのァ ッセィバッファ一に懸濁し、 分注後 - 80° Cで保存し、 使用の都度解凍して用い た。
GTP r S結合活性の測定は以下の通り実施した。 ポリプロピレン製の 96穴プレ 一卜に、 アツセィバッファ一で希釈したヒト SLC-1発現 CH0細胞膜画分 173 n 1を 分注した後、 種々の濃度の MCH(Bachem社製）を溶解した DMS0溶液 2 、 および [35S] -Guanos ine 5'-(r-thio) triphosphate (第一化学薬品 社製） 25 を同時 に添加 した （細胞膜終濃度 ： 20 g/ml 、 [35S] -Guanos ine 5'- ( r - thio) triphosphate終濃度： 0.33nM)。 この反応液を 25°Cで 1時間、 攪拌しなが ら反応させた後、 グラスフィル夕一（GF-C)を用いて吸引ろ過し、 さらに洗浄液 (50mM Tris- HC1緩衝液 pH7.5) 300 //1で 3回洗浄した。 グラスフィル夕一に液 体シンチレ一夕一を 50 l添加し、 残った放射活性を液体シンチレ一シヨン力 ゥン夕一で測定した。
MCHは、 用量依存的に、 ヒト SLC- 1発現 CH0細胞膜画分に結合する [35S]- Guanosine 5' (ァ- thio) triphosphate量を増大させた。 また、 MCHのヒト SLC-1 発現 CH0細胞膜画分に対する ED5。値は 0.2 nMであった。 実施例 1 7 手動エドマン分解による MCH(2- 19)、 MCH(3- 19)、 MCH(4- 19)、 MCH (5-19), MCH(6- 19)および MCH(7- 19) (配列番号： 1 9-24) の調製
MCH 0.1 mg (シグマ社） を 30 1の 50%ピリジンに溶解し、 1 1のフエ二ルイ ソチオシァネート （和光純薬） を加えて窒素置換した後、 45°Cに保温した。 10 分おきに攪拌して 1時間を経過したところで保温を止め、 窒素気流下で乾固した 。 20 1のエタノールに再度溶解し、 窒素気流下、 次いで減圧下で溶媒を溜去し て乾固した。反応生成物であるフエ二ルチオ力ルバモイル誘導体を 20 ^ 1のトリ „„
7 7
フルォロ酢酸 （和光純薬） によって溶解し、 窒素置換して 45°Cで 20分間保温す ることによりペプチドのァミノ末端アミノ酸をァニリノチアゾリノン誘導体と して切断した。 窒素気流でトリフルォロ酢酸を除いた後、 30 ^ 1の水および 100 1の酢酸 n-ブチルを加え、 酢酸 n-ブチルにより過剰な試薬およびァニリノチア ゾリノン誘導体を抽出して除去した。酢酸 n-ブチルによる抽出は 3回繰り返した 。 ァミノ末端が 1残基短縮された MCH(2- 19)を含む水相を窒素気流下、 次いで減 圧下で乾固した。
この分解過程を 1回のみ行なうことにより、 ァミノ末端の 1残基のみが欠失 した MCH (2-19)を得た。 同様な分解過程を 2回、 3回、 4回、 5回あるいは 6回繰り 返すことにより、 1残基ずつ N末端のァミノ基が短縮された MCH (3-19)、 MCH (4- 19) 、 MCH(5-19) , MCH (6-19)および MCH (7-19)を得た。
上記の分解反応によって得られた MCH(2- 19)、 MCH (3- 19) , MCH (4-19)、 MCH (5-19) , MCH (6- 19)および ~ CH (7- 19)を次のように精製した後、 質量分析およ びアミノ酸分析によって構造の確認を行なった。以下に MCH (4- 19)について詳細 に述べるが、 他の誘導体についてもほぼ同様の操作を行なった。 得られた MCH(2-19)、 MCH (3-19)、 MCH (4- 19)、 MCH (5-19) MCH (6 - 19)および MCH (7- 19)の 分析値を表 1に示した。
表 1 MCH (2-19)、 MCH (3-19)、 MCH (4-19)、 MCH (5-19)、 MCH (6-19)および "MCH (7-19) の質量分析値およびアミノ酸分析値 構造 質量 ( IH+) アミノ酸分析値 （残基数）
。へ
測定値 （理論値
) へへ o o
組成式
MCH(2- -19) D 1.90 (1), E 2.28 (1), P 1.32 (1), G 2.33
(1), V 1.76 (2), C n. d. (1), 0.46 (2), L 2.0 (2), Y 0.50 (1)， F 0.93 (1), R 1.98 (3)
MCH(3- -19) D 1.01 (1)， E 1.05 (1), P 1.25 (1), G 1.02
(1), V 1.9 (2), C 0.30 (1)， M 1.37 (2), L 2.0 (2), Y 0.20 (1), R 2.94 (3)
