WO2023063719A1 - 가역적 소낭 분비 조절 광유전학 시스템 - Google Patents

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이창준
허원도
원종하
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기초과학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to an optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release (Opto-vTrap), a light-inducible and reversible inhibition system for transient trapping of transmitter-containing vesicles from exocytotic release.
  • Opto-vTrap optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release
  • a light-inducible and reversible inhibition system for transient trapping of transmitter-containing vesicles from exocytotic release.
  • ChR2 Channelrhodopsin-2
  • Activated ChR2 increases calcium influx through the ChR2 gating and voltage-gated calcium channels, which triggers the release of the transmitter (Schoenenberger, P., et al., (2011). Exp Physiol 96 , 34-39 ).
  • Optogenetic tools for stimulating neural activity such as ChR2, ChR2 variants, or others of the same, generally use cation channels that depolarize the membrane potential (Nagel, G., et al., (2003). Proc Natl Acad Sci USA 100 , 13940-13945).
  • NpHR halorhodopsin
  • Arch archaerhodopsin
  • anion-conducting channelrhodopsin have become popular.
  • NpHR and Arch use photoinducible chloride or proton pumps to hyperpolarize the membrane potential (Chow, BY, et al., (2010). Nature 463 , 98-102; Zhang, F., et al., (2007) Nature 446 , 633-639).
  • Photoactivation of NpHR and Arch efficiently silences neuronal activity within a short period of time, but long-term activation results in chaotic responses (Wiegert, JS, et al., (2017). Neuron 95 , 504-529).
  • NpHR-mediated hyperpolarization allows low voltage activated T-type calcium channels to recover from inactivation, which are subsequently activated upon light removal, resulting in unintended burst firing (Mahn, M., et al., ( 2016. Nat Neurosci 19 , 554-556; Mattingly, M., et al., (2016).
  • G i -DREADD has the same problems, such as unintended multiple firing upon activation, in addition to other disadvantages such as slow drug initiation and offset kinetics (Saloman, JL, et al., (2016). J Neurosci 36 , 10769- 10781; Wiegert, JS, et al., (2017) Neuron 95 , 504-529).
  • NpHR and Arch are not applicable to non-excitable glial cells such as astrocytes. Due to these drawbacks, there is an urgent need to develop advanced optogenetic silencing factors that do not affect membrane potential.
  • the synaptic vesicle release system includes SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion Attachment protein REceptor) complex-mediated vesicle docking and priming, complexin binding to the SNARE complex, and calcium binding to synaptotagmin-1 and vesicle fusion for vesicle fusion.
  • SNARE complexes zipper to form pores (Rizo, J., and Xu, J. (2015). Annu Rev Biophys 44 , 339-367; Sudhof, TC (2004). Annu Rev Neurosci 27 , 509- 547; Zhou, Q., et al., (2017). Nature 548 , 420-425).
  • the SNARE complex consists of a highly conserved vesicular SNARE (v-SNARE), including VAMP2 (vesicle associated membrane protein 2, Synaptobrevin2), and a t-SNARE (target plasma membrane SNARE), including syntaxin-1 and SNAP25 (Sollner , T., et al., (1993). Cell 75 , 409-418).
  • v-SNARE vesicular SNARE
  • VAMP2 vesicle associated membrane protein 2, Synaptobrevin2
  • t-SNARE target plasma membrane SNARE
  • syntaxin-1 and SNAP25 Sollner , T., et al., (1993). Cell 75 , 409-418.
  • CALI Chromophore-assisted light inactivation
  • InSynC Chromophore-assisted light inactivation
  • the system exploits the light-dependent generation of singlet oxygen, which damages v-SNAREs and prevents synaptic ves
  • PA-BoNT light-activated botulinum neurotoxin
  • Opto-vTrap a rapid and reversible optogenetic inhibition system for direct inhibition of follicular exocytosis.
  • This system directly targets vesicles containing the transmitter, sequesters them into vesicle clusters and inhibits vesicle release.
  • Opto-vTrap uses light-induced on/off to quickly activate and recover.
  • NpHR or Arch it does not induce changes in membrane potential.
  • Opto-vTrap shows much faster recovery than other vesicles targeted with optogenetic probes.
  • LARIAT light-activated reversible inhibition by assembled trap
  • LARIAT sequesters target proteins by forming CRY2-CIB1 multimeric complexes (Kennedy, MJ, et al., (2010). Nat Methods 7 , 973-975; Lee, S., et al. , (2014) Nat Methods 11 , 633-636).
  • the present inventors confirmed that Opto-vTrap effectively and reversibly entraps synaptic vesicles of neurons and glial cell transporter-containing vesicles of astrocytes.
  • Opto-vTrap can be widely used in cell, brain slice, and animal behavior experiments, recovers quickly, and does not affect membrane potential.
  • Opto-vTrap photoactivation of Opto-vTrap resulted in complete vesicle-clusterization and complete inhibition of exocytosis within 1 min, which was restored within 30 min after light removal.
  • the present inventors confirmed a significant decrease in synaptic transmission and glial transmission upon activation of Opto-vTrap in brain slices.
  • Opto-vTrap significantly inhibited hippocampus-dependent memory retrieval with complete recovery within 1 hour.
  • ChR2 Channelrhodopsin-2
  • Activated ChR2 increases calcium influx through the ChR2 gating and voltage-gated calcium channels, which triggers the release of the transmitter (Schoenenberger, P., et al., (2011). Exp Physiol 96, 34-39 ).
  • Optogenetic tools for stimulating neural activity such as ChR2, ChR2 variants, or others of the same, generally use cation channels that depolarize the membrane potential (Nagel, G., et al., (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13940-13945).
  • NpHR halorhodopsin
  • Arch archaerhodopsin
  • anion-conducting channelrhodopsin have become popular.
  • NpHR and Arch use photoinducible chloride or proton pumps to hyperpolarize the membrane potential (Chow, B.Y., et al., (2010). Nature 463, 98-102; Zhang, F., et al., (2007) Nature 446, 633-639).
  • Photoactivation of NpHR and Arch efficiently silences neuronal activity within a short period of time, but long-term activation results in chaotic responses (Wiegert, J.S., et al., (2017). Neuron 95, 504-529).
  • NpHR-mediated hyperpolarization allows low voltage activated T-type calcium channels to recover from inactivation, which are subsequently activated upon light removal, resulting in unintended burst firing (Mahn, M., et al., ( 2016). Nat Neurosci 19, 554-556; Mattingly, M., et al., (2016).
  • Gi-DREADD Gi-Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs
  • Armbuster, B.N., et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 5163-5168.
  • Gi-DREADD has the same problems, such as unintended multiple firing upon activation, in addition to other disadvantages such as slow drug initiation and offset kinetics (Saloman, J.L., et al., (2016). J Neurosci 36, 10769-10781 Wiegert, J.S., et al., (2017) Neuron 95, 504-529).
  • NpHR and Arch are not applicable to non-excitable glial cells such as astrocytes. Due to these drawbacks, there is an urgent need to develop advanced optogenetic silencing factors that do not affect membrane potential.
  • the synaptic vesicle release system includes SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion Attachment protein REceptor) complex-mediated vesicle docking and priming, complexin binding to the SNARE complex, and calcium binding to synaptotagmin-1 and vesicle fusion for vesicle fusion.
  • SNARE complexes zipper to form pores (Rizo, J., and Xu, J. (2015). Annu Rev Biophys 44, 339-367; Sudhof, T.C. (2004). Annu Rev Neurosci 27, 509- 547; Zhou, Q., et al., (2017). Nature 548, 420-425).
  • the SNARE complex consists of a highly conserved vesicular SNARE (v-SNARE), including VAMP2 (vesicle associated membrane protein 2, Synaptobrevin2), and a t-SNARE (target plasma membrane SNARE), including syntaxin-1 and SNAP25 (Sollner , T., et al., (1993). Cell 75, 409-418).
  • VAMP2 vesicle associated membrane protein 2, Synaptobrevin2
  • t-SNARE target plasma membrane SNARE
  • PA-BoNT light-activated botulinum neurotoxin
  • Opto-vTrap a rapid and reversible optogenetic inhibition system for direct inhibition of follicular exocytosis.
  • This system directly targets vesicles containing the transmitter, sequesters them into vesicle clusters and inhibits vesicle release.
  • Opto-vTrap uses light-induced on/off to quickly activate and recover.
  • NpHR or Arch it does not induce changes in membrane potential.
  • Opto-vTrap shows much faster recovery than other vesicles targeted with optogenetic probes.
  • LARIAT light-activated reversible inhibition by assembled trap
  • LARIAT sequesters target proteins by forming CRY2-CIB1 multimeric complexes (Kennedy, M.J., et al., (2010). Nat Methods 7, 973-975; Lee, S., et al. , (2014) Nat Methods 11, 633-636).
  • the present inventors confirmed that Opto-vTrap effectively and reversibly entraps synaptic vesicles of neurons and glial cell transporter-containing vesicles of astrocytes.
  • Opto-vTrap can be widely used in cell, brain slice, and animal behavior experiments, recovers quickly, and does not affect membrane potential.
  • Opto-vTrap photoactivation of Opto-vTrap resulted in complete vesicle-clusterization and complete inhibition of exocytosis within 1 min, which was restored within 30 min after light removal.
  • the present inventors confirmed a significant decrease in synaptic transmission and glial transmission upon activation of Opto-vTrap in brain slices.
  • Opto-vTrap significantly inhibited hippocampus-dependent memory retrieval with complete recovery within 1 hour.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid construct capable of regulating follicular secretion in a non-invasive, temporal, spatial and reversible manner.
  • Another object of the present invention is to provide a vector containing the nucleic acid construct.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting vesicle secretion and a method for regulating vesicle secretion using the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting vesicle secretion, a pharmaceutical composition for treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder, and a cosmetic composition for skin improvement containing the nucleic acid construct or the vector.
  • Another object of the present invention is a method of treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder comprising the step of administering the nucleic acid construct or the vector, and the nucleic acid construct or the vector for the treatment of a neurotransmitter secretion-related disease or disorder. It is to provide the use of the nucleic acid construct or the vector for the manufacture of a drug for use and treatment of neurotransmitter secretion-related diseases or disorders.
  • the present invention provides a nucleic acid construct for regulating vesicle secretion controllable optogenetically by light irradiation, comprising a nucleic acid encoding a CIBN-VAMP2 fusion peptide and a nucleic acid encoding a CRY2 domain.
  • the present invention also provides a vector comprising the nucleic acid construct.
  • the present invention also includes (a) injecting the vector of claim 8 into a host cell; And (b) a method for inhibiting vesicle secretion comprising the step of agglomeration of the vesicles containing the transmitter by irradiating blue light, and (c) a method for regulating vesicle secretion further comprising the step of releasing the agglomeration of the vesicles by removing blue light.
  • the present invention also provides a composition for inhibiting vesicle secretion, a pharmaceutical composition for treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder, and a cosmetic composition for skin improvement containing the nucleic acid construct and the vector.
  • the present invention also relates to a method for treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder comprising administering the nucleic acid construct or the vector, the use of the nucleic acid construct or the vector for the treatment of a neurotransmitter secretion-related disease or disorder, and Provided is the use of the nucleic acid construct or the vector for the preparation of a medicament for the treatment of neurotransmitter secretion-related diseases or disorders.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the design and principle of Opto-vTrap.
  • A Map of LARIAT components and Opto-vTrap structure.
  • B It is a schematic diagram of the operation principle experiment of Opto-vTrap. Since blue light (488 nm) induces heteromeric dimerization of CRY2:CIBN-VAMP and homomeric oligomerization of CRY2:CRY2, and induces vesicle agglomeration, CIBN-VAMP2-targeting vesicles are formed under blue light illumination. reversibly agglomerated.
  • FIG. 2 is a diagram showing the characterization of Opto-vTrap in COS-7 cells.
  • A Timeline and schematic diagram of a live cell imaging experiment of Opto-vTrap, where the blue laser was turned on for 15 minutes (Light On). A 561 nm laser was used for CIBN-VAMP2 detection, and a 488 nm laser with a 20% duty cycle of 0.2 Hz was used for Opto-vTrap activation and CRY2 detection.
  • Figure 3 is a diagram showing optogenetic inhibition of follicular exocytosis by Opto-vTtrap in Neuroscreen-1 cells.
  • A It is a schematic diagram of an experiment of follicular exocytosis imaging under TIRF microscopic observation. CIBN-VAMP2 and NPY-VENUS were expressed in Control, and CIBN-VAMP2, CRY2 and NPY-VENUS were expressed in Opto-vTrap. NPY-VENUS was used as the vesicle content, and exocytotic events were induced by Ringer's solution with high KCl concentration.
  • FIG. 1 (B) Experimental timeline of follicular exocytosis imaging under TIRF microscopy, where 5 Hz of 40% duty cycle of 488 nm laser was used for NPY-VENUS detection and Opto-vTrap activation.
  • C Representative TIRF microscopy images of Control and Opto-vTrap expressed in Neuroscreen-1 cells, green signal represents NPY-VENUS.
  • D Representative images of Control and Opto-vTrap expressed in Neuroscreen-1 cells 10 seconds after treatment with high KCl concentration Ringer's solution, each circle representing NPY-VENUS containing vesicles and analyzed in Figure 3E.
  • E Representative traces of NPY-VENUS in Control and Opto-vTrap expressed in Neuroscreen-1 cells of FIG.
  • E Experimental diagram of eEPSC recordings using blue light illumination and representative recordings of eEPSCs in Control and Opto-vTrap injected with brain slices under Before, Light On, and After conditions (Scale bar: 20 ms, 100 pA. P1: 1st peak amplitude, P2: 2nd peak amplitude).
  • FIG. 5 shows that activation of Opto-vTrap inhibits neocortical astrocyte vesicular gliotransmitter release.
  • A Map of the Lentiviral GFAP::Opto-vTrap construct and experimental strategy of astrocyte exocytosis-mediated fast internal NMDAR-mediated current measurement.
  • B Representative whole-cell current recorded at the baseline, showing TFLLR application with blue light off and TFLLR application with light on.
  • C Dynamics of transient NMDAR-mediated currents in neurons in the GFAP::Opto-vTrap condition.
  • FIG. 6 shows that activation of Opto-vTrap reversibly inhibits contextual fear memory recovery.
  • A Experimental strategy of Schaffer collateral pathway-mediated memory recovery (fear conditioning test) in Opto-vTrap injected mice.
  • B Experimental diagram of the memory recovery test. During the contextual recovery test in trials 1-6, the blue laser was turned on only in trial 2.
  • D Showing the normalized freezing behavior in FIG.
  • FIG. 7 is related to FIG. 4 and shows the unique characteristics of Opto-vTrap expressing neurons.
  • A Representative current injection recordings of Control and Opto-vTrap expressing CA3 neurons.
  • B Summary graph of action potential firing frequency during current injection (n.s., 2-way Anova).
  • C Summary graph of action potential thresholds (unpaired t-test).
  • D A summary graph of input resistance of control and Opto-vTrap expressing cells (unpaired t-test). Data are presented as mean ⁇ s.e.m.
  • FIG. 8 is related to FIG. 4 and shows super-resolution imaging of the stratum radiatum region of the hippocampus in OptovTrap-injected mice.
  • A–B Representative super-resolution images of mCherry, SYT1 and Bassoon in Control and Opto-vTrap injection groups.
  • FIG. 9 is related to FIG. 4 and shows that activation of Opto-vTrap suppresses evoked EPSCs at Schaffer collateral synapses.
  • Figure 10 related to Figure 4, shows that activation of Opto-vTrap inhibits mEPSCs at Schaffer collateral synapses.
  • A Representative recordings of mEPSCs in Before and Light On conditions of Control and Opto-vTrap injection groups.
  • B Representative graphs of running average mEPSC frequencies in Control and Opto-vTrap injection groups.
  • FIG 11 shows that activation of AAV-Opto-vTrap inhibits evoked EPSCs at Schaffer collateral synapses.
  • A Map of AAV CK(0.4)::Opto-vTrap construct and injection strategy for Opto-vTrap expression.
  • B Experimental diagram of eEPSC recordings using blue light illumination and representative recordings of eEPSCs in Control and Opto-vTrap injected into brain slices during Before, Light on, and After conditions, respectively.
  • Figure 12 related to Figure 6, shows that expression of Opto-vTrap in Dark does not affect learning and memory behaviors and general motor activity.
  • A Experimental timeline of the open field test and representative locomotion recordings of Control and OptovTrap-injected mice.
  • D Experimental timeline and schematic diagram of the novel place recognition test.
  • Figure 13 related to Figure 6, shows that activation of Opto-vTrap reversibly inhibits locomotor activity in a continuous paradigm.
  • A Map of the lentiviral DDC::Opto-vTrap construct and experimental strategy of SNpc for testing dorsal striatal pathway-mediated locomotor activity in opto-vTrap-injected mice.
  • B Locomotor index of Opto-vTrap-injected mice, the blue box indicates the timing of 488 nm laser exposure.
  • C Normalized motion index of Opto-vTrap-injected mice, blue box indicates timing of 488 nm laser exposure.
  • optogenetic probes such as halorhodopsin and achirhodopsin hyperpolarize the membrane potential and indirectly inhibit transmitter secretion, but cause undesirable ion imbalance and rebound spikes, and are not usable for non-excitable glial cells.
  • the inventors of the present invention tried to develop a method of inhibiting the secretion of a transmitter in a non-invasive, temporal, spatial, and reversible manner to disrupt the intercellular signal transduction mechanism and change its function.
  • an optogenetic method was used, in particular, the property that CIBN and CRY2 proteins combine in blue light ( ⁇ 488 nm) and are separated again when blue light is removed.
  • the newly developed Opto-vTrap is a highly effective optogenetic trap for light-induced reversible inhibition of vesicle release, synaptic transmission, glial transmission and behavior.
  • This unique advantage of the Opto-vTrap i.e., voltage-independence and Ca 2+ -independence, enables not only neurons but also glial cells, endocrine cells and voltage-gated ions to mediate action potentials or rebound spikes.
  • Opto-vTrap exhibits higher inhibition efficiency than other synaptic transmission inhibition methods such as the Gi-DREADD system.
  • Local expression of AAV-hM4Di in CA3 of the hippocampus has been reported to block fEPSP by about 30% by bath perfusion of clozapine-N-oxide, an agonist of hM4Di (Katzel, D., et al., ( 2014). Nat Commun 5 , 3847).
  • Hippocampal CA1 inputs arise from the ipsilateral CA3-CA1 Schaffer collateral pathway as well as the contralateral CA3 sympathetic pathway (Bliss, TV, et al., (1983). J Physiol 341 , 617-626). In addition, there are some reports that both ipsilateral and contralateral projections contribute equally to synaptic plasticity in rodent models (Bliss, TV, et al., (1983). J Physiol 341 , 617-626; Kohl, MM, et al. , (2011). Nat Neurosci 14 , 1413-1415; Shipton, OA, et al., (2014). Proc Natl Acad Sci USA 111 , 15238-15243).
  • Opto-vTrap One of the most prominent advantages of Opto-vTrap is its fast recovery time. After immediate clumping, the Opto-vTrap took about 15 min to fully disengage the clumping (Fig. 2D). A similar 15 min recovery time was observed for foveal glial transfer ( Figures 5F and 5G). Reduced neurotransmission upon Opto-vTrap activation in hippocampal slices was restored within 30 min, but showed a non-statistically significant increase in PPR (Fig. 4G-Fig. 4L). Finally, complete restoration of impaired memory recovery was confirmed within 1 hour by Opto-vTrap activation in the fear memory recovery test (Fig. 6C).
