ES2291890T3

ES2291890T3 - Procedimiento para la diferenciacion de celulas madre en celulas que producen una hormona pancreatica.

Info

Publication number: ES2291890T3
Application number: ES04740218T
Authority: ES
Inventors: Charli Kruse; Gunter Fuhr
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2003-06-23
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2024-06-23
Also published as: ATE373080T1; US20070037281A1; EP1636350A1; WO2005001073A1; EP1636350B1; DE502004004962D1

Abstract

Procedimiento para la formación de células productoras de hormona pancreática, que comprende: - un cultivo y una diferenciación de células madre pluripotenciales que se han obtenido a partir de tejido glandular exocrino diferenciado de un organismo y que presentan la capacidad de formar cuerpos organoides.

Description

Procedimiento para la diferenciación de células madre en células que producen una hormona pancreática.

La presente invención se refiere a un procedimiento para diferenciar células madre en células que producen una hormona pancreática, en especial en células que producen insulina, células que producen hormona pancreática, composiciones celulares que contienen células que producen hormona pancreática y especialmente que se forman con el procedimiento mencionado, aplicaciones de células y composiciones celulares de este tipo, en especial aplicaciones farmacéuticas de estas células y composiciones celulares.

La diferenciación de células madre en células que producen insulina u otras hormonas pancreáticas es conocida (véanse las patentes DE 10290025T1, WO 02/059278). Las técnicas de diferenciación habituales poseen inconvenientes importantes, tanto en relación a las células precursoras para la diferenciación celular como también en relación a las complejas condiciones del procedimiento que se deben mantener par la diferenciación celular. Los procedimientos habituales se basan en la práctica en la diferenciación de las células a partir de agregados de células madre embrionarias (los llamados embrioides). La posibilidad de usar embrioides en masa para la diferenciación celular está excluida no obstante por una serie de razones y especialmente consideraciones éticas. En la patente DE 10290025 se propone aun así la diferenciación de células madre adultas. Las células madre adultas obtenidas con los procedimientos habituales sólo aportan sin embargo de forma limitada los resultados de diferenciación deseados.

El objetivo de la invención es proporcionar procedimientos mejorados para la diferenciación de células madre en células que producen al menos una hormona pancreática, con los que se eviten las limitaciones en relación con el uso de células madre embrionarias y que sean adecuados no obstante para una aplicación masiva en condiciones de procedimiento sencillas. El objetivo de la invención consiste en especial en lograr un procedimiento mejorado para producir células que producen hormona pancreática para el trasplante en pacientes que sufren de enfermedades pancreáticas, en especial de diabetes.

Este objetivo se alcanza mediante un procedimiento con las características de la reivindicación 1, una célula con las características de la reivindicación 22 y una composición celular con las características de la reivindicación 24. De las reivindicaciones subordinadas se desprenden formas de realización ventajosas y aplicaciones.

En lo relativo al procedimiento, el objetivo anteriormente mencionado se soluciona mediante un cultivo y diferenciación de células madre no embrionarias que se han obtenido a partir del tejido de una glándula exocrina de un organismo. Una ventaja especial de este procedimiento consiste en la formación de células que producen hormona pancreática (de ahora en adelante: células productoras de hormona) sin la diferenciación de células madre embrionarias usada hasta ahora. Los inventores han determinado que las células madre adultas aisladas a partir de tejido glandular exocrino son pluripotenciales y muestran una alta capacidad de división y un fuerte crecimiento. Con ello se proporciona una fuente eficaz de células capaces de diferenciación, a partir de las cuales se pueden formar de manera masiva células productoras de hormona.

El tejido glandular exocrino que se utiliza según la invención puede provenir de un organismo adulto, organismo juvenil u organismo fetal no humano, preferentemente un organismo postnatal. El término "adulto", tal como se usa en la presente solicitud, se refiere por lo tanto al estado de desarrollo del tejido de partida y no al correspondiente organismo donante del que proviene el tejido. Células madre "adultas" son células madre no embrionarias.

Preferiblemente, el tejido glandular exocrino se aísla a partir de una glándula salival, glándula lacrimal, glándula sebácea, glándula sudorípara, de glándulas del tracto genital, incluyendo la próstata, o de tejido gastrointestinal, incluyendo el páncreas o de tejido secretor del hígado. En una forma de realización muy preferida, se trata a este respecto de tejido acinar. El tejido acinar, de forma muy especialmente preferida, proviene del páncreas, de la glándula salival parótida o de la glándula salival submandibular.

Otra ventaja importante del procedimiento según la invención consiste en que las células madre se pueden obtener de forma eficaz a partir de organismos donantes vivos, por ejemplo, de glándulas salivales de mamíferos o de glándulas salivales de seres humanos, sin que el organismo donante se vea afectado de forma significativa. Esto es especialmente ventajoso tanto desde el punto de vista ético como con vistas a la posibilidad de la siguiente observación del organismo donante respecto a eventuales enfermedades.

Según una primera forma de realización de la invención, las células madre aisladas en primer lugar a partir del organismo se usan como fuente para el posterior cultivo y diferenciación hasta células productoras de hormona. Esta variante posee la ventaja de una realización del procedimiento especialmente fácil. Las células diferenciadas deseadas pueden obtenerse directamente a partir de un cultivo primario. Como alternativa, según una forma de realización de la invención derivada está previsto que se lleve a cabo en primer lugar una agregación de las células madre aisladas a partir del organismo hasta los llamados cuerpos organoides. Esta variante posee la ventaja de que con los cuerpos organoides se consigue una reserva eficaz para mayores cantidades de células diferenciadas. Los inventores han determinado que las células madre aisladas a partir del tejido glandular exocrino forman cuerpos organoides, que con suministro de nutrientes muestran un fuerte crecimiento hacia cuerpos tisulares con diámetros de hasta varios milímetros o
más.

