KR20020086491A - 스크리닝 방법 - Google Patents

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KR20020086491A
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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염 및 TGR-1 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과 TGR-1 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법은, 고혈압증, 스트레스성 질환 등의 예방ㆍ치료약 등을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. TGR-1 길항제는 고혈압증, 스트레스성 질환 등의 예방ㆍ치료약으로 유용하다.

Description

스크리닝 방법 {SCREENING METHOD}
대부분의 호르몬이나 신경전달물질은 세포막에 존재하는 특이적인 수용체를 통하여 생체의 기능을 조절하고 있다. 이들 수용체의 대부분은 공액하고 있는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 (이하, G 단백질로 약칭하는 경우가 있음) 의 활성화를 통하여 세포내의 신호 전달을 행하고, 또 7 개의 막관통 영역을 갖는 공통된 구조를 갖고 있기 때문에 G 단백질 공액형 수용체 또는 7 회 막관통형 수용체로 총칭된다.
이와 같은 호르몬이나 신경전달물질과 G 단백질 공액형 수용체와의 상호작용을 통하여 생체 항상성의 유지, 생식, 개체의 발달, 대사, 성장, 신경계, 순환기계, 면역계, 소화기계, 대사계의 조절, 감각수용 등의 생체에 있어서 중요한 기능조절이 행해지고 있다. 이와 같이 생체기능의 조절에는 다양한 호르몬이나 신경전달물질에 대한 수용체 단백질이 존재하여 그 기능조절에 중요한 역할을 다하고 있음을 알 수 있지만, 아직 알려지지 않은 작용물질 (호르몬이나 신경전달물질 등) 및 이에 대한 수용체가 존재하는지의 여부에 대해서는 아직 불명확한 경우가 많다.
최근, G 단백질 공액형 수용체 단백질이 그 구조의 일부에 아미노산 서열의 유사성을 나타내는 것을 이용하여, 중합 연쇄 반응 (이하, PCR 로 약칭함) 법에 의해 신규 수용체 단백질을 코딩하는 DNA 를 탐색하는 방법이 행해지게 되어, 수많은 리간드가 불명확한 소위 오펀 G 단백질 공액형 수용체 단백질이 클로닝되고 있다 (Libert, F., 등 Science, 제 244 권, 569-572 페이지, 1989 년, Welch, S.K., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 제 209 권, 606-613 페이지, 1995 년, Marchese, A., 등, Genomics, 제 23 권, 609-618 페이지, 1994 년, Marchese, A., Genomics, 제 29 권, 335-344 페이지, 1995 년). 또, 게놈 DNA 또는 cDNA 의 랜덤한 서열결정에 의해서도 신규 G 단백질 공액형 수용체 단백질이 계속해서 발견되고 있다 (Nomura, N., 등, DNA Research 제 1 권, 27-35 페이지, 1994 년). 이들 오펀 G 단백질 공액형 수용체 단백질의 리간드를 결정하는 일반적인 수단으로는, G 단백질 공액형 수용체 단백질의 일차구조상의 유사성에서 추정할 수밖에 없었다. 그러나, 대부분의 오펀 G 단백질 공액형 수용체 단백질은 이미 알려진 수용체와의 상동성이 낮은 것이 많아, 실제는 이미 알려진 리간드의 수용체 서브타입인 경우를 제외하고는 일차구조상의 유사성만으로 그 리간드를 추정하기가 곤란하였다. 한편, 유전자 해석에서 많은 오펀 G 단백질 공액형 수용체가 발견되고 있기 때문에 대응되는 아직 알려지지 않은 리간드가 계속 다수 존재하고 있음이 추정되고 있지만, 지금까지 실제로 오펀 G 단백질 공액형 수용체의 리간드를 동정한 예는 수가 적다.
한편, 뉴로메딘 U 는 래트의 자궁 평활근 수축활성을 지표로 하여 돼지의 척수에서 단리ㆍ정제된 펩티드로, 8 개 아미노산 잔기로 이루어지는 뉴로메딘 U-8 및 25 개 아미노산 잔기로 이루어지는 뉴로메딘 U-25 의 2 종이 최초로 보고되어 있다 (Minamino, N. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 제 130 권, 1078-1085 페이지, 1985 년). 뉴로메딘 U-8 의 서열은 뉴로메딘 U-25 의 C 말단 부분과 일치하고, 그 상류에는프로세싱에 의해 절단되는 부위에 자주 나타나는 염기성 아미노산 페어가 존재하고 있기 때문에, 양자는 공통된 전구체에서 유래하는 것으로 여겨진다. 평활근 수축작용 외에도 뉴로메딘 U 의 생리작용은 널리 알려져 있고, 예컨대 혈압상승 (Minamino, N. 등), 내장의 혈류량 저하 (Sumi, S. 등, Life Sci. 제 41 권, 1585-1590 페이지, 1987 년), 장관에서의 이온수송 조절 (Brown, D.R. 및 Quito, F.L., Eur. J. Pharmacol. 155, 159-162 페이지, 1988 년), 피하투여 후의 ACTH 및 이에 이어지는 코르티코스테론의 상승 (Malendowicz, L.K. 등, In Vivo, 제 7 권, 419-422 페이지, 1993 년) 등이 보고되어 있다.
발명의 개시
현재까지 뉴로메딘 U 의 수용체로서 FM-3 가 보고되어 있지만 (WO 00/02918), FM-3 이외의 수용체의 존재를 탐색하여 뉴로메딘 U 의 생리적 역할을 더욱 다면적으로 밝히고, 그 구조를 활성화 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하여 새로운 의약을 개발할 필요가 있었다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 신규 오펀 G 단백질 공액형 수용체인 TGR-1 을 발견하고, 이 TGR-1 발현 CHO 세포에 대해 뉴로메딘 U 가 예상외로 특이적인 세포자극활성을 가짐을 발견하였다. 이들 관찰에 기초하여 더욱 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은
(1) 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(2) 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트,
(3) 상기 (1) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (2) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어질 수 있는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산서열을 포함하는 단백질 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,
(4) 상기 (3) 에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하여 이루어지는 의약,
(5) 비만증, 고혈압증 또는 스트레스성 질환의 예방ㆍ치료약인 상기 (4) 에 기재된 의약,
(6) 뉴로메딘 U 가 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 상기 (1) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (2) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(7) 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염,
(8) 상기 (7) 에 기재된 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA,
(9) 서열번호: 2 또는 서열번호: 22 로 표시되는 염기 서열을 갖는 상기 (8) 에 기재된 DNA,
(10) 상기 (8) 에 기재된 DNA 를 포함하는 재조합 벡터,
(11) 상기 (10) 에 기재된 재조합 벡터로 형질전환시킨 형질전환체,
(12) 상기 (11) 에 기재된 형질전환체를 배양하고, 상기 (7) 에 기재된 단백질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 상기 (7) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 제조법 및,
(13) 상기 (7) 에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 항체 등을 제공하는 것이다.
본 발명에서의 뉴로메딘 U 에 관해서는 구체적으로 상기 서술한 뉴로메딘 U 또는 그 염 등을 들 수 있을 뿐만 아니라,
(14) 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 또는 서열번호: 15 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 (폴리펩티드) 인 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 뉴로메딘 U 는 그 C 말단 아미노산 잔기의 카르복실기가 아미드체인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 TGR-1 이란, 상기 서술한 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염인 것을 의미하지만,
(15) 서열번호: 17 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염, 또는
(16) 서열번호: 1, 서열번호: 17 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 개 이상 30 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열번호: 1, 서열번호: 17 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열에 1 개 이상 30 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 부가된 (또는 삽입된) 아미노산 서열, 또는 서열번호: 1, 서열번호: 17 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 아미노산 서열 중 1 개 이상 30 개 이하, 바람직하게는 1 개 이상 10 개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염 등도 TGR-1 의 구체예로 들 수 있다. 또, 보다 구체적으로는 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 4 번째 (Met) ∼ 415 번째 (Thr) 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 서열번호: 17 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 4 번째 (Met) ∼ 415 번째 (Thr) 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등도 TGR-1 의 구체예로 들 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 실시예 2 에서 행해진 사이트센서에 의한 TGR-1 수용체 특이적인 세포자극활성의 검출 결과를 나타내는 도면을 표시한다. 사이트센서 분석에서 TGR-1 수용체 발현 CHO 세포 (○) 및 mock CHO 세포 (●) 에 대해 도면에 표시한 농도의 돼지형 뉴로메딘 U-8 을 7 분 2 초간 작용시켜, 그 동안의 산성화 속도의 최대값을 플롯하고 있다.
도 2 는 실시예 1 에서 얻어진 인간형 TGR-1 과 실시예 3 에서 얻어진 래트형 TGR-1 과의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 그 염 (이하, 간단하게 TGR-1 로 약칭하는 경우가 있음) 및 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염 (이하, 간단하게 뉴로메딘 U 로 약칭하는 경우가 있음) 의 제조법을 이하에 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 및 뉴로메딘 U 는 인간, 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 돼지, 양, 소, 원숭이, 개, 닭 등), 양서류 (예컨대, 개구리 등) 및 어류 등 모든 조직 (예컨대, 하수체, 췌장, 뇌, 신장, 간강, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관, 혈관, 심장 등) 또는 세포 등에 유래하는 단백질 ((폴리)펩티드) 로서, TGR-1 로는 서열번호: 1 또는 서열번호: 21, 뉴로메딘 U 로는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 ((폴리)펩티드) 이면 어떤 것이어도 된다.
예컨대, TGR-1 로는 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등 외에 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
이 「실질적으로 동일」이란, 예컨대 리간드 (뉴로메딘 U) 와 수용체 (TGR-1) 의 결합활성, 생리적인 특성 등이 실질적으로 동일함을 의미한다. 아미노산의 치환, 결실, 부가 또는 삽입은 종종 폴리펩티드의 생리적인 특성이나 화학적인 특성에 큰 변화를 초래하지 않지만, 이러한 경우 그 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 실시된 단백질 ((폴리)펩티드) (소위 뉴로메딘 U 개변체, TGR-1 개변체 등) 은 그러한 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 실시되지 않은 것과 실질적으로 동일하게 된다. 이 아미노산 서열 중의 아미노산의 실질적으로 동일한 치환물로는, 예컨대 그 아미노산이 속하는 곳의 클래스 중 다른 아미노산류에서 선택할 수 있다. 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성 (중성) 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있다.양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있다. 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
따라서, 수용체 결합활성의 강도 등의 강약, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.
보다 구체적으로, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 예컨대 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
특히, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, 예컨대 부분 아미노산 서열로서 Leu-Phe-Val, Trp-Ser-Glu, Val-Phe-Phe 또는 Ser-Met-His 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 등이 바람직하다.
본 발명의 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질로는, 예컨대 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질 등이 바람직하다.
특히, 본 발명의 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질로는, 부분 아미노산 서열로서 Leu-Phe-Val, Trp-Ser-Glu, Val-Phe-Phe 또는 Ser-Met-His 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질이 바람직하다.
실질적으로 동질의 활성으로는, 예컨대 리간드결합활성, 신호정보전달작용 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이란, 이들의 활성이 성질적으로 동질인 것을 나타낸다. 따라서, 리간드결합활성이나 신호정보전달작용 등의 활성이 동등 (예, 약 0.01 ∼ 100 배, 바람직하게는 약 0.5 ∼ 20 배, 보다 바람직하게는 약 0.5 ∼ 2 배) 한 것이 바람직하지만, 이들 활성의 정도나 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.
리간드결합활성이나 신호정보전달작용 등의 활성의 측정은 자체 공지된 방법에 준하여 행할 수 있지만, 예컨대 후술하는 스크리닝 방법 등에 따라 측정할 수 있다.
또, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, ① 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 ④ 이들을 조합한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등도 사용된다.
특히, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는, ① 부분 아미노산 서열로서 Leu-Phe-Val, Trp-Ser-Glu, Val-Phe-Phe 또는 Ser-Met-His 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 부분 아미노산 서열로서 Leu-Phe-Val, Trp-Ser-Glu, Val-Phe-Phe 또는 Ser-Met-His 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 부분 아미노산 서열로서 Leu-Phe-Val, Trp-Ser-Glu, Val-Phe-Phe 또는 Ser-Met-His 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더욱 바람직하게는 수개 (1 ∼ 5 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 ④ 이들을 조합한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등이 바람직하게 사용된다.
또, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 4 번째 (Met) ∼ 415 번째 (Thr) 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 서열번호: 17 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 4 번째 (Met) ∼ 415 번째 (Thr) 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등도 TGR-1 의 구체예로 들 수 있다.
한편, 본 발명의 뉴로메딘 U 로는, 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (폴리)펩티드 등 외에, 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (폴리)펩티드와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 (폴리)펩티드 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질의 활성으로는, 예컨대 수용체결합활성 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이란, 수용체결합활성 등이 성질적으로 동질임을 나타낸다. 따라서, 수용체결합활성의 강도 등의 강약, (폴리)펩티드의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.
본 명세서에서의 TGR-1 및 뉴로메딘 U 은 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노 말단), 우단이 C 말단 (카르복실 말단) 이다. 예컨대, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 또는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열 등을 포함하는 단백질 또는 (폴리)펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO-) 이지만, C 말단이 아미드 (-CONH2) 또는 에스테르 (-COOR) 여도 된다. 에스테르의 R 로는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C1-6의 알킬기, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C3-8시클로알킬기, 페닐, α-나프틸 등의 C6-12아릴기, 벤질, 페네틸, 벤즈히드릴 등의 페닐-C1-2알킬, 또는α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C1-2알킬 등의 C7-14아르알킬기 외, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 뉴로메딘 U 로는 C 말단의 카르복실기 (-COOH) 가 아미드 (-CONH2) 인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 및 뉴로메딘 U 의 염으로는, 생리학적으로 허용되는 염기 (예컨대 알칼리금속 등) 나 산 (유기산, 무기산) 과의 염이 사용되는데, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레인산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 및 뉴로메딘 U 는 공지된 방법 (예, FEBS Letters 398 (1996) 253-258, WO 96/18651 호 공보에 기재된 방법) 에 준한 방법, 즉 인간이나 온혈동물의 조직 또는 세포에서 폴리펩티드를 정제하는 방법에 따라 제조할 수도 있고, 후술하는 단백질 (펩티드) 합성법에 준하여 제조할 수도 있다. 또, 후술하는 단백질 (펩티드) 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 형질전환체를 배양함으로써 제조할 수도 있다.
인간, 온혈동물, 양서류, 어류 등의 조직 또는 세포에서 제조하는 경우, 인간, 온혈동물, 양서류, 어류 등의 조직 또는 세포를 호모게니즈한 후, 산, 유기용매 등으로 추출하고 이 추출액을 염석, 투석, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제 단리할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 TGR-1 및 뉴로메딘 U 는 자체 공지된 단백질 ((폴리)펩티드) 의 합성법에 따라, 또는 TGR-1 및/또는 뉴로메딘 U 를 포함하는 단백질 ((폴리)펩티드) 을 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 단백질 ((폴리)펩티드) 의 합성법으로는, 예컨대 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 것이어도 된다. 즉, TGR-1 및/또는 뉴로메딘 U 를 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여부분을 축합시켜, 생성물이 보호기를 갖는 경우는 보호기를 탈리시킴으로써 목적으로 하는 단백질 ((폴리)펩티드) 을 제조할 수 있다. 공지된 축합방법이나 보호기의 탈리로는, 예컨대 이하의 ① ∼ ⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.