MCH(4- -19) E 1.04 (1), P 1.12 (1), G 1.02 (1), V 1.88
(2), C 0.34 (1), M 1.42 (2), L 2.0 (2), Y 0.23 (1), R 2.93 (3)
MCH(5- -19) E 1.51 (1), P 0.69 (1), G 2.16 (1), V 1.27
(2), C n. d. (1), M 0.38 (1), L 2.0 (2), Y 0.18 (1), R 1.80 (3)
MCH(6- -19) E 0.69 (1), P 0.79 (1), G 0.70 (1), V 1.21
(2), C 0.15 (1), M 0.50 (1), L 1.0 (1), Y 0.20 (1), R 1.84 (3)
MCH(7- -19) 1609.2 (1608.8) E 0.90 (1), P 0.62 (1), G 1.03 (1), V 1.05
(2), C 0.07 (1), M 0.33 (1), L 1.0 (1), Y 0.15 (1), R 1.04 (2) MCH (4- 19)を以下のように HPLCで精製した。 Spher i-5 RP-18逆相高速液体クロ マトグラフィ一用カラム （ブラウンリー社、 2. 1 mm X 30 mm) にあらかじめ A液 (0. 1%トリフルォロ酢酸） を流速 300 1/minで流し、 25°Cにて平衡化した。 反 応産物は 270 1の 0. 1%トリフルォロ酢酸に溶解し、 1回 50 1をカラムに打ち込 んだ後、 流速 300 ^ 1/ininを保ちながら、 30分間かけて Β液 （0. 1 トリフルォロ酢 酸 /70%ァセトニトリル） 濃度を 70%まで上昇させた。 溶出液を 210 nmの吸光度で モニタ一し、 ピークを手動で分取した。 MCH (4-19)は 17. 1分に溶出した。 1つの 試験管に集めた MCH (4-19)を濃縮乾固し、 100 ^ 1の DMS0に溶解した。
質量分析は日本電子 JMS-HX110で LSIMS法にて行なった。 即ち、 プロ一ブチッ プ上で 1 1の 3-ニトロべンジルアルコールとグリセロールが 3 : 2からなるマト リクスと、 1 1のサンプルとを混合し、 イオン源に導入した。 15 kVに加速され たセシウムイオンを照射し、 生成した正二次イオンを 10 kVに加速して検出器に 導いた。
アミノ酸分析のための加水分解は、 サンプル 5 ^ 1をガラス管にとって減圧乾 固し反応バイアルに入れ、 その底部に 6 N共沸塩酸 （ピアス社、 Sequenal Grade ) 200 1を入れ、 ウォーターズ社 Pi co- Tagワークステーションを用いてウォー 夕ーズ社の推奨する方法に従って脱気後、 110° (：、 24時間保温して行なった。 反応バイアル中の塩酸を真空ポンプにより減圧下除去した後、 150 ^ 1の 20 mM 塩酸で試料を希釈し、 分析バイアルに注入してアミノ酸分析装置にセットし、 100 1を分析に供した。 アミノ酸分析は日立 L - 8500高速アミノ酸分析計を用い て、 オルトフタルアルデヒド試薬 （和光純薬） を誘導体化反応に用いた蛍光分 析法にて分析した。 蛍光分析用緩衝液の調製法、 反応液の調製法、 分析条件は 、 L-8500アミノ酸分析計取り扱い説明書の記載に従った。 ロイシンを基準とし たときの測定値のモル比は表 1に示したとおりである。
なお、 MCHあるいは MCH (2- 19)、 MCH (3-19) , MCH (4-19)および H (5-19)は実施 例 24から実施例 28に記載した固相合成法によっても調製することができる。 実施例 1 8 MCH、 MCH(2- 19)、 MCH(3 - 19)、 MCH(4- 19)および MCH (5- 19)の非アイ ソトープポルトン一ハンター試薬による誘導体化
MCHおよび実施例 17で得られた MCH (2- 19)、 MCH(3-19)、 MCH(4 - 19)、 MCH (5-19) および MCH(6- 19)の非ァイソト一プボルトン—ハンター試薬による誘導体化を 行なった。 MCH (4- 19)の誘導体化を例にして以下に述べる。
ジメチルホルムアミド に溶解した MCH(4-19) 1 nmolに非アイソトープポ ルトン一ハン夕一試薬である 3- (4-ヒドロキシ -3-ョ一ドフエニル）プロピオン 酸 N-スクシンィミジル （和光純薬） 100 nmo lおよび N, N-ジイソプロピルェチル ァミン （和光純薬） 100 nmolを加えて 37°Cで 4時間反応させた。
