WO2003080791A2 - Zellträger und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

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WO2003080791A2
WO2003080791A2 PCT/EP2003/002971 EP0302971W WO03080791A2 WO 2003080791 A2 WO2003080791 A2 WO 2003080791A2 EP 0302971 W EP0302971 W EP 0302971W WO 03080791 A2 WO03080791 A2 WO 03080791A2
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cells
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Rainer Marksteiner
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Innovacell Biotechnologie Gmbh
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    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/22—Transparent or translucent parts

Definitions

  • the invention relates to cell carriers, in particular carrier substrates for biological cells, and to methods for their production and use.
  • An object of modern processes in biotechnology, biochemistry, pharmacy and genetic engineering is in particular the investigation of the interaction of biological cells with biological materials, such as for example other cells, cell components, microorganisms, macromolecules or the like, or with biologically active substances of natural or synthetic origin.
  • biological materials such as for example other cells, cell components, microorganisms, macromolecules or the like, or with biologically active substances of natural or synthetic origin.
  • the induction of the interaction, the examination of the interaction result or a cell cultivation before or after the actual examination are generally carried out with cells adhering to a solid substrate.
  • a wide variety of cell supports are known from practice which, depending on the practical task, have a specific geometry and / or a specific surface functionalization.
  • cell carriers consist of inert materials, such as. B. glass, plastic or semiconductor material.
  • a disadvantage of conventional cell carriers is that they generally only have a substrate function. They form a support for the cells to be examined, which essentially grow out of order on a substrate. It is generally known from practice to locally modify substrates in order to induce improved cell growth in certain areas. However, complicated substrate preparations such as e.g. B. surface etching or the like is required.
  • the object of the invention is to provide an improved cell carrier with which the disadvantages of conventional cell carriers are overcome and which in particular enables a defined cell deposition and / or a defined cell growth.
  • the object of the invention is also to provide a method for producing such a cell carrier.
  • the basic idea of the invention is to provide a substrate with an adherently structured polymer film which has adherent regions which are separated from one another by non-adherent regions.
  • a cell carrier Gers with a polymer surface on which the adherent areas are formed by a polymer modification has the advantage that the polymer surface can be defined and reproducibly adapted for a defined cell deposition and / or a defined cell growth using procedures known per se.
  • the inventors have found that a modified polymer surface has an altered bioreactivity and biocompatibility. Surface modification involves changing the binding properties of the polymer on the surface, in particular breaking polymer bonds. Binding sites are generated which are advantageously used for cell deposition and / or cell growth.
  • the invention can be implemented with various organic polymers, e.g. B. with polyolefins, especially fluorinated polyolefins, polyhydroxyethylene methacrylate, polyurethane, polytetrafluoroethylene (PTFE), polysaccharides and biopolymers, such as. B. collagen, fibrin, fibronectin and the like.
  • polyolefins especially fluorinated polyolefins, polyhydroxyethylene methacrylate, polyurethane, polytetrafluoroethylene (PTFE), polysaccharides and biopolymers, such as. B. collagen, fibrin, fibronectin and the like.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • biopolymers such as. B. collagen, fibrin, fibronectin and the like.
  • the cell carrier consists of a transparent, fluorine-containing polymer film, in particular a transparent PTFE film.
  • the fluorine-containing polymer films used according to the invention have the advantages, on the one hand, of being able to be subjected to the structuring processes for producing the adherent areas in a particularly simple manner, and, on the other hand, of enabling adaptation to the most varied of applications.
  • Foil cell supports according to the invention can be used with particular advantage in micro-hybridization chambers known per se.
  • the adherent areas in which cells adhere preferentially and / or grow cells form a defined geometric pattern.
  • this pattern with high reproducibility with structure sizes of z. B.
  • the pattern includes, for example, island-like or strip-like adherent areas, which are accordingly separated by non-modified, non-adherent areas.
  • polymer surfaces can be set up for selective cell deposition by equipping the adherent areas with specifically acting adsorbates.
  • Adsorbates preferably comprise biologically active macromolecules such as e.g. B. proteins, collagen, antibodies, laminin and other proteins of the extracellular matrix of biological cells.
  • the invention further relates to a method for producing the said cell carrier, in which a polymer surface is treated in order to produce the adherent regions.
  • a treatment with electromagnetic radiation, particle radiation, a chemical substance or field influence e.g. corona discharge
  • fluorine-containing polymer surfaces are treated in a structured manner by means of electromagnetic radiation in order to produce the adherent regions.
  • the invention enables that with sufficiently thin sowing of a cell mixture (consisting of different cell types) Max. 1 cell per adherent area is attached.
  • clonal cell growth is achieved on the adherent areas, ie a clone develops from only one original cell attached to a spot. Due to the demarcation of other spots by non-adhesive areas (ie untreated surfaces), the clones cannot be mixed.
  • the rapidly dividing cells overgrow the culture dish, with the result that no clones can be separated and cells which divide particularly slowly become overgrown quickly.
  • adherent areas have a precisely defined dimension, this also enables precise punctiform isolation of individual clones. This is achieved in that an isolation instrument for holding cells has the same dimensions as the adherent area. In this way, cells can be removed from the adherent region (mechanically or enzymatically) without the risk of accidentally isolating several clones. This does not affect growth in the other adherent areas.
  • the isolation of the clones can be automated.
  • a mark e.g. optically
  • the polymer surface e.g. Foil
  • the defined dot pattern of the adherent areas x, y axes
  • the adhesion and growth of certain cell types can be promoted by additional modification of the adherent areas (e.g. application of macromolecules such as amino acids, peptides, proteins, sugars, lipids, nucleic acids, cells, cell components, viruses).
  • macromolecules such as amino acids, peptides, proteins, sugars, lipids, nucleic acids, cells, cell components, viruses.
  • reaction of the cell clones e.g. can be automatically read out via a change in the fluorescence of a corresponding dye and analyzed cell-specifically. Cell growth or other reactions can also be recorded in this way.
