CN111443209A - 一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，所述方法包括不分先后的以下步骤：步骤A、确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；步骤B、确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；步骤C、确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；步骤A、B、C全部通过后，认定待测分子为非激动剂型PPARγ配体。

Description

一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及筛选非激动剂型过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体的方法。

背景技术

1.PPARγ及其配体

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属于核激素受体家族中的配体激活受体，控制细胞内许多代谢过程。研究发现，PPARγ对脂质代谢、脂肪形成、细胞分裂和凋亡等多种生物学过程具有调节作用，其与配体的相互作用与肥胖、心血管病、糖尿病、高血压及肿瘤等疾病的发生、发展有密切的关联。

PPARγ的功能域(domain)包括：N-末端活化域(A/Bdomain)，与PPARγ活化抑制相关；DNA结合域(DNA blinding domain，DBD)；铰链域(hinge domain又称Cdomain)，DNA配体与此域结合可影响PPAR活性；配体结合域(ligand blinding domain，LBD)，与配体结合后形成异二聚体，与辅活化子的招募活动和配体依赖性转录激活密切相关。

PPARγ配体按来源不同分为生理性配体和药理性配体，后者与PPARγ结合的特异性较强。通过对糖尿病治疗的研究中发现，噻唑烷二酮(thiazolidinedione，TZDs)类药物是PPARγ较强的药理性功能配体。该类药物称为PPARγ完全激动剂，其代表药为罗格列酮、吡格列酮等。尽管PPARγ完全激动剂有非常有效的疗效，但是在应用过程中发现其副作用显著。由于PPARγ参与多种调节通路，激活PPARγ可以导致体重增加、钠水潴留、心血管损伤以及骨质疏松。随后，对PPARγ的药物研发主要集中在寻找转录活性较弱的PPARγ部分激动剂(例如：INT131、balaglitazone)或PPAR多激动剂(如PPARα/γ、γ/δ双激动剂和PPARα/γ/δ泛激动剂)。不同PPARγ配体与PPARγ结合诱导发生的分子构型改变不同，从而导致辅活化或辅抑制蛋白的结合形式各异，引发不同的体内效能和副作用。

近年来，一种新的化合物SR1664引起研究者的关注。研究发现，该化合物可以特异性结合PPARγ并抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)介导的PPARγ磷酸化水平，进而如完全激动剂一样激活PPARγ调节糖脂代谢的相关功能，同时基本不激活PPARγ的转录活性，因此不会引起类似PPARγ完全激动剂的副作用。该化合物与其它相类似功能的化合物被称为非激动剂型PPARγ配体，是理论上最有药用价值的PPARγ配体，也是目前相关领域的药物筛选与研发的热点。

2.现有的PPARγ结合分子的检测方法及其弊端

1)荧光共振能量转移法(竞争法)

该技术是目前对PPARγ与小分子结合最主要的检测技术。GST-PPARγ-LBD、铽(Tb)标记的GST抗体、Fluormone Pan-PPAR Green与待测分子混合后，室温孵育2小时(h)后检测TR-FRET信号，即检测340nm激发波长、520nm发射波长的荧光值，490nm检测铽信号，通过计算待测分子组与对照组(DMSO)的520nm/490nm比值，获得待测分子的荧光强度。当待测分子为PPARγ配体时，它将与Fluormone Pan-PPAR Green竞争性结合PPARγ，表现为荧光强度降低。该方法操作步骤繁琐、灵敏度不高、重复性差，容易引入大量的检测误差因素。

2)放射性标记法

放射性标记的待测分子与PPARγ结合后过滤分离未结合的分子，通过同位素信号的变化量计算结合分子数量。改进的方法原理也是计量放射性信号变化，偶联的微珠与待筛选的受体相连，当放射性配体与受体结合会激活闪烁剂从而发光。但是这种方法计量误差较大，步骤繁琐。