  • Opto-vTrap Another important advantage of the Opto-vTrap lies in the fact that its design is based on LARIAT, which exploits CIBN and CRY2 interactions under light conditions. Recently, by applying the basic principle of LARIAT, IM-LARIAT and mRNA-LARIAT (Kim, NY, et al., (2020). Nat Cell Biol. 22 , 341-352; Nguyen, MK, et al., (2016). Nat Chem Biol 12 , 431-436) have further developed various versions of LARIAT-derived optogenetic tools.
  • CRY2clust exhibits improved clustering properties compared to the currently used CRY2PHR (Park, H., et al., (2017). Nat Commun 8 , 30)
  • CRY2 E281A -A9 provides non-invasive optical integration without the need to insert fiber optic cables. It exhibits ultrahigh light sensitivity allowing stimulation (Kim, S., et al., (2020). Nat Commun 11 , 210).
  • the present invention relates to a nucleic acid construct for regulating vesicle release that is optogenetically controllable by light irradiation, including a nucleic acid encoding a CIBN-VAMP2 fusion peptide and a nucleic acid encoding a CRY2 domain will be.
  • the nucleic acid encoding the CIBN-VAMP2 fusion peptide includes a nucleic acid encoding N-terminal domain of CIB1 (CIBN) and a nucleic acid encoding vesicle associated membrane protein 2 (VAMP2). there is.
  • the CIBN may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the VAMP2 may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • Synaptobrevins/VAMPs, syntaxins, and the 25-kD synaptosomal-associated protein SNAP25 are key components of a protein complex involved in the docking and/or fusion of synaptic vesicles and presynaptic membranes.
  • VAMP2 is a vesicle associated membrane protein. A member of the /synaptobrevin family, it participates in neurotransmitter release in the step between docking and fusion.
  • the nucleic acid encoding the CRY2 domain may include a nucleic acid encoding the PHR domain (CRY2PHR) of cryptochrome 2 (CRY2).
  • the PHR domain may be characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the light may be characterized in that the blue light of 450 ⁇ 500nm wavelength.
  • it may be characterized in that it is 440 to 490 nm, more preferably 488 nm, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid construct for regulating follicle secretion.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid linked as a nucleic acid molecule, including plasmid vectors; cosmid vector; and viral vectors such as bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors, and adeno-associated viral vectors.
  • a vector can be used as a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • the nucleic acid may be included in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell, which may include one or more regulatory elements that may be selected on a host cell basis such that the vector is used for expression, i.e., operably linked to a nucleic acid sequence to be expressed. means to include
  • “Operably linked” means a functional linkage between a regulatory sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or transcriptional regulator) related to gene expression and another gene, whereby the regulatory sequence is transcribed of the other gene. and/or regulate detoxification.
  • a regulatory sequence e.g., a promoter, signal sequence, or transcriptional regulator
  • the vector includes one or more pol III promoters, one or more pol II promoters, one or more pol I promoters, or a combination thereof.
  • pol III promoters include, but are not limited to, the U6 and H1 promoters.
  • pol II promoters include, but are not limited to, retroviral Rous Sarcoma Virus (RSV) LTR promoter (optionally with RSV enhancer), cytomegalovirus (CMV) promoter (optionally with CMV enhancer), SV40 promoter, dihydropol late reductase promoter, ⁇ -actin promoter, phosphoglycerol kinase (PGK) promoter and EF1 ⁇ promoter.
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 promoter dihydropol late reductase promoter
  • ⁇ -actin promoter phosphoglycerol kinase (PGK) promoter
  • PGK phospho
  • the vector is a “plasmid”, which refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments may be inserted, eg, by standard molecular cloning techniques.
  • the viral vector may include, for example, Adeno-Associated Viral Vector (AAV), Adenoviral Vector (AdV), Lentiviral Vector (LV) or Retroviral Vector (RV), but is not limited thereto.
  • AAV Adeno-Associated Viral Vector
  • AdV Adenoviral Vector
  • LV Lentiviral Vector
  • RV Retroviral Vector
  • the lumping may be characterized in that it is induced by heteromeric dimerization of CIBN-VAMP2 and CRY2 and homomeric oligomerization of CRY2 and CRY2.
  • the secretion of the follicle can be effectively controlled because the secretion of the follicle can be reversibly inhibited using the agglomeration and disaggregation of the follicle.
  • the light may be characterized in that the blue light of 450 ⁇ 500nm wavelength.
  • it may be characterized in that it is 440 to 490 nm, more preferably 488 nm, but is not limited thereto.
  • the transmitter is included without limitation as long as it is contained in a follicle and can be delivered by exocytosis, and is characterized in that it is a neurotransmitter or a gliotransmitter. It may be, but is not limited thereto.
  • neurotransmitter is a molecule that plays a role of a mediator in transmitting signals between nerve cells at chemical synapses, and is stored in synaptic vesicles and then released through the synaptic cleft by activation of nerve cells. It is secreted and diffused into the synaptic cleft and combines with neurotransmitter receptors present in postsynaptic cells (nerve cells, muscles, secretory cells, etc.) to activate the receptors and generate new signals.
  • Neurotransmitters include amino acids such as glutamate, glycine, and gamma aminobutyric acid (GABA); monoamines such as acetylcholine, dopamine, norepinephrine, epinephrine, serotonin, and histamine; peptides such as neuropeptide Y (NPY), somatostatin, opioid peptide, oxytocin, substance P (SP), endorphin, and cholecystokinin (CCK); other neurotransmitters such as melatonin, gasotransmitter, but are not limited thereto.
  • GABA gamma aminobutyric acid
  • monoamines such as acetylcholine, dopamine, norepinephrine, epinephrine, serotonin, and histamine
  • peptides such as neuropeptide Y (NPY), somatostatin, opioid peptide, oxytocin, substance P (SP), endor
  • glial cell transmitter is a chemical substance secreted from glial cells, which promotes signal transmission between neurons-glial cells-other cells. It can be secreted from all glial cells, including oligodendrocytes, astrocytes, and microglia, and is mainly secreted from astrocytes. Glial transporters secreted by astrocytes include glutamic acid and ATP, as well as homocysteic acid, taurine, atrial natriuretic factor (ANF), and tumor necrosis factor-alpha. alpha, TNF-alpha) and GABA are included in glial cell transporters, but are not limited thereto.
  • the host cell may be a prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cell, but is not limited thereto.
  • Escherichia coli strains of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida), Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • Bacillus such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis
  • Streptomyces Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida)
  • Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S or HT1080 It may be, but is not limited thereto.
  • the cells can be cultured in various media. Among commercially available media, it can be used as a culture medium without limitation. All other necessary supplements known to those skilled in the art may also be included in suitable concentrations. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are already in use with host cells selected for expression, and will be apparent to those skilled in the art.
  • transfection is also referred to as “transfection” and may mean injecting nucleic acids into host cells, and in one embodiment, nucleic acids into host cells using a lentiviral vector. can mean injecting
  • the term “transduction” may refer to the introduction of foreign DNA into another cell through a viral vector, and in one embodiment, a virus produced by a cell transfected with a lentiviral vector It may mean that the particle is treated with another host cell so that the target nucleic acid is introduced into the host cell.
  • the present invention relates to a composition for inhibiting vesicle release comprising the nucleic acid construct for regulating vesicle release or the vector.
  • the "inhibition" of follicle secretion means suppression of follicle exocytosis by optogenetically clustering follicles by light irradiation.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder comprising the nucleic acid construct for regulating follicular secretion or the vector.
  • the present invention relates to a method for treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder comprising administering the nucleic acid construct for regulating follicular secretion or the vector.
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid construct for regulating follicular secretion or the vector for the treatment of neurotransmitter secretion-related diseases or disorders.
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid construct for regulating follicular secretion or the vector for preparing a drug for treating a neurotransmitter secretion-related disease or disorder.
  • the "disease or disorder related to neurotransmitter secretion” refers to a disease/disorder related to the brain nervous system, neuropsychiatric system, or neuromuscular system related to excessive or inappropriate release of neurotransmitters.
  • the cranial nervous system or neuropsychiatric disease/disorder is schizophrenia (schizophrenia), manic depression (bipolar disorder), depression (depressive disorder), anxiety disorder (anxiety disorder), personality disorder (personality disorder) , phobia, post-traumatic stress disorder (PTSD), attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD), Tourette's Disorder, Parkinson's disease, Alzheimer's disease (Alzheimer's disease), stroke (stroke) may include, but are not limited thereto.
  • neuromuscular diseases include myoclonus, hemifacial spasm, spasmodic torticollis, anal fissure, blepharospasm, facial spasm, and cerebral palsy. cerebral palsy, medication overuse headache, chronic migraine, myalgia, strabismus, temporomandibular disorder, neuralgia, overactive bladder ), urge urinary incontinence, rhinitis, acne, dystonia, hyperhydrosis, and vocal fold granuloma, but is not limited thereto.
  • treatment refers to all activities in which symptoms of a disease are improved, symptoms are alleviated, or cured by administration of a composition containing the nucleic acid construct or vector. In addition, it may also include the act of irradiating blue light to activate the composition containing the nucleic acid construct or vector, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition comprising the nucleic acid construct or vector according to the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of the nucleic acid construct or vector alone, or may contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmacologically effective amount in the above refers to an amount sufficient to prevent, improve, and treat symptoms of disease.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders and dizziness or similar reactions when administered to humans.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers and preservatives.
  • carrier is defined as a compound that facilitates the addition of the nucleic acid construct or vector into a cell or tissue.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • carrier facilitates the introduction of many organic compounds into the cells or tissues of living organisms.
  • diot is defined as a compound that is diluted in water which will dissolve the compound as well as stabilize the biologically active form of the subject compound. Salts dissolved in buffer solutions are used as diluents in the art. A commonly used buffer solution is phosphate buffered saline because it mimics the salt state of human solutions. Because buffer salts can control the pH of a solution at low concentrations, buffer diluents rarely modify the biological activity of a compound.
  • the material containing the nucleic acid construct or vector in the present invention may be administered to a patient as such or as a mixed pharmaceutical composition together with other active ingredients or suitable carriers or excipients as in combination therapy.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration.
  • the dosage form may be in the form of a powder, granule, tablet, emulsion, syrup, aerosol, soft or hard gelatin capsule, sterile injectable solution, or sterile powder.
  • composition of the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal or direct injection into the brain, and the dosage of the active ingredient depends on the route of administration, the patient's age, sex, weight and patient It can be appropriately selected according to various factors such as the severity of
  • compositions suitable for use in the present invention include compositions in which the active ingredients are contained in effective amounts to achieve their intended purpose. More specifically, a therapeutically effective amount refers to an amount of a compound effective to prolong the survival of the subject being treated or to prevent, alleviate or ameliorate symptoms of a disease. Determination of a therapeutically effective amount is well within the ability of those skilled in the art, especially in light of the detailed disclosure provided herein.
  • any nucleic acid delivery method known in the art can be used.
  • suitable delivery reagents include, for example, Mirus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, polycations (eg, polylysine), atelocollagen, nanoplexes, and liposomes.
  • atelocollagen as a delivery vehicle for nucleic acid molecules has been described by Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); and Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008).
  • Exemplary interfering nucleic acid delivery systems are provided in U.S. Patent Nos. 8,283,461, 8,313,772, and 8,501,930.
  • the nucleic acid construct or vector may be administered using a delivery vehicle such as a liposome.
  • a delivery vehicle such as a liposome.
  • the liposome can help target the nucleic acid construct or vector to a specific tissue, such as lymphoid tissue, or selectively target infected cells, and also help increase the half-life of a composition containing the nucleic acid construct or vector.
  • can give Liposomes include emulsions, foams, micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, phospholipid dispersions, lamellar layers, and the like.
  • Liposomes for use in accordance with the present invention are generally formed from standard vesicle-forming lipids, including neutral and negatively charged phospholipids and sterols such as cholesterol.
  • lipids are selected in consideration of, for example, stability of liposomes in the blood stream, acid lability, and size of liposomes.
  • a variety of methods can be used to prepare liposomes. See, eg, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), and US Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 and 5,019,369.
  • administration refers to the act of introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a subject by any appropriate method, and the route of administration may be administered through various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue. there is.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, intranasally, intrapulmonaryly, or intrarectally, as desired.
  • the composition may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors.
  • the present invention relates to a cosmetic composition for skin improvement comprising the nucleic acid construct for regulating follicular secretion or the vector.
  • the skin improvement may include skin moisturizing, skin whitening, skin elasticity improvement, skin regeneration, wrinkle improvement or anti-aging, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid construct or vector according to the present invention prevents active secretion of neurotransmitters contained in vesicles, and thus reduces muscle contraction, thereby improving skin wrinkles.
  • it can show the effects of lifting, sebum secretion improvement, acne improvement, sweat secretion inhibition (hyperhidrosis improvement), sagging improvement under the eyes, aegyo under the eyes, muscle relaxation and pain relief, and migraine improvement.
  • a fatty substance an organic solvent, a solubilizing agent, a thickening agent and a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, and water are added.
  • ionic or nonionic emulsifiers fillers, sequestering agents and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles, or skin external preparations It may contain adjuvants commonly used in the field of dermatology, such as any other ingredients that are In addition, the components may be introduced in an amount generally used in the field of skin science.
  • composition for skin improvement When the composition for skin improvement is provided as a formulation for external application to the skin, it may have formulations such as ointments, patches, gels, creams, or sprays, but is not limited thereto.
  • the composition for improving skin of the present invention can be used in cosmetics.
  • the composition when used as a cosmetic, it may be prepared in the form of a general emulsified formulation and a solubilized formulation.
  • lotion such as softening lotion or nourishing lotion, emulsion such as facial lotion, body lotion, etc.
  • cream such as nourishing cream, moisture cream, eye cream, essence, cosmetic ointment, spray, gel, pack, sunscreen, makeup base, liquid
  • It may have formulations such as foundation, powder, cleansing cream, cleansing lotion, makeup remover such as cleansing oil, cleanser such as cleansing foam, soap, body wash, and the like.
  • mice Male C57BL/6J mice (6-10 weeks old) were used for electrophysiological analysis of brain slices. Behavioral tests used male C57BL/6J (10-14 weeks of age). All mice were maintained by trained faculty in the Departmental Animal Facility with a 12:12-h light-dark cycle (lights on 8:00 A.M.) and free access to rodent food and reverse osmosis water. All experimental procedures were performed in accordance with the procedures of the Animal Experimentation Ethics Committee (IACUC) of the Korea Institute of Science and Technology (Seoul, Korea) and the Institute of Basic Science (Daejeon, Korea).
  • IACUC Animal Experimentation Ethics Committee
  • Example 1-2 Cell line
  • COS-7 cells (#21651, Korea Cell Line Bank) and Neuroscreen-1 cells (NS-1, subclone of PC12 cells; Cellomics) were used.
  • COS-7 cells were grown in 90% Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM , #10- 013-CV, Corning® NS-1 cells were provided by T. Meyer (Stanford University) and maintained at 37°C, 5% CO 2 in 15% heat-inactivated horse serum (#26050088, GibcoTM Life technologies) and 80% Ham's F-12K (Kaighn's) medium (#21127022, GibcoTMLife technologies) with 5% heat-inactivated FBS (#10082147, GibcoTMLife technologies). It was confirmed that all cell lines were free of mycoplasma using a PCR detection kit (ver. 2.0, iNtRON).
  • Mus musculus VAMP2 containing vector (VAMP2-BTX) was provided by J. Sanes (Harvard University). CRY2PHR-mCherry and CIBN-pmEGFP coding vectors were provided by CLTucker (University of Colorado).
  • sequences encoding CIBN (amino acids 1-170 of CIB1) and VAMP2 were PCR-amplified and restricted by NheI/AgeI and XhoI/EcoRI, respectively. Enzyme restriction CIBN and VAMP2 were inserted into the corresponding sites of the EGFP-C1 vector (Clontech).
  • PHR and CIBN-mCherry-VAMP2 were respectively amplified using the tagging P2A sequence.
  • PCR-amplified and P2A sequence-containing fragments were recombined into the NheI/XhoI restricted pECFP-C1 vector (Clontech) using the In-Fusion® HD Cloning Kit (#639649, Clontech).
  • PCR-amplified CamKIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2 was recombined into the PacI/EcoRI restricted pLenti-CaMKIIa-ChETA-EYFP vector (Clontech) using the In-Fusion HD Cloning Kit (#639649, Clontech). .
  • PCR-amplified CK(0.4) of AAV-CK(0.4)GW was MluI/NheI restricted pAAV-pAAV-CamIIa- Enzymatically linked to PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2.
  • the PacI/BamHI restriction PCR-amplified GfaABC1D promoter was inserted into the corresponding site of pLenti-CamKIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2.
  • MluI/NheI restriction PCR-amplified DDC promoter was inserted into the corresponding site of pLenti-CamKIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2.
  • COS-7 cells were transfected by electroporation (NeonTM Transfection System, Invitrogen) according to the manufacturer's recommendations. Briefly, 1 ⁇ 10 6 COS-7 cells were mixed with a total of 1 ⁇ g DNA and electroporated with 2 pulses of 1050 V for 30 msec. 5 ⁇ 10 4 transfected cells were plated on ⁇ -Plate 96 Well ibiTreat wells (ibidi, 89626). After transfection, the plate was covered with aluminum foil to avoid exposure to light before experiments. After 20-24 hours, replace with fresh media and imaging.
  • Live-cell confocal imaging was performed using a Nikon A1R confocal microscope mounted on a Nikon Eclipse Ti body and equipped with CFI Plan Apochromat VC objectives (60 ⁇ , numerical aperture (NA) 1.4, oil, Nikon Instruments).
  • the live cell imaging chamber and incubation system were used to maintain environmental conditions at 37°C, 10% CO 2 (Live Cell Instruments).
  • Images were acquired using an NIS-element AR (Nikon Instruments), and light excitation was performed with a 488-nm laser with a laser power of approximately 6.5 ⁇ W.
  • NIS-element AR NIS-element AR
  • ImageJ software were used for image analysis. Signals are defined as 0.3-2.0 micron square size, circularity 0.0-1.0 in NIS-element (Nikon).
  • NS-1 cells were plated in 8-well Lab-Tek II Chambered Coverglass (#155409, Thermo Scientific) and transfected with Lipofectamine LTX (Invitrogen) according to the manufacturer's recommendations. did Briefly, a total of 0.2 ⁇ g DNA diluted in 20 ⁇ l Opti-MEMTM I Reduced Serum Medium (#31985062, GibcoTM, Life technologies) was mixed with Lipofectamine LTX reagent. The DNA and reagent mixture was then carefully added to each well along with fresh medium. After transfection, the plate was covered with aluminum foil to avoid exposure to light before experiments. After 20-24 hours, replace with fresh media and imaging.
  • TIRF imaging was performed at room temperature (25° C.) using a Nikon Ti-E TIRF microscope equipped with a CFI Apochromat TIRF 60 ⁇ objective (Nikon Instruments). Neuropeptide Y-VENUS and light stimulation were simultaneously visualized using a 488-nm laser (CVI-Melles Griot). To induce exocytosis, imaging wells were treated with Ringer's solution containing high concentrations of KCl (70 mM KCl, 67 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 10 mM HEPES, and 2.8 mM glucose).