  • a modified application of the analytical cell chip is that different cell types (e.g. tumor cells) are applied to a film and cultivated. Adherent areas are matched to the adhesive properties of the respective cells.
  • the influence on growth can be analyzed (e.g. for a search for cytostatics).
  • the clones can be read out automatically and analyzed together with the type of coating. It can e.g. B. can quickly be determined whether growth has taken place or not.
  • Cell carriers according to the invention enable spatial division of two or more different cell populations. different their cell types require the support of feeding cells (eg keratinocytes and fibroblasts) to grow. After the target cells have grown, these so-called feeder cells must be separated. Due to the spatial separation by non-adherent areas on the film, there can be no mixing and the target cells can be isolated from separate spots without significant mixing with the feeding cells.
  • feeding cells eg keratinocytes and fibroblasts
  • the orientation of cells on a growth surface is initially random. In the organism, however, the cells are oriented according to a precise pattern in order to function as tissue (e.g. muscle). Flat patterns of the adherent areas (e.g. lines) enable the cells to grow in an oriented manner. In addition, different cell types can be attached to defined locations by different additional coating of the individual spots, which enables a defined growth pattern (eg alignment of muscle cells to muscle fibers) and, as a result, two-dimensional organotypical cell growth on a surface treated in this way, also outside the body ,
  • Cell carriers according to the invention have an expanded field of application. In addition to the substrate function, they also perform a modification function by influencing cell deposition and / or cell growth depending on the geometry and / or material composition of the adherent areas. There are advantageous applications in the collection of cells on cell carriers, in particular for their attachment, proliferation, growth or cultivation.
  • Figure 4 is a schematic sectional view of a perfusion chamber which is equipped with the cell carrier according to the invention.
  • An essential feature of the invention is the local treatment of polymer surfaces to produce certain patterns of adherent areas (interaction areas, interaction areas) and / or certain material modifications.
  • the invention is explained below using the example of the modification of fluorine-containing polymer films, in particular PTFE films, without being restricted to these polymers and this flexible substrate shape. Rather, substrates made of any solid materials, in particular glass, semiconductor material or plastic, can be used, on the surface of which a polymer layer is formed. However, transparent PTFE foils are preferred because they offer advantages in the optical analysis of the cells collected on the cell carrier.
  • the partial images (A) to (D) schematically show the steps of a method for producing a cell carrier 40 according to an embodiment of the invention.
  • the illustrated size relationships do not correspond to the size relationships in reality.
  • the cell carrier comprises a substrate 10 with a fluoropolymer-containing surface 11.
  • a transparent PTFE film is used.
  • the film thickness is, for example, 1 mm to 10 ⁇ m.
  • the surface of the PTFE film is modified to produce adherent areas.
  • the modification is carried out according to the pulsed laser deposition process, which in itself is used to modify PTFE surfaces is known (see WO 00/37122).
  • the PTFE film 10 is exposed to laser radiation, in which a change in the degree of crosslinking and the chain lengths is induced in the near-surface polymer material.
  • the laser radiation 51 is directed onto the PTFE film 10 through a mask 52 with translucent areas 53.
  • the film modification takes place at the locations of the exposure.
  • adherent areas 12 are formed in the form of islands 21 (FIG. 1 (C)), whose matrix-like arrangement in straight rows and columns corresponds to the mask shape.
  • the islands 21 have a diameter of 0.001 to 3 mm, for example. They are completely enclosed by non-adherent areas 13, ie by untreated surface parts. Each adherent area, e.g. B. each island 21 is surrounded by a non-adherent area. The distance between the edges of the adherent areas is preferably at least 500 ⁇ m.
  • Cells 30 (shown enlarged) are applied to the modified PTFE film. The inventors have found for the first time that the cells 30 adhere well to the adherent areas 12 (islands 21) and continue to grow, while in the non-adherent areas 13 in between, adherence or growth of the cells is hindered or excluded.
  • the cells 30 thus grow on the finished cell carrier 40 according to FIG. 1 (D) with a pattern corresponding to the geometry of the adherent regions 12. This pattern arrangement has particular advantages in the subsequent analysis of cases, for example by means of fluorescence measurements.
  • UV radiation can be provided, for example.
  • the radiation can be treated with a chemical treatment be combined.
  • the surface area of interest is irradiated in a reactive, gaseous or liquid medium, so that chemical groups on the surface may be replaced by new chemical groups and / or connection points.
  • the UV radiation is carried out using radiation sources known per se, preferably in the range from 150 nm to 360 nm.
  • a wavelength in the visible wavelength range can also be used for the radiation.
  • the surface is modified by ion irradiation (ion implantation through a mask).
  • Ion radiation leads to a chemical and / or structural change in the surface.
  • C, N, 0, Ne or Ar ions are used.
  • Irradiation is carried out with implantation devices available per se at room temperature in a vacuum or in a reactive plasma.
  • ion energies of a few 10 to a few 100 keV with current densities in the range of approx. 10 12 ions / cm to 10 16 ions / cm -2 are used.
  • a surface treatment with a reactive or a non-reactive plasma is provided.
  • the plasma treatment accordingly leads to chemical and / or structural changes in the surface.
  • the same method steps as in FIG. 1 are illustrated in FIG. 2, but here non-adherent islands, but rather adherent strips 29 are formed.
  • the cell carrier according to the invention is characterized by an oriented coating and thus an oriented growth of the cells according to FIG. 1 (D).
  • a particular advantage of oriented cell cultivation on a cell carrier according to FIG. 2 is that cells are cultivated with a specific growth pattern that the Cell alignment in a biological system, particularly in a tissue.
  • Cell carriers according to the invention make it possible to simulate the growth of cells of the same or different types under geometric conditions which are adapted to the conditions in an organ.
  • the surface modification of the cell carrier can also include a material modification.
  • an adsorbent additive 54 takes place during the pulsed laser deposition.
  • amino acids, peptides, nucleic acids, sugars, proteins or the like are taken up in the adherent areas, which form adsorbate areas 23 here.
  • the adherent areas are modified after their formation.