① M. Bodanszky 및 M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966 년);
② Schroeder 및 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965 년);
③ 이즈미야 노부오 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠 (주) (1975 년);
④ 야지마 하루아키 및 사카기 쥰페이, 생화학 실험강좌 1, 단백질 화학 Ⅳ, 205, (1977 년);
⑤ 야지마 하루아키 감수, 속 의약품 개발 제 14 권, 펩티드 합성 히로가와서점.
또, 반응 후는 통상적인 정제법, 예컨대 용매추출ㆍ증류ㆍ컬럼 크로마토그래피ㆍ액체 크로마토그래피ㆍ재결정 등을 조합하여 단백질 ((폴리)펩티드) 을 정제 단리할 수 있다. 상기 방법에서 얻어지는 단백질 ((폴리)펩티드) 이 유리체인 경우, 공지된 방법에 따라 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우는 공지된 방법에 따라 유리체로 변환할 수 있다.
TGR-1 및 뉴로메딘 U 의 아미드체는 아미드 형성에 적합한 시판되고 있는 펩티드 합성용 수지를 사용할 수 있다. 그와 같은 수지로는, 예컨대 클로로메틸 수지, 히드록시메틸 수지, 벤즈히드릴 아민 수지, 아미노메틸 수지, 4-벤질옥시벤질 알콜 수지, 4-메틸벤즈히드릴 아민 수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미드메틸 수지, 폴리아크릴아미드 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시 수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc 아미노에틸)페녹시 수지 등을 들 수 있다. 이와 같은 수지를 사용하여 α-아미노기와 측쇄 관능기를 적당하게 보호한 아미노산을, 목적으로 하는 펩티드의 서열과 같이 자체 공지된 각종 축합방법에 따라 수지상에서 축합시킨다. 반응 마지막에 수지로부터 단백질 ((폴리)펩티드) 을 절단함과 동시에 각종 보호기를 제거하고, 필요에 따라 고희석 용액 중에서 분자내 디술피드결합 형성반응을 실시하여 목적으로 하는 단백질 ((폴리)펩티드) 을 취득한다.
상기 보호된 아미노산의 축합에 관해서는 단백질 ((폴리)펩티드) 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있지만, 특히 카르보디이미드류가 바람직하다. 카르보디이미드류로는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 등을 들 수 있다. 이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제 첨가제 (예컨대, HOBT, HOOBT) 와 함께 보호된 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나 또는 대칭 산 무수물 또는 HOBT 에스테르 또는 HOOBT 에스테르로서 미리 보호된 아미노산의 활성화를 행한 후에 수지에 첨가할 수 있다. 보호된 아미노산의 활성화나 수지와의 축합에 사용되는 용매는, 단백질 ((폴리)펩티드) 축합반응에 사용할 수 있음이 알려져 있는 용매에서 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산 아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등의 알코올류, 디메틸 술폭시드 등의 술폭시드류, 피리딘 등의 3 급 아민류, 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 또는 이들의 적절한 혼합물 등이 사용된다. 반응온도는 펩티드결합 형성반응에 사용될 수 있음이 알려져 있는 범위에서 적절하게 선택되고, 통상 약 -20℃ ∼ 50℃ 의 범위에서 적절하게 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 ∼ 4 배 과잉으로 사용된다. 닌히드린 반응을 사용한 테스트의 결과, 축합이 불충분한 경우에는 보호기의 탈리를 행하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 행할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 축합을 얻을 수 없을 때에는 무수 아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화시킴으로써 이후의 반응에 영향을 미치지 않도록 할 수 있다.
원료인 아미노산의 아미노기의 보호기로는, 예컨대 Z, Boc, tert-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등을 들 수 있다. 카르복실기의 보호기로는, 예컨대 R 로서 상기한 C1-6알킬기, C3-8시클로알킬기, C7-14아르알킬기 외, 2-아다만틸, 4-니트로벤질, 4-메톡시벤질, 4-클로로벤질, 페나실기 및 벤질옥시카르보닐히드라지드, tert-부톡시카르보닐히드라지드, 트리틸히드라지드 등을 들 수 있다.
세린 및 트레오닌의 수산기는, 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호할 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로는 예컨대 아세틸기 등의 저급알카노일기, 벤조일기 등의 아로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄산에서 유도되는 기 등을 들 수 있다. 또, 에테르화에 적합한 기로는, 예컨대 벤질기, 테트라히드로피라닐기, tert-부틸기 등이다.
티로신의 페놀성 수산기의 보호기로는, 예컨대 Bzl, Cl2-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, tert-부틸 등을 들 수 있다.
히스티딘의 이미다졸의 보호기로는, Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등을 들 수 있다.
원료인 카르복실기가 활성화된 것으로는, 예컨대 대응되는 산 무수물, 아지드, 활성 에스테르 [알콜 (예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸 알콜, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시프탈이미드, HOBT) 과의 에스테르] 등을 들 수 있다. 원료인 아미노기가 활성화된 것으로는, 예컨대 대응되는 인산 아미드 등을 들 수 있다.
보호기의 제거 (탈리) 방법으로는, 예컨대 Pd 블랙 또는 Pd 탄소 등의 촉매 존재하의 수소기류 중에서의 접촉환원이나, 또 무수 불소화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플로오로아세트산 또 이들의 혼합액 등에 의한 산 처리나, 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기 처리, 또는 액체 암모니아 중 나트륨에 의한 환원 등도 들 수 있다. 상기 산처리에 의한 탈리 반응은 일반적으로 -20℃ ∼ 40℃ 의 온도에서 행해지지만, 산처리에서는 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올과 같은 양이온 포착제의 첨가가 유효하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀처리에 의해 제거되고, 트립토판의 인돌 보호기로 사용되는 포르밀기는 상기 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등의 존재하의 산처리에 의한 탈보호 이외에 묽은 수산화나트륨, 묽은 암모니아 등에 의한 알칼리 처리에 의해서도 제거된다.
원료의 반응에 관여하지 않는 관능기의 보호와 보호기, 및 이 보호기의 탈리, 반응에 관여하는 관능기의 활성화 등은 공지된 기 또는 공지된 수단에서 적절하게 선택할 수 있다.
TGR-1 및 뉴로메딘 U 의 아미드체를 얻는 다른 방법으로는, 우선 카르복실 말단 아미노산의 α-카르복실기를 아미드화한 후, 아미노기측에 펩티드쇄를 원하는 쇄길이로 신장시킨 후, 이 펩티드쇄 N 말단의 α-아미노기의 보호기만을 제거한 펩티드와 C 말단의 카르복실기의 보호기만을 제거한 펩티드 (또는 아미노산) 를 제조하여 이 두 펩티드를 상기한 바와 같은 혼합용매 중에서 축합시킨다. 축합반응의 상세에 대해서는 상기와 동일하다. 축합에 의해 얻어진 보호 펩티드를 정제한 후, 상기 방법에 의해 모든 보호기를 제거하고 원하는 조단백질 ((폴리)펩티드) 을 얻을 수 있다. 이 조단백질 ((폴리)펩티드) 은 이미 알려진 각종 정제수단을 구사하여 정제하고 주요 분획을 동결 건조시킴으로써 원하는 단백질 ((폴리)펩티드) 의 아미드체를 얻을 수 있다.
TGR-1 및 뉴로메딘 U 의 에스테르체를 얻기 위해서는 카르복실 말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알콜류와 축합하여 아미노산 에스테르로 한 후, 단백질 ((폴리)펩티드) 의 아미드체와 동일하게 하여 원하는 단백질 ((폴리)펩티드) 의 에스테르체를 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 뉴로메딘 U 의 유도체로는, ① 뉴로메딘 U 의 부분 펩티드, ② 뉴로메딘 U 의 구성 아미노산이 결실된 펩티드, 구성 아미노산에 다른 아미노산이 부가된 펩티드, 구성 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 펩티드, 또는 ③ 뉴로메딘 U, 상기 ① 에 기재된 부분 펩티드 또는 상기 ② 에 기재된 펩티드가 표지화된 것 등, TGR-1 과의 결합능을 갖는 것이면 어느 것이어도 된다.
뉴로메딘 U 의 부분 펩티드로서 구체적으로는, 서열번호: 16 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염 등을 들 수 있다. 그 중에서도 서열번호: 16 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 C 말단 카르복실기가 아미드화된 것 또는 그 염이 바람직하다.
이 뉴로메딘 U 의 부분 펩티드는 상기 서술한 뉴로메딘 U 를 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있고, 상기 단백질 ((폴리)펩티드) 의 합성법에 따라 제조할 수 있다. 뉴로메딘 U 의 부분 펩티드의 아미드 또는 에스테르도 상기 서술한 아미드체 또는 에스테르체의 제조방법에 준하여 제조할 수 있다. 또한 뉴로메딘 U 의 부분 펩티드의 염으로는 상기 TGR-1 및 뉴로메딘 U 의 염과 동일한 것 등을 들 수 있다.
또, 뉴로메딘 U 의 구성 아미노산이 결실된 펩티드, 구성 아미노산에 다른 아미노산이 부가된 펩티드, 구성 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 펩티드로는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 개 이상 3 개 이하, 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열에 1 개 이상 3 개 이하, 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 아미노산이 부가된 (또는 삽입된) 아미노산 서열, 또는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 개 이상 3 개 이하, 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
또한, 구성 아미노산이 결실된 펩티드, 구성 아미노산에 다른 아미노산이 부가된 펩티드, 구성 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 펩티드로는, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 또는 서열번호: 15 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 개 이상 3 개 이하, 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9,서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 또는 서열번호: 15 로 표시되는 아미노산 서열에 1 개 이상 3 개 이하, 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 아미노산이 부가된 (또는 삽입된) 아미노산 서열, 또는 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 또는 서열번호: 15 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 개 이상 3 개 이하, 바람직하게는 1 개 또는 2 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 등도 들 수 있다.
이 아미노산 서열 중의 아미노산의 실질적으로 동일한 치환물로는, 예컨대 그 아미노산이 속하는 곳의 클래스 중 다른 아미노산류에서 선택할 수 있다. 비극성 (소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성 (중성) 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 히스티딘 등을 들 수 있다. 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
뉴로메딘 U, 상기 ① 에 기재된 부분 펩티드 또는 상기 ② 에 기재된 펩티드가 표지화된 것으로는, 자체 공지된 방법으로 동위원소 표지된 것, 형광표지된 것 (예컨대, 플루오레세인 등에 의한 형광표지), 비오틴화된 것, 효소표지된 것 등을 들 수 있다.
구체적으로는 예컨대 공지된 방법에 의해 [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지된 뉴로메딘 U 등을 이용할 수 있다.
뉴로메딘 U 의 유도체의 염으로는 상기 TGR-1 및 뉴로메딘 U 의 염과 동일한 것 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 로는, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA, 본 발명에서 사용되는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 로는, 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 이면 어떤 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 조직ㆍ세포 유래의 cDNA, 상기한 조직ㆍ세포 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다. 라이브러리에 사용하는 벡터는 박테리오파아지, 플라스미드, 코스미드, 파아지미드 등 어느 것이어도 된다. 또, 상기한 조직ㆍ세포에서 RNA 분획을 제조한 것을 사용하여 직접 역전사효소 중합 연쇄 반응 (이하, RT-PCR 법으로 약칭함) 에 의해 증폭시킬 수도 있다.
서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 로는, 예컨대 서열번호: 2 로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있고, 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 로는, 예컨대 서열번호: 22 로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있고, 서열번호: 17 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 로는, 예컨대 서열번호: 18 로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있다.
또한, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 4 번째 (Met) ∼ 415 번째 (Thr) 의 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 로는, 예컨대 서열번호: 2 로 표시되는 염기 서열의 5'말단에서 10 번째 (A) ∼ 1245 번째 (C) 의 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있고, 서열번호: 17 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 4 번째 (Met) ∼ 415 번째 (Thr) 의 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 로는, 예컨대 서열번호: 18 로 표시되는 염기 서열의 5'말단에서 10 번째 (A) ∼ 1245 번째 (C) 의 염기 서열을 포함하는 DNA 등을 들 수 있다.
특히, 서열번호: 1 로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 를 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 로는, 예컨대 부분 염기 서열로서 -CTGTTTGTC- (서열번호: 2 중의 제 808 번째 (C) ∼ 제 816 번째 (C) 로 표시되는 부분 염기 서열), -TGGAGTGAA- (서열번호: 2 중의 제 888 번째 (T) ∼ 제 896 번째 (A) 로 표시되는 부분 염기 서열), -GTCTTCTTC- (서열번호: 2 중의 제 940 번째 (G) ∼ 제 948 번째 (C) 로 표시되는 부분 염기 서열) 또는 -TCCATGCAC- (서열번호: 2 중의 제 1159 번째 (T) ∼ 제 1167 번째 (C) 로 표시되는 부분 염기 서열) 로 표시되는 염기 서열을 포함하고, 서열번호: 2 로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA 등이 바람직하게 사용된다.
보다 구체적으로는, (1) 스트린젠트한 조건하에서 서열번호: 1, 서열번호: 21 또는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 (폴리)펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA 와 혼성화되는 DNA, (2) 유전코드의 축중으로 인해 서열번호: 1, 서열번호: 21 또는 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 (폴리)펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA, 및 (1) 에 정해져 있는 서열과 혼성화되지 않지만 동일 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 (폴리)펩티드를 코딩하는 DNA 등이 사용된다. 혼성화는 자체 공지된 방법 또는 이에 준한 방법에 따라 행할 수 있다. 상기 스트린젠트한 조건으로는, 예컨대 42℃, 50% 포름아미드, 4×SSPE(1 ×SSPE=150mM NaCl, 10mM NaH2PO4ㆍH2O, 1mM EDTA pH7.4), 5 ×덴하르트용액, 0.1% SDS 이다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 는 이하의 유전자 공학적 수법에 의해서도 제조할 수 있다.
본 발명의 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 완전하게 코딩하는 DNA 의 클로닝 수단으로는, 본 발명의 폴리펩티드의 부분 염기 서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여 자체 공지된 PCR 법에 의해 상기 DNA 라이브러리 등에서 목적으로 하는 DNA 를 증폭하거나, 또는 적당한 벡터에 삽입한 DNA 를 예컨대 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 염기 서열의 일부 또는 전체 영역을 갖는 DNA 단편 또는 합성 DNA 를 사용하여 표지한 것과 혼성화에 의해 선별할 수 있다. 혼성화의 방법은, 예컨대 Molecular Cloning (2nd ed.; J. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 등에 기재된 방법에 따라 행해진다. 또, 시판되고 있는 라이브러리를 사용할 경우는, 첨부한 사용설명서에 기재된 방법에 따라 행한다.