反応混合物に 0. \%トリフルォロ酢酸を含む 10%ァセトニトリル 1を加え て HPLCにより精製した。 クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。 力 ラムは Wakos i卜 I I 5C18HG (4. 6 x 150 mm)で流速は毎分 1. 0 mlとした。 溶出は 0. 1%トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリル水を用い、 ァセトニトリル濃度を 2 分間 10%に保持した後、 5分間で 20%まで上昇させ、 その後 20分間に 50%まで上昇 させて行なった。 MCH (4- 19)の非ァイソト一プポルトン—ハンター試薬による誘 導体である [N- (3- (4-ヒドロキシ- 3-ョードフエ二ル）プロピオニル） -Met4] - MCH (4-19)は 22. 9分に溶出され、 手動によって分取した。 MCHある! は MCH(2- 19) 、 MCH (3-19) MCH (5-19)および MCH(6-19)についてもほぼ同様の操作によって N 末端アミノ酸のァミノ基に 3- (4 -ヒドロキシ- 3-ョ一ドフエニル）プロピオニル 基を導入して誘導体化し、 HPLCによって分取した。 これらの誘導体を実施例 17 に記載した方法と同様にして酸加水分解した後、 アミノ酸分析を行なった。 結 果を表 2に示した。 表 2 誘導体化 MCH(2-19)、 MCH(3- 19)、 MCH(4-19)、 MCH(5-19)および Ή(6- 19) のアミノ酸分析値
Figure imgf000083_0001
実施例 19 ラジオアイソトープ標識 MCH (4-19)の作製
実施例 17で調製した MCHの N末端ァミノ酸 3残基欠失体である MCH (4-19)を、 ボ ルトン一ハン夕一法でラジオァイソ 1 ^一プ標識した。 チューブの中でベンゼン に溶解している [1251] -ボルトン一ハンター試薬 （3- (4-ヒドロキシ- 3-ョ一ドフ ェニル）プロピオン酸 N-スクシンィミジル） 9.25 MBq (0.11 nmol) (NENライ フサイエンスプロダクツ社、 81.4 TBq/mmol) に乾燥窒素ガスを吹き付けて、 ベ ンゼンを溜去した。 このチューブに、 1の 50 mMリン酸緩衝液 （pH 7.5) と 1.5 1のジメチルスルフォキシドに溶解した 2.3 nmolの MCH (4 - 19)と 0.5/ilのジ メチルスルフォキシドを添加し、 よく混合した。 混合液を 37°Cで 2時間保温した 後、 ポルトン一ハンター試薬による MCH(4-19)の放射化誘導体である [1251]- [N - (3 - (4-ヒドロキシ- 3-ョ一ドフエニル）プロピオニル） -Met4] -MCH (4-19) (構造式 は上記 （4) に記載） を逆相 HPLCにより分取した。 (3- (4-ヒドロキシ - 3 -ョ一ドフエニル）プロピオニル) -Met4]- MCH (4- 19)は、 0DSカラム （トーソ一、 0DS-80TM (4.6 mm x 150 mm)) からァセトニトリル濃度 43.6付近に溶出した。 同様にして ['Ζ5Π-ポルトン—ハンター試薬を用いることによって N末端アミ ノ酸のアミノ基に [1251]-3-(4-ヒドロキシ- 3 -ョードフエニル）プロピオニル基 を導入して MCH、 MCH(2- 19)、 MCH(3- 19)、 MCH(5- 19)、 MCH(6- 19)および MCH(7- 19) のラジオアイソトープ誘導体 （上記 （1) 〜 （3) 、 （5) 〜 （7) ) を調製 することができる。 実施例 20 放射ョード標識 MCH、 MCH(2-19)、 MCH(3_19)、 MCH(4_19)、 MCH(5- 19)、 MCH(6- 19)および MCH(7- 19)の作製
アイソトープ標識 MCH、 MCH(2- 19)、 MCH(3-19)、 MCH(4- 19)、 MCH(5- 19)、 MCH (6-19)および MCH (7-19)は以下のようにアミノ酸配列中の Tyr13を放射ョード 化して作製することもできる。 MCH (4- 19)について例示するが、 同様の方法によ つて MCH、 MCH (2-19)、 MCH (3 - 19)、 MCH (5- 19)、 MCH (6- 19)および MCH (7-19)の放 射ョード化体を作製することができる。
MCH(4-19) 5 gを 25 1の 0.4 M酢酸ナトリウム （pH 5.6) に溶解し、 これに 200 ngのラクトパ一ォキシダ一ゼ （和光純薬製） を加えた後、 1 mCiの [|251] -ョ ゥ化ナトリウム （アマシャムフアルマシアバイオテク社） および 200 ngの過酸 化水素 （10 xl) を加える。 室温で 10分間静置した後、 さらに 200 ngの過酸化水 素 （10 1) を加えて 10分間静置する。 これを TSKgel ODS-80TSカラム （4.6 mm x 25 cm, ト一ソ一） を用いた HPLCによって精製し、 標識 MCH(4- 19)を得る