  • Example 1-5 Stereotaxic surgery and virus injection
  • mice were anesthetized with 300 mg/kg body weight of 2,2,2-tribromoethanol (#T48402, Sigma-Aldrich).
  • Lentiviruses of Lenti-CamKIIa::PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2 or AAV-DDC::PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP were injected into the hippocampal CA3 region ( ⁇ 1.94 at bregma for 6-7 week old mice).
  • mice were injected stereotactically using a SP100IZ syringe pump (WPI).
  • WPI SP100IZ syringe pump
  • Lenti-GFAP::PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2 was stereotaxically injected into neocortical layer 2/3.
  • mice were first anesthetized with a 4% isoflurane and oxygen mixture, and re-anaesthetized with ketamine at 20 mg/kg body weight. The body temperature was maintained at 36° C. using a heating pad.
  • Lentivirus of Lenti-CamKIIa::PHR-P2A-CIBN-mCherry was injected into the hippocampal CA3 region (for 8-10 week old mice, -1.94 mm lambda from bregma, ⁇ 2.3 mm lateral to midline, -2.12 mm ventral from brain surface). ) was stereotactically injected using pressure (Picospritzer III, Parker Hannifin Corp.).
  • Lenti-DDC::PHR-P2A-CIBN-mCherry's lentivirus was injected into the SNpc region (for 7-9 week-old mice, -3.2 mm lambda from bregma, ⁇ 1.7 mm lateral to midline, -3 mm ventral from brain surface). was injected stereotactically using a syringe pump (KD Scientific).
  • the optical cannula (R-FOC-L100C-22NA, ceramic ferrule- ⁇ 1.25mm/100um/0.22NA, RWD) was inserted into the hippocampal CA1 area (-1.94 mm lambda from bregma, ⁇ 1.3 mm lateral to midline, -1.20 from brain surface). mm ventral side) was targeted.
  • dental cement was applied to cover the skull.
  • mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of 2% 2,2,2-tribromoethanol and perfused with 0.9% normal saline followed by ice-cold 4% paraformaldehyde (PFA).
  • PFA paraformaldehyde
  • the extracted brains were post-fixed in 4% PFA at 4° C. for 24 hours and then dehydrogenated in 30% sucrose containing PBS for 24 hours.
  • Brain slices were prepared to a thickness of 30 ⁇ m using a cryostat and stored in a storage solution at 4°C. Brain sections were washed with PBS and incubated for 1 hour in blocking solution (0.3% Triton X-100, 2% donkey serum, 2% goat serum, 0.1M PBS).
  • Brain slices were incubated for 18 hours at 4°C on a shaker with primary antibodies (ab167453, Anti-mCherry antibody, abcam; NB120-13249, Novus Biologicals, anti-Bassoon antibody (SAP7F407); ab133856, Anti-Bassoon antibody) containing blocking solution. SYT1 antibody, abcam) was immunostained. After primary immunostaining, sections were washed with PBS at room temperature, secondary immunostained in the corresponding fluorescence-conjugated secondary antibody containing blocking solution for 1 hour, and then washed with PBS. Brain sections were mounted with fluorecent mounting media (S3023, Dako). A series of fluorescence images were obtained with an Eylra 7 Zeiss super-resolution microscope. 3D imaging rendering and analysis were performed with IMARIS software.
  • Example 1-7 Section patch-clamp recording
  • mice were anesthetized with isoflurane and sacrificed. 300 ⁇ m coronal sections of the hippocampus were prepared in ice-cold sucrose-based cutting solution (sucrose, 234 mM; KCl, 2.5 mM; MgSO 4 , 10 mM; NaH 2 PO 4 , 1.25 mM) from DSK Linear Slicer pro7 (Dosaka EM Co., Ltd). ; NaHCO 3 , 24 mM; CaCl 2 -2H 2 O, 0.5 mM; and glucose, 11 mM).
  • evoked-EPSC recording For evoked-EPSC recording, recording in oxygenated aCSF (NaCl, 126 mM; NaHCO 3 , 24 mM; KCl, 2.5 mM; NaH 2 PO 4 , 1 mM; MgCl 2 , 2 mM; and glucose, 10 mM) Prior to this, sections were collected for at least 1 hour. For miniature EPSC recordings, 1 ⁇ M of TTX was added to oxygenated aCSF. In the case of evoked EPSC and miniature EPSC recordings, current was recorded by whole-cell voltage-clamp in an oxygenated aCSF solution.
  • oxygenated aCSF NaCl, 126 mM; NaHCO 3 , 24 mM; KCl, 2.5 mM; NaH 2 PO 4 , 1 mM; MgCl 2 , 2 mM; and glucose, 10 mM
  • Recording electrode (5-8 M ⁇ ) is made of standard-wall borosilicate glass (GC150F-10, Warner Instrument Corp., USA), CeMeSO 4 -based internal solution (CeMeSO 4 , 132 mM; NaCl, 8 mM; HEPES, 10 mM; EGTA, 0.25 mM; Mg-ATP, 2 mM; and Na 2 -GTP, 0.5 mM; QX-314, 1 mM; with pH adjusted to 7.3 and osmolality adjusted to 295 mOsmol/kg).
  • Synaptic activity was induced by pair-stimulation (0.1 ms, 50 mA to 500 mA, 100 msec interval) of the Schaffer collateral pathway using a tungsten bipolar electrode maintained at -60 mV.
  • mice were anesthetized with isoflurane and sacrificed. 300 ⁇ m coronal sections of the hippocampus were prepared in ice-cold NMDG-based cutting solution (NMDG, 93 mM; KCl, 2.5 mM; NaHPO, 1.2 mM; NaHCO, 30 mM; HEPES, 20 mM; Glucose, 25 mM; Sodium ascorbate, 5 mM; Thourea, 2 mM; Sodium pyruvate, 3 mM; MgCl 2 , 10 mM; CaCl 2 , 0.5 mM, pH adjust to 7.3 with HCl, 310 mOsm).
  • NMDG 93 mM
  • KCl 2.5 mM
  • NaHPO 1.2 mM
  • NaHCO NaHCO
  • HEPES 20 mM
  • Glucose 25 mM
  • Sodium ascorbate 5 mM
  • Thourea 2
  • mice 10-12 week old male mice were individually placed in a white acrylic container (40 cm ⁇ 40 cm ⁇ 40 cm) with two identical objects placed in the first and second quadrants of the cage (Fig. 12). ), and were allowed to freely explore the object for 10 min (affinity session). Mice were then transferred to their home cages for 1 hour. After 1 hour, the mice were placed back in the acrylic container with two identical objects placed in the first and fourth quadrants of the cage (Fig. 12D) and allowed to explore the object freely for 10 minutes (test session). Each mouse's exploratory behavior was monitored with a video camera and manually analyzed by the experimenter.
  • Example 3 Engineering of Opto-vTrap, a LARIAT-based vesicle capture system
  • LARIAT a light-guided vesicle trap system based on LARIAT
  • CIB1 conjugated to the multimeric protein of interest FIG. 1A
  • CRY2 strongly and reversibly interacts with CIB1 to form a CRY2:CIB1 heterodimer, which aggregates with other CRY2s (CRY2:CRY2) to form homo-oligomers under blue light illumination (Bugaj, LJ, et al., (2013).
  • CRY2 refers to a shortened version of the PHR domain (amino acids 1-498) of CRY2.
  • VAMP2 v-SNARE protein
  • t-SNARE proteins such as SNAP25 and syntaxin-1
  • Sci Rep 7 , 2835 Hayashi, T., et al., (1994) EMBO J 13 , 5051-5061; Lin, JY, et al., (2013) Neuron 79 , 241-253; Schoch, S ., et al., (2001. Science 294 , 1117-1122).
  • Opto-vTrap consisted of two molecular components of an overexpression vector (pcDNA3.1) containing CMV::CIBN-mCherry-VAMP2 (CIBN-VAMP2) and CMV::CRY2PHR-mCitrine (CRY2), respectively ( Figure 1A).
  • CIBN-VAMP2 CMV::CIBN-mCherry-VAMP2
  • CMV::CRY2PHR-mCitrine CRY2
  • Figure 1A Upon illumination of the Opto-vTrap with blue light ( ⁇ 488 nm), CRY2 reacts by forming heterodimers of CRY2:CIBN-VAMP2 and homo-oligomers of CRY2:CRY2 (Fig. 1B).
  • Opto-vTrap inhibits follicular exocytosis upon light stimulation
  • TIRF total internal reflection fluorescence
  • NPY-VENUS VENUS pH-insensitive fluorescent protein tagged neuropeptide-Y (NPY)
  • a high potassium solution 70 mM KCl was applied 30 s after the start of 488 nm blue light stimulation at 5 Hz and 40% duty cycle (80 ms exposure, 120 ms off, 200 ms interval) (Fig. 3B).
  • the 488 nm laser simultaneously activated Opto-vTrap and visualized NPY-VENUS in TIRF imaging (Fig. 3B).
  • high potassium was applied under the control condition (no CRY2), it was observed that numerous spots of about 1 ⁇ m in size appeared (Fig. 3C and 3D), which were not present under the Opto-vTrap condition (Fig. This indicates that the exocytosis of NPY-VENUS was disrupted.
  • Example 6 Inhibition of evoked EPSCs at Schaffer collateral synapses by Opto-vTrap activation
  • evoked excitatory post-synaptic currents evoked excitatory post-synaptic currents, eEPSCs
  • paired-pulse electrical stimulation Amaral, DG, and Witter, MP (1989). Neuroscience 31 , 571-591)
  • a continuous 300 ⁇ W continuous blue light was turned on in the CA1 region near the patch-clamp cell (Fig. 4E).
  • follicle biogenesis and presynaptic volume were not affected by Opto-vTrap expression (FIG. 8). These results indicate that overexpression of Opto-vTrap is inactive in the absence of light stimulation. In contrast, the Opto-vTrap-injection condition showed a significant decrease in primary and secondary eEPSC amplitudes after 15 min of light-on (Fig. 4G-J).
  • AAV Opto-vTrap was further constructed from the CK(0.4) promoter, which is a short version (0.4 kb) of the CamKIIa promoter (8.5 kb) (Dittgen, T., et al., (2004).
  • Example 7 Inhibition of vesicular gliotransmitter release in neocortical astrocytes by activation of Opto-vTrap
  • the compact GFAP promoter GfaABC1D (Lee, Y., et al., (2008). Glia 56 , 481-493), a lentivirus containing Opto-vTrap and CRY2PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2 was constructed, and the lentivirus was injected into the 2/3 layer of the neocortex (hereinafter, the GFAP promoter means the GfaABC1D promoter). ) (Fig. 5A).
  • NMDA receptor (NMDAR)-mediated spontaneous current activity was recorded in layer 2/3 neurons located near Opto-vTrap expressing astrocytes in sharply prepared cortical slices (Fig. 5A).
  • TFLLR To selectively activate astrocytes, TFLLR, a selective agonist of PAR1, a G i - and G q -binding GPCR that induces Ca 2+ increase in astrocytes, was applied (Hollenberg, MD, et al., (1997) Can J Physiol Pharmacol 75 , 832-841).
  • PAR1 activation has been demonstrated to induce both TREK-1-mediated fast glutamate release and Best1-mediated slow glutamate release in hippocampal CA1 (Woo, DH, et al., (2012).
  • NMDAR-mediated spontaneous transient inward currents characterized by decay time dynamics in cortical layer 2/3 neurons: decay times of 20 ms and neuronal mEPSCs circled in blue, decay times of 40–45 ms. and glial-induced fast current (gFIC) indicated by orange squares, and glial-induced slow current (sFIC) with decay times of 100-300 ms and indicated by green triangles ( Figure 5B and 5C). While all types of currents were inhibited by D-AP5, only gFIC and gSIC were inhibited by ifenprodil, suggesting that they are mediated by GluN2B-containing extrasynaptic NMDA receptors (Figs.
  • the optogenetic vesicle secretion control system Using the optogenetic vesicle secretion control system according to the present invention, secretion of transmitters including neurotransmitters and glial transmitters can be reversibly inhibited, and thus their functions can be inhibited. Therefore, it is possible to control brain functions, functions of normal cells or nerve cells through optogenetics, and can be applied as a treatment mechanism for diseases caused by overexcitation of nerve cells. In addition, it can exhibit skin beauty wrinkle improvement effects and muscle disorder treatment effects through cell function suppression.

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Abstract

본 발명은 빛을 이용하여 가역적으로 세포 전달물질 분비를 억제할 수 있는 시스템에 관한 것으로, 상기 시스템은 세포의 흥분성(excitability)을 조절하는 방식이 아닌 전달물질을 포함하는 소낭을 직접 컨트롤하여 분비를 억제하는 것을 특징으로 한다. 상기 시스템은 빛으로 소낭을 일시적으로 덩어리화하여 소낭이 분비하려는 기능을 억제하고, 신경세포, 비신경세포, 신장세포 등 다양한 종류의 세포에서 이용이 가능하다. 본 발명에 따르면, 광유전학을 통한 뇌 기능 조절, 일반 세포 혹은 신경세포 등의 기능 조절이 가능하며, 신경세포 과흥분에 의한 질병에 치료 기전으로 응용 가능하다. 또한, 세포 기능 억제를 통해 피부미용 주름 개선 효과, 세포 기능 억제를 통해 근육 장애 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

가역적 소낭 분비 조절 광유전학 시스템
본 발명은 세포외 방출(exocytotic release)로부터 전달물질-함유 소낭(vesicle)을 일시적으로 포획하기 위한 광-유도 및 가역적 억제 시스템인 Opto-vTrap(optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release)에 관한 것이다.
뇌 세포 사이에서 분자를 방출 및 수용함으로써 활성화되거나 침묵되는 뇌 회로를 이해하는 것은 신경과학의 주요 도전과제이다. 뉴런과 뉴런, 또는 신경교와 뉴런 사이의 빠른 기능 정보 전달 동안, 전달물질(transmitter)은 칼슘-유발 소낭 엑소사이토시스에 의해 방출된다(Harada, K., et al., (2015). Front Neurosci 9, 499; Parpura, V., and Zorec, R. (2010). Brain Res Rev 63, 83-92; Sudhof, T.C. (2012). Cold Spring Harb Perspect Biol 4, a011353). 세포 수준에서부터 행동하는 동물에 이르기까지 뇌 활동을 조절하는 도구를 개발하기 위한 상당한 연구 노력이 있어 왔다. 공간적, 시간적, 및 세포 유형 특이적으로 뇌 회로를 조절하기 위해 광유전학적 전략이 등장했다. 빛-개폐형 양이온 채널인 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2, ChR2)는 빛 조사에 의해 막 전위를 탈분극시켜 뇌 네트워크를 자극하는 데 널리 사용된다(Boyden, E.S., et al., (2005). Nat Neurosci 8, 1263-1268; Lin, J.Y., et al., (2009). Biophys J 96, 1803-1814; Nagel, G., et al., (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13940-13945). 활성화된 ChR2는 ChR2의 게이트와 전압-개폐형 칼슘 채널을 통한 칼슘 유입을 증가시키고, 이는 전달물질의 방출을 유발한다(Schoenenberger, P., et al., (2011). Exp Physiol 96, 34-39). ChR2, ChR2 변이체 또는 기타 유사한 것과 같은 신경 활성을 자극하기 위한 광유전학적 도구는 일반적으로 막 전위를 탈분극시키는 양이온 채널을 사용한다(Nagel, G., et al., (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13940-13945).
한편, 할로로돕신(halorhodopsin, NpHR), 아키로돕신(archaerhodopsin, Arch) 및 음이온-전도 채널로돕신과 같은 신경 활성을 억제하기 위한 광유전학적 도구가 대중화되었다. NpHR 및 Arch는 막 전위를 과분극시키는 광유도성 염화물 또는 양성자 펌프를 사용한다(Chow, B.Y., et al., (2010). Nature 463, 98-102; Zhang, F., et al., (2007). Nature 446, 633-639). NpHR 및 Arch의 광 활성화는 짧은 시간 내에 뉴런 활동을 효율적으로 침묵시키지만, 장시간 활성화는 혼란스러운 반응을 초래한다(Wiegert, J.S., et al., (2017). Neuron 95, 504-529). 예를 들어, NpHR의 장시간 활성화는 세포 내 염화물 이온의 축적과 GABAA 역전 전위 이동을 일으켜 GABA에 대한 의도하지 않은 흥분 반응을 초래한다(Raimondo, J.V., et al., (2012). Nat Neurosci 15, 1102-1104). 또한, NpHR-매개 과분극은 저전압 활성화 T 타입 칼슘 채널의 비활성화로부터 회복하게 하고, 이후에 광 제거시 활성화되어 의도하지 않은 다발성 발화(burst firing)를 초래한다(Mahn, M., et al., (2016). Nat Neurosci 19, 554-556; Mattingly, M., et al., (2018). PLoS One 13, e0200107; Weiss, N., et al., (2012). Commun Integr Biol 5, 377-380). Arch의 활성화는 세포 내 양성자 농도의 감소 또는 높은 pH를 유발하여 칼슘 농도 증가 및 신경전달물질(neurotransmitter) 방출과 같은 다양한 세포 경로에 중대한 영향을 미친다(Mahn, M., et al., (2016). Nat Neurosci 19, 554-556).
이러한 중요한 이슈들로 인해 많은 연구자들이 NpHR 및 Arch를 외면하고, Gi-DREADD(Gi-Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)와 같은 화학유전학적 접근 방식을 선호하기 시작했다(Armbruster, B.N., et al., (2007). Proc Natl Acad Sci U S A 104, 5163-5168). 그러나 Gi-DREADD는 느린 약물 개시 및 오프셋 역학과 같은 다른 단점 외에도 활성화시 의도하지 않은 다발성 발화와 같은 동일한 문제를 갖고 있다(Saloman, J.L., et al., (2016). J Neurosci 36, 10769-10781; Wiegert, J.S., et al., (2017). Neuron 95, 504-529). 마지막으로, NpHR 및 Arch는 성상세포와 같은 비흥분성 신경교 세포에 적용할 수 없다. 이러한 단점으로, 인해 막 전위에 영향을 미치지 않으면서 고급 광유전학적 침묵인자 개발이 절실히 필요하다.
