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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufnahme von biologischen Zellen
aus einer Vielzahl von Stammzellen, bei dem die aufzunehmenden Zellen
mittels ihrer natürlichen Zellbewegung auf ein Aufnahmesubstrat
wandern. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Substratanordnung
zur Aufnahme von biologischen Zellen aus einer Vielzahl von Stammzellen,
wobei die Substratanordnung zwei Substrate aufweist, zwischen denen
die aufzunehmenden Zellen durch ihre natürliche Zellbewegung übertragen
werden können.
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Es
ist bekannt, dass adhärente biologische Zellen auf einem
Substrat eine natürliche Zellbewegung ausführen.
Die Zellbewegung (englisch: cell locomotion) umfasst allgemein eine
Ortsänderung einer kompletten Zelle auf der festen Oberfläche
des Substrats oder in Zellmaterial durch eine Umordnung von Adhäsionskontakten
von Zellorganen (Membranorgane, zum Beispiel Membranausstülpungen).
Die natürliche Zellbewegung wird zum Beispiel von M. Abercrombie
et al. in „Experimental Cell Research", Band 67, 1971,
S. 359–367 und von L. P. Cramer in „Biochem. Soc.
Symp.", Band 65, 1999, S. 17–205, beschrieben.
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Eine
praktische Anwendung der natürlichen Zellbewegung besteht
in der stressfreien und verletzungsfreien Entnahme von Zellen aus
in vitro-Kulturen. So wird beispielsweise in
US 2006/051735 A1 ein
Transfer biologischer Zellen durch natürliche Zellbewegung
zwischen einem Träger und einer Sonde beschrieben. Da der
Transfer durch die natürliche Zellbewegung erfolgt, werden
bei diesem Verfahren mechanische oder bioche mische Einflüsse
auf die Zellen minimiert und unphysiologische Eingriffe, wie zum
Beispiel eine Trypsinierung des Zellmaterials, vermieden.
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Die
in
US 2006/051735
A1 beschriebene Kombination aus einem Träger und
einer Sonde stellt ein Spezialwerkzeug dar, dessen praktische Anwendbarkeit
durch die folgenden Probleme beschränkt sein kann. Da die
Sonde zur Aufnahme einer einzelnen Zelle vom Träger oder
zur Übertragung einer einzelnen Zelle auf den Träger
vorgesehen ist, bedarf es zur Übertragung einer Vielzahl
von Zellen eines seriellen Betriebes oder der Verwendung einer Vielzahl
von Sonden. Im ersten Fall ergibt sich der Nachteil eines hohen
Zeitaufwandes, während die zweite Variante aus Platzgründen
auf die Kombination von wenigen Sonden beschränkt wäre.
Des Weiteren ist die Sonde nur zum Transport der Zelle geeignet.
Für weitere Untersuchungen oder Behandlungen muss die Zelle
von der Sonde auf ein weiteres Substrat übertragen werden.
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Nachteilig
kann ferner sein, dass alle an der Übertragung beteiligten
Zellen, das heißt sowohl die Zellen im Zellmaterial auf
dem Träger und als auch die zu übertragende Zelle
die natürliche Zellbewegung aufweisen. Die selektive Entnahme
einzelner Zellen oder kleiner Zellgruppen aus dem Zellmaterial auf
dem Träger erfordert daher Maßnahmen, um eine Übertragung
unerwünschter Zellen zu vermeiden. Es kann beispielsweise
erforderlich sein, dass der Träger und die Sonde während
der Übertragung bewegt werden. Des Weiteren kann es für
eine selektive Entnahme bestimmter Zellen erforderlich sein, dass
die Ausrichtung des Trägers und der Sonde und die Wanderung
der betreffenden Zelle mit einem Mikroskop beobachtet werden. Aufgrund
der genannten Nachteile bestehen Beschränkungen hinsichtlich
der Automatisierbarkeit der herkömmlichen Technik.
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Ein
weiterer Nachteil der herkömmlichen Technik besteht darin,
dass zur selektiven Übertragung bestimmter Zellen Vorkenntnisse über
diese Zellen vorhanden sein müssen. Wenn beispielsweise in
einer Stammzellenkultur, in der sich einige Zellen differenziert
haben (zum Beispiel Differenzierung zu Nervenzellen), die differenzierten
Zellen für eine weitere Untersuchung oder Anwendung entnommen werden
sollen, müssen die differenzierten Zellen in der Stammzellenkultur
identifiziert werden. Dies erfordert bisher einen invasiven Eingriff
in die Stammzellenkultur, wie zum Beispiel eine spezifische Färbung,
was eine unerwünschte Beeinflussung der Zellen darstellt.
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Bei
der in vitro-Kultivierung bilden biologische Zellen auf einem Substrat
typischerweise eine Zellschicht mit wenigen Zelllagen oder einer
einzigen Zelllage (Monoschicht). Bestimmte Zelltypen zeichnen dadurch
aus, dass sie über die Dicke der Monoschicht hinauswachsen.
Beispielsweise bilden Stammzellen im adhärenten Zustand
dreidimensionale Zellaggregate (so genannte organoide Körper, siehe
C.
Kruse et al. in „Appl. Phys. A", Band 79, 2004, S. 1617–1624;
und C. Kruse et al. in „Ann. Anat.", Band 188 (6), 2006,
S. 503–517). Aus diesen Publikationen ist auch
bekannt, dass aus den Zellaggregaten Stammzellen oder differenzierte
Zellen herauswachsen, die ebenfalls die oben genannte natürliche
Zellbewegung aufweisen (siehe des
Weiteren S. Danner et
al. in "Mol. Hum. Reprod." Bd. 13, 2007, S. 11–20).
Ein Problem der Kultivierung der Zellaggregate besteht insbesondere
darin, dass bisher kein praktikables, nicht-invasives Verfahren
zur Charakterisierung der in einem Zellaggregat enthaltenen Zellen
verfügbar ist.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Aufnahme,
insbesondere Trennung von biologischen Zellen aus einer Stammzellenkultur
bereitzustellen, mit dem die Nachteile und Beschränkungen
der herkömmlichen Technik vermieden werden. Des Weiteren
besteht die Aufgabe in der Bereitstellung einer verbesserten Substratanordnung,
mit der insbesondere die Nachteile der herkömmlichen Kombination
aus einem Träger und einer Sonde überwunden werden.
