JP6630875B2 - 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞膜の生体機能をその細胞膜の両面から観察や解析が可能な、細胞膜観察及び解析装置と、細胞膜観察及び解析方法に関する。
抗がん剤は通常の薬剤に比べて副作用が強く、個々の患者毎に有効な薬剤が異なり、患者によっては十分な治療効果が得られない場合がある。また、高価な抗がん剤を投与して治療効果が得られないことは、医療費の高騰にもつながる。これらの問題を解決するため、抗がん剤を投与する前に、その抗がん剤が個々の患者に有効な薬剤かどうか検査する抗がん剤感受性試験が考案されている。
これまでに知られているがん細胞の薬剤感受性試験の方法として、手術切片やバイオプシーにより得られたがん細胞を細胞培養液還流法や酵素処理法により細胞浮遊液とし、それと抗がん剤を含む培養液と共にカルチャープレートに蒔き、数日〜十数日間培養を行い、光顕化あるいはギムザ等の染色をし、使用した抗がん剤に対し、がん細胞が感受性を有するか否かを調べる方法が取られていた。（例えば、特許文献１参照）
しかしながら、薬剤の感受性などの解析に必要な生体機能は細胞膜で起こっていた。従って、薬剤感受性試験を信頼良く行うためには、細胞膜で起こる薬物輸送（薬剤の搬入又は排出のポンプ機能）、感染、情報伝達などの生体機能を高感度に観察及び解析することが必要であった。しかし、従来の薬剤感受性試験は細胞で試験を行っていたため、細胞膜の生体機能を高感度に追跡することは困難であった。また、薬剤感受性試験には多量の細胞サンプルが必要であり、試験の実施に時間を要していた。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞膜で発生する生体機能を高感度に追跡可能な細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法の提供を課題とする。
前記課題は、以下の本発明により達成される。即ち本発明の細胞膜観察及び解析装置は、顕微鏡、及び複数の穴を有する基板で少なくとも構成され、基板の各穴の上にそれぞれ細胞膜が配置されて基板上に細胞膜が配置され、穴を介して細胞膜が吸引されながら細胞膜が緩衝液に浸漬され、更に緩衝液が封止され、細胞膜を観察及び解析することを特徴とする。
更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の一実施形態は、基板を配置して備える基板配置用部材が更に備えられると共に、直交する二軸方向の突き当て部分が、基板配置用部材の最外面の少なくとも一部と、基板を配置する配置部分に、それぞれ二軸に対して平行に設けられていることが好ましい。
更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の他の実施形態は、基板配置用部材で基板が備えられる側の他方側に、光を透過する光透過窓が備えられると共に、光透過窓を透過した光で細胞膜が照射され、更に、光透過窓が基板配置用部材から取り外し可能であることが好ましい。
更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の他の実施形態は、細胞膜の互いの面での生体機能が、面ごとに別々に解析されることが好ましい。
更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の他の実施形態は、光透過窓が、可視光の光透過率90％以上であるガラス製であることが好ましい。
また本発明の細胞膜観察及び解析方法は、複数の穴を有する基板を用意し、次に細胞膜を緩衝液に分散して懸濁液を作製し、その懸濁液を基板面上に滴下し、次に各穴を介して細胞膜をポンプで吸引し、各穴の上に細胞膜を配置し、次に細胞膜の吸引を継続しながら細胞膜を第２の緩衝液に浸漬して、第２の緩衝液を封止し、細胞膜を顕微鏡により観察及び解析することを特徴とする。