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Según una primera variante del uso de cuerpos organoides como fuente para las células productoras de hormona deseadas, según la invención se prevé que se lleve a cabo la diferenciación de las células madre hasta los cuerpos organoides y a continuación se extraigan las células productoras de hormona diferenciadas de los cuerpos organoides. Según una segunda variante, se aíslan de forma secundaria células madre en estado indiferenciado a partir de los cuerpos organoides, se cultivan y se diferencian hasta las células productoras de hormona deseadas. Esta forma de realización posee la ventaja de una realización del procedimiento especialmente sencilla, ya que los cuerpos organoides en cultivo en adhesión muestran una migración y un crecimiento espontáneos de células madre o células diferenciadas, que están disponibles entonces para el posterior cultivo y diferenciación.

En principio, el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo seleccionando y multiplicando células productoras de hormona que se han formado espontáneamente a partir de las células madre aisladas de forma primaria o secundara o a partir de los cuerpos organoides. Según una forma de realización preferida de la invención, durante la diferenciación de las células productoras de hormona está prevista una estimulación del cultivo celular. La estimulación posee la ventaja de una efectividad velocidad de la formación aumentadas de las células productoras de hormona deseadas. Según una primera variante, tras la diferenciación de las células madre hasta las células productoras de hormona está prevista su multiplicación estimulada en un medio de cultivo. Según una segunda variante, la estimulación está prevista desde una diferenciación estimulada

\hbox{de las células madre hasta las
células productoras de hormona deseadas.}

Según la invención, la estimulación puede comprender uno o más de los siguientes tratamientos de estimulación, que se pueden llevar a cabo simultánea o consecutivamente. Puede estar previsto un tratamiento con sobrenadantes de un cultivo primario del páncreas endocrino o de líneas celulares del páncreas endocrino, un cocultivo con células diferenciadas del páncreas endocrino o con líneas celulares derivadas del mismo, un tratamiento (impronta) con factores de diferenciación moleculares inmovilizados o disueltos proporcionados en la fase líquida o su activación génica en la célula madre. Además se puede lograr una estimulación mediante la adición de células productoras de hormona ya diferenciadas y/u otras sustancias, como por ejemplo hormonas, o tipos celulares que influyen sobre la diferenciación.

Cuando se lleva a cabo la impronta con factores de crecimiento inmovilizados, se utilizan preferiblemente factores de diferenciación que están fijados a un portador móvil, posicionable en relación con las células madre. De forma ventajosa se puede alcanzar con ello una diferenciación dirigida de células madre individuales o determinados grupos de células madre. El portador es por ejemplo un sustrato sintético, que posee unas ventajas para una formación concreta con factores de diferenciación o una célula biológica sobre cuya membrana están dispuestos los factores de diferenciación.

Cuando, según otra forma de realización preferida de la invención, está prevista una identificación y selección de las células diferenciadas a partir del cultivo celular, se pueden obtener ventajas para el uso posterior de las células productoras de hormona pancreática formadas. Se puede proporcionar en especial una composición celular que se componga completamente o en su mayor parte de células productoras de hormona. Cuando se lleva a cabo la selección con procedimientos de clasificación, que son en sí conocidos, como por ejemplo con un procedimiento preparativo de clasificador celular o una clasificación en un microsistema líquido, se pueden obtener ventajas para la compatibilidad con procedimientos de biología celular convencionales.

Una ventaja adicional de la identificación y selección consiste en que las células que no se identifican como células productoras de hormona y de forma correspondiente no se seleccionan a partir del cultivo procesado pueden someterse a otro cultivo y diferenciación. Con ello se puede aumentar el rendimiento del procedimiento según la invención.

Según otras variantes preferidas de la invención, para formar células productoras de hormona se obtienen células madre a partir de tejidos de glándulas secretoras o glándulas del tracto gastrointestinal del organismo. Las células se aíslan especialmente a partir de tejido que consiste en tejido acinar o que contiene tejido acinar. Cuando se extraen del páncreas, se pueden obtener ventajas para el uso de otras partes del tejido del páncreas para la mencionada estimulación. Cuando se extraen de las glándulas salivales, se pueden obtener ventajas para el tratamiento respetuoso con el organismo donante.

Son organismos donantes preferidos animales vertebrados, en especial mamíferos, como por ejemplo el ser humano. Cuando se usan células madre humanas, el aislamiento de las células madre se lleva a cabo a partir de estados no embrionarios, es decir a partir de tejido diferenciado en la fase juvenil o en la fase adulta. En el caso de organismos donantes no humanos, en principio también se puede recurrir a tejido no diferenciado en estado fetal.

Las células productoras de hormona preparadas según la invención se utilizan preferiblemente de forma terapéutica. Según una primera variante, puede estar previsto un tratamiento humano con células productoras de hormona que se han extraído de organismos animales. Además, son posibles tratamientos de un ser humano con células productoras de hormona que se han extraído de otro ser humano. Se prefiere especialmente el tratamiento autólogo de un ser humano con células productoras de hormona que se han extraído de células madre propias, juveniles o adultas. El tratamiento puede referirse a enfermedades pancreáticas, síndromes metabólicos o enfermedades metabólicas, en especial la diabetes, la hiperglucemia o una tolerancia disminuida a la glucosa. Como hormona pancreática se produce de forma especialmente preferida insulina.

Representa un objeto independiente de la invención una célula aislada, que produce una hormona pancreática que se ha diferenciado a partir de una célula madre, que proviene de tejido glandular endocrino diferenciado de un organismo. Una célula aislada de este tipo se obtiene preferiblemente con el procedimiento según la invención.