DNA 의 염기 서열의 변환은, 공지된 키트, 예컨대 MutanTM-super Express Km (다까라슈조 (주)), MutanTM-K (다까라슈조 (주)) 등을 사용하여, ODA-LA PCR 법이나 Gapped duplex 법이나 Kunkel 법 등의 자체 공지된 방법 또는 이들에 준하는 방법에 따라 행할 수 있다.
클론화된 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 는 목적에 따라 그대로, 또는 원하는 바에 따라 제한효소로 소화시키거나 링커를 부가시켜 사용할 수 있다. 이 DNA 는 그 5' 말단측에 번역 개시 코돈으로서의 ATG 를 갖고, 또 3' 말단측에 번역 종지 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 갖고 있어도 된다. 이들 번역 개시 코돈이나 번역 종지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 부가할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 의 발현 벡터는 예컨대 (가) 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 절단하고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.
벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예,pSH19, pSH15), λ파아지 등의 박테리오파아지, 레트로 바이러스, 백시니어 바이러스, 배큘로 바이러스 등의 동물 바이러스 등이 사용된다. 사용되는 프로모터로는, 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떤 것이어도 된다.
형질전환할 때의 숙주가 동물세포인 경우에는, SV40 유래의 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트쇼크 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SPα프로모터 등을 이용할 수 있다. 숙주가 에쉐리키아속균인 경우는, Trp 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL프로모터, lpp 프로모터 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우는, SPOl 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우는, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH1 프로모터, GAL 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우는 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.
발현 벡터에는 이상 외에 원하는 바에 따라 엔헨서, 스플라이싱 시그널, 폴리A 부가시그널, 선택마커, SV40 복제오리진 (이하, SV40ori 로 약칭하는 경우가 있음) 등을 포함하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택마커로는, 예컨대 디히드로엽산환원효소 (이하, dhfr 로 약칭하는 경우가 있음) 유전자 [메소트렉세이트 (MTX) 내성], 앰피실린 내성 유전자 (이하, Ampr로 약칭하는 경우가 있음), 네오마이신 내성 유전자 (이하, Neo 로 약칭하는 경우가 있음, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, CHO (dhfr-) 세포를 사용하여 DHFR 유전자를 선택마커로서 사용하는경우, 티미딘을 포함하지 않는 배지에 의해서도 선택할 수 있다.
또, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널 서열을 폴리펩티드 또는 그 부분 펩티드의 N 말단측에 부가시킨다. 숙주가 에쉐리키아속균인 경우는 phoAㆍ시그널 서열, OmpAㆍ시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우는 α-아밀라아제ㆍ시그널 서열, 서브틸리신ㆍ시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우는 MFαㆍ시그널 서열, 인베르타아제ㆍ시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 예컨대 인슐린ㆍ시그널 서열, α-인터페론ㆍ시그널 서열, 항체 분자ㆍ시그널 서열 등을 각각 이용할 수 있다.
이렇게 해서 구축된 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 를 포함한 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조할 수 있다.
숙주로서는 예컨대 공지된 에쉐리키아속균, 바실러스속균, 효모, 곤충 또는 곤충세포, 동물세포 등이 사용된다.
에쉐리키아속균으로는, 대장균 (Escherichia coli) K12ㆍDH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 60 권, 160 페이지 (1968 년)], JM103 [Nucleic Acids Research, 제 9 권, 309 페이지 (1981 년)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 제 120 권, 517 페이지 (1978 년)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 제 41 권, 459 페이지 (1969 년)], C600 [Genetics, 제 39 권, 440 페이지 (1954 년)] 등이 사용된다.
바실러스속균으로는, 예컨대 고초균 (Bacillus subtilis) MI114 [Gene, 제 24 권, 255 페이지 (1983 년)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 제 95 권, 87페이지 (1984 년)] 등이 사용된다.
효모로는, 예컨대 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 등이 사용된다.
곤충으로는, 예컨대 누에의 유충 등이 사용된다 [마에다 외, Nature, 제 315 권, 592 페이지 (1985 년)].
곤충세포로는, 예컨대 바이러스 AcNPV 의 경우는 야행성나방의 유충 유래 주화세포 (Spodoptera frugiperda cell; Sf 세포), 양배추 은무늬밤나방 (Trichoplusia ni) 의 중장 유래의 MGl 세포, 양배추 은무늬밤나방의 난 유래의 High FiveTM세포, 배추밤나방 (Mamestra brassicae) 유래의 세포 또는 에스티그메나 아크레아 (Estigmena acrea) 유래의 세포 등이 사용된다. 바이러스가 BmNPV 인 경우는 누에 유래 주화세포 (Bombyx mori N; BmN 세포) 등이 사용된다. 이 Sf 세포로는, 예컨대 Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 [이상, Vaughn, J.L. 외 in Vitro, 13 권, 213-217 페이지 (1977 년)] 등이 사용된다.
동물세포로는, 예컨대 원숭이 COS-7 세포, Vero 세포, 차이니스 햄스터 세포 CHO, DHFR 유전자 결손 차이니스 햄스터 세포 CHO (dhfr-CHO 세포), 마우스 L 세포, 마우스 3T3 세포, 마우스 미엘로마 세포, 인간 HEK293 세포, 인간 FL 세포, 293 세포, C127 세포, BALB 3T3 세포, Sp-2/O 세포 등이 사용된다.
에쉐리키아속균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 69 권, 2110 페이지 (1972 년) 이나 Gene, 제 17 권, 107 페이지 (1982년) 등에 기재된 방법에 따라 실시된다.
바실러스속균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대, Molecular & General Genetics, 제 168 권, 111 페이지 (1979 년) 등에 기재된 방법에 따라 실시된다.
효모를 형질전환하기 위해서는, 예컨대 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 75 권, 1929 페이지 (1978 년) 등에 기재된 방법에 따라 실시된다.
곤충세포 또는 곤충을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 Bio/Technology, 제 6 권, 47-55 페이지 (1988 년) 등에 기재된 방법에 따라 실시된다.
동물세포를 형질전환하기 위해서는, 예컨대 Virology, 제 52 권, 456 페이지 (1973 년) 등에 기재된 방법에 따라 실시된다.
발현 벡터의 세포로의 도입방법으로는, 예컨대 리포펙션법 [Felgner, P.L. 등 (Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America), 제 84 권, 7413 페이지 (1987 년)], 인산칼슘법 [Graham, F.L. 및 van der Eb, A.J. Virology, 제 52 권, 456-467 페이지 (1973 년)], 전기천공법 [Nuemann, E. 등 EMBO J., 제 1 권 841-845 페이지 (1982 년)] 등을 들 수 있다.
이렇게 하여 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 얻을 수 있다.
또한, 동물세포를 사용하여 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 을 안정적으로 발현시키는 방법으로는, 상기 동물세포에 도입된 발현 벡터가 염색체에 삽입된 세포를 클론선택에 의해 선택하는 방법이 있다. 구체적으로는 상기 선택마커를 지표로 하여 형질전환체를 선택한다. 또한, 이와 같이 선택마커를 사용하여 얻어진 동물세포에 대해 반복 클론선택을 행함으로써 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 의 고발현능을 갖는 안정된 동물세포주를 얻을 수 있다. 또, dhfr 유전자를 선택마커로 사용한 경우, MTX 농도를 서서히 올려 배양하고 내성주를 선택함으로써 dhfr 유전자와 함께 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 를 세포내에서 증폭시켜 더욱 고발현의 동물세포주를 얻을 수도 있다.
상기 형질전환체를 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 코딩하는 DNA 가 발현가능한 조건하에서 배양하고, 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 생성, 축적시킴으로써 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 제조할 수 있다.
숙주가 에쉐리키아속균, 바실러스속균인 형질전환체를 배양할 때 배양에 사용되는 배지로서는 액체 배지가 적당하며, 그 중에는 이 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 그 외가 포함된다. 탄소원으로서는 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등이, 질소원으로서는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스팁 리커, 펩톤, 카제인, 고기 추출액, 대두박, 감자 추출액 등과 같은 무기 또는 유기물질, 무기물로서는 예컨대 염화칼슘, 인산2수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또, 효모 추출액, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가해도 된다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 이 바람직하다.
에쉐리키아속균을 배양할 때의 배지로서는 예컨대 글루코스, 카자미노산을 포함한 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433페이지, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972 년] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해서, 예컨대 3β-인돌릴아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다.
숙주가 에쉐리키아속균인 경우, 배양은 통상 약 15℃ ∼ 43℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.
숙주가 바실러스속균인 경우, 배양은 통상 약 30℃ ∼ 40℃ 에서 약 6 ∼ 24 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.
숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때에 배지로서는, 예컨대 Burkholder 최소 배지 [Bostian, K.L. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 77 권, 4505 페이지 (1980 년)] 나 0.5% 카자미노산을 포함한 SD 배지 [Bitter, G.A. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 81 권, 5330 페이지 (1984 년)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20℃ ∼ 35℃ 에서 약 24 ∼ 72 시간을 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.
숙주가 곤충세포인 형질전환체를 배양할 때에 배지로서는 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature, 제 195 권, 788 페이지 (1962 년)) 에 비동화된 10% 소 혈청 등의 첨가물을 적절하게 첨가한 것 등이 사용된다. 배지의 pH는 약 6.2 ∼ 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27℃ 에서 약 3 ∼ 5 일간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.
숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때에 배지로서는 예컨대 약 5 ∼ 20% 의 태아 소 혈청을 포함한 MEM 배지 [Science, 제 122 권, 501 페이지 (1952년)], DMEM 배지 [Virology, 제 8 권, 396 페이지 (1959 년)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association 제 199 권, 519 페이지 (1967 년)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 제 73 권, 1 페이지 (1950 년)] 등이 사용된다. pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30℃ ∼ 40℃ 에서 약 15 ∼ 60 시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반할 수도 있다.
특히 CHO (dhfr-) 세포 및 dhfr 유전자를 선택마커로 사용하는 경우에는 티미딘을 거의 포함하지 않는 투석 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 배양물로부터 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 분리 정제하기 위해서는 예컨대 하기 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 배양균체 또는 세포에서 추출할 때에는 배양 후, 공지된 방법으로 균체 또는 세포를 모아 이것을 적당한 완충액에 현탁하고, 초음파, 리조자임 및/또는 동결융해 등으로 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 의 조추출액을 얻는 방법 등을 적당하게 사용할 수 있다. 완충액 중에는 요소나 염산구아니딘 등과 같은 단백질 변성제나, 트리톤 X-100 (등록상표: 이하, TM 으로 생략하는 경우가 있음) 등과 같은 계면활성제가 포함되어도 된다.
배양액 중에 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 가 분비되는 경우에는 배양종료 후, 자체 공지된 방법으로 균체 또는 세포와 상청을 분리하여 상청을 모은다.
이렇게 하여 얻어진 배양상청 또는 추출액 중에 포함되는 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 의 정제는 자체 공지된 분리ㆍ정제법을 적절하게 조합하여 행할 수 있다. 이들의 공지된 분리, 정제법으로는, 염석이나 용매 침전법 등과 같은 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔 여과법 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등과 같은 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차이를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법이나 크로마토포커싱 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등이 사용된다.
이렇게 얻어지는 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 가 유리체로 얻어지는 경우에는, 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 자체 공지 방법 또는 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.
또한, 재조합체가 생산하는 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 를 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백 수식효소를 작용시킴으로써 임의로 수식을 첨가하거나 단백질 ((폴리)펩티드) 을 부분적으로 제거할 수도 있다. 단백 수식효소로는 예컨대, 트립신, 키모트립신, 아르기닐 엔도펩티다아제, 단백질 키나아제, 글리코시다아제 등이 사용된다. 또 N 말단 아미노산을 결실시키기 위해서는 에드만 (Edman) 시약 (페닐이소티오시아네이트) 을 사용한 공지된 에드만법을 사용할 수 있다.
이렇게 하여 생성되는 본 발명에서 사용되는 TGR-1 또는 뉴로메딘 U 의 존재는 특이 항체를 사용한 효소 면역분석법 등에 의해 측정할 수 있다.
뉴로메딘 U 및 TGR-1 을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘과 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법, 또는 뉴로메딘 U 및 TGR-1 을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트 (이하, 본 발명의 스크리닝 방법, 본 발명의 스크리닝용 키트로 약기하는 경우가 있음) 에 대해 이하에 후술한다.
TGR-1 를 사용하거나 또는 재조합형 TGR-1 의 발현계를 구축하고, 이 발현계를 사용한 뉴로메딘 U 와의 결합 분석계 (리간드ㆍ수용체 분석계) 를 사용함으로써 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 (예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등) 또는 그 염을 스크리닝할 수 있다.
이와 같은 화합물에는, TGR-1 을 통하여 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 을 갖는 화합물 (즉 TGR-1 작동제) 과 이 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (즉, TGR-1 길항제) 등이 포함된다.
또, 「뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는」이란, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합을 저해하는 경우와 결합을 촉진시키는 (결합시간을 길게 함) 경우 양쪽을 포함하는 것이다.
즉, 본 발명은 (ⅰ) TGR-1 에 뉴로메딘 U 를 접촉시킨 경우와 (ⅱ) 상기 TGR-1 에 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 접촉시킨 경우와의 비교를 행하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, (ⅰ) 상기한 TGR-1 에 뉴로메딘 U 를 접촉시킨 경우와 (ⅱ) 상기 TGR-1 에 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 접촉시킨 경우에서의, 예컨대 TGR-1 에 대한 리간드의 결합량, 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 등을 측정하여 비교한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 구체적으로,
① 상기한 뉴로메딘의 유도체로 표시되는 표지된 뉴로메딘 U (이하, 간략하게 「표지된 뉴로메딘 U」로 함) 를 상기한 TGR-1 에 접촉시킨 경우와, 표지된 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 TGR-1 에 접촉시킨 경우에서의, 표지된 뉴로메딘 U 의 이 TGR-1 에 대한 대한 결합량을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
② 표지된 뉴로메딘 U 를 TGR-1 을 포함하는 세포 또는 이 세포의 막분획에 접촉시킨 경우와, 표지된 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 TGR-1 을 포함하는 세포 또는 이 세포의 막분획에 접촉시킨 경우에서의, 표지된 뉴로메딘 U 의 이 세포 또는 이 막분획에 대한 결합량을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
③ 표지된 뉴로메딘 U 를 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 TGR-1 에 접촉시킨 경우와, 표지된 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 TGR-1 에 접촉시킨 경우에서의, 표지된 뉴로메딘 U 의 TGR-1 에 대한 결합량을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
④ TGR-1 을 활성화시키는 화합물 (예컨대, 뉴로메딘 U) 을 TGR-1 을 포함하는 세포에 접촉시킨 경우와, TGR-1 을 활성화시키는 화합물 및 시험화합물을 TGR-1 을 포함하는 세포에 접촉시킨 경우에서의, TGR-1 을 통한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법 및,
⑤ TGR-1 을 활성화시키는 화합물 (예컨대, 뉴로메딘 U) 을 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 TGR-1 에 접촉시킨 경우와, TGR-1 을 활성화시키는 화합물 및 시험화합물을 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 형질전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현된 TGR-1 에 접촉시킨 경우에서의, TGR-1 을 통한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 을 측정하고 비교하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법 등이다.