  • the functionalization of the adherent areas can be directed to the fact that only a certain type of cells grow on the cell carrier.
  • the cells 30 according to FIG. 3 comprise a first cell type 31 (large cells) and a second cell type 32 (small cells).
  • the modification of the PTFE film is selected by selecting specific binding sites so that only the first cell type 31 adheres to the cell carrier 40.
  • an additional step of synthesizing further substances e.g. B.
  • a synthesis of proteins can be provided.
  • the modifications illustrated in the figures can be carried out together.
  • a structured surface modification according to FIGS. 1 or 2 can be formed, in which the adherent regions 12 contain specifically binding adsorbates.
  • Cell carriers according to the invention form sheet-like cell matrices which, depending on the application, are themselves subjected to examinations or are used as detectors.
  • the adherent areas are arranged with a high density (e.g. 10 islands 21 per mm 2 ).
  • the cells 30 are preferably applied from a suspension with a sufficiently low dilution so that a single cell adheres to each island 21.
  • a so-called cloning film is thus produced, which consists of a cell carrier 40 according to the invention with on average at most one cell per adherent area 12.
  • the cell carrier according to the invention is used with particular advantage in a method for analyzing cells.
  • Cells are applied to the modified surface from a suspension and, after attachment, are examined using optical methods known per se, in particular fluorescence measurements.
  • the cells on the cell carrier 40 have defined spatial coordinates.
  • the position of each cell can be specified with X and Y coordinates. This simplifies the measurement and storage of measurement data together with the respective geometric position.
  • a cell carrier according to the invention can carry at least one reference marking.
  • a cross-shaped reference marking 14 is provided as the calibration mark, which defines a coordinate origin. This advantageously facilitates the assignment of the coordinates of the adherent areas or the cells arranged thereon for an optical detection system.
  • FIG. 4 shows an enlarged schematic sectional view of a reaction chamber 60 which is equipped with a cell carrier according to the invention.
  • the reaction chamber 60 which for example forms a cloning chamber or a perfusion chamber, is itself the subject of the present invention. It comprises a cell carrier 40 according to the invention, which is arranged on at least one wall 61 of the reaction chamber 60. The opposite wall is formed by a cover 63.
  • fluid connections 65 are provided for the inflow or outflow of a cell suspension or a treatment solution into the interior of the reaction chamber 60.
  • the side walls 64 are preferably equipped with a schematically illustrated height adjustment 66, with which the cover 63 can be arranged at different distances from the cell carrier 40 (see double arrow).
  • the reference number 67 refers to an electrode device with which electrical fields for treating or manipulating cells can be generated in the interior of the reaction chamber 60. The electrode device 67 can be used to additionally influence the cell movement on the basis of dielectrophoretic force effects.
  • the cover 63 is made of a transparent material. This enables the cell carrier 40 to be observed with an optical detection system 70 from the top of the reaction chamber.
  • the detection system 70 contains, for example, a CCD camera with which fluorescent emissions of cells on the cell carrier 40 can be recorded.
  • the reaction chamber 60 forms a so-called biochip, ie a composite component made of a plastic or semiconductor material, in which the structure of the reaction chamber 60 and the cell carrier 40 are integrated.
  • a biochip according to the invention contains a cell carrier 40 with the adherent regions described above.
  • the cell carrier 40 in the biochip is brought into contact with a cell suspension solution by the user.
  • cells are attached to the adherent areas.
  • the cells are then cultivated or manipulated depending on the task.
  • the adjustable height of the cover 63 has the advantage that the flow rate in the reaction chamber 60 is adjustable.
  • the flow rate is increased and thus the contact time of the cells in a cell suspension with the cell carrier 40 is reduced.
  • the probability of a short-term contact of the cells with the cell carrier is increased with a reduced chamber height.

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Abstract

Es wird ein Zellträger (40) mit einem Substrat (10) beschrieben, auf dem eine adhärente Struktur (20) gebildet ist, die adhärente Bereiche (12) umfasst, die ein erhöhtes Haftvermögen für biologische Materialien, insbesondere biologische Zellen, Zellbestandteile und/oder biologisch wirksame Makromoleküle, besitzen und die durch nicht-adhärente Bereiche (13) voneinander abgegrenzt sind, wobei das Substrat (10) aus einer transparenten Polymerfolie besteht, die an sich ein vermindertes Haftvermögen für die biologischen Materialien besitzt und deren Oberfläche (11) in den adhärenten Bereichen (12) chemisch und/oder strukturell modifiziert ist, wobei in den nicht-adhärenten Bereichen (13) die Oberfläche (11) der Polymerfolie unmodifiziert freiliegt und die Polymerfolie ein Polymer umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Polyolefinen, insbesondere fluorinierten Polyolefinen, Polyhydroxy-ethylenmethacrylat, Polyurethan, Polytetrafluorethylen, Kollagen, Fibrin, Fibronektin und Polysacchariden ausgewählt ist.

Description

Zellträger und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf Zellträger, insbesondere Trägersubstrate für biologische Zellen, und auf Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
Ein Gegenstand moderner Verfahren der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Gentechnik ist insbesondere die Untersuchung der Wechselwirkung biologischer Zellen mit biologischen Materialien, wie zum Beispiel weiteren Zellen, Zellbestandteilen, Mikroorganismen, Makromolekülen oder dergleichen, oder mit biologisch wirksamen Stoffen natürlichen oder synthetischen Ursprungs. Die Herbeiführung der Wechselwirkung, die Untersuchung des Wechselwirkungsergebnisses oder eine Zellkultivierung vor oder nach der eigentlichen Untersuchung werden in der Regel mit adhärent auf einem festen Substrat angeordneten Zellen durchgeführt. Aus der Praxis sind die verschiedensten Zellenträger bekannt, die je nach der praktischen Aufgabe eine bestimmte Geometrie und/oder eine bestimmte Oberflächenfunkti- onalisierung besitzen. In der Regel bestehen Zellträger aus inerten Materialien, wie z. B. Glas, Kunststoff oder Halbleitermaterial.