막 전위 조작의 단점을 회피하기 위해, 시냅스 소낭 방출 시스템을 직접적으로 타겟하고 방해하는 광유전학적 및 화학유전학적 도구가 고려되었다(Karpova, A.Y., et al., (2005). Neuron 48, 727-735; Lin, J.Y., et al., (2013). Neuron 79, 241-253; Liu, Q., et al., (2019). Neuron 101, 863-875 e866). 시냅스 소낭 방출 시스템에는 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion Attachment protein REceptor) 복합체-매개 소낭 도킹 및 프라이밍, SNARE 복합체에 컴플렉신의 결합, 및 시냅토태그민-1에 대한 칼슘 결합 및 소낭 융합을 위한 기공을 형성하기 위한 SNARE 복합체 지퍼링이 포함된다(Rizo, J., and Xu, J. (2015). Annu Rev Biophys 44, 339-367; Sudhof, T.C. (2004). Annu Rev Neurosci 27, 509-547; Zhou, Q., et al., (2017). Nature 548, 420-425). SNARE 복합체는 VAMP2(vesicle associated membrane protein 2, Synaptobrevin2)를 포함하는 고도로 보존된 vesicular SNARE(v-SNARE)와 신탁신-1 및 SNAP25를 포함하는 t-SNARE(target plasma membrane SNARE)로 구성된다(Sollner, T., et al., (1993). Cell 75, 409-418). 소낭 방출 시스템을 광유전학적으로 타겟하고 방해하기 위해, CALI(Chromophore-assisted light inactivation) 기반 시냅스 억제(InSynC)의 도입이 보고된 바 있다(Lin, J.Y., et al. (2013). Neuron 79, 241-253). 상기 시스템은 v-SNARE를 손상시키고 시냅스 소낭 방출을 방해하는 일중항 산소의 빛-의존적 생성을 활용한다. 그러나, 이 시스템은 생성된 일중항 산소가 확산되어 근처의 단백질을 영구적으로 파괴할 수 있기 때문에 심각한 오프타겟 효과가 있다.
최근에 보고된 광-활성 보툴리눔 신경독(PA-BoNT)은 빛 조사에 따라 VAMP2를 직접 절단하여 이러한 한계를 극복하고자 하였다(Liu, Q., et al. (2019). Neuron 101, 863-875 e866). 그러나, PA-BoNT는 C. elegans에서 약 24시간의 매우 긴 회복 시간을 보여주었고, 이는 절단된 VAMP2가 새로운 단백질 합성에 의해 또는 손상되지 않은 VAMP2로부터의 측면 이동에 의해 보충되는 데 오랜 시간이 걸리기 때문일 수 있다(Liu, Q., et al. (2019). Neuron 101, 863-875 e866). InSynC는 손상된 단백질의 느린 보충으로 인해 비슷한 긴 회복 시간을 갖는다. 긴 회복 시간은 일반적으로 수행할 수 있는 실험 유형에 시간 제약을 부과한다. 예를 들어, 새로운 대상 인식, 대상 위치 인식, 5회 사회적 상호작용, 공포 조건화 및 소거와 같은 단기 행동 테스트는 24시간 회복 시간을 갖는 광유전학적 도구로 수행할 수 없다. 따라서 빠른 회복 시간으로 소낭 방출 시스템을 방해하는 새로운 광유전학적 도구의 개발이 필요하다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 소낭 엑소사이토시스의 직접적인 억제를 위한 빠른 가역적 광유전학적 억제 시스템인 Opto-vTrap을 디자인하고 개발하였다. 이 시스템은 전달물질을 포함하는 소낭을 직접적으로 타겟하여 소낭 클러스터로 격리하고 소낭 방출을 억제한다. Gi-DREAD 시스템과 달리 Opto-vTrap은 광-유도 온/오프를 사용하여 빠르게 활성화하고 복구한다. 또한, NpHR 또는 Arch와 달리 막 전위 변화를 유도하지 않는다. 그리고 Opto-vTrap은 광유전학적 프로브를 타겟하는 다른 소낭보다 훨씬 빠른 회복을 보인다.
본 발명자들은 소낭 방출 시스템을 직접적으로 타겟하고 가역적으로 방해하고자 최근 특성화된 LARIAT(light-activated reversible inhibition by assembled trap)를 사용하였다(Lee, S., et al., (2014). Nat Methods 11, 633-636). LARIAT는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 크립토크롬 2(CRY2)와 CIB1(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix 1) 사이의 청색광-유도 이성체화(heteromerization) 특성을 활용하며, 이는 1초 미만의 분해능과 몇 분 내의 빠른 가역성을 갖는다(Kennedy, M.J., et al., (2010). Nat Methods 7, 973-975). 이러한 특성으로 인해, LARIAT는 CRY2-CIB1 다량체 복합체를 형성하여 표적 단백질을 격리한다(Kennedy, M.J., et al., (2010). Nat Methods 7, 973-975; Lee, S., et al., (2014). Nat Methods 11, 633-636). 본 발명자들은, Opto-vTrap이 뉴런의 시냅스 소낭과 성상세포의 교세포전달물질 함유 소낭을 효과적이고 가역적으로 포획하는 것을 확인하였다. 또한, Opto-vTrap은 세포, 뇌 절편 및 동물 행동 실험에 널리 사용될 수 있으며, 빠른 시간에 회복되고 막 전위에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
요약하면, Opto-vTrap의 광 활성화는 1분 이내에 완전한 소낭-덩어리화(clusterization)와 엑소사이토시스(exocytosis)의 완전한 억제를 일으켰으며, 광 제거 후 30분 이내에 회복되었다. 본 발명자들은 뇌 절편에서 Opto-vTrap의 활성화시 시냅스 전달 및 신경교 전달의 상당한 감소를 확인하였다. Opto-vTrap은 1시간 이내에 완전한 회복으로 해마 의존적 기억 회복(hippocampus-dependent memory retrieval)을 유의하게 억제하였다. 결과적으로, 최소한의 교란 효과로 뇌 활동 및 행동을 제어하는 차세대 광유전학적 침묵인자(silencer)로서 Opto-vTrap이 사용될 수 있음을 시사한다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
뇌 세포 사이에서 분자를 방출 및 수용함으로써 활성화되거나 침묵되는 뇌 회로를 이해하는 것은 신경과학의 주요 도전과제이다. 뉴런과 뉴런, 또는 신경교와 뉴런 사이의 빠른 기능 정보 전달 동안, 전달물질(transmitter)은 칼슘-유발 소낭 엑소사이토시스에 의해 방출된다(Harada, K., et al., (2015). Front Neurosci 9, 499; Parpura, V., and Zorec, R. (2010). Brain Res Rev 63, 83-92; Sudhof, T.C. (2012). Cold Spring Harb Perspect Biol 4, a011353). 세포 수준에서부터 행동하는 동물에 이르기까지 뇌 활동을 조절하는 도구를 개발하기 위한 상당한 연구 노력이 있어 왔다. 공간적, 시간적, 및 세포 유형 특이적으로 뇌 회로를 조절하기 위해 광유전학적 전략이 등장했다. 빛-개폐형 양이온 채널인 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2, ChR2)는 빛 조사에 의해 막 전위를 탈분극시켜 뇌 네트워크를 자극하는 데 널리 사용된다(Boyden, E.S., et al., (2005). Nat Neurosci 8, 1263-1268; Lin, J.Y., et al., (2009). Biophys J 96, 1803-1814; Nagel, G., et al., (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13940-13945). 활성화된 ChR2는 ChR2의 게이트와 전압-개폐형 칼슘 채널을 통한 칼슘 유입을 증가시키고, 이는 전달물질의 방출을 유발한다(Schoenenberger, P., et al., (2011). Exp Physiol 96, 34-39). ChR2, ChR2 변이체 또는 기타 유사한 것과 같은 신경 활성을 자극하기 위한 광유전학적 도구는 일반적으로 막 전위를 탈분극시키는 양이온 채널을 사용한다(Nagel, G., et al., (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13940-13945).
한편, 할로로돕신(halorhodopsin, NpHR), 아키로돕신(archaerhodopsin, Arch) 및 음이온-전도 채널로돕신과 같은 신경 활성을 억제하기 위한 광유전학적 도구가 대중화되었다. NpHR 및 Arch는 막 전위를 과분극시키는 광유도성 염화물 또는 양성자 펌프를 사용한다(Chow, B.Y., et al., (2010). Nature 463, 98-102; Zhang, F., et al., (2007). Nature 446, 633-639). NpHR 및 Arch의 광 활성화는 짧은 시간 내에 뉴런 활동을 효율적으로 침묵시키지만, 장시간 활성화는 혼란스러운 반응을 초래한다(Wiegert, J.S., et al., (2017). Neuron 95, 504-529). 예를 들어, NpHR의 장시간 활성화는 세포 내 염화물 이온의 축적과 GABAA 역전 전위 이동을 일으켜 GABA에 대한 의도하지 않은 흥분 반응을 초래한다(Raimondo, J.V., et al., (2012). Nat Neurosci 15, 1102-1104). 또한, NpHR-매개 과분극은 저전압 활성화 T 타입 칼슘 채널의 비활성화로부터 회복하게 하고, 이후에 광 제거시 활성화되어 의도하지 않은 다발성 발화(burst firing)를 초래한다(Mahn, M., et al., (2016). Nat Neurosci 19, 554-556; Mattingly, M., et al., (2018). PLoS One 13, e0200107; Weiss, N., et al., (2012). Commun Integr Biol 5, 377-380). Arch의 활성화는 세포 내 양성자 농도의 감소 또는 높은 pH를 유발하여 칼슘 농도 증가 및 신경전달물질(neurotransmitter) 방출과 같은 다양한 세포 경로에 중대한 영향을 미친다(Mahn, M., et al., (2016). Nat Neurosci 19, 554-556).
이러한 중요한 이슈들로 인해 많은 연구자들이 NpHR 및 Arch를 외면하고, Gi-DREADD(Gi-Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)와 같은 화학유전학적 접근 방식을 선호하기 시작했다(Armbruster, B.N., et al., (2007). Proc Natl Acad Sci U S A 104, 5163-5168). 그러나 Gi-DREADD는 느린 약물 개시 및 오프셋 역학과 같은 다른 단점 외에도 활성화시 의도하지 않은 다발성 발화와 같은 동일한 문제를 갖고 있다(Saloman, J.L., et al., (2016). J Neurosci 36, 10769-10781; Wiegert, J.S., et al., (2017). Neuron 95, 504-529). 마지막으로, NpHR 및 Arch는 성상세포와 같은 비흥분성 신경교 세포에 적용할 수 없다. 이러한 단점으로, 인해 막 전위에 영향을 미치지 않으면서 고급 광유전학적 침묵인자 개발이 절실히 필요하다.
막 전위 조작의 단점을 회피하기 위해, 시냅스 소낭 방출 시스템을 직접적으로 타겟하고 방해하는 광유전학적 및 화학유전학적 도구가 고려되었다(Karpova, A.Y., et al., (2005). Neuron 48, 727-735; Lin, J.Y., et al., (2013). Neuron 79, 241-253; Liu, Q., et al., (2019). Neuron 101, 863-875 e866). 시냅스 소낭 방출 시스템에는 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion Attachment protein REceptor) 복합체-매개 소낭 도킹 및 프라이밍, SNARE 복합체에 컴플렉신의 결합, 및 시냅토태그민-1에 대한 칼슘 결합 및 소낭 융합을 위한 기공을 형성하기 위한 SNARE 복합체 지퍼링이 포함된다(Rizo, J., and Xu, J. (2015). Annu Rev Biophys 44, 339-367; Sudhof, T.C. (2004). Annu Rev Neurosci 27, 509-547; Zhou, Q., et al., (2017). Nature 548, 420-425). SNARE 복합체는 VAMP2(vesicle associated membrane protein 2, Synaptobrevin2)를 포함하는 고도로 보존된 vesicular SNARE(v-SNARE)와 신탁신-1 및 SNAP25를 포함하는 t-SNARE(target plasma membrane SNARE)로 구성된다(Sollner, T., et al., (1993). Cell 75, 409-418). 소낭 방출 시스템을 광유전학적으로 타겟하고 방해하기 위해, CALI(Chromophore-assisted light inactivation) 기반 시냅스 억제(InSynC)의 도입이 보고된 바 있다(Lin, J.Y., et al. (2013). Neuron 79, 241-253). 상기 시스템은 v-SNARE를 손상시키고 시냅스 소낭 방출을 방해하는 일중항 산소의 빛-의존적 생성을 활용한다. 그러나, 이 시스템은 생성된 일중항 산소가 확산되어 근처의 단백질을 영구적으로 파괴할 수 있기 때문에 심각한 오프타겟 효과가 있다.
최근에 보고된 광-활성 보툴리눔 신경독(PA-BoNT)은 빛 조사에 따라 VAMP2를 직접 절단하여 이러한 한계를 극복하고자 하였다(Liu, Q., et al. (2019). Neuron 101, 863-875 e866). 그러나, PA-BoNT는 C. elegans에서 약 24시간의 매우 긴 회복 시간을 보여주었고, 이는 절단된 VAMP2가 새로운 단백질 합성에 의해 또는 손상되지 않은 VAMP2로부터의 측면 이동에 의해 보충되는 데 오랜 시간이 걸리기 때문일 수 있다(Liu, Q., et al. (2019). Neuron 101, 863-875 e866). InSynC는 손상된 단백질의 느린 보충으로 인해 비슷한 긴 회복 시간을 갖는다. 긴 회복 시간은 일반적으로 수행할 수 있는 실험 유형에 시간 제약을 부과한다. 예를 들어, 새로운 대상 인식, 대상 위치 인식, 5회 사회적 상호작용, 공포 조건화 및 소거와 같은 단기 행동 테스트는 24시간 회복 시간을 갖는 광유전학적 도구로 수행할 수 없다. 따라서 빠른 회복 시간으로 소낭 방출 시스템을 방해하는 새로운 광유전학적 도구의 개발이 필요하다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 소낭 엑소사이토시스의 직접적인 억제를 위한 빠른 가역적 광유전학적 억제 시스템인 Opto-vTrap을 디자인하고 개발하였다. 이 시스템은 전달물질을 포함하는 소낭을 직접적으로 타겟하여 소낭 클러스터로 격리하고 소낭 방출을 억제한다. Gi-DREAD 시스템과 달리 Opto-vTrap은 광-유도 온/오프를 사용하여 빠르게 활성화하고 복구한다. 또한, NpHR 또는 Arch와 달리 막 전위 변화를 유도하지 않는다. 그리고 Opto-vTrap은 광유전학적 프로브를 타겟하는 다른 소낭보다 훨씬 빠른 회복을 보인다.
본 발명자들은 소낭 방출 시스템을 직접적으로 타겟하고 가역적으로 방해하고자 최근 특성화된 LARIAT(light-activated reversible inhibition by assembled trap)를 사용하였다(Lee, S., et al., (2014). Nat Methods 11, 633-636). LARIAT는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 크립토크롬 2(CRY2)와 CIB1(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix 1) 사이의 청색광-유도 이성체화(heteromerization) 특성을 활용하며, 이는 1초 미만의 분해능과 몇 분 내의 빠른 가역성을 갖는다(Kennedy, M.J., et al., (2010). Nat Methods 7, 973-975). 이러한 특성으로 인해, LARIAT는 CRY2-CIB1 다량체 복합체를 형성하여 표적 단백질을 격리한다(Kennedy, M.J., et al., (2010). Nat Methods 7, 973-975; Lee, S., et al., (2014). Nat Methods 11, 633-636). 본 발명자들은, Opto-vTrap이 뉴런의 시냅스 소낭과 성상세포의 교세포전달물질 함유 소낭을 효과적이고 가역적으로 포획하는 것을 확인하였다. 또한, Opto-vTrap은 세포, 뇌 절편 및 동물 행동 실험에 널리 사용될 수 있으며, 빠른 시간에 회복되고 막 전위에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
요약하면, Opto-vTrap의 광 활성화는 1분 이내에 완전한 소낭-덩어리화(clusterization)와 엑소사이토시스(exocytosis)의 완전한 억제를 일으켰으며, 광 제거 후 30분 이내에 회복되었다. 본 발명자들은 뇌 절편에서 Opto-vTrap의 활성화시 시냅스 전달 및 신경교 전달의 상당한 감소를 확인하였다. Opto-vTrap은 1시간 이내에 완전한 회복으로 해마 의존적 기억 회복(hippocampus-dependent memory retrieval)을 유의하게 억제하였다. 결과적으로, 최소한의 교란 효과로 뇌 활동 및 행동을 제어하는 차세대 광유전학적 침묵인자(silencer)로서 Opto-vTrap이 사용될 수 있음을 시사한다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 비침습적, 시간적, 공간적, 가역적인 방식으로 소낭 분비를 조절할 수 있는 핵산 구조체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 구조체를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용한 소낭 분비 억제 방법 및 소낭 분비 조절 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 포함하는 소낭 분비 억제용 조성물, 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약학적 조성물 및 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애의 치료방법, 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료를 위한 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터의 용도 및 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약제 제조를 위한 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CIBN-VAMP2 융합 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 CRY2 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는, 광 조사에 의해 광유전학적으로 조절 가능한 소낭 분비 조절용 핵산 구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 구조체를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 숙주세포에 제8항의 벡터를 주입하는 단계; 및 (b) 청색광을 조사하여 전달물질을 포함하는 소낭을 덩어리화하는 단계를 포함하는 소낭 분비 억제 방법 및 (c) 청색광을 제거하여 소낭의 덩어리화를 해제하는 단계를 더 포함하는 소낭 분비 조절 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 구조체 및 상기 벡터를 포함하는 소낭 분비 억제용 조성물, 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약학적 조성물 및 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애의 치료방법, 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료를 위한 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터의 용도 및 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약제 제조를 위한 상기 핵산 구조체 또는 상기 벡터의 사용을 제공한다.
도 1은 Opto-vTrap의 설계 및 원리를 나타낸 모식도이다. (A) LARIAT 구성요소 및 Opto-vTrap 구조의 맵이다. (B) Opto-vTrap의 작동 원리 실험 모식도이다. 청색광(488nm)은 CRY2:CIBN-VAMP의 이종 이량체화(heteromeric dimerization) 및 CRY2:CRY2의 동종 올리고머화(homomeric oligomerization)를 유발하고, 소낭 덩어리화를 유도하므로, CIBN-VAMP2 타겟팅 소낭은 청색광 조명 시 가역적으로 덩어리화된다.
도 2는 COS-7 세포에서 Opto-vTrap의 특성화를 나타낸 도면이다. (A) Opto-vTrap의 라이브 셀 이미징 실험 타임라인 및 모식도로, 청색 레이저를 15분 동안 켰다(Light On). CIBN-VAMP2 검출을 위해 561 nm 레이저를 사용하였고, 488nm 레이저의 20% duty cycle의 0.2 Hz가 Opto-vTrap 활성화 및 CRY2 검출에 사용되었다. (B) COS-7 세포에 발현하는 Opto-vTrap(CIBN-mCherry-VAMP2 및 CRY2-mCitrine)의 공초점 이미지로, 노란색 화살표는 도 2C에서 키모그래프 묘사의 위치를 나타낸다. (C) 도 2B에 그려진 노란색 화살표를 통한 CIBN-VAMP2의 키모그래프로, 마젠타색 화살표는 도 2D에서 강도 프로필 묘사의 위치를 나타내고, 488 nm 레이저의 타이밍은 파란색 선으로 표시된다. (D) 도 2C의 키모그래프에서 마젠타색 화살표를 통한 CIBN-VAMP2의 강도 프로파일(intensity profile)이다. (E) 도 2B에서 소낭 수의 대표 정량화 그래프로, 파란색 박스는 Opto-vTrap 활성화를 위한 488nm 레이저 조명을 나타낸다. (F) 소낭 수의 각각(회색) 및 평균(검정색) 정량화 그래프이다. (G) 빛이 없을 때(Before), 빛을 가했을 때(Light On) 및 빛 제거(light off) 15분 후(After)의 CIBN-VAMP2 형광 백분율을 나타낸 그래프로, Before는 0-5분에 평균 수; Light On은 빛을 가한 동안 최대값; After는 25-30분에 평균 수를 각각 의미한다(n=10, 데이터는 평균±s.e.m으로 표시됨, ****p<0.0001, One-way ANOVA test). (H) 블루 레이저를 켰을 때 CIBN-VAMP2-mCherry와 CRY2-mCitrine 사이의 Pearson's 상관 계수(파란색 선) (n=10, 데이터는 평균±s.e.m으로 표시됨) 및 비선형 피팅 곡선(검정색, one-phase association)이다. (I) COS-7 세포에 발현하는 Opto-vTrap(CIBN-mCherry-VAMP2 및 CRY2-iFRP)의 대표 공초점 이미지이다. (J) CIBN-VAMP2-mCherry와 CRY2-iRFP682 사이의 Pearson's 상관 계수(검정색 선)로서, 파란색 박스는 488 nm 레이저 조명을 나타낸다(n=8, 데이터는 평균±s.e.m으로 표시됨).