実施例 2 1 MCH、 MCH (2- 19)、 MCH (3- 19)、 MCH (4- 19)、 MCH (5-19)、 MCH (6-19) および ¾1(¾(7-19)の6了？ァ3バィンディングアツセィを用いたァゴニス卜活性の 測定
ラット SLC-1発現 CH0細胞膜画分は以下の方法により調製した。 5 mM EDTA (ェ „„
83
ミン四酢酸） を添加したリン酸緩衝生理食塩水 （pH 7.4) にラット SLC- 1発現 CH0細胞 （1x10s個） を浮遊させ、 遠心した。 細胞のペレットにホモジ ネートバッファ一 （10 mM NaHC03 、 5 mM EDTA、 pH 7.5) を 10 ml加え、 ポリト ロンホモジナイザーを用いてホモジネートした。 400 X gで 15分間遠心して得ら れた上清をさらに 100， OOOXgで 1時間遠心し、 膜画分の沈澱物を得た。 この沈澱 物を 2 mlのアツセィバッファ一 （50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 1 mM EDTA、 0.1% BSA (ゥシ血清アルブミン） 、 10 mM MgCl2、 100 mM NaCK 1 M GDP (グアノシ ン 5'-二リン酸） 、 0.25 mMPMSF (フエ二ルメチルスルホニルフルオライド） 、 1 fig/ml ぺプス夕チン、 20 /g/ml ロイぺプチン、 10 g/ml フォスフオラミドン ) に懸濁し、 100， OOOXgで 1時間遠心した。 沈澱物として回収された膜画分を再 び 20 mlのアツセィ バッファーに懸濁し、 分注後 -80°Cで保存し、 使用の都度 解凍して用いた。
MCH、 MCH (2-19)、 MCH (3-19)、 MCH (4-19)、 MCH (5-19)、 MCH (6-19)および" MCH (7-19) のァゴニスト活性の測定は以下の通り実施した。 ポリプロピレン製の 96穴プレ —卜に、 アツセィバッファ一で希釈したラット SLC-1発現 CH0細胞膜画分 173 1 を分注した後、 DMS0溶液で種々の濃度に希釈した MCH、 MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4- 19)、 MCH (5-19)、 MCH (6-19)および MCH (7 - 19)溶液を 2 i、 および [35S] - guanosine 5，-（ァ- thio) triphosphate (第一化学薬品社製) を を同時に添 加した (細胞膜終濃度：
Figure imgf000085_0001
1、 [35S] -guanos ine 5'-(r-thio) triphosphate 終濃度： 0.33 nM) 。 この反応液を 25°Cで 1時間、 攪拌しながら反応させた後、 グラスフィルター （GF- C) を用いて吸引ろ過し、 さらに洗浄液 （50mMTris-HCl 緩衝液 pH7.5) 300^1で 3回洗浄した。 グラスフィル夕一に液体シンチレ一夕一 を 50 1添加し、 残った放射活性を液体シンチレ一ションカウンタ一で測定した MCH(6- 19)およ D¾CH(7- 19)のァゴニスト活性が MCHと比較して、 それぞれ 10倍 および 200倍程度低下していたのに対し、 MCH(2-19)、 MCH (3- 19)、 MCH (4-19) ¾ よび MCH (5-19)は MCHとほぼ同等のァゴニスト活性を示した （図 7) 。 実施例 22 非ァイソト一プポルトン一ハンター試薬によって誘導体化された MCH、 MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4- 19)および MCH (5-19)の GTPァ Sバインディン グアツセィを用いたァゴニスト活性の測定
実施例 18で得られた非ァイソト一プボルトン一ハンター試薬によって誘導体 化された MCH、 MCH (2-19), MCH (3- 19), MCH (4- 19)および1 MCH (5- 19)のァゴニスト 活性を、 実施例 21と同様に GTPrSバインディングアツセィを用いて測定した。 誘導体化された MCH、 MCH (2-19), MCH (3-19), MCH (4- 19)および MCH (5- 19)は MCH と同様に用量依存的にヒト SLC-1発現 CH0細胞膜画分に結合する [ ]- guanosine 5' -（了- thio) triphosphate量を増大させ、非ァイソ 1 ^一プボルトン—ハンター試 薬によって誘導体化された各種 MCHがァゴニスト活性を有することを確認した (図 8) 。 図中、 BH-MCH, BH- MCH(2-19)、 BH- MCH (3-19)、 BH- MCH(4- 19)および BH-MCH(5-19)はそれぞれ非ァイソトープボルトン一ハンター試薬によって誘導 体化された MCH、 MCH (2-19) MCH (3-19), MCH(4- 19)および MCH(5-19)を示す。 実施例 23 ボルトン—ハンター試薬を用いて作製した 標識 MCH(4-19) を用いた受容体結合実験