3)配体诱导复合物法

待测物和PPARγ结合后，通过光谱测定大分子构象的变化，可以测定待测物是否与PPARγ结合。这种检测方法所需时间长，步骤繁琐并且不能进行实时监测。

4)表面等离子共振(SPR)技术

1、以Biacore为代表的SPR技术是近年来发展出的新型检测方法。基本原理为通过共振角的变化反映了金属膜表面溶液物质浓度的变化。将生物大分子偶联在金属膜的表面构建检测芯片，目标化合物分子流经芯片表面，目标化合物分子与大分子结合导致芯片的膜表面的质量增加，从而引起共振角发生变化。通过计量共振角的变化测定分子间结合的数量及时间。由于SPR技术和相关设备灵敏度及精确性的优势，相比于其它PPARγ结合分子检测方法，有一定优势。在当前的研究中，以Biacore为代表的SPR技术最常用的芯片是CM5等检测物直接交联芯片。对于小分子与靶蛋白之间结合的检测，常把靶蛋白之间交联在CM5芯片上(固定相)，再将待测小分子流过芯片(流动相)，检测相互作用产生的响应值(Response Unit，RU值)。利用CM5芯片交联的方法虽然能使用最多剂量的靶蛋白作为固定相，但是其缺点(1)交联过程可能会破坏靶蛋白的天然结构或结合位点；(2)交联后的蛋白会随着时间的延长和检测次数的增加而逐渐减少、变构，甚至完全失活，所以该方法往往只能用于已知的、单一的小分子与靶蛋白之间结合的检测，而很难用于未知的、大样品个数的小分子与靶蛋白之间结合的检测，更难用于靶蛋白结合分子的高通量筛选及小分子结合能力的定量比较。

有人提出了一种优化的SPR方案，采用Anti-His tag芯片或NTA芯片等非交联芯片，以提高对小分子的筛选能力。然而，这种方法在筛选非激动剂型PPARγ配体方面几乎无能为力，发明人根据实验结果进行分析，主要存在以下几个方面的问题：(1)待测小分子分子量小，响应信号弱，干扰大，不确定性高，定量性差；(2)直接交联固定蛋白的方式导致蛋白不稳定，易失活，实际应用性差；(3)用亲和方式非共价固定蛋白，但固定的蛋白量少，信号更弱。鉴于此，本发明提供了一种基于SPR技术建立的筛选非激动剂型PPARγ配体的方法。该方法采用非共价固定，用多肽放大信号，并根据PPARγ与多肽生物特性设计3种SPR检测方式，逐步排除其他配体或无关分子，获得非激动剂配体；具有快速、便捷、定量性强等优点，可显著提高筛选的精确度与效率，使得易于筛选获得新的非激动剂型PPARγ配体。

发明内容

本发明提供了一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤A：确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；

步骤B：确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；

步骤C：确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；

步骤A、B、C没有先后顺序，全部通过后认定待测分子为非激动剂型PPARγ

配体。

其中，无促进PPARγ下游转录的活性是指没有使PPARγ被激活后促使其下游的受调控基因转录增强的活性。

本发明的方法中，使用基于改进的表面等离子共振(SPR)技术鉴定PPARγ与其他分子的相互作用，进一步地，表面等离子共振(SPR)技术使用Biacore实现，例如BiacoreT200；其他分子包括待测分子和各种配体。在一些实施例中，在Biacore T200中待测分子相互作用使用PPARγ-His tag蛋白通过含有anti-His tag的CM5芯片，例如：采用CM5芯片(Sensor Chip CM5；GE公司)并利用anti-His tag抗体交联试剂盒(Biacore His-captureKit；GE公司)按说明书交联获得的anti-His tag芯片，缓冲液为含有5％(v/v)DMSO的HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％(v/v)Surfactant P20)。

在一个实施方案中，步骤A通过确定待测分子不能促进PPARγ与GST-SRC1的结合来确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；步骤B中所述PPARγ配体的已知完全激动剂可以各种已知的完全激动剂，例如：罗格列酮(Rosiglitazone)和吡格列酮(Pioglitazone)等，以Rosiglitazone为例，竞争结合通过观察所述待测分子是否影响Rosiglitazone促进PPARγ与GST-SRC1结合的作用来确定，优选地，步骤B是在包含待测分子、PPARγ、GST-SRC1和Rosiglitazone的体系中实现的；步骤C是通过确认待测分子不能促进PPARγ与GST-NCOR2多肽结合来确认其不是PPARγ的拮抗剂型配体，进一步地，步骤C可以是通过以Rosiglitazone和SR1664作为对照进行对比证明待测分子的功能来完成的。

进一步地，在一个实施方案中，本发明的步骤B中当待测分子组相比对照组时，使Rosiglitazone促进PPARγ与GST-SRC1结合作用降低至少25％被认为通过检测。