도 3은 Neuroscreen-1 세포에서 Opto-vTtrap에 의한 소낭 엑소사이토시스의 광유전학적 억제를 나타낸 도면이다. (A) TIRF 현미경 관찰 하에서 소낭 엑소사이토시스 이미징의 실험 모식도이다. Control에서 CIBN-VAMP2 및 NPY-VENUS가 발현되었고, Opto-vTrap에서 CIBN-VAMP2, CRY2 및 NPY-VENUS가 발현되었다. 소낭 내용물로 NPY-VENUS를 사용하였으며, 엑소사이토시스 이벤트는 높은 KCl 농도의 Ringer's 용액에 의해 유발되었다. (B) TIRF 현미경 관찰 하에서 소낭 엑소사이토시스 이미징의 실험 타임라인으로, NPY-VENUS 검출 및 Opto-vTrap 활성화를 위해 488nm 레이저의 40% duty cycle의 5 Hz가 사용되었다. (C) Neuroscreen-1 세포에 발현하는 Control 및 Opto-vTrap의 대표 TIRF 현미경 이미지로, 초록색 신호는 NPY-VENUS를 나타낸다. (D) 높은 KCl 농도의 Ringer's 용액 처리 10초 후 Neuroscreen-1 세포에 발현하는 Control 및 Opto-vTrap의 대표 이미지로, 각각의 원은 소낭을 포함하고 도 3E에서 분석된 NPY-VENUS를 나타낸다. (E) 도 2B-D의 Neuroscreen-1 세포에 발현하는 Control 및 Opto-vTrap에서 NPY-VENUS의 대표 기록(trace)이다. (F) 높은 KCl 농도의 용액 처리 후 Neuroscreen-1 세포에 발현하는 Control 및 Opto-vTrap에서 NPY-VENUS 피크 진폭 백분율을 요약한 그래프이다(각각 n=11, 데이터는 평균±s.e.m으로 표시됨. ****P<0.0001, Mann-Whitney test).
도 4는 Opto-vTrap의 활성화가 Schaffer 부차 시냅스에서 evoked EPSC를 억제함을 보여준다. (A) Lentiviral CamKIIα::Opto-vTrap 구조 및 Opto-vTrap 발현을 위한 주입 전략의 맵이다. (B) Opto-vTrap 발현 세포에서 전류 주입에 대한 대표적 막 전위 기록(trace)이다. (C) Opto-vTrap 발현 세포에서 대표적인 막 전위 기록으로, 파란색 선은 청색광 조명을 나타낸다. (D) Before 및 Light On 조건에서 막 전위의 요약 그래프이다(n=5, Wilcoxon test). (E) 청색광 조명을 사용한 eEPSC 기록의 실험 모식도와 Before, Light On 및 After 각 조건에서 뇌 절편이 주입된 Control 및 Opto-vTrap에서 eEPSC의 대표 기록이다(Scale bar: 20 ms, 100 pA. P1: 1차 피크 진폭, P2: 2차 피크 진폭). (F) Control(왼쪽) 및 Opto-vTrap(오른쪽) 조건에서 쌍-펄스 자극 동안 1차 진폭의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=6, Opto-vTrap은 n=9). (G) Control(왼쪽) 및 Opto-vTrap 그룹(오른쪽)에서 쌍-펄스 자극 동안 1차 진폭의 백분율로서, 파란색 박스는 청색광 조명(0~15분)을 나타낸다(Control은 n=6, Opto-vTrap은 n=9). (H) Control 및 Opto-vTrap 그룹의 Before, Light On 및 After 조건 동안 1차 진폭의 백분율에 대한 요약 막대 그래프이다(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=12; ****P<0.0001, *p < 0.05; n.s. between Before vs. After (25 and 30 min); One-way ANOVA (mixed-effects analysis)). (I) Control(왼쪽) 및 Opto-vTrap 마우스(오른쪽)에서 쌍-펄스 자극 동안 2차 진폭의 백분율로서, 파란색 박스는 청색광 조명(0~15분)을 나타낸다(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=12). (J) Control 및 Opto-vTrap 그룹의 Before 및 Light On, After 조건 동안 2차 진폭의 백분율에 대한 요약 막대 그래프이다(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=12; *p < 0.05; n.s. between Before vs. After (20, 25, and 30 min) in EPSC 2nd amplitude (도 4J); One-way ANOVA (mixed-effects analysis)). (K) Control(왼쪽) 및 Opto-vTrap 그룹(오른쪽)에서 쌍-펄스 자극 동안 쌍-펄스 비율(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=12)이다. (L) Control 및 Opto-vTrap의 Before, Light On 및 After 조건 동안 쌍-펄스 비율의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=12; n.s. between all conditions, One-way ANOVA (mixed-effects analysis)).
도 5는 Opto-vTrap의 활성화가 신피질 성상세포 소낭 교세포전달물질(gliotransmitter) 방출을 억제함을 보여준다. (A) Lentiviral GFAP::Opto-vTrap 구조의 맵 및 성상세포 엑소사이토시스-매개 빠른 내부 NMDAR-매개 전류 측정의 실험 전략이다. (B) 기준선에서 기록되는 대표적인 전체 셀 전류로서, 청색광 Light Off인 TFLLR 적용 및 Light On인 TFLLR 적용을 나타낸다. (C) GFAP::Opto-vTrap 조건의 뉴런에서 일시적인 NMDAR-매개 전류의 역학을 나타낸다. (D) Control에서 TFLLR로 성상세포를 자극하기 전(기준선) 및 후의 주파수에 대한 통합 데이터를 나타낸다(Control은 n=14, TFLLR+D-AP5는 n=6, TFLLR+ifenprodil은 n=7; *p < 0.05, paired-t-test). (E) 파상풍 신경독소 경쇄(TeNTx, 3nM, 기록 15분 전) 또는 스파딘(TREK-1 차단제, 200nM)의 배스 적용을 포함한 성상세포의 세포내 관류 후 기록된 gFIC 및 gSIC의 주파수 통합 데이터를 나타낸다(기준선은 n=6, TFLLR은 n=5; **p < 0.01, non-paired t-test). (F) Control(왼쪽) 및 Opto-vTrap(오른쪽) 마우스의 신피질 뉴런에 기록된 신경교-유도 빠른(gFICs) 및 느린(gSICs) 전류의 평균 진폭 및 주파수의 대표 시간 경과로서, 파란색 박스는 청색광 조명(5~20분)의 타이밍을 나타낸다(Control은 n=4, Opto-vTrap은 n=4, #p < 0.05, paired t-test). (G) Before(Light Off), Light On 및 After(Light Off) 동안 gFIC 및 gSIC의 주파수에 대한 통합 데이터를 나타낸다(기준선은 n=4, TFLLR은 n=4, *p < 0.05, non-paired-t-test). 데이터는 평균±s.e.m으로 표시된다.
도 6은 Opto-vTrap의 활성화가 상황별 공포 기억 회복을 가역적으로 억제함을 보여준다. (A) Opto-vTrap 주입 마우스에서 Schaffer 부차 경로 매개 기억 회복(공포 조건화 테스트)의 실험 전략이다. (B) 기억 회복 테스트의 실험 모식도로, trial 1-6에서 상황별 회복 테스트 동안 청색 레이저는 trial 2에서만 켜졌다. (C) Trial 1-3 및 4-6 동안 각 Opto-vTrap 마우스의 얼어붙는 행동의 백분율을 나타낸 것으로서, 파란색 박스는 488 nm 레이저 노출의 타이밍(trial 2만 해당)을 나타낸다(n=6). (D) 도 6C에서 정규화된 얼어붙는 행동을 나타낸 것으로, trial 1-3의 얼어붙는 행동 퍼센트는 trial 1로 정규화되고, trial 4-6은 trial 4로 정규화된다(Control은 n=10, Opto-vTrap은 n=6, ****p<0.0001, in Opto-vTrap trial 2 vs. Opto-vTrap trial 5 and ***p<0.001 in Opto-vTrap trial 2 vs. Control trial 2, 2-way ANOVA; ####p<0.0001, RM one-way ANOVA in Opto-vTrap trial 1 vs. trial 2). 데이터는 평균±s.e.m으로 표시된다.
도 7은 도 4와 관련되며, Opto-vTrap 발현 뉴런의 고유 특성을 보여준다. (A) CA3 뉴런을 발현하는 Control 및 Opto-vTrap의 대표 전류 주입 기록이다. (B) 전류 주입 중 활동 전위 점화 주파수(action potential firing frequency)의 요약 그래프이다(n.s., 2-way Anova). (C) 활동 전위 역치의 요약 그래프이다(unpaired t-test). (D) Control 및 Opto-vTrap 발현 세포의 입력 저항 요약 그래프이다(unpaired t-test). 데이터는 평균±s.e.m으로 표시된다.
도 8은 도 4와 관련되며, OptovTrap 주입 마우스에서 해마의 방사층(stratum radiatum) 영역의 초해상도 이미징을 보여준다. (A-B) Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹에서 mCherry, SYT1 및 Bassoon의 대표적인 초해상도 이미지이다. (C) Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹에서 SYT1 스팟 수의 요약 그래프이다(Control은 n=27, Opto-vTrap은 n=25, unpaired t-test). (D) Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹에서 Bassoon의 부피의 요약 그래프이다(Control은 n=27, Opto-vTrap은 n=25, unpaired t-test). 데이터는 평균±s.e.m으로 표시된다.
도 9는 도 4와 관련되며, Opto-vTrap의 활성화가 Schaffer 부차 시냅스에서 evoked EPSC를 억제함을 보여준다. (A) Control 및 opto-vTrap 조건에서 Before, Light On일 때 1차 진폭의 요약 그래프이다(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=7, ***p<0.001, paired t-test). (B) Control 및 opto-vTrap 조건에서 Before, Light On일 때 2차 진폭의 요약 그래프이다(Control은 n=7, Opto-vTrap은 n=7, ****P<0.0001, paired t-test).
도 10은 도 4와 관련되며, Opto-vTrap의 활성화가 Schaffer 부차 시냅스에서 mEPSC를 억제함을 보여준다. (A) Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹의 Before 및 Light On 조건에서 mEPSC의 대표 기록이다. (B) Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹에서 실행 평균 mEPSC 주파수의 대표 그래프이다. (C) Before 조건에서 Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹의 mEPSC 진폭의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=6, Opto-vTrap은 n=6, unpaired t-test). (D) Before 조건에서 Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹의 mEPSC 주파수의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=6, Opto-vTrap은 n=6, unpaired t-test). (E) Before 및 Light On 조건에서 Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹의 mEPSC 주파수의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=6, Opto-vTrap은 n=6, unpaired t-test).
도 11은 도 4와 관련되며, AAV-Opto-vTrap의 활성화가 Schaffer 부차 시냅스에서 evoked EPSC를 억제함을 보여준다. (A) AAV CK(0.4)::Opto-vTrap 구조 및 Opto-vTrap 발현을 위한 주입 전략의 맵이다. (B) 청색광 조명을 사용한 eEPSC 기록의 실험 모식도와 각각 Before, Light on 및 After 조건 동안 뇌 절편에 주입된 Control 및 Opto-vTrap에서 eEPSC의 대표 기록이다. (C) 쌍-펄스 자극 AAV-Opto-vTrap 주입 그룹의 1차 진폭(왼쪽) 및 2차 진폭(오른쪽)의 백분율로서, 파란색 박스는 청색 조명(0~15분)을 나타낸다(n=7). (D) Control 및 Opto-vTrap 주입 그룹에서 Before 및 Light On 조건 동안 1차 및 2차 진폭의 백분율에 대한 요약 막대 그래프이다(n=7, *p < 0.05, paired t-test). (E) AAV-Opto-vTrap 주입 그룹에서 쌍-펄스 자극 동안 쌍-펄스 비율이다(n=7). (F) AAV-Opto-vTrap 주입 그룹에서 Before 및 Light On 동안의 쌍-펄스 비율의 요약 막대 그래프이다(n=7, paired t-test). 데이터는 평균±s.e.m으로 표시된다.
도 12는 도 6과 관련되며, Dark에서 Opto-vTrap의 발현은 학습 및 기억 행동과 일반적인 운동 활동에 영향을 미치지 않음을 보여준다. (A) 오픈 필드 테스트의 실험 타임 라인과 Control 및 OptovTrap 주입 마우스의 대표 이동 기록이다. (B) 모서리 비율의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=10, Opto-vTrap은 n=12, unpaired t-test). (C) 마우스 속도의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=10, Opto-vTrap은 n=12, unpaired t-test). (D) 새로운 장소 인식 테스트의 실험 타임 라인 및 모식도이다. (E) 식별 지수의 요약 막대 그래프이다(Control은 n=10, Opto-vTrap은 n=12, *<0.05, paired t-test).
도 13은 도 6과 관련되며, Opto-vTrap의 활성화는 연속적인 패러다임에서 운동 활동을 가역적으로 억제함을 보여준다. (A) Lentiviral DDC::Opto-vTrap 구조의 맵 및 opto-vTrap 주입 마우스에서 등쪽 선조체 경로 매개 운동 활동 테스트에 대한 SNpc의 실험 전략이다. (B) Opto-vTrap 주입 마우스의 운동 지수로서, 파란색 박스는 488 nm 레이저 노출의 타이밍을 나타낸다. (C) Opto-vTrap 주입 마우스의 정규화된 움직임 인덱스(normalized motion index)로, 파란색 박스는 488 nm 레이저 노출의 타이밍을 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
광유전학에 의한 뇌 활동의 시공간적 제어는 뇌 기능을 연구하는 데 필수적인 도구로 등장했다. 뇌 활동을 억제하기 위해 할로로돕신 및 아키로돕신과 같은 광유전학적 프로브는 막 전위를 과분극시켜 간접적으로 전달물질 분비를 억제하지만, 바람직하지 않은 이온 불균형과 반동 스파이크를 유발하며, 비흥분성 신경교 세포에는 사용할 수 없다.
본 발명자들은, 비침습적, 시간적, 공간적, 가역적인 방식으로 전달물질의 분비를 억제하여 세포간 신호전달 기전을 방해하고 기능을 변화시키는 방식을 개발하고자 하였다. 이를 위해 광유전학적인 방법, 특히 CIBN과 CRY2 단백질이 청색광(~488nm)에서 결합하고 청색광을 제거하면 다시 분리되는 특성을 이용하였다.
새로 개발된 Opto-vTrap은 소낭 방출, 시냅스 전달, 교세포전달 및 행동의 광-유도 가역적 억제를 위한 매우 효과적인 광유전학적 트랩이다. 막 전위 변화를 우회하고 소낭 엑소사이토시스 경로를 직접 타겟함으로써, 과분극-유도 반동 스파이크 및 시냅스 앞 말단의 잔류 Ca2+와 같은 Arch 및 NpHR에 대한 악명 높은 많은 교란 효과를 우회할 수 있다. Opto-vTrap의 이러한 고유한 이점, 즉 전압-독립성 및 Ca2+-독립성은 뉴런뿐만 아니라 신경교 세포(glial cells), 내분비 세포(endocrine cells) 및 활동 전위 또는 반동 스파이크를 매개하기 위해 전압-개폐 이온 채널의 호스트를 발현하지 않는 기타 분비 세포와 같은 비흥분성 세포에도 광범위하게 적용할 수 있음을 의미한다. 광범위한 적용 가능성에는 세포 배양 및 오가노이드 시스템의 in vitro 모델, 다양한 영역의 뇌 절편의 ex vivo 모델, 행동하는 동물의 in vivo 동물 모델에서의 사용 가능성도 포함된다. 이러한 장점으로 인해 Opto-vTrap은 억제를 위한 광유전학적 프로브 선택 목록의 맨 위에 있다.
Opto-vTrap은 Gi-DREADD 시스템과 같은 다른 시냅스 전달 억제 방법보다 높은 억제 효율을 보인다. 해마 CA3에서 AAV-hM4Di를 국소적으로 발현하면 hM4Di의 아고니스트인 clozapine-N-oxide의 배스 관류에 의해 fEPSP가 약 30% 차단되는 것으로 보고된 바 있다(Katzel, D., et al., (2014). Nat Commun 5, 3847).
본 발명자들은 Opto-vTrap 활성화 시 eEPSC의 약 45% 차단을 관찰했다(도 4H). 대조적으로, gFIC 주파수에서 TFLLR-유도 증가의 거의 완전한 억제와 기저 gFIC의 주파수의 상당한 감소를 관찰했다(도 5F). 신경교 소낭 방출은 Opto-vTrap 활성화에 의해 거의 완전히 억제된 반면, 시냅스 소낭 방출은 절반만 차단된 것으로 보인다. 이 불일치는 해마에서 CA3에서 CA1으로의 양쪽 투영(bilateral projection)을 고려하면 설명될 수 있다. 해마 CA1 입력은 동측 CA3-CA1 Schaffer 부차 경로뿐만 아니라 반대쪽 CA3 교감 경로로부터도 발생한다(Bliss, T.V., et al., (1983). J Physiol 341, 617-626). 또한, 동측 및 반대쪽 투영 모두 설치류 모델에서 시냅스 가소성에 동등하게 기여한다는 일부 보고서가 존재한다(Bliss, T.V., et al., (1983). J Physiol 341, 617-626; Kohl, M.M., et al., (2011). Nat Neurosci 14, 1413-1415; Shipton, O.A., et al., (2014). Proc Natl Acad Sci U S A 111, 15238-15243).
따라서, evoked-EPSC(자극에 의한 흥분성 시냅스 후 전류)의 부분적 차단은 해마의 방사층에서 Schaffer 부차 경로의 전기 자극 동안, 반대쪽 CA3 접합면 투영과 같은 Opto-vTrap-비발현 섬유로부터 남은 시냅스 방출로 인한 것일 가능성이 높다. 반면, Opto-vTrap 활성화에 의해 거의 완전한 억제를 보인 gFIC 전류는 Opto-vTrap이 발현된 국소 영역에서만 발생한다. 또한, Opto-vTrap 바이러스 형질도입 효율은 이미 높아진 억제 효율에 약간의 영향을 미칠 수 있다. 따라서, Opto-vTrap의 발현과 활성화가 소낭 방출을 고효율로 억제할 수 있다고 볼 수 있다.