実施例 19でボルトン一ハンター試薬を用いて作製した [1251]-標識 MCH (4- 19) (構造式は上記 （4) に記載） およびヒト SLC-1発現 CH0細胞から調製した細胞 膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
ヒト SLC-1発現 CH0細胞から実施例 16に従って調製した細胞膜画分を、 アツセ ィ用バッファ一 （25 mM Tris-HCl、 1 mM EDTA (エチレンジァミン四酢酸） 、 0.1
% BSA (ゥシ血清アルブミン） 、 0.25 mM PMSF (フエ二ルメチルスルホニルフ ルォライド） 、 l g/ml ぺプスタチン、 20 g/ml ロイぺプチン、 10 g/ml フ ォスフオラミドン、 pH 7.5) で各種濃度に希釈後、 96穴のプレートに 173 ^1ず 8 D
つ分注した。最大結合量（TB)を測定するために、 2 1の DMS0と、 ΙΟΟρΜの [1251] - 標識 MCH(4 - 19) を、 また、 非特異的結合 （NSB) を測定するために、 100 M MCHの DMS0溶液 2μ1と、 100 ρΜの [1251]-標識 MCH(4 - 19) 25^1を、 膜画分溶液 に添加した。 25 °Cで 60分間反応させた後、 ポリエチレンィミン処理したワット マングラスフィル夕一 （GF- C) を用いて反応液を吸引ろ過した。 ろ過後、 ァ -力 ゥン夕一を用いてろ紙上に残った [1251]-標識 MCH (4- 19)の放射活性を測定した。 図 9に示すように、 膜画分の濃度に依存した [1251]_標識 MCH(4- 19)の特異的な結 合 （SB) が認められた。
また、 膜画分濃度を 2.5^ g/m 1に設定して、 阻害率 （％) から MCHの 50%阻 害濃度 （IC5()値） を算出したところ、 IC5Q値は 0.2 nMであった （図 10) 。
ラット SLC- 1発現 CH0細胞から調製した膜画分と [|251] -標識 MCH (4-19)を用い て同様の結合実験を行なうことができる。 実施例 24 MCH (Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr- Arg-Pro-Cys- Trp- Gln_Val)の製造
巿販 Boc-Va卜 0CH2- PAM樹脂 (0.77画 1/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成 機 ABI 430Aの反応曹に入れ、 Boc- strategy (NMP- HOBt)ペプチド合成方法で Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys (MeBzl), Boc- Pro, Boc - Arg(Tos), Boc- Tyr(Br-Z), Boc-Va 1, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc - Leu, Boc- Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc- Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Phe, Boc- Asp(OcHex)を順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂 0.6 gを p -クレゾール 2 g、 1， 4 -ブタンジチオール 1.2 mlと共に無水弗化水素 10 ml中、 0 °C * 60分撹拌した後、 弗化水素を減圧留去し、 残留物へジェチルエーテルを加 え沈殿を濾過する。 この沈殿に 50%酢酸水を加え抽出し、 不溶部分を除き、 抽 出液を十分に濃縮後、 50%酢酸水で充填したセフアデックス （商品名） G- 25カラ ム （2.0 X 80 cm) に付し、 同溶媒で展開、 主要画分を集め LiChroprep (商品名 8 ο