在又一个实施方案中，本发明的步骤C中，PPARγ与GST-NCOR2结合的降幅是通过以下公式计算的：降幅＝(GST-NCOR2组RU值+药物组RU值-GST-NCOR2+药物组RU值/(GST-NCOR2组RU值+药物组RU值)×100％)，进一步地，通过该公式得到的降幅≥15％在本发明中被认为具有显著的下调效应，例如最低降幅可以为15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％等。

本发明的方法中，检测添加待测分子或配体后，PPARγ与GST-NCOR2或GST-SRC1的相互作用时，通过anti-His tag抗体将GST-NCOR2或GST-SRC1与CM5芯片交联。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1示出了利用Biacore分析PPARγ与各待测分子之间的结合；A、Biacore分析的检测流程图；B、在待测分子注入起点及终点阶段不同分子的结合曲线，缓冲液组为基线组，各结合曲线在注入起点前以缓冲液组为标准数据归一。

图2示出了PPARγ-His tag重组蛋白的制备；A、利用分子筛层析纯化NTA亲和层析制备的PPARγ-His tag重组蛋白：11ml左右的蛋白峰被收集；B、SDS-PAGE电泳分析分子筛纯化的蛋白：lane 1，纯化前的蛋白；lane 2，纯化后的蛋白，箭头所示为PPARγ-His tag重组蛋白理论位点的蛋白带。

图3 GST-SRC1及GST-NCOR2重组蛋白的制备。A、利用分子筛层析纯化经GST亲和层析制备的GST-SRC1蛋白，11-12ml左右的蛋白峰被收集。B、利用分子筛层析纯化经GST亲和层析制备的GST-NCOR2蛋白，11-12ml左右的蛋白峰被收集。C、SDS-PAGE电泳分析分子筛纯化的两种GST融合蛋白。箭头所示为两种GST融合蛋白理论位点的蛋白带。

图4利用Biacore分析各待测分子对PPARγ与GST-SRC1之间结合的影响。A、Biacore分析的检测流程图。缓冲液组为基线组，各结合曲线在药物分子注入起点前以缓冲液组为标准数据归一。B、Rosiglitazone对PPARγ与GST-SRC1之间结合的影响。缓冲液组、Rosiglitazone组、GST-SRC1组为仅注入缓冲液、Rosiglitazone、GST-SRC1；GST-SRC1+Rosiglitazone组为GST-SRC1与Rosiglitazone混合后注入。C、SR1664对PPARγ与GST-SRC1之间结合的影响，各组设置同B。

图5利用Biacore分析各待测分子与Rosiglitazone竞争PPARγ结合位点。A、Biacore上样方案示意图。B、在GST-SRC1注入起点及终点阶段不同分子的结合曲线。各结合曲线在GST-SRC1注入起点前以无Rosiglitazone组为标准数据归一。

图6利用Biacore分析各待测分子对PPARγ与GST-NCOR2之间结合的影响。A、Biacore分析的检测流程图。与待测分子等浓度的DMSO溶液(DMSO组)为基线组，各结合曲线在GST-NCOR2及药物分子注入起点前以DMSO组为标准数据归一。B、在GST-NCOR2及药物分子注入起点及终点阶段不同分子的结合曲线。各曲线包括无GST-NCOR2(即DMSO溶液)组、GST-NCOR2组以及GST-NCOR2与不同待测分子混合组。

图7利用PPRE-Luciferase报告基因系统检测各种分子对PPARγ转录活性的作用。A、Biacore检测阳性结果的几种分子对PPARγ转录活性的作用。与与待测分子等浓度的DMSO溶液(Control)组为阴性对照，Rosiglitazone组为阳性对照。B、Biacore检测阴性结果的几种分子对PPARγ转录活性的作用。组别设定同A。C、A中各组Luciferase酶促反应荧光值(Luc光值)的统计结果。D、B中各组Luciferase酶促反应荧光值(Luc光值)的统计结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

