FR2687680A1 - Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. - Google Patents
Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. Download PDFInfo
- Publication number
- FR2687680A1 FR2687680A1 FR9201939A FR9201939A FR2687680A1 FR 2687680 A1 FR2687680 A1 FR 2687680A1 FR 9201939 A FR9201939 A FR 9201939A FR 9201939 A FR9201939 A FR 9201939A FR 2687680 A1 FR2687680 A1 FR 2687680A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- labeling reagent
- reagent
- acylation
- amino
- peptides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 OC1*C*CC1 Chemical compound OC1*C*CC1 0.000 description 2
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/085—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being neurotensin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/006—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length of peptides containing derivatised side chain amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
L'invention a pour objet un procédé de fixation d'un groupement marqueur sur un peptide, consistant à acyler la fonction alpha aminée du peptide par un réactif de marquage comportant une fonction carboxylique activée, à un pH compris entre environ 7,5 et 5,5. La fonction carboxylique du réactif de marquage est avantageusement activée sous la forme d'un ester de N-hydroxysuccinimide; le réactif de marquage peut être en particulier le réactif de Bolton-Hunter.
Description
PROCEDE DE MARQUAGE DE PROTEINES ET DE
PEPTIDES PAR ACYLATION DE LEUR FONCTION A AMINE PAR UN
REACTIF COMPORTANT UNE FONCTION CARBOXYLIQUE ACTIVEE.
PEPTIDES PAR ACYLATION DE LEUR FONCTION A AMINE PAR UN
REACTIF COMPORTANT UNE FONCTION CARBOXYLIQUE ACTIVEE.
La présente invention concerne le domaine du marquage de molécules dotées d'activité biologique et plus particulièrement des protéines, polypeptides et peptides. L'analyse biochimique et pharmacologique de molécules dotées d'activité biologique nécessite de disposer d'analogues repérables de ces molécules. Ces analogues sont notamment indispensables à l'étude biochimique des cibles des effecteurs biologiques.
Ce marquage peut être réalisé à l'aide d'un traceur radioactif comme l'iode 125, ou à l'aide d'une enzyme comme la peroxydase, d'un marqueur fluorescent comme la fluorescéine, ou encore avec un ligand comme la biotine.
Le marquage par l'iode 125 constitue la méthode la plus utilisée pour radiomarquer des peptides et des protéines. En effet, l'iode 125 présente un coût réduit, une radioactivité suffisamment énergétique pour être facilement mesurable sans être trop ionisante, et ses méthodes d'incorporation sont relativement simples à mettre en oeuvre. On peut distinguer deux types de techniques pour le marquage par l'iode 125. D'une part, l'incorporation de l'iode 125 au niveau d'une tyrosine ou d'une histidine grâce à un agent oxydant tel que la chloramine T, l'iodogen ou la lactoperoxydase; d'autre part, par l'intermédiaire d'un réactif de marquage tel que le réactif de Bolton-Hunter (Bolton A. E. , Hunter
W. E., 1973, Biochemical Journal 133, 529-539).
W. E., 1973, Biochemical Journal 133, 529-539).
Le réactif de Bolton-Hunter ou Nsuccinimidyl 3-(4-hydroxyphényl) propionate, une fois iodé à l'iode 125, est un moyen indirect de radiomarquer les molécules possédant une ou plusieurs amines primaires. Le N-succinimidyl 3-(4-hydroxyphényl) propionate n'est en fait qu'une tyrosine dépourvue de fonction a aminée, dont on a activé la fonction carboxylique sous la forme d'un ester de Nhydroxysuccinimide. Le réactif de Bolton-Hunter est avantageusement utilisé lorsque les acides aminés tyrosine et histidine sont absentes, ou lorsque ces deux acides aminés sont cruciales pour l'activité biologique, ou encore lorsque les conditions oxydantes du marquage direct sont néfastes, notamment en raison de l'oxydation des méthionines qui sont généralement nécessaires à l'activité biologique.
Les protéines et peptides sont susceptibles de porter deux types de fonction aminée. D'une part la fonction a aminée de l'acide aminé en position Nterminale, et d'autre part, la fonction àminée de la chaîne latérale du ou des résidus lysine éventuellement présents dans la séquence peptidique.
Un certain nombre de peptides ont été marqués par l'iode 125 à l'aide du réactif de Bolton
Hunter : la substance P (voir à ce sujet les références 2 et 3), le neuropeptide Y (voir à ce sujet la référence 4), l'élédoisine (voir à ce sujet les références 5 et 6), la neurokinine A (voir à ce sujet la référence 7) et la kassinine (voir à ce sujet la référence 8).
Hunter : la substance P (voir à ce sujet les références 2 et 3), le neuropeptide Y (voir à ce sujet la référence 4), l'élédoisine (voir à ce sujet les références 5 et 6), la neurokinine A (voir à ce sujet la référence 7) et la kassinine (voir à ce sujet la référence 8).
Toutefois, il n'a pu être mis en évidence que le dérivé substitué sur la fonction Eaminée de la lysine et jamais sur l'extrémité aaminée. On observe une incorporation très faible sur la fonction aaminée uniquement lorsque les peptides sont dépourvus de lysine.
Il semble donc que la réactivité de la fonction laminée soit très supérieure à celle de la fonction aaminée. Cette différence de réactivité entre les deux fonctions aminées tient probablement d'une part à la valeur du pK de l'amine primaire etr d'autre part, à la différence de réactivité intrinsèque de chacune des fonctions aminées. La réactivité intrinsèque est liée à la différence d'environnement électronique du doublet de l'amine primaire; en effet, dans la fonction aaminée, le doublet est proche de la liaison peptidique, alors que dans la fonction aminée, le doublet est séparé de la liaison peptidique par la chaîne carbonée latérale de la lysine.