更に本発明の細胞膜観察及び解析方法の一実施形態は、基板を配置して備える基板配置用部材を更に用意し、直交する二軸方向の突き当て部分を基板配置用部材の最外面の少なくとも一部と、基板を配置する配置部分に、それぞれ二軸に対して平行に設け、基板の最外面の直交する二辺を、基板の配置部分の突き当て部分に当接して、基板を基板配置用部材の、基板の配置部分に配置し、次に、基板配置用部材の最外面の直交する二軸方向の突き当て部分を、顕微鏡の基板配置用部材の配置箇所の直交する二軸方向の突き当てに当接して、基板配置用部材を顕微鏡の配置箇所に配置することが好ましい。
更に本発明の細胞膜観察及び解析方法の他の実施形態は、細胞膜の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することが好ましい。
本発明の細胞膜観察及び解析装置に依れば、細胞膜を両面から観察及び解析することが出来る。従って、細胞膜で起こる生体機能を高感度に追跡することが可能となり、薬剤感受性試験に多量の細胞サンプルが不要となり、試験の実施を速やかに行うことが可能となる。更に、サンプルの差し替えの手間が省略され、速やかに細胞膜両面を観察及び解析することが可能となる。
以下、図１〜図１１を参照して、本発明に係る実施形態の細胞膜観察及び解析装置と、細胞膜観察及び解析方法を詳細に説明する。本実施形態の細胞膜観察及び解析装置は、細胞膜が配置された基板を備えると共に、基板上に配置された細胞膜を観察及び解析するものである。
基板１として、外形寸法が奥行きＬを10ｍｍ、幅Ｗを10ｍｍ、厚みＴを0.2ｍｍで、図１（a）に示すように穴２が複数形成されている基板１を用意する。基板１は、光を透過する透明体な材料から成るか、それ以外の基板が挙げられる。透明体な材料とは、例えば石英ガラス又はサファイア等であり、石英ガラスは可視光の波長λが588ｎｍにおいて光透過率90％以上、屈折率1.5の物性を有するものとする。一方のサファイアは可視光の波長λが588ｎｍにおいて光透過率80％以上、屈折率1.8の物性を有するものとする。一方、透明体以外の基板とは、可視光域において光非透過性のプラスチックやシリコン等から成る基板か、又は基板１表面に遮蔽膜やシールを貼り付けて光非透過性とした基板を含むものとする。但し、遮蔽膜やシールを貼り付けた上で、穴２は形成されているものとする。
図１（b）より穴２の平面形状は円形状であり、且つ穴２の断面形状は図示しないがストレート穴又はテーパ穴とする。穴２がテーパ状の断面形状に形成される場合、細胞膜の配置側を小径とする。穴２の数は細胞膜の生体機能の観察及び解析に最低限必要とされるサンプル数500個以上が必要であり、25個×25列で計625個形成する。各穴２が形成される範囲は１ｍｍ角内としている。各穴２の径φは2.0μｍ、各穴２の中心部どうしの間の間隔Ｄは40μｍ、更に各穴２のアスペクト比は100（基板の厚みＴ0.2ｍｍを穴径φ2.0μｍで除した値）とする。なお、図１（a）又は図６では図の見易さの点から穴２の数を省略して図示すると共に、基板１の外形寸法に対する各穴２の径φの比率を拡大して図示している。
細胞膜としては、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、昆虫細胞等の動物細胞等の各細胞におけるがん細胞由来の細胞膜を観察及び解析の対象とする。更に、インキュベートされた細胞膜を対象のサンプルとしても良い。これら細胞の細胞膜を含むサンプルとしては、少なくとも500〜10万個の細胞膜を含むサンプルが好ましい。
細胞膜は緩衝液に分散され、その懸濁液が基板１の面上に滴下されることで、基板１の面上に細胞膜３が図２（a）に示すように丸まって吸着する。また、図７に示すような受け皿の中にも予め、所定量の第２の緩衝液を入れておく。その緩衝液としては、一例としてPBS（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を用いれば良いが、これに限定されない。また細胞膜を緩衝液で洗浄しても良い。