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Un objeto independiente adicional de la invención es una composición celular que contiene una pluralidad de tales células productoras de hormona pancreática. La composición celular se obtiene preferiblemente mediante el procedimiento según la invención. Según una forma de realización preferida de la invención, la composición celular puede contener otras células o materiales, que por ejemplo forman una matriz. Correspondientemente, un objeto adicional de la invención es un islote de Langerhans artificial.

Según una forma de realización preferida de la invención, la composición celular comprende una envoltura o una matriz tridimensional, en la que están dispuestas las células productoras de hormona y otros tipos celulares. La envoltura o matriz tridimensional consiste por ejemplo en alginato, colágeno, materiales implantables, polímeros (biopolímeros o polímeros sintéticos). Se utiliza un material semipermeable, que deja pasar la hormona (por ejemplo insulina) hacia fuera, pero no a las células. Los otros tipos celulares comprenden por ejemplo células madre y/o células vecinas de los islotes de Langerhans en el tejido pancreático. La formación de la cubierta (cápsula) es preferida, dado que con ésta se inmovilizan en especial las células productoras de hormona de forma especialmente eficaz y dado el caso se impide un crecimiento adicional. El compuesto de cápsula-célula expuesto en la presente descripción posee un diámetro de algunos 100 \mum hasta algunos mm.

Otro objeto independiente de la invención es una composición farmacéutica con al menos una célula productora de hormona o composición celular preparada según la invención y una sustancia portadora farmacéutica. Como sustancia farmacéutica, en especial líquida portadora se puede utilizar cualquier material que sea conocido para esta función en farmacia.

Otras ventajas y detalles de la invención se describirán a continuación en relación a los dibujos adjuntos. Muestran

la fig. 1 un diagrama de flujo de un procedimiento de diferenciación según una forma de realización de la invención,

la fig. 2 un diagrama de flujo para ilustrar diferentes variantes de proporcionar células madre;

la fig. 3 un diagrama de flujo para ilustrar diferentes variantes de la agregación de células madre hasta cuerpos organoides,

la fig. 4 un procedimiento para la preparación de cuerpos organoides,

la fig. 5 una ilustración del cultivo de cuerpos organoides,

las figs. 6 y 7 ilustraciones esquemáticas de la impronta de células madre mediante factores moleculares de señalización, y

la fig. 8 una ilustración de la comprobación de la producción de insulina de células diferenciadas según la invención.

(I) Aislamiento y agregación de células madre a partir de una glándula exocrina diferenciada de un organismo vivo hasta cuerpos organoides

El cultivo y diferenciación según la invención de células madre que se han obtenido a partir de tejido glandular exocrino de un organismo comprende las etapas ilustradas en la figura 1. En primer lugar tiene lugar el aislamiento de células madre a partir del organismo (etapa 100) para formar una fuente para la estimulación y diferenciación hasta las células productoras de hormona. A continuación se mencionan detalles del aislamiento y diferentes variantes de fuentes para las restantes etapas del procedimiento. A continuación, en el marco de la diferenciación sigue la estimulación (etapa 200) de un cultivo celular usado como fuente. Después de la diferenciación tiene lugar en la etapa 300 una identificación de las células productoras de hormona y una selección correspondiente. Las células productoras de hormona seleccionadas se recolectan y dado el caso se preparan adicionalmente para, por ejemplo, una aplicación farmacéutica (etapa 400). Además puede estar prevista una devolución de las células no diferenciadas al cultivo de partida (etapa 500) para volver a someterlas a la estimulación y diferenciación.

En las figuras 2 y 3 se ilustran diferentes variantes de la provisión de células madre indiferenciadas para la posterior estimulación. Según la figura 2, en primer lugar se lleva a cabo el aislamiento de células madre a partir del organismo donante (etapa 110, véanse los ejemplos que siguen). a partir de estas células madre aisladas de forma primaria, según una primera variante (a) se puede pasar directamente a la estimulación (etapa 200). Como alternativa, en la etapa 120 se lleva a cabo en primer lugar una agregación de las células madre hasta cuerpos organoides. En las figuras 3 y 4 se resumen detalles de la etapa de agregación. A partir de los cuerpos organoides en la etapa 130 se pueden separar y/o clasificar células madre o células ya diferenciadas (etapa 140), pudiendo entonces según la variante (b) continuar con la siguiente estimulación, la diferenciación o la multiplicación de las células ya diferenciadas.

Según la figura 3, la agregación de células madre hasta cuerpos organoides comprende según la etapa 120 las siguientes etapas parciales. En primer lugar se lleva a cabo el cultivo de las células madre en gotas colgantes (etapa 121, véase el ejemplo a continuación). Como alternativa, el cultivo se puede llevar a cabo en un cultivo con agitación o en un estado suspendido sin contacto con superficies sólidas en campos electromagnéticos. En gotas colgantes o el cultivo tridimensional en suspensión correspondiente, la agregación tiene lugar la agregación hasta cuerpos organoides primarios (etapa 122). Estos se pueden usar como fuente para la separación de células. Según la variante (a) en la figura 4, aquí tiene lugar el salto hasta la etapa 130 en la figura 2. Como alternativa, los cuerpos organoides primarios se disponen en primer lugar sobre un sustrato en un medio de cultivo para un cultivo en adhesión (etapa 123). Sobre el sustrato tiene lugar una migración celular y una formación de capa (etapa 124, véase la figura 5). Como resultado, tras la etapa 124 están presentes células madre o células diferenciadas individuales, de modo que, según la variante (b) en la figura 3 se puede dar inmediatamente el salto hasta la etapa 140 en la figura 2.