L'inconvénient majeur du marquage à l'aide du réactif de Bolton-Hunter réside dans le fait que la réaction d'acylation est conduite en milieu aqueux, et qu'en conséquence on observe une hydrolyse rapide dans l'eau, de l'ester de N-hydroxysuccinimide destiné à réagir avec l'amine primaire. Le rendement de la réaction est donc faible, particulièrement lorsque la séquence peptidique ne comporte pas de lysine, car le réactif s'hydrolyse avant d'avoir pu réagir avec le peptide.
Le problème de l'hydrolyse a été résolu en se plaçant en milieu organique mais la différence de réactivité des deux types d'amines primaires n'a pas été réduite. L'incorporation en milieu organique n'a donc été mise en oeuvre qu'avec des peptides ne possédant qu'une fonction a aminée. Par cette méthode ont été marqués le senktide, qui est un analogue de la substance
P, spécifique des récepteurs de type NK3 (voir à ce sujet la référence 9), la CCK8 (voir à ce sujet la référence 10) et la neuromédine B (voir à ce sujet la référence 11).
P, spécifique des récepteurs de type NK3 (voir à ce sujet la référence 9), la CCK8 (voir à ce sujet la référence 10) et la neuromédine B (voir à ce sujet la référence 11).
Le protocole décrit par Bolton et Hunter (voir à ce sujet le référence 1) indique que la réaction d'acylation est effectuée à un pH d'environ 8,5; ce pH est également recommandé par les fournisseurs du réactif qui se réfère aux travaux de Bolton et Hunter. Ce protocole permet de radiomarquer les peptides en milieu aqueux sur la fonction àminée des lysines, et en milieu organique sur l'extrémité aaminée lorsqu'il n'existe pas de lysine.
Les travaux de recherche effectués par les
Inventeurs sur la réactivité des deux types de fonctions aminées présentent au niveau des peptides, les ont conduit à mettre au point un procédé de marquage des peptides ou protéines, à l'aide d'un réactif de marquage portant une un groupe carboxyle activée, permettant
- de choisir la fonction aminée acylée par le réactif de marquage, pour les peptides possédant à la fois une lysine et une extrémité aaminée,
- l'acylation en milieu aqueux des fonctions a aminée pour les peptides ne possédant que ce type d'amine primaire.
Inventeurs sur la réactivité des deux types de fonctions aminées présentent au niveau des peptides, les ont conduit à mettre au point un procédé de marquage des peptides ou protéines, à l'aide d'un réactif de marquage portant une un groupe carboxyle activée, permettant
- de choisir la fonction aminée acylée par le réactif de marquage, pour les peptides possédant à la fois une lysine et une extrémité aaminée,
- l'acylation en milieu aqueux des fonctions a aminée pour les peptides ne possédant que ce type d'amine primaire.
Ce but est atteint en faisant réagir à un pH compris entre environ 7,5 et 5,5 un réactif de marquage comportant une fonction carboxylique activée, avec la fonction aaminée d'un peptide ou d'une protéine.
Le procédé de l'invention est une acylation de l'amine primaire en position N-terminale par la fonction carboxylique activée du réactif de marquage de formule suivante
Dans laquelle
X représente un groupement marqueur;
Y représente le groupe activant la fonction carboxylique de formule
X représente un groupement marqueur;
Y représente le groupe activant la fonction carboxylique de formule
Le schéma général de la réaction d'acylation de l'amine primaire en position N-terminale d'un peptide (R-NH2) par la fonction carboxylique activée du réactif de marquage de formule (I) est donnée ci-après
De manière avantageuse, la fonction carboxyle du réactif de marquage est activée sous la forme d'un ester de N-hydroxysuccinimide; dans la formule (I), Y a alors la signification suivante
La fonction carboxyle du réactif de marquage peut également être activée sous la forme d'un ester de sulfo-N-hydroxysuccinimide; dans la formule (I), Y a alors la signification suivante
Un pH d'environ 6,5 correspond aux conditions de mise en oeuvre du procédé de l'invention favorisant au mieux l'acylation au niveau de l'extrémité a aminée.
Une valeur du pH comprise entre 7,5 et 6,5 permet également, malgré des rendements inférieurs, de favoriser l'acylation au niveau de l'extrémité aminée; ces dernières conditions permettent la préparation des deux analogues d'un peptide possédant à la fois une lysine et une extrémité a aminée. Une valeur de pH comprise entre 7,5 et 8,5 donne lieu à des rendements d'acylation au niveau de l'extrémité a aminée très faible.
Une valeur du pH comprise entre 6,5 et 5,5 favorise également l'acylation au niveau de l'extrémité aaminée mais avec une vitesse de réaction lente. Un pH inférieur à 5,5 peut également favoriser l'acylation au niveau de l'extrémité laminée mais avec une vitesse de réaction très lente qui n'est compensée par aucun avantage.
La fonction carboxylique activée sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide est très utilisée en biochimie, or, toutes les techniques qui utilisent ce réactif préconisent de se mettre dans des conditions de pH basique, lesquelles favorisent l'acylation de la fonction aminée. Le procédé de l'invention permet en se plaçant dans des conditions de pH plus acides d'acyler la fonction a aminée. Il devient ainsi possible de discriminer entre les deux cibles possibles en ne faisant varier que les conditions de pH, et ainsi de doubler les chances d'obtenir un bon analogue.
