DE102017130518A1

DE102017130518A1 - Messgerät, Messverfahren, Hochdurchsatz-Testgerät und Messkit für elektrophysiologische Messungen, insbesondere an Zellaggregaten

Info

Publication number: DE102017130518A1
Application number: DE102017130518.1A
Authority: DE
Inventors: Steffen Hering
Original assignee: Chanpharm GmbH
Current assignee: Chanpharm GmbH
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-06-19
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: WO2019121162A1; DE102017130518B4

Abstract

Ein elektrophysiologisches Messgerät (100) zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1), insbesondere mit einer Querschnittsdimension im Bereich von 50 µm bis 1 mm, umfasst eine Halteeinrichtung (10) mit einem Innenraum (11), der einen Bodenbereich (14) und einen Wandbereich (15) aufweist und zur Aufnahme der Zellprobe (1) in einem physiologischen Umgebungsmedium (2) konfiguriert ist, eine Perfusionseinrichtung (20) mit mindestens einer Mess-Perfusionskammer (21A, 21B), die zur Aufnahme eines Perfusionsmediums (3A, 3B) konfiguriert ist und über mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei eine zum Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) weisende Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet ist, eine Elektrodeneinrichtung (30) mit mindestens einer Mess-Elektrode (31A, 31B), die jeweils für einen elektrischen Kontakt mit dem Perfusionsmedium in der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, und eine Messeinrichtung (40), die zur Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der mindestens einen Mess-Elektrode (31A, 31B) verbunden ist, wobei die Halteeinrichtung (10) mindestens einen Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) aufweist, der benachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, und geometrische Eigenschaften des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) so gewählt sind, dass die Zellprobe (1) mittels des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) in einem deformierten Zustand in der Halteeinrichtung (10) fixierbar ist. Es werden auch ein Hochdurchsatz-Testgerät, ein elektrophysiologisches Messverfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1) und ein Messkit für pharmakologische Untersuchungen an Zellaggregaten beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft ein elektrophysiologisches Messgerät und ein elektrophysiologisches Messverfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe, insbesondere ein Messgerät und ein Messverfahren zur Erfassung von einem Aktionspotential und/oder Oberflächenpotentialen der Zellprobe und/oder einem lonenstrom durch mindestens eine Zellmembran der Zellprobe. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Hochdurchsatz-Testgerät, das eine Vielzahl von elektrophysiologischen Messgeräten enthält, und ein Messkit zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe. Anwendungen der Erfindung sind bei der Charakterisierung von biologischen Proben, insbesondere von Zellaggregaten, in der Pharmakologie, Medizin, Biochemie und/oder Biomedizin gegeben.
In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt:

[1] EP 1 040 349 B1 ;
[2] O. P. Hamill et al. in „Pflugers Arch." 1981 Aug; 391(2):85-100;
[3] EP 1 349 916 A2 ;
[4] EP 1 311 655 B1 ;
[5] US 2002/0064841 A1 ;
[6] EP 0 938 674 B1 ;
[7] Y. I. Zilberter et al. in „Pflugers Arch." 1982 Aug;394(2):150-5;
[8] B. Schubert, R. Bodewei, S. Hering, A. Wollenberger in „J. Mol. Cell. Cardiol." 1987 Nov; 19(11):1129-39;
[9] M. Huch et al. in „Development" 2017 Mar 15; 144(6);
[10] P. Saxena et al. in „Br. J. Pharmacol." 2017 Jul 6. doi: 10.1111/bph.13942;
[11] M. Hencek et al. in „Pflugers Arch." 1969;313(1):71-9; und
[12] N. Akaike et al. in „Jpn. J. Physiol." 1994;44(5):433-73.

Elektrophysiologische Untersuchungen an Proben aus mindestens einer biologischen Zelle oder Zellaggregaten umfassen insbesondere die Messung von lonenströmen durch die Zellmembran („patch-clamp“-Messung) oder die Messung von Aktionspotentialen an der Zellmembran („current-clamp“-Messung). Bei dem älteren „voltage-clamp“-Verfahren wird ein Kompensationsstrom in die Probe geleitet, um die Membranspannung konstant zu halten, wohingegen bei „patch-clamp“-Messungen wegen der geringen Stromamplituden auf die Injektion eines Kompensationsstromes während der Messung verzichtet werden kann.
Es ist bekannt, elektrophysiologische Messungen an Pipettenspitzen oder mit planaren Messgeräten durchzuführen, bei denen einzelne Zellen oder rekonstituierte Membransysteme auf einer Pore in einer ebenen Oberfläche („patch-Pore“) positioniert werden ([1], [2]). Es können mehrere Poren in einer Oberfläche vorhanden sein und somit mehrere Einzelzellen gleichzeitig mit der „patch-clamp“ Technik ([2]) untersucht werden. Die (Multiarray-)-„patch-clamp“-Methode bzw. „patch-clamp“-Chips werden z. B. in [1] und [3] beschrieben.
15 (Stand der Technik) zeigt ein Beispiel eines herkömmlichen planaren „patch-clamp“-Messgeräts 100', das eine Halteeinrichtung 10' zur Aufnahme einer Suspension 2' biologischer Zellen 1' und eine Mess-Perfusionskammer 21' mit einer Mess-Pore 22' aufweist. Die Mess-Perfusionskammer 21' ist mit einer Platte 23' mit adhäsiver Oberfläche verschlossen, in der die Mess-Pore 22' gebildet ist. Über Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24' kann durch die Mess-Perfusionskammer 21' ein Perfusionsmedium geleitet werden, das je nach „patch-clamp“-Konfiguration eine intrazelluläre („whole-cell“-Konfiguration) oder extrazelluläre Lösung („cell-attached“-Konfiguration) umfasst ([2]). In der Mess-Perfusionskammer 21' befindet sich eine Elektrode 31', die zur Erfassung eines Potentials oder eines Stroms relativ zu einer Referenzelektrode 16' in der Halteeinrichtung 10' mit einem Operationsverstärker (nicht gezeigt) verbunden ist.
Für die „patch-clamp“-Messung ist eine abdichtende Adhäsion der Zelloberfläche im Randbereich der Mess-Pore 22' mit der Bildung eines hohen elektrischen Widerstands („seal“-Widerstand) zwischen dem Potential in der Pore und dem Potential in der Umgebung der Zellprobe erforderlich ([2]). Die Oberflächen herkömmlicher „patch-clamp“-Messgeräte („adhärente Oberflächen“) bestehen daher aus elektrisch isolierenden Materialien, auf denen Zellen gut haften, wie z.B. Glas, und sie können zusätzlich Beschichtungen aufweisen, die das Anhaften der Zellen verbessern ([1], [3]).
Zur elektrophysiologischen Messung mit dem Messgerät 100' wird die Suspension 2' in die Halteeinrichtung 10' gefüllt und durch einen Fluidkanal 11' über die Mess-Pore 22' geleitet. Eine der Zellen wird durch Anlegen eines Unterdrucks in der Mess-Perfusionskammer 21' oder einer zusätzlichen Saugeinrichtung oder durch elektrostatische Kräfte in der Mess-Pore 22' platziert ([1], [4]). Anschließend folgt an der Zelle 1' in der Mess-Pore 22' die Messung von lonenströmen durch die Membran der Zelle ([2]).