본 발명에 사용되는 뉴로메딘 U 는 오펀 수용체 단백질인 FM-3 (Tan, C.P. 등, Genomics 52, 223-229, 1998) 에 대해서도 리간드활성을 갖는 것이 알려져 있기 때문에 (WO 00/02919), 상기 ① ∼ ⑤ 에서의 활성을 TGR-1 대신에 FM-3 을 사용함으로써 측정하여 뉴로메딘 U 와 FM-3 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염 (FM-3 길항제, FM-3 작동제) 을 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본 발명에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 TGR-1 길항제, TGR-1 작동제의 활성과, TGR-1 대신에 FM-3 을 사용함으로써 본 발명에 기재된 스크리닝 방법 또는 이에 준한 방법에 의해 얻어지는 FM-3 길항제, FM-3 작동제의 활성을 비교함으로써, FM-3 에 의해 선택적인 활성을 갖는 길항제 또는 작동제, 또는 TGR-1 에 의해 선택적인 활성을 갖는 길항제 또는 작동제를 얻을 수 있다.
여기에서, 「FM-3 에 의해 선택적인 작용을 갖는 길항제」란 FM-3 에 대한 활성 (수용체 (TGR-1, FM-3) 를 통하는 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 등) 이 TGR-1 에 대한 활성에 대해 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 약한 화합물 또는 그 염인 것을 말한다.
「FM-3 에 의해 선택적인 작용을 갖는 작동제」란 FM-3 에 대한 활성 (수용체 (TGR-1, FM-3) 를 통하는 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 등) 이 TGR-1 에 대한 활성에 대해 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 강한 화합물 또는 그 염인 것을 말한다.
「TGR-1 에 의해 선택적인 작용을 갖는 길항제」란 TGR-1 에 대한 활성 (수용체 (TGR-1, FM-3) 를 통하는 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 등) 이 FM-3 에 대한 활성에 대해 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 약한 화합물 또는 그 염인 것을 말한다.
「TGR-1 에 의해 선택적인 작용을 갖는 작동제」란 TGR-1 에 대한 활성 (수용체 (TGR-1, FM-3) 를 통하는 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 변화 등을 촉진시키는 활성 등) 등) 이 FM-3 에 대한 활성에 대해 2 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 강한 화합물 또는 그 염인 것을 말한다.
본 발명의 스크리닝 방법의 구체적인 설명을 이하에 설명한다.
우선, 본 발명의 스크리닝 방법에 사용하는 TGR-1 로는 상기한 TGR-1 을 포함하는 것이면 어느 것이어도 되지만, 인간, 온혈동물, 양서류, 어류 등의 장기의 막분획 등이 바람직하다. 그러나, 특히 인간 유래의 장기는 입수가 매우 곤란하기 때문에 스크리닝에 사용되는 것으로는 재조합체를 사용하여 대량 발현시킨 TGR-1 등이 적합하다.
TGR-1 을 제조하기 위해서는 상기 서술한 방법 등이 사용된다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 TGR-1 을 포함하는 세포 또는 이 세포막분획 등을 사용하는 경우, 후술하는 제조법에 따르면 된다.
TGR-1 을 포함하는 세포를 사용하는 경우, 이 세포를 글루타르알데히드, 포르말린 등으로 고정화시켜도 된다. 고정화방법은 그 자체 공지된 방법에 따라 행할 수도 있다.
TGR-1 을 포함하는 세포로는 TGR-1 을 발현시킨 숙주세포를 말하는데, 이 숙주세포로는 전술한 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등을 들 수 있다.
막분획으로는, 세포를 파쇄시킨 후, 그 자체 공지된 방법으로 얻어지는 세포막이 많이 포함되는 분획인 것을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는, Potter-Elvehjem 형 호모게니저로 세포를 압궤하는 방법, 워링 블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치 프레스 등으로 가압하면서 세포를 가는 노즐로부터 분출시키는 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는 분획 원심분리법이나 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용된다. 예컨대, 세포 파쇄액을 저속 (500rpm ∼ 3000rpm) 으로 단시간 (통상, 약 1 분 ∼ 10 분) 원심시키고, 상청을 다시 고속 (15000rpm ∼ 30000rpm) 으로 통상 30 분 ∼ 2 시간 원심시켜 얻어지는 침전을 막분획으로 한다. 이 막분획중에는 발현된 TGR-1 과 세포 유래의 인지질이나 막단백질 등의 막성분이 많이 포함된다.
이 TGR-1 을 포함하는 세포나 막분획중의 TGR-1 의 양은 1 세포 당 103∼ 108분자인 것이 바람직하고, 105∼ 107분자인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 발현량이 많을수록 막분획 당 리간드 결합활성 (비활성 (比活性)) 이 높아져 고감도인 스크리닝계의 구축이 가능해질 뿐만 아니라 동일 로트에서 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.
뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 스크리닝하는 상기의 ① ∼ ③ 을 실시하기 위해서는 적당한 TGR-1 분획과, 표지된 리간드 또는 리간드활성을 갖는 화합물 (뉴로메딘 U, 그 유도체 등) 이 사용된다.TGR-1 분획으로는, 천연형 TGR-1 분획이거나 또는 이와 동등한 활성을 갖는 재조합형 TGR-1 분획 등이 바람직하다. 여기에서, 동등한 활성이란, 동등한 리간드 결합활성 등을 나타낸다. 표지된 리간드 또는 리간드활성을 갖는 화합물로는, 표지된 리간드 또는 리간드활성을 갖는 화합물 (뉴로메딘 U, 그 유도체 등) 등이 사용된다. 예컨대, [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지된 리간드 (뉴로메딘 U 유도체로 표시되는 뉴로메딘 U 의 표지체) 등을 이용할 수 있다.
구체적으로는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 과의 결합성을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행하기 위해서는, 우선 TGR-1 을 포함하는 세포 또는 세포의 막분획을, 스크리닝에 적합한 완충액에 현탁함으로써 수용체 단백질 표품을 제조한다. 완충액에는 pH 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 6 ∼ 8) 의 인산 완충액, 트리스-염산 완충액 등의 리간드와 수용체와의 결합을 저해하지 않는 완충액이면 어느 것이어도 된다. 또, 비특이적 결합을 저감시키는 목적으로 CHAPS, Tween-80TM(가오-아틀라스사), 디기토닌, 데옥시콜레이트 등의 계면활성제를 완충액에 첨가할 수도 있다. 또한, 프로테아제에 의한 TGR-1 이나 뉴로메딘 U 의 분해를 억제하는 목적으로 PMSF, 로이펩틴, E-64 (펩티드겐뀨쇼 제조), 펩스타틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수도 있다. 0.01㎖ ∼ 10㎖ 의 이 수용체 용액에 일정량 (5000cpm ∼ 500000cpm) 의 표지된 뉴로메딘 U (뉴로메딘 U 유도체로 표시되는 뉴로메딘 U 의 표지체) 를 첨가하고, 동시에 10-4M ∼ 10-1μM 의 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 을 알기 위해 대과잉의 미표지 뉴로메딘 U 를 첨가한 반응튜브도 준비한다. 반응은 약 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 약 4℃ 내지 37 ℃ 에서 20 분 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분 내지 3 시간 행한다. 반응 후, 유리섬유 여과지 등으로 여과하여 적당한 양의 동일 완충액으로 세정한 후, 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 길항하는 물질이 없는 경우의 카운트 (B0) 에서 비특이적 결합량 (NSB) 을 뺀 카운트 (B0-NSB) 를 100% 로 했을 때, 특이적 결합량 (B-NSB) 이, 예컨대 80% 이하가 되는 시험화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 와의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.
또, TGR-1 과 뉴로메딘 U 와의 결합을 측정하는 방법으로, BIA core (아마샴팔마시아바이오테크사 제조) 를 사용할 수도 있다. 이 방법에서는 뉴로메딘 U 를 장치에 첨부한 프로토콜에 따른 아미노커플링법에 의해 센서칩에 고정시키고 TGR-1 을 포함하는 세포 또는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 를 포함하는 형질전환체에서 정제한 TGR-1 또는 TGR-1 을 포함하는 막분획, 또는 정제된 TGR-1 또는 TGR-1 을 포함하는 막분획 및 시험화합물을 포함하는 인산완충액 또는 트리스완충액 등의 완충액을 센서칩상을 매분 2-20㎕ 의 유량으로 통과시킨다. 센서칩상의 뉴로메딘 U 와 TGR-1 이 결합함으로써 생기는 표면 플라즈몬 공명의 변화를 공존하는 시험화합물이 변화시키는 것을 관찰함으로써 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이 방법은 TGR-1 을 센서칩에 고정시키고 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 포함한 인산 완충액 또는 트리스 완충액 등의 완충액을 센서칩 상을 통과시키는 방법을 이용해도 동일하게 측정할 수 있다. 시험화합물로는 상기와 동일한 것 등을 들 수 있다.
뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝하는 상기 ④ ∼ ⑤ 방법을 실시하기 위해서는, TGR-1 를 통한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위 변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 의 저하 등을 촉진시키는 활성 또는 억제시키는 활성 등) 을 공지 방법 또는 시판되는 측정용 키트를 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는 먼저, TGR-1 을 포함하는 세포를 멀티웰 플레이트 등에 배양한다. 스크리닝을 행함에 있어서 미리 신선한 배지 또는 세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 완충액으로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정시간 인큐베이트한 후 세포를 추출 또는 상청액을 회수하여 생성된 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포자극활성의 지표로 하는 물질 (예컨대, 아라키돈산 등) 의 생성이 세포가 포함하는 분해효소에 의해 검정이 어려운 경우에는 이 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 분석을 행해도 된다. 또, cAMP 생산 억제 등의 활성에 대해서는 폴스콜린 등으로 세포의 기초적인 생산량을 증대시켜 둔 세포에 대한 생산억제작용으로 검출할 수 있다.
세포자극활성을 측정하여 스크리닝을 행하기 위해서는, 적당한 TGR-1 을 발현시킨 세포가 사용된다. 본 발명의 TGR-1 을 발현시킨 세포로는 상기 서술한 재조합형 TGR-1 발현세포주 등이 바람직하다. 형질전환체인 TGR-1 발현세포는안정 발현주여도 일과성 발현주여도 상관없다. 또, 동물세포 종류는 상기와 동일한 것이 사용된다.
시험화합물로는 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액 등을 들 수 있다.
상기 리간드 수용체 분석계에 대해서 더 구체적으로 기재하면 다음과 같은 분석계가 사용된다.
(1) 수용체 발현세포가 수용체 작동제에 의해 자극되면 세포내의 G 단백질이 활성화되어 GTP 가 결합된다. 이 현상은 수용체 발현세포의 막분획에서도 관찰된다. 통상 GTP 는 가수 분해되어 GDP 로 변화되지만, 이 때 반응액 중에 GTPγS 를 첨가해 두면 GTPγS 는 GTP 와 동일하게 G 단백질에 결합되지만 가수 분해되지 않고 G 단백질을 포함한 세포막에 결합된 상태가 유지된다. 표지된 GTPγS 를 사용하면 세포막에 잔존한 방사활성을 측정함으로써 수용체 작동제의 수용체 발현세포 자극활성을 측정할 수 있다. 이 반응을 이용하여 뉴로메딘 U 의 TGR-1 발현세포에 대한 자극활성을 측정할 수 있다. 이 방법은 상기 ④ ∼ ⑤ 와 같이 TGR-1 을 포함한 세포를 사용하는 것이 아니라, ① ∼ ③ 과 같이 TGR-1 을 포함한 막분획을 사용하는 분석법이지만, ④ ∼ ⑤ 와 같이 세포자극활성을 측정하는 것으로, 본 측정법에서 TGR-1 막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성을 나타내는 물질은 작동제이다. 여기에서, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가하고, 뉴로메딘 U 의 단독 투여에 비하여 TGR-1 세포막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성에 변화가 생기는 것을 관찰함으로써 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합성을 변화시키는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 에 의한 TGR-1 세포막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성을 억제하는 활성을 나타내는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 TGR-1 세포막분획으로의 GTPγS 결합촉진활성을 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
스크리닝법의 일례에 대해서 보다 구체적으로 다음에 서술한다. 상기 서술한 방법으로 제조한 TGR-1 을 포함한 세포막분획을 막 희석 완충액 (50mM Tris, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 1μM GDP, 0.1% BSA pH 7.4) 으로 희석한다. 희석율은 수용체의 발현량에 따라 다르다. 이를 Falconb 2053 에 0.2㎖ 씩 나눠 붓고, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가하고, 다시 최종농도 200pM 이 되도록 [35S]GTPγS 를 첨가한다. 25℃ 에서 1 시간 보온한 후, 빙냉한 세정용 완충액 (50mM Tris, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS pH 7.4 1.5㎖) 을 첨가하여 유리섬유 여과지 GF/F 로 여과한다. 65℃, 30 분간 보온하여 건조시킨 후, 액체 신틸레이션 카운터로 여과지 상에 남은 막분획에 결합된 [35S]GTPγS 의 방사활성을 측정한다. 뉴로메딘 U만 첨가한 실험구의 방사활성을 100%, 뉴로메딘 U 을 첨가하지 않은 실험구의 방사활성을 0% 로 하여, 뉴로메딘 U 에 의한 GTPγS 결합촉진활성에 대한 시험화합물의 영향을 산출한다. GTPγS 결합촉진활성이 예컨대 80% 이하가 되는 시험화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.
(2) TGR-1 발현세포는 뉴로메딘 U 자극에 의해 세포내 cAMP 량이 감소하는 경우, 이 반응을 이용하여 뉴로메딘 U의 TGR-1 발현세포에 대한 자극활성을 측정할 수 있다.
TGR-1 을 발현시킨 각종 동물세포의 cAMP 생산량은 마우스, 래트, 토끼, 염소, 소 등을 면역시켜 얻은 항 cAMP 항체와125I 표지 cAMP (모두 시판품) 를 사용함으로써 RIA 또는 항 cAMP 항체와 표지 cAMP 를 조합한 다른 EIA 계에서도 측정할 수 있다. 또, 항 cAMP 항체를 protein A, 또는 항 cAMP 항체 생산에 사용한 동물의 IgG 등에 대한 항체 등을 사용하여 고정시킨 신틸런트를 포함한 비즈와125I 표지 cAMP 를 사용하는 SPA 법에 의한 정량도 가능하다 (아마샴팔마시아 바이오테크 제조의 키트 등을 사용함).
본 방법에서 폴스콜린 또는 칼시토닌 등 세포내 cAMP 량을 증가시키는 리간드로 세포내 cAMP 량을 상승시키고, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가함으로써 뉴로메딘 U 의 단독 투여에 의한 세포내 cAMP 량의 억제가 변화되는 것을 관찰하고, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 에 의한 TGR-1 발현세포의 cAMP 생산억제활성을 저해시키는 활성을 나타내는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 첨가하여 cAMP 생산억제활성을 조사함으로써 작동제 활성을 나타내는 화합물의 스크리닝을행할 수 있다.