Una particularidad de los cuerpos organoides en cultivo en adhesión consiste en la formación de cuerpos organoides secundarios a partir de la capa celular formada en el cultivo en adhesión (etapa 125). A partir de los cuerpos organoides secundarios o de los cuerpos organoides derivados correspondientes se pueden separar por su parte células según la variante (c) en la figura 3 (salto a la etapa 130 en la figura 2).

La separación de las células diferenciadas a partir de un cultivo en adhesión se lleva a cabo según procedimientos en sí conocidos, por ejemplo usando sustancias marcadoras que son características para las hormonas pancreáticas. Se lleva a cabo por ejemplo una tripsinización de las células diferenciadas en el cultivo en adhesión y su traspaso a una suspensión. En esta se lleva a cabo una identificación por ejemplo utilizando un dispositivo de clasificación celular en sí conocido con un microsistema líquido, con un procedimiento preparativo de clasificación celular o con perlas magnéticas a las que están acoplados anticuerpos, que únicamente se acoplan con las células productoras de hormona en la suspensión. En el caso del procedimiento preparatorio de clasificación celular se buscan de forma dirigida marcadores superficiales y las células productoras de hormona se seleccionan con marcadores superficiales específicos.

La identificación de las células buscadas se puede realizar también en el cultivo celular por ejemplo sobre la base de características morfológicas diferenciales, por las que las células productoras de hormona se diferencian de las células indiferenciadas u otros tipos celulares. Las características morfológicas diferenciales se refieren por ejemplo a la geometría de la célula o a la disposición del núcleo de la célula o componentes granulares en la célula.

La identificación y selección de las células productoras de hormona se puede llevar acabo además mediante una investigación electroforética celular o una investigación de otra propiedad específica nativa, como por ejemplo la movilidad superficial.

Pueden estar previstas además identificaciones y selecciones multietapa o combinadas de las técnicas mencionadas.

Según el esquema representado en la figura 4, para la obtención de las células se pone en cultivo tejido acinar, preferiblemente de una glándula salival o de una glándula secretora abdominal (páncreas) triturado de forma mecánica y enzimática (etapa 110 en la figura 2). Al contrario que los datos de Bachem y col., Gastroenterol.- 115:421-432 (1998) y Grosfils y col. Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 79:99-115 (1993), no se cultivan bloques de tejido, a partir de los cuales deben crecer células, sino que se tritura mucho el tejido con la condición de que las uniones celulares de los acinos permanezcan intactas en la mayor medida posible.

A lo largo de varias semanas, estas células y uniones celulares se cultivan en cultivo. Cada 2 a 3 días se cambia el medio, retirándose todas las células diferenciadas. En el caso de las células que persisten en el cultivo se trata de células indiferenciadas con capacidad de división ilimitada.

Se han aislado a partir del páncreas con las mismas condiciones y se han descrito células parecidas y se han denominado como un tipo de miofibroblastos o células estrelladas pancreáticas (Bachern y col., 1998). Al contrario que las células de la presente invención, no se pudo observar una capacidad de división ilimitada. Además estas células no se podían someter a pasos de forma ilimitada sin perder vitalidad.

En una segunda etapa (12), se cultivan aproximadamente 400 a 800 células en 20 \mul de medio respectivamente en gotas colgantes. Para ello se colocan las gotas sobre tapas de placas de petri bacteriológicas, se dan la vuelta y se disponen sobre la placa de petri llena de medio, de forma que las gotas cuelgan hacia abajo.

Mediante este tipo de cultivo, en el transcurso de 48 horas se forman los agregados celulares denominados cuerpos organoides (14) que se pueden transformar durante aproximadamente 6 días en un cultivo en suspensión (16). La vista parcial (18) de la figura 2 muestra una imagen microscópica de un cuerpo organoide 2 de este tipo.

La formación de los cuerpos organoides secundarios anteriormente mencionados se ilustra en la figura 5. Los cuerpos organoides primarios 2 se forman sobre el sustrato del cultivo en adhesión, como por ejemplo sobre el fondo de la placa de cultivo 20, mediante una migración o un crecimiento de células 3 en primer lugar una monocapa a partir de la cual crecen después los cuerpos organoides secundarios 4. Con el cultivo de los cuerpos organoides primarios 2 hasta cuerpos organoides secundarios 4 se consigue una diversificación adicional del material celular. A partir de cada uno de los cuerpos organoides primarios o secundarios, 2, 4 se pueden obtener las células productoras de hormona.

Otros ejemplos de realización para el aislamiento y agregación de células madre

A continuación se explicarán con mayor detalle el aislamiento y la agregación de células madre en los siguientes ejemplos no limitativos.

Deben respetarse las instrucciones de trabajo, como son habituales para procedimientos para el cultivo de células biológicas y en especial de células de mamífero. Se debe mantener en cualquier caso un entorno estéril, en el que se debe llevar a cabo el procedimiento, a pesar de que no se lleve a cabo ninguna descripción a este respecto en el presente documento. Se utilizan los siguientes tampones y medios.

1

En lugar de suero de ternera fetal (STF) en el medio nutritivo y el medio de diferenciación se puede usar dado el caso también plasma propio o, de forma menos preferida, suero propio del donante de tejido. Esto es especialmente relevante cuando el donante de tejido es idéntico al posterior receptor de las células madre o de las células diferenciadas derivadas de las mismas. Un tratamiento autólogo de este tipo se prefiere para evitar una posible reacción de rechazo.

El medio nutritivo puede contener como medio de base, en lugar del medio DMEM usado, también un medio de base conocido adecuado para el cultivo de células eucariotas, en especial de células de mamífero, en el que las células diferenciadas se mueran y las células madre deseadas se multipliquen. También el medio de aislamiento, el medio de incubación y el medio de diferenciación pueden contener otro medio de base convencional adecuado.