Die herkömmliche Technik, z. B. gemäß 15, hat den Nachteil, dass die verabreichte Suspension eine möglichst hohe Zelldichte (z.B. 10⁶ Zellen/ml) aufweisen muss, damit eine Zelle mit hoher Wahrscheinlichkeit auf der Mess-Pore 22' platziert werden kann. Aus [5] und [6] ist zwar bekannt, die Halteeinrichtung an der Mess-Pore als Trichter zu gestalten, der die Zellen zur Mess-Pore lenkt. Der Trichter hat jedoch nur eine grobe Zuführungsfunktion. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Zellen eine bestimmte Größe (Durchmesser z. B. < 30 µm) nicht überschreiten dürfen, damit sie in der Suspension in einem schwebenden Zustand gehalten werden können und nicht auf den Boden der Halteeinrichtung absinken. Große Zellen mit einem Durchmesser von z. B. 500 µm bis 800 µm, wie z.B. Xenopus Oozyten, lassen sich mit dem herkömmlichen planaren Messgerät nicht untersuchen. Aufgrund der Größenbeschränkung ist das „patch-clamp“-Messgerät auf die Untersuchung von kleineren Zellen beschränkt und für Zellaggregate ungeeignet.
Von Y. I. Zilberter et al. [7] wird eine elektrophysiologische Messung an einer großen zylinderförmigen Zelle (Abmessungen: 200 µm Länge, Durchmesser: 50 µm) beschrieben, die an einer Pipettenspitze positioniert ist. Die Mündung der Pipettenspitze (Mess-Pore) ist dafür ausgelegt, einen so genannten Makropatch zu bilden, der anders als bei der „patch-clamp“-Messung an einzelnen lonenkanälen eine Vielzahl von z.B. 10 bis 1000 lonenkanälen abdeckt. Ein Teil der Oberfläche der Zelle wird mit der patch-Pipette isoliert, und bei Applikation eines Potentialsprungs fällt das gesamte Potential an dem Makropatch ab. Diese Messung hat eine hohe Genauigkeit, da die restliche Membranoberfläche der Zelle viel größer als der Makropatch unter der Mess-Pore ist und damit der Widerstand der restlichen Oberfläche in Relation zum Makropatch vernachlässigbar klein ist. Dies ermöglicht eine schnelle Umladung und die Messung schneller Natriumströme. Die an einer einzelnen Zelle ausgeführte Technik gemäß [7] wurde von Schubert et al. [8] auf die Messung an einem Zellaggregat übertragen. Dabei erwies es sich jedoch als schwierig, das Zellaggregat zuverlässig an der Pipettenspitze zu halten.
Elektrophysiologische Untersuchungen von Zellaggregaten haben im Vergleich zur Messung an Einzelzellen den Vorteil, dass im Zellaggregat eine dreidimensionale, „in vivo“-ähnliche Mikroumgebung der Zellen geschaffen wird. Besonderes Interesse besteht dabei an Zellaggregaten aus differenzierten Zellen, insbesondere Stammzellen (so genannter „Organoid“, „Spheroid“, „Cell Aggregate“, oder „Cell Cluster“, insbesondere „Cardiac Body“) und/oder aus Gewebefasern, wie z. B. Muskelfasern. Zellen in dreidimensionalen Strukturen wachsen generell unter ähnlichen Bedingungen wie in nativem Gewebe und sind deshalb besonders geeignet für z. B. toxikologische, pharmakologische und physiologische „patch-clamp“-Untersuchungen. Zellaggregate begünstigen ferner Differenzierungsprozesse der Einzelzellen, und sie weisen homogenere Eigenschaften auf ([9]), was sich auf die Homogenität z. B. von gemessenen Aktionspotentialen auswirkt. So haben die Aktionspotentiale von einzelnen Herzzellen eine hohe Variabilität, z. B. der Länge des Aktionspotentials und des Ruhepotentials. Diese Variabilität erschwert es, zu statistisch signifikanten Aussagen über Veränderungen am Aktionspotential bei Testung von Substanzen zu gelangen ([10]). Im Aggregat hingegen wird die Variabilität ausgeglichen, da Einzelzellen innerhalb des Aggregates durch Nexuskontakte (elektrische Verbindungen zwischen benachbarten Zellen) verbunden sind. Ein Aggregat aus differenzierten Stammzellen ähnelt durch diese synzytiale Struktur einem Herzmuskelsegment. Auf Basis der Nexuskontakte können sich Aktionspotentiale in Aggregaten, wie in nativen Muskeln, ausbreiten und gemessen werden. Substanztestungen an Aggregaten können mit weniger Variabilität als an Einzelzellen erfolgen.
Ein Nachteil der Zellaggregate besteht jedoch darin, dass keine elektrophysiologischen Messgeräte verfügbar sind, mit denen unter praktischen Bedingungen routinemäßig und zuverlässig an Zellaggregaten gemessen werden kann. Ein weiter Nachteil der Messung an Zellaggregaten besteht darin, dass diese aufgrund der Ausbildung von Myofibrillen zwischenzelluläre Kräfte und Kontraktionen zeigen, so dass sich ihre Größe und Form während der Messung wiederholt ändern. Es sind verschiedene Messvorrichtungen bekannt, mit denen die Kontraktionen z. B. mit optischen Mitteln oder einer Impedanzmessung untersucht wird. Die Kontraktionen stellen eine Herausforderung bei elektrophysiologischen Untersuchungen dar, da sie den Kontakt des Zellaggregats zur Mess-Pore (den „seal-Widerstand“) verändern und damit das Ergebnis einer „patch-clamp“-Messung beeinträchtigen können ([2]). Auswirkungen von Kontraktionen auf das Ergebnis elektrophysiologischer Untersuchungen können zwar vermieden werden, wenn ein Zellaggregat auf dem Messgerät festgespannt wird, wie von M. Hencek et al. [11] bei einer Untersuchung an einer Herzmuskelfaser mit dem „voltage-clamp“-Verfahren gezeigt wurde. Das Aufspannen von Muskelfasern kann jedoch nicht auf die Untersuchung empfindlicher Zellaggregate übertragen werden.
Ein weiterer Nachteil der Messung an Zellaggregaten besteht darin, dass Zellzwischenräumen unter physiologischen Bedingungen mit einer elektrisch leitenden, wässrigen Flüssigkeit gefüllt sind, die durch Leckströme zwischen den Zellen außerhalb der Nexuskontakte die elektrophysiologische Untersuchung beeinträchtigen kann. Von M. Hencek et al. [11] wurde daher die Flüssigkeit in den Zellzwischenräumen der Muskelfaser mittels Perfusion durch eine nicht-leitende Saccharose-Lösung ersetzt. Die Perfusion der Oberfläche der aufgespannten Muskelfaser erfolgte durch eine Ringöffnung, die konzentrisch um die Mess-Pore angeordnet ist. Zellaggregate haben jedoch eine runde Form, was die Perfusion eines Abschnittes des Aggregates erschwert.
Ein weiteres Problem ergibt sich daraus, dass herkömmliche elektrophysiologische Messgeräte keine gleichzeitigen Messungen insbesondere von Aktionspotentialen und lonenströmen an Zellaggregaten ermöglichen. Für die lonenstrommessungen („patch-clamp“) oder Aktionspotentialmessungen („current-clamp“) an Einzelzellen enthalten diese Messgeräte jeweils eine Elektrode. Für die gleichzeitige Erfassung von Aktionspotentialen und lonenströmen wären jedoch mindestens zwei ableitende Elektroden und eine ausreichende Isolation der Aggregatoberfläche unter der Mess-Pore erforderlich. Die für „patch-clamp“-Messungen an Aggregaten oder Oozyten erforderlichen patch-Poren („Makropatches“) sind größer (z.B. Durchmesser > 2 µm bis 100 µm) als für „patch-clamp“ Messungen an Einzelzellen und können bei Messungen an Aggregaten mehr als eine Zelloberfläche umfassen.