1、蛋白制备

PPARγ-His tag重组蛋白的制备步骤如下：

PPARγcDNA购自义翘神州科技有限公司(HG12019-G)；PPARγ的LBD区域(Leu²³²-Tyr⁵⁰⁵)的cDNA序列(SEQ ID No：1)利用基因克隆技术装载入PET30a载体中，酶切位点分别为NdeI及XhoI，表达产物(SEQ ID No：5)为C端含有6×His tag的PPARγLBD蛋白(简称为PPARγ-His tag蛋白)。重组载体被转化到Transetta(DE3)表达菌中，37℃培养至菌体OD600＝0.6时加入IPTG至终浓度0.5mM诱导表达5小时(h)，收集菌体，使用PBS缓冲液(pH7.3)重悬细菌并超声破碎(200mW，超声3秒(s)，间隔5s，共20分钟(min))，离心10000rpm，10min收集上清，利用Ni⁺-NTA亲和层析柱(HisTrapFF；GE公司)按其说明书进行Ni⁺-NTA亲和层析纯化。纯化后的蛋白利用Superdex75分子筛层析柱(GE公司)进行分子筛纯化，缓冲液为PBSpH7.3，与理论大小相符合的蛋白峰被收集用于Biacore分析。

GST-SRC1多肽及GST-NCOR2多肽的制备步骤如下：

SRC1多肽(SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP)的cDNA序列(含有终止子)以及NCOR2多肽(GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF)的cDNA序列(含有终止子)被分别装载入pGEX-6P-1载体中，酶切位点分别为BamHI及XhoI，表达产物为N端含有GSTtag的融合蛋白。用于表达GST-SRC1多肽的cDNA序列为SEQ ID No：3，对应的表达产物为GST-SRC1多肽(SEQ ID No：4)；用于表达GST-NCOR2多肽的cDNA序列为SEQ ID No：2，对应的表达产物为GST-NCOR2多肽(SEQ IDNo：6)。重组载体被转化到Transetta(DE3)表达菌中，37℃培养至菌体OD600＝0.6时加入IPTG至终浓度1mM诱导表达5小时，收集菌体，使用PBS缓冲液(pH7.3)重悬细菌并超声破碎(200mW，超声3s，间隔5s，共20min)，离心10000rpm，10min收集上清，利用GST亲和层析柱(GSTrapFF；GE公司)按其说明书进行GST亲和层析纯化。纯化后的蛋白利用Superdex75分子筛(GE公司)层析柱进行分子筛纯化，缓冲液为PBSpH7.3，与理论大小相符合的蛋白峰被收集用于Biacore分析。

2、PPARγ蛋白与待测小分子及GST-多肽之间结合的检测利用Biacore T200来开展PPARγ蛋白与待测分子及GST-多肽之间结合的检测工作。检测采用CM5芯片(SensorChip CM5；GE公司)并利用anti-His tag抗体交联试剂盒(Biacore His-captureKit；GE公司)按说明书交联获得的anti-His tag芯片，缓冲液为含有5％(v/v)DMSO的HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％(v/v)Surfactant P20)。PPARγ蛋白、各种检测小分子及GST-多肽都利用含有5％(v/v)DMSO的HBS-EP缓冲液进行稀释，上样浓度分别为20μg/ml、10μM及5μg/ml。作为固定相的PPARγ蛋白被注入芯片并行两个通道中的通道2，作为流动相的各种检测小分子及GST-多肽被注入芯片并行的全部两个通道，通道2减去通道1的信号值作为结合信号响应值(RU)。

3、利用PPRE-Luciferase报告基因系统检测PPARγ的转录激活情况

将购自义翘神州科技有限公司的PPARγ真核表达质粒(HG12019-UT)利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen公司)按说明书转染入本实验室已构建的稳定表达PPRE-Luciferase报告基因的HEK293细胞中。转染24h后，细胞利用D10(DMEM+10％胎牛血清)培养基悬浮，并按1×10⁴细胞/孔接种至96孔板中，于培养箱中孵育(37℃，5％CO₂)培养过夜。在更换新鲜D10培养基后，细胞培养孔中被加入终浓度为1μM的各种待测分子，每组3个复孔，并于4h后更换为新鲜D10培养基。12h后取10μl培养基/孔，添加含有3μM腔肠素的PBST缓冲液(含0.03％(V/V)TritonX-100的PBS缓冲液)100μL，于IVIS Lumina III小动物活体光学成像系统(PE公司)中检测Luciferase酶促反应发光值，取三次上清重复检测实验。与待测分子同浓度的DMSO设为对照组，检测数据按照对照组数据进行归一化处理。