更に丸まって基板１の面上に吸着された細胞膜３に超音波などの物理的刺激により、細胞膜３の丸まっていた部分が除去され、予め基板１の面上に吸着していた一部のみ図２（b）に示すように残存される。なお、基板１の表面に遮蔽膜やシールが予め貼り付けている場合は、細胞膜３を吸着させる基板１の表面は、遮蔽膜やシールを貼り付けた側の面の反対側の面とする。
次に細胞膜３の一部が面上に吸着した基板１を、図４〜図８に示すような基板配置用部材４に配置する。基板配置用部材４はステンレス鋼からなり、光透過窓５の配置部分と、基板１の配置部分、及び受け皿６の周縁部6aを受け入れるために周方向に形成された座ぐり部とを有するように形成される。
基板配置用部材４において光透過窓５の配置部分は、基板１が備えられる側の他方側に設けられる。光透過窓は平面形状がＯ形のリング部材７で受け止められて前記配置部分の内部に配置され、更に上面から光透過窓５の抑え部材８で抑えられて固定され、基板配置用部材４に備えられる。光透過窓５は、可視光において光透過率90％以上、屈折率1.5の物性を有するガラス製であることが好ましい。可視光の波長としては、588ｎｍが挙げられる。また、抑え部材８は例えばポリテトラフルオロエチレン (PTFE：polytetrafluoroethylene)で作製され、四隅をボルト締めにより基板配置用部材４の一方の面側に固定される。このようにして、光透過窓５は基板配置用部材４から取り外し可能なように備えられる。
基板配置用部材４の一方の面側には基板１の配置部分として、図４〜図８に示すように直交する二軸に対して平行な方向に突き当て部分4a、4aが設けられる。突き当て部分4a、4aの高さは基板の厚みＴと同じかそれ以上とする。図４〜図８（特に図６）に示すように、基板配置用部材４の一方の面側に設けられた直交する二軸方向の突き当て部分4a、4aに、細胞膜が滴下された基板１の最外面の直交する二辺が当接して、基板１が基板配置用部材４に配置される。このような配置状態の時に、配置用部材４内に設けられた採光用の穴4b上に、各穴２が全て配置されるように、予め基板１の外形寸法及び穴２の形成位置を設定しておくものとする。
穴4bは直径5.0ｍｍ程度の円形に成形され、基板配置用部材４において図５（b）又、図７、図８に示すように、基板１の配置部分と、光透過窓５の配置部分の間を連結するように設けられる。従って、光透過窓５を透過した光によって、基板１の面上に滴下されている細胞膜３が照射される。更に、その穴4bの側面から直交方向に、第２の穴4cが形成され、図示しない真空ポンプ等のポンプへと、ジョイント口（ぐち）12を介して連結されている。穴4cも直径５ｍｍ程度の円形に形成される。
その真空ポンプで吸引を行うことで図３に示されるように、前記穴4b及び4cから基板１の面上に吸着されている細胞膜３が、各穴２の中心部に吸い寄せられて移動すると共に、基板１の面上に対して押し付けられる。図３の各穴２から下方に向かう矢印によって、吸引方向を模式的に示している。吸引圧力は一例として800Ｐａ又は1000Ｐａで行うことで、細胞膜３を傷つけること無く、また穴２を細胞膜３が通過すること無く、細胞膜３を基板１の面上に穴２を介して押し続けることが可能となり、好ましい。
吸引動作を行いながら基板配置用部材４を反転し、前記第２の緩衝液を入れた受け皿６を基板配置用部材４に嵌め込む。受け皿６は少なくとも底面がガラス製であり、周縁部6aはポリスチレン（polystyrene）で形成されている。その受け皿６の嵌め込みは、受け皿６の周縁部6aを前記座ぐり部内に嵌め込むことで行い、更に、周縁部6a外側の90°等間隔の四点を、図５に示すボールプランジャー９で係止することによって行われる。なお、ボールプランジャー９による周縁部6a外側の係止の図示を優先するため、図４（a）及び図５（a）のボールプランジャー９の設置位置と異なる位置であることを前提として、図４（b）及び図５（b）でボールプランジャー９を図示している。また、図４（b）及び図５（b）では、外観に現れるボールプランジャー９の図示を省略している。
