DE10061347A1

DE10061347A1 - Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von Ionenströmen an einer einzelnen Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation

Info

Publication number: DE10061347A1
Application number: DE2000161347
Authority: DE
Inventors: Klaus Benndorf
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2002-06-13

Abstract

Es war Aufgabe der Erfindung, die Ionenströme an einer einzelnen Zelle entsprechend ihren physiologischen bzw. pathophysiologischen sowie gewebetypischen Zellbedingungen zu messen, wobei die Messung insbesondere unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation möglich sein soll. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird die Messung in einer Mikromesskammer (1) durchgeführt, deren Größe und vorzugsweise Form im Wesentlichen den Ausmaßen der zu untersuchenden Zelle angepasst ist und deren Wand als Ag/AgCl-Referenzdiode dient. Die Ionenstrommessung erfolgt dabei unter einer konstantgehaltenen Chloridionenkonzentration der Extrazellulärlösung (2) in der Mikromesskammer (1). DOLLAR A Die vorgeschlagene Messung der Ionenströme findet Anwendung bei der elektrophysiologischen Untersuchung von Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von Ionenströmen an einer einzelnen Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation.

Elektrophysiologisch werden isolierte Zellen untersucht, indem sich diese Zellen in einem relativ großen Volumen an extrazellulärem Medium befinden und die Ionenströme mittels der Patch-Clamp-Technik gemessen werden (O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann und F. J. Sigworth: Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. 391, 1981, 85-100). Zu diesem Zweck wird eine spitz ausgezogene Glaspipette auf die Zelle aufgesetzt. Es können die Ströme entweder in dem Stück Membran unter der Pipettenspitze oder nach Eröffnung der Zelle durch die gesamte Zellmembran gemessen werden. Die Badlösung stellt in jedem Falle ein praktisch unendlich großes Reservoir dar, in dem Stoffe, die aus der Zelle austreten, sich auch nahezu unendlich verdünnen. Unter diesen Voraussetzungen können bei der Messung physiologische bzw. pathophysiologische Zellbedingungen nur relativ begrenzt simuliert werden, so dass die Messergebnisse oft nicht aussagefähig sind für Zellfunktionen unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation.

Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung, die Ionenströme an einer einzelnen Zelle entsprechend ihren physiologischen bzw. pathophysiologischen sowie gewebetypischen Zellbedingungen zu messen, wobei die Messung insbesondere unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation möglich sein soll.

Erfindungsgemäß wird der über die Zellmembran fließende Ionenstrom in einer Mikromesskammer gemessen, deren Größe und vorzugsweise Form im wesentlichen den Ausmaßen der Zelle angepasst ist. Auf diese Weise wird die Zelle nicht wie bisher in einem nahezu unendlich großen Reservoir an extrazellulärem Medium untersucht, in welchem sich die aus der Zelle austretenden Stoffe in entsprechender Weise verdünnen.

Infolge der an die Zelle angepassten speziellen Mikromesskammer umgibt die darin befindliche Extrazellulärlösung die zu untersuchende Zelle als vergleichsweise sehr kleines Flüssigkeitsvolumen. In diesem verändert sich die Konzentration der besagten aus der Zelle austretenden Stoffe nicht wesentlich, so dass sie für die Ionenstrommessung an der Zelle erhalten bleiben. Auf diese Weise gelingt es, die Zelle nach der gestellten Aufgabe unter ihren physiologischen bzw. pathophysiologischen sowie gewebetypischen Zellbedingungen zu untersuchen, wodurch die Messergebnisse nunmehr auch aussagefähig sind für Zeltfunktionen unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation.

Die Wand der Mikromesskammer ist vorzugsweise selbst die Ag/AgCl-Referenzelektrode für die elektrophysiologischen Untersuchungen. Die Chlorierung der Silberwand erfolgt vor den Messungen.

Bei der vorbeschriebenen Messung von Ganzzell-Ionenströmen, die zelltypisch im Nanoampere-Bereich auftreten, würde sich in dem kleinen Volumen der in der Mikromesskammer befindlichen Extrazellulärlösung die Konzentration der Chloridionen, je nach Stromrichtung, ändern. Bisher war dieser Aspekt infolge des vergleichsweise großen Reservoirs an Zellsuspension gegenstandslos und ohne Einfluss auf das Messergeb nis. Um zu gewährleisten, dass sich in diesem sehr kleinen Flüssigkeitsvolumen die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung während der Messwerterfassung nicht verändert, wird initial die Spannung ermittelt, bei welcher der Strom über die Zellmembran null beträgt. Zu diesem Zweck wird die Spannung an der Zelle vor jeder durchzuführenden Patch-Clamp-Messung iterativ verändert, bis der Strom über die Zellmembran null ist (Nullstrom).