4、利用直接检测的方式难于筛选获得非激动剂型PPARγ配体首先我们采用直接检测PPARγ与待测分子结合响应值的方式筛选待测小分子。Biacore分析的检测流程图如图1A所示，在PPARγ-His tag蛋白被anti-His tag芯片捕获后注入待测小分子，通过检测通道与参比通道的差值计算待测小分子与PPARγ的结合情况。结果显示(图1B)，不管是作为阳性对照的罗格列酮(Rosiglitazone)(完全激动剂配体)和SR1664(非激动剂配体)，还是其它6种待测分子，其结合响应值都很微弱(都小于5RU)，并且各分子间的响应值并无明显差异。这表明直接检测PPARγ与待测分子之间的结合响应值即使对于阳性配体分子Rosiglitazone和SR1664也很难获得很好的结合数据，更难于通过比较Rosiglitazone和SR1664之间的差异区分完全激动剂配体和非激动剂配体。待测小分子分子量小且与PPARγ结合量不多，导致响应信号值(RU)较低，影响实验的精准度。因此，实验结果显示利用直接检测的方式难于筛选获得非激动剂型PPARγ配体。

5、采用两种GST-多肽及三检测方式联合应用的方法筛选非激动剂型PPARγ配体

上述结果表明，直接检测PPARγ与待测分子之间响应值的方式难于筛选获得非激动剂型PPARγ配体。在发明中，我们提出一种采用两种GST-多肽及三检测方式联合应用的解决方案。两种GST-多肽分别是GST-SRC1多肽和GST-NCOR2多肽。其中SRC1多肽是PPARγ共刺激蛋白SRC1上与负责PPARγ结合的一段多肽序列，在激动剂型配体存在的情况下其与PPARγ的结合大幅增加；NCOR2多肽为PPARγ共抑制蛋白NCOR上与负责PPARγ结合的一段多肽序列，在无配体存在的情况下会与PPARγ产生结合，在非拮抗剂型配体与PPARγ结合后促进该多肽的解离。两种多肽在与GST重组融合后分子量达到约28kD，是待测小分子分子量(通常分子量在300-1000Da)的25-90倍。因为SPR响应值与流动相物质的分子量呈正比例关系，所以与待测小分子相比该两种GST-多肽与PPARγ的结合或解离都有显著的信号反应。

与PPARγ的其它类型配体如完全激动剂、部分激动剂、拮抗剂相比，在与GST-SRC1多肽和GST-NCOR2多肽的结合方面，非激动剂型配体有如下三个特征：①无促进转录活性，即基本不促进PPARγ与SRC1多肽(与促进转录相关)的结合。该特征可以排除完全激动剂型配体和部分激动剂型配体等情况；②非激动剂型配体与完全激动剂型配体在PPARγ结合部位上相重叠，即非激动剂型配体与完全激动剂型配体在与PPARγ结合上存在竞争关系。完全激动剂型配体Rosiglitazone可以大幅提升PPARγ与SRC1多肽的结合量，而非激动剂型配体本身不提升二者的结合量，同时通过竞争性作用替代PPARγ结合的Rosiglitazone分子，因此在非激动剂型配体存在的情况下，Rosiglitazone对PPARγ与SRC1多肽结合的促进作用会大大减弱。该特征可以证明待测分子为PPARγ配体，因此可以排除非配体情况；③除非激动剂型配体外，拮抗剂型配体也有可能满足前两个特征，因此我们引入GST-NCOR2多肽。非激动剂型配体与拮抗剂型配体在对PPARγ与NCOR2多肽结合的影响上表现不同：拮抗剂型配体会促进二者的结合，而非激动剂型配体则不会促进二者的结合，并展现出一定的抑制作用。因此通过降低PPARγ与NCOR2多肽之间结合的现象排除拮抗剂型配体的情况。根据上述非激动剂型配体的三个特征，我们提出利用两种GST-多肽开展三种检测方式联合应用的检测方案，进行实验如下：

制备蛋白

利用基因重组及蛋白表达技术，我们分别表达了PPARγ-His tag蛋白及GST-SRC1、GST-NCOR2两种GST融合蛋白。表达蛋白经相应的亲和层析纯化后，分别利用SuperdexG-75层析柱进行了分子筛纯化，理论位置的蛋白峰被收集并利用SDS-PAGE电泳进行了验证。结果表明我们制备获得了这三种重组蛋白(图2和图3)。