Otros medios de diferenciación que se pueden utilizar para la estimulación prevista según la invención consisten en los sobrenadantes de cultivos primarios o líneas celulares derivadas del páncreas endocrino o en suspensiones celulares con células diferenciadas o células derivadas del páncreas endocrino. Se pueden usar en especial células o grupos de células que están dispuestas en el tejido endocrino del páncreas en el entorno de los islotes de Langerhans.

Los siguientes ejemplos 1 y 2 describen de forma detallada dos protocolos de trabajo para el aislamiento y cultivo de células madre adultas pluripotenciales de tejido acinar del páncreas. Los ejemplos 1 y 2 se refieren al aislamiento de células madre de ratas. El aislamiento a partir de otros mamíferos, por ejemplo de cerdos se lleva a cabo de forma análoga. El ejemplo 3 describe un protocolo correspondiente para el aislamiento a partir de tejido acinar de la glándula salival.

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Ejemplo 1

1. Preparación del tejido y aislamiento de las células

En el conducto pancreático de ratas de 2-3 años de edad se inyectan a las ratas por medio de una jeringa y una cánula roma 10 ml de medio de digestión de forma lenta y sin burbujas. Todo el páncreas se hincha a causa de ello y de este modo se puede extraer mejor. El páncreas se traslada entonces a un vaso de precipitado y se añaden otros 5 ml de medio de digestión. Después de retirar el tejido adiposo y los ganglios linfáticos, el tejido se tritura muy finamente en el vaso de precipitado con una tijera fina, se aspira el tejido adiposo que flota en la parte superior y se gasea la suspensión finalmente durante 1 minuto con Carbogeno (se repite si es necesario) y se incuba durante 20 minutos a 37ºC cubierta con papel de aluminio en un agitador a 200 ciclos/minuto. Después se aspira el medio cuidadosamente, se tritura de nuevo el tejido con una tijera y se lavan los trozos de tejido dos veces con 10 ml de medio de aislamiento cada vez y se añaden otros 5 ml de medio de digestión al tejido.

Después de volver a gasear con Carbogeno durante aproximadamente 1 minuto e incubar durante 15 minutos a 37ºC en un agitador a 200 ciclos/minuto, los trozos de tejido se trituran mediante pasadas sucesivas en pipetas de vidrio de 10 ml, 5 ml, 2 ml y 1 ml, respectivamente y se presiona a través de tejido filtrante de una capa. Las células separadas de esta manera se lavan cinco veces en un medio de incubación (a 37ºC), se gasean con Carbogeno y se centrifugan cada vez durante 5 minutos a 90 g. El sedimento obtenido en último lugar se resuspende en medio de incubación, se gasea y se reparte en placas de cultivo tisular.

2. Cultivo de las células

Las placas de cultivo tisular con las células aisladas se cultivan en la estufa incubadora a 37ºC y 5% de CO_{2}. Cada 2-3 días se cambia el medio. En ese momento se retiran todas las células diferenciadas.

Al séptimo día en cultivo, se realizan pasos con las células con una solución de 2 ml de PBS, 1 ml de tripsina y 2 ml de medio de incubación. En ese momento se separan las células del fondo de la placa de cultivo. La suspensión celular se centrifuga durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y se resuspenden las células en 2 ml de medio de incubación, se traslada a una botella de cultivo celular mediana y se añaden 10 ml de medio de incubación. El cambio de medio se lleva a cabo cada tres días.

Al decimocuarto día en cultivo, se realizan de nuevo pasos con las células, pero esta vez con 3 ml de tripsina y 6 ml de medio de incubación. La suspensión celular se centrifuga durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y se resuspenden las células en 6 ml de medio de incubación, se trasladan a 3 botellas de cultivo medianas y se añaden respectivamente 10 ml de medio de incubación.

Las células se siguen cultivando y se someten a pasos y se aspiran las veces necesarias hasta que las células alcanzan un estado semiconfluente a confluente.

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Ejemplo 2

Se obtuvieron acinos pancreáticos provinentes de ratas Sprague-Dawley macho (20-300 g) que habían sido narcotizadas y desangradas por la aorta dorsal. Se introdujo una cánula por vía transoduodenal en el páncreas y se inyectó al páncreas por detrás 10 ml de medio de digestión que contenía medio de Eagle-HEPES (pH 7,4), tampón de HEPES 0,1 mM (pH,7,6) 70% (vol/vol), medio de Eagle modificado al, Trasylol al 0,5% (vol/vol) (Bayer AG, Leverkusen, Alemania), albúmina de suero bovino al 1% (p/vol)), CaCl_{2} 2,4 mM y

\hbox{colagenasa (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, 
Alemania).}