Nach der Messung von Jonenströmen ist es für die besagten zelltypischen Ionenstrom größen wesentlich, die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung wiederher zustellen und die elektrische Stabilität der Ag/AgCl-Referenzelektrode zu gewährleisten. Dies wird erreicht, indem jeweils ein Strom kleiner Amplitude solange appliziert wird, bis die in der Messperiode bewegte Nettoladung wieder zurückgeflossen ist.

Bei zyklischen Verfahren zur Ionenstrommessung ist es möglich, nach Wiederherstellung der ursprünglichen Chloridionenkonzentration jeweils nochmals iterativ den Nullstrom zu ermitteln. Damit können für jede Patch-Clamp-Messung eventuelle geringfügige Abweichungen des Nullstromes korrigiert werden.

In den Unteransprüchen sind weitere Ausgestaltungsmerkmale zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere zur Begasung der Mikromesskammer während der Patch-Clamp-Messung mit wasserdampfgesättigten Gasen, aufgeführt. Mit dieser Begasung, die ein Austrocknen des sehr kleinen extrazellulären Flüssigkeits volumens verhindert, wird dafür gesorgt, dass die Atmosphäre über der Mikromesskammer wasserdampfangereichert ist.

Zur Untersuchung autokrin vermittelter Aktivierung von Ionenkanälen oder parakriner Stimulation unter Verwendung von jeweils zwei Zellen kann wasserdampfgesättigte Luft bzw. wasserdampfgesättigter Sauerstoff eingesetzt werden.

Zur Messung unter Bedingungen der Ischämie ist auch eine Begasung mit wasserdampfgesättigtem reinen Argon als laminarer Strom durch die Messkammer möglich.

Die Ionenstrommessung an der erfindungsgemäß im kleinen extrazellulären Flüssigkeits volumen der Mikromesskammer befindlichen Zelle gestattet ferner gleichzeitig zu dieser Auswertung die Anwendung anderer Verfahren zur Zelluntersuchung, beispielsweise an sich bekannte Fluoreszenzverfahren für eine optische Erfassung von Flüssigkeits bewegungen und Ionenflüssen über die Zellmembran.

Die Erfindung soll nachstehend anhand einer schematisch in der Zeichnung dargestellten Mikromesskammer als Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

In der Zeichnung ist eine Mikromesskammer 1 dargestellt, in der sich eine Extrazellulär lösung 2 befindet. Mittels einer Patch-Pipette 3, die vorzugsweise mit einem aus Übersichtsgründen nicht dargestellten Mikromanipulator in Verbindung steht, wird eine Zelle 4, die nach dem an sich bekannten Patch-Clamp-Verfahren zu untersuchen ist, ausgewählt und in der Mikromesskammer I mit der Extrazellulärlösung 2 platziert. Das Aufnahmevolumen der Mikromesskammer 1 ist dabei der Größe der zu untersuchenden Zelle 4 angepasst und beträgt ungefähr das Zweifache des Zellvolumens. Kleinere Kammervolumen, beispielsweise das 1,5-fache gegenüber dem Zellvolumen, sind möglich. Damit ist auch die Menge der Extrazellulärlösung 2 festgelegt und stellt in Relation zu vergleichbaren Messkammern des Standes der Technik ein sehr geringes Reservoir dar, in welchem sich aus der Zelle austretende Stoffe nicht wesentlich verdünnen können, so dass die Effekte von diesen durch die Zelle 4 sezernierten Stoffen auf die Zelle 4 selbst berücksichtigt werden.

Der Ionenstrom in der Zelle 4 wird über die Patch-Pipette 3 mit dem Patch-Clamp- Verfahren bei konstanter Spannung gemessen. Die Referenzelektrode wird durch die aus Silber bestehende Wandung der Mikromesskammer 1 selbst gebildet. Auf diese Wandung wird vor der Messung eine AgCl-Schicht aufgebracht.

Um zu vermeiden, dass sich bei der Messung von Ganzzell-Ionenströmen, die zelltypisch im Nanoampere-Bereich auftreten, während des erfindungsgemäßen Messfahrens in der kleinvolumigen Mikromesskammer 1 die Konzentration der Chloridionen in der Extrazel lulärlösung 2 je nach Stromrichtung ändert, wird deshalb in einem ersten Schritt vor jeder Patch-Clamp-Messung in einem iterativen Prozess die Spannung ermittelt, bei welcher der Strom über die Zellmembran null beträgt (Nullstrom). Über rechnergestützte Verfahren kann dieser Prozess, in weniger als einer Sekunde erledigt werden. Mit dieser Spannung, die für die nachfolgende Ionenstrommessung an der Zelle 4 konstantgehalten wird, ist die Stabilität der durch die Wandung der Mikromesskammer 1 gebildeten Ag/AgCl- Referenzelektrode gewährleistet und bleibt auch die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung 2 durch Elektrodenreaktionen unverändert, so dass das Ergebnis der nachfolgenden Messung und Auswertung nicht durch solche Elektrodenreaktionen beeinträchtigt wird.