Ein Nachteil herkömmlicher Zellträger besteht darin, dass diese in der Regel lediglich eine Substratfunktion besitzen. Sie bilden eine Auflage für die zu untersuchenden Zellen, die im Wesentlichen ungeordnet auf einem Substrat aufwachsen. Es ist zwar aus der Praxis allgemein bekannt, Substrate lokal zu modifizieren, um in bestimmten Bereichen ein verbessertes Zellwachstum zu induzieren. Hierzu sind jedoch komplizierte Substratpräparationen, wie z. B. Oberflächenätzungen oder dergleichen erforderlich.
Aus der Polymerphysik ist es allgemein bekannt, Polymeroberflächen durch chemische oder physikalische Behandlungen zu mo- difizieren. Zu den Behandlungen zählen beispielsweise eine Behandlung mit chemischen Substanzen, eine Bestrahlung mit Partikeln oder elektromagnetischen Strahlen, eine Koronaentladung, eine Plasmabehandlung, eine Flammbehandlung, eine Ozonbehandlung oder dgl. Es ist insbesondere bekannt, Polymeroberflächen mit UV-Licht zu modifizieren. Es kann auch eine strukturierte Modifizierung vorgesehen sein, wie z. B. bei der Herstellung von Photoresists in der Mikroelektronik, wobei eine Ortsauflösung im Bereich von 100 nm erreichbar ist. Die herkömmlichen Verfahren zur Behandlung von Polymeroberflächen sind auf eine Änderung der chemischen Oberflächenstruktur gerichtet. Es werden Bindungen im Polymer aufgebrochen und/oder neue Bindungsstellen generiert. In WO 00/37122 wird die Modifizierung von Polytetrafluorethylen-Oberflachen durch gepulste Laserdeposition beschrieben. Diese Technik war bisher auf die Behandlung großer Polymeroberflächen (z. B. Werkstoffoberflachen) beschränkt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Zellträger bereitzustellen, mit dem die Nachteile herkömmlicher Zellträger überwunden werden und der insbesondere eine definierte Zellablage und/oder ein definiertes Zellwachstum ermöglicht. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Zellträgers bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden durch einen Zellträger, eine Reaktionskammer und ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß den Ansprüchen 1, 7, 10 und 13 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Die Grundidee der Erfindung ist es, ein Substrat mit einer ad- härent strukturierten Polymerfolie bereitzustellen, die adharente Bereiche aufweist, die durch nichtadhärente Bereiche voneinander getrennt sind. Die Bereitstellung eines Zellträ- gers mit einer Polymeroberfläche, auf der die adhärenten Bereiche durch eine Polymermodifizierung geformt sind, besitzt den Vorteil, dass die Polymeroberfläche mit an sich bekannten Prozeduren definiert und reproduzierbar für eine definierte Zellablage und/oder ein definiertes Zellwachstum angepasst werden kann. Die Erfinder haben festgestellt, dass eine modifizierte Polymeroberfläche eine veränderte Bioreaktivität und Biokompatibilität besitzt. Eine Oberflächenmodifizierung umfasst eine Änderung der Bindungseigenschaften des Polymers auf der Oberfläche, insbesondere eine Aufbrechen von Polymerbindungen. Es werden Bindungsstellen generiert, die vorteilhafterweise für eine Zellablage und/oder ein Zellwachstum ausgenutzt werden.
Die Erfindung ist mit verschiedenen organischen Polymeren umsetzbar, z. B. mit Polyolefinen, insbesondere fluorinierten Polyolefinen, Polyhydroxyethylenmethacrylat, Polyurethan, Po- lytetrafluorethylen (PTFE) , Polysachariden und Biopolymeren, wie z. B. Kollagen, Fibrin, Fibronektin und dgl. umsetzbar. Ein Vorteil dieser Materialien besteht in deren Modifizierbar- keit, insbesondere durch elektromagnetische Bestrahlung, wie z. B. durch UV- und/oder Laserbestrahlung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der Zellträger aus einer transparenten, fluorhaltigen Polymerfolie, insbesondere aus einer transparenten PTFE-Folie. Die erfindungsgemäß verwendeten fluorhaltigen Polymerfolien besitzen die Vorteile, einerseits besonders einfach den Strukturie- rungsverfahren zur Herstellung der adhärenten Bereiche unterzogen werden zu können und andererseits eine Anpassung an die verschiedensten Anwendungen zu ermöglichen. Erfindungsgemäße Folien-Zellträger können mit besonderem Vorteil in an sich bekannten Mikrohybridisierungskammern verwendet werden. Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung bilden die adhärenten Bereiche, in denen eine bevorzugtes Anhaften von Zellen und/oder ein bevorzugtes Zellwachstum erfolgen, ein definiertes geometrisches Muster. Vorteilhafterweise kann dieses Muster mit hoher Reproduzierbarkeit mit Strukturgrößen von z. B. 10 μm bis 2 mm hergestellt werden. Es können aber auch größere Strukturen realisiert werden. Das Muster umfasst beispielsweise insel- oder streifen- förmige adharente Bereiche, die entsprechend durch nicht- modifizierte, nichtadhärente Bereiche getrennt sind. Es ergeben sich besondere Vorteile bei der Analyse der Zellen auf dem Zellträger, insbesondere mit optischen Detektoren, die für eine ortsaufgelöste Fluoreszenzdetektion eingerichtet sind.
Gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung können Polymeroberflächen zur selektiven Zellablage eingerichtet werden, indem die adhärenten Bereiche mit spezifisch wirkenden Adsorbaten ausgestattet werden. Adsorbate umfassen vorzugsweise biologisch wirksame Makromoleküle, wie z. B. Proteine, Kol- lagene, Antikörper, Laminin und andere Proteine der extrazellulären Matrix biologischer Zellen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des genannten Zellträgers, bei dem eine Polymeroberfläche behandelt wird, um die adhärenten Bereiche herzustellen. Es wird vorzugsweise eine Behandlung mit elektromagnetischer Bestrahlung, Teilchenbestrahlung, einer chemischen Substanz oder einer Feldbeeinflussung (z. B. Koronaentladung) realisiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden fluorhaltige Polymeroberfläche mittels elektromagnetischer Bestrahlung strukturiert behandelt, um die adhärenten Bereiche zu erzeugen.