또한, Opto-vTrap이 동물의 행동에 적용 가능한지 여부를 확인하기 위해 상황별 공포 기억 회복 테스트를 수행하였다. 동일한 CA3-CA1 회로를 한쪽으로 치우치게 타겟하였고, Opto-vTrap에 의해 뇌 절편에서 고효율로 테스트되었다. Opto-vTrap 활성화 시 약 25%의 기억 회복 차단이 관찰되었으며(도 6C 및 6D), 이는 다른 실험 결과보다 상대적으로 낮은 값이다. CA3-CA1 및 CA1-amygdala 또는 CA1-mPFC와 같은 다양한 회로가 상황별 기억 회복 프로세스에 관여한다는 것은 잘 알려져 있다(Jimenez, J.C., et al., (2020). Nat Commun 11, 3492; Liu, X., et al., (2012). Nature 484, 381-385; Orsini, C.A., et al., (2011). J Neurosci 31, 17269-17277; Xu, C., et al., (2016). Cell 167, 961-972 e916). Opto-vTrap에 의한 CA3-CA1 회로의 한쪽만의 억제와 상황별 기억 회복에 관련된 다른 회로의 가능성을 감안할 때, 기억 회복의 25% 차단은 상당한 것으로 간주되어야 한다. 따라서, Opto-vTrap이 동물 행동에서 고효율로 특정 회로를 억제할 수 있는 것으로 볼 수 있다.
Opto-vTrap의 가장 두드러진 장점 중 하나는 빠른 회복 시간이다. 즉각적인 덩어리화 후 Opto-vTrap은 덩어리화를 완전히 해제하는 데 약 15분이 걸렸다(도 2D). 소포성 교세포전달에서 유사하게 15분 회복 시간이 관찰되었다(도 5F 및 5G). 해마 절편에서 Opto-vTrap 활성화 시 감소된 신경전달은 30분 이내에 회복되었지만, PPR에서 통계적으로 유의하지 않은 증가를 보였다(도 4G-도 4L). 마지막으로, 공포 기억 회복 테스트에서 Opto-vTrap 활성화에 의해 1시간 이내에 손상된 기억 회복의 완전한 복구를 확인하였다(도 6C). 행동 테스트의 특성으로 인해 더 짧은 간격을 테스트할 수 없었지만, 시험관 내(in vitro) 결과(도 2D 및 도 5D)에 기초할 때, 행동의 회복 시간이 1시간 미만일 수 있다. 두 개의 연속 세션 사이에 더 짧은 간격이 필요한 다른 행동 테스트로 더 짧은 회복 시간을 테스트하는 것은 흥미로울 것이다.
그럼에도 불구하고, 관찰된 Opto-vTrap의 1시간 회복 시간은 약 24시간의 매우 긴 회복 시간을 나타내는 PA-BoNT 및 InSynC와 같은 다른 광유전학적 프로브보다 훨씬 우수하다(Lin, J.Y., et al., (2013). Neuron 79, 241-253; Liu, Q., et al. (2019). Neuron 101, 863-875 e866). 결정적인 차이점은 Opto-vTrap의 활성화가 단백질 손상을 유발하지 않는다는 점이며, 손상된 단백질은 새로운 단백질 합성에 의해 보충되기까지 오랜 시간이 걸릴 것이다. 실제로, 등쪽 선조체에서 SNpc 뉴런 말단으로부터의 Opto-vTrap에 의한 도파민 방출 억제가 실시간 운동 행동 결핍을 유발하는지 여부를 조사했다(도 13). Opto-vTrap 활성화 시 움직임 감소의 자세한 메커니즘은 향후 조사가 필요하지만, 빛 자극 후 10분 이내에 움직임이 크게 감소하고 빛 제거 후 회복되는 것을 확인하였다(도 13C 및 도 13D).
Opto-vTrap의 또 다른 중요한 이점은 이의 설계가 빛 조건시 CIBN 및 CRY2 상호작용을 활용하는 LARIAT를 기반으로 한다는 사실에 있다. 최근, LARIAT의 기본 원리를 적용하여, 각각 빠른 세포내 막 응집을 유도하고 특정 mRNA의 번역을 억제하기 위해 IM-LARIAT 및 mRNA-LARIAT(Kim, N.Y., et al., (2020). Nat Cell Biol 22, 341-352; Nguyen, M.K., et al., (2016). Nat Chem Biol 12, 431-436)와 같은 LARIAT-파생 광유전학 도구의 다양한 버전을 추가로 개발하였다. 또한, 다양한 엑소사이토시스 소낭을 비특이적으로 타겟하는 VAMP2를 통해 소낭을 덩어리화함으로써 소낭 엑소사이토시스를 억제하는 LARIAT-유래 Opto-vTrap의 새로운 버전을 개발하였다.
유사한 컨셉을 바탕으로, vGluT, vGAT 및 vMAT와 같은 다른 표적 단백질을 사용하여 각각 글루타메이트, GABA 및 도파민을 포함하는 소낭의 서브타입을 특이적으로 타겟하는 것이 가능해야 한다. 시냅스 전달물질(synaptic transmitter) 또는 교세포전달물질(gliotransmitter) 방출뿐만 아니라, 조밀한 코어 소낭을 포함하는 작은 펩타이드 방출이 Opto-vTrap에 의해 차단될 수 있을 것으로 예상된다(도 3). 또한, CRY2clust 및 CRY2E281A-A9와 같은 CRY2:CRY2 동종 이량체화를 위한 CRY2 변이체의 훨씬 향상된 버전이 개발되었다. CRY2clust는 현재 사용되는 CRY2PHR에 비해 향상된 클러스터링 특성을 나타내는 한편(Park, H., et al., (2017). Nat Commun 8, 30), CRY2E281A-A9는 광섬유 케이블을 삽입할 필요 없이 비침습적 광자극을 허용하는 초고광 감도를 나타낸다(Kim, S., et al., (2020). Nat Commun 11, 210).
요약하면, 본 발명에서 개발된 기본 개념과 분자 도구는 다양한 뇌 영역이 인지 및 행동에 기여하는 방식에 대한 회로 수준 메커니즘을 설명하는 데 매우 유용하다. 나아가, LARIAT-기반 Opto-vTrap은 새로운 다용도의 유연한 광유전학적 도구의 개발을 시사한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, CIBN-VAMP2 융합 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 CRY2 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는, 광 조사에 의해 광유전학적으로 조절 가능한 소낭 분비(vesicle release) 조절용 핵산 구조체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 CIBN-VAMP2 융합 펩타이드를 코딩하는 핵산은 CIBN(N-terminal domain of CIB1)을 코딩하는 핵산 및 VAMP2(vesicle associated membrane protein 2)를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CIBN은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 VAMP2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
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Synaptobrevins/VAMPs, syntaxins, 및 25-kD synaptosomal-associated protein SNAP25은 시냅스 소낭과 시냅스 전 막의 도킹 및/또는 융합에 관여하는 단백질 복합체의 주요 구성요소로서, VAMP2는 소낭 관련 막 단백질(vesicle associated membrane protein)/synaptobrevin 패밀리의 구성원으로, 도킹과 융합 사이의 단계에서 신경전달물질 방출에 참여한다.
본 발명에 있어서, 상기 CRY2 도메인을 코딩하는 핵산은 CRY2(cryptochrome 2)의 PHR 도메인(CRY2PHR)을 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 PHR 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2022015396-appb-img-000003
본 발명에 있어서, 상기 광은 450~500nm 파장의 청색광인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 440 내지 490nm, 더욱 바람직하게는 488nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 “벡터”는 핵산 분자로서 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자로서, 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
벡터는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 숙주세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 벡터가 발현을 위해 사용되도록 즉, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되도록 숙주세포를 기반을 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
“작동 가능하게 연결”은 유전자 발현과 관련된 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 등)과 다른 유전자 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 유전자의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
경우에 따라서 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 비제한적으로 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예는 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포 글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 “플라스미드”이며, 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 것으로서, 여기에 예컨대, 표준 분자 클로닝 기법에 의해 추가적인 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다.
본 발명에 있어서, 바이러스 벡터는 예를 들어, Adeno-Associated Viral Vector(AAV), Adenoviral Vector(AdV), Lentiviral Vector(LV) 또는 Retroviral Vector(RV)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 숙주세포에 상기 벡터를 주입하는 단계; 및 (b) 청색광을 조사하여 전달물질(transmitter)을 포함하는 소낭을 덩어리화(clusterization)하는 단계를 포함하는 소낭 분비(vesicle release) 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 숙주세포에 상기 벡터를 주입하는 단계; (b) 청색광을 조사하여 전달물질(transmitter)을 포함하는 소낭을 덩어리화(clusterization)하는 단계; 및 (c) 청색광을 제거하여 소낭의 덩어리화를 해제(declusterization)하는 단계를 포함하는 소낭 분비(vesicle release) 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 덩어리화는 CIBN-VAMP2와 CRY2의 이종 이량체화(heteromeric dimerization) 및 CRY2와 CRY2의 동종 올리고머화(homomeric oligomerization)에 의해 유도되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소낭의 덩어리화 및 덩어리화 해제를 이용하여 가역적으로 소낭 분비를 억제할 수 있으므로 효과적으로 소낭 분비를 조절할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광은 450~500nm 파장의 청색광인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 440 내지 490nm, 더욱 바람직하게는 488nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 전달물질은 소낭 내 포함되어 엑소사이토시스(exocytosis)에 의해 전달될 수 있는 물질이라면 제한없이 포함되며, 신경전달물질(neurotransmitter) 또는 교세포전달물질(gliotransmitter)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “신경전달물질”은 화학적 시냅스(chemical synapse)에서 신경세포 간에 신호를 전달하는 매개체의 역할을 수행하는 분자로, 시냅스 소낭(synaptic vesicle)에 저장된 후 신경세포의 활성에 의해서 시냅스 틈(synaptic cleft)으로 분비되고 확산되어 시냅스후 세포(postsynaptic cell; 신경세포, 근육, 분비세포 등)에 존재하는 신경전달물질 수용체와 결합하여 수용체를 활성화시켜 새로운 신호를 발생시킨다. 신경전달물질은 글루탐산(glutamate), 글라이신(glycine), 감마아미노부틸산(GABA)과 같은 아미노산; 아세틸콜린(acetylcholine), 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 세로토닌(serotonin), 히스타민(histamine)과 같은 모노아민; 신경펩타이드 Y(neuropeptide Y, NPY), 소마토스타틴(somatostatin), 오피오이드(opioid) 펩타이드, 옥시토신(oxytocin), 물질 P(Substance P, SP), 엔돌핀(endorphin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin, CCK)과 같은 펩타이드; 멜라토닌(melatonin), 기체신호전달물질(gasotransmitter)과 같은 기타 신경전달물질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “교세포전달물질”은 신경교 세포(glial cell)에서 분비되는 화학물질로, 뉴런-신경교세포-다른세포간 신호전달을 촉진한다. 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 성상교세포(astrocyte), 미아교세포(microglia)를 포함하는 모든 신경교 세포에서 분비될 수 있으며, 주로 성상교세포에서 분비된다. 성상교세포에서 분비되는 교세포전달물질에는 글루탐산과 ATP가 있으며, 호모시스테산(homocysteic acid), 타우린(taurine), 심방나트륨배설인자(atrial natriuretic factor, ANF), 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-alpha) 및 GABA가 교세포전달물질에 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “형질주입(transfection)”은 “형질감염”이라고도 하며, 숙주세포에 핵산을 주입하는 것을 의미할 수 있고, 일 구체예에서, 렌티바이러스 벡터를 이용하여 숙주세포에 핵산을 주입하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “형질도입(transduction)”은 바이러스 벡터를 통하여 외부 DNA가 다른 세포에 도입되는 것을 의미할 수 있고, 일 구체예에서, 렌티바이러스 벡터에 의해 형질감염된 세포가 생산한 바이러스 입자를 다른 숙주세포에 처리하여 그 숙주세포에 표적 핵산이 도입되도록 하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 포함하는 소낭 분비(vesicle release) 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 소낭 분비 “억제”는 광 조사에 의해 광유전학적으로 소낭을 덩어리화(clusterization)하여 소낭 엑소사이토시스를 억제하는 것을 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 포함하는 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료를 위한 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체 또는 상기 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약제 제조를 위한 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체 또는 상기 벡터의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 “신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애”는 신경전달물질의 과도한 방출 또는 부적절한 방출과 관련된 뇌신경계, 신경정신계 또는 신경근육계 관련 질환/장애를 의미한다.
구체적으로, 뇌신경계 또는 신경정신계 질환/장애는 조현병(정신분열증, schizophrenia), 조울증(양극성 정동장애, bipolar disorder), 우울증(depressive disorder), 불안장애(anxiety disorder), 인격장애(personality disorder), 공포증(phobia), 외상후스트레스장애(post-traumatic stress disorder, PTSD), 주의력결핍/과잉행동 장애(attention deficit/hyperactivity disorder, ADHD), 뚜렛장애(Tourette's Disorder), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 뇌졸중(stroke)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 신경근육계 질환은 근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temperomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhydrosis), 성대 육아종(vocal fold granuloma)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “치료”는, 상기 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 증상의 경감 또는 완치되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 조성물이 작동하게 위해 청색광을 조사하는 행위도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 핵산 구조체 또는 벡터를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내로의 상기 핵산 구조체 또는 벡터의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서의 상기 핵산 구조체 또는 벡터를 함유하는 물질은, 환자에게 그 자체로서 또는 병용 요법(combination therapy)에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥, 근육, 피내 또는 뇌의 직접 주입을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 약학 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명의 상기 핵산 구조체 또는 벡터의 투여에 있어서, 당업계에 공지된 임의의 핵산 전달 방법이 사용될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 적합한 전달 시약은 예를 들어, Mirus Transit TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, polycations(예를 들어, polylysine), atelocollagen, nanoplexes 및 리포좀이 있다. 핵산 분자의 전달 운반체로서 아테로콜라겐(atelocollagen)의 사용은 Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); and Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)에 기술되어 있다. 예시적인 간섭 핵산 전달 시스템은 미국 특허 제8,283,461호, 제8,313,772호, 제8,501,930호에 제공된다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 구조체 또는 벡터는 리포솜(liposome) 등의 전달체를 이용하여 투여할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 핵산 구조체 또는 벡터를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 핵산 구조체 또는 벡터가 포함된 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클(vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467, 1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 용어 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 소낭 분비 조절용 핵산 구조체 또는 상기 벡터를 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서, 상기 “피부 개선”은 피부 보습, 피부 미백, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 주름 개선 또는 노화 방지를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 핵산 구조체 또는 벡터는 소낭에 포함된 신경전달물질을 활성적으로 분비할 수 없도록 하며, 따라서 근육 수축이 덜 일어나게 하여 피부 주름을 개선하는 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 리프팅, 피지 분비 개선, 여드름 개선, 땀 분비 억제(다한증 개선), 눈 밑 꺼짐 개선, 눈 밑 애교살, 근육 이완 및 통증 완화, 편두통 개선의 효과를 나타낼 수 있다.
상기 화장료 조성물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
상기 피부 개선용 조성물이 피부 외용제 제형으로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제와 같은 제형을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 개선용 조성물은 화장품 제조에 이용될 수 있다. 상기 조성물을 화장품으로 사용하는 경우, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양크림, 수분크림, 아이크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실험 모델 및 실험 대상 세부 정보
실시예 1-1: 동물
뇌 절편의 전기생리학적 분석을 위해 수컷 C57BL/6J 마우스(6-10주령)를 사용하였다. 행동 테스트는 수컷 C57BL/6J(10-14주령)를 사용하였다. 모든 마우스는 12:12-h 명암 주기(lights on 8:00 A.M.)와 설치류 먹이 및 역삼투성 물에 대한 자유로운 접근이 가능한 상태로 부서별 동물 시설의 훈련된 교수진에 의해 유지되었다. 모든 실험 절차는 한국과학기술연구원(서울, 한국) 및 기초과학연구원(대전, 한국)의 동물실험윤리위원회(IACUC)의 절차에 따라 수행되었다.
실시예 1-2: 세포주
In vitro 이미징을 위해 COS-7 세포(#21651, 한국세포주은행)와 Neuroscreen-1 세포(NS-1, PC12 세포의 서브클론; Cellomics)를 사용하였다. COS-7 세포는 37℃, 10% CO2 조건에서, 10% 열-불활성화 소태아혈청(FBS, #10082147, Gibco™Life technologies)이 포함된 90% Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM, #10-013-CV, Corning®에서 유지되었다. NS-1 세포는 T. Meyer(Stanford University)로부터 제공되었고, 37℃, 5% CO2 조건에서, 15% 열-불활성화 말 혈청(#26050088, Gibco™Life technologies) 및 5% 열-불활성화 FBS(#10082147, Gibco™Life technologies)가 포함된 80% Ham's F-12K(Kaighn's) 배지(#21127022, Gibco™Life technologies)에서 유지되었다. e-Myco Mycoplasma PCR detection kit(ver. 2.0, iNtRON)를 이용하여 모든 세포주에 mycoplasma가 없는 것을 확인하였다.
실시예 1-3: DNA 구조체 제조
Mus musculus VAMP2 함유 벡터(VAMP2-BTX)는 J. Sanes(Harvard University)로부터 제공되었다. CRY2PHR-mCherry 및 CIBN-pmEGFP 코딩 벡터는 C.L.Tucker(University of Colorado)로부터 제공되었다. CIBN-mCherry-VAMP2 구조체의 클로닝을 위해, CIBN(CIB1의 아미노산 1-170) 및 VAMP2를 코딩하는 서열은 각각 NheI/AgeI 및 XhoI/EcoRI에 의해 PCR-증폭 및 제한된다. 효소 제한 CIBN 및 VAMP2를 EGFP-C1 벡터(Clontech)의 해당 부위에 삽입했다. PHR-mCitrine 구조체의 클로닝을 위해, 이전 논문(Lee, S., et al., (2014). Nat Methods 11, 633-636; Nguyen, M.K., et al., (2016). Nat Chem Biol 12, 431-436)에 설명된 코돈 최적화 PHR(CRY2의 아미노산 1-498)을 사용하였다. NheI/AgeI-제한 코돈-최적화된 PHR은 pmcitrine-C1(Clontech)의 해당 부위에 삽입된다. PHR-iRFP682 구조체의 클로닝을 위해, PHR-mCitrine 구조체에서 mCitrine을 iRFP682-N1 벡터(Clontech)의 iRFP682로 대체하였다. PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 클로닝을 위해, tagging P2A 서열을 사용하여 PHR 및 CIBN-mCherry-VAMP2를 각각 증폭하였다. PCR-증폭 및 P2A 서열 함유 단편은 In-Fusion®HD Cloning Kit(#639649, Clontech)를 이용하여 NheI/XhoI 제한 pECFP-C1 벡터(Clontech)로 재조합되었다. pLenti-CamkIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 클로닝을 위해, 먼저 AscI/NheI 제한 PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2를 pAAV-CaMKIIa-eArchT3.0-P2A-EGFP-WPRE-hGHpA(Clonetech)의 해당 부위에 삽입하여 pAAV-CamIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2를 클로닝하였다. PCR-증폭된 CamKIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2는 In-Fusion®HD Cloning Kit(#639649, Clontech)를 이용하여 PacI/EcoRI 제한 pLenti-CaMKIIa-ChETA-EYFP 벡터(Clontech)로 재조합되었다. AAV-CK(0.4)-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 클로닝을 위해, AAV-CK(0.4)GW(Stratagene)의 PCR-증폭 CK(0.4)는 MluI/NheI 제한 pAAV-pAAV-CamIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2와 효소적으로 연결되었다. pLenti-GFAP-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 클로닝을 위해, PacI/BamHI 제한 PCR-증폭된 GfaABC1D 프로모터를 pLenti-CamKIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 해당 부위에 삽입하였다. pLenti-DDC-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 클로닝을 위해, MluI/NheI 제한 PCR-증폭된 DDC 프로모터를 pLenti-CamKIIa-PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2의 해당 부위에 삽입하였다.
실시예 1-4: 형질주입 및 라이브 셀 이미징
공초점 생세포 이미징(confocal live-cell imaging)을 위해, COS-7 세포를 제조사의 권장사항에 따라 전기천공법(Neon™ Transfection System, Invitrogen)으로 형질주입하였다. 요약하면, 1 × 106 COS-7 cells을 총 1 μg DNA와 혼합하고, 30 msec 동안 1050 V의 2 pulses로 전기천공하였다. 5 × 104개의 형질주입 세포를 μ-Plate 96 Well ibiTreat well(ibidi, 89626)에 플레이팅하였다. 형질주입 후, 실험 전 빛에 노출되지 않도록 플레이트를 알루미늄 호일로 덮었다. 20-24시간 후, 새로운 배지와 이미징으로 교체한다. 라이브 셀 공초점 이미징은 Nikon Eclipse Ti 본체에 장착되고 CFI Plan Apochromat VC objectives(60×, numerical aperture(NA) 1.4, oil, Nikon Instruments)가 장착된 Nikon A1R confocal microscope를 사용하여 수행되었다. 라이브 셀 이미징 챔버와 인큐베이션 시스템은 37℃, 10% CO2(Live Cell Instruments)에서 환경 조건을 유지하는 데 사용되었다. NIS-element AR(Nikon Instruments)을 사용하여 이미지를 얻고, 빛 자극은 약 6.5 μW 레이저 출력으로 488-nm 레이저로 수행되었다. 이미지 분석을 위해, NIS-element(Nikon) 및 ImageJ software를 사용하였다. 신호는 NIS-element (Nikon)에서 0.3-2.0 마이크론 정사각형 크기, 원형도 0.0-1.0으로 정의된다.
TIRF 이미징을 위해, 5 × 104개의 NS-1 세포를 8-well Lab-Tek II Chambered Coverglass(#155409, Thermo Scientific)에 플레이팅하고, 제조사의 권장사항에 따라 Lipofectamine LTX(Invitrogen)으로 형질주입하였다. 요약하면, 20 μl Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium(#31985062, Gibco™, Life technologies)에 희석된 총 0.2 μg DNA를 Lipofectamine LTX 시약과 혼합하였다. 그 다음, DNA 및 시약 혼합물을 새로운 배지와 함께 각 웰에 조심스럽게 첨가하였다. 형질주입 후, 실험 전 빛에 노출되지 않도록 플레이트를 알루미늄 호일로 덮었다. 20-24시간 후, 새로운 배지와 이미징으로 교체한다. TIRF 이미징은 CFI Apochromat TIRF 60× 대물렌즈(Nikon Instruments)가 장착된 Nikon Ti-E TIRF 현미경을 사용하여 상온(25℃)에서 수행하였다. 488-nm 레이저(CVI-Melles Griot)를 사용하여 신경펩타이드 Y-VENUS와 광 자극을 동시에 시각화하였다. 엑소사이토시스를 유도하기 위해, 높은 농도의 KCl 함유 Ringer’s 용액(70 mM KCl, 67 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, and 2.8 mM glucose)을 이미징 웰에 처리하였다.
실시예 1-5: 입체정위시술(stereotaxic surgery) 및 바이러스 주입
모든 바이러스는 KIST 바이러스 시설(http://virus.kist.re.kr) 또는 IBS 바이러스 시설(http://www.ibs.re.kr/virusfacility)에서 생성되었다. 전기생리학적 분석을 위한 바이러스 주입을 위해, 마우스를 300 mg/kg 체중의 2,2,2-트리브로모에탄올(#T48402, Sigma-Aldrich)로 마취시켰다. Lenti-CamKIIa::PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2 또는 AAV-DDC::PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP의 렌티바이러스를 해마 CA3 영역(6-7주령 마우스의 경우, 브레그마에서 -1.94 mm 람다, 정중선으로 ± 2.28 mm 측면, 뇌 표면에서 -2.10 mm 배쪽)에 SP100IZ 주사기 펌프(WPI)를 사용하여 정위적으로 주입하였다. Lenti-GFAP::PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2를 신피질 층 2/3에 정위적으로 주입하였다. 시각 자극을 이용한 행동 실험을 위해, 마우스를 먼저 4% 이소플루란 및 산소 혼합물로 마취하고, 20 mg/kg 체중의 케타민으로 재마취하였다. 발열 패드를 이용하여 체온을 36℃로 유지시켰다. Lenti-CamKIIa::PHR-P2A-CIBN-mCherry의 렌티바이러스를 해마 CA3 영역(8-10주령 마우스의 경우, 브레그마에서 -1.94 mm 람다, 정중선으로 ± 2.3 mm 측면, 뇌 표면에서 -2.12 mm 배쪽)에 압력(Picospritzer III, Parker Hannifin Corp.)을 이용하여 정위적으로 주입하였다. Lenti-DDC::PHR-P2A-CIBN-mCherry의 렌티바이러스를 SNpc 영역(7-9주령 마우스의 경우, 브레그마에서 -3.2 mm 람다, 정중선으로 ± 1.7 mm 측면, 뇌 표면에서 -3 mm 배쪽)에 주사기 펌프(KD Scientific)를 사용하여 정위적으로 주입하였다. 광학 캐뉼라(R-FOC-L100C-22NA, ceramic ferrule-Ø1.25mm/100um/0.22NA, RWD)는 해마 CA1 영역(-브레그마에서 1.94 mm 람다, 정중선으로 ± 1.3 mm 측면, 뇌 표면에서 -1.20 mm 배쪽)을 타겟으로 하였다. 광학 캐뉼라 이식 후, 두개골을 덮기 위해 치과용 시멘트를 도포하였다.
실시예 1-6: 뇌 절편의 면역조직화학 및 초해상도 이미징
면역염색을 위해, 마우스를 2% 2, 2, 2-트리브로모에탄올의 복강내 주사로 마취하고, 0.9% 생리식염수로 관류시킨 후, 아주 찬 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 관류시켰다. 추출한 뇌를 24시간 동안 4℃에서 4% PFA에 후고정시킨 후, PBS를 함유하는 30% 수크로오스에서 24시간 동안 탈수소화하였다. 뇌 절편은 저온유지장치에 의해 30μm 두께로 준비되었고, 4℃의 저장 용액에 보관되었다. 뇌 절편을 PBS로 세척하고, 차단 용액(0.3% Triton X-100, 2% 당나귀 혈청, 2% 염소 혈청, 0.1M PBS)에서 1시간 동안 배양하였다. 뇌 절편은 4℃, 진탕기에서 18시간 동안, 차단 용액을 포함하는 1차 항체(ab167453, Anti-mCherry antibody, abcam; NB120-13249, Novus Biologicals, anti-Bassoon antibody (SAP7F407); ab133856, Anti-SYT1 antibody, abcam)에서 면역염색되었다. 1차 면역염색 후, 절편을 실온에서 PBS로 세척하고, 차단 용액을 포함하는 상응 형광-접합 2차 항체에서 1시간 동안 2차 면역염색한 다음, PBS로 세척하였다. 뇌 섹션은 fluorecent mounting media(S3023, Dako)로 마운팅되었다. 일련의 형광 이미지는 Eylra 7 Zeiss 초해상도 현미경으로 얻었다. 3D 이미징 랜더링 및 분석은 IMARIS 소프트웨어로 수행하였다.
실시예 1-7: 절편 패치-클램프 기록
eEPSC 기록을 위해, 마우스를 이소플루란으로 마취하고, 희생시켰다. 해마의 300 μm 관상 절편은 D.S.K Linear Slicer pro7(Dosaka EM Co., Ltd)의 얼음 냉각 수크로오스 기반 절단 용액(sucrose, 234 mM; KCl, 2.5 mM; MgSO4, 10 mM; NaH2PO4, 1.25 mM; NaHCO3, 24 mM; CaCl2-2H2O, 0.5 mM; and glucose, 11 mM)에서 준비되었다. evoked-EPSC 기록의 경우, 산소처리된 aCSF(NaCl, 126 mM; NaHCO3, 24 mM; KCl, 2.5 mM; NaH2PO4, 1mM; MgCl2, 2 mM; and glucose, 10 mM)에 기록하기 전에, 절편을 최소 1시간 동안 회수하였다. miniature EPSC 기록의 경우, TTX 1 μM를 산소처리된 aCSF에 추가였다. evoked EPSC 및 miniature EPSC 기록의 경우, 산소처리된 aCSF 용액에서 whole-cell voltage-clamp로 전류를 기록하였다. Recording electrode(5-8 MΩ)는 standard-wall borosilicate glass(GC150F-10, Warner Instrument Corp., USA)로 제작되고, CeMeSO4-based internal solution(CeMeSO4, 132 mM; NaCl, 8 mM; HEPES, 10 mM; EGTA, 0.25 mM; Mg-ATP, 2 mM; and Na2-GTP, 0.5 mM; QX-314, 1 mM; with pH adjusted to 7.3 and osmolality adjusted to 295 mOsmol/kg)으로 채워졌다. 시냅스 활성은 -60 mV에서 유지되는 tungsten bipolar electrode를 이용하여 Schaffer 부차 경로의 쌍-자극(0.1 ms, 50 mA~500 mA, 100 msec interval)에 의해 유발되었다.
막 전위 기록을 위해, 마우스를 이소플루란으로 마취하고 희생시켰다. 해마의 300 μm 관상 절편은 얼음 냉각 NMDG 기반 절단 용액(NMDG, 93 mM; KCl, 2.5 mM; NaH2PO4, 1.2 mM; NaHCO3, 30 mM; HEPES, 20 mM; Glucose, 25 mM; Sodium ascorbate, 5 mM; Thourea, 2 mM; Sodium pyruvate, 3 mM; MgCl2, 10 mM; CaCl2, 0.5 mM, pH adjust to 7.3 with HCl, 310 mOsm)에서 준비되었다. 동일한 용액에서, 절편을 32℃에서 15분 동안 회수하였다. 전류 주입의 경우, -100 pA, -20 pA 증분에서 +100 pA까지 전류가 주입되었다. 막 전위는 산소처리된 aCSF 용액에서 기록되었다. Recording electrodes(5-8 MΩ)는 standard-wall borosilicate glass(GC150F-10, Warner Instrument Corp., USA)로 제작되고, K-gluconate-based internal solution(120 mM potassium gluconate; 10 mM KCl; 1 mM MgCl2; 0.5 mM EGTA; 40 mM HEPES; with pH adjusting to 7.2 and osmolality adjusting to 300 mOsmol/kg)으로 채웠다. 모든 기록은 상온(25℃)에서 진행된다.
실시예 1-8: 동물 행동 테스트
상황별 공포 기억 회복 테스트를 위해 11-13주령 수컷 마우스를 공포 조절 챔버(Coulbourn Instruments)에 개별적으로 배치했다. 2.5분의 습관화(habituation) 기간 후, 1일째에(Day 1) 2.5분 동안 1분마다 1초의 발 충격(1mA)을 전달하였다(총 3회 충격). 공포 상황 기억을 평가하기 위해 마우스를 수득 후 24시간 동안 동일한 챔버에 다시 배치했다(Day 2). 상황별 기억 회복 테스트의 모든 시도(trials) 동안, 광섬유는 해마 CA1 영역에 이식된 시신경 캐뉼라에 연결되었다. 2일차에는(Day 2) 1시간 간격으로 3회(trial 1-3) 상황별 공포 회복 테스트를 수행하였다. 1.0 mW의 488 nm 레이저는 trial 2에서만 켰다. 3일차에는(Day 3) 레이저 없이 상황별 공포 회복 테스트를 3회(trial 4-6) 수행하였다. 마우스의 행동은 Freezeframe 소프트웨어(Coulbourn Instruments)로 기록되었고, Freezeview 소프트웨어(Coulbourn Instruments)로 분석되었다. 오픈 필드 테스트를 위해, 10-12주령 수컷 마우스를 흰색 아크릴 용기(40 cm × 40 cm × 40 cm)에 개별적으로 배치하고, 습관화를 위해 챔버로 10분 동안 자유롭게 이동하도록 하였다. 동물은 10분 동안 장치를 자유롭게 탐색할 수 있었다. 오픈 필드를 중앙 구역(12 cm × 12 cm)과 주변 구역으로 구분하고, Ethovision XT 소프트웨어(Noldus)를 사용하여 이동 거리 및 속도를 분석하였다. 새로운 장소 인식 테스트를 위해, 케이지의 제1사분면과 제2사분면에 두 개의 동일한 물체가 위치한 흰색 아크릴 용기(40 cm × 40 cm × 40 cm)에 10-12주령 수컷 마우스를 개별적으로 놓고(도 12), 10분 동안 물체를 자유롭게 탐색할 수 있도록 하였다(친화 세션). 그 다음, 마우스를 1시간 동안 그들의 홈 케이지로 옮겼다. 1시간 후, 케이지의 제1사분면과 제4사분면에 두 개의 동일한 물체가 위치한 아크릴 용기에 마우스를 다시 놓고(도 12D), 10분 동안 물체를 자유롭게 탐색할 수 있도록 하였다(테스트 세션). 각 마우스의 탐색 행동은 비디오 카메라로 모니터링되었고 실험자가 수동으로 분석하였다.
실시예 2: 정량화 및 통계 분석
실험 샘플의 수, 평균 및 SEM 값은 도면 범례에 나열되어 있다. 숫자와 개별 점은 도면 범례에서 달리 명시되지 않는 한 셀의 수를 의미한다. 데이터 표시 및 통계 분석을 위해, Graphpad Prism(GraphPad Software)을 사용했다. 전기생리학적 분석을 위해, Clampfit(Molecular Devices) 및 Mini analysis(Synaptosoft)를 사용했다. 행동 분석의 경우, Ethovision XT(Noldus) 및 Freezeview(Coulbourn Instruments)를 사용하였다. 이미지 분석을 위해, NIS-element(Nikon) 및 Imagej software를 사용했다. 통계적 유의성은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 설정되었다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다.
실시예 3: LARIAT 기반 소낭 포획 시스템인 Opto-vTrap의 엔지니어링
소낭 방출 시스템을 직접적으로 타겟하고 가역적으로 방해하기 위해, LARIAT를 기반으로 하는 광-유도 소낭 포획 시스템인 Opto-vTrap을 새롭게 설계하였다(도 1A). LARIAT는 두 가지 중요한 구성요소로 구성된다: 광-반응성 CRY2 및 이의 타겟 단백질인 대상 다량체 단백질과 접합된 CIB1(도 1A). CRY2는 CIB1과 가역적으로 강력하게 상호작용하여 CRY2:CIB1 이종이량체를 형성하고, 청색광 조명 시 다른 CRY2들(CRY2:CRY2)과 덩어리화되어 동종 올리고머를 형성한다(Bugaj, L.J., et al., (2013). Nat Methods 10, 249-252; Rosenfeldt, G., et al., (2008). Mol Plant 1, 4-14). 이종이량체 및 동종 올리고머 형성을 통한 광-유도 소낭 포획의 효율성을 높이기 위해, CIB1과 CRY2의 크기를 줄이고자 하였고, CRY2의 N-말단 광분해효소 상동성 영역(PHR) 도메인(아미노산 1-498)의 단축 버전과 CIB1의 C-말단 truncate된 버전(아미노산 1-170) (CIBN)을 활용하였다(Kennedy, M.J., et al., (2010). Nat Methods 7, 973-975) (도 1A). 이하, CRY2는 CRY2의 PHR 도메인(아미노산 1-498)의 단축 버전을 의미한다. 광학적으로 소낭을 포획하기 위해, SNAP25 및 syntaxin-1과 같은 t-SNARE 단백질과 상호작용하는 v-SNARE 단백질 VAMP2(도 1A)와 CIBN을 접합하였다(Hastoy, B., et al., (2017). Sci Rep 7, 2835; Hayashi, T., et al., (1994). EMBO J 13, 5051-5061; Lin, J.Y., et al., (2013). Neuron 79, 241-253; Schoch, S., et al., (2001). Science 294, 1117-1122). VAMP2의 세포질 N-말단 또는 내강 C-말단에 형광 단백질을 태깅하여도 엑소사이토시스 동안 VAMP2 기능이 방해되지 않는 것으로 밝혀진 바 있으므로(Deak, F., et al., (2006). J Neurosci 26, 6668-6676), 형광 리포터로서 CIBN과 VAMP2 사이에 mCherry를 삽입하였다(도 1A). CRY2의 경우, 형광 리포터로서 mCitrine를 접합시켰다(도 1A). 따라서, Opto-vTrap은 각각 CMV::CIBN-mCherry-VAMP2(CIBN-VAMP2) 및 CMV::CRY2PHR-mCitrine(CRY2)을 포함하는 과발현 벡터(pcDNA3.1)의 두 개의 분자 구성요소로 구성되었다(도 1A). Opto-vTrap의 청색광(~488 nm) 조명 시, CRY2는 CRY2:CIBN-VAMP2의 이종이량체 및 CRY2:CRY2의 동종 올리고머를 형성하여 반응한다(도 1B).
Opto-vTrap이 광 자극 시 세포 내 소낭을 덩어리화하는지 여부를 시각화하고 테스트하기 위해, Cos-7 세포에서 CIBN-VAMP2와 CRY2를 공동 발현시키고 소낭의 움직임을 측정하였다. 청색 레이저를 사용하여 Opto-vTrap을 자극하고 공초점 현미경으로 소낭의 덩어리화를 조사하였다(도 2B). 청색광 조명 전에 CIBN-VAMP2 및 CRY2 신호는 세포질에 널리 분포되었다(도 2B, 왼쪽 패널 및 도 2I-J). 그러나, 0.2 Hz 및 20% duty cycle(1초 노출, 4초 끄기, 5초 간격)에서 청색 레이저를 조사하면 CIBN-VAMP2와 CRY2가 5분 이내에 그리고 빛 조명 전체에 걸쳐 동시에 덩어리화되는 것이 관찰되었고, 레이저 제거 15분 후에 완전히 회복되었다(도 2B). 도 2B의 노란색 화살표를 따라 선-강도 이미지의 시간 경과는 CIBN-VAMP2 및 CRY2 덩어리화 및 복구의 자세한 시간 경과를 보여준다(도 2C 및 2D). 2분 이내에 즉각적인 덩어리화가 관찰되었고, 완전히 복구하는 데 약 15분이 소요되는 훨씬 느린 덩어리화 해제가 관찰되었다(도 2D). 또한, CIBN-VAMP2 상대적인 수가 레이저 켜기의 2분 이내에 증가하고, 레이저 끄기의 15분 후에 천천히 회복됨을 관찰하였다(도 2E-G). CIBN-VAMP2와 CRY2 사이의 덩어리화의 시간 경과를 알아내기 위해, 각 시점에서 Pearson's 상관 계수를 계산하였으며, 계수 값이 τ= 10.9초의 시간 상수로 급격히 증가하고, 60초 후에 안정되며(도 2H), τ= 543.9초로 기하급수적으로 감소함을 확인하였다(도 2J). 이러한 결과는 Opto-vTrap의 두 구성요소가 빛 자극 시 1분 또는 2분 이내에 빠르게 덩어리화되고, 자극 해제 후 15분 이내에 천천히 회복됨을 나타낸다.