In einem zweiten Schritt erfolgt die an sich bekannte Messung des Ionenstromes (Patch- Clamp-Messung) über die Zelle 4. Je nach Fragestellung werden die entsprechenden Spannungsprotokolle appliziert und die entsprechenden Membranströme gemessen bzw. aufgezeichnet. Am Ende der Applikation der Spannungsprotokolle wird berechnet, welche Nettoladung in der Messperiode geflossen ist. Je nach Vorzeichen dieser Nettoladung hat sich die Konzentration der Chloridionen in der Extrazellulärlösung 2 erhöht bzw. erniedrigt.

Um die ursprüngliche Chloridionenkonzentration vor der Patch-Clamp-Messung wieder herzustellen, wird in einem dritten Schritt ein Strom kleiner Amplitude und entsprechender Stromrichtung solange appliziert, bis die in der Messperiode bewegte Nettoladung wieder zurückgeflossen ist. Dieser Vorgang wird rechentechnisch kontrolliert. Im Ergebnis stellt sich die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung 2 wieder weitgehend auf den Ausgangswert ein, wobei geringe Abweichungen von dem Nullstrom über der Zelle 4 durch nochmalige Ausführung von Schritt 1 korrigiert werden können. Nach Ermittlung und Einstellung der Spannung, die den Nullstrom hervorruft, kann beliebig lange Zeit vergehen, da die Zelle 4 bei ihrem normalen Ruhepotential gehalten wird. Infolge des Nullstroms über die Zelle 4 bleibt auch die Chloridionenkonzentration in der Extrazellulär lösung 2 konstant.

Bei zyklischen Ionenstrommessungen werden die vorgenannten Schritte in einem entsprechenden Rhythmus ausgeführt.

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen

1

Mikromesskammer

2

Extrazellulärlösung

3

Patch-Pipette

4

Zelle

Claims

1. Verfahren zur elektrophysiologischen Messung von Ionenströmen an einer einzelnen Zelle unter Bedingungen der Ischämie und/oder der autokrinen bzw. parakrinen Stimulation, bei dem die Ionenströme über die Zellmembran, vorzugsweise in zyklischen Messungen, mittels der Patch-Clamp-Technik in einer Messkammer gemessen werden, worin sich die zu untersuchende Zelle in einer Extrazellulärlösung befindet, und bei dem die Ionenströme mit einer Patch-Pipette gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode außerhalb der Zelle registriert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung unter Konstanthaltung der Chloridionenkonzentration der Extrazellulärlösung in einer Mikromesskammer durchgeführt wird, deren Größe und vorzugsweise Form im wesentlichen den Ausmaßen der zu untersuchenden Zelle angepasst ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung in einer Mikromesskammer durchgeführt wird, deren Volumen im wesentlichen doppelt so groß ist wie das Volumen der zu messenden Zelle und auf deren aus Silber bestehende Wandung zur Ausbildung der Ag/AgCl-Referenzelektrode vor der Messung eine AgCl-Schicht aufgebracht wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Zweck der Konstant haltung der Chloridionenkonzentration in der Extrazellulärlösung für die Gewährleistung der Stabilität der Ag/AgCl-Referenzelektrode vor jeder durchzuführenden Patch-Clamp- Messung iterativ die Spannung ermittelt wird, bei welcher der Strom über die Zellmembran null (Nullstrom) beträgt, und dass zur Wiederherstellung der ursprünglichen Chloridionen konzentration in der Extrazellulärlösung nach jeder Patch-Clamp-Messung jeweils ein Strom kleiner Amplitude solange appliziert wird, bis die in der Patch-Clamp-Messperiode bewegte Nettoladung wieder zurückgeflossen ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach Wiederherstellung der ursprünglichen Chloridionenkonzentration nochmals iterativ die Spannung ermittelt wird, bei welcher der Strom über die Zellmembran null (Nullstrom) beträgt, um eventuelle geringfügige Abweichungen des Nullstromes zu korrigieren.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer während der Patch-Clamp-Messung mit einem wasserdampfgesättigten Gas überströmt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer zur Messung unter aeroben Bedingungen, beispielsweise zur autokrin vermittelten Aktivierung von Ionenkanälen, mit wasserdampfgesättigter Luft bzw. wasserdampfgesättigtem Sauer stoff begast wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer unter Begasung mit wasserdampfgesättigter Luft bzw. wasserdampfgesättigtem Sauerstoff zum Zweck der Untersuchung parakriner Stimulation mit zwei Zellen belegt wird, wobei eine Zelle zur Simulation und die andere Zelle zur Messung der Jonenströme verwendet wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikromesskammer zur Messung unter Bedingungen der Ischämie an der Zelle mit wasserdampfgesättigtem reinen Argon überströmt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig zur Messung der Ionenströme an sich bekannte Fluoreszenzverfahren für eine optische Erfassung von Flüssigkeitsbewegungen und Ionenflüssen durch die Zellmembran eingesetzt werden.