利用Biacore分析待测分子对PPARγ与GST-SRC1之间结合的影响

利用制备的PPARγ-His tag蛋白及GST-SRC1蛋白，我们检测完全激动剂阳性对照物Rosiglitazone、非激动剂阳性对照物SR1664以及白屈菜红碱、白屈菜碱、重楼皂苷E、山姜素、山茶酚、芍药苷6种待测小分子对PPARγ与GST-SRC1之间结合的影响。Biacore分析的检测流程图如图4A所示，在PPARγ-His tag蛋白被anti-His tag芯片捕获后注入GST-SRC1蛋白与缓冲液、Rosiglitazone、SR1664以及待测小分子的组合物。GST-SRC1蛋白与每种待测分子的组合都包括：缓冲液、仅GST-SRC1蛋白、仅待测小分子、GST-SRC1蛋白与待测小分子的混合物。由完全激动剂阳性对照物Rosiglitazone组的实验结果(图4B)可以看到，Rosiglitazone组的结合曲线与缓冲液组的结合曲线相似；GST-SRC1组展示出一定量的结合响应值，表明在无配体的状态下PPARγ可以结合一定量的GST-SRC1蛋白；Rosiglitazone+GST-SRC1组展示出很高的结合响应值，远超GST-SRC1组和Rosiglitazone组，经计算响应值是GST-SRC1组和Rosiglitazone组响应值之和的7.2倍(表1)。这表明，同理论一致，完全激动剂Rosiglitazone可大幅促进PPARγ与GST-SRC1的结合。由非激动剂阳性对照物SR1664的实验结果(图4C)可以看到，缓冲液组、SR1664组与GST-SRC1组与前面结果相似，而SR1664+GST-SRC1组展示出与GST-SRC1组较接近的响应值，经计算响应值是GST-SRC1组和SR1664组响应值之和的1.16倍(表1)。这表明，同理论一致，非激动剂SR1664基本不能促进PPARγ与GST-SRC1的结合，与Rosiglitazone相比，其对PPARγ与GST-SRC1结合的促进作用仅为后者的2.51％(表1)。随后对其它待测小分子的检测表明，这些小分子对PPARγ与GST-SRC1的结合皆未表现出明显促进作用(与Rosiglitazone相比，促进作用皆小于其效果的5％)。

表1.各测试分子对PPARγ与GST-SRC1之间结合增幅的比较

利用Biacore分析测试分子对Rosiglitazone的竞争性作用

基于完全激动剂阳性对照物Rosiglitazone可大幅促进PPARγ与GST-SRC1结合的实验现象，以及非激动剂不促进PPARγ与GST-SRC1的结合但可竞争完全激动剂结合位点的特点，我们进而利用PPARγ-His tag蛋白、GST-SRC1蛋白以及Rosiglitazone作为检测体系，尝试检测测试分子是否可与Rosiglitazone竞争性结合PPARγ的结合位点。Biacore分析的检测流程图如图5A所示，在PPARγ-His tag蛋白被anti-His tag芯片捕获后注入Rosiglitazone或缓冲液(无Rosiglitazone组，作为基线对照组)，经清洗后注入SR1664、测试分子以及等浓度的DMSO溶液(作为阴性对照)，再经清洗后注入GST-SRC1蛋白。实验结果表明(图5B)，无Rosiglitazone组及DMSO组的结合响应值之间有约200RU的差异，说明同前面实验结果相似，Rosiglitazone预先与PPARγ结合后仍可大幅促进PPARγ与GST-SRC1的结合，因此可作为竞争PPARγ结合位点实验的模型分子。随后，我们检测非激动剂阳性对照物SR1664对Rosiglitazone的竞争作用。结果表明(图5B)，SR1664的注入可使得GST-SRC1的结合曲线大幅下降，经计算下降程度可达63.6％(表2)，表明该模型确实可检测到非激动剂型配体对Rosiglitazone的竞争作用。随后我们检测6种测试分子对Rosiglitazone的竞争作用。结果表明(图5B)，白屈菜红碱和白屈菜碱的注入可使得GST-SRC1的结合曲线有一定程度的下降；其它4种分子的注入基本不影响GST-SRC1的结合曲线。计算结果表明(表2)，白屈菜红碱和白屈菜碱可使GST-SRC1结合响应值下降35.4％和25.5％，展现出对Rosiglitazone的竞争作用；其它4种分子未表现出对Rosiglitazone的竞争作用。