Schließlich ist kein bekanntes elektrophysiologisches Messgerät für zuverlässige und reproduzierbare „patch-clamp“-Messungen an Zellaggregaten geeignet, da einzelne Zellaggregate oder große Zellen nicht gezielt in einer Mess-Pore positioniert werden können. Eine gezielte Applikation von Aggregaten oder großen Zellen ist jedoch besonders wichtig bei Hochdurchsatzverfahren, wenn die Messungen an mehreren Aggregaten oder Oozyten gleichzeitig erfolgen und die Aggregate oder Oozyten mit automatischen Pipettiersystemen verabreicht werden sollen. Einzelne Aggregate oder große Zellen, die ggf. ungezielt in ein Zellreservoir (15) verabreicht werden, sinken unter Schwerkrafteinwirkung auf die adhärente Oberfläche neben die Mess-Pore, wo sie anhaften und für lonenstrommessungen nicht mehr verwendbar sind. Ferner wäre die Zufuhr einer Suspension mit einer Vielzahl von Zellaggregaten oder großen Zellen nachteilig, da dies die benötigten Zellmengen stark erhöhen und damit hohe Kosten verursachen würde.
Aufgrund der genannten Herausforderungen ist kein Hochdurchsatz-Testgerät und auch kein Messkit verfügbar, mit dem Zellaggregate zuverlässig untersucht werden können. In [6] wird zwar erwähnt, dass sich in einem Trichter über einer Mess-Pore ein Zellhaufen bilden kann. Dabei handelt es sich jedoch nicht um Zellaggregate, die durch Differenzierungsprozesse geprägt sind und aus miteinander gewachsenen und verbundenen Zellen bestehen. Die elektrophysiologische Messung erfolgt in [6], mit extrazellulären Elektroden an Zellhaufen, die sich ggf. im Trichterbereich bilden.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes elektrophysiologisches Messgerät und ein verbessertes elektrophysiologisches Messverfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe bereitzustellen, mit denen Nachteile und Beschränkungen herkömmlicher Techniken vermieden werden können. Das Messgerät bzw. das Messverfahren sollen insbesondere elektrophysiologische Untersuchungen mit erhöhter Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit ermöglichen, für die Untersuchung von Zellaggregaten und/oder größeren Zellen geeignet sein, einen erweiterten Anwendungsbereich aufweisen, für Hochdurchsatzverfahren (insbesondere Hochdurchsatztestverfahren) geeignet sein, eine Halterung der Zellprobe mit erhöhter Stabilität ermöglichen und/oder die gleichzeitige Messung verschiedener elektrischer Messwerte ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, ein verbessertes Hochdurchsatz-Testgerät und ein verbessertes elektrophysiologisches Messkit zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe bereitzustellen, mit dem Nachteile und Beschränkungen herkömmlicher Techniken vermieden werden können.
Diese Aufgaben werden durch ein Messgerät, ein Messverfahren, ein Hochdurchsatz-Testgerät bzw. ein Messkit mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Anwendungen und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein elektrophysiologisches Messgerät gelöst, das zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe eingerichtet ist. Das Messgerät umfasst mindestens eine Halteeinrichtung, eine Perfusionseinrichtung, eine Elektrodeneinrichtung und eine Messeinrichtung.
Die Halteeinrichtung weist einen Innenraum auf, der zur Aufnahme der Zellprobe mit einer charakteristischen Größe (maximale Querschnittsdimension, z. B. Durchmesser) insbesondere im Bereich von 50 µm bis 1 mm in einem physiologischen Umgebungsmedium ausgelegt ist. Die Halteeinrichtung hat einen Bodenbereich, der einen Teilbereich der Halteeinrichtung an deren Unterseite umfasst. Der Bodenbereich kann eine Bodenwand mit mindestens einer Perfusionsöffnung umfassen oder hin zu der Perfusionseinrichtung offen sein (Bodenöffnung). Der Bodenbereich ist horizontal ausgerichtet. Die Vertikalrichtung wird auch als Längsrichtung der Halteeinrichtung bezeichnet. Des Weiteren hat die Halteeinrichtung einen Wandbereich, der die Halteeinrichtung seitlich quer zu der Längsrichtung begrenzt. An der Oberseite ist die Halteeinrichtung offen oder durch einen Deckel verschlossen.
Die Perfusionseinrichtung umfasst eine oder mehrere Mess-Perfusionskammern. Jede Mess-Perfusionskammer ist zur Aufnahme eines Perfusionsmediums konfiguriert und an mindestens einer Mess-Perfusionsöffnung (auch als Perfusionspore bezeichnet) hin zum Innenraum der Halteeinrichtung offen. Die Innenform der Mess-Perfusionskammer ist frei wählbar und vorzugsweise eine Quaderform, eine Zylinderform oder eine langgestreckte Kanalform oder eine Zusammensetzung aus diesen. Die Mess-Perfusionskammer kann einteilig geformt und über eine einzige, vorzugsweise kreisförmige Mess-Perfusionsöffnung mit dem Innenraum der Halteeinrichtung verbunden sein (einseitige Perfusion). Die Mess-Perfusionskammer kann alternativ mehrteilig geformt und über mehrere, vorzugsweise kreisförmige Mess-Perfusionsöffnungen mit dem Innenraum der Halteeinrichtung verbunden sein (durchströmende Perfusion). Des Weiteren können zwei oder mehr Mess-Perfusionskammern jeweils über eine oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen mit dem Innenraum der Halteeinrichtung verbunden sein. Des Weiteren können zwei oder mehr Halteeinrichtungen vorgesehen sein, die gemeinsam mit mindestens einer Mess-Perfusionskammer oder getrennt mit mehreren Mess-Perfusionskammern verbunden sind. Wenn mehrere Mess-Perfusionsöffnungen vorgesehen sind, können diese den gleichen Durchmesser oder verschiedene Durchmesser aufweisen. Eine in der Mess-Perfusionsöffnung positionierte Zellprobe ist durch die Mess-Perfusionsöffnung(en) mit einem Perfusionsmedium in der zugehörigen Mess-Perfusionskammer perfundierbar. Eine zum Innenraum der Halteeinrichtung weisende Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung(en) ist aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet.
Vorzugsweise ist jede Mess-Perfusionskammer für eine Durchströmung mit dem Perfusionsmedium, Spülung der Zellprobe mit dem Perfusionsmedium und/oder die Bildung eines Über- oder Unterdrucks im Perfusionsmedium (relativ zum Druck in der Halteeinrichtung) ausgelegt und hierzu jeweils mit einer Druckeinrichtung und Steuerelementen, wie z. B. Ventilen ausgestattet und zur Verbindung mit einem Flüssigkeitsreservoir des jeweiligen Perfusionsmediums ausgelegt. Die Perfusionskammern der Perfusionseinrichtung sind insbesondere für eine individuelle Einstellung eines Unterdrucks an der jeweils zugehörigen Perfusionsöffnung ausgelegt.