) RP- 18を充填した逆相クロマトカラム （2.6 X 60 cm)に付け 0.1% TFA水 200 ml で洗浄、 0.1¾ TFA水 300 mlと 0.1¾ TFA含有 40%ァセトニトリル水 300 mlを用いた 線型勾配溶出を行ない、 主要画分を集め濃縮する。 此れを約 4 mlの酢酸に溶解 し、 蒸留水で 240 mlに希釈の後、 アンモニア水を用い pH 7.5に調整し、 緩やか に空気を吹込み攪拌する。 反応を HPLCで追跡し、 SH体ペプチドのピークがすべ て SS体に変化した事を確認後、 酢酸を加え溶液の PHを 3に調整し、 上記 LiChroprep (商品名） RP- 18カラムに吸着する。 カラムを 0.1% TFA水 200 ml で洗浄後、 0.1% TFA水 300 mlと 0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水 300 mlを用い た線型勾配溶出を行ない、 主要画分を集め、 凍結乾燥し目的とするペプチドを 得る。
質量分析による（M+H)+ 2387.3 (理論値 2387.9)
HPLC溶出時間： 20.9分
カラム条件
カラム： Wakosil-II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液： A液一 0.1% TFA含有 10%ァセトニトリル水、 B液一 0.1 FA含有 60%ァセト 二トリル水を用い、 A/B ： 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出 （20分） 流速： 1.0 ml/分 実施例 2 5 Des-Asp'-MCH (MCH(2-19), Phe- Asp- Met-Leu-Arg - Cys- Met- Leu - Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)の製造
巿販 Boc- Va卜 0CH2- PAM樹脂 (0.77 mmol/g resin) 0.5誦 ol分をペプチド合成 機 ABI 430Aの反応曹に入れ、 Boc- strategy (匪 P-HOBt)ペプチド合成方法で Boc - Gin, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys (MeBzl), Boc - Pro, Boc-Arg(Tos), Boc- Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc- Met, Boc - Cys (MeBzl), Boc- Arg(Tos), Boc-Leu, Boc - Met, Boc-Asp(OcHex), Boc - Pheを順 に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂を実施例 24と同様に脱保 護、 環化、 精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による（M+H)+ 2272.3 (理論値 2272.1)
HPLC溶出時間： 20.6分
カラム条件
カラム： Wakosi卜 II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液： A液一 0. \% TFA含有 10%ァセトニトリル水、 B液一 0. TFA含有 60 ァセト 二トリル水を用い、 A/B ： 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出 (20分) 流速： 1.0 ml/分 実施例 2 6 Des-[Asp', Phe2] -MCH (MCH(3-19), Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met- Leu-G 1 y-Arg-Va 1 -Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-G 1 n-Va 1 )の製造
巿販 Boc- Va卜 0CH2- PAM樹脂 （0.77匪 ol/g resin) 0.5匪 ol分をペプチド合成 機 ABI 430Aの反応曹に入れ、 Boc-strategy (NMP- HOB t)ペプチド合成方法で Boc- Gin, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys (MeBzl), Boc- Pro, Boc- Arg(Tos), Boc- Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc- Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc- Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc- Met, Boc- Asp (OcHex)を順に導入し 目的の保護ペプチド樹脂を得る。 この樹脂を実施例 24と同様に脱保護、 環化 、 精製を行い目的のペプチドを得る。