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Diese
Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine Substratanordnung mit
den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst.
Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung
ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Gemäß einem
ersten Gesichtspunkt beruht die Erfindung auf der allgemeinen technischen
Lehre, ein Verfahren zur Aufnahme biologischer Zellen aus einer
Zellkultur bereitzustellen, bei dem die Zellen sich durch ihre natürliche
Zellbewegung von einem Hauptsubstrat, auf dem die Zellkultur angeordnet
ist, auf ein oder mehrere Aufnahmesubstrate bewegen, auf dem oder
denen eine Kultivierung der Zellen erfolgt. Im Unterschied zur herkömmlichen Zellübertragung
zwischen einem Träger, der ein Substrat für eine
Zellkultur bildet, und einer Sonde, die ein Transportwerkzeug für
einzelne Zellen darstellt, erfolgt erfindungsgemäß die
Zellübertragung zwischen Substraten, die beide für
eine Kultivierung biologischer Zellen eingerichtet sind.
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Vorrichtungsbezogen
wird die genannte Aufgabe durch eine Substratanordnung mit mindestens zwei
Substraten gelöst, die aneinandergrenzend so positioniert
sind, dass die Zellen durch ihre natürliche Zellbewegung
von einem der Substrate auf das benachbarte Substrat übertragen
werden können. Die Substrate umfassen ein Hauptsubstrat,
auf dem eine Zellkultur kultivierbar ist, und mindestens ein Aufnahmesubstrat,
das zur Besiedelung mit Zellen aus der Zellkultur des Hauptsubstrats und
zur Kultivierung dieser Zellen eingerichtet ist. Das Hauptsubstrat
und das mindestens eine Aufnahmesubstrat sind separate Bauteile,
die für die Zellübertragung aneinandergrenzend
positionierbar und nach der Zellübertragung voneinander
trennbar sind.
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Ein
wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass zahlreiche Nachteile
und Beschränkungen der herkömmlichen Technik überwunden
werden. Mit dem mindestens einen Aufnahmesubstrat kann eine einzelne
Zelle oder es können eine Vielzahl von Zellen (z. B. mindestens
10, 100, 1000 oder sogar eine Millionen oder mehr Zellen) gleichzeitig vom
Hauptsubstrat übernommen werden. Die Kultivierung der Zellen
auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat ermöglicht, dass
die Zellen auf dem Aufnahmesubstrat ohne weitere Zwischenschritte weiteren
Verfahren, insbesondere Untersuchungen oder Behandlungen unterzogen
werden können. Für die Übertragung der
Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat ist es lediglich
erforderlich, dass dieses passend zu einem Rand des Hauptsubstrats angeordnet
ist. Die Übertragung der Zellen erfordert keine Rückkopplungs-gesteuerte
Manipulation der Substrate und auch keine besonderen Maßnahmen zur
Justierung der Haupt- und Aufnahmesubstrate relativ zueinander vor
oder während der Zellübertragung.
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Erfindungsgemäß ist
das mindestens eine Aufnahmesubstrat für eine Kultivierung
der aus der Zellkultur ausgewanderten Zellen eingerichtet. Das Aufnahmesubstrat
hat eine Substratoberfläche, deren Größe
und Material so gewählt sind, dass auf dem Aufnahmesubstrat
eine adhärente Zellkultur umfassend mindestens eine Zelle
oder eine Vielzahl von Zellen (vorzugsweise mindestens 10 Zellen,
z. B. einige Tausend Zellen) gebildet werden kann. Die Zellen sind
auf dem Aufnahmesubstrat kultivierbar, d. h. das Aufnahmesubstrat
ist für ein Wachstum und/oder eine Differenzierung der
Zellen unter einstellbaren, reproduzierbaren Kultivierungsbedingungen
geeignet. Auf dem Aufnahmesubstrat kann eine Oberflächenmodifizierung
(z. B. eine molekulare Deposition oder eine Mikro- oder Nanostrukturierung) vorgesehen
sein.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Zellen
aus mindestens einem dreidimensionalen Zellaggregat, das auf dem
Hauptsubstrat angeordnet ist, auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat übertragen.
Das dreidimensionale Zellaggregat ist aus Stammzellen und ggf. einer
Mischung von Zellen verschiedener Typen gebildet und umfasst vorzugsweise
einen organoiden Körper, wie er bspw. von C. Kruse et al.
in den oben genannten Publikationen beschrieben ist. Der organoide
Körper hat vorzugsweise eine Querschnittsdimension (z.
B. Dicke, Durchmesser) im Bereich von 50 μm bis 20 mm.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Eigenschaft organoider
Körper, im adhärenten Zustand einen dreidimensionalen
Zellhaufen zu bilden, von dessen Oberfläche gleichmäßig
Zellen auswachsen, einen wesentlichen Vorteil für die Erfindung
bietet. Der organoide Körper bildet auf dem Hauptsubstrat eine
ortsfeste Zellkultur, d. h. während der Übertragung
von Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat bleibt die Position
des organoiden Körpers unverändert.
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Im
Unterschied zu der herkömmlichen Technik werden daher keine
besonderen Anforderungen an eine gegenseitige Ausrichtung oder sogar
Bewegung der Haupt- und Aufnahmesubstrate gestellt. Aus dem Zellaggregat
können selektiv ausschließlich die auswandernden
Zellen aufgenommen werden, ohne dass das Zellaggregat beeinträchtigt
wird. Dabei bedarf es keiner mikroskopischen Beobachtung oder Steuerung.
Das Verfahren kann vorteilhafterweise automatisiert werden. Des
weiteren wird mit besonderem Vorteil die dauerhafte Proliferation
organoi der Körper ausgenutzt. Das Wachstum von Zellen aus
organoiden Körpern kann über lange Kultivierungszeiten,
z. B. im Bereich von 1 oder 2 Tagen bis 2, 10, 30 oder mehr Wochen
stabil erhalten werden. Somit kann sich die Aufnahme von Zellen
auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat ebenfalls über einen
entsprechenden Zeitraum erstrecken.