Die Elektrodeneinrichtung weist eine oder mehrere Mess-Elektroden auf. Jede Mess-Elektrode ist in Bezug auf jeweils eine Mess-Perfusionskammer so angeordnet, dass bei Befüllung der Mess-Perfusionskammer mit einem Perfusionsmedium ein elektrischer Kontakt mit dem Perfusionsmedium gegeben ist. Die Mess-Elektrode ist in der Mess-Perfusionskammer oder in einem mit der Mess-Perfusionskammer verbundenen Raum, wie z. B. einer Flüssigkeitsleitung, angeordnet. Die Messeinrichtung, die vorzugsweise mindestens einen Spannungsverstärker und/oder Operationsverstärker umfasst, ist zur Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der mindestens einen Mess-Elektrode verbunden.
Gemäß der Erfindung weist der Innenraum der Halteeinrichtung in einem Teilbereich, der benachbart (oder: angrenzend) zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer angeordnet ist, mindestens einen Fixierabschnitt auf. Die Anordnung benachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer bedeutet vorzugsweise, dass der Fixierabschnitt die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung enthält, die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung zum Wandbereich der Halteeinrichtung mündet, die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung zum Bodenbereich der Halteeinrichtung mündet, und/oder die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung mit einem Abstand vom Bodenbereich gleich der Höhe einer Perfusionskammer angeordnet ist.
Der mindestens eine Fixierabschnitt zeichnet sich durch derartige geometrische Eigenschaften des Innenraums der Halteeinrichtung aus, dass die Zellprobe in dem Fixierabschnitt in einem deformierten, z. B. elongierten, eingeschnürten und/oder komprimierten Zustand, fixierbar ist. Geometrische Eigenschaften, insbesondere umfassend einen Innendurchmesser des Fixierabschnitts, eine axiale Länge des Fixierabschnitts in einer Längsrichtung der Halteeinrichtung (insbesondere senkrecht zur Randfläche der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung) und/oder eine Neigung der Innenwand des Fixierabschnitts hin zur mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung, sind so gewählt, dass die Zellprobe in dem Fixierabschnitt ortsfest positionierbar ist (Konfiguration des Fixierabschnitts für eine Deformation der Zellprobe).
Der Innendurchmesser des Fixierabschnitts ist vorzugsweise geringer als 400 µm, insbesondere geringer als 100 µm. Der Fixierabschnitt ist so geformt, dass die Haltekraft, die im Fixierabschnitt auf die deformierte Zellprobe wirkt, größer als intrazelluläre Deformationskräfte der Zellprobe, Druckkräfte an der jeweiligen Mess-Perfusionsöffnung (und/oder ggf. mindestens einer weiteren Perfusionsöffnung) und/oder Perfusions-Strömungskräfte im Innenraum der Halteeinrichtung an der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung ist.
Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein elektrophysiologisches Messverfahren, vorzugsweise unter Verwendung des Messgeräts gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung gelöst, wobei folgenden Schritte vorgesehen sind. Die Zellprobe wird an einer Halteeinrichtung bereitgestellt, indem die Zellprobe mit einer Trägerflüssigkeit (Suspensionsflüssigkeit) in einen Innenraum der Halteeinrichtung geliefert wird. Die Zellprobe umfasst ein Zellaggregat aus differenzierten Zellen, wie z. B. differenzierten Stammzellen (so genannter „Organoid“, „Spheroid“, „Cell Aggregate“, oder „Cell Cluster“, insbesondere „Cardiac Body“) und/oder Gewebefasern, wie z. B. Muskelfasern, oder eine große Einzelzellen mit einem Durchmesser von mindestens 500 µm. Eine Perfusionseinrichtung wird derart mit einem Unterdruck beaufschlagt, dass die Zellprobe in mindestens einen Fixierabschnitt der Halteeinrichtung bis zur Mess-Perfusionsöffnung gezogen wird. In dem mindestens einen Fixierabschnitt wird die Zellprobe deformiert, z. B. elongiert, eingeschnürt und/oder quer zur Längsrichtung der Halteeinrichtung komprimiert. Der Durchmesser der Zellprobe im Fixierabschnitt ist quer zur Längsrichtung der Halteeinrichtung vorzugsweise geringer als 400 µm, insbesondere geringer als 100 µm. Zellproben, wie insbesondere Zellaggregate, z. B. Spheroid-Aggregate, oder große Einzelzellen, weisen eine Elastizität auf, die eine Kompression der Zellprobe ohne einen Funktionsverlust ermöglicht. Im deformierten Zustand wirken elastische Rückstellkräfte auf die Innenseite, z. B. Innenwand des Fixierabschnitts, unter deren Wirkung die Zellprobe im Fixierabschnitt ortsfest positioniert ist. Wenn die Zellprobe in mindestens einer Mess-Perfusionsöffnung in dem mindestens einem Fixierabschnitt sitzt, wird die Perfusionseinrichtung so betrieben, dass die Mess-Perfusionskammer von einem Perfusionsmedium durchströmt und die an der Mess-Perfusionsöffnung frei liegende Oberfläche der Zellprobe mit dem Perfusionsmedium gespült wird. Es wird mit der Messeinrichtung mindestens ein elektrischer Messwert der Zellprobe erfasst, der zur elektrophysiologischen Charakterisierung der Zellprobe geeignet ist. Vorzugsweise erfolgt die Positionierung und Fixierung der Zellprobe auf Mess-Perfusionsöffnungen für die Messung von lonenströmen durch Membranoberflächen, z. B. von Aggregaten (Aggregat-patches) mit Hilfe der patch-clamp Technik (z. B. [2]) und/oder die Messung von Aktionspotentialen und/oder Oberflächenpotentialen. Vorteilhafterweise kann nach der Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts die Zellprobe aus dem elektrophysiologischen Messgerät entnommen und für biochemische und molekularbiologische Untersuchungen aufgearbeitet und/oder in ein Zellkulturgefäß überführt werden.
Gemäß einem dritten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Hochdurchsatz-Testgerät gelöst, das eine Vielzahl von Messgeräten gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung umfasst.
Gemäß einem vierten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Messkit (Test-Kit) gelöst, welches das Messgerät gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung und mindestens eine Testsubstanz mit einer physiologischen, insbesondere arrhythmogenen, Wirkung auf die Zellprobe umfasst. Vorzugsweise ist die mindestens eine Testsubstanz zur Beeinflussung von Parametern des Aktionspotentials, insbesondere Anstiegssteilheit, Länge und/oder Auftreten von Nachpotentialen, und/oder von lonenströmen (Hemmung-Stimulation) geeignet.
Im Unterschied zu den herkömmlichen Techniken zeichnet sich das erfindungsgemäße Messgerät durch den Fixierabschnitt der Halteeinrichtung aus. Anders als bei elektrophysiologischen Untersuchungen an Pipettenspitzen oder an Mess-Poren von planaren Messgeräten erlaubt der Fixierabschnitt, Zellaggregate und/oder große Zellen zuverlässig an der Mess-Perfusionsöffnung zu halten. Selbst wenn rhythmische Deformationen der Zellprobe auftreten, kann diese stabil in der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung gehalten werden, so dass unerwünschte Einflüsse auf das Ergebnis der elektrophysiologischen Untersuchung vermieden werden. Die Halterung der Zellprobe durch einen Unterdruck an der Mess-Perfusionsöffnung wird mit der Erfindung verbessert, was einen Vorteil im Vergleich zu herkömmlichen Techniken darstellt. Es können mehrere Mess-Perfusionsöffnungen zum mindestens einen Fixierabschnitt benachbart angeordnet sein, z. B. in den Fixierabschnitt münden, so dass sich neue Anwendungen, z. B. hinsichtlich der gleichzeitigen Messung von lonenströmen und Aktionspotentialen ergeben. Durch Wandschluss mit der Innenwand der Halteeinrichtung in dem Fixierabschnitt kann die Zellprobe in der Halteeinrichtung bereits vor dem Herstellen eines Kontaktes (seal-Kontakt) mit der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung von einem Flüssigkeitssog erfasst und in Richtung der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung gesaugt werden. Dieses gezielte Positionieren einer Zellprobe auf der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung durch den Ansaugvorgang beschleunigt vorteilhafterweise den Messvorgang.