質量分析による（M+H)+ 2124.8 (理論値 2125.0)
HPLC溶出時間： 19.2分
カラム条件
カラム： Wakosi卜 II 5C18HG (4.6 x 150 mm)
溶離液： A液— 0.1% TFA含有 10%ァセトニ卜リル水、 B液— 0.1%TFA含有 60%ァセト 二トリル水を用い、 A/B ： 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出 (20分) 流速： 1.0 ml/分 o o
実施例 2 7 Des-[Asp', Phe2, Asp3] -MCH (MCH(4- 19), Met-Leu-Arg-Cys-Met- Leu-G 1 y-Arg-V 1 - Ty r-Arg- Pr o- Cy s- T卬- G 1 n-Va 1 )の製造
市販 Boc- Va卜 OCH厂 PAM樹脂 （0.77 画 ol/g resin) 0.5 mmol分をペプチド合成 機 ABI 430Aの反応曹に入れ、 Boc-strategy (NMP- HOBt)ペプチド合成方法で Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc- Arg(Tos), Boc- Tyr (Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc- Leu, Boc- Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Metを順に導入し目的の保護べプチ ド樹脂を得る。 この樹脂を実施例 24と同様に脱保護、 環化、 精製を行い目的 のペプチドを得る。
質量分析による（M+H)+ 2009.9 (理論値 2010.0)
HPLC溶出時間： Π.9分
カラム条件
カラム： Wakosi卜 II 5C18HG (4.6 150删）
溶離液： A液一 0.1% TFA含有 10%ァセトニトリル水、 B液一 0.1%TFA含有 60%ァセト 二トリル水を用い、 A/B ： 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出 （20分） 流速： 1.0 ml/分 実施例 2 8 Des-[Asp', Phe2, Asp3, Met4] -MCH (MCH (5-19), Leu-Arg-Cys- Me t -Leu-Gly-Arg-Va 1 -Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Va 1 -OH)の製造
巿販 Boc- Va卜 0CH2- MM樹脂 （0.77 mmol/g resin) 0.5 誦 ol分をペプチド合成 機 ABI 430Aの反応曹に入れ、 Boc- strategy (画 P- HOBt)ペプチド合成方法で Boc-Gln, Boc- T卬（CH0)， Boc-Cys (MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc- Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc- Cys (MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leuを順に導入し目的の保護ペプチド樹脂を得 る。 この樹脂を実施例 24と同様に脱保護、 環化、 精製を行い目的のペプチド を得る。 o 9
質量分析による（M+H) + 1878. 9 (理論値 1878. 9)
HPLC溶出時間： 17. 4分
カラム条件
カラム： Wakos i l-I I 5C18HG (4. 6 x 150 mm)
溶離液： A液— 0. 1% TFA含有 10%ァセトニトリル水、 B液— 0. 1%TFA含有 60 ァセト 二トリル水を用い、 A/B ： 20/80〜80/20へ直線型濃度勾配溶出 （20分） 流速： 1. 0 ml/分
(配列表フリーテキスト）
配列番号： 1
配列に関する他の情報：第 7番目および第 1 6番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 2
配列に関する他の情報：第 7番目および第 1 6番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 1 9
配列に関する他の情報：第 6番目および第 1 5番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 2 0