Antes de su extracción, el páncreas se liberó parcialmente del tejido adiposo adherido, ganglios linfáticos y vasos sanguíneos. Entonces se introdujo tejido pancreático sano en medio de digestión (a 20ºC, escaso metabolismo), el tejido pancreático se trituró finamente con una tijera, se aspiró el tejido adiposo que flotaba en la parte superior y se gaseó la suspensión de tejido con Carbogeno (Messer, Krefeld, Alemania), sin que la boquilla con el medio se pusiese en contacto con las células (disminución del estrés mecánico) y con ello se ajustó a pH 7,4. A continuación se incubó la suspensión en un matraz Erlenmeyer de 25 ml (cubierto con papel de aluminio) con agitación constante (150-200 ciclos por minuto) a 37ºC en 10 ml de medio de digestión. Después de 15-20 minutos, se aspiró la grasa que flotaba en la parte superior y el tejido se trituró de nuevo y se aclaró con medio sin colagenasa (el proceso se repitió al menos dos veces, preferiblemente hasta que la fracción celular fue transparente), se añadió medio de digestión y se volvió a gasear aproximadamente durante 1 minuto con Carbogeno. A continuación le siguió por otra parte una digestión con colagenasa durante 15 minutos a 37ºC en el agitador usando el mismo tampón. Después de la digestión se disociaron los acinos aspirando y expulsando sucesivamente a través de pipetas de vidrio de 10 ml, 5 ml y 2 ml con estrechas aberturas y se filtraron a través de un tamiz de nailon de una capa (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zürich, Suiza) con un tamaño de malla de aproximadamente 250 \mum. Los acinos se centrifugaron (a 37ºC y 600-800 rpm en una centrifugadora Beckman GPR, que corresponde a aproximadamente 90 g) y se purificaron adicionalmente mediante lavado en medio de incubación, que contenía HEPES 24,5 mM (pH 7,5), NaCl 96 mM, KCl 6 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaH_{2}PO_{4} 2,5 mM, CaCl_{2} 0, mM, glucosa 11,5 mM, piruvato de sodio 5 mM, glutamato de sodio 5 mM, fumarato de sodio 5 mM, medio de Eagle modificado al 1% (vol/vol), albúmina de suero bovino 1% (p/vol), se equilibró con Carbogeno y se ajustó a pH 7,4. El procedimiento de lavado (centrifugación, aspiración, resuspensión) se repitió cinco veces. Mientras que no se indique lo contrario, en el caso del aislamiento anterior se trabaja a aproximadamente 20ºC.

Los acinos se resupendieron en medio de incubación y se cultivaron en una atmósfera humedecida con 5% de CO_{2}. A este respecto, el tejido acinar moría rápidamente (al cabo de dos días) y las células diferenciadas moribundas se separaban a este respecto de las células próximas, sin perjudicar a estas (aislamiento cuidadoso), las células madre no moribundas se hundían hasta el fondo y se adherían. Las células acinares diferenciadas no son capaces de ello. El medio de incubación se cambiaba por primera vez al segundo o tercer día después de sembrar, retirándose una gran parte de los acinos flotantes y células acinares. En este momento, las primeras células madre o sus precursores ya se habían adherido al fondo y comenzaban a dividirse. El cambio de medio se repitió después cada tercer día y se retiraron en cada cambio de medio células acinares pancreáticas.

Al séptimo día en cultivo, las células se sometieron a pasos con una solución compuesta de 2 ml de PBS, 1 ml de tripsina (+ EDTA al 0,05%) y 2 ml de medio de incubación. A este respecto, las células se soltaban del fondo de la placa de cultivo. La suspensión celular se centrifugó durante 5 minutos a aproximadamente 1000 rpm (centrifugadora Beckman GPR), se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 2 ml de medio de incubación. se trasladaron a una botella de cultivo celular mediana y se añadieron 10 ml de medio de incubación.

Al decimocuarto día en cultivo, se realizan de nuevo pasos con las células, pero esta vez con 6 ml de PBS, 3 ml de tripsina/EDTA y 6 ml de medio de incubación. La suspensión celular se centrifuga durante 5 minutos a 1000 rpm, se aspira el sobrenadante y se resuspenden las células en 6 ml de medio de incubación, se trasladan a 3 botellas de cultivo medianas y se añaden respectivamente 10 ml de medio de incubación

Al 17 día, se llevó a cabo un tercer pasaje a un total de 6 botellas de cultivo medianas y al día 24 un cuarto pasaje a un total de 12 botellas de cultivo celular medianas. Como muy tarde ahora se habían retirado todas las células primarias menos las células madre del cultivo.

Las células madre se pueden cultivar adicionalmente y someterse a pasos tan frecuentemente y seleccionarse como se desee. La siembre se lleva a cabo preferiblemente con una densidad respectivamente de 2-4 x 10^{5} células/cm^{2} en medio de incubación.

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Ejemplo 3

El aislamiento y cultivo a partir de tejido exocrino de la glándula salivar parótida de un ser humano se llevó a cabo de forma análoga al protocolo del páncreas con las siguientes modificaciones:

1.: El tejido exocrino de la glándula salival parótida era una mezcla de tejido acinar y tejido tubular.

2.: Dado que las glándulas salivales contienen menos proteasas y amilasas que el páncreas, es posible conservar el tejido de la glándula salival antes del procesamiento algún tiempo en el refrigerador a aproximadamente 4ºC sin que el tejido resulte demasiado perjudicado. En el caso del ejemplo concreto, el tiempo de conservación ascendió a 15 h y no trajo consigo ninguna consecuencia perjudicial para el aislamiento de las células madre deseadas

El siguiente ejemplo 4 describe en detalle un protocolo de trabajo para la preparación de cuerpos organoides.

Ejemplo 4

Las células indiferenciadas se tripsinizan y se centrifugan durante 5 minutos con una solución de 10 ml de PBS, 4 ml de tripsina y 8 ml de medio de diferenciación. El sedimento resultante se resuspende en medio de diferenciación tantas veces como sea necesario para ajustar una dilución de 3000 células por cada 100 \mul. A continuación se suspenden las células otra vez bien con una pipeta de 3 ml.

Se quita la tapa de placas de petri bacteriológicas que han sido previamente recubiertas con 15 ml de PBS (37ºC) respectivamente por placa y se da la vuelta. Con ayuda de una pipeta automática se disponen sobre cada tapa aproximadamente cincuenta gotas de 20 \mul. Entonces se da la vuelta a la tapa rápidamente y se coloca sobre placas de petri llenas de medio de diferenciación, de modo que las gotas cuelgan hacia abajo. Las placas de petri se colocan a continuación con cuidado en la estufa incubadora y se incuban durante 48 h.