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Vorrichtungsbezogen
wird die genannte Aufgabe somit insbesondere durch eine Substratanordnung
mit dem Hauptsubstrat und dem mindestens einen Aufnahmesubstrat
gelöst, wobei auf dem Hauptsubstrat mindestens ein dreidimensionales
Zellaggregat angeordnet ist, das aus Stammzellen gebildet ist und
aus dem Zellen heraus wandern.
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Vorteilhafterweise
könnten somit erfindungsgemäß ausschließlich
Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat übertragen
werden, die aus dem organoiden Körper herauswandern, während andere
Zellen, die Teil des organoiden Körpers sind, auf dem Hauptsubstrat
bleiben. Es wird eine selektive Entnahme der wandernden Zellen aus
der Stammzellen-Zellkultur im organoiden Körper ermöglicht.
Besondere Maßnahmen, etwa eine Nachführung der
aneinandergrenzenden Substrate oder eine Überwachung der
Zellübertragung sind nicht erforderlich. Das Verfahren
zur Aufnahme von Zellen aus der Zellkultur bildet in diesem Fall
ein Verfahren zur Trennung von Zellen aus organoiden Körpern,
wobei vorteilhafterweise der Herkunftsort und der Weg der Zellen
sowie gegebenenfalls deren Veränderung (z. B. Differenzierung,
Dedifferenzierung) verfolgt und dokumentiert werden können.
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Wenn
die Zellen aus der Zellkultur auf dem Hauptsubstrat auf mehrere
verschiedene Aufnahmesubstrate bewegt werden, können sich
Vorteile aus dem Potential, eine Vielzahl von Tochter-Zellkulturen auf
den Aufnahmesubstraten zu bilden, und/oder aus der Möglichkeit
ergeben, die Zellen auf den verschiedenen Aufnahmesubstraten verschiedenen
Kultivierungsbedingungen auszusetzen.
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Somit
umfasst die Substratanordnung gemäß einer bevorzugten
Variante der Erfindung das Hauptsubstrat und eine Vielzahl von Aufnahmesubstraten,
die passend zu dem Hauptsubstrat gebildet und an dieses angrenzend
positionierbar sind. Ein Aufnahmesubstrat ist passend zum Hauptsubstrat gebildet,
wenn das Aufnahmesubstrat am Hauptsubstrat positionierbar ist und
durch einen Rand des Hauptsubstrats eine Grenzlinie gebildet wird,
bei deren Überwindung durch die natürliche Zellbewegung die
Zellen auf das Aufnahmesubstrat gelangen. Vorzugsweise ist vorgesehen,
das sich die Zellen vom Hauptsubstrat unmittelbar auf das Aufnahmesubstrat bewegen.
Die Aufnahmesubstrate bilden einen Satz von Austauschteilen, mit
denen das Hauptsubstrat aufeinander folgend zusammensetzbar ist.
Mit jedem weiteren Aufnahmesubstrat können weitere Zellen aus
dem Zellaggregat aufgenommen werden. Erfindungsgemäß kann
somit ein Modulsystem geschaffen werden, bei dem das erste Aufnahmesubstrat durch
mindestens ein weiteres Aufnahmesubstrat ersetzbar ist oder bei
dem auf das erste Aufnahmesubstrat ein mindestens weiteres Aufnahmesubstrat folgt.
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Gemäß einer
vorteilhaften Variante der Erfindung kann vorgesehen sein, dass
sich die Zellen, die von den verschiedenen Aufnahmesubstraten aufgenommen
werden, in ihren Eigenschaften unterscheiden. Zur spezifischen Aufnahme
von Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften jeweils auf verschiedene Aufnahmesubstrate
können verschiedene inhärente Eigenschaften der
Zellen und/oder verschiedene Eigenschaften der Substratoberflächen
der Aufnahmesubstrate verwendet werden. Wenn aus der Stammzellen-Zellkultur
auf dem Hauptsubstrat Zellen auswandern, können diese Zellen
verschiedene Zelltypen, wie z. B. Stammzellen, Vorläuferzellen
oder differenzierte Zellen umfassen. Die Erfinder haben festgestellt,
dass die verschiedenen Zelltypen verschiedene Wanderungsgeschwindigkeiten
haben. Somit können, ausgehend von einer Startzeit, zu
der das Hauptsubstrat und das Aufnahmesubstrat aneinandergrenzend
positioniert werden, zu verschiedenen Zeiten verschiedene Zelltypen
auf verschiedene Aufnahmesubstrate übertragen werden.
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Vorteilhafterweise
ermöglicht dies eine nicht-invasive Trennung von Zellen
aus der Stammzellen-Zellkultur, insbesondere aus dem organoiden Körper,
in Abhängigkeit von ihren Zelltypen. Die Erfinder haben
des Weiteren festgestellt, dass die Zellen in Abhängigkeit
von ihren Differenzierungstypen auf verschiedene Aufnahmesubstrate
wandern können, in dem die Aufnahmesubstrate mit einer
modifizierten Substratoberfläche bereitgestellt werden,
auf die ausschließlich ein bestimmter Differenzierungstyp
aufwandert. Die Erfinder haben Hinweise darauf gefunden, dass die
Zellen in Abhängigkeit von bisher unbekannten intrinsischen
Eigenschaften auf verschiedene Aufnahmesubstrate wandern oder anwachsen
können, in dem die Aufnahmesubstrate mit einer modifizierten
Substratoberfläche bereitgestellt werden, auf die dann
bestimmte Zellen aufwandern oder anwachsen.
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Wenn
die Übertragung von Zellen auf eine Vielzahl von Aufnahmesubstraten
vorgesehen ist, können diese gemäß einer
ersten Variante der Erfindung zeitlich aufeinanderfolgend an dem
Hauptsubstrat bereitgestellt werden. Beispielsweise werden in einem
ersten Schritt das Hauptsubstrat mit der Zellkultur, insbesondere
dem organoiden Körper, und ein erstes Aufnahmesubstrat
für eine Zellübertragung einer ersten Zellgruppe
und/oder eines ersten Zelltyps auf das erste Aufnahmesubstrat bereitgestellt.
Anschließend werden das Hauptsubstrat und das erste Aufnahmesubstrat
voneinander getrennt. Die weitere Kul tivierung der Zellen auf dem
ersten Aufnahmesubstrat erfolgt getrennt von dem Hauptsubstrat.