配列に関する他の情報：第 5番目および第 1 4番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 2 1
配列に関する他の情報：第 4番目および第 1 3番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 2 2
配列に関する他の情報：第 3番目および第 1 2番目の 2つの Cys残基は分子内ジ g 0
スルフィド結合を形成している。
配列番号： 23
配列に関する他の情報：第 2番目および第 1 1番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。
配列番号： 24
配列に関する他の情報：第 1番目および第 10番目の 2つの Cys残基は分子内ジ スルフィド結合を形成している。 産業上の利用可能性
本発明の MCHもしくはその誘導体またはその塩および SLC— 1またはそ の塩を用いることを特徴とする MCHもしくはその誘導体またはその塩と S L C- 1またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二 ング方法は、 食欲 （摂食） 増進剤の他、 微弱陣痛、 弛緩出血、 胎盤娩出前後、 子宮復古不全、 帝王切開術、 人工妊娠中絶、 乳汁うっ滞などの予防 ·治療薬な どとして用いることができる SLC— 1ァゴニスト、 抗肥満剤（薬）、 食欲 （摂 食） 調節剤などの他、 過強陣痛、 強直性子宮収縮、 胎児仮死、 子宮破裂、 頸菅 裂傷、 早産、 Prader- Willi症候群などの予防 '治療薬などとして用いることが できる S LC— 1アン夕ゴニストのスクリーニング方法として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. メラニン凝集ホルモン（MCH) もしくはその誘導体またはその塩および S LC一 1またはその塩を用いることを特徴とする MCHまたはその塩と S L C 一 1またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ方法。
2. MCHもしくはその誘導体またはその塩および SLC— 1またはその塩を 含有することを特徴とする MCHまたはその塩と S LC— 1またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3. 請求項 1記載のスクリ一エング方法または請求項 2記載のスクリーニング 用キットを用いて得られうる、 MCHまたはその塩と S L C— 1またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩。
4. 請求項 3記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
5. 抗肥満薬である請求項 4記載の医薬。
6. 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその 塩。
7. 請求項 6記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する DNAを含有す る DNA。
8. MCHが配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するべプチドである請求項 1記載のスクリ一二ング方 法または請求項 2記載のスクリーニング用キット。
9. 誘導体が配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N末端から第 5番目ない し第 1 9番目の配列を含有するべプチドである請求項 1記載のスクリ一二ング 方法または請求項 2記載のスクリーニング用キット。
10. 誘導体がポルトンハンター試薬により誘導された MCHまたはボルトン ハンター試薬により誘導された配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N末端 力 第 5番目ないし第 19番目の配列を含有するペプチドである請求項 1記載 のスクリーニング方法または請求項 2記載のスクリーニング用キット。
1 1. ボルトンハンター試薬により誘導された MCHもしくはボルトンハン夕 一試薬により誘導された配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N末端から第 5番目ないし第 19番目の配列を含有するぺプチドまたはその塩。
12. 式
Figure imgf000094_0001
で表される化合物またはその塩。
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