Vorteilhafterweise ist die Erfindung insbesondere für Hochdurchsatzverfahren geeignet, indem das erfindungsgemäße Messgerät mit einer Vielzahl von Halteeinrichtungen jeweils mit einem oder mehreren Fixierabschnitten ausgestattet und/oder eine Vielzahl von erfindungsgemäßen Messgeräten zu dem Hochdurchsatz-Testgerät kombiniert werden, wodurch eine Vielzahl von Zellproben gleichzeitig untersucht werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Innenraum der Halteeinrichtung des Weiteren einen Führungsabschnitt aufweisen, der ein größeres Volumen als der Fixierabschnitt aufweist und entgegengesetzt zur Position der Mess-Perfusionsöffnung zu dem Fixierabschnitt benachbart angeordnet ist. Die Halteeinrichtung ist vorzugsweise zweistufig mit dem Führungsabschnitt und dem Fixierabschnitt aufgebaut, die jeweils eine Funktion der Halteeinrichtung hinsichtlich der Zuführung und der Fixierung der Zellprobe erfüllen. Vorteilhafterweise vereinfacht der Führungsabschnitt mit dem größeren Volumen die Zuführung der Zellprobe zu dem Fixierabschnitt, indem der Führungsabschnitt zusätzlich zur Zellprobe ein größeres Volumen der Trägerflüssigkeit aufnimmt und damit die Zuführung der Zellprobe zu dem Fixierabschnitt vereinfacht.
Besonders bevorzugt weist der Führungsabschnitt eine Trichterform auf, die sich hin zum Fixierabschnitt verjüngt. Vorteilhafterweise ist der Führungsabschnitt somit an seiner weiteren Oberseite zur Aufnahme der Zellprobe in einem nicht-deformierten, insbesondere nicht-komprimierten (entspannten) Zustand und für ein Deformieren der Zellprobe beim Ansaugen in den Fixierabschnitt konfiguriert. Vorteilhafterweise wird durch die Trichterform des Führungsabschnitts die Zellprobe unter der Wirkung der Schwerkraft gezielt hin zum Fixierabschnitt bewegt. Der Führungsabschnitt der Halteeinrichtung kann in mehre Fixierabschnitte münden, die jeweils eine oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen aufweisen.
Vorteilhafterweise ist der Fixierabschnitt durch die deformierte Zellprobe in axialer Richtung (Längsrichtung der Halteeinrichtung) verschlossen, so dass der mindestens eine Fixierabschnitt eine Durchmischung einer Suspensionsflüssigkeit in der Halteeinrichtung und eines Perfusionsmediums zumindest während des Messzeitraums behindert. Dies ist besonders unter Messbedingungen von Vorteil, wenn die Zellprobe kontinuierlich perfundiert wird, d.h. das Perfusionsmedium in der mindestens einen Perfusionskammer stetig erneuert wird.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht in der Variabilität der Position der Mess-Perfusionsöffnung relativ zum Fixierabschnitt. Gemäß einer ersten Variante der Erfindung mündet die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer in dem Bodenbereich der Halteeinrichtung. In diesem Fall können sich Vorteile aus einer in radialen Richtungen allseits gleichartigen Haltekraft der Zellprobe im Fixierabschnitt und für den Aufbau des Messgeräts als Fluidikchip ergeben. Alternativ oder zusätzlich mündet die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung gemäß einer zweiten Variante der Erfindung in dem Wandbereich der Halteeinrichtung in einer radialen Richtung in den Innenraum der Halteeinrichtung. Vorteilhafterweise ermöglicht dies durch Anlegen eines Unterdrucks die zusätzliche Fixierung der Zellprobe auf der Mess-Perfusionsöffnung, eine seitliche Perfusion der Zellprobe oder sogar, bei Bereitstellung von zwei Mess-Perfusionsöffnungen eine Durchströmung der Zellprobe mit dem Perfusionsmedium. Beide Varianten können kombiniert sein, indem bei zwei übereinander angeordneten Perfusionskammern eine erste Mess-Perfusionsöffnung lateral am Wandbereich in die Halteeinrichtung mündet und eine zweite Mess-Perfusionsöffnung axial unterhalb des Bodenbereichs der Halteeinrichtung mündet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Perfusionseinrichtung mindestens zwei Mess-Perfusionskammern auf, die in der Konfiguration des Messgeräts übereinander angeordnet sind. Eine untere Mess-Perfusionskammer mündet über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung hin zum Bodenbereich der Halteeinrichtung. Mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer, die über der unteren Mess-Perfusionskammer angeordnet ist/sind, mündet seitlich über eine allseits umlaufende Mess-Perfusionsöffnung am Wandbereich der Halteeinrichtung. Die Anordnung von mindestens zwei Mess-Perfusionskammern kann mehrere Vorteile haben. Die Mess-Perfusionskammern können für die gleichzeitige Messung verschiedener elektrophysiologischer Größen verwendet werden. Des Weiteren können die Mess-Perfusionskammern als Kanäle mit einer derart geringen Höhe konfiguriert sein, dass eine laterale Deformation der Zellprobe bei der Perfusion durch die mindestens eine umlaufende Mess-Perfusionsöffnung vermieden wird. Gemäß vorteilhaften Ausführungsformen des Messverfahrens kann dabei der im Fixierabschnitt fixierte Teil der Zellprobe an die unterhalb des Fixierabschnitts angeordnete Mess-Perfusionsöffnung gesaugt werden, die mit einer separaten Saugleitung und separaten Unterdruckkammern oder Mikrofluidkanälen verbunden ist.
Vorteilhafterweise kann die mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer an der umlaufenden Mess-Perfusionsöffnung eine kammerförmige Ausnehmung aufweisen, die so angeordnet ist, dass Perfusionsmedium in der kammerförmigen Ausnehmung die Zellprobe allseits umspülen kann. Damit wird eine allseitige Perfusionswirkung verbessert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Perfusionseinrichtung mindestens eine Isolations-Perfusionskammer aufweisen, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden Isolationsmediums konfiguriert ist und über mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung mit dem Innenraum der Halteeinrichtung, insbesondere an den Fixierabschnitt angrenzend oder in diesen mündend, verbunden ist. Die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung ist vorzugsweise jeweils benachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer angeordnet. Bei Beaufschlagung des Isolationsmediums in einer Isolations-Perfusionskammer mit einem Überdruck ist die Zellprobe im Fixierabschnitt mit dem Isolationsmedium perfundierbar. Über die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung kann das Isolationsmedium in die Zellprobe gepresst werden, um das physiologische, salzhaltige Medium in den Zellzwischenräumen durch das Isolationsmedium zu ersetzen. Das Isolationsmedium umfasst z. B. eine Saccharose- und/oder Glukose-Lösung in deionisiertem Wasser oder eine andere isoosmolare ionenfreie Flüssigkeit. Die mindestens eine Isolations-Perfusionskammer ist mit einer Druckeinrichtung und Steuerelementen, wie z. B. Ventilen ausgestattet und zur Verbindung mit einem Flüssigkeitsreservoir des jeweiligen Isolationsmediums ausgelegt.