表2.各测试分子对Rosiglitazone结合PPARγ的竞争效果的比较

利用Biacore分析测试分子对PPARγ与GST-NCOR2之间结合的影响

利用PPARγ-His tag蛋白及GST-NCOR2蛋白检测待测小分子是否可影响PPARγ与GST-NCOR2之间结合。Biacore分析的检测流程图如图6A所示，在PPARγ-His tag蛋白被anti-His tag芯片捕获后注入缓冲液(无GST-NCOR2，作为基线对照组)，以及GST-NCOR2蛋白与缓冲液、Rosiglitazone、SR1664以及测试分子的组合物。实验结果显示(图6及表3)，完全激动剂阳性对照物Rosiglitazone及非激动剂阳性对照物SR1664都可以降低PPARγ与GST-NCOR2蛋白的结合响应值，表明该检测体系可有效进行检测。随后检测结果表明(图6及表3)，两种测试分子——白屈菜红碱和白屈菜碱都可一定程度降低PPARγ与GST-NCOR2蛋白的结合响应值，而其它四种分子不能产生降低效果，表明白屈菜红碱和白屈菜碱有类似Rosiglitazone及SR1664的抑制PPARγ与GST-NCOR2之间结合的作用。

表3.各检测分子对PPARγ与GST-NCOR2之间结合降幅的比较

以上结果表明，白屈菜红碱、白屈菜碱与SR1664一样可以满足两个条件：(A)基本不能促进PPARγ与GST-SRC1的结合(B)可以与Rosiglitazone竞争PPARγ结合位点(C)抑制PPARγ与GST-NCOR2之间的结合这三个特点。利用PPRE-Luciferase报告基因系统对Biacore分析结果进行验证

在获得上述Biacore分析结果之后，我们利用可以检测PPARγ转录活性的PPRE-Luciferase报告基因系统对Rosiglitazone、SR1664、白屈菜红碱、白屈菜碱、重楼皂苷E、山姜素、山茶酚、芍药苷调节PPARγ转录活性的作用进行了检测。结果表明(图7及表4)，与理论一样，Rosiglitazone具有很强的激活PPARγ转录活性的作用，而在同样浓度下(1μM)，SR1664有较弱的激活PPARγ转录活性的作用，其激活能力仅为Rosiglitazone的8.74％。该现象与已有SR1664的报道相一致：在这些文献报道中，SR1664尽管被定义为非激动剂型PPARγ配体，但仍在足够高的浓度下(如1μM)展现出较弱的促进PPARγ转录的作用。白屈菜红碱和白屈菜碱的检测结果同Biacore分析的结果一致，也表现了较弱的激活PPARγ转录活性的作用(Rosiglitazone活性的7.47％和7.62％)，而Biacore分析中结果为阴性的重楼皂苷E、山姜素、山茶酚、芍药苷在PPARγ转录活性检测中也表现为无促进作用。此外，有文献报道白屈菜红碱可以激活PPARγ调节糖脂代谢的相关功能，同时仅有微弱的PPARγ转录活性，该确认实验证明了本发明筛选方法的有效性。

表4.与Rosiglitazone相比，各测试分子对PPARγ转录活性促进效果的比较

*，以PPARγ部分激动剂中表现较好的INT131为标尺，其PPARγ活性的促进效果相当于Rosiglitazone的15％；另小于2.5％可以被认为是背景噪音。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 中国中医科学院医学实验中心

<120> 一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法

<130> CP20127

<141> 2020-03-26

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatgctga atccagagtc cgctgacctc cgggccctgg caaaacattt gtatgactca 60