A continuación, las células agregadas en las gotas colgantes que forman cuerpos organoides de cuatro tapas respectivamente se traspasan cada una a una placa de petri bacteriológica con 5 ml de medio de incubación con STF al 20% y se cultivan durante otras 96 horas.

Los cuerpos organoides se recogen ahora cuidadosamente con una pipeta y se traspasan a recipientes de cultivo recubiertos con gelatina al 0,1% con medio de diferenciación. En una configuración especialmente preferida del procedimiento, se usa como recipiente de cultivo placas de petri de 6 cm recubiertas con gelatina al 0,1%, en las que se habían dispuesto previamente 4 ml de medio de diferenciación y estas se dotaron de 6 cuerpos organoides cada una. Otro recipiente de cultivo preferido eran portas son las "Chamber slides" recubiertas con gelatina al 0,1% en las que se habían dispuesto previamente 3 ml de medio de diferenciación y que se dotaron a continuación cada una con 3-8 cuerpos organoides. Además se pueden usar placas de microtitulación de 24 pocillos que estaban recubiertas con gelatina al 0,1% y en las que se había dispuesto previamente 1,5 ml de medio de diferenciación (I) por pocillo y que se dotaron a continuación con 4 cuerpos organoides cada uno.

Cultivadas de esta forma, se activa la capacidad de diferenciación de las células en los cuerpos organoides y las células se pueden diferenciar especialmente en células productoras de hormona. Las células se pueden almacenar y cultivar tanto como cuerpos organoides como también como células individuales y mantienen su pluri-
potencia.

(II) Diferenciación en los cuerpos organoides y/o cuerpos tisulares

Después del aislamiento y dado el caso, agregación, en los respectivos celulares o cuerpos organoides están presentes las células madre o dado el caso células productoras de hormona espontáneamente diferenciadas. En otros procedimientos se lleva a cabo la diferenciación estimulada de las células madre o el crecimiento estimulado de las células ya diferenciadas según la etapa 200 (figura 1). Para ello se llevan a cabo uno o varios de los tratamientos de estimulación anteriormente mencionados. La estimulación de la diferenciación se puede llevar a cabo con el medio de diferenciación (I) anteriormente mencionado de modo que tenga lugar en general una diferenciación de las células madre o cuerpos organoides. Los inventores han comprobado que la diferenciación, además de otros tipos celulares, da como resultado especialmente las células productoras de hormona, que se seleccionan entonces en el procesamiento posterior (etapa 300 en la figura 1). Como alternativa está prevista la diferenciación con los otros medios de diferenciación anteriormente mencionados, con los que se lleva a cabo una diferenciación preferencial hasta las células productoras de hormona y con cuyo uso se simplifican las siguientes etapas de la identificación y selección. El siguiente ejemplo 5 se refiere a la estimulación con el medio de diferenciación (I), mientras que el resto de los ejemplos se refieren a los otros medios de diferenciación y técnicas de estimulación.

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Ejemplo 5

Para la inducción de la diferenciación se usaron preferiblemente células madre después del 42º día de cultivo. El uso de células madre después del 3º ó 4º paso o de células que habían sido conservadas a la temperatura del nitrógeno líquido 12-18 meses también fue posible sin ningún problema.

En primer lugar, las células se trasladaron a medio de diferenciación (I) con la composición anteriormente mencionada y se ajustaron a una densidad de aproximadamente 3 x 10^{4} células/ml, por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina de un cultivo de células madre en medio nutritivo, centrifugación durante 5 minutos a 1000 rpm y resuspensión del sedimento en medio de diferenciación (I) y dilución en caso de que fuese necesario.

A continuación se dispusieron gotas de aproximadamente 20-50 \mul (600 células/20 \mul) con una pipeta de 20 \mul sobre la parte interior de la tapa de una placa de petri bacteriológica (puntas taponadas) y las tapas se colocaron cuidadosamente sobre las placas de petri llenas de PBS, de manera que las gotas cuelgan hacia abajo. Para cada tapa se usó una punta nueva. Las placas de petri se dispusieron a continuación con cuidado en la estufa incubadora y se incubaron durante 48 horas a 37ºC.

Después se trasladaron las células agregadas en las gotas colgantes, los cuerpos organoides, de cuatro tapas respectivamente en una placa de petri bacteriológica cada una con 5 ml de medio de incubación con STF al 20% (mantener la tapa inclinada y aclarar los cuerpos organoides con aproximadamente 2,5 ml de medio nutritivo) y se cultivaron durante otros 5-9 días, preferiblemente 96 horas.

Los cuerpos organoides se recogieron cuidadosamente con una pipeta y se trasladaron a recipientes de cultivo celular recubiertos con gelatina al 0,1% con medio de diferenciación (I). Los cuerpos organoides se multiplicaron y crecieron en colonias en parte de células individuales que se volvieron a multiplicar individualmente y se pudieron multiplicar. En una configuración especialmente preferida del procedimiento, se usaron como recipiente de cultivo placas de petri de 6 cm recubiertas con gelatina al 0,1%, en la que se habían dispuesto previamente 4 ml de medio de diferenciación (I) y estas se dotaron de 6 cuerpos organoides cada una. Otro recipiente de cultivo preferido son las "Chamber slides" recubiertas con gelatina al 0,1% en las que se habían dispuesto previamente 3 ml de medio de diferenciación y que se dotaron a continuación cada una con 3-8 cuerpos organoides y placas Thermanox (Nalge Nonc International, EE.UU.) para estudios de microscopía electrónica. Otra alternativa eran placas de microtitulación de 24 pocillos que estaban recubiertas con gelatina al 0,1% y en las que se había dispuesto previamente 1,5 ml de medio de diferenciación (I) por pocillo y que se dotaron a continuación con 4 cuerpos organoides cada
uno.