A titre d'exemple, on peut citer le cas de la neurotensine, pour laquelle le protocole de l'art antérieur ne permettait d'utiliser que la fonction a aminée de la lysine 6 pour introduire un groupement marqueur. Or cette modification diminue l'affinité de la neurotensine par un facteur de 3 à 5. La possibilité d'utiliser la fonction aaminée de la neurotensine 2-13 constitue un progrès considérable. Les inventeurs ont pu ainsi préparé une série d'analogues de la neurotensine qui conservent les caractéristiques de la molécule native car les groupements marqueurs ont été orientés, grâce au procédé de l'invention, vers l'extrémité a aminée.Il a ainsi été synthétisé une neurotensine fluorescente par fixation sur l'extrémité aaminée de la neurotensine 2-13 d'un noyau aminométhylcoumarine, une neurotensine a-biotinylée et des neurotensines photoactivables grâce à l'introduction de groupement marqueur a-azido et a-azido-nitro.
Outre la neurotensine il existe un grand nombre de peptides ou protéines pour lesquels les fonctions Eaminées sont essentielles à l'activité biologique et dont l'étude sera possible grâce à un marquage de la fonction aminée.
Les groupements marqueurs peuvent être radioactifs, fluorescents, photoactivables ou encore du type d'un ligand comme la biotine.
La fixation d'un groupement marqueur de type radioactif sur la fonction laminée d'un peptide, peut être effectuée selon le procédé de l'invention en utilisant comme réactif de marquage le réactif de
Bolton-Hunter mono ou di-iodé à l'iode 125; dans la formule (I), Y correspond alors au groupe Nhydroxysuccinimide et X a la signification suivante
Bolton-Hunter mono ou di-iodé à l'iode 125; dans la formule (I), Y correspond alors au groupe Nhydroxysuccinimide et X a la signification suivante
Le procédé de l'invention mis en oeuvre avec le réactif de Bolton-Hunter permet de radiomarquer par l'iode 125 la fonction aaminée d'un peptide possédant une lysine, alors que la fonction Eaminée apparaît dans l'art antérieur comme la cible privilégié de ce type de réactif.
D'autres réactifs de marquage, tels que le succinimidyl propionate tritié ou encore l'ester succinimidyl de la méthionine marqué au soufre 35, peuvent être utilisés pour un marquage radioactif.
La fixation d'un groupement marqueur de type fluorescent sur la fonction laminée d'un peptide, peut être effectuée selon le procédé de 1 invention en utilisant comme réactif de marquage l'acétate-3méthylcoumarin-4-amino-7-succinimidyle, ou son dérivé sulfoné, de formule suivante
dans laquelle X a la signification suivante
D'autres réactifs de marquage, telles que la
N-hydroxysuccinimidyl fluorescéine ou la Nhydroxysuccinimidyl rhodamine, peuvent être utilisés pour un marquage de type fluorescent.
N-hydroxysuccinimidyl fluorescéine ou la Nhydroxysuccinimidyl rhodamine, peuvent être utilisés pour un marquage de type fluorescent.
La fixation d'un groupement marqueur du type ligand tel que la biotine sur la fonction laminée d'un peptide, peut être effectuée selon le procédé de l'invention en utilisant comme réactif de marquage la Nhydroxysuccinimidobiotine, ou son dérivé sulfoné, de formule suivante
La biotine pourra être conjuguée, conformément aux techniques de l'art antérieur, à un dérivé de l'avidine lui-même marqué.
La fixation d'un groupement marqueur de type photoactivable sur la fonction laminée d'un peptide, peut être effectué selon la procédé de l'invention en utilisant des groupements azido ou azido-nitro ou encore azido salicilique marquable à l'iode 125
Le procédé de l'invention permet, selon la valeur du pH, de choisir la fonction aminée des peptides possédant à la fois une lysine et une extrémité a aminée, acylée par le réactif de marquage; de même, devient possible, l'acylation en milieu aqueux des fonctions aaminée pour les peptides ne possédant que ce type d'amine primaire.
Le procédé de l'invention permet, selon la valeur du pH, de choisir la fonction aminée des peptides possédant à la fois une lysine et une extrémité a aminée, acylée par le réactif de marquage; de même, devient possible, l'acylation en milieu aqueux des fonctions aaminée pour les peptides ne possédant que ce type d'amine primaire.
Les Inventeurs ont ainsi synthétisé deux dérivés de la neuromédine N, qui est un neuropeptide dont il n' existe pas de ligand radioactif; en effet la neuromédine N acylée en aest totalement inactive alors que la neuromédine N acylée en a présente une forte affinité pour le récepteur de ce peptide. D'autres peptides ont été acylés sur la fonction aminée, grâce au procédé de l'invention, comme la leucine-enképhaline, la méthionine-enképhaline, la neurotensine, le DAGO et le DADLE.
Le procédé de l'invention permet également d'orienter le pontage par des agents couplants sur la fonction aaminée de peptides et protéines. Le terme de marquage doit donc être entendu largement, et en conséquence concerne aussi la fixation d'agents couplants comme le disuccinimidyl subérate sur la fonction laminée de peptides. En outre, il existe des supports de chromatographie d'affinité activés à la Nhydroxysuccinimide, sur lesquels le procédé de l'invention permet un greffage sélectif de peptides par leur fonction CL aminée.
Outre les caractéristiques qui précèdent, 1 invention comporte d'autres caractéristiques qui apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples de réalisation et de mise en oeuvre de la présente invention, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications.
I - METHODES
1) Etude analytique de l'acylation par le réactif Bolton-Hunter
a) Préparation des peptides acylés par le réactif de Bolton-Hunter
Les peptides (5 nmoles) sont incubés pendant deux heures avec le réactif de Bolton-Hunter (5 nmoles) dans un volume de 50 fl de tampon borate/phosphate (50 mM/50 mM) tamponné à différents pH. Le volume est porté à 200 Rl par 150 Rl de TFA 0,1 % et injecté sur
HPLC. Le système HPLC phase réverse utilisé est du type C18 lichrocart 250-4 Art 15539 commercialisé par la
Société Merck, en TEA/TFA (0,05 %/0,1 %) avec un gradient de 10 % à 50 % d'acétonitrile en 56 minutes et un débit de 1 ml/minute. Les différents produits de la réaction sont repérés par leur profil de densité optique à 230 nm.