基板配置用部材４における突き当て部分4a、4aの高さ寸法と、基板１の厚みＴ、及び受け皿６に入れる第２の緩衝液の量の設定により、受け皿６が基板配置用部材４に嵌め込まれたときに、受け皿６の内面の底面が、基板配置用部材４の基板１の配置側の面上に当接し、更に当接したときに基板１の面上に配置されている細胞膜３が第２の緩衝液で封止されることとする。
次に、ポンプによる吸引を継続しながら、基板配置用部材４を顕微鏡に載置し、細胞膜３を観察及び解析する。顕微鏡への基板配置用部材４の配置は、基板配置用部材４の抑え部材８側を上にして、吸引を行いながら基板配置用部材４の最外面に設けた二軸方向の突き当て部分4d、4dを、顕微鏡のステージ上に設けた受け入れ用のＬ字型の突き当て10に当接して行う（図９参照）。従って、突き当て10が顕微鏡における基板配置用部材４の配置箇所となる。突き当て部分4d、4dはそれぞれ基板配置用部材４の最外面の少なくとも一部に設けられる。本発明では、顕微鏡が細胞膜観察及び解析装置を構成しているものとする。顕微鏡としては、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡（原子間力顕微鏡含む）、共焦点顕微鏡、レーザ顕微鏡を使用すれば良い。なお図９では、外観に現れるボールプランジャー９及びジョイント口12の図示を省略している。
突き当て部分4d、4dも前記突き当て部分4a、4aと同様に、直交する二軸に対して平行な方向にそれぞれ設けられる。従って、図４（c）及び図５（c）に示すように、各突き当て部分4a、4aと各突き当て部分4d、4dは、それぞれ互いに平行に設けられることとなる。従って、顕微鏡のステージにＬ字型の突き当て10を用意しておけば、ステージの二軸方向と基板１の穴の二軸方向がそれぞれ平行となり、細胞膜３を観察及び解析する際に、細胞膜３の個数測定を容易に行うことが可能となる。
次に、ポンプの吸引により基板１の面上に押しつけられている各細胞膜３に、蛍光顕微鏡等によるイメージング観察及び解析（以下、説明の便宜上「蛍光観察及び解析」と記載）を行う。本発明に係る蛍光観察及び解析は、大きく分けて２つの観察法及び解析法が挙げられる。第１は、サンプルである細胞膜３に蛍光染色剤を付着させ、更にその蛍光染色剤に励起光を照射することで赤や緑に発光させ、細胞膜３を蛍光観察及び解析することである。第２は、各細胞膜３の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することである。
最初に、蛍光染色剤を使用する観察法及び解析法を説明する。図１０に示す顕微鏡は、対物レンズ11が顕微鏡のステージ13の穴を介して、図の下側に設けられた倒立型の顕微鏡による観察及び解析状態を示している。倒立型顕微鏡による蛍光観察及び解析では、対物レンズ11を通して下から上に向かって励起光を入れ、サンプルである細胞膜３に付けた蛍光染色剤に励起光が照射することで赤や緑に発光し、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を蛍光観察及び解析することが可能となる。
また倒立型顕微鏡による可視光観察及び解析（透過観察及び解析）は、図示しない透過照明ユニットがステージ13側に付属しているため、可視光観察及び解析を行う時に透過照明ユニットを細胞膜３の上側に持ってきて、図１０の上から下に向けて可視光域の照明光を当てることで、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を観察及び解析することが可能となる。
また顕微鏡の構造は倒立型に限定されず、他にも正立型の顕微鏡に基板配置用部材４を載置しても良い。図１１に示す顕微鏡は、対物レンズ11が図１１の上側に設けられた正立型の顕微鏡による観察及び解析状態を示している。
正立型顕微鏡による観察及び解析の場合は、対物レンズが図１１の上側となり、基板１の上側から観察及び解析することとなる。蛍光観察及び解析は、対物レンズ11を通して上から下に向かって励起光を入れ、サンプルである細胞膜３に付けた蛍光染色剤に励起光が照射することで赤や緑に発光し、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を蛍光観察及び解析することが可能となる。
また可視光観察及び解析（透過観察及び解析）は、図示しない透過照明ユニットがステージ13側に付属しているため、可視光観察及び解析を行う時に透過照明ユニットを細胞膜３の下側付近に持ってきて、図１１の下から上に向けて可視光域の照明光を当てることで、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を観察及び解析することが可能となる。
或いは正立型顕微鏡においては、基板配置用部材４を裏返して基板２の配置側を対物レンズ11と対向するように配置することで、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を可視光で観察及び解析しても良い。この場合、受け皿６は使用しない。基板２の配置側を対物レンズ11と対向することで、細胞膜３と対物レンズ11を近づけることが出来るので、より高倍率で細胞膜３を観察及び解析することが可能となる。
次に、各細胞膜３の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析する観察法及び解析法を説明する。各穴２上に配置される細胞膜３は、採取した細胞膜の表裏状態を維持している。そのため、細胞膜３の表面側と裏面側へのタンパク質や薬物などの標的分子の結合性を独立して評価可能である。例えば、細胞膜３の面上に結合した蛍光ラベル化標的分子の濃度依存的な結合量を解析し、標的分子の細胞膜３両面への親和性を見積もる事が可能となる。従って、本発明では、各細胞膜３の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することが可能となる。図１０に示す倒立型顕微鏡による蛍光観察及び解析では、細胞膜３の面上に蛍光ラベル化標的分子を結合させ、対物レンズ11を通して下から上に向かって励起光を入れることで、標的分子の細胞膜３両面のうち対物レンズ11側の面への親和性を見積もる事が可能となる。
また、図１１に示す正立型顕微鏡による蛍光観察及び解析では、細胞膜３の面上に蛍光ラベル化標的分子を結合させ、対物レンズ11を通して上から下に向かって励起光を入れることで、標的分子の細胞膜３両面のうち対物レンズ11と反対側の面への親和性を見積もる事が可能となる。
細胞膜３を可視光観察及び解析する際に、基板１が透明体な材料で構成されている場合は、細胞膜３全体の様子や形状または輪郭を明確に観察及び解析することが可能となる。一方、基板１が可視光域で光非透過性のプラスチックやシリコン等で構成されているか、基板１の表面に遮蔽膜やシールを貼り付けて光非透過性の基板とした場合は、細胞膜３を可視光観察及び解析する際、穴２の開口面積と同面積分の細胞膜のみ観察及び解析可能となる。しかし、基板１を透過する光の光量が各穴２の全開口面積分に応じた一定値となるため、定量的な観察や解析が可能となる。
以上、本発明に係る細胞膜観察及び解析装置及び細胞膜観察及び解析方法に依れば、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、昆虫細胞等の動物細胞等の各細胞におけるがん細胞由来の細胞膜の生体機能を、高感度に観察及び解析することが可能となった。
更に、細胞膜３を両面から観察及び解析することが出来る。従って、細胞膜３で起こる生体機能を高感度に追跡することが可能となり、薬剤感受性試験に多量の細胞サンプルが不要となり、試験の実施を速やかに行うことが可能となる。更に、サンプルの差し替えの手間が省略され、速やかに細胞膜３両面を観察及び解析することが可能となる。また、細胞膜３両面または任意の片面に、所望の生体反応を施すことも可能となる。
更に、ポンプの吸引により細胞膜３が分散されている緩衝液（懸濁液）又は第２の緩衝液が吸引され、穴4bを通って光透過窓５に接触して光透過窓５が汚れても、光透過窓５は基板配置用部材４から取り外し可能なように備えられているため、光透過窓５の洗浄を容易に行うことが出来る。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