tacataaagt ccttcccgct gaccaaagca aaggcgaggg cgatcttgac aggaaagaca 120

acagacaaat caccattcgt tatctatgac atgaattcct taatgatggg agaagataaa 180

atcaagttca aacacatcac ccccctgcag gagcagagca aagaggtggc catccgcatc 240

tttcagggct gccagtttcg ctccgtggag gctgtgcagg agatcacaga gtatgccaaa 300

agcattcctg gttttgtaaa tcttgacttg aacgaccaag taactctcct caaatatgga 360

gtccacgaga tcatttacac aatgctggcc tccttgatga ataaagatgg ggttctcata 420

tccgagggcc aaggcttcat gacaagggag tttctaaaga gcctgcgaaa gccttttggt 480

gactttatgg agcccaagtt tgagtttgct gtgaagttca atgcactgga attagatgac 540

agcgacttgg caatatttat tgctgtcatt attctcagtg gagaccgccc aggtttgctg 600

aatgtgaagc ccattgaaga cattcaagac aacctgctac aagccctgga gctccagctg 660

aagctgaacc accctgagtc ctcacagctg tttgccaagc tgctccagaa aatgacagac 720

ctcagacaga ttgtcacgga acacgtgcag ctactgcagg tgatcaagaa gacggagaca 780

gacatgagtc ttcacccgct cctgcaggag atctacaagg acttgtacct cgagcaccac 840

caccaccacc actga 855

<210> 2

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccggacata gcttcgcaga ccctgctagc 720

aatctgggac tagaggatat catccgcaag gcactgatgg gaagcttcct cgagcggccg 780

catcgtgact ga 792

<210> 3

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggaagttc tgttccaggg gcccctggga tccagcccaa gcagccatag cagcctgact 720

gaacggcata aaattttgca tcgtttgttg caagaaggca gccctctcga gcggccgcat 780

cgtgactga 789

<210> 4

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Ser Pro Ser Ser His Ser Ser Leu Thr

225 230 235 240

Glu Arg His Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Glu Gly Ser Pro Leu

245 250 255

Glu Arg Pro His Arg Asp

260

<210> 5

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg Ala Leu Ala Lys His Leu

1 5 10 15

Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu Thr Lys Ala Lys Ala Arg

20 25 30

Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys Ser Pro Phe Val Ile Tyr

35 40 45

Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp Lys Ile Lys Phe Lys His

50 55 60

Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu Val Ala Ile Arg Ile Phe

65 70 75 80

Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala Val Gln Glu Ile Thr Glu

85 90 95

Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn Leu Asp Leu Asn Asp Gln

100 105 110

Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu Ile Ile Tyr Thr Met Leu

115 120 125

Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu Ile Ser Glu Gly Gln Gly

130 135 140

Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu Arg Lys Pro Phe Gly Asp

145 150 155 160

Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val Lys Phe Asn Ala Leu Glu

165 170 175

Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile Ala Val Ile Ile Leu Ser

180 185 190

Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys Pro Ile Glu Asp Ile Gln

195 200 205

Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln Leu Lys Leu Asn His Pro

210 215 220

Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu Gln Lys Met Thr Asp Leu

225 230 235 240

Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu Leu Gln Val Ile Lys Lys

245 250 255

Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu Leu Gln Glu Ile Tyr Lys

260 265 270

Asp Leu Tyr Leu Glu His His His His His His

275 280

<210> 6

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Gly His Ser Phe Ala Asp Pro Ala Ser

225 230 235 240

Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ile Ile Arg Lys Ala Leu Met Gly Ser Phe

245 250 255

Leu Glu Arg Pro His Arg Asp

260

Claims (10)

1.一种筛选非激动剂型PPARγ配体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤A：确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性；

步骤B：确定待测分子可以与PPARγ的已知完全激动剂竞争结合PPARγ；

步骤C：确定待测分子不是PPARγ的拮抗剂型配体；

步骤A、B、C没有先后顺序，全部通过后认定所述待测分子为非激动剂型PPARγ配体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法基于改进的表面等离子共振(SPR)技术鉴定PPARγ与其他分子的相互作用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中使用PPARγ-His tag蛋白通过含有anti-His tag的芯片。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A通过确定待测分子不能促进PPARγ与GST-SRC1的结合来确定待测分子无促进PPARγ下游转录的活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤B中所述PPARγ配体的已知完全激动剂是罗格列酮(Rosiglitazone)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B中的竞争结合通过观察所述待测分子是否影响Rosiglitazone促进PPARγ与GST-SRC1结合的作用来确定的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤B中当待测分子组相比对照组，使Rosiglitazone促进PPARγ与GST-SRC1结合作用降低至少25％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤C是通过确认待测分子不能促进PPARγ与GST-NCOR2多肽结合来实现的。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤C中PPARγ与GST-NCOR2结合的降幅是通过以下公式计算的：降幅＝(GST-NCOR2组响应值+药物组响应值-GST-NCOR2+药物组响应值/(GST-NCOR2组响应值+药物组响应值)×100％)。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述降幅≥15％被认为是具有显著的下调效应。

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