1) Etude analytique de l'acylation par le réactif Bolton-Hunter
a) Préparation des peptides acylés par le réactif de Bolton-Hunter
Les peptides (5 nmoles) sont incubés pendant deux heures avec le réactif de Bolton-Hunter (5 nmoles) dans un volume de 50 fl de tampon borate/phosphate (50 mM/50 mM) tamponné à différents pH. Le volume est porté à 200 Rl par 150 Rl de TFA 0,1 % et injecté sur
HPLC. Le système HPLC phase réverse utilisé est du type C18 lichrocart 250-4 Art 15539 commercialisé par la
Société Merck, en TEA/TFA (0,05 %/0,1 %) avec un gradient de 10 % à 50 % d'acétonitrile en 56 minutes et un débit de 1 ml/minute. Les différents produits de la réaction sont repérés par leur profil de densité optique à 230 nm.
b) Attaque par la leucine aminopeptidase des peptides acylés par le réactif de Bolton-Hunter
Cette technique permet de différencier les peptides dont la fonction aaminée est libre ou bloquée.
Cette technique permet de différencier les peptides dont la fonction aaminée est libre ou bloquée.
Les peptides acylés par le réactif de Bolton-Hunter (10 Wl) sont incubés avec la leucine aminopeptidase (10 Rl, 0,2 mg/ml) dans un volume final de 100 Al en présence d'inhibiteurs d'endopeptidase 24.11 (Phosphoramidon 10-5
M) pendant 1 heure à 370 C. La réaction est arrêtée par l'ajout de 50 Al d'HCl 0,1 N. Les différents essais sont alors injectés en HPLC dans le système précédemment décrit.
M) pendant 1 heure à 370 C. La réaction est arrêtée par l'ajout de 50 Al d'HCl 0,1 N. Les différents essais sont alors injectés en HPLC dans le système précédemment décrit.
2) - Préparation des radioligands : peptides acylés par le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125
500 FCi du réactif de Bolton-Hunter iodés sont séchés par un jet doux d'azote; puis le peptide est ajouté (25 nmoles dans un tampon borate/phosphate 50 mM/50 mM) dans un volume de 30 1 pendant 30 minutes pour pH 8,5; 1 heure pour pH 7,5; 2 heures pour pH 6,5.
500 FCi du réactif de Bolton-Hunter iodés sont séchés par un jet doux d'azote; puis le peptide est ajouté (25 nmoles dans un tampon borate/phosphate 50 mM/50 mM) dans un volume de 30 1 pendant 30 minutes pour pH 8,5; 1 heure pour pH 7,5; 2 heures pour pH 6,5.
le volume est alors porté à 300 Al par de la BSA 0,1 % puis injecté en HPLC. Les produits de l'acylation sont suivis par mesure en continue de la radioactivité et de la densité optique à 230 nm. Ils sont collectés par fraction de 500 W1 et tamponnés par 50 Al de tampon
TRIS/HEPES/BSA (0,3 M/0,3 M/1 %). Tous les radioligands sont dilués dans un tampon TRIS : BSA (50 mM; 0,1 %) et stockés à une radioactivité volumique d' environ 106 cpm/10 Fl, à - 200 C.
TRIS/HEPES/BSA (0,3 M/0,3 M/1 %). Tous les radioligands sont dilués dans un tampon TRIS : BSA (50 mM; 0,1 %) et stockés à une radioactivité volumique d' environ 106 cpm/10 Fl, à - 200 C.
II - RESULTATS
1) Produits de l'acylation par le réactif
Bolton-Hunter non iodé
a) Principe
Les profils de densité optique à 230 nm ont permis d'étudier les résultats de l'acylation par le réactif de Bolton-Hunter de différents peptides à différents pH, afin de mettre en évidence l'orientation de l'acylation sur l'extrémité laminée à pH 6,5 et sur l'extrémité aminée à pH 8,5.
1) Produits de l'acylation par le réactif
Bolton-Hunter non iodé
a) Principe
Les profils de densité optique à 230 nm ont permis d'étudier les résultats de l'acylation par le réactif de Bolton-Hunter de différents peptides à différents pH, afin de mettre en évidence l'orientation de l'acylation sur l'extrémité laminée à pH 6,5 et sur l'extrémité aminée à pH 8,5.
b) Peptide ne possédant qu'une fonction a aminée : la neurotensine
Cet exemple concerne la neurotensine de formule suivante
Cet exemple concerne la neurotensine de formule suivante
Les profils HPLC de la figure 1 montrent l'acylation de la neurotensine par le réactif de Bolton
Hunter à trois pH différents. Les deux pics correspondent respectivement (temps de rétention sur la colonne) au peptide natif (pic n01) et au seul produit d'acylation possible de la neurotensine (pic n02). En effet l'extrémité a aminée étant bloqué sous forme d'acide pyroglutamique, la fonction aminée de la lysine est la seule disponible. On observe que la taille du pic d'acylation (pic n02) varie sensiblement en fonction du pH de l'incubation. La hauteur de ce pic est importante à pH basique et diminue lorsque le milieu est acidifié.
Hunter à trois pH différents. Les deux pics correspondent respectivement (temps de rétention sur la colonne) au peptide natif (pic n01) et au seul produit d'acylation possible de la neurotensine (pic n02). En effet l'extrémité a aminée étant bloqué sous forme d'acide pyroglutamique, la fonction aminée de la lysine est la seule disponible. On observe que la taille du pic d'acylation (pic n02) varie sensiblement en fonction du pH de l'incubation. La hauteur de ce pic est importante à pH basique et diminue lorsque le milieu est acidifié.
Le rendement d'incorporation est donc très bon à pH 8,5, et devient de plus en plus faible lorsque le pH diminue.
Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans les conditions préconisées par Bolton et Hunter.
c) Peptide ne possédant qu'une fonction CL aminée : la Leu-enképhaline
Cet exemple concerne la Leu-enképhaline de formule suivante CLNH-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
Les profils HPLC de la figure 2 montrent l'acylation de la Leu-enképhaline par le réactif de
Bolton-Hunter à trois pH différents. Le premier pic (pic n01) correspond au peptide natif et le second pic (pic n02) au seul produit d'acylation possible. Contrairement au cas de la neurotensine, on observe que le produit d'acylation est plus facilement formé à pH 6,5 qu'il ne l'est à pH plus basique. C'est précisément à ce problème que ce sont heurtées les équipes qui ont tenté de marquer un peptide ne possédant pas de lysine, en travaillant au pH préconisé par Bolton et Hunter.La quantité de produit radioactif formé à pH 8,5 est infime et donc le rendement d'incorporation à ce pH est très mauvais. Ce qui n'est pas le cas à un pH de 6,5.
Cet exemple concerne la Leu-enképhaline de formule suivante CLNH-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
Les profils HPLC de la figure 2 montrent l'acylation de la Leu-enképhaline par le réactif de
Bolton-Hunter à trois pH différents. Le premier pic (pic n01) correspond au peptide natif et le second pic (pic n02) au seul produit d'acylation possible. Contrairement au cas de la neurotensine, on observe que le produit d'acylation est plus facilement formé à pH 6,5 qu'il ne l'est à pH plus basique. C'est précisément à ce problème que ce sont heurtées les équipes qui ont tenté de marquer un peptide ne possédant pas de lysine, en travaillant au pH préconisé par Bolton et Hunter.La quantité de produit radioactif formé à pH 8,5 est infime et donc le rendement d'incorporation à ce pH est très mauvais. Ce qui n'est pas le cas à un pH de 6,5.
d) Peptide possédant une fonction laminée et une fonction laminée : la neurotensine 2-13
Cet exemple concerne la neurotensine 2-13 de formule suivante CLNH-leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu
ENH2
Contrairement à la neurotensine qui possède un résidu pyroglutamique, la neurotensine 2-13 possède une lysine et une extrémité aaminée libre.
Cet exemple concerne la neurotensine 2-13 de formule suivante CLNH-leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu
ENH2
Contrairement à la neurotensine qui possède un résidu pyroglutamique, la neurotensine 2-13 possède une lysine et une extrémité aaminée libre.
Les profils HPLC de la figure 3 montrent l'acylation de la neurotensine 2-13 par le réactif de
Bolton-Hunter à trois pH différents. On observe quatre pics correspondant respectivement au peptide natif, aux deux dérivés monoacétylés et au dérivé diacétylé. La difficulté est d'identifier chacun de ces produits.
Bolton-Hunter à trois pH différents. On observe quatre pics correspondant respectivement au peptide natif, aux deux dérivés monoacétylés et au dérivé diacétylé. La difficulté est d'identifier chacun de ces produits.
Le peptide natif est aisément identifiable par son temps de rétention, il s'agit du premier pic (pic n01). Le dérivé diacétylé correspond au dernier dernier pic (pic n04) car il possède deux résidus BH, résidus qui sont assez hydrophobes. La proportion des pics intermédiaires varie en fonction du pH, ce qui donne un premier élément de réponse; la taille du pic n02 est plus importante que celle du pic n03 à pH 8,5; cette tendance s'atténue à pH 7,5 et s'inverse à pH 6,5.
Ces résultats sont en accord avec ceux observés dans les exemples précédents, lesquels indiquaient une bonne réactivité à pH 6,5 pour les fonctions laminées et une bonne réactivité à pH 8,5 pour les fonctions aminées.
En conséquence, le pic n02 correspond au dérivé aminé et le pic n03 au dérivé aminé. Ces résultats ont été confirmés par des expériences de dégradation par 1 'aminopeptidase.
Une analyse similaire a été réalisée sur d'autres peptides possédant une fonction aminée et une fonction a aminée, telle que la neuromédine et la substance P.
La figure 4 représente les profils HPLC de l'acylation par le réactif de Bolton-Hunter à trois pH différents de la neuromédine de formule suivante
On observe sur la figure 4 quatre pics, le pic n01 correspond au peptide natif, le pic n02 correspond au dérivé examiné, le pic n03 au dérivé a aminé et le pic n04 au dérivé diacétylé.
Pour la substance P, on observe une inversion de l'ordre des temps de rétention des dérivés monoacétylés, le dérivé laminé majoritaire à pH 8,5 a un temps de rétention plus important que le dérivé laminé qui est majoritaire à pH 6,5.
2) Identification des dérivés acylés par le réactif de Bolton-Hunter à l'aide de la leucineaminopeptidase
a) Principe
L'acylation par le réactif de Bolton-Hunter bloque la fonction a aminé du peptide et lui confère ainsi une résistance à la dégradation par une aminopeptidase. L'étude suivante concerne l'effet de la dégradation par la leucine-aminopeptidase des dérivés de leu-enképhaline et de la neurotensine 2-13.
a) Principe
L'acylation par le réactif de Bolton-Hunter bloque la fonction a aminé du peptide et lui confère ainsi une résistance à la dégradation par une aminopeptidase. L'étude suivante concerne l'effet de la dégradation par la leucine-aminopeptidase des dérivés de leu-enképhaline et de la neurotensine 2-13.
La leucine-aminopeptidase a été choisi car elle constitue l'aminopeptidase la moins influencée par la nature de l'acide aminé en position N-terminal. La solution commerciale de leucine-aminopeptidase utilisée dans cette étude étant contaminée par l'endopeptidase 24.11 (voir à ce sujet la référence 12), les incubations ont été réalisées en présence d'une concentration saturante (10 FM) d'un inhibiteur de l'endopeptidase 24.11, le phosphoramidon.