Die Erfindung ermöglicht, dass bei genügend dünner Aussaat eines Zellgemisches (bestehend aus verschiedenen Zelltypen) max. 1 Zelle pro adhärenten Bereich zur Anheftung kommt. Dadurch wird auf den adhärenten Bereichen ein klonales Zellwachstum erreicht, d.h. ein Klon entwickelt sich aus nur einer auf einem Spot zur Anheftung gebrachten Ursprungszelle. Durch die Abgrenzung von anderen Spots durch nichthaftende Bereiche (d.h. unbehandelte Oberflächen) kann es zu keiner Vermischung der Klone kommen. Bei herkömmlichen Kulturoberflächen, die nicht auf die erfindungsgemäße Weise hergestellt wurden, überwuchern die sich schnell teilende Zellen die Kulturschale, was zur Folge hat, dass keine Klone separiert werden können und sich besonders langsam teilende Zellen schnell überwuchert werden.
Viele Zelltypen haben die Eigenschaft, dass sie sich mit Hilfe ihres Zytoskelettes über Oberfläche bewegen können. Durch die vorgegebenen adhärenten Bereiche (Wachstumsflächen) können sich die Zellen nur in genau bekannten Bereichen bewegen. Das bedeutet, dass es zu keiner Kreuzkontamination, d.h. keiner Vermischung der Zeilklone kommen kann. Besonders in der Biotechnologie stellt die garantierte Reinheit von Zellen, die über dieses Verfahren ermöglicht wird, einen großen Vorteil dar.
Da die adhärenten Bereiche eine genau definierte Abmessung besitzen, ermöglicht dies auch die genaue punktförmige Isolierung von einzelnen Klonen. Dies wird dadurch erreicht, dass ein Isolierungsinstrument zur Aufnahme von Zellen die gleiche Abmessung wie der adharente Bereich besitzt. Auf diese Art können, ohne die Gefahr, versehentlich mehrere Klone zu isolieren, Zellen von dem adhärenten Bereich entfernt werden (mechanisch oder enzymatisch) . Das Wachstum auf den anderen adhärenten Bereichen wird dadurch nicht beeinflußt.
Durch das Aufbringen einer Markierung (Eichmarke für Koordinatenerfassung, z.B. optisch) auf der Polymeroberfläche (z. B. Folie) und dem definierten Punktmuster der adhärenten Bereiche (x, y Achsen) kann die Isolierung der Klone automatisiert werden.
Durch zusätzliche Modifikation der adhärenten Bereiche (z.B. Aufbringung von Makromolekülen wie Aminosäuren, Peptide, Proteine, Zucker, Lipide, Nukleinsäuren, Zellen, Zellbestandteile, Viren) kann die Anhaftung und Wachstum von bestimmten Zelltypen gefördert werden.
Durch die Variation der zusätzlichen Beschichtungen der adhärenten Stellen innerhalb einer Folie wird die Bereitstellung eines Analytik-Zell-Chips ermöglicht. Zusammen mit einer Markierung (Eichpunkt für Koordinatensystem) und definierten Punktmustern können Reaktionen der Zellklone, z.B. über eine Veränderung der Fluoreszenz eines entsprechenden Farbstoffs automatisch ausgelesen und zellspezifisch analysiert werden. Es lassen sich auf diese Weise auch Zellwachstum oder andere Reaktionen erfassen.
Eine abgewandelte Anwendung des Analytik-Zell-Chips besteht darin, dass verschiedene Zelltypen (z. B Tumorzellen) auf einer Folie aufgebracht und kultiviert werden. Adharente Bereiche sind dabei auf die Haftungseigenschaften der jeweiligen Zellen abgestimmt. Durch die Zugabe eines Pharmakons kann der Einfluß auf das Wachstum analysiert werden (z. B für eine Suche nach Zytostatika) . Zusammen mit einer Markierung (Eichpunkt für Koordinatensystem) und definiertem Punktmuster können die Klone automatisch ausgelesen werden und zusammen mit der Art der Beschichtung analysiert werden. Es kann z. B. schnell erfasst werden, ob ein Wachstum stattgefunden hat oder nicht.
Erfindungsgemäße Zellträger ermöglichen eine räumliche Teilung zweier oder mehrerer verschiedener Zellpopulationen. Verschie- dene Zelltypen benötigen zum Wachstum die Unterstützung von Fütterzellen (z.B. Keratinozyten und Fibroblasten) . Nachdem die Zielzellen gewachsen sind, müssen diese sogenannten Fütterzellen (feeder cells) abgetrennt werden. Durch die räumliche Trennung durch nichtadhärente Bereiche auf der Folie kann es zu keiner Durchmischung kommen und die Zielzellen können von separaten Spots isloliert werden, ohne dass es zu einer signifikanten Vermischung mit den Fütterzellen kommt.
Die Orientierung von Zellen auf einer Wachstumsoberfläche ist zunächst zufällig. Im Organismus sind jedoch die Zellen nach einem genauen Muster orientiert, um als Gewebe (z. B. Muskel) zu funktionierten. Durch flächige Muster der adhärenten Bereiche (z.B. Linien) wird den Zellen ein orientiertes Wachstum ermöglicht. Zusätzlich können durch unterschiedliche zusätzliche Beschichtung der einzelnen Spots verschiedene Zelltypen an definierten Stellen zur Anhaftung gebracht werden, was ein definiertes Wachstumsmuster (z.B. Ausrichtung von Muskelzellen zu Muskelfasern) und in der Folge zweidimensionales organoty- pisches Zellwachstum auf einer so behandelten Oberfläche auch außerhalb des Körpers ermöglicht.