Vorzugsweise wird die Isolations-Perfusionsöffnung, die mit einem Isolationsmedium durchspült wird, mit einem anderen Druck als die Mess-Perfusionsöffnung beaufschlagt. Vorteilhafterweise wird die Zellprobe dabei nicht nur im Fixierabschnitt seitlich komprimiert, sondern auch in der Längsrichtung elongiert (länglich deformiert), was die Durchspülung des elongierten Abschnittes der Zellprobe mit Isolationsmedium verbessert. Dies geschieht durch das Einsaugen in den Fixierabschnitt und das gleichzeitige Einsaugen in eine darunter befindliche Mess-Perfusionsöffnung.
Die Ausführungsform mit der mindestens einen Isolations-Perfusionskammer hat insbesondere bei der Messung von Zellaggregaten den Vorteil, dass Leckströme zwischen den Zellen des Zellaggregats außerhalb der Nexuskontakte vermindert oder sogar vollständig ausgeschlossen werden. Diese Verringerung der Leckströme ist zumindest in der Umgebung der Mess-Perfusionsöffnung, vorzugsweise jedoch in des gesamten des Zellaggregats gegeben. Die erfindungsgemäße Deformation des Zellaggregats im Fixierabschnitt hat dabei den besonderen Vorteil, dass durch eine Verengung des Zellaggregats leitende Flüssigkeit in den Zellzwischenräumen verdrängt und der zu spülende Raum verkleinert wird, so dass sich die Effektivität der Perfusion mit dem Isolationsmedium verbessert. Vorteilhafterweise erfolgt eine Verformung der Spheroide von einer Kugelform in eine längliche Ellipsoidform oder eine eingeschnürte und elongierte Form, so dass bei einer Durchspülung des Zellaggregats mit dem Isolationsmedium dieses einen möglichst kurzen Weg durch das Zellaggregat fließt.
Die Perfusion mit einem isolierenden Medium kann bei Anwendungen der Erfindung unterbleiben, bei denen Leckströme zwischen den Zellen des Zellaggregats außerhalb der Nexuskontakte eine vernachlässigbare Störung darstellen oder bereits durch die Verdrängung von leitenden Medien in den Zellzwischenräumen durch Zelldifferenzierungsprodukte in der Zellprobe vermindert oder ausgeschlossen sind. In diesen Fällen kann auf die Isolations-Perfusionskammer verzichtet werden.
Vorteilhafterweise besteht auch eine Variabilität der Position der mindestens einen Isolations-Perfusionsöffnung relativ zum Fixierabschnitt. Die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung kann z. B. im Bodenbereich der Halteeinrichtung und/oder für eine laterale Perfusion der Zellprobe am Wandbereich der Halteeinrichtung in den Innenraum der Halteeinrichtung, insbesondere hin zum Fixierabschnitt münden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung und die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer so angeordnet sein, dass die Isolations-Perfusionsöffnung die Mess-Perfusionsöffnung umgibt. Vorzugsweise sind die Perfusionsöffnungen zueinander konzentrisch angeordnet. Diese Ausführungsformen der Erfindung haben den Vorteil, dass die Isolations-Perfusionsöffnung neben der Perfusionsfunktion zusätzlich den „seal“-Widerstand der Zellprobe erhöht. Vorteilhafterweise ist eine hohe Gestaltungsfreiheit auch für die Isolations-Perfusionsöffnung gegeben, deren Position insbesondere im Bodenbereich oder im Wandbereich der Halteeinrichtung gewählt sein kann. Wenn die Isolations-Perfusionsöffnung im Wandbereich der Halteeinrichtung angeordnet ist, können eine Isolationslösung durch einen radialen Kanal fließen und durch ein gleichzeitiges „ringförmiges Ansaugen“ der Zellprobe die Fixierung auf der Mess-Perfusionsöffnung verbessert werden.
Gemäß einer weiteren, besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können die Isolations-Perfusionskammer und die mindestens eine Mess-Perfusionskammer axial übereinander (d. h. axial entlang der Längsausdehnung der Halteeinrichtung) angeordnet sein. Eine untere Mess-Perfusionskammer mündet mit einer zentralen Mess-Perfusionsöffnung am Bodenbereich der Halteeinrichtung, während die Isolations-Perfusionskammer oberhalb der unteren Mess-Perfusionskammer mit einer allseits umlaufenden Isolations-Perfusionsöffnung am Wandbereich der Halteeinrichtung mündet. Es können insbesondere mindestens zwei Mess-Perfusionskammern übereinander angeordnet sein, die eine untere Mess-Perfusionskammer und eine mittlere Mess-Perfusionskammer umfassen, über der die Isolations-Perfusionskammer angeordnet ist. Die untere Mess-Perfusionskammer weist die zentrale Mess-Perfusionsöffnung auf, die durch die mittlere Mess-Perfusionskammer und die Isolations-Perfusionskammer zum Bodenbereich der Halteeinrichtung hin offen ist. Die mittlere Mess-Perfusionskammer und die Isolations-Perfusionskammer münden jeweils über umlaufende Perfusionsöffnungen am Wandbereich der Halteeinrichtung.
Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung und/oder die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung für eine laterale Perfusion der Zellprobe am Wandbereich der Halteeinrichtung konfiguriert sind, ist besonders bevorzugt vorzugsweise an der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung und/oder der mindestens einen Isolations-Perfusionsöffnung eine Rückhalteeinrichtung angeordnet, die für Perfusionsflüssigkeiten durchlässig und für die Zellprobe undurchlässig ist. Besonders bevorzugt ist die Rückhalteeinrichtung mit dem Wandbereich der Halteeinrichtung fluchtend ausgerichtet. Vorteilhafterweise ermöglicht die Rückhalteeinrichtung, dass eine laterale Deformation der Zellprobe bei der Perfusion durch die mindestens eine umlaufende Perfusionsöffnung vermieden und die Zellprobe stabilisiert wird.
Vorzugsweise umfasst die Rückhalteeinrichtung ein poröses Material, insbesondere mit Porengrößen im Bereich von 100 nm bis 1 um, ein Material mit durchgehenden Kanälen, insbesondere mit Durchmessern im Bereich von 100 nm bis 1 um, ein Filtermaterial und/oder eine Verteilung von Säulenelementen, z. B. quaderförmige oder säulenförmige oder runde Säulenelemente.
Mit der Rückhalteeinrichtung wird eine zusätzliche Fixierung der Zellprobe insbesondere auf der zentralen Mess-Perfusionsöffnung erzielt, die senkrecht zwischen den Plattenelementen vorgesehen ist. Durch die Bereitstellung der Rückhalteeinrichtung werden seitlich einwirkende Strömungskräfte (Wasserhammereffekte) minimiert und die Zellprobe am Bodenbereich und darunter in seitlicher Richtung stabilisiert. Dadurch werden Störungen des Kontaktes zwischen Zellprobe und zentraler Mess-Perfusionsöffnung vermindert.