Cette analyse permet la discrimination entre les dérivés acylés sur la fonction aminée, résistants à la dégradation par l'enzyme, et les dérivés acylés sur la fonction aminée, hydrolysée par l'enzyme.
b) Sensibilité de la Leu-enképhaline et de son dérivé acylé par le réactif de Bolton-Hunter à la leucine-aminopeptidase
La figure 5 montre les produits de dégradation par la leucine-aminopeptidase de la Leuenképhaline et de son dérivé acylé par le réactif de
Bolton-Hunter. Le pic n01 correspondant au peptide natif disparaît complètement en présence de l'enzyme alors que le pic n02 correspondant au produit de l'acylation en position an'est absolument pas touché. Comme attendu, la leucine-aminopeptidase dégrade complètement la Leuenképhaline dans les conditions expérimentales utilisées mais est incapable de dégrader le peptide acylé en a, seul produit d'acylation possible de la Leu-enképhaline.
La figure 5 montre les produits de dégradation par la leucine-aminopeptidase de la Leuenképhaline et de son dérivé acylé par le réactif de
Bolton-Hunter. Le pic n01 correspondant au peptide natif disparaît complètement en présence de l'enzyme alors que le pic n02 correspondant au produit de l'acylation en position an'est absolument pas touché. Comme attendu, la leucine-aminopeptidase dégrade complètement la Leuenképhaline dans les conditions expérimentales utilisées mais est incapable de dégrader le peptide acylé en a, seul produit d'acylation possible de la Leu-enképhaline.
c) Sensibilité de la neurotensine 2-13 et de ses dérivés acylés par le réactif de Bolton-Hunter à la leucine-aminopeptidase
La figure 6 montre les produits de dégradation par la leucine-aminopeptidase de la neurotensine 2-13 et de ses dérivés acylés par le réactif de Bolton-Hunter. Les pics n01 et n02 disparaissent en présence de l'aminopeptidase, ce qui signifie que ces deux pics correspondent aux dérivés dont l'extrémité a aminée est libre. Ceci confirme parfaitement les résultats de l'orientation de l'acylation en fonction du pH puisque le pic n02 correspond au dérivé acylé produit majoritairement à pH basique et donc présumé modifié au niveau de la fonction aminée. Le pic n01 correspond au peptide natif qui n'a aucune raison d'être résistant à la dégradation.Les pics nO 3 et n04, par contre, sont intacts confirmant que ce sont les dérivés acylés sur la fonction aminée.
La figure 6 montre les produits de dégradation par la leucine-aminopeptidase de la neurotensine 2-13 et de ses dérivés acylés par le réactif de Bolton-Hunter. Les pics n01 et n02 disparaissent en présence de l'aminopeptidase, ce qui signifie que ces deux pics correspondent aux dérivés dont l'extrémité a aminée est libre. Ceci confirme parfaitement les résultats de l'orientation de l'acylation en fonction du pH puisque le pic n02 correspond au dérivé acylé produit majoritairement à pH basique et donc présumé modifié au niveau de la fonction aminée. Le pic n01 correspond au peptide natif qui n'a aucune raison d'être résistant à la dégradation.Les pics nO 3 et n04, par contre, sont intacts confirmant que ce sont les dérivés acylés sur la fonction aminée.
La différence entre les temps d'élution de ces deux pics vient de la différence d'hydrophobicité entre le produit monoacétylé (pic n03), qui a le temps de rétention le plus court, et le produit diacétylé (pic nO 4). le pic n05 correspond au phosphoramidon.
III - CONCLUSIONS
En utilisant le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125, les inventeurs ont reproduit les mêmes types de résultats, et notamment les analogues radioactifs des peptides suivants ont été préparés
- la Neurotensine 2-13 marquée en a eut espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125,
- la Neuromédine N marquée en a eut espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125,
- la Substance P marquée en a et espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125,
- la Leucine-enképhaline, la Méthionineenképhaline, le DAGO et le DADLE marqués en apar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125.
En utilisant le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125, les inventeurs ont reproduit les mêmes types de résultats, et notamment les analogues radioactifs des peptides suivants ont été préparés
- la Neurotensine 2-13 marquée en a eut espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125,
- la Neuromédine N marquée en a eut espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125,
- la Substance P marquée en a et espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125,
- la Leucine-enképhaline, la Méthionineenképhaline, le DAGO et le DADLE marqués en apar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125.
Outre le rendement très supérieur du procédé de l'invention par rapport à ceux des techniques antérieurs, le bénéfice de la fixation sur l'extrémité a aminée peut se révéler tout à fait exceptionnel en permettant de préparer certains analogues jusqu'alors indisponible. Les inventeurs ont pu synthétiser deux dérivés de la Neuromédine N neuropeptide dont il n'existait pas de ligand radioactif. La Neuromédine N marquée en espar le réactif de Bolton-Hunter iodé à l'iode 125 étant totalement inactif alors que la
Neuromédine N marquée en apar le même réactif présente une forte affinité pour le récepteur de ce peptide.
Neuromédine N marquée en apar le même réactif présente une forte affinité pour le récepteur de ce peptide.
REFERENCE S
1. Bolton A. E., Hunter W. E., 1973,
Biochemical Journal 133, 529-539.
1. Bolton A. E., Hunter W. E., 1973,
Biochemical Journal 133, 529-539.
2. Michelot R., Golzan H, Beaujouan JC,
Besson MJ., Torrens Y, Glowinski J., 1980, Biochemical and Biophysical Research Communication 95 (2), 491-498.
Besson MJ., Torrens Y, Glowinski J., 1980, Biochemical and Biophysical Research Communication 95 (2), 491-498.