Anschließend werden die Schritte der Zellübertragung und
Trennung mit mindestens einem weiteren Aufnahmesubstrat wiederholt,
wobei weitere Zellen, insbesondere weiterer Zelltypen aus der Zellkultur
von dem Hauptsubstrat auf das mindestens eine weitere Aufnahmesubstrat
wandern.
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Mit
der zeitlich aufeinanderfolgenden Zellübertragung auf verschiedene
Aufnahmesubstrate können verschiedene Vorteile erreicht
werden. Erstens kann die genannte Trennung nach Zelltypen mit verschiedenen
Wanderungsgeschwindigkeiten erreicht werden, indem die Aufnahmesubstrate
in vorbestimmten Zeitbereichen am Hauptsubstrat bereitgestellt werden.
Des Weiteren können eine Vielzahl von Tochtersubstraten
mit Zellen aus der Zellkultur besiedelt werden. Durch die aufeinanderfolgende Kombination
des Hauptsubstrats mit den Aufnahmesubstraten kann bspw. in einer
Kultivierungseinrichtung ein Hauptsubstrat mit einem organoiden
Körper aufeinanderfolgend zwischen verschiedenen Aufnahmesubstraten
umgesetzt werden, um jeweils eine Besiedelung mit Zellen aus dem
organoiden Körper zu erzielen.
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Bei
der Übertragung der Zellen auf verschiedene Aufnahmesubstrate
kann gemäß einer weiteren Variante der Erfindung
vorgesehen sein, dass alle Aufnahmesubstrate gleichzeitig am Hauptsubstrat bereitgestellt
werden. Die Aufnahmesubstrate können bspw. an verschiedene
Abschnitte des Randes des Hauptsubstrats angrenzend angeordnet sein. Diese
Gestaltung eignet sich besonders für die Übertragung
von Zellen mit gleichen Wanderungsgeschwindigkeiten auf Aufnahmesubstrate
mit verschieden modifizierten Substratoberflächen. Gemäß einem
weiteren Beispiel können die Aufnahmesubstrate so an dem
Hauptsubstrat angeordnet sein, dass Zellen zunächst ein
unmittel bar an das Hauptsubstrat angrenzendes Aufnahmesubstrat überwandern,
bevor sie auf ein Aufnahmesubstrat mit einem größeren Abstand
vom Hauptsubstrat gelangen. In diesem Fall wandern Zellen mit hoher
Wanderungsgeschwindigkeit in einem Zeitbereich auf entfernt angeordnete Aufnahmesubstrate,
indem gleichzeitig Zellen mit einer geringeren Wanderungsgeschwindigkeit
auf Aufnahmesubstrate mit einem geringen Abstand vom Hauptsubstrat
wandern. Die Wanderung der Zellen kann über Chemotaxis,
Galvanotaxis oder andere Attraktoren gerichtet oder beschleunigt
werden.
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Wenn
gemäß einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung die Zellen von der Zellkultur auf dem Hauptsubstrat
in mindestens zwei verschiedene Richtungen auf das mindestens eine
Aufnahmesubstrat auswandern, können sich Vorteile aus einer
erhöhten Effektivität der Zellaufnahme aus der
Zellkultur ergeben. Die Zellen können bspw. auf ein einziges Aufnahmesubstrat
wandern, welches das Hauptsubstrat zumindest teilweise umgibt, oder
auf verschiedene Aufnahmesubstrate wandern, die entsprechend in
verschiedenen Richtungen der Zellwanderung angeordnet sind. Besonders
bevorzugt ist eine Variante, bei der sich die Zellen radial allseitig
aus der Zellkultur, insbesondere aus dem organoiden Körper
auf dem Hauptsubstrat auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat bewegen.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Geschwindigkeit der aus
dem Zellaggregat auswandernden Zellen mit fallender Dichte ansteigt. Somit
wird vorteilhafterweise eine gleichmäßige Besiedelung
des mindestens einen Aufnahmesubstrats erzielt.
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Vorteilhafterweise
besteht eine große Variabilität bei der Gestaltung
des mindestens einen Aufnahmesubstrates. Somit kann die Erfindung
unter verschiedenen Anwendungsbedingungen und für verschiedene
Aufgaben implementiert werden. Gemäß einer ersten
Variante wird durch das mindestens eine Aufnahme substrat ein Substratrahmen
gebildet, der das Hauptsubstrat umgibt. Der Substratrahmen ist besonders
für die Aufnahme von Zellen geeignet, die allseitig vom
Hauptsubstrat auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat wandern.
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Allgemein
wird ein Aufnahmesubstrat als Substratrahmen bezeichnet, wenn die
Substratoberfläche, die zur Aufnahme und Kultivierung der
Zellen vorgesehen ist, einen Bereich umgibt, der während der
Zellübertragung frei von Zellen bleibt. Beispielsweise
kann der Substratrahmen eine innere Öffnung aufweisen,
die den zellfreien Bereich bildet und in die das Hauptsubstrat einsetzbar
ist. Alternativ kann das Aufnahmesubstrat zur Bildung des Substratrahmens ein
Substrat mit einer geschlossenen Substratoberfläche sein,
auf die zur Zellübertragung das Hauptsubstrat aufsetzbar
ist, so dass ein äußerer Bereich des Substrats
als Substratoberfläche zur Aufnahme und Kultivierung der
Zellen frei bleibt. In diesem Fall umfasst die erfindungsgemäße
Substratanordnung einen Stapel aus einem Hauptsubstrat und mindestens
einem Aufnahmesubstrat.
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Der
Substratrahmen hat somit allgemein einen Innenrand, der an die Form
und Größe des Randes des Hauptsubstrats angepasst
ist. Hat das Hauptsubstrat bspw. allgemein eine Vieleckform, so ist
der Innenrand des Substratrahmens komplementär zu der Vieleckform.
Bevorzugt ist jedoch eine Kreisform des Hauptsubstrats und des Innenrandes des
Substratrahmens. In diesem Fall wird der Substratrahmen auch als
Substratring bezeichnet. Die Kreisform bietet Vorteile für
eine radial allseitig gleichförmige Übertragung
der Zellen auf das Aufnahmesubstrat.