Die Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Erfindungsgemäße Zellträger besitzen einen erweiterten Anwendungsbereich. Sie erfüllen neben der Substratfunktion zusätzlich eine Modifizierungsfunktion, indem sie die Zellablage und/oder das Zellwachstum je nach der Geometrie und/oder stofflichen Zusammensetzung der adhärenten Bereiche beeinflussen. Es ergeben sich vorteilhafte Anwendungen bei der Sammlung von Zellen auf Zellträgern, insbesondere zu deren Anhaftung, Proliferation, Wachstum oder Kultivierung.
Weitere Vorteile und Einzelheiten werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen: Figuren 1 bis 3 schematische Illustrationen der Herstellung erfindungsgemäßer Zellträger, und
Figur 4 eine schematische Schnittansicht einer Perfusionskammer, die mit dem erfindungsgemäßen Zellträger ausgestattet ist.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht in der lokalen Behandlung von Polymeroberflächen zur Erzeugung bestimmter Muster adhärenter Bereiche (Wechselwirkungsbereiche, Interak- tionsbereiche) und/oder bestimmter stofflicher Modifizierungen. Die Erfindung wird im Folgenden am Beispiel der Modifizierung von fluorhaltigen Polymerfolien, insbesondere PTFE- Folien erläutert, ohne auf diese Polymere und diese flexible Substratform eingeschränkt zu sein. Vielmehr können Substrate aus beliebigen festen Materialien, insbesondere Glas, Halbleitermaterial oder Kunststoff, verwendet werden, auf deren Oberfläche eine Polymerschicht gebildet ist. Transparente PTFE- Folien werden jedoch bevorzugt verwendet, da diese Vorteile bei der optischen Analyse der auf dem Zellträger gesammelten Zellen bieten.
In Figur 1 sind mit den Teilbildern (A) bis (D) schematisch die Schritte eines Verfahrens zur Herstellung eines Zellträgers 40 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung dargestellt. Die illustrierten Größenverhältnisse entsprechen nicht den Größenverhältnissen in der Realität. Der Zellträger umfasst ein Substrat 10 mit einer fluorpolymerhaltigen Oberfläche 11. Beim dargestellten Beispiel wird eine transparente PTFE-Folie verwendet. Die Foliendicke beträgt bspw. 1 mm bis 10 μm.
Gemäß Figur 1 (B) erfolgt eine Oberflächenmodifizierung der PTFE-Folie zur Herstellung von adhärenten Bereichen. Die Modifizierung erfolgt nach dem Verfahren der gepulsten Laserdeposition, die an sich zur Modifizierung von PTFE-Oberflachen be- kannt ist (siehe WO 00/37122). Die PTFE-Folie 10 wird einer Laserbestrahlung ausgesetzt, bei der eine Änderung des Vernetzungsgrades und der Kettenlängen im oberflächennahen Polymermaterial induziert wird. Zur strukturierten Modifizierung wird die Laserbestrahlung 51 durch eine Maske 52 mit lichtdurchlässigen Bereichen 53 auf die PTFE-Folie 10 gerichtet. Die Folienmodifizierung erfolgt an den Orten der Belichtung. Im dargestellten Beispiel werden adharente Bereiche 12 in Form von Inseln 21 (Fig. 1 (C) ) gebildet, deren matrixartige Anordnung in geraden Reihen und Spalten der Maskengestalt entspricht. Die Inseln 21 besitzen bspw. einen Durchmesser von 0.001 bis 3 mm. Sie sind vollständig von nichtadhärenten Bereichen 13, d. h. von unbehandelten Oberflächenteilen umschlossen. Jeder adharente Bereich, z. B. jede Insel 21, wird von einem nichtadhärenten Bereich umgeben. Der Abstand zwischen den Rändern der adhärenten Bereiche beträgt vorzugsweise mindestens 500 μm. Auf die modifizierte PTFE-Folie werden Zellen 30 (vergrößert gezeigt) aufgebracht. Die Erfinder haben erstmalig festgestellt, dass die Zellen 30 auf den adhärenten Bereichen 12 (Inseln 21) gut anhaften und weiterwachsen, während in den dazwischen liegenden, nichtadhärenten Bereichen 13 ein Anhaften oder Wachsen der Zellen behindert oder ausgeschlossen ist. Es wurde festgestellt, dass in den nichtadhärenten Bereichen 13 keine Wechselwirkungs-Bindungen für die Zellen gegeben sind, die Bereiche 13 bieten keinen Halt für Pseudopodien der Zellen oder andere Bestandteile von Zellmembranen. Damit wachsen auf dem fertigen Zellträger 40 gemäß Figur 1 (D) die Zellen 30 mit einem Muster entsprechend der Geometrie der adhärenten Bereiche 12. Diese Musteranordnung besitzt besondere Vorteile bei der nachfolgenden Analyse von Fällen, beispielsweise durch Fluoreszenzmessungen.
Alternativ zur genannten Laserbehandlung einer PTFE-Folie kann beispielsweise eine UV-Bestrahlung vorgesehen sein. Je nach Aufgabe kann die Bestrahlung mit einer chemischen Behandlung kombiniert werden. Hierzu wird der interessierende Oberflächenbereich in einem reaktiven, gasförmigen oder flüssigem Medium bestrahlt, so dass ggf. chemische Gruppen an der Oberfläche durch neue chemische Gruppen und/oder Verbindungsstellen ersetzt werden. Die UV-Bestrahlung erfolgt mit an sich bekannten Bestrahlungsquellen vorzugsweise im Bereich von 150 nm bis 360 nm. Je nach dem verwendeten Material kann auch eine Wellenlänge im sichtbaren Wellenlängenbereich zur Bestrahlung verwendet werden.
Alternativ erfolgt die Oberflächenmodifizierung durch Ionenbestrahlung (Ionenimplantation durch eine Maske) . Die Ionenbestrahlung führt zu einer chemischen und/oder strukturellen Veränderung der Oberfläche. Es werden bspw. C-, N-, 0-, Ne- oder Ar-Ionen verwendet. Die Bestrahlung erfolgt mit an sich verfügbaren Implantationsgeräten bei Raumtemperatur im Vakuum oder in einem reaktiven Plasma. Es werden typischerweise Ionenenergien von einigen 10 bis einigen 100 keV mit Stromdichten im Bereich von rd. 1012 Ionen/cm bis 1016 Ionen/cm-2 verwendet .