3. Liang T., Cascieri M. A., 1980,
Biochemical and Biophysical Research Communication 96 (4), 1793-1799.
Biochemical and Biophysical Research Communication 96 (4), 1793-1799.
4. Chang R. S., Lotti V. J., Chen T. B.,
Cerino D. J., Kling P. J., 1985, Life Sciences 37 (22), 2111-2122.
Cerino D. J., Kling P. J., 1985, Life Sciences 37 (22), 2111-2122.
5. Cascieri M. A., Liang T., 1984, Life
Sciences 35 (2), 179-184.
Sciences 35 (2), 179-184.
6. Beaujouan JC, Torrens Y,Saffroy M.,
Glowinski J., 1984, Molecular Pharmacology 26, 248-254.
Glowinski J., 1984, Molecular Pharmacology 26, 248-254.
7. Buck S. H., Burcher E, Shults DC. W.,
Lowenberg W., O'Donohue T. L., 1984, Science 226, 987989.
Lowenberg W., O'Donohue T. L., 1984, Science 226, 987989.
8. Mantyh P. W., Maggio J. E., Hunt S. P., 1984, European Journal of Pharmacology 102, 361-364.
9. Laufer R, Gilon C, Chorev M, Selinger Z, 1986, Journal of Biological Chemistry 261 (22), 1025710263.
10. Miller L. J., Rosenzweig S. A., Jamieson
J. D., 1981, Journal of Biological Chemistry 256 (23), 12417-12423.
J. D., 1981, Journal of Biological Chemistry 256 (23), 12417-12423.
11. Ladeheim E. E., Timothy H. M., Jensen R.
T., 1991, Methods in Neuroscience (Ed. P. M. Conn) Vol.
5, Neuropeptide Technology, 426-441.
12. Almenoff J., Orlowski M., 1983,
Biochemistry 22, 590-599.
Biochemistry 22, 590-599.
Claims (17)
1) Procédé de fixation d'un groupement marqueur sur un peptide, caractérisé en ce que l'on effectue une acylation de la fonction a aminée du peptide par un reactif de marquage comportant une fonction carboxylique activée, à un pH compris entre environ 7,5 et 5,5.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH est d'environ 6,5.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la fonction carboxylique du réactif de marquage est activée sous la forme d'un ester de N-hydroxysuccinimide ou son dérivé sulfoné.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif de marquage porte un groupement marqueur radioactif.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le réactif de marquage est le Nsuccinimidyl 3-(4-hydroxyphényl) propionate, ou son dérivé sulfoné, mono ou di-iodé à l'iode 125.
6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le réactif de marquage est le succinimidyl propionate tritié.
7) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce le réactif de marquage est l'ester succinimidyl de la méthionine marqué au soufre 35.
8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif de marquage porte un groupement marqueur fluorescent.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le réactif de marquage est 1 'acétate-3-méthylcoumarin-4-amino-7-succinimidyle ou son dérivé sulfoné.
10) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le réactif de marquage est la Nhydroxysuccinimimidyl fluorescéine.
11) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le réactif de marquage est la Nhydroxysuccinimimidyl rhodamine.
12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif de marquage porte un groupement marqueur du type ligand.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le réactif de marquage est la Nhydroxysuccinimidobiotine ou son dérivé sulfoné.
14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé que le réactif de marquage porte un groupement marqueur photoactivable.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le groupement marqueur est un groupement azido ou azido-nitro, ou azido salicilique marquable à l'iode 125.
16) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le réactif de marquage est un agent couplant.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'agent couplant est le disuccinimidyl subérate.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9201939A FR2687680A1 (fr) | 1992-02-20 | 1992-02-20 | Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9201939A FR2687680A1 (fr) | 1992-02-20 | 1992-02-20 | Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2687680A1 true FR2687680A1 (fr) | 1993-08-27 |
Family
ID=9426839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9201939A Pending FR2687680A1 (fr) | 1992-02-20 | 1992-02-20 | Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2687680A1 (fr) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994001451A2 (fr) * | 1992-07-13 | 1994-01-20 | Bionebraska, Inc. | Procede pour la modification de polypeptides recombines |
| EP0744614A2 (fr) | 1995-03-31 | 1996-11-27 | Laboratory of Molecular Biophotonics | Marqueurs du point isoélectrique et leur emploi dans la focalisation isoélectrique à détection par fluorescence |
| EP0752873A1 (fr) * | 1994-02-18 | 1997-01-15 | Mallinckrodt Medical, Inc. | Composes peptidiques marques |
| FR2745576A1 (fr) * | 1996-03-04 | 1997-09-05 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux peptides radioactifs, leur preparation, et leur utilisation pour le test de selection d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline |
| WO1998033531A1 (fr) * | 1997-02-03 | 1998-08-06 | Mallinckrodt Medical, Inc. | Procede servant a detecter et a localiser des tumeurs malignes humaines |
| WO1999009052A1 (fr) * | 1997-08-15 | 1999-02-25 | Amgen Inc. | Modification chimique de proteines pour ameliorer la biocompatibilite et la bioactivite |
| EP1143000A1 (fr) * | 1998-12-28 | 2001-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Methode d'analyse |
| CN110824839A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 信越化学工业株式会社 | 抗蚀剂组合物和图案化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0177023A2 (fr) * | 1984-10-02 | 1986-04-09 | The Calpis Food Industry Co., Ltd. | Composant de complément C1q lié à une substance |
-
1992