스크리닝법을 보다 구체적으로 다음에 기재한다. TGR-1 수용체를 발현시킨 CHO 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰로 파종하고 48 시간 배양한다. 세포를 0.2mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 으로 세정한다 (이하, 0.2mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 을 반응용 완충액이라고 함). 그 다음에 0.5㎖ 반응용 완충액을 첨가하고 30 분간 배양기에서 보온한다. 반응용 완충액을 제거하고 다시 0.25㎖ 반응용 완충액을 세포에 첨가한 후 2μM 폴스콜린을 포함한 0.25㎖ 반응용 완충액에 1nM 뉴로메딘 U, 또는 1nM 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가한 것을 세포에 첨가하고 37℃ 에서 24 분간 반응시킨다. 100㎕ 의 20% 과염소산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 다음에 빙상에서 1 시간 방치함으로써 세포내 cAMP 를 추출한다. 추출액 중의 cAMP 량은 cAMP EIA 키트 (아마샴팔마시아 바이오테크) 를 사용하여 측정한다. 폴스콜린 자극에 의해 생산된 cAMP 량을 100% 로 하고 1nM 뉴로메딘 U 의 첨가에 의해 억제된 cAMP 량을 0% 로 하여, 뉴로메딘 U 에 의한 cAMP 생산억제활성에 대한 시험화합물의 영향을 산출한다. 뉴로메딘 U 의 활성을 저해시켜 cAMP 생산활성이 예컨대 80% 이하가 되는 시험화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.
cAMP 생산촉진활성을 측정하기 위해서는, 폴스콜린을 첨가하지 않고 TGR-1수용체를 발현시킨 CHO 세포에 시험화합물을 첨가하여 생산된 cAMP 를 상기 방법으로 정량한다. 이 경우에는 cAMP 의 생산활성이 예컨대 10% 이상의 시험화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.
(3) CRE (cAMP 반응 요소) 를 포함한 DNA 를, 피카진 베이직 벡터 또는 피카진 엔핸서 벡터 (도요잉크제조 (주)) 의 루시페라아제 유전자 상류의 멀티클로닝사이트에 삽입하여 이를 CRE-리포터 유전자 벡터로 한다. CRE-리포터 유전자 벡터를 트랜스펙션한 세포에서, cAMP 상승을 수반하는 자극은 CRE 를 통한 루시페라아제 유전자 발현과 이에 계속되는 루시페라아제 단백질의 생산을 유도한다. 즉, 루시페라아제 활성을 측정함으로써 CRE-리포터 유전자 벡터 도입 세포내의 cAMP 량의 변동을 검출할 수 있다. CRE-리포터 유전자 벡터를 TGR-1 발현세포에 트랜스펙션한 세포를 이용하여 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 구체적인 스크리닝법을 다음에 기재한다.
CRE-리포터 유전자 도입 TGR-1 발현세포를 24 웰 플레이트에 5 ×103세포/웰로 파종하고 48 시간 배양한다. 세포를 0.2mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 으로 세정한다 (이하, 0.2mM 3-이소부틸-메틸크산틴과 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 을 반응용 완충액이라고 함). 그 다음에 0.5㎖ 반응용 완충액을 첨가하여 30 분간 배양기에서 보온한다. 반응용 완충액을 제거하고 다시 0.25㎖ 반응용 완충액을 세포에 첨가한 후, 1nM 뉴로메딘 U, 또는 1nM 뉴로메딘 U 및 시험화합물과 2μM 폴스콜린을 포함한 0.25㎖ 반응용 완충액을 세포에 첨가하고 37℃ 에서 24 분간 반응시킨다. 세포를 피카진용 세포용해제 (도요잉크제조 (주)) 로 용해시키고 용해액에 발광기질 (도요잉크제조 (주)) 을 첨가한다. 루시페라아제에 의한 발광은 루미노미터, 액체 신틸레이션 카운터 또는 톱 카운터로 측정한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 루시페라아제에 의한 발광량을 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의해 폴스콜린 자극에 의한 발광량의 증가가 억제되지만, 이 억제를 회복시키는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 폴스콜린 자극에 의해 상승된 발광량의 뉴로메딘 U 와 동일한 억제를 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
리포터 유전자로서 루시페라아제 이외에 예컨대 알칼리포스파타아제, 클로램페니콜 아세틸트랜스페라아제 또는 β-갈락토시다아제를 사용할 수도 있다. 이들 리포터 유전자의 유전자 산물의 효소활성은 다음과 같이 시판되는 측정키트를 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 알칼리포스파타아제 활성은 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 Lumi-Phos 530 에 의해, 클로램페니콜 아세틸트랜스페라아제 (chloramphenicol acetyltransferase) 활성은 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 FAST CAT Chloramphenicol Acetyltransferase Assay Kit 에 의해, β-갈락토시다아제 활성은 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 Aurora Gal-XE 에 의해 측정할 수 있다.
(4) TGR-1 발현세포가 뉴로메딘 U 자극에 의해 아라키돈산 대사물을 세포밖으로 방출하는 경우, 미리 방사활성을 갖는 아라키돈산을 세포에 주입시켜 둠으로써 그 활성을 세포 밖으로 방출된 방사활성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가하여 뉴로메딘 U 의 아라키돈산 대사물 방출활성에 대한 영향을 조사함으로써, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 에 의한 아라키돈산 대사물 방출활성을 저해시키는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 또, 시험화합물만 첨가하고 TGR-1 발현세포의 아라키돈산 대사물 방출활성을 조사함으로써, 작동제 활성을 나타내는 화합물의 스크리닝을 행할 수도 있다.
뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝법을 구체적으로 다음에 서술한다.
TGR-1 수용체를 발현시킨 CHO 세포를 24 웰 플레이트에 5 ×104세포/웰로 파종하고 24 시간 배양한 후, [3H]아라키돈산을 0.25μCi/웰이 되도록 첨가한다. [3H]아라키돈산을 첨가한 16 시간 후, 세포를 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 으로 세정하고, 각 웰에 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 에 용해된 최종농도 10nM 뉴로메딘 U 또는 10nM 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 포함한 완충액 500㎕ 을 첨가한다. 이후에, 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 을 반응용 완충액이라고 한다.37℃ 에서 60 분간 인큐베이트한 후에 반응액 400㎕ 를 신틸레이터에 첨가하고, 반응액 중에 유리된 [3H]아라키돈산 대사물의 양을 신틸레이션 카운터로 측정한다. 뉴로메딘 U 를 첨가하지 않은 반응 완충액에 의한 배지 중의 [3H]아라키돈산 대사물의 양을 0% 로 하고 10nM 뉴로메딘 U 를 첨가했을 때 배지 중의 [3H]아라키돈산 대사물의 양을 100% 로 하여, 시험화합물의 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 대한 영향을 산출한다. 아라키돈산 대사물 생산활성이 예컨대 50% 이하가 되는 시험화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다.
(5) TGR-1 발현세포를 뉴로메딘 U 로 자극함으로써 세포내의 Ca2+농도가 상승되는 경우, 이것을 이용함으로써 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 대한 시험화합물의 영향을 조사할 수 있다.
TGR-1 발현세포를, 멸균된 현미경용 커버글라스 위에 파종하고, 이틀 후 배양액을 4mM Fura-2 AM (도진 화학연구소) 을 현탁시킨 HBSS 로 치환하고 실온에서 2 시간 30 분간 둔다. HBSS 로 세정한 후 인큐베이트에 커버글라스를 세팅하고, 형광측정기로 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가했을 때 여기파장 340㎚ 및 380㎚ 에서의 505㎚ 의 형광강도의 비의 상승을 측정한다. 이 때, 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여했을 때에 비하여 시험화합물의 첨가에 의해 발생되는 형광강도의 변화를 측정함으로써, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 대하여 영향을 주는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 또, 다음과 같이 FLIPR (몰레큘러 디바이스사 제조) 을 사용할 수도 있다. 즉, 세포현탁액에 Fluo-3 AM (도진 화학연구소 제조) 을 첨가하고 세포에 주입시킨 후, 상청액을 원심으로 몇번 세정한 후 96 웰 플레이트에 세포를 파종한다. FLIPR 장치에 세팅하고, Fura-2 AM 의 경우와 동일하게 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가하고, 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여했을 때에 비하여 시험화합물의 첨가에 의해 관측되는 형광강도가 변화되는 것을 측정함으로써, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 대하여 영향을 주는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 여기에서, 뉴로메딘 U 에 의한 형광강도의 상승을 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만의 첨가에 따른 형광강도의 상승을 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
TGR-1 발현세포에 aequorin 등과 같이 세포내 Ca 이온의 상승에 따라 발광하는 단백질의 유전자를 공발현시켜 두고, 세포내 Ca 이온농도의 상승에 따라 aequorin 이 Ca 결합형으로 되어 발광하는 것을 이용하며, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가하고, 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여했을 때에 비하여 시험화합물의 첨가에 의해 관측되는 발광강도가 변화되는 것을 측정함으로써, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 대하여 영향을 주는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 방법은 형광물질을 주입시키지 않는 것 이외에는 상기와 동일하다.
(6) 수용체를 발현시키는 세포에 수용체 작동제를 첨가하면, 세포내 이노시톨 3 인산 농도가 상승되는 것이 알려져 있다. 뉴로메딘 U 에 의해 발생되는TGR-1 세포에서의 이 반응을 관찰함으로써, 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 영향을 주는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다. 24 웰 플레이트에 파종하고 하루째의 세포에 미오-[2-3H]이노시톨 (2.5 마이크로 Ci/웰) 을 첨가한 배지 중에서 하루 배향한 세포를 잘 세정한 후, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가한 후, 10% 과염소산을 첨가하고 반응을 정지시킨다. 1.5M KOH, 60mM HEPES 용액에서 중화시키고, 0.5㎖ 의 AGl ×8 수지 (Bio-Rad) 를 채운 칼럼을 통과시키고, 5mM Na2BO360mM HCOONH4로 세정한 후, 1M HCOONH40.1M HCOOH 에서 용출된 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. 뉴로메딘 U 를 첨가하지 않은 반응 완충액에 의한 배지 중의 방사활성을 0% 로 하고 뉴로메딘 U 를 첨가했을 때 배지 중의 방사활성을 100% 로 하여, 시험화합물의 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합에 대한 영향을 산출한다. 이노시톨3인산 생산활성이 예컨대 50% 이하가 되는 시험화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만의 첨가에 따른 이노시톨3인산 생산 상승을 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(7) TRE (TPA 반응 요소) 를 포함한 DNA 을, 피카진 베이직 벡터 또는 피카진 엔핸서 벡터 (도요잉크제조 (주)) 의 루시페라아제 유전자 상류의 멀티클로닝사이트에 삽입하여 이를 TRE-리포터 유전자 벡터로 한다. TRE-리포터 유전자 벡터를 트랜스펙션한 세포에서 세포내 Ca2+상승을 수반하는 자극은 TRE 를 통한 루시페라아제 유전자 발현과 이에 계속되는 루시페라아제 단백질의 생산을 유도한다.즉, 루시페라아제 활성을 측정함으로써 TRE-리포터 유전자 벡터 도입 세포내의 칼슘량의 변동을 검출할 수 있다. TRE-리포터 유전자 벡터를 TGR-1 발현세포에 트랜스펙션한 세포를 이용한 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 구체적인 스크리닝법을 다음에 기재한다.
TRE-리포터 유전자 도입 TGR-1 발현세포를 24 웰 플레이트에 5 ×103세포/웰로 파종하고 48 시간 배양한다. 세포를 0.05% BSA 와 20mM HEPES 를 포함한 행크스 완충액 (pH 7.4) 으로 세정한 후, 10nM 뉴로메딘 U 또는 10nM 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가하고 37℃ 에서 60 분간 반응시킨다. 세포를 피카진용 세포용해제 (도요잉크제조 (주)) 로 용해시키고 용해액에 발광기질 (도요잉크제조 (주)) 을 첨가한다. 루시페라아제에 의한 발광은 루미노미터, 액체 신틸레이션 카운터 또는 톱 카운터로 측정한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 루시페라아제에 의한 발광량을 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의해 세포내 Ca2+의 상승에 따라 발광량이 증가되지만, 이 증가를 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 뉴로메딘 U 와 동일한 발광량의 증가를 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
리포터 유전자로서 루시페라아제 이외에 예컨대 알칼리포스파타아제, 클로램페니콜 아실트랜스페라아제 또는 β-갈락토시다아제를 사용할 수도 있다. 이들리포터 유전자의 유전자 산물의 효소활성은 다음과 같이 시판되는 측정키트를 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 알칼리포스파타아제 활성은 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 Lumi-Phos 530 에 의해, 클로램페니콜 아세틸트랜스페라아제 (chloramphenicol acetyltransferase) 활성은 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 FAST CAT Chloramphenicol Acetyltransferase Assay Kit 에 의해, β-갈락토시다아제 활성은 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 Aurora Gal-XE 에 의해 측정할 수 있다.
(8) 뉴로메딘 U 에 응답한 TGR-1 발현세포에 대해서 MAP kinase 활성화에 의한 증식이 관찰되는 경우, 이 증식을 MAP kinase 활성, 티미딘 주입, 세포수 측정 (MTT 등) 에 의해 측정할 수 있다. 이것을 이용하여 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
MAP kinase 활성은 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 세포에 첨가한 후, 세포용해액으로부터 항 MAP kinase 항체를 사용한 면역 침강에 의해 MAP kinase 분획을 얻은 후, 예컨대 와코쥰야쿠 제조의 MAP Kinase Assay Kit와 γ-[32P]-ATP 를 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 티미딘 주입 활성은 TGR-1 발현세포를 파종하고, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가한 후에 [메틸-3H]-티미딘을 첨가하고, 그 다음에 세포내에 주입된 표지 티미딘의 방사활성을 세포를 용해시켜 액체 신틸레이션 카운터로 계수함으로써 측정할 수 있다.
TGR-1 발현세포의 증식은 발현세포를 파종하고, 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 첨가한 후에 MTT (3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드) 를 첨가하고, 세포내에 주입되어 MTT가 변화된 MTT 포르마잔을 염산으로 산성화시킨 이소프로판올로 세포를 용해시킨 후 570㎚ 의 흡수를 측정함으로써 측정할 수 있다.
뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 표지 티미딘 주입 활성을 이용한 구체적인 스크리닝법을 다음에 기재한다.
TGR-1 발현세포를 24 웰 플레이트에 웰당 5000 개 파종하고 하루동안 배양한다. 다음에 혈청을 포함하지 않은 배지에서 2 일간 배양하여 세포를 기아 상태로 만든다. 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 세포에 첨가하여 24 시간 배양한 후, [메틸-3H]-티미딘을 웰당 0.015MBq 첨가하고 6 시간 배양한다. 세포를 PBS(-) 로 세정한 후 메탄올을 첨가하고 10 분간 방치한다. 다음에, 5% 트리클로로아세트산을 첨가하고 15분간 방치한 후, 고정된 세포를 증류수로 4 회 세정한다. 0.3N 수산화나트륨 용액으로 세포를 용해시키고 용해액 중의 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 티미딘 주입에 의한 방사활성의 상승을 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의한 방사활성의 증가를 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 뉴로메딘 U 와 동일한 방사활성의 증가를 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(9) TGR-1 발현세포에 뉴로메딘 U 를 첨가하면 K channel 이 활성화되고, 세포내에 있는 K 이온이 세포밖으로 유출되는 경우, K 이온과 동족원소인 Rb 이온은 K 이온과 구별없이 K channel 을 통과하여 세포밖으로 유출되므로, 세포에 표지 Rb([86Rb]) 를 첨가하여 주입시켜 둔 후, 뉴로메딘 U 의 자극에 의해 유출되는 [86Rb] 의 유출을 측정함으로써 뉴로메딘 U 의 작용을 측정할 수 있다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 [86Rb] 의 유출활성을 이용한 구체적인 스크리닝법을 다음에 나타낸다.