Zusätzlich kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Perfusionseinrichtung eine Test-Perfusionskammer aufweisen, die zur Aufnahme einer Testsubstanz konfiguriert ist und über eine Test-Perfusionsöffnung mit der Halteeinrichtung, benachbart zum Fixierabschnitt oder in diesen mündend, verbunden ist. Die Test-Perfusionsöffnung ist vorzugsweise in dem Wandbereich der Halteeinrichtung angeordnet. Vorteilhafterweise ermöglicht die Test-Perfusionskammer, der Zellprobe die Testsubstanz unabhängig von der chemischen Zusammensetzung des Perfusionsmediums in der Mess-Perfusionskammer zuzuführen. Die Vergleichbarkeit von elektrophysiologischen Messungen, die aufeinanderfolgend oder parallel mit einem Perfusionsmedium, aber mit verschiedenen Testsubstanzen durchgeführt werden, wird dadurch verbessert.
Vorteilhafterweise kann die Perfusionseinrichtung zusätzlich mindestens eine Unterdruck-Kammer aufweisen, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden, inerten Druckmediums konfiguriert ist und über mindestens eine Saugleitung mit einer Saugöffnung mit der Halteeinrichtung verbunden ist. Die mindestens eine Saugöffnung ist vorzugsweise zusätzlich zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung vorgesehen. Die mindestens eine Unterdruck-Kammer und die mindestens eine Saugöffnung sind dafür konfiguriert, bei Beaufschlagung des Druckmediums in der mindestens einen Unterdruck-Kammer mit einem Unterdruck die Zellprobe im Fixierabschnitt anzusaugen. Vorzugsweise ist die mindestens eine Saugöffnung in dem Bodenbereich des Fixierabschnitts angeordnet. Daraus ergeben sich die Vorteile, dass ein Einsaugen der Zellprobe über die gesamte Länge des Fixierabschnitts hin erzielt und damit die Stabilität der Aufnahme der Zellprobe im Fixierabschnitt optimiert wird. Randbereiche der Zellprobe neben der Mess-Perfusionsöffnung werden zusätzlich immobilisiert und dynamische Veränderungen im Leck-Strom durch Kontraktionen werden vermindert. Alternativ oder zusätzlich ist die mindestens eine Saugöffnung in dem Wandbereich des Fixierabschnitts angeordnet. Auch in diesem Fall ergibt sich der Vorteil, dass die Immobilisierung der Zellprobe im Fixierabschnitt verbessert werden kann.
Die mindestens eine Saugöffnung kann ringförmig gebildet sein und jeweils eine Mess-Perfusionsöffnung umgeben. Vorteilhafterweise wird damit ein gleichmäßiges Ansaugen des Randbereiches der Zellprobe erreicht, wodurch Bewegungs- oder Positionierungsartefakte weiter gemindert und die Bildung des „seal“-Widerstands verbessert werden.
Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung können mehrere Saugöffnungen vorgesehen sein, wie z. B. eine Saugöffnung im Bodenbereich und eine oder mehr Saugöffnungen im Wandbereich. Die Saugöffnungen können jeweils mit einer separaten Unterdruck-Kammer verbunden sein, so dass sie vorteilhafterweise jeweils mit einem spezifischen Unterdruck beaufschlagt werden können.
Vorteilhafterweise können die genannten Funktionen der mindestens einen Isolations-Perfusionsöffnung und der mindestens einen Saugöffnung von mindestens einer Öffnung erfüllt werden, an der sequentiell zuerst ein Isolationsmedium mit einem Unterdruck beaufschlagt wird, um die Zellprobe in den Fixierabschnitt zu ziehen, und anschließend das Isolationsmedium mit einem Überdruck beaufschlagt wird, um die Zellprobe zu perfundieren. Bei der sequentiellen Nutzung der mindestens einen Öffnung kann ferner ein Medienwechsel erfolgen, indem zum Ansaugen zunächst eine physiologische Lösung und zum Perfundieren das Isolationsmedium zugeführt werden.
Mit der Messeinrichtung wird mindestens ein elektrischer Messwert der Zellprobe erfasst, der gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung einen lonenstrom durch mindestens eine Zellmembran einer Zelle der Zellprobe und/oder ein an einer Zellmembran generiertes Aktionspotential umfasst. Vorteilhafterweise können somit erfindungsgemäß „patch clamp“- und/oder „voltage clamp“-Messungen durchgeführt werden.
Besonders bevorzugt weisen die Perfusionseinrichtung zwei Mess-Perfusionskammern und die Messeinrichtung zwei Messkreise auf. Vorteilhafterweise ermöglicht dies die gleichzeitige Messung verschiedener elektrophysiologischer Größen. Beispielsweise ist die gleichzeitige Messung sowohl des lonenstroms als auch des Aktionspotentials an einer Zellprobe vorgesehen. In diesem Fall weisen die Perfusionseinrichtung mindestens zwei Mess-Perfusionskammern und die Messeinrichtung mindestens zwei Messkreise auf, die jeweils für die Erfassung des Aktionspotentials der Zellprobe oder des lonenstroms durch eine Membran der Zellprobe konfiguriert sind. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den besonderen Vorteil, dass insbesondere Zellaggregate vollständig charakterisiert werden kann, ohne das Messgerät zu wechseln, was mit herkömmlichen Techniken nicht möglich war. An jeder Halteeinrichtung des Messgeräts können eine oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen für die lonenstrommessung und oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen für die Aktionspotentialmessung vorgesehen sein.
Die Halteeinrichtung kann mehrere, insbesondere zwei Fixierabschnitte aufweisen, was insbesondere von Vorteil ist, wenn mehrere Mess-Perfusionskammern vorgesehen sind. Die Fixierabschnitte verbessern die Halterung der Zellprobe an den jeweiligen Perfusionsöffnungen. Besonders bevorzugt sind hierzu die Mess-Perfusionsöffnungen der Mess-Perfusionskammern und die Fixierabschnitte zueinander unmittelbar benachbart angeordnet.
Wenn die Mess-Perfusionsöffnungen der Mess-Perfusionskammern zueinander unmittelbar benachbart angeordnet sind, ergeben sich weitere Vorteile für die Auswertbarkeit der Messergebnisse. Besonders bevorzugt ist eine konzentrische Anordnung der Mess-Perfusionsöffnungen der Mess-Perfusionskammern vorgesehen. Eine Mess-Perfusionsöffnung, die z. B. für die Messung des lonenstroms vorgesehen ist, hat die Gestalt einer Ringöffnung, welche die andere Mess-Perfusionsöffnung, die z. B. für Messung des Aktionspotentials vorgesehen ist, umgibt. Die konzentrische Anordnung hat besondere Vorteile für die Fixierung der Zellprobe auf Mess-Perfusionsöffnungen, da durch das Anlegen eines Unterdrucks ein über den gesamten Randbereich der Mess-Perfusionsöffnung gleichmäßiges (zentriertes) Anpressen des Aggregates gefördert wird, welches die Isolation der Membranabschnitte unter der Perfusionsöffnung verbessert.
Wenn die Perfusionseinrichtung mit der mindestens einen Isolations-Perfusionskammer ausgestattet ist, ist die konzentrische Anordnung vorzugsweise so modifiziert, dass eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung von einer ringförmigen Isolations-Perfusionsöffnung und diese von der zweiten ringförmigen Mess-Perfusionsöffnung umgeben ist. Die Anordnung der Isolations-Perfusionsöffnung zwischen den Mess-Perfusionsöffnungen hat den Vorteil, dass die Isolations-Perfusionsöffnung eine Doppelfunktion in Bezug auf die elektrische Isolation zwischen den Mess-Perfusionsöffnungen und die Perfusion der Zellprobe mit dem Isolationsmedium erfüllen kann.