- 1992-02-20 FR FR9201939A patent/FR2687680A1/fr active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0177023A2 (fr) * | 1984-10-02 | 1986-04-09 | The Calpis Food Industry Co., Ltd. | Composant de complément C1q lié à une substance |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994001451A2 (fr) * | 1992-07-13 | 1994-01-20 | Bionebraska, Inc. | Procede pour la modification de polypeptides recombines |
| WO1994001451A3 (fr) * | 1992-07-13 | 1994-03-03 | Bionebraska Inc | Procede pour la modification de polypeptides recombines |
| EP1170300A1 (fr) * | 1992-07-13 | 2002-01-09 | Bionebraska, Inc. | Procede pour la modification de polypeptides recombines |
| EP0752873A4 (fr) * | 1994-02-18 | 2002-05-15 | Mallinckrodt Inc | Composes peptidiques marques |
| EP0752873A1 (fr) * | 1994-02-18 | 1997-01-15 | Mallinckrodt Medical, Inc. | Composes peptidiques marques |
| US5866683A (en) * | 1995-03-31 | 1999-02-02 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Isoelectric point markers for isoelectric focusing with fluorescence detection |
| EP0744614A3 (fr) * | 1995-03-31 | 1998-06-10 | Laboratory of Molecular Biophotonics | Marqueurs du point isoélectrique et leur emploi dans la focalisation isoélectrique à détection par fluorescence |
| EP0744614A2 (fr) | 1995-03-31 | 1996-11-27 | Laboratory of Molecular Biophotonics | Marqueurs du point isoélectrique et leur emploi dans la focalisation isoélectrique à détection par fluorescence |
| FR2745576A1 (fr) * | 1996-03-04 | 1997-09-05 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux peptides radioactifs, leur preparation, et leur utilisation pour le test de selection d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline |
| WO1997032897A1 (fr) * | 1996-03-04 | 1997-09-12 | Roussel Uclaf | Peptides radioactifs utiles pour le criblage d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endotheline |
| WO1998033531A1 (fr) * | 1997-02-03 | 1998-08-06 | Mallinckrodt Medical, Inc. | Procede servant a detecter et a localiser des tumeurs malignes humaines |
| WO1999009052A1 (fr) * | 1997-08-15 | 1999-02-25 | Amgen Inc. | Modification chimique de proteines pour ameliorer la biocompatibilite et la bioactivite |
| US6017876A (en) * | 1997-08-15 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity |
| EP1762574A3 (fr) * | 1997-08-15 | 2009-01-07 | Amgen Inc. | Modification chimique de protéines pour améliorer la biocompatibilité et la bioactivité |
| EP1143000A1 (fr) * | 1998-12-28 | 2001-10-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Methode d'analyse |
| EP1143000A4 (fr) * | 1998-12-28 | 2005-01-12 | Takeda Pharmaceutical | Methode d'analyse |
| CN110824839A (zh) * | 2018-08-09 | 2020-02-21 | 信越化学工业株式会社 | 抗蚀剂组合物和图案化方法 |
| US11392034B2 (en) * | 2018-08-09 | 2022-07-19 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Resist composition and patterning process |
| CN110824839B (zh) * | 2018-08-09 | 2023-06-20 | 信越化学工业株式会社 | 抗蚀剂组合物和图案化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hughes et al. | Analysis of growth hormone and lactogenic binding sites cross-linked to iodinated human growth hormone | |
| Press et al. | The N-and c-terminal amino acid sequences of the heavy chain from a pathological human immunoglobulin IgG | |
| EP0093652B1 (fr) | Toxine synthétique ST, son procédé de préparation et son application comme agent vaccinant | |
| SANDBERG et al. | Synthesis and biological properties of enzyme‐resistant analogues of substance P | |
| Slobin et al. | Action of carboxypeptidase-A on bovine insulin: preparation of desalanine-desasparagine-insulin | |
| Krahn et al. | Lima bean trypsin inhibitor. Limited proteolysis by trypsin and chymotrypsin | |
| EP2901160B1 (fr) | Méthode pour détecter spécifiquement dans un echantillon une métalloprotéase matricielle (mmp) d'intérêt uniquement dans sa forme active | |
| Groenen et al. | The carboxy‐terminal lysine of αB‐crystallin is an amine‐donor substrate for tissue transglutaminase | |
| FR2687680A1 (fr) | Procede de marquage de proteines et de peptides par acylation de leur fonction alpha aminee par un reactif comportant une fonction carboxylique activee. | |
| Mitchell et al. | Localisation of light chain and actin binding sites on myosin | |
| Lehman et al. | The FMRFamide-like neuropeptide of Aplysia is FMRFamide | |
| Han et al. | Current developments in chemical cleavage of proteins | |
| EP0451070B1 (fr) | Procédé d'identification ou de dosage de protéines et applications | |
| WO1996031531A2 (fr) | Peptides fluorescent | |
| US6054557A (en) | Fluorescent peptides | |
| Kini et al. | Comparison of amino terminal region of three isoenzymes of phospholipases A2 (TFV PL-Ia, TFV PL-Ib, TFV PL-X) from Trimeresurus flavoviridis (habu snake) venom and the complete amino acid sequence of the basic phospholipase, TFV PL-X | |
| FR2550943A1 (fr) | Vaccin synthetique contre le cholera | |
| Bregman et al. | Synthesis and isolation of a glucagon antagonist | |
| Chrétien et al. | Substrate specificity of the enzyme tonin: cleavage of substance P | |
| US5242680A (en) | Thiol-reactive maleimido-based radiolabeling reagents | |
| CA2070961C (fr) | Reactifs radiomarques a base de maleimide, reagissant avec les thiols | |
| Graf et al. | Human somatotropin. Selective removal with trypsin of residues 135-145 from the hormone molecule with no loss of biological activities. | |
| Fedorova et al. | Covalent chromatography of influenza virus membrane M1 protein on activated thiopropyl Sepharose-6B | |
| Tabarin et al. | Heterogeneity of neuropeptide Y immunoreactivity in patients with pheochromocytoma: influence on the diagnostic power of measuring plasma NPY using antisera with different specificities | |
| Duggleby et al. | A general method for the determination of the carboxyl-terminal sequence of proteins |