Gemäß einer weiteren Alternative ist eine Oberflächenbehandlung mit einem reaktiven oder einem nicht-reaktiven Plasma vorgesehen. Die Plasmabehandlung führt entsprechend zu chemischen und/oder strukturellen Änderungen der Oberfläche.
In Figur 2 sind die gleichen Verfahrensschritte wie in Figur 1 illustriert, wobei hier jedoch nichtadhärente Inseln, sondern adharente Streifen 29 gebildet sind. Der erfindungsgemäße Zellträger zeichnet sich durch eine orientierte Beschichtung und damit ein orientiertes Wachstum der Zellen gemäß Figur 1 (D) aus.
Ein besonderer Vorteil der orientierten Zellkultivierung auf einem Zellträger gemäß Figur 2 besteht darin, dass Zellen mit einem bestimmten Wachstumsmuster kultiviert werden, das der Zellausrichtung in einem biologischen System, insbesondere in einem Gewebe entspricht. Erfindungsgemäße Zellträger ermöglichen eine Simulation des Wachstums von Zellen gleicher oder verschiedener Typen unter geometrischen Bedingungen, die den Bedingungen in einem Organ angepasst sind.
Die Oberflächenmodifizierung des Zellträgers kann gemäß Figur 3 auch eine stoffliche Modifizierung umfassen. Gemäß Figur 3 (B) erfolgt während der gepulsten Laserdeposition ein Adsor- batzusatz 54. Es werden bspw. Aminosäuren, Peptide, Nukleinsäuren, Zucker, Proteine oder dgl. in die adhärenten Bereiche aufgenommen, die hier Adsorbatbereiche 23 bilden. Alternativ erfolgt die Modifizierung der adhärenten Bereiche nach deren Bildung. Die Funktionalisierung der adhärenten Bereiche kann darauf gerichtet sein, dass auf dem Zellträger nur eine bestimmte Art von Zellen wachsen. Beispielsweise umfassen die Zellen 30 gemäß Figur 3 einen ersten Zelltyp 31 (große Zellen) und einen zweiten Zelltyp 32 (kleine Zellen) . Die Modifizierung der PTFE-Folie ist durch Auswahl spezifischer Bindungsstellen so gewählt, dass lediglich der erste Zelltyp 31 auf dem Zellträger 40 anhaftet.
Alternativ zum Einbau der Adsorbate während oder nach der Polymerbehandlung (z. B. Laserdeposition) kann ein zusätzlicher Schritt eines Aufsynthetisierens von weiteren Substanzen, z. B. eines Aufsynthetisierens von Proteinen, vorgesehen sein. Des Weiteren können die in den Figuren illustrierten Modifizierungen gemeinsam durchgeführt werden. Es kann bspw. eine strukturierte Oberflächenmodifizierung gemäß den Figuren 1 o- der 2 gebildet werden, bei der die adhärenten Bereiche 12 spezifisch bindende Adsorbate enthalten.
Erfindungsgemäße Zellträger bilden folienförmige Zellmatrizen, die je nach Anwendung selbst Untersuchungen unterzogen werden oder als Detektoren verwendet werden. Vorteilhafterweise kön- nen die adhärenten Bereiche mit einer hohen Dichte angeordnet werden (z. B. 10 Inseln 21 pro mm2) . Die Aufbringung der Zellen 30 erfolgt vorzugsweise aus einer Suspension mit einer ausreichend geringen Verdünnung, so dass auf jeder Insel 21 eine einzelne Zelle anhaftet. Damit wird eine sog. Klonie- rungsfolie hergestellt, die aus einem erfindungsgemäßen Zellträger 40 mit im Mittel höchstens einer Zelle pro adhärentem Bereich 12 besteht.
Mit besonderem Vorteil wird der erfindungsgemäße Zellträger bei einem Verfahren zur Analyse von Zellen verwendet. Zellen werden aus einer Suspension auf die modifizierte Oberfläche aufgebracht und nach Anhaftung mit an sich bekannten optischen Methoden, insbesondere Fluoreszenzmessungen untersucht.
Die Zellen auf dem Zellträger 40 besitzen definierte Raumkoordinaten. Die Position jeder Zelle kann mit X- und Y- Koordinaten angegeben werden. Dies erleichtert die Messung und die Ablage von Messdaten gemeinsam mit der jeweiligen geometrischen Position. Zur Angabe der geometrischen Position kann ein erfindungsgemäßer Zellträger mindestens eine Referenzmarkierung tragen. Es ist bspw. als Eichmarke eine kreuzförmige Referenzmarkierung 14 (siehe Fig. 2) vorgesehen, die einen Koordinatenursprung definiert. Damit wird vorteilhafterweise die Zuordnung der Koordinaten der adhärenten Bereiche oder der auf diesen angeordneten Zellen für ein optisches Detektionssystem erleichtert.
In Figur 4 ist in vergrößerter schematischer Schnittansicht eine Reaktionskämmer 60 illustriert, die mit einem erfindungsgemäßen Zellträger ausgestattet ist. Die Reaktionskammer 60, die bspw. eine Klonierungskammer oder eine Perfusionskammer bildet, ist selbst Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Sie umfasst einen erfindungsgemäßen Zellträger 40, der auf mindestens einer Wand 61 der Reaktionskammer 60 angeordnet ist. Die gegenüberliegende Wand wird durch einen Deckel 63 gebildet. In den Seitenwänden 64 sind Fluidanschlüsse 65 zum Zufluss oder Abfluss einer Zellsuspension oder einer Behandlungslösung in das Innere der Reaktionskammer 60 vorgesehen. Die Seitenwände 64 sind vorzugsweise mit einer schematisch illustrierten Höhenverstellung 66 ausgestattet, mit der der Deckel 63 in verschiedenen Abständen vom Zellträger 40 angeordnet werden kann (siehe Doppelpfeil) . Das Bezugszeichen 67 verweist auf eine Elektrodeneinrichtung, mit der im Innern der Reaktionskammer 60 elektrische Felder zur Behandlung oder Manipulierung von Zellen erzeugt werden können. Mit der Elektrodeneinrichtung 67 kann eine zusätzliche Beeinflussung der Zellbewegung auf der Grundlage dielektrophoretischer Kraftwirkungen erzielt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der Deckel 63 aus einem transparenten Material. Dies ermöglicht eine Beobachtung des Zellträgers 40 mit einem optischen Detektionssystem 70 von der Oberseite der Reaktionskammer her. Das Detektionssystem 70 enthält bspw. eine CCD-Kamera, mit der Fluoreszenzemissionen von Zellen auf dem Zellträger 40 erfasst werden können.