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Gemäß einer
weiteren Alternative kann der Substratrahmen aus mehreren Aufnahmesubstraten (Substratsegmente)
zusammenge setzt sein, die auf verschiedenen Seiten an das Hauptsubstrat
angrenzend positionierbar sind. Die Substratsegmente sind voneinander
trennbare Bauteile, die in zusammengesetztem Zustand den Substratrahmen
bilden. Mit den Substratsegmenten können vorteilhafterweise
für eine Zellübertragung verschieden modifizierte
Substratoberflächen bereitgestellt werden. Die aus der Zellkultur
auf dem Hauptsubstrat gleichzeitig abgetrennten Zellen können
auf den Substratsegmenten verschiedenen Kultivierungsbedingungen
unterzogen werden.
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Gemäß einer
weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können
die Aufnahmesubstrate einen Substratverbund bilden. Das Hauptsubstrat
und der Substratverbund können so relativ zueinander positioniert
werden, dass das Hauptsubstrat an jeweils ein Aufnahmesubstrat des
Substratverbundes angrenzt. Des Weiteren sind das Hauptsubstrat
und der Substratverbund relativ zueinander beweglich. Somit kann
durch eine gegenseitige Verschiebung des Substratverbundes und des
Hauptsubstrates ein vorbestimmtes Aufnahmesubstrat für die
Aufnahme von Zellen bereitgestellt und/oder dieses Aufnahmesubstrat
nach der Aufnahme der Zellen vom Hauptsubstrat getrennt werden.
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Besonders
bevorzugt ist eine Variante der Erfindung, bei der der Substratverbund
ein biegsames Substratband bildet, in dessen Oberfläche
die Aufnahmesubstrate gebildet sind. Es ist eine Reihe der Aufnahmesubstrate
entlang der Länge des Substratbandes vorgesehen. Das Substratband
ist für eine Translationsbewegung relativ zu einer Randkante
des Hauptsubstrats eingerichtet. Die Randkante des Hauptsubstrats
liegt auf der Oberfläche des Substratbandes auf. Somit
kann durch die Translation des Substratbandes jeweils ein vorbestimmtes
Aufnahmesubstrat am Hauptsubstrat bereitgestellt werden. Vorteilhafterweise
kann das Substratband von einer Substratrolle am Hauptsubstrat vorbeigezogen werden,
um Zellen auf die verschiedenen Aufnahmesubstrate aufzunehmen.
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Wenn
die Verschiebung des Substratverbundes relativ zum Hauptsubstrat
diskontinuierlich erfolgt, ergeben sich Vorteile für Verfahren,
bei denen abwechselnd Zellen auf eines der Aufnahmesubstrate wandern
und dann das betreffende Aufnahmesubstrat vom Hauptsubstrat getrennt
wird. Alternativ kann die Verschiebung des Substratverbundes relativ
zum Hauptsubstrat kontinuierlich erfolgen. In diesem Fall können
die Zellen ununterbrochen auf den Substratverbund übertragen
werden. Vorteilhafterweise können somit große
Oberflächen mit Zellen besiedelt werden, die aus einer
einzigen Zellkultur, insbesondere einem einzigen organoiden Körper
ausgewandert sind. Die gegenseitige Verschiebung des Substratverbundes
und des Hauptsubstrats erfolgen vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit,
die an die Geschwindigkeit der natürlichen Zellbewegung
angepasst ist. Die Geschwindigkeit ist z. B. im Bereich von 1 μm/h
bis 400 μm/h gewählt.
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Weitere
Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Möglichkeit,
nach der Aufnahme der Zellen auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat
weitere Schritte der Behandlung und/oder Untersuchung der auf dem
Aufnahmesubstrat kultivierten Zellen zu realisieren. So kann eine
Immobilisierung der Zellen auf dem Aufnahmesubstrat vorgesehen sein,
bspw. um eine Testkultur bereitzustellen. Auf dem Aufnahmesubstrat
kann ein weiteres Wachstum und/oder eine Differenzierung der Zellen
erfolgen. Da die Zellen auf verschiedenen Aufnahmesubstraten aus
einer gemeinsamen Zellkultur, insbesondere aus einem einzigen organoiden
Körper ausgewandert sind, sind vorteilhafterweise vergleichende
Untersuchungen möglich. Des Weiteren kann nach der Aufnahme der
Zellen auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat eine weitere Trennung
von differenzierten und nicht differenzierten Zellen und/oder eine
Wechselwirkung der Zellen mit weiteren biologischen Zellen vorgesehen
sein. Beispielsweise können die Zellen, die mit verschiedenen
Aufnahmesubstraten aufgenommen und dort verschiedenen Kultivierungsbedingungen
ausgesetzt wurden, gegenseitig zu Wechselwirkung gebracht werden.
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Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter
Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
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1:
eine schematische Illustration einer ersten Ausführungsform
der Erfindung mit einer Zellwanderung auf einen Substratring;
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2:
eine Draufsicht auf eine Substratanordnung mit einem Stapel aus
Haupt- und Aufnahmesubstraten;
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3 und 4:
schematische Seitenansichten erfindungsgemäßer
Substratanordnungen;
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5:
eine weitere schematische Illustration der ersten Ausführungsform
der Erfindung mit einer Zellwanderung auf Substratsegmente;
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6:
eine schematische Seitenansicht einer zweiten Ausführungsform
der Erfindung mit einem Substratverbund; und
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7:
eine Draufsicht auf die in 6 gezeigte
Ausführungsform der Erfindung.
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Ausführungsformen
der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf
die Aufnahme von Stammzellen und/oder differenzierten Zellen aus
Zellaggregaten (organoiden Körpern) erläutert,
die aus glandulären Stammzellen gebildet sind. Die Umsetzung
der Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung der glandulären
Stammzellen beschränkt, sondern auch mit anderen, adulten
oder embryonalen Stammzellen, Vorläuferzellen und Zellgemischen
menschlichen oder tierischen Ursprungs möglich. Die Zellaggregate
können verschiedene Zelltypen, das heißt neben
den Stammzellen auch Vorläuferzellen und/oder differenzierte
Zellen enthalten. Alternativ können Zellen aus einem Gewebeisolat
(z. B. Dermis, Haarfolikel) aufgenommen werden. Einzelheiten der
Kultivierung von Stammzellen oder anderen Zelltypen werden hier
nicht beschrieben, da diese aus den Standardverfahren der Zellbiologie
an sich bekannt sind.
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Als
"Substrat" wird hier allgemein ein Bauteil verwendet, das als Träger
für biologische Zellen geeignet ist. Das Substrat weist
eine Substratoberfläche auf, auf der die Zellen adhärent
anwachsen und die natürliche Zellbewegung ausführen
können. Das Substrat hat eine flächige Ausdehnung,
es besteht aus einem festen Material, das starr (z. B. Scheibe, Platte)
oder nachgiebig (z. B. Folie) sein kann. Während der Übertragung
der Zellen sind die Haupt- und Aufnahmesubstrate miteinander verbunden.
Die Haupt- und Aufnahmesubstrate weisen z. B. ebene Substratoberflächen
auf, die im verbundenen Zustand unmittelbar aneinander grenzend
oder überlappend angeordnet sind. Die erfindungsgemäße Substratanordnung
ist in einer Kultivierungseinrichtung, die in den Figuren nicht
dargestellt ist. Die Kultivierungseinrichtung umfasst z. B. ein
herkömmliches Kultivierungsgefäß mit
einem flüssigen Kultivierungsmedium.
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1 illustriert
in Draufsicht schematisch eine erste Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Substratanordnung 100 mit einem
Hauptsubstrat 10 und einem Aufnahmesubstrat 20.
Das Hauptsubstrat 10 umfasst eine Platte in Form einer
Kreisscheibe mit einem kreisförmigen äußeren
Rand 11. Das Hauptsubstrat 10 besteht z. B. aus
Glas oder Kunststoff. Auf der ebenen Substratoberfläche 12 des
Hauptsubstrats 10 kann eine Beschichtung zur Bereitstellung
vorbestimmter Kultivierungsbedingungen, z. B. eine Beschichtung
aus Laminin, Poly-Lysin, Gelatine, Fibronektin oder andere Peptide
vorgesehen sein. Der Durchmesser des Hauptsubstrats 10 ist
z. B. im Bereich von 0,5 mm bis 2 cm gewählt. Die Dicke
des Hauptsubstrats 10 ist z. B. im Bereich von 10 μm
bis 2 mm gewählt. Das Hauptsubstrat 10 kann mit
einem schematisch illustrierten Trägerelement 13 ausgestattet
sein (siehe 3). Das Trägerelement 13 ist ein
Vorsprung, mit dem eine Manipulation des Hauptsubstrats 10 unter
Verwendung eines mechanischen Werkzeugs erleichtert wird.
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Das
Aufnahmesubstrat 20 umfasst einen Substratring 21 mit
einer Substratoberfläche 21.1, die für
eine Kultivierung biologischer Zellen eingerichtet ist. Der Substratring 21 weist
eine innere Öffnung 21.2 auf, die vom Innenrand 21.3 des
Substratringes 21 umgrenzt ist. Die Form und Größe
des Innenrandes 21.3 ist gleich der Form und Größe
des äußeren Randes 11 des Hauptsubstrats 10 gewählt. Der äußere
Durchmesser des Substratringes 21 ist z. B. im Bereich
von 5 mm bis 5 cm gewählt. Das Hauptsubstrat 10 passt
formschlüssig in die innere Öffnung 21.2 des
Substratringes 21. Die Oberflächen des Hauptsubstrates
und des Aufnahmesubstrates sind vorzugsweise fluchtend ausgerichtet.
Das Hauptsubstrat 10 und der Substratring 21 sind
getrennte Bauteile, die für die erfindungsgemäße
Zellübertragung zusammensetzbar sind.
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In 1 sind
auch die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Aufnahme von Zellen aus einer Zellkultur schema tisch illustriert.
In einer ersten Phase wird die Zellkultur 3 auf dem Hauptsubstrat 10 kultiviert.
Die Zellkultur 3 umfasst einen oder mehrere, Stammzellen
enthaltende, organoide Körper. Die Kultivierung der Zellkultur 3 mit
der Bildung des organoiden Körpers auf dem Hauptsubstrat 10 erfolgt,
während das Hauptsubstrat 10 noch vom Substratring 21 getrennt
oder bereits in diesem eingesetzt ist.
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Nach
der Bildung des organoiden Körpers wandern Zellen 1, 2 aus
der Zellkultur 3 radial allseitig aus (siehe Pfeile). Aufgrund
der natürlichen Zellbewegung wandern die Zellen 1, 2 auf
den Substratring 21, auf dem eine weitere Kultivierung
der Zellen erfolgt.
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Nach
der Zellübertragung der Zellen 1, 2 auf den
Substratring 21 werden das Hauptsubstrat 10 und
das Aufnahmesubstrat 20 (Substratring 21) voneinander
getrennt (siehe unterer Teil von 1). Der Zeitpunkt
der Trennung wird in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen
der Erfindung gewählt. Beispielsweise kann die Trennung
nach einer vorbestimmten Übertragungszeit (z. B. 1 Stunde bis
14 Tage) oder nach Erreichen eines vorbestimmten Besiedelungsgrades
des Aufnahmesubstrats 20 erfolgen.
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Anschließend
kann das Hauptsubstrat 10 mit einem weiteren Aufnahmesubstrat 20 (in 1 nicht dargestellt)
kombiniert werden, um weitere Zellen auf das weitere Aufnahmesubstrat
zu übertragen. Des Weiteren kann die auf dem Substratring 21 gebildete Zellkultur
weiteren Schritten der Behandlung und/oder Untersuchung, wie z.
B. einer weiteren Differenzierung unterzogen werden.
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2 illustriert
eine abgewandelte Variante einer Substratanordnung 100,
bei der mehrere Aufnahmesubstrate 20.1, 20.2, 20.3 mit
einem Hauptsubstrat 10 als Substratstapel kombiniert sind.
Das Hauptsubstrat 10 mit der Zellkultur 3 (organoider
Körper) umfasst eine Kreisscheibe, die auf dem ersten Aufnahmesubstrat 20.1 aufliegt.
Das erste Aufnahmesubstrat 20.1 umfasst ebenfalls eine
Kreisscheibe, die auf dem zweiten Aufnahmesubstrat 20.2 liegt, das
seinerseits auf dem dritten Aufnahmesubstrat 20.3 liegt.
Da die Aufnahmesubstrate 20.1, 20.2 und 20.3 verschiedene
Durchmesser haben, wird durch eine konzentrische Anordnung an jedem
der Aufnahmesubstrate ein Substratring gebildet. Beispielsweise
wird durch den vom Hauptsubstrat 10 nicht abgedeckten Teil
des ersten Aufnahmesubstrats 20.1 der erste Substratring
gebildet, der das Hauptsubstrat 10 allseitig umgibt.
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Für
eine wirksame Zellübertragung ist die Dicke des Hauptsubstrats 10 vorzugsweise
geringer als 1 mm, insbesondere geringer als 250 μm gewählt. Hierzu
besteht das Hauptsubstrat 10 bspw. aus einer Kunststofffolie,
z. B. aus Polyurethan. Die Dicken der Aufnahmesubstrate 20.1 und 20.2 weisen
vorzugsweise ebenfalls eine Dicke auf, die geringer als 1 mm, insbesondere
geringer als 250 μm ist. Die aneinander grenzenden Ränder
der Haupt- und Aufnahmesubstrate können angeschrägt
sein, so dass die Zellwanderung zwischen den Substraten erleichtert wird.
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Zur
erfindungsgemäßen Aufnahme biologischer Zellen
aus der Zellkultur 3 wird das Hauptsubstrat 10 mit
der Zellkultur 3 auf den Stapel aus Aufnahmesubstraten 20.1, 20.2 und 20.3 aufgesetzt.
Die aus der Zellkultur 3 auswandernden Zellen bewegen sich
aufgrund der natürlichen Zellbewegung radial allseitig
auf die Substratringe. Da sich die verschiedenen Zelltypen, die
aus der Zellkultur 3 auswandern, in ihren Wanderungsgeschwindigkeiten
unterscheiden können, kann durch die Zellübertragung eine
Trennung nach Zelltypen erfolgen. So er reichen nach einer vorbestimmten
Zeit der Zellübertragung (z. B. 1 bis 2 Stunden bis 14
Tage) die schnellsten Zellen den äußersten Substratring 21.3,
während die übrigen Zellen auf den inneren Substratringen 21.1, 21.2 angeordnet
sind. Anschließend erfolgt eine Trennung des Hauptsubstrats 10 von
den Aufnahmesubstraten 20.1, 20.2 und 20.3 und
eine Trennung der Aufnahmesubstrate voneinander. Das Hauptsubstrat 10 mit
der Zellkultur 3 wird anschließend auf einen weiteren
Substratstapel aufgesetzt, um weitere Zellen aus der Zellkultur 3 aufzunehmen.
Die Aufnahmesubstrate 20.1, 20.2 und 20.3 werden
weiteren Kultivierungsschritten unterzogen.
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Das
in 2 gezeigte Prinzip der Bildung eines Substratstapels
ist nicht auf die Kombination des Hauptsubstrats 10 mit
drei Aufnahmesubstraten beschränkt, sondern entsprechend
auch bspw. mit einem einzigen Aufnahmesubstrat oder mehr als drei Aufnahmesubstraten
möglich. Alternativ zu der gezeigten Anordnung des Hauptsubstrates
mit einem geringen Durchmesser auf den Aufnahmesubstraten mit steigenden
Durchmessern können die Aufnahmesubstrate Substratringe
mit verschiedenen Innendurchmesser umfassen, die auf ein Hauptsubstrat aufgesetzt
sind. Diese beiden Varianten der Bildung des Substratstapels sind
mit den Seitenansichten in den 3 und 4 schematisch
illustriert.
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Gemäß 3 liegt
das Hauptsubstrat 10 wie bei 2 beschrieben
auf einem flächigen Substrat. Durch dessen vom Hauptsubstrat 10 nicht
abgedeckten Teil wird das Aufnahmesubstrat 20 (Substratring 21)
gebildet. Auf dem Hauptsubstrat 10 ist die Zellkultur 3 angeordnet,
aus der Zellen 1, 2 auswandern und auf den Substratring 21 übertragen
werden. Nach der Besiedelung des Substratringes 21 mit
den Zellen 1, 2 kann das Hauptsubstrat 10 mit
der Zellkultur 3 vom flächigen Substrat abgenommen
und weiteren Verfahrensschritten zugeführt werden. Zur
Trennung der Haupt- und Aufnahmesubstrate 10, 20 wird
das Hauptsubstrat 10 am Trägerelement 13 mit
einem mechanischen Werkzeug (nicht dargestellt) ergriffen.
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4 illustriert
das umgekehrtes Prinzip der Bildung eines Substratstapels, bei dem
das Hauptsubstrat 10 einen Träger für
ein ringförmiges Aufnahmesubstrat 20 mit einer
inneren Öffnung 21.2 bildet. Die Zellkultur 3 ruht
unbeweglich auf dem Aufnahmesubstrat 10 in der inneren Öffnung 21.2 des
Aufnahmesubstrats 20. Die von der Zellkultur auswandernden
Zellen 1, 2 besiedeln die Substratoberfläche
des Aufnahmesubstrats 20, wo auch eine weitere Kultivierung
der Zellen 1, 2 erfolgt.
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5 illustriert
eine weitere Variante der Erfindung, bei der als Aufnahmesubstrate 20 mehrere Substratsegmente 22.1, 22.2 und 22.4 vorgesehen sind,
die das Hauptsubstrat 10 umgeben. Die Substratsegmente 22.1 bis 22.4 bilden
im zusammengesetzten Zustand einen Substratring, der mit Zellen besiedelt
werden kann, wie dies oben unter Bezug auf 1 beschrieben
wurde. Nach der Zellübertragung können Substratsegmente 22.1 bis 22.4 voneinander
getrennt werden (siehe Pfeile). Nach der Trennung können
verschiedene Substratsegmente miteinander kombiniert werden, um
die Zellen auf den Substratsegmenten zur Wechselwirkung zu bringen.
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Gemäß einer
Variante der Erfindung kann die Trennung eine Verschiebung der Substratsegmente 22.1 bis 22.4 auf
einem gemeinsamen Träger umfassen, das ein weiteres Aufnahmesubstrat 20.4 bildet.
Dabei können die Zellen von den Substratsegmenten 22.1 bis 22.4 auf
das weitere Aufnahmesubstrat 20.4 aufwandern und auf diesem
miteinander Wechselwirken.
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5 illustriert
schematisch, dass das Aufnahmesubstrat 20 eine biologische
wirksame Beschichtung aufweisen kann. Die biologisch wirksame Beschichtung
kann z. B. Fibronektin, ein anderes Matrixmolekül, ein
Polymer oder immobilisierende Signalmoleküle umfassen.
Die Beschichtung kann homogen gebildet sein (22.1), eine
Flächendichtegradienten aufweisen (22.2) oder
mindestens eine Beschichtungssubstanz (22.3, 22.4)
umfassen. Verschiedene Beschichtungssubstanzen können sich beim Übergang
zwischen den Substratsegmenten ggf. teilweise überlagern
(22.3, 22.4). Gemäß einer weiteren
Alternative können Muster der Beschichtung mit Detailstrukturen
mit typischen Dimensionen im μm- oder mm-Maßstab
vorgesehen sein. Durch die biologisch wirksame Beschichtung der
Substratsegmente werden auf den verschiedenen Teilen des Aufnahmesubstrates 20 verschiedene
Kultivierungsbedingungen geschaffen. Beispielsweise können
die aus der Zellkultur 3 auswandernden Stammzellen auf den
Substratsegmenten 22.1 bis 22.4 verschieden differenziert
werden. Nach der Trennung der Substratsegmente und/oder der Übertragung
auf das gemeinsame Aufnahmesubstrat 20.4 können
die verschieden differenzierten Zellen miteinander Wechselwirken.
Gemäß einer weiteren Variante können
verschiedene Aufnahmesubstrate mit Zellen aus verschiedenen Zellkulturen
(in 5 nicht gezeigt) besiedelt werden. Nach der Zellübertragung
auf die Aufnahmesubstrate kann eine gegenseitige Wechselwirkung
der verschiedenen Zellen vorgesehen sein.
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Die 6 und 7 zeigen
eine zweite Ausführungsform der Erfindung, bei der die
Aufnahmesubstrate 20, 20.1, ... Teil eines Substratbandes 23 sind,
in schematischer Seitenansicht und Draufsicht. Die Substratanordnung 100 umfasst
das Hauptsubstrat 10 zur Aufnahme der Zellkultur 3 und
das Substratband 23. Das Hauptsubstrat 10 ist
ortsfest in einer Kultivierungseinrichtung angeordnet und z. B.
an einer Wand 30 eines Kultivierungsgefäßes
(nicht dargestellt) befestigt. Auf dem Hauptsubstrat 10 kann eine
adhäsionsmindernde Beschichtung 14 (z. B. aus PTFE,
Alginat, Polysaccharide) vorgesehen sein, um die Bewegung von Zellen
auf Wege hin zum Rand 11 zu beschränken. Eine
Mulde 15 des Hauptsubstrates 10 dient der Aufnahme
der Zellkultur 3.
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Das
Substratband 23 umfasst ein flexibles Material, z. B. Kunststoff,
auf dessen Oberfläche die Aufnahmesubstrate 20, 20.1 gebildet
sind. Die Aufnahmesubstrate 20, 20.1 umfassen
voneinander getrennte Bereiche der Oberfläche des Substratbandes 23.
Das Substratband 23 weist eine Dicke von z. B. 250 μm
und eine Breite von z. B. 10 mm auf. Die Aufnahmesubstrate 20, 20.1 sind
mit verschiedenen biologisch wirksamen Beschichtungen, z. B. aus
Laminin, Fibronektin oder andere bioaktive Moleküle, die für
eine spezifische Adhäsion von Zellen verwendet werden,
gebildet.
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Das
Substratband 23 ist in einer Substratrolle 24 unterhalb
des Hauptsubstrats 10 angeordnet. Von der Substratrolle 24 wird
das Substratband 23 über Umlenkrollen (nicht dargestellt)
so an dem Rand 11 des Hauptsubstrats 10 vorbeigeführt,
dass Zellen 1, 2 auf das jeweils angrenzende Aufnahmesubstrat 20, 20.1 aufwandern
können. Die Translationsbewegung (siehe Pfeil) des Substratbandes 24 erfolgt bspw.
mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1 μm/h bis 400 μm/h.
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Gemäß einer
weiteren Variante kann vorgesehen sein, dass das Band diskontinuierlich
schneller weiter geschaltet wird, um Abstände mit geringerer
oder ohne Zellbesiedelung zu schaffen. Vorteilhafterweise kann das
Band anschließend an diesen Abständen durchtrennt
werden, ohne die übrigen Zellen zu beschädigen.
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Zur
erfindungsgemäßen Aufnahme biologischer Zellen
aus der Zellkultur 3 wird diese auf dem Hauptsubstrat 10 angeordnet.
Die aus der Zellkultur 3 auswandernden Zellen 1, 2 bewegen
sich aufgrund der natürlichen Zellbewegung über
den Rand 11 auf das angrenzende Aufnahmesubstrat 20.
Um weitere Zellen aus der Zellkultur 3 aufzunehmen, wird
das Substratband 23 mit den Aufnahmesubstraten 20, 20.1,
... relativ zum Rand 11 des Hauptsubstrats 10 verschoben.
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Mit
der in den 6 und 7 gezeigten Ausführungsform
der Erfindung können vorteilhafterweise verschiedene Zelltypen
aus der Zellkultur 3 (umfassend z. B. einen organoiden
Körper oder ein Gewebeisolat) separiert und auf Oberflächen
getrennt aufgenommen werden. Weitere Kultivierungsschritte, Behandlungen
und/oder Untersuchungen können sich an den voneinander
getrennten Zellen anschließen.
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüche
offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln
als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung
in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
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Zitierte Patentliteratur
-
- - US 2006/051735
A1 [0003, 0004]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - M. Abercrombie
et al. in „Experimental Cell Research", Band 67, 1971,
S. 359–367 und von L. P. Cramer in „Biochem. Soc.
Symp.", Band 65, 1999, S. 17–205 [0002]
- - C. Kruse et al. in „Appl. Phys. A", Band 79, 2004, S.
1617–1624; und C. Kruse et al. in „Ann. Anat.", Band
188 (6), 2006, S. 503–517 [0007]
- - Weiteren S. Danner et al. in "Mol. Hum. Reprod." Bd. 13, 2007,
S. 11–20 [0007]