Vorteilhafterweise bestehen keine Beschränkungen hinsichtlich der Innenform des Fixierabschnitts, der gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Form eines Hohlzylinders (Rohrform) oder eines Hohlkonus (Trichter), der sich zur Mess-Perfusionsöffnung hin verjüngt, aufweisen kann. Der Hohlzylinder oder Trichter ermöglicht vorteilhafterweise durch einen allseitigen Kontakt mit der Zellprobe deren Kompression und Elongation.
Gemäß vorteilhaften Varianten der Erfindung werden geometrische Eigenschaften des Fixierabschnitts in Form eines Hohlzylinders oder Trichters einzeln oder in Kombination vorzugsweise wie folgt gewählt. Die axiale Länge des Fixierabschnitts, d. h. die Länge in der Längsrichtung, ist vorzugsweise mindestens gleich dem 0,3-fachen Durchmesser, insbesondere mindestens gleich dem 0,8-fachen Durchmesser oder mindestens gleich dem 1,5-fachen Durchmesser der Zellprobe in einem nicht-komprimierten Zustand gewählt. Indem mindestens ein Teil der Zellprobe oder die vollständige Zellprobe im Fixierabschnitt in eine längliche Form komprimiert wird, wird vorteilhafterweise die Halterung der Zellprobe während der Messung stabilisiert und des Weiteren die Perfusion der Zellprobe mit dem Isolationsmedium verbessert. Wenn der Fixierabschnitt die Trichterform aufweist, hat der Trichter vorzugsweise einen Trichterwinkel relativ zur Ebene der Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung aufweist, der im Bereich von 50° bis 85° gewählt ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Fixierabschnitt einen umlaufenden Vorsprung in der Halteeinrichtung, z. B. in deren Wandbereich oder Bodenbereich umfassen, wobei der umlaufende Vorsprung für eine radial allseitige Verankerung der Zellprobe eingerichtet ist. Der umlaufende Vorsprung auf der Innenwand oder im Bodenbereich der Halteeinrichtung ist für eine Aufnahme der Zellprobe im eingeschnürten Zustand und eine Behinderung einer Verschiebung der Zellprobe in der Längsrichtung der Halteeinrichtung während der Messung konfiguriert. Der Vorsprung bildet eine lokal begrenzte, sich quer zur Längsrichtung der Halteeinrichtung erstreckende Verengung der Halteeinrichtung, und er wird z. B. durch eine Lochplatte (Lochscheibe) oder ein Ringprofil gebildet. Die Lochplatte oder das Ringprofil hat ein zentrales Loch, das vorzugsweise in der Längsrichtung der Halteeinrichtung über der Mess-Perfusionsöffnung angeordnet ist. Die vorzugsweise ebene Platte mit dem Loch kann auch als zylindrischer Fixierabschnitt mit einem Abstand von der Mess-Perfusionsöffnung beschrieben werden. Die Höhe des umlaufenden Vorsprungs kann z. B. 40 µm für eine Zellprobe mit 200 µm Durchmesser betragen. Gemäß vorteilhaften Ausführungsformen des Messverfahrens kann dabei der im Fixierabschnitt fixierte Teil der Zellprobe an eine unterhalb des Vorsprungs angeordnete Mess-Perfusionsöffnung gesaugt werden, die mit einer separaten Saugleitung und separaten Unterdruckkammern oder Mikrofluidkanälen verbunden ist.
Ausführungsformen mit einer Trichter- oder Zylinderform des Fixierabschnitts und der Bildung des Fixierabschnitts als umlaufender Vorsprung können kombiniert werden. In diesem Fall bildet mindestens ein umlaufender Vorsprung auf der Innenoberfläche der Trichter- oder Zylinderform mindestens ein Fixierelement, das für eine zusätzliche Verankerung der Zellprobe im Fixierabschnitt eingerichtet ist.
Für bevorzugte Anwendungen der Erfindung beträgt die axiale Länge des Fixierabschnitts gemäß den obigen Ausführungsformen vorzugsweise mindestens 40 µm, z. B. mindestens 100 µm, und/oder höchstens 300 µm µm, z. B. höchstens 800 µm, während die Dimension in der Querrichtung vorzugsweise mindestens 30 µm, z. B. mindestens 80 µm, und/oder höchstens 100 µm, z. B. höchstens 300 µm beträgt. Die Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer hat vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 5 µm bis 100 µm. In diesem Größenbereich ergeben sich Vorteile für eine effektive Messung der elektrophysiologischen Größen.
Der Durchmesser des Fixierabschnitts, d. h. seine Dimension in einer Querrichtung senkrecht zur Längsrichtung, ist vorzugsweise höchstens gleich dem 0,9-fachen Durchmesser, insbesondere höchstens gleich dem 0,7-fachen Durchmesser der Zellprobe in einem nicht-komprimierten Zustand gewählt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann eine Innenoberfläche des Fixierabschnitts aus einem elektrisch leitenden Material, wie z. B. Gold, gebildet sein. Vorteilhafterweise kann der Fixierabschnitt als Zusatzelektrode, z. B. für eine extrazelluläre elektrische Anregung der Zellprobe und/oder eine weitere Messung an der Zellprobe, verwendet werden. Alternativ kann in der Halteeinrichtung mindestens eine separate Anregungs-Elektrode angeordnet sein. Die leitende Innenoberfläche des Fixierabschnitts oder die Anregungs-Elektrode können z. B. mit einer Spannungsquelle verbunden und für die extrazelluläre elektrische Anregung der Zellprobe oder eine weitere Messung konfiguriert sein. Beispielsweise kann an der Zellprobe eine Kontraktionsmessung vorgesehen sein, bei der elastische Eigenschaften der Zellprobe gemessen werden. Die Kontraktionsmessung erfolgt vorzugsweise mittels einer Druck- und/oder Impedanzmessung, z. B. unter Verwendung der mindestens einen Anregungs-Elektrode.
Für „patch-clamp“-Messungen an der Zellprobe, insbesondere an einem Aggregat oder einer großen Zelle, hat die Mess-Perfusionsöffnung (patch-Pore) vorzugsweise einen Durchmesser, der im Bereich von 5 µm bis 100 µm gewählt ist. Die patch-Pore ist damit größer als die Poren herkömmlicher planarer patch-Systeme (0.5 µm bis 2 um), die für Einzelzellen ausgelegt sind. Die erfindungsgemäß größere patch-Pore ermöglicht „patch-clamp“-Messungen an größeren Oberflächen des Aggregates mit mehreren Einzelzellen oder entsprechende Messungen an größeren Oberflächensegmenten von großen Zellen, wie z. B. Xenopus Oozyten. Für Aktionspotential-Messungen an der Zellprobe hat die Mess-Perfusionsöffnung (Elektroden-Pore) vorzugsweise einen Durchmesser, der im Bereich von 5 µm bis 200 µm gewählt ist.
Besonders bevorzugt haben die Mess-Perfusionsöffnung für die „patch-clamp“-Messungen und für die Aktionspotential-Messungen die gleiche oder annähernd gleiche Größe, insbesondere den gleichen oder annähernd gleichen Durchmesser. Vorteilhafterweise vereinfacht dies einen Tausch der Funktion der Mess-Perfusionsöffnungen, indem jeweils passend Strom- oder Spannungsmesseinