JPH0690205B2 - 薬剤感受性試験方法 - Google Patents
薬剤感受性試験方法Info
- Publication number
- JPH0690205B2 JPH0690205B2 JP18364789A JP18364789A JPH0690205B2 JP H0690205 B2 JPH0690205 B2 JP H0690205B2 JP 18364789 A JP18364789 A JP 18364789A JP 18364789 A JP18364789 A JP 18364789A JP H0690205 B2 JPH0690205 B2 JP H0690205B2
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- JP
- Japan
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- antibody
- cells
- drug
- complement
- cancer cells
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、癌細胞の薬剤感受性試験方法に関する。
これまでに知られている癌細胞の薬剤感受性試験の方法
として、手術切片やバイオプシーにより得られた細胞を
細胞培養液還流法や酵素処理法により細胞浮遊液とし、
それと抗癌剤を含む培養液と共にカルチャープレートに
蒔き、数日〜十数日間培養を行い、光顕化あるいはギム
ザ等の染色をし、使用した抗癌剤に癌細胞が感受性があ
るか否かを調べる方法が取られていた。
として、手術切片やバイオプシーにより得られた細胞を
細胞培養液還流法や酵素処理法により細胞浮遊液とし、
それと抗癌剤を含む培養液と共にカルチャープレートに
蒔き、数日〜十数日間培養を行い、光顕化あるいはギム
ザ等の染色をし、使用した抗癌剤に癌細胞が感受性があ
るか否かを調べる方法が取られていた。
癌患者の治療に抗癌剤を投与することは、一般的に行わ
れている。個々の患者に適した抗癌剤を選択することは
容易でなく、誤るとその副作用のために逆効果を招く結
果となることは周知のことである。
れている。個々の患者に適した抗癌剤を選択することは
容易でなく、誤るとその副作用のために逆効果を招く結
果となることは周知のことである。
そこで個々の癌患者に対して最も適した抗癌剤を選択す
る方法として、癌細胞の薬剤感受性試験方法が開発され
た。
る方法として、癌細胞の薬剤感受性試験方法が開発され
た。
しかしながら、これまでの薬剤感受性試験方法は、試料
中に含まれる増殖性の高い正常繊維芽細胞が癌細胞より
多く増殖し、目的の癌細胞の増殖を抑制したり、癌細胞
の周囲を取り囲んだりするため、感受性の判定が不明瞭
となり、正しい結果を得ることができなかった。このた
め、薬剤感受性試験方法は個々の患者に対して最も高い
治療効果を期待できる抗癌剤を見いだすことができると
言われながらも多用されずにいるのが現状といえる。
中に含まれる増殖性の高い正常繊維芽細胞が癌細胞より
多く増殖し、目的の癌細胞の増殖を抑制したり、癌細胞
の周囲を取り囲んだりするため、感受性の判定が不明瞭
となり、正しい結果を得ることができなかった。このた
め、薬剤感受性試験方法は個々の患者に対して最も高い
治療効果を期待できる抗癌剤を見いだすことができると
言われながらも多用されずにいるのが現状といえる。
本発明者は、これら従来の課題を解決すべく研究した結
果、癌細胞を含む細胞を抗ヒト繊維芽細胞抗体あるいは
抗ヒトマクロファージ抗体および補体と反応させること
により、問題の繊維芽細胞あるいはマクロファージの影
響を受けることなく癌細胞の薬剤感受性試験方法を行う
ことができることを見い出し、発明を完成したものであ
る。
果、癌細胞を含む細胞を抗ヒト繊維芽細胞抗体あるいは
抗ヒトマクロファージ抗体および補体と反応させること
により、問題の繊維芽細胞あるいはマクロファージの影
響を受けることなく癌細胞の薬剤感受性試験方法を行う
ことができることを見い出し、発明を完成したものであ
る。
一般式に、薬剤感受性試験方法は、病原菌の薬剤に対す
る抵抗性を調べる際に利用されている。例えば、ぶどう
球菌のペニシリンに対する耐性株は、ペニシリンで殺菌
することが困難であり、ペニシリン以外の効果を有する
殺菌剤を見い出し、それをもって殺菌することが必要で
ある。この際、効果を有する殺菌剤を決めるために、目
的の菌を種々の、殺菌剤を含んだ培地で培養し、コロニ
ー形成の有無を調べることにより行うものである。その
結果、コロニーが形成されない培養液に含まれる殺菌剤
をその菌の感受性薬剤とするものである。
る抵抗性を調べる際に利用されている。例えば、ぶどう
球菌のペニシリンに対する耐性株は、ペニシリンで殺菌
することが困難であり、ペニシリン以外の効果を有する
殺菌剤を見い出し、それをもって殺菌することが必要で
ある。この際、効果を有する殺菌剤を決めるために、目
的の菌を種々の、殺菌剤を含んだ培地で培養し、コロニ
ー形成の有無を調べることにより行うものである。その
結果、コロニーが形成されない培養液に含まれる殺菌剤
をその菌の感受性薬剤とするものである。
本発明は、前記の殺菌剤の感受性試験方法と基本的原理
が同じである。
が同じである。
本発明を行うにあたっては、癌細胞を含む細胞は種々の
抗癌剤を含む培地で培養される。種々の培養法が採用さ
れるが、比較的培養が行いやすいリキッドモノレイヤー
培養法の採用が望ましい。即ち、癌細胞を含む細胞を懸
濁化し、その液を約10％牛胎児血清を含むイーグルアル
ファ（Eaglealfa）MEM培養液で希釈し、培養を行うもの
である。癌細胞を含む細胞は、培養液中で小さくカット
し、トリプシン等を含む酵素液で細胞を完全に１個ずつ
に懸濁させたものを使用する。この懸濁液に抗繊維芽細
胞体ありは抗マクロファージ抗体を加え反応させるもの
である。この時の抗体濃度は、細胞浮遊液1ml当たり0.0
1μｇ〜10mgであり、好ましくは１μｇ〜1mgである。こ
の時の反応温度は、細胞が正常に機能する温度であり、
通常、室温〜45℃である。
抗癌剤を含む培地で培養される。種々の培養法が採用さ
れるが、比較的培養が行いやすいリキッドモノレイヤー
培養法の採用が望ましい。即ち、癌細胞を含む細胞を懸
濁化し、その液を約10％牛胎児血清を含むイーグルアル
ファ（Eaglealfa）MEM培養液で希釈し、培養を行うもの
である。癌細胞を含む細胞は、培養液中で小さくカット
し、トリプシン等を含む酵素液で細胞を完全に１個ずつ
に懸濁させたものを使用する。この懸濁液に抗繊維芽細
胞体ありは抗マクロファージ抗体を加え反応させるもの
である。この時の抗体濃度は、細胞浮遊液1ml当たり0.0
1μｇ〜10mgであり、好ましくは１μｇ〜1mgである。こ
の時の反応温度は、細胞が正常に機能する温度であり、
通常、室温〜45℃である。
ここで用いる抗体は山羊やウサギに免疫して得られるポ
リクローナル抗体であっても、あるいは細胞融合法によ
って得られるモノクローナル抗体であっても良い。モノ
クローナル抗体は、例えば、「モノクローナル抗体とが
ん」（（株）サイエンスフォーラム）などに記載の方法
に従い容易に作ることができる。抗体の使用にあたって
はアフィニティークロマトにより精製した抗体を使用す
ることで交差反応を避けることが出来る。
リクローナル抗体であっても、あるいは細胞融合法によ
って得られるモノクローナル抗体であっても良い。モノ
クローナル抗体は、例えば、「モノクローナル抗体とが
ん」（（株）サイエンスフォーラム）などに記載の方法
に従い容易に作ることができる。抗体の使用にあたって
はアフィニティークロマトにより精製した抗体を使用す
ることで交差反応を避けることが出来る。
尚、抗体の反応にあたっては、抗ヒト繊維芽細胞抗体お
よび抗マクロファージ抗体を同時に用いることもでき
る。
よび抗マクロファージ抗体を同時に用いることもでき
る。
補体は、前記抗体と同時あるいは前記抗体反応後５〜60
分後に加え反応させるものである。使用する補体は、各
々の成分を分けて用いてもあるいは新鮮血清をそのまま
使用しても良い。血清中の補体を用いるときはその中に
含まれる異種抗体を除くために低温（０〜４℃）で試料
細胞懸濁液と補体血清を反応させ異種抗体を吸収する必
要がある。一般に補体は市販されているもので充分であ
り、必要に応じて希釈して用いてもよい。使用する補体
量は細胞浮遊液1ml当たり、一般的には１〜100単位/ml
（モルモット血清）で、好ましくは３〜８単位である。
新鮮補体の調製は免疫実験操作法（日本免疫学会編）等
に記載されている方法により得ることもできる。補体を
加えてから、撹拌しながら20℃〜40℃、好ましくは35℃
〜39℃で10〜60分以上の反応後、反応に用いた培養液と
抗癌剤を含む培養液と交換し、更に十数日間培養するも
のである。培養は、一般に室温〜45℃で行われる。その
結果、コロニーの形成を調べることにより薬剤感受性が
あるか否か判定するものである。細胞は、判定しやすい
ように前もって適当な染色液で染色しておいてもよい。
分後に加え反応させるものである。使用する補体は、各
々の成分を分けて用いてもあるいは新鮮血清をそのまま
使用しても良い。血清中の補体を用いるときはその中に
含まれる異種抗体を除くために低温（０〜４℃）で試料
細胞懸濁液と補体血清を反応させ異種抗体を吸収する必
要がある。一般に補体は市販されているもので充分であ
り、必要に応じて希釈して用いてもよい。使用する補体
量は細胞浮遊液1ml当たり、一般的には１〜100単位/ml
（モルモット血清）で、好ましくは３〜８単位である。
新鮮補体の調製は免疫実験操作法（日本免疫学会編）等
に記載されている方法により得ることもできる。補体を
加えてから、撹拌しながら20℃〜40℃、好ましくは35℃
〜39℃で10〜60分以上の反応後、反応に用いた培養液と
抗癌剤を含む培養液と交換し、更に十数日間培養するも
のである。培養は、一般に室温〜45℃で行われる。その
結果、コロニーの形成を調べることにより薬剤感受性が
あるか否か判定するものである。細胞は、判定しやすい
ように前もって適当な染色液で染色しておいてもよい。
本発明は、癌細胞の薬剤感受性試験方法において、癌細
胞の培養を安定に行え、癌細胞には全く影響を及ぼさな
い。
胞の培養を安定に行え、癌細胞には全く影響を及ぼさな
い。
以下に実施例により本発明を説明する。
実施例１ バイオプシーにより得られた固形癌1gを無菌に保ちメデ
ィウム（10Uヘパリン、イーグルアルファMEM培養液）で
洗浄した後、この組織をはさみで1mm以下にカットし、
0.075％コラゲナーゼ、0.005％DNaseおよび10％牛胎児
血清（FCS）を含むF-12培養液で37℃、16時間撹拌し
た。これを遠心し（1000rpm、10分）、アルファMEM培養
液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマイシ
ン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.27μ
g/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/mlEG
F、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。次にこの
細胞懸濁液1ml当たり無菌の1mgの抗繊維芽細胞マウスモ
ノクローナル抗体と予め異種抗体を吸収したモルモット
新鮮補体液５単位を加え37℃、１時間撹拌下、加温し
た。再度、これを遠心し（1000rpm、10分）、アルファM
EM培養液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマ
イシン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.
27μg/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/m
lEGF、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。この
細胞を24穴プレートに２×103細胞になるように希釈し
蒔いた。24時間後に一度同じ培養液を交換し、13日間、
５％CO2環境下、37℃で培養した。対照には抗体および
補体を加えずに上記と同時に操作し培養した。
ィウム（10Uヘパリン、イーグルアルファMEM培養液）で
洗浄した後、この組織をはさみで1mm以下にカットし、
0.075％コラゲナーゼ、0.005％DNaseおよび10％牛胎児
血清（FCS）を含むF-12培養液で37℃、16時間撹拌し
た。これを遠心し（1000rpm、10分）、アルファMEM培養
液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマイシ
ン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.27μ
g/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/mlEG
F、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。次にこの
細胞懸濁液1ml当たり無菌の1mgの抗繊維芽細胞マウスモ
ノクローナル抗体と予め異種抗体を吸収したモルモット
新鮮補体液５単位を加え37℃、１時間撹拌下、加温し
た。再度、これを遠心し（1000rpm、10分）、アルファM
EM培養液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマ
イシン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.
27μg/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/m
lEGF、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。この
細胞を24穴プレートに２×103細胞になるように希釈し
蒔いた。24時間後に一度同じ培養液を交換し、13日間、
５％CO2環境下、37℃で培養した。対照には抗体および
補体を加えずに上記と同時に操作し培養した。
実施例２ 手術材料により得られた固形癌1gを無菌に保ち、メディ
ウム（10Uヘパリン、イーグルアルファMEM培養液）で洗
浄した後、この組織をはさみで1mm以下にカットし、0.0
75％コラゲナーゼ、0.005％DNaseおよび10％牛胎児血清
（FCS）を含むF-12培養液で37℃、16時間撹拌した。こ
れを遠心し（1000rpm、10分）イーグルアルファMEM培養
液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマイシ
ン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.27μ
g/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/mlEG
F、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。次に、こ
の細胞懸濁液1ml当たり無菌の1mgの抗繊維芽細胞マウス
モノクローナル抗体と予め異種抗体を吸収したモルモッ
ト新鮮補体液５単位を加え37℃、１時間撹拌下、加温し
た。再度、これを遠心し（1000rpm、10分）、アルファM
EM培養液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマ
イシン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.
27μg/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/m
lEGF、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。この
細胞を24穴プレートに２×103細胞になるように希釈し
蒔いた。24時間後に一度同じ培養液を交換し、13日間、
５％CO2環境下、37℃で各抗癌剤（アドリアマイシン0.0
01〜0.03μg/ml、5-フルオロウラシル0.05〜0.7μg/m
l）を含む上記細胞培養液で培養した。対照には抗体お
よび補体を加えずに上記と同様に操作し培養した。
ウム（10Uヘパリン、イーグルアルファMEM培養液）で洗
浄した後、この組織をはさみで1mm以下にカットし、0.0
75％コラゲナーゼ、0.005％DNaseおよび10％牛胎児血清
（FCS）を含むF-12培養液で37℃、16時間撹拌した。こ
れを遠心し（1000rpm、10分）イーグルアルファMEM培養
液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマイシ
ン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.27μ
g/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/mlEG
F、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。次に、こ
の細胞懸濁液1ml当たり無菌の1mgの抗繊維芽細胞マウス
モノクローナル抗体と予め異種抗体を吸収したモルモッ
ト新鮮補体液５単位を加え37℃、１時間撹拌下、加温し
た。再度、これを遠心し（1000rpm、10分）、アルファM
EM培養液（10％FCS、100U/mlペニシリン‐ストレプトマ
イシン、５μg/mlインスリン、10μg/mltransferin、0.
27μg/mlestradiol、10.5μg/mlhydrocortisone、5ng/m
lEGF、0.6％メチルセルロース含有）に交換した。この
細胞を24穴プレートに２×103細胞になるように希釈し
蒔いた。24時間後に一度同じ培養液を交換し、13日間、
５％CO2環境下、37℃で各抗癌剤（アドリアマイシン0.0
01〜0.03μg/ml、5-フルオロウラシル0.05〜0.7μg/m
l）を含む上記細胞培養液で培養した。対照には抗体お
よび補体を加えずに上記と同様に操作し培養した。
表１に各種の手術材料として得られた癌組織の薬剤感受
性試験方法の結果を抗体および補体で処理した場合とし
ない場合とで示した。
性試験方法の結果を抗体および補体で処理した場合とし
ない場合とで示した。
〔発明の効果〕 本発明の方法によれば、抗ヒト繊維芽細胞抗体あるいは
抗ヒトマクロファージ抗体および補体反応後の癌細胞上
には全くヒトの繊維芽細胞あるいはマクロファージが存
在せず、極めて有効な癌細胞の薬剤感受性試験方法と言
える。
抗ヒトマクロファージ抗体および補体反応後の癌細胞上
には全くヒトの繊維芽細胞あるいはマクロファージが存
在せず、極めて有効な癌細胞の薬剤感受性試験方法と言
える。
第１図は抗繊維芽細胞抗体および補体処理を行って13日
間培養した染色像で示す生物の形態の写真。第２図は抗
繊維芽細胞抗体および補体処理を行わずに13日間培養し
たメラノーマである生物の形態の写真。
間培養した染色像で示す生物の形態の写真。第２図は抗
繊維芽細胞抗体および補体処理を行わずに13日間培養し
たメラノーマである生物の形態の写真。
Claims (8)
- 【請求項１】癌細胞を含む細胞を抗ヒト繊維芽細胞抗体
および補体と反応させた後、薬剤とともに細胞培養を行
う癌細胞の薬剤感受性試験方法。 - 【請求項２】癌細胞を含む細胞を抗ヒトマクロファージ
抗体および補体と反応させた後、薬剤とともに細胞培養
を行う癌細胞の薬剤感受性試験方法。 - 【請求項３】抗ヒト繊維芽細胞抗体がポリクローナル抗
体である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】抗ヒト繊維芽細胞抗体がモノクローナル抗
体である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】抗ヒトマクロファージ抗体がポリクローナ
ル抗体である請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】抗ヒトマクロファージ抗体がモノクローナ
ル抗体である請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】薬剤が抗癌剤である請求項１または２に記
載の方法。 - 【請求項８】抗ヒト繊維芽細胞抗体と抗ヒトマクロファ
ージ抗体を同時に用いる請求項１または２に記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18364789A JPH0690205B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 薬剤感受性試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18364789A JPH0690205B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 薬剤感受性試験方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0348767A JPH0348767A (ja) | 1991-03-01 |
| JPH0690205B2 true JPH0690205B2 (ja) | 1994-11-14 |
Family
ID=16139457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18364789A Expired - Lifetime JPH0690205B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | 薬剤感受性試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0690205B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015115448A1 (ja) | 2014-01-30 | 2015-08-06 | 並木精密宝石株式会社 | 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009156808A (ja) * | 2007-12-27 | 2009-07-16 | Horiba Ltd | 検体サンプリング装置 |
-
1989
- 1989-07-18 JP JP18364789A patent/JPH0690205B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015115448A1 (ja) | 2014-01-30 | 2015-08-06 | 並木精密宝石株式会社 | 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0348767A (ja) | 1991-03-01 |
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