Die Reaktionskämmer 60 bildet gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung einen sog. Biochip, d. h. ein Verbundbauteil aus einem Kunststoff- oder Halbleitermaterial, in das die Struktur der Reaktionskammer 60 und der Zellträger 40 integriert sind. Ein erfindungsgemäßer Biochip enthält vor Verwendung einen Zellträger 40 mit den oben beschriebenen adhärenten Bereichen. Vom Anwender wird der Zellträger 40 im Biochip mit einer Zellsuspensionslösung in Kontakt gebracht. Nach einem vorgegebenen Protokoll erfolgt ein Anheften von Zellen auf den adhärenten Bereichen. Anschließend erfolgt eine Kultivierung oder eine Manipulierung der Zellen je nach der Aufgabenstellung. Die verstellbare Höhe des Deckels 63 besitzt den Vorteil, dass die Strömungsgeschwindigkeit in der Reaktionskammer 60 einstellbar ist. Durch Absenkung des Deckels 63 (Verringerung der Kammerhöhe) wird die Strömungsgeschwindigkeit erhöht und damit die Kontaktzeit der in einer Zellsuspension befindlichen Zellen mit dem Zellträger 40 verringert. Gleichzeitig wird mit einer verringerten Kammerhöhe die Wahrscheinlichkeit eines kurzzeitigen Kontakts der Zellen mit dem Zellträger erhöht.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Zellträger (40) mit einem Substrat (10), auf dem eine adharente Struktur (20) gebildet ist, die adharente Bereiche (12) umfasst, die ein erhöhtes Haftvermögen für biologische
Materialien, insbesondere biologische Zellen, Zellbestandteile und/oder biologisch wirksame Makromoleküle, besitzen und die durch nicht-adhärente Bereiche (13) voneinander abgegrenzt sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) aus einer transparenten Polymerfolie besteht, die an sich ein vermindertes Haftvermögen für die biologischen Materialien besitzt und deren Oberfläche (11) in den adhärenten Bereichen (12) chemisch und/oder strukturell modifiziert ist, wobei in den nicht-adhärenten Bereichen (13) die Oberfläche (11) der Polymerfolie unmodifiziert freiliegt und die Polymerfolie ein Polymer umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Polyolefinen, insbesondere fluorinierten Polyolefinen, Polyhydroxyethylenmethacrylat, Polyurethan, Polytetra- fluorethylen, Kollagen, Fibrin, Fibronektin und Polysacchari- den ausgewählt ist.
2. Zellträger gemäß Anspruch 1, bei dem die Polymerfolie aus PTFE-Folie besteht.
3. Zellträger gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Folie in einem Rahmen aufgespannt ist.
4. Zellträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die adhärenten Bereiche punkt- oder kreisförmige Inseln (21), Streifen (22) und/oder Schichten (23) mit Adsorbaten umfassen.
5. Zellträger gemäß Anspruch 4, bei dem punktförmige adharente Bereiche vorgesehen sind, die zur adhärenten Anheftung jeweils einer biologischen Zelle ausgelegt sind.
6. Zellträger gemäß Anspruch 4 oder 5, bei dem die Adsorbate biologisch wirksame Makromoleküle, insbesondere Kollagene, Antikörper, Laminin oder Proteine der extrazellulären Matrix umfassen.
7. Reaktionskämmer (60) zur Aufnahme einer Zellsuspension, bei der an mindestens einer Seitenwand ein Zellträger (40) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 angeordnet ist.
8. Reaktionskammer gemäß Anspruch 7, die eine Zellkulturschale umfasst, auf deren Boden der Zellträger (40) angeordnet ist .
9. Reaktionskammer gemäß Anspruch 7 oder 8, die mit einem höhenverstellbaren, transparenten Deckel (63) und/oder einer Elektrodenanordnung (67) ausgestattet ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die adhärenten Bereiche (12) auf dem Substrat (10) mit Hilfe von elektromagnetischer Bestrahlung, insbesondere UV- Bestrahlung, Partikelbestrahlung, chemischer Behandlung, Plasmabehandlung oder gepulster Laserdeposition erzeugt werden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem zur Erzeugung der adhärenten Bereiche eine Maske (52) verwendet wird, die punktförmige, runde oder streifenförmige, durchlässige Bereiche (53) aufweist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, bei dem während oder nach der Erzeugung der adhärenten Bereiche (12) auf diesen Schichten mit Adsorbaten gebunden werden.
13. Verfahren zur Beladung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit biologischen Zellen, bei dem der Zellträger mit der Oberfläche (11), die die adhärenten Bereiche (12) aufweist, mit einer Suspension in Kontakt gebracht wird, die die Zellen enthält.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem der Zellträger dauerhaft mit der Suspension in Kontakt gebracht wird und die Konzentration der Zellen in der Suspension so gering ist, dass auf jedem adhärenten Bereich (12) maximal eine Zelle fixiert wird.
15. Verwendung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Sammlung, zur Anhaftung, zum Wachstum, zur Proliferation und/oder zur Kultivierung von biologischen Zellen, als Klonierungsfolie und/oder als biologischer Detektor.
16. Verwendung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Reaktionskammer gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Isolierung von Zeilklonen.
17. Verwendung von PTFE als Trägermaterial für biologische Zellen.
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