本実施例に係る細胞膜観察及び解析装置には、倒立型の顕微鏡を用いると共に、透明体からなる基板を備える。基板は、外形寸法が奥行き10ｍｍ、幅10ｍｍ、厚み0.2ｍｍの石英ガラスからなるものを用意し、可視光の波長λが588ｎｍにおいて光透過率90％以上、屈折率1.5の物性を有する。その基板に形成される穴は、平面形状が円形状であり、断面形状がストレート穴に形成されている。穴は25個×25列の計625個形成した。各穴の径（直径）は2.0μｍ、各穴の中心部どうしの間の間隔は40μｍ、更に各穴のアスペクト比は100とした。
観察及び解析対象の細胞膜はHeLa細胞由来の細胞とし、MEM培地で培養された細胞を用いた。90%程度のコンフルエンシーに達したHeLa細胞を 10ｃｍ ディッシュ準備した。HeLa細胞を含むサンプルとして、１ｍｌ当たり50万個の細胞を含むサンプルを準備した。なお、MEM ５ｍｌに対して３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO) (１ｍｇ／ｍｌ)を10μｌ添加し、37℃、5%CO2の条件で10分インキュベートした。
次にHeLa細胞を 緩衝液Ａ（２ｍＭ CaCl2、10ｍＭ Tris／HCl pH 7.5、150ｍＭ NaCl）５ｍｌで洗浄した。更に、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに、25ｍＭ フォルムアルデヒドと２ｍＭ DTTを加えたもの）をHeLa細胞に加えた。
次に、37℃、５％CO2の条件で30分インキュベートし、その上澄みを蛍光染色剤で染色したGPMVs （giant plasma membrane vesicles）懸濁液とした。GPMVsは培養細胞から切り出された10μｍ程度の球状の細胞膜構造体である。
そのGPMVs懸濁液(500,000個／ml)を50μl、基板上に滴下し、大気圧の少なくとも20％程度の減圧下に１分放置した。基板配置用部材、光透過窓、光透過窓の抑え部材、及び受け皿は、前記実施形態で記載した物を用い、各部品間の配置や組み立ても前記実施形態で記載した通りとした。
なおGPMVsの吸引には真空ポンプを用い、吸引圧力は800Ｐａとした。その真空ポンプによる吸引を継続しながら、基板配置用部材を倒立型顕微鏡に載置し、蛍光染色剤による染色処理を行った後、紫外または可視光領域の光を照射して、蛍光観察及び解析を行うことで、HeLa細胞膜を観察及び解析した。その蛍光顕微鏡写真を図１２に示す。以上により、本発明の目的が達成される。
１ 基板
２ 穴
３ 細胞膜
４ 基板配置用部材
4a、4d 突き当て部分
4b、4c 穴
５ 光透過窓
６ 受け皿
6a 受け皿の周縁部
７ リング部材
８ 光透過窓の抑え部材
９ ボールプランジャー
10 突き当て
11 顕微鏡の対物レンズ
12 ポンプへのジョイント口
13 ステージ
２ 穴
３ 細胞膜
４ 基板配置用部材
4a、4d 突き当て部分
4b、4c 穴
５ 光透過窓
６ 受け皿
6a 受け皿の周縁部
７ リング部材
８ 光透過窓の抑え部材
９ ボールプランジャー
10 突き当て
11 顕微鏡の対物レンズ
12 ポンプへのジョイント口
13 ステージ
Claims (1)
- 複数の穴を有する基板を用意し、次に細胞膜を緩衝液に分散して懸濁液を作製し、その懸濁液を基板面上に滴下し、次に各穴を介して細胞膜をポンプで吸引し、各穴の上に細胞膜を配置し、各穴上に配置された細胞膜が、採取した細胞膜の表裏状態を維持しており、次に細胞膜の吸引を継続しながら細胞膜を第２の緩衝液に浸漬して、細胞膜を第２の緩衝液で封止し、細胞膜を顕微鏡により観察及び解析し、細胞膜の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することを特徴とする細胞膜観察及び解析方法。
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