24 웰에 파종하고 이틀 후의 TGR-1 발현세포를 1mCi/㎖의86RbCl 을 포함한 배지 중에서 2시간 보온한다. 배지를 잘 세정하고 외부액 중의86RbCl을 완전히 제거한다. 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 세포에 첨가하고 30 분 후의 외부액을 회수하여 γ카운터로 방사활성을 측정한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 [86Rb] 의 유출에 따른 방사활성의 상승을 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의한 방사활성의 상승을 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 뉴로메딘 U 와 동일한 방사활성의 상승을 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(10) TGR-1 발현세포가 뉴로메딘 U 에 반응하여 변화되는 세포밖의 pH (산성화 속도) 를 사이트센서장치 (몰레큘러 디바이스사) 를 사용하여 측정함으로써 뉴로메딘 U 의 활성을 측정할 수 있다. 사이트센서장치를 이용한 세포밖 pH 변화를 측정하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 구체적인 스크리닝법을 다음에 기재한다.
TGR-1 발현세포를 사이트센서장치용 캡슐내에서 밤새 배양하고, 장치의 챔버에 세팅하고 세포밖 pH 가 안정될 때까지 약 2 시간 0.1% BSA 를 포함한 RPMI1640 배지 (몰레큘러 디바이스사 제조) 를 관류시킨다. pH 가 안정된 후 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 포함한 배지를 세포 상에 관류시킴으로써 발생되는 배지의 pH 변화를 측정한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 TGR-1 발현세포의 세포밖 pH 변화를 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의한 세포밖 pH 변화를 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 뉴로메딘 U 와 동일한 세포밖 pH 변화를 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
(11) 맥주 효모균 (Saccharomyces cerevisiae) 의 단수체 α-교배형 (MATα) 의 성페로몬 수용체 STe2 는 G 단백질 Gpa1 과 커플링되어 있고, 성페로몬 α-교배 인자에 응답하여 MAP 키나아제를 활성화시키고, 다음에 Farl (세포 주기 정지) 및 전사활성화 인자 Stel2 가 활성화된다. Stel2 는 접합에 관여하는 FUSl 을 포함한 각종 단백질의 발현을 유도한다. 한편, 제어인자 Sst2 는 이상과 같은 과정에 억제적으로 기능한다. 이 계에서 수용체 유전자를 도입한 효모를 제조하고, 수용체 작동제 자극에 의해 효모 세포내의 신호 전달계를 활성화시키고, 그 결과 발생되는 증식 등의 지표를 사용한, 수용체 작동제와 수용체의 반응의 측정계의 시도가 행해지고 있다 (Pausch, M.H., Trends in Biotechnology, vol.15, pp.487-494 (1997)). 이러한 수용체 유전자 도입 효모계를 이용하여 뉴로메딘 U 및 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
MATα효모의 Ste2 및 Gpal 을 코딩하는 유전자를 제거하고, 대신에 TGR-1 유전자 및 Gpal-Gai2 융합단백질을 코딩하는 유전자를 도입한다. Far 을 코딩하는 유전자를 제거하여 세포 주기 정지가 발생하지 않게 하고, 또 Sst를 코딩하는 유전자를 제거함으로써 뉴로메딘 U 에 대한 응답의 감도를 향상시켜 둔다. 또한, FUSl 에 히스티딘 생합성 유전자 HIS3 을 연결한 FUSl-HIS3 유전자를 도입한다. 이상과 같은 유전자 재조합 조작은, 예컨대 Price 외 (Price, L.A. 등, Molecular and Cellular Biology, vol.15, pp.6188-6195 (1995)) 의 보고에 기재된 방법에서 소마토스타틴 수용체 타입 2 (SSTR2) 유전자를 TGR-1 유전자로 치환하여 실시함으로써 쉽게 행할 수 있다. 이렇게 해서 구축된 형질전환 효모는 TGR-1 의 리간드인 뉴로메딘 U 에 고감도로 반응하고, 그 결과 MAP 키나아제의 활성화가 일어나 히스티딘 생합성 효소가 합성되도록 되고, 히스티딘 결핍 배지에서 생육이 가능해진다. 이것을 이용하여 히스티딘 결핍 배지에서의 효모 생육을 지표로 하여 뉴로메딘 U 에 의한 TGR-1 발효 효모의 응답을 관찰할 수 있다. 다음에뉴로메딘 U 및 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 스크리닝법을 서술한다.
상기와 같이 해서 제조된 형질전환 효모를 완전 합성배지의 액체 배지에서 밤새 배양하고, 2 ×104세포/㎖ 농도로 히스티딘을 제거한 용해 한천배지에 첨가하여 9 ×9㎝ 의 각형 샬레에 파종한다. 한천이 고화된 후 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 배어들게 한 멸균여과지를 한천 표면에 두고 30℃ 에서 3 일간 배양한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 여과지 주위의 효모 생육을 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의한 효모 생육을 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 뉴로메딘 U 와 동일한 효모 생육을 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다. 또, 미리 한천배지에 뉴로메딘 U 를 첨가해 두고 멸균여과지에 시험화합물만 배어들게 하여 배양하고, 샬레 전체면에서의 효모 생육이 여과지 주위에서 영향을 받는 것을 관찰함으로써 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향을 조사할 수 있다.
(12) TGR-1 유전자 RNA 를 제노푸스 라에비스 (Xenopus laevis) 의 난모세포에 주입하고 뉴로메딘 U 로 자극하면, 세포내 Ca2+이온농도가 상승되어 칼슘-활성화 클로라이드 전류가 발생한다. 이것을 막 전위의 변화로 취할 수 있다 (K 이온농도 구배에 변화가 있는 경우에도 동일함). 뉴로메딘 U 에 의해 발생되는 TGR-1 도입 제노푸스 라에비스의 난모세포에서의 이 반응을 관찰함으로써 뉴로메딘U 와 TGR-1 의 결합에 영향을 주는 화합물의 스크리닝을 행할 수 있다.
빙냉시켜 움직일 수 없게 된 암컷 제노푸스 라에비스에서 취출한 난모세포 덩어리를 MBS 액 (88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl2, 0.33mM Ca(NO3)2, 0.82mM MgSO4, 2.4mM NaHCO3, 10mM HEPES, pH 7.4) 에 용해시킨 콜라게나아제 (0.5㎎/㎖) 로 난덩어리가 풀릴 때까지 19℃, 1-6 시간, 150rpm 으로 처리한다. 외부액을 MBS 액으로 치환함으로써 3 번 세정하고, 마이크로매뉴플레이터로 TGR-1 mRNA (50ng/50nl) 를 마이크로인젝션한다. TGR-1 mRNA 는 조직이나 세포로부터 제조해도 되고 플라스미드에서 in vitro 로 전사해도 된다. 이것을 MBS 액 중에 20℃ 에서 3 일 배양한다. 이것을 링거액이 흐르고 있는 전압 클램프 장치의 오목한 부분에 두고, 전위 고정용 유리 미소 전극, 전위 측정용 유리 미소 전극을 세포내에 삽입하고 (-) 극은 세포밖에 방치한다. 전위가 안정되면 뉴로메딘 U, 또는 뉴로메딘 U 및 시험화합물을 포함한 링거액을 흐르게 하여 전위 변화를 기록한다. 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 화합물의 영향은 TGR-1 도입 제노푸스 라에비스의 난모세포의 세포막 전위 변화를 뉴로메딘 U 를 단독으로 투여한 경우와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이 때, 뉴로메딘 U 의 투여에 의한 세포막 전위 변화를 억제하는 화합물을 TGR-1 과 뉴로메딘 U 의 결합성을 변화시키는 능력이 있는 후보물질로 선택할 수 있다. 한편, 시험화합물만 투여하고 뉴로메딘 U 와 동일한 세포막 전위 변화를 관찰함으로써 작동제의 스크리닝을 행할 수도 있다.
이 계에서 변화량을 증대시켜 반응을 측정하기 쉽도록 각종 G 단백질 유전자의 poly(A+) RNA 를 도입할 수도 있다. 또, aequorin 과 같은 Ca2+존재 하에서 발광을 발생시키는 단백질 유전자의 poly(A+) RNA 를 모두 인젝션함으로써 막 전위 변화가 아니라 발광을 관찰하여 이 반응을 측정할 수도 있다.
뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트는 TGR-1, TGR-1 을 포함하는 세포 또는 TGR-1 을 포함하는 세포의 막분획 및 뉴로메딘 U 를 포함하는 것이다.
본 발명의 스크리닝용 키트의 예로는 다음 것을 들 수 있다.
1. 스크리닝용 시약
① 측정용 완충액 및 세정용 완충액
Hank's Balanced Salt Solution (기브코사 제조) 에 0.05% 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.
웰 직경 0.45㎛ 의 필터로 여과 멸균하여 4℃ 에서 보존하거나, 또는 사용시 제조해도 된다.
② TGR-1 표품
TGR-1 을 발현시킨 CHO 세포를 12 웰 플레이트에 5 ×105개/웰로 계대하고, 37℃, 5% CO2, 95% 대기에서 2 일간 배양한 것.
③ 표지 리간드
[3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지된 뉴로메딘 U.
적당한 용매 또는 완충액에 용해시킨 것을 4℃ 또는 -20℃ 에서 보존하여 사용시에 측정용 완충액으로 1μM 에 희석한다.
④ 리간드 표준액
뉴로메딘 U 를 0.1% 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 포함하는 PBS 로 1mM 가 되도록 용해하여 -20℃ 에서 보존한다.
2. 측정법
① 12 웰 조직배양용 플레이트에서 배양한 TGR-1 을 발현시킨 세포를, 측정용 완충액 1㎖ 로 2 회 세정한 후, 490㎕ 측정용 완충액을 각 웰에 첨가한다.
② 10-3∼ 10-10M 의 시험화합물 용액을 5㎕ 첨가한 후, 표지 뉴로메딘 U 를 5㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는 시험화합물 대신에 10-3M 의 뉴로메딘 U 를 5㎕ 첨가해 둔다.
③ 반응액을 제거하여 1㎖ 세정용 완충액으로 3 회 세정한다. 세포에 결합된 표지 뉴로메딘 U 를 0.2N NaOH-1% SDS 로 용해시켜 4㎖ 액체 신틸레이터 A (와코쥰야쿠 제조) 와 혼합한다.
④ 액체 신틸레이션 카운터 (베크만사 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정하여 최대결합 퍼센트 (Percent Maximum Binding, PMB) 을 다음 식으로 구한다.
식
PMB=[(B-NSB)/(B0-NSB)] ×100
PMB: 최대결합 퍼센트
B: 검체를 첨가했을 때의 값
NSB: 비특이적 결합량 (Non-specific Binding)
B0: 최대 결합량
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그 염은 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합을 변화시키는 (결합을 저해 또는 촉진시키는) 화합물로, 구체적으로는 TGR-1 을 통해 세포자극활성을 갖는 화합물 (소위, TGR-1 작동제) 또는 이 자극활성을 갖지 않는 화합물 (소위, TGR-1 길항제) 이다. 이 화합물로는 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이거나 공지된 화합물일 수도 있다.
상기 TGR-1 작동제인지 길항제인지의 구체적인 평가방법은 다음 (i) 또는 (ii) 에 따르면 된다.
(i) 상기 ① ∼ ③ 의 스크리닝 방법으로 표시되는 결합 분석을 행하여 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합성을 변화시키는 (특히, 결합을 저해시키는) 화합물을 얻은 후, 이 화합물이 상기 TGR-1 을 통한 세포자극활성을 갖고 있는지의 여부를 측정한다. 세포자극활성을 갖는 화합물 또는 그 염은 TGR-1 작동제이고, 이 활성을 갖지 않는 화합물 또는 그 염은 TGR-1 길항제이다.
(ii) (a) 시험화합물을 TGR-1 을 포함하는 세포에 접촉시키고 상기 TGR-1 을 통한 세포자극활성을 측정한다. 세포자극활성을 갖는 화합물 또는 그 염은 TGR-1 작동제이다.
(b) TGR-1 을 활성화시키는 화합물 (예컨대, 뉴로메딘 U 또는 TGR-1 작동제 등) 을 TGR-1 을 포함하는 세포에 접촉시킨 경우와 TGR-1 을 활성화시키는 화합물 및 시험화합물을 TGR-1 을 포함하는 세포에 접촉시킨 경우에 TGR-1 을 통한 세포자극활성을 측정 비교한다. TGR-1 을 활성화시키는 화합물에 의한 세포자극활성을 감소시킬 수 있는 화합물 또는 그 염은 TGR-1 길항제이다.
이 TGR-1 작동제는 TGR-1 에 대한 뉴로메딘 U 가 갖는 생리활성과 동일한 작용을 갖고 있기 때문에, 뉴로메딘 U 와 동일하게 안전하고 저독성인 의약으로 유용하다.
한편, TGR-1 길항제는 TGR-1 에 대한 뉴로메딘 U 가 갖는 생리활성을 억제할 수 있기 때문에, 이 수용체 활성을 억제하는 안전하고 저독성인 의약으로 유용하다.
뉴로메딘 U 또는 그 염은 평활근 수축작용, 혈압상승작용, 장관에서의 이온 수송의 조절, 피하 투여 후의 ACTH 및 이에 계속되는 코르티코스테론의 상승 등에 관여하고 있다는 점에서 저혈압증 예방ㆍ치료제나 국소혈관 수축제 등으로서 이용할 수 있기 때문에, 상기 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 중 TGR-1 작동제는 저혈압증 예방ㆍ치료제나 국소혈관 수축제 등으로서 이용할 수 있는 것 이외에, 자궁수축 촉진제로서, 미약진통, 이완출혈, 태반분만전후, 자궁복고부전, 인공임신중절, 분만유발, 분만정지, 자궁경관무력증, 자궁내반(증), 유잔태반 및 유잔난막, 분만후출혈, 여성성기탈, 불임증, 다태임신에서의 모체 케어, 태위이상, 월경곤란증, 유산, 자궁내막증, 만성자궁염증성질환, 자궁근종, 자궁기형, 자궁선근증, 자궁경부열상, 외상후 스트레스증후군 등, 자궁수축부전에 관계된 각종 질환의 개선, 예방 및 치료약으로 사용할 수 있다. 또, TGR-1 길항제는 고혈압증, 심근경색, 급성신부전, 스트레스성 질환 (예컨대, ① 심혈관계 질환 (협심증, 심근경색, 부정맥 등), ② 호흡기계 질환 (기관지 천식, 과호흡증후군 등), ③ 근골격계 질환 (만성관절류머티즘, 허리통증, 편두통, 긴장성 두통 등), ④ 기타 (당뇨병, 갱년기장애, 만성동통, 면역력 저하 등), 소화기계 질환 (위궤양, 궤양성 대장염 등) 등의 예방ㆍ치료약 등으로서 사용할 수 있는 것 이외에, 자궁수축억제제로서 심한 진통, 임시 진통, 천연 임신, 강직성 자궁수축, 태아임시사망, 자궁파열, 경관파열, 조산, 자궁근종, 자궁기형, 자궁선근증, 분만력 이상, 만성자궁염증성질환, 다태임신에서의 모체 케어, 태위이상, Prader-Willi 증후군, 월경곤란증 등 자궁수축 과다에 관계된 각종 질환의 개선, 예방 및 치료약으로 유용하다.