실시예 4: 소낭 엑소사이토시스를 손상시키는 Opto-vTrap
Opto-vTrap이 광 자극 시 소낭 엑소사이토시스를 손상시키는지 여부를 조사하기 위해, TIRF(total internal reflection fluorescence)-이미징을 수행하여 개별 엑소사이토시스 이벤트를 시각화하였다(Becherer, U., et al., (2007). PLoS One 2, e505). 엑소사이토시스 이벤트를 시각화하기 위해, NPY-VENUS(VENUS pH-둔감성 형광 단백질로 태그된 신경펩타이드-Y(NPY))와 함께 Neuroscreen-1(NS-1) 세포에서 Opto-vTrap을 발현시켰다(도 3A). 엑소사이토시스를 유도하기 위해, 5 Hz 및 40% duty cycle(80 ms 노출, 120 ms 끄기, 200 ms 간격)에서 488nm 청색광 자극 시작 후 30초에 고 칼륨 용액(70mM KCl)을 가했다(도 3B). 488nm 레이저는 동시에 Opto-vTrap을 활성화하고 TIRF 이미징에서 NPY-VENUS를 시각화하였다(도 3B). Control 조건(CRY2 없음)에서 고 칼륨 적용 시, Opto-vTrap 조건에서는 전혀 없었던 약 1 μm 크기의 수많은 반점이 나타나는 것을 관찰하였으며(도 3C 및 3D), 이는 Opto-vTrap의 광 자극이 소낭을 포함하는 NPY-VENUS의 엑소사이토시스를 파괴하였음을 나타낸다. 형광 강도에 의해 측정된 각 엑소사이토시스 이벤트의 상세한 분석(도 3D)은 KCl-유도 엑소사이토시스 이벤트가 control 조건에서 KCl 적용 후 빠르게 발생하지만 Opto-vTrap 조건에서는 발생하지 않는 것을 보여준다(도 3E). 엑소사이토시스 동안 피크 진폭 형광 강도는 Opto-vTrap의 광 자극에 의해 완전히 제거되었다(도 3F). 이러한 결과는 Opto-vTrap이 소낭 엑소사이토시스를 효과적으로 차단함을 의미한다.
실시예 5: Opto-vTrap 활성화가 막 전위에 미치는 영향 확인
Opto-vTrap 활성화가 막 전위에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, CamKIIα 프로모터 하 CRY2PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2를 포함하는 렌티바이러스 Opto-vTrap 벡터를 구성하고, CA3 해마에 렌티바이러스를 양방향으로 주입하였다(도 4A). 그 다음, -100 pA에서 +40 pA 범위의 전류 단계로 예리하게 준비된 해마 절편의 Opto-vTrap-발현 CA3 피라미드 뉴런의 막 전위 변화를 기록했다(도 4B). 전류 단계 직후에, CA3 영역에 대한 지속적인 청색광 자극 시 막 전위의 변화를 측정하였다(도 4C). 10분 동안 지속되는 청색광 조명에 의해 막 전위 변화가 일어나지 않는 것이 확인되었다(도 4C 및 4D). 이러한 결과는 Opto-vTrap의 활성화가 막 전위에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
실시예 6: Opto-vTrap 활성화에 의한 Schaffer 부차 시냅스에서 evoked EPSC의 억제
Opto-vTrap의 활성화가 Schaffer 부차 시냅스(Schaffer-collateral synapse)에서 시냅스 전달을 선택적으로 억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, CA1 피라미드 뉴런으로부터 자극에 의한 흥분성 시냅스 후 전류(evoked excitatory post-synaptic currents, eEPSCs)를 기록하면서 Schaffer 부차 시냅스를 쌍-펄스 전기 자극으로 전기적 자극하였다(Amaral, D.G., and Witter, M.P. (1989). Neuroscience 31, 571-591) (도 4E). eEPSC 진폭의 안정적인 기준선을 설정한 후, 패치 클램프 셀 근처의 CA1 영역에 연속 300 μW의 지속적인 청색광을 켰다(도 4E). 바이러스 주입이 없는 control 조건에서 광 자극이 1차 eEPSC 또는 2차 eEPSC의 eEPSC 또는 쌍-펄스 비율의 어떠한 변화도 일으키지 않는 것이 관찰되었으며(도 4F-L), 이는 광 조명이 시냅스 전달에 대해 해로운 영향을 미치지 않음을 시사한다. 또한, 조명 전에 evoked-EPSC 진폭, mEPSC 진폭 및 주파수에서 control과 Opto-vTrap 발현 그룹 사이에 유의한 차이가 없었다(도 4F 및 도 10 A-D). 한편, 전류 주입 시 활동 전위 발화 빈도, AP 임계값 및 입력 저항에서 control과 Opto-vTrap 발현 그룹 사이에 유의한 차이가 없었다(도 7). 또한, 소낭 생물발생 및 시냅스 전 부피는 Opto-vTrap 발현에 의해 영향을 받지 않았다(도 8). 이러한 결과는 Opto-vTrap의 과발현이 빛 자극이 없을 때는 활성이 없음을 나타낸다. 대조적으로, Opto-vTrap-주입 조건은 15분의 light-on 후 1차 eEPSC 진폭과 2차 eEPSC 진폭의 상당한 감소를 나타냈다(도 4G-J). 또한 CamKIIa 프로모터(8.5 kb)의 짧은 버전(0.4 kb)인 CK(0.4) 프로모터에서 AAV Opto-vTrap을 추가로 구성하고(Dittgen, T., et al., (2004). Proc Natl Acad Sci U S A 101, 18206-18211), Schaffer 부차 시냅스에서 테스트하였다(도 11A). Light-on 10분 이내에 1차 및 2차 eEPSC 진폭이 약 50% 감소하는 것을 관찰하였다(도 11B-F). AAV-Opto-vTrap은 렌티바이러스 Opto-vTrap에 비해 억제 효율이 약 5%, 시작 속도가 약 5분 향상되었다. evoked-EPSC 외에도 mEPSC의 주파수는 Opto-vTrap-주입 조건에서 15분 light-on 후 감소했다(도 10). 그리고 1차 및 2차 진폭 모두 light-off 후 30분 이내에 완전히 복구되었다(도 4G-J). 이러한 결과는 Opto-vTrap이 뇌 회로에서 신경전달물질 방출을 효과적이고 가역적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. 흥미롭게도, Opto-vTrap의 활성화는 시냅스 전 방출 확률의 변화에 대한 기존의 마커인 paired-pulse ratio(PPR)(Dobrunz, L.E., and Stevens, C.F. (1997). Neuron 18, 995-1008)를 변경하지 않았다(도 4K 및 4L). PPR은 light-off 후 미미하지만 통계적으로 유의하지 않은 증가를 나타내었지만, 점등 전, 중, 후 조건 사이에 유의미한 차이가 없었다(도 4K 및 4L). PPR의 변화를 유도하는 요인 중 하나는 시냅스 전 말단의 잔류 Ca2+의 변화이다(Dobrunz, L.E., and Stevens, C.F. (1997). Neuron 18, 995-1008). 따라서, PPR의 변화가 없다는 것은 Opto-vTrap에 의한 소낭 방출 억제가 시냅스 전 잔류 Ca2+에 영향을 미치지 않을 수 있음을 시사한다.
실시예 7: Opto-vTrap의 활성화에 의한 신피질 성상세포 소낭 교세포전달물질(gliotransmitter) 방출 억제
Opto-vTrap이 성상세포(astrocyte)와 같은 비흥분성 세포에서 소낭 방출을 선택적으로 억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, compact GFAP 프로모터 GfaABC1D(Lee, Y., et al., (2008). Glia 56, 481-493)에서 Opto-vTrap과 CRY2PHR-P2A-CIBN-mCherry-VAMP2를 포함하는 렌티바이러스를 제작하고, 신피질의 2/3 층에 렌티바이러스를 주입했다(이하, GFAP 프로모터는 GfaABC1D 프로모터를 의미함) (도 5A). 예리하게 준비된 피질 절편에서 Opto-vTrap 발현 성상세포 근처에 존재하는 2/3 층 뉴런에서 NMDA 수용체(NMDAR)-매개 자연발생적 전류 활성을 기록하였다(도 5A). 성상세포를 선택적으로 활성화시키기 위해, 성상세포에서 Ca2+ 증가를 유발하는 Gi- 및 Gq-결합 GPCR인 PAR1의 선택적 작용제(agonist)인 TFLLR을 적용하였다(Hollenberg, M.D., et al., (1997). Can J Physiol Pharmacol 75, 832-841). PAR1 활성화는 해마 CA1에서 TREK-1 매개 빠른 글루타메이트 방출 및 Best1 매개 느린 글루타메이트 방출을 모두 유도하는 것이 입증된 바 있다(Woo, D.H., et al., (2012). Cell 151, 25-40). 피질층 2/3 뉴런에서 붕괴 시간 역학을 특징으로 하는 세 가지 유형의 NMDAR-매개 자연발생적 과도 내부 전류를 확인하였다: 붕괴 시간은 20 ms이고 파란색 원으로 표시된 신경 mEPSC, 붕괴 시간이 40-45 ms이고 주황색 사각형으로 표시된 신경교-유도 빠른 전류(gFIC), 붕괴 시간이 100-300ms이고 녹색 삼각형으로 표시된 신경교-유도 느린 전류(sFIC) (도 5B 및 5C). 모든 유형의 전류가 D-AP5에 의해 억제된 한편, gFIC 및 gSIC의 경우에만 ifenprodil에 의해 억제되었으며, 이는 이들이 GluN2B 함유 시냅스 외 NMDA 수용체에 의해 매개됨을 시사한다(도 5C 및 5D). TFLLR 적용이 mEPSC의 주파수에 어떠한 변화도 일으키지 않았다는 것을 확인하였으며(도 5D), 반면 TFLLR은 Control 조건에서 gFIC와 gSIC의 주파수에 상당한 증가를 일으켰다(도 5D). Control 그룹의 절편에서, 기준선 및 TFLLR-유도 gFIC는 모두 성상세포 세포내 소낭 방출 억제제에 의해 차단되었지만, 파상풍 신경독소(tetanus neurotoxin) 경쇄(TeNTx), 기준선 및 TFLLR-유도 gSIC는 TREK-1 차단제인 스파딘(spadin)에 의해 차단된 것을 확인하였다(도 5E). GFAP::Opto-vTrap 주입 마우스에서, 300 μW의 연속 청색광 조명에 의해 gFIC 주파수에서 TFLLR-유도 증가가 완전히 방해된 것을 확인하였으며, light-off 15분 후에 완전히 회복되었고(도 5F 및 5G), 이는 gFIC가 소낭 방출 메커니즘에 의해 매개됨을 나타낸다. 대조적으로, gSIC의 주파수에서 TFLLR-유도 증가는 광 조명에 의해 영향을 받지 않았으며(도 5F 및 G), 이는 gSIC가 비소포성 채널-매개 방출 메커니즘에 의해 매개됨을 나타낸다. 종합하면, 이러한 결과는 Opto-vTrap이 소포성 신경교전달 물질 방출을 위한 빠르고 가역적인 광유전학적 억제 도구로 활용될 수 있음을 의미한다.
실시예 8: 상황별 공포 기억 회복을 가역적으로 억제하는 Opto-vTrap의 활성화
최종 테스트로 Opto-vTrap의 활성화가 행동, 즉 해마-의존적 상황별 기억을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 해마는 공포 기억의 공간적, 상황별 처리와 관련되어 있음이 알려진 바 있다(Arias, N., et al., (2015). Hippocampus 25, 1242-1249; Fanselow, M.S., and LeDoux, J.E. (1999). Neuron 23, 229-232; Kim, J.J., and Fanselow, M.S. (1992). Science 256, 675-677). 해마 CA3-CA1 시냅스 가소성은 기억 획득, 소거, 회복 및 연관 학습의 재조정 동안 활동-의존 방식으로 조절된다(Gruart, A., et al., (2006). J Neurosci 26, 1077-1087). 랫트 모델에서 해마 CA3 영역의 병변이 공간 기억 유지 장애를 일으킨다는 보고가 있었기 때문에(Hunsaker, M.R., et al., (2009). Behav Neurosci 123, 624-630; Steffenach, H.A., et al., (2002). Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3194-3198), Opto-vTrap의 활성화에 의한 Schaffer 부차 경로의 억제가 상황별 기억 회복을 손상시키는지 여부를 조사하였다. 해마 CA3 영역에 CamKIIa::Opto-vTrap 렌티바이러스를 한쪽에 치우치게 주입하고 광 조명을 위해 CA1 영역에 광학 캐뉼라를 이식하였다(도 6A). Opto-vTrap이 없는 벡터 대조군으로 CMV::mCherry 렌티바이러스를 주입했다. 수술 3주 후, 1일차에(Day 1) 각 Opto-vTrap 주입 마우스는 상황별 공포 조건화를 받았다(도 6A). 2일차에(Day 2), 마우스가 두 세션 사이에 1시간 간격으로 각각 3분의 세 세션 동안 공포 기억을 획득하는 동일한 상황에 각 마우스를 배치하였다(도 6B). Opto-vTrap의 활성화를 위해, 2일차에 3분 동안 Trial 2에서 1.0 mW의 연속 청색광을 조명했다(도 6B). 조명이 없는 control 조건으로 각 마우스는 3일차에(Day 3) 추가 상황별 기억 회복 테스트를 받았다(도 6B). Laser-off Trial 3 후 1시간 동안 완전히 구조된 Trial 2에서 Opto-vTrap의 한쪽만의 활성화 동안 얼어붙는 행동(freezing behavior)이 크게 감소했음을 확인하였다(도 6C 및 6D). 대조적으로, 3일차의 얼어붙는 행동은 조명이 없는 Trial 4-6 동안에는 크게 변하지 않았다(도 6B 및 6C). 얼어붙는 행동은 CMV::mCherry 주입 그룹에서 Day 2의 Trial 1-3 동안 크게 변하지 않았다(도 6D). 이러한 결과는 Opto-vTrap의 활성화에 의한 Schaffer-부차 경로의 억제는 1시간 이내에 완전한 회복과 함께 공포 기억 회복을 효과적이고 가역적으로 손상시킬 수 있음을 의미한다. 조명 없이 오픈 필드 테스트와 새로운 물체 인식 테스트를 수행한 결과, control과 Opto-vTrap 발현 그룹 사이에 큰 차이가 없었다. 또한, Opto-vTrap이 지속적인 행동 패러다임에서 행동을 효율적이고 가역적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(도 13). 종합하면, 이러한 결과들은 Opto-vTrap이 빠른 시작 및 빠른 회복 시간으로, 빛 조명에 의해 뇌 회로와 행동을 공간적, 시간적, 세포 유형 특이적으로 침묵시키는 동물 행동 제어에 활용될 수 있음을 시사한다.
본 발명에 따른 광유전학적 소낭 분비 조절 시스템을 이용하여 신경전달물질, 교세포전달물질을 포함한 전달물질의 분비를 가역적으로 억제할 수 있으며, 이에 따라 그 기능을 억제시킬 수 있다. 따라서, 광유전학을 통한 뇌 기능 조절, 일반 세포 혹은 신경세포 등의 기능 조절이 가능하며, 신경세포 과흥분에 의한 질병에 치료 기전으로 응용 가능하다. 또한, 세포 기능 억제를 통한 피부미용 주름 개선 효과, 근육 장애 치료 효과를 나타낼 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (16)

  1. CIBN-VAMP2 융합 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 CRY2 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는, 광 조사에 의해 광유전학적으로 조절 가능한 소낭 분비(vesicle release) 조절용 핵산 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CIBN-VAMP2 융합 펩타이드를 코딩하는 핵산은 CIBN(N-terminal domain of CIB1)을 코딩하는 핵산 및 VAMP2(vesicle associated membrane protein 2)를 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CIBN은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 VAMP2는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 CRY2 도메인을 코딩하는 핵산은 CRY2(cryptochrome 2)의 PHR 도메인(CRY2PHR)을 코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PHR 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 광은 450~500nm 파장의 청색광인 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  8. 제1항의 핵산 구조체를 포함하는 벡터.
  9. 다음 단계를 포함하는 소낭 분비(vesicle release) 억제 방법:
    (a) 숙주세포에 제8항의 벡터를 주입하는 단계; 및
    (b) 청색광을 조사하여 전달물질(transmitter)을 포함하는 소낭을 덩어리화(clusterization)하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 덩어리화는 CIBN-VAMP2와 CRY2의 이종 이량체화(heteromeric dimerization) 및 CRY2와 CRY2의 동종 올리고머화(homomeric oligomerization)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 소낭 분비 억제 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 청색광의 파장은 450~500nm인 것을 특징으로 하는 소낭 분비 억제 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 전달물질은 신경전달물질(neurotransmitter) 또는 교세포전달물질(gliotransmitter)인 것을 특징으로 하는 소낭 분비 억제 방법.
  13. 다음 단계를 포함하는 소낭 분비(vesicle release) 조절 방법:
    (a) 숙주세포에 제8항의 벡터를 주입하는 단계;
    (b) 청색광을 조사하여 전달물질(transmitter)을 포함하는 소낭을 덩어리화(clusterization)하는 단계; 및
    (c) 청색광을 제거하여 소낭의 덩어리화를 해제(declusterization)하는 단계.
  14. 제1항의 핵산 구조체 또는 제8항의 벡터를 포함하는 소낭 분비(vesicle release) 억제용 조성물.
  15. 제1항의 핵산 구조체 또는 제8항의 벡터를 포함하는 신경전달물질 분비 관련 질환 또는 장애 치료용 약학적 조성물.
  16. 제1항의 핵산 구조체 또는 제8항의 벡터를 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물.
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LIU QI; SINNEN BROOKE L.; BOXER EMMA E.; SCHNEIDER MARTIN W.; GRYBKO MICHAEL J.; BUCHTA WILLIAM C.; GIBSON EMILY S.; WYSOCZYNSKI C: "A Photoactivatable Botulinum Neurotoxin for Inducible Control of Neurotransmission", NEURON, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 101, no. 5, 1 January 1900 (1900-01-01), AMSTERDAM, NL, pages 863, XP085620107, ISSN: 0896-6273, DOI: 10.1016/j.neuron.2019.01.002 *
MATTHEW J KENNEDY, ROBERT M HUGHES, LESLIE A PETEYA, JOEL W SCHWARTZ, MICHAEL D EHLERS, CHANDRA L TUCKER: "Rapid blue-light–mediated induction of protein interactions in living cells", NATURE METHODS, NATURE PUB. GROUP, vol. 7, no. 12, 1 December 2010 (2010-12-01), pages 973 - 975, XP055039821, ISSN: 15487091, DOI: 10.1038/nmeth.1524 *
WON JOUNGHA, PANKRATOV YURIY, JANG MINWOO WENDY, KIM SUNPIL, JU YEON HA, LEE SANGKYU, LEE SEUNG EUN, KIM ARIE, PARK SOOWON, LEE C.: "Opto-vTrap, an optogenetic trap for reversible inhibition of vesicular release, synaptic transmission, and behavior", NEURON, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 110, no. 3, 1 February 2022 (2022-02-01), AMSTERDAM, NL, pages 423 - 435.e4, XP093057082, ISSN: 0896-6273, DOI: 10.1016/j.neuron.2021.11.003 *

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