En una configuración preferida del procedimiento se cultivaron cuerpos organoides durante aproximadamente 7 semanas en las placas de petri de 6 cm recubiertas con gelatina al 0,1% y a continuación se cortaron cuerpos organoides individuales con el microdisector (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) según las instrucciones del fabricante y a continuación se trasladaron por ejemplo a nuevas placas de petri de 6 cm, "Chamber Slides" o placas
Thermanox.

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Ejemplo 6

La estimulación con los otros medio de diferenciación anteriormente mencionados se lleva a cabo de forma análoga.

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Ejemplo 7

La figura 6 ilustra la estimulación (etapa 200) de una célula madre 1 sobre un sustrato 21 mediante factores de señalización o diferenciación 5 que están contenidos en el medio de cultivo. Sobre la superficie de la célula madre 1 se encuentran receptores celulares 1a. Al acoplarse los factores de señalización o diferenciación a los receptores celulares 1a se produce una impronta de la célula madre 1 y el comienzo de la diferenciación hasta la célula productora de hormona deseada.

Los factores de señalización o diferenciación 5 moleculares comprenden macromoléculas, componentes celulares de células pancreáticas o en especial células, componentes celulares de células pancreáticas en sí conocidos o en especial se utilizan células, componentes celulares o grupos de células que se disponen en el tejido endocrino del páncreas en el entorno de los islotes de Langerhans.

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Ejemplo 8

La figura 7 ilustra de forma correspondiente la impronta de una célula madre 1 con una célula ya diferenciada 6, sobre cuya superficie de membrana se fijan o se dan de forma natural factores de señalización o de diferenciación.

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Ejemplo 9

Según otra variante, puede estar prevista una activación génica de las células madre, como se describe por ejemplo en la patente DE 10290025.

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Ejemplo 10

La figura 8 ilustra la producción de insulina de las células diferenciadas con una imagen microscópica de células productoras de insulina, que se obtuvieron a partir del páncreas exocrino del ser humano. Se han descubierto resultados correspondientes con glándulas salivales del ser humano o de otros mamíferos. Los puntos marcados con las flechas representan la insulina producida por las células. La raya blanca corresponde a una longitud de 20 \mum en el
original.

Las características dadas a conocer en la anterior descripción, en las reivindicaciones y en los dibujos de la invención pueden ser relevantes para la puesta en práctica de la invención en sus diferentes configuraciones tanto de forma individual como en combinación.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por los solicitantes es sólo para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. A pesar de haberse puesto un gran cuidad al recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP se exime de cualquier responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción

\bullet DE 10290025 T1

\bullet WO 02059278

Bibliografía no perteneciente a patentes citada en la descripción

\bulletBACHEM y col. Gastroenterol., 1998 , vol. 15, 421-432.

\bulletGROSFILS y col. Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 1993 , vol. 79, 99-115.

Claims

1. Procedimiento para la formación de células productoras de hormona pancreática, que comprende:

-: un cultivo y una diferenciación de células madre pluripotenciales que se han obtenido a partir de tejido glandular exocrino diferenciado de un organismo y que presentan la capacidad de formar cuerpos organoides.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se cultivan y se diferencian células madre aisladas a partir del organismo de forma primaria.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que está prevista una agregación de las células madre en cuerpos organoides.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que se lleva a cabo la diferenciación de las células madre en los cuerpos organoides.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que se cultivan y diferencian células madre aisladas a partir de los cuerpos organoides de forma secundaria.

6. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que está prevista una estimulación de la formación de las células productoras de hormona pancreática, que comprende una multiplicación estimulada de las células productoras de hormona pancreática y/o una diferenciación de las células madre.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la estimulación comprende al menos uno de los siguientes tratamientos de estimulación:

-: Tratamiento con sobrenadantes de un cultivo primario del páncreas endocrino,

-: Tratamiento con sobrenadantes de líneas celulares del páncreas endocrino,

-: Co-cultivo con células diferenciadas del páncreas endocrino,

-: Co-cultivo con líneas celulares del páncreas endocrino, o

-: Tratamiento con factores de crecimiento moleculares inmovilizados,

-: Activación de al menos un gen, que está implicado en la diferenciación de las células madre hasta las células productoras de hormona pancreática, y

-: Tratamiento con factores de crecimiento moleculares disueltos en un líquido.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el tratamiento con factores de crecimiento moleculares inmovilizados comprende una impronta de las células con factores de diferenciación moleculares inmovilizados sobre un soporte.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que se utiliza como soporte un sustrato sintético, una membrana celular o un sustrato matricial tridimensional.

10. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que está prevista una identificación y selección de las células productoras de hormona pancreática.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la selección de las células productoras de hormona pancreática comprende un procedimiento de clasificación celular.

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que se somete a células no identificadas y seleccionadas a un cultivo y diferenciación adicionales.

13. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que se usan células madre que se han obtenido a partir de glándulas secretoras o glándulas del tracto gastrointestinales del organismo.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que se utilizan células que se han obtenido a partir del páncreas o de las glándulas salivales del organismo.

15. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que se utilizan células madre de un tejido glandular que es un tejido acinar.

16. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que se utilizan células madre de un vertebrado, preferiblemente de un mamífero.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que se utilizan células de un primate, en especial de un ser humano.

18. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones precedentes, en el que las células productoras de hormona pancreática producen insulina.