또, 뉴로메딘 U 또는 그 염은 식욕조절작용을 지니고 있기 때문에, 그 식욕조절작용에 따라 상기 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 중 FM-3 작동제는 식욕억제제, 항비만제, 과식증 치료약, 다식증 치료약 등으로, 그리고 FM3 길항제는 식욕촉진제 등으로 사용할 수 있다.
상기 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물의 염으로는 예컨대 약학적으로 허용 가능한 염 등이 사용된다. 예컨대, 무기염기와의 염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다.
무기염기와의 염의 바람직한 예로는, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리토금속염 및 알루미늄염, 암모늄염 등을 들 수 있다.
유기염기와의 염의 바람직한 예로는, 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 등과의 염을 들 수 있다.
무기산과의 염의 바람직한 예로는, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등과의 염을 들 수 있다.
유기산과의 염의 바람직한 예로는, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 푸말산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 벤조산 등과의 염을 들 수 있다.
염기성 아미노산과의 염의 바람직한 예로는, 예컨대 아르기닌, 리신, 오르니틴 등과의 염을 들 수 있고, 산성 아미노산과의 바람직한 예로는, 예컨대 아스파라긴산, 글루타민산 등과의 염을 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그 염을 상기 서술한 의약으로 사용하는 경우에는 다음에 기재하는 바와 같이 사용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그 염을 상기 서술한 의약으로 사용하는 경우, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 필요에 따라 당의나 장용성 피막을 실시한 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대, 이 화합물 또는 그 염을 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제의 유효 성분량은 지지된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로서는, 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라간트검, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 아르긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 아까모노 (akamono) 오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용된다. 제조단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상담체를 포함시킬 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수성액으로서는 예컨대 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장액 (예컨대, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올 (예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리소르베이트80(TM), HCO-50 등) 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다.
또, 완충액 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액 등), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전된다.
이렇게 해서 얻은 제제는 안전하고 저독성이기 때문에, 예컨대 온혈동물 (예컨대, 인간, 모르모트, 래트, 마우스, 돼지, 양, 소, 원숭이, 개, 닭 등), 양서류 (예컨대, 개구리 등) 및 어류 등에 대하여 투여할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 (특히, 길항제) 또는 그 염의 투여량은 증상 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여의 경우 일반적으로 성인의 고혈압증 환자 (체중 60㎏) 에게는 하루에 약 0.1 ∼ 1000㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 300㎎, 보다 바람직하게는 약 3.0 ∼ 50㎎이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 그 1 회 투여량은 투여대상, 증상, 투여방법 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 주사제의 형태로는 성인의 고혈압증 환자 (체중 60㎏) 에게 투여하는 경우 하루에 약 0.01 ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 TGR-1 에 대한 항체에 관한 것이다.
TGR-1 에 대한 항체는 TGR-1 을 인식할 수 있는 항체라면 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 된다.
TGR-1 에 대한 항체는 TGR-1 을 항원으로서 사용하고, 자체 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다.
[모노클로날 항체의 제조]
(a) 모노클로날 항체 생산 세포의 제조
TGR-1 은 포유동물에 대하여 투여에 따라 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에는 항체 생산능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아주반트나 불완전 프로인트 아주반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 2 ∼ 6 주마다 1 회씩, 총 2 ∼ 10 회 정도 실시된다. 사용되는 포유동물로서는 예컨대 원숭이, 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 들 수 있으나 마우스 및 래트가 바람직하게 사용된다.
모노클로날 항체 생산 세포의 제조시에는 항원으로 면역된 온혈동물, 예컨대 마우스로부터 항체가를 알 수 있는 개체를 선택하여 최종 면역의 2 ∼ 5 일 후에 비장 또는 림프절을 채취하고, 이들에 포함된 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써, 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 제조할 수 있다. 항혈청 중의 항체가의 측정은 예컨대 후술하는 표지화 TGR-1 과 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써 실시할 수 있다. 융합 조작은 이미 알려진 방법, 예컨대 켈러와 밀스타인의 방법 [Nature, 256, 495 (1975)] 에 따라 행할 수 있다. 융합 촉진제로서는 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이나 센다이 바이러스 등을 들 수 있으나 바람직하게는 PEG 가 사용된다.
골수종 세포로서는 예컨대 NS-1, P3U1, SP2/0 등을 들 수 있으나 P3U1 이 바람직하게 사용된다. 사용되는 항체 생산 세포 (비장 세포) 수와 골수종 세포수의 바람직한 비율은 1:1 ∼ 20:1 정도이고, PEG (바람직하게는 PEG 1000 ∼ PEG 6000) 가 10 ∼ 80% 정도의 농도로 첨가되고, 약 20 ∼ 40℃, 바람직하게는 약 30 ∼ 37℃ 에서 약 1 ∼ 10 분간 인큐베이트함으로써 효율적으로 세포 융합을 실시할 수 있다.
모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝에는 여러 방법을 사용할 수 있으나, 예컨대 TGR-1 항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상 (예, 마이크로플레이트) 에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고, 이어서 방사성 물질이나 효소 등으로 표지 항면역 글로불린 항체 (세포 융합에 사용되는 세포가 마우스인 경우 항마우스 면역 글로불린 항체가 사용됨) 또는 프로테인A 를 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린 항체 또는 프로테인A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고 방사성 물질이나 효소 등으로 표지 TGR-1 을 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법 등을 들수 있다.
모노클로날 항체의 선별은 자체 공지 또는 이에 준하는 방법에 따라 행할 수 있으나, 통상적으로는 HAT (히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 첨가한 동물세포용 배지 등에서 행할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는 하이브리도마를 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 사용해도 된다. 예컨대, 약 1 ∼ 20%, 바람직하게는 약 10 ∼ 20% 소 태아 혈청을 포함한 RPMI 1640 배지, 약 1 ∼ 10% 소 태아 혈청을 포함한 GIT 배지 (와코쥰야쿠 공업 (주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛스이 제약 (주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 약 20 ∼ 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. 배양시간은 통상 5 일 ∼ 3 주일, 바람직하게는 1 주일 ∼ 2 주일이다. 배양은 통상 5% 탄산 가스하에서 행할 수 있다. 하이브리도마 배양 상청액의 항체가는 상기 항혈청 중의 항체가의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다.
(b) 모노클로날 항체의 정제
모노클로날 항체의 분리 정제는 통상적인 폴리클로날 항체의 분리 정제와 동일하게 면역 글로불린의 분리 정제법 [예, 염석법, 알콜침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환체 (예, DEAE) 에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔 여과법, 항원결합고상 또는 프로테인 A 또는 프로테인 G 등의 활성흡착제에 의해 항체만 채취하고 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법] 에 따라 실시할 수 있다.
[폴리클로날 항체의 제조]
본 발명의 폴리클로날 항체는 그 자체 공지 또는 이에 준하는 방법에 따라제조할 수 있다. 예컨대, 면역 항원 (TGR-1 항원) 과 캐리어 단백질의 복합체를 제조하여 상기 모노클로날 항체의 제조법과 마찬가지로 포유동물을 면역시키고, 이 면역동물로부터 TGR-1 에 대한 항체 포함물을 채취하여 항체를 분리 정제함으로써 제조할 수 있다.
포유동물을 면역시키기 위해서 사용되는 면역 항원과 캐리어 단백질의 복합체에 관하여, 캐리어 단백질의 종류 및 캐리어와 햅텐의 혼합비는 캐리어에 가교시켜 면역시킨 햅텐에 대하여 항체를 효율적으로 할 수 있으면 어떠한 것을 어떠한 비율로 가교시켜도 되지만, 예컨대 소 혈청 알부민이나 소 사일로글로불린, 키홀 림펫 헤모시아닌 등을 중량비로 햅텐 1 에 대하여 약 0.1 ∼ 20, 바람직하게는 약 1 ∼ 5 의 비율로 커플링시키는 방법이 사용된다.
또한, 햅텐과 캐리어의 커플링에는 각종 축합체를 사용할 수 있으나, 글루타르알데히드나 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르, 티올기, 디티올피리딜기를 포함한 활성 에스테르 시약 등이 사용된다.
축합 생성물은 온혈동물에 대하여 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생산능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 아주반트나 불완전 프로인트 아주반트를 투여해도 된다. 투여는 통상 약 2 ∼ 6 주마다 1 회씩, 총 약 3 ∼ 10 회 정도 행할 수 있다.
폴리클로날 항체는 상기 방법으로 면역된 온혈동물의 혈액, 복수 등 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다.
항혈청 중의 폴리클로날 항체가의 측정은 상기 항혈청 중의 항체가의 측정과동일하게 하여 측정할 수 있다. 폴리클로날 항체의 분리 정제는 상기 모노클로날 항체의 분리 정제와 동일한 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라 실시할 수 있다.
상기 본 발명의 항체는 TGR-1 을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 TGR-1 의 정량, 특히 샌드위치 면역측정법에 의한 정량 등에 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 예컨대 (ⅰ) 본 발명의 항체와 피검액 및 표지화 TGR-1 을 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합된 표지화 TGR-1 의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 TGR-1 의 정량법,
(ii) 피검액과 담체 상에 불용화된 본 발명의 항체 및 표지화된 본 발명의 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체 상의 표지제 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 TGR-1 의 정량법을 제공한다.
상기 (ⅱ) 에서는 일측 검체가 TGR-1 의 N 단부를 인식하는 항체이고, 타측 항체가 TGR-1 의 C 단부에 반응하는 항체인 것이 바람직하다.
TGR-1 에 대한 모노클로날 항체 (이하, 본 발명의 모노클로날 항체라고 칭함) 를 사용하여 TGR-1 의 측정을 할 수 있는 것 이외에 조직 염색 등에 따라 검출할 수도 있다. 이들 목적에는 항체 분자 그 자체를 사용해도 되고, 또한 항체 분자의 F(ab')2, Fab' 또는 Fab 분획을 사용해도 된다. TGR-1 에 대한 항체를 사용하는 측정법은 특별히 제한되지 않고, 피측정액 중의 항원량 (예컨대, TGR-1 량) 에 대응한 항체, 항원 또는 항체-항원 복합체의 양을 화학적 또는 물리적 수단에 의해 검출되고, 이것을 이미 알려진 양의 항원을 포함한 표준액을 사용하여 제조한 표준곡선에서 산출하는 측정법이면 어떠한 측정법을 이용해도 된다. 예컨대, 네프로메트리, 경합법, 이뮤노메트릭법 및 샌드위치법이 바람직하게 사용되지만, 감도, 특이성이라는 면에서 후술하는 샌드위치법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
표지물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지제로서는 예컨대 방사성 동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용된다. 방사성 동위원소로서는 예컨대 [125I], [131I], [3H], [14C] 등이 사용된다. 상기 효소로서는 안정되고 비활성이 큰 것이 바람직하고, 예컨대 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산탈수소효소 등이 사용된다. 형광물질로서는 예컨대 플루오레스카민, 플루오레센 이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광물질로서는 예컨대 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 항체 또는 항원과 표지제의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용할 수도 있다.
항원 또는 항체의 불용화에 있어서는 물리흡착을 사용해도 되고 또한 통상 단백질 또는 효소 등을 불용화, 고정화시키기에 사용되는 화학결합을 이용하는 방법이어도 된다. 담체로서는 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용성다당류, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지 또는 유리 등이 사용된다.
샌드위치법에서는 불용화된 본 발명의 모노클로날 항체에 피검액을 반응시키고 (1 차 반응), 다시 표지화된 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시킨 (2 차 반응) 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정함으로써, 피검액 중의 TGR-1 을 정량할 수 있다. 1 차 반응과 2 차 반응은 반대 순서로 실시해도 또한 동시에 실시해도 되고, 시간을 어긋나게 실시해도 된다. 표지화제 및 불용화의 방법은 상기한 것들에 준하여 실시할 수 있다.
또, 샌드위치법에 의한 면역측정법에서 고상용 항체 또는 표지용 항체에 사용되는 항체는 반드시 1 종류일 필요는 없고, 측정감도를 향상시키는 등의 목적으로 2 종류 이상의 항체의 혼합물을 사용해도 된다.
본 발명의 샌드위치법에 의한 TGR-1 의 측정법에서는 1 차 반응과 2 차 반응에 사용되는 본 발명의 모노클로날 항체는 TGR-1 이 결합되는 부위가 상이한 항체가 바람직하게 사용된다. 즉, 1 차 반응 및 2 차 반응에 사용되는 항체는 예컨대 2 차 반응에서 사용되는 항체가 TGR-1 의 C 단부를 인식하는 경우, 1 차 반응에서 사용되는 항체는 바람직하게는 C 단부 이외에, 예컨대 N 단부를 인식하는 항체가 사용된다.
본 발명의 모노클로날 항체를 샌드위치법 이외의 측정시스템, 예컨대 경합법, 이뮤노메트릭법 또는 네프로메트리 등에 사용할 수 있다. 경합법에서는 피검액 중의 항원과 표지 항원을 항체에 대하여 경합적으로 반응시킨 후, 미반응 표지항원 (F) 와 항체와 결합한 표지항원 (B) 를 분리하고 (B/F 분리), B, F 중 어느 하나의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다. 본 반응법에는 항체로서 가용성 항체를 사용하며 B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한제 2 항체 등을 사용하는 액상법 및 제 1 항체로서 고상화 항체를 사용하거나 또는 제 1 항체는 가용성의 것을 사용하며 제 2 항체로서 고상화 항체를 사용하는 고상화법이 이용된다.
이뮤노메트릭법에서는 피검액 중의 항원과 고상화 항원을 일정량의 표지화 항체에 대하여 경합 반응시킨 후, 고상과 액상을 분리하거나 또는 피검액 중의 항원과 과잉량의 표지화 항체를 반응시키고, 이어서 고상화 항원을 첨가하고 미반응 표지화 항체를 고상으로 결합시킨 후 고상과 액상을 분리한다. 이어서, 어느 하나의 상의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다.
또, 네프로메트리에서는 겔내 또는 용액 중에서 항원 항체 반응의 결과 발생된 불용성 침강물의 양을 측정한다. 피검액 중의 항원량이 아주 적어 소량의 침강물 밖에 얻을 수 없는 경우에도, 레이저의 산란을 이용하는 레이저 네프로메트리 등이 바람직하게 사용된다.
이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정방법에 적용함에 있어서는 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않게 된다. 각각의 방법에서의 통상 조건, 조작법에 당업자가 통상적인 기술적 배려를 하여 TGR-1 의 측정계를 구축하면 된다. 이들 일반적인 기술수단의 상세함에 대해서는 총설, 도서 등을 참조할 수 있다 [예컨대, 이리에 히로시 저 「라디오 이뮤노 어세이」(코우단사, 1974년 발행), 이리에 히로시 저 「속 라디오 이뮤노 어세이」(코우단사, 1979년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(이가쿠쇼잉, 1978년 발행), 이시까와 에이지 외 편 「효소면역 측정법」(제 2 판) (이가쿠쇼잉, 1982년 발행), 이시까와에이지 외 편 「효소면역 측정법」(제 3 판) (이가쿠쇼잉, 1987년 발행), 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 동서 Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 동서 Vol.74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 동서 Vol.84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), 동서 Vol.92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동서 Vol.121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹 프레스사 발행) 등 참조].
이상과 같이 하여 본 발명의 항체를 사용함으로써 TGR-1 을 감도좋게 정량할 수 있다.
또, 본 발명의 항체를 사용하여 생체 내에서의 TGR-1 을 정량함으로써, TGR-1 의 기능 부전에 관련된 각종 질환의 진단을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 체액이나 조직 등과 같은 피검체 중에 존재하는 TGR-1 을 특이적으로 검출하기 위해서 사용할 수 있다. 또, TGR-1 을 정제하기 위해서 사용되는 항체 칼럼의 제조, 정제시의 각 분획 중의 TGR-1 의 검출, 피검 세포내의 TGR-1 의 거동 분석 등을 위해서 사용할 수 있다.
본 명세서 및 도면에서 염기나 아미노산 등을 약칭으로 표시하는 경우 IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature 에 의한 약칭 또는 당해 분야에서 관용되는 약칭에 의거한 것으로, 그 예를 다음에 기재한다. 또, 아미노산에 관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우에는 특히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.
DNA: 데옥시리보핵산
cDNA: 상보적 데옥시리보핵산
A: 아데닌
T: 티민
G: 구아닌
C: 시토신
Y: 티민 또는 시토신
N: 티민, 시토신, 아데닌 또는 구아닌
R: 아데닌 또는 구아닌
M: 시토신 또는 아데닌
W: 티민 또는 아데닌
S: 시토신 또는 구아닌
RNA: 리보핵산
mRNA: 메신저 리보핵산
dATP: 데옥시아데노신 3 인산
dTTP: 데옥시티미딘 3 인산
dGTP: 데옥시구아노신 3 인산
dCTP: 데옥시시티딘 3 인산
ATP: 아데노신 3 인산
EDTA: 에틸렌디아민 4 아세트산
SDS: 도데실황산나트륨
TFA: 트리플루오로아세트산
EIA: 효소 면역분석
Gly 또는 G: 글리신
Ala 또는 A: 알라닌
Val 또는 V: 밸린
Leu 또는 L: 류신
Ile 또는 I: 이소류신
Ser 또는 S: 세린
Thr 또는 T: 트레오닌
Cys 또는 C: 시스테인
Met 또는 M: 메티오닌
Glu 또는 E: 글루타민산
Asp 또는 D: 아스파라긴산
Lys 또는 K: 리신
Arg 또는 R: 아르기닌
His 또는 H: 히스티딘
Phe 또는 F: 페닐알라닌
Tyr 또는 Y: 티로신
Trp 또는 W: 트립토판
Pro 또는 P: 프롤린
Asn 또는 N: 아스파라긴
Gln 또는 Q: 글루타민
pGlu: 피로글루타민산
Me: 메틸기
Et: 에틸기
Bu: 부틸기
Ph: 페닐기
TC: 티아졸리딘-4(R)-카르복사미드기
Bom: 벤질옥시메틸
NMP: N-메틸피롤리돈
PAM: 페닐아세트아미드메틸
또한, 본 명세서 중에서 자주 사용되는 치환기, 보호기 및 시약을 아래와 같은 기호로 표기한다.
Tos: p-톨루엔술포닐
HONB: N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드
Bzl: 벤질
Z: 벤질옥시카르보닐
Br-Z: 2-브로모벤질옥시카르보닐
Cl-Z: 2-클로로벤질옥시카르보닐
Boc: t-부틸옥시카르보닐
HOBt: 1-히드록시벤즈트리아졸
DCC: N,N'-디시클로헥실카르보디이미드
TFA: 트리플루오로아세트산
Fmoc: N-9-플루오레닐메톡시카르보닐
DNP: 디니트로페닐
Bum: t-부톡시메틸
Trt: 트리틸
BSA: 소 혈청 알부민
CHAPS: 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판 술포네이트
PMSF: 페닐메틸술포닐플루오리드
E64: (L-3-트랜스-카르복시이란-2-카르보닐)L-류실-아구마틴
GDP: 구아노신-5'-2 인산
MEMα: 최소 필수배지 알파
Fura-2AM: 1-[6-아미노-2-(5-카르복시-2-옥사졸릴)-5-벤조푸라닐옥시]-2-(2-아미노-5-메틸페녹시)-에탄-N,N,N',N'-4 아세트산펜타아세톡시메틸에스테르
HBSS: 행크스 평형 염액
Fluo-3AM: 1-[2-아미노-5-(2,7-디클로로-6-히드록시-3-옥시-9-크산테닐)페녹시]-2-(2-아미노-5-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-4아세트산펜타아세톡시메틸에스테르
HEPES: 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산
MeBzl: 4-메틸벤질
NMP: N-메틸피롤리돈
본원 명세서의 서열표의 서열번호는 다음 서열을 나타낸다.
[서열번호: 1]
실시예 1 에서 얻은 TGR-1 의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 2]
실시예 1 에서 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 TGR-1 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호: 3]
실시예 1 에 기재된 프라이머 1 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호: 4]
실시예 1 에 기재된 프라이머 2 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호: 5]
돼지형 뉴로메딘 U-8 을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 6]
개형 뉴로메딘 U-8 을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 7]
닭형 뉴로메딘 U-9 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 8]
모르모트형 뉴로메딘 U-9 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 9]
래트형 뉴로메딘 U-23 을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 10]
개구리형 뉴로메딘 U-23 을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 11]
인간형 뉴로메딘 U-25 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 12]
돼지형 뉴로메딘 U-25 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 13]
개형 뉴로메딘 U-25 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 14]
닭형 뉴로메딘 U-25 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 15]
개구리형 뉴로메딘 U-25 를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 16]
뉴로메딘 U-25 의 부분 펩티드를 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 5 로 표시되는 아미노산 서열의 4 번째 내지 8 번째의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 17]
TGR-1 과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 나타낸다 (WO99/55732 호에 기재된 것).
[서열번호: 18]
서열번호: 23 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다 (WO99/55732 호에 기재된 것).
[서열번호: 19]
실시예 3 에서 사용된 프라이머 RTGRF2 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호: 20]
실시예 3 에서 사용된 프라이머 RTGRR1 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호: 21]
실시예 3 에서 얻은 래트형 TGR-1 을 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호: 22]
래트형 TGR-1 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
후술하는 실시예 1 에서 얻은 서열번호: 1 로 표시되는 TGR-1 을 코딩하는 cDNA 를 갖는 형질전환체 대장균 TOP10/pCR2.1 TOPO-TGR1 은 1999 년 12 월 6 일부터 일본 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-3, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6964 로서, 1999 년 11 월 12 일부터 일본 오사카후 오사카시 요도가와쿠 주산본마치 2-17-85, 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16336 으로서 기탁되어 있다.
후술하는 실시예 3 에서 서열번호: 21 로 표시되는 TGR-1 을 코딩하는 cDNA를 갖는 형질전환체 대장균 JM109/prTGR-1 은 2000 년 11 월 9 일부터 일본 이바라기껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-3, 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7355 로서, 2000 년 10 월 24 일부터 일본 오사카후 오사카시 요도가와쿠 주산본마치 2-17-85, 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16488 로서 기탁되어 있다.
본 발명은 인간 정소 및 래트 자궁 유래의 신규 수용체 단백질인 TGR-1, TGR-1 을 코딩하는 DNA, TGR-1 과 뉴로메딘 U (Minamino, N. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 제 130 권, 1078-1085 페이지, 1985 년 등) 또는 그 유도체 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 고혈압증, 스트레스성 질환 등의 예방ㆍ치료약 또는 식욕조절제 등의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
이하, 실시예를 나타나며 본 발명을 더욱 상세하게 설명하겠으나, 이들은 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1TGR-1 을 코딩하는 cDNA 의 클로닝과 염기 서열의 결정
인간 정소 cDNA (Marathon-ReadyTMcDNA ; Clontech사) 를 주형으로 하고, 2 개의 프라이머, 프라이머 1 (서열번호: 3) 및 프라이머 2 (서열번호: 4) 를 사용하여 PCR 을 행한다. PCR 반응에는 Advantage 2 Polymerase Mixture (Clontech사) 를 사용하고, ① 95℃ 1 분 후, ② 95℃ 30 초, 68℃ 2 분을 5 회, ③ 95℃ 30 초, 64℃ 30초, 68℃ 2 분을 5 회, ④ 95℃ 30 초, 62℃ 30 초, 68℃ 2 분을 30 회 후, ⑤ 68℃ 7 분의 신장 반응을 행한다. 반응 후 반응산물을 TA 클로닝 키트 (Invitrogen사) 의 처방에 따라 플라스미드 벡터 pCR2.1 TOPO (Invitrogen사) 로 클로닝한다. 이것을 대장균 TOP10 에 도입하고, 플라스미드를 갖는 클론을 앰피실린을 포함한 LB 한천배지 중에서 선택한다. 개개의 클론 서열을 해석한 결과, TGR-1 (서열번호: 1) 을 코딩하는 cDNA 의 염기 서열 (서열번호: 2) 을 얻는다.
실시예 2TGR-1 발현 CHO 세포 및 mock CHO 세포에 대한 뉴로메딘 U-8 의 반응성의 사이트센서에 의한 비교
실시예 1 에서 얻은 TGR-1 을 코딩하는 cDNA 를 사용하고, 자체 공지된 방법에 준하여 제조한 TGR-1 발현 CHO 세포 및 mock CHO 세포를 사이트센서용 캡슐에 2.7 ×105세포/웰 밀도로 파종하고 하룻밤 배양한다. 세포가 들어 있는 캡슐을 사이트센서에 세팅하고, 0.1% 소 혈청 알부민을 첨가한 저완충 RPMI1640 배지를 환류시키면서 세포를 순화시킨다. 사이트센서로 펌프의 ON (80 초간)ㆍOFF (40 초간) 를 1 사이클로 하여 반복적으로 행하고, 펌프가 정지되어 있는 동안의 세포밖 pH 의 변화율을 산성화 속도로서 시간 경과에 따라 측정한다. 이 배지에 돼지형 뉴로메딘 U-8 (BACHEM사, H-5505, 서열번호: 5) 을 용해시키고, 단계적으로 희석한 것을 사이트센서의 유로계의 전환에 의해 세포에 7 분 2 초간 노출시킨다. 반응하는 피크의 값에 대하여 샘플이 세포에 노출되기 직전의 3 사이클의 평균값을 100% 로 하여 환산 비교한 결과, TGR-1 발현 CHO 세포는 특이적이고 농도 의존적으로 뉴로메딘 U 에 반응하는 것을 발견하였다 (도 1).
실시예 3래트형 TGR-1 을 코딩하는 cDNA 취득
래트형 TGR-1 을 코딩하는 cDNA 의 전체길이를 코딩하는 단편 취득을 위해서 다음 2 종류의 DNA 를 합성한다.
RTGRF2: 5'-CTGATGCTATCCTTTCACTCTCTCAGACC-3' (서열번호: 19)
RTGRR1: 5'-TCCTTGCAGTTTTGGCACATAGATGGA-3' (서열번호: 20)
이들 합성 DNA, RTGRF2 및 RTGRR1 을 프라이머로 사용하고, 래트 자궁 poly(A)+RNA 에서 합성한 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 을 행하여 전체길이를 코딩하는 단편을 증폭시킨다. PCR 의 반응액은 cDNA 용액 2㎕ (8ng poly(A)+RNA 유래), 1㎕ dNTPs (10mM), 0.5㎕ Advantage2 DNA polymerase (Clontech사), 2.5㎕ Advantage2 DNA polymerase 에 첨부되어 있는 10 ×완충액, 18㎕ 증류수, 그리고 합성 DNA RTGRF2 와 RTGRR1 (각 10μM) 을 0.5㎕ 씩 첨가하여 합계 25㎕ 로 한다. 이 반응액은 94℃ 2 분의 변성 후 98℃ 10 초, 68℃ 90 초의 사이클을 31 회 반복하는 PCR 반응을 행한다. 전기영동으로 확인된 약 1.4kb 의 PCR 산물을 QIA quick Gel Extraction Kit (Quiagen사) 를 사용하여 정제하고, TA cloning kit (Invitrogen사) 의 매뉴얼에 따라 클로닝 벡터 pCR2.1 TOPO 로 삽입, 대장균 JM109 에 도입하여 형질전환체 E.coli JM109/prTGR-1 을 얻는다. 이 플라스미드 prTGR- 에 삽입되어 있는 염기 서열을 규정하고 (서열번호: 22), 여기에서 코딩되는 래트형 TGR-1 의 예측되는 아미노산 서열을 서열번호: 21 로 나타낸다.
또, 실시예 1 에 나타낸 인간형 서열 (서열번호: 1) 과의 비교를 도 2 에 나타낸다.
본 발명의 뉴로메딘 U 및 TGR-1 을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴로메딘 U 와 TGR-1 의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법은 비만증,고혈압증, 스트레스성 질환 등의 예방ㆍ치료약 등을 스크리닝하기 위해서 사용할 수 있다. TGR-1 작동제는 비만증 등의 예방ㆍ치료약으로 유용하고, TGR-1 길항제는 고혈압증, 스트레스성 질환 등의 예방ㆍ치료약으로 유용하다.

Claims (13)

  1. 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염, 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법.
  2. 뉴로메딘 U 또는 그 유도체 또는 그 염, 및 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트.
  3. 제 1 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 2 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어질 수 있는, 뉴로메딘 U 또는 그 염과, 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그 염과의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염.
  4. 제 3 항에 기재된 화합물 또는 그 염을 포함하여 이루어지는 의약.
  5. 제 4 항에 있어서, 비만증, 고혈압증 또는 스트레스성 질환의 예방ㆍ치료약인 의약.
  6. 뉴로메딘 U 가 서열번호: 11 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인 제 1 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 2 항에 기재된 스크리닝용 키트.
  7. 서열번호: 1 또는 서열번호: 21 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염.
  8. 제 7 항에 기재된 단백질을 코딩하는 DNA 를 포함하는 DNA.
  9. 제 8 항에 있어서, 서열번호: 2 또는 서열번호: 22 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA.
  10. 제 8 항에 기재된 DNA 를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제 10 항에 기재된 재조합 벡터로 형질전환시킨 형질전환체.
  12. 제 11 항에 기재된 형질전환체를 배양하고 제 7 항에 기재된 단백질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 제 7 항에 기재된 단백질 또는 그 염의 제조법.
  13. 제 7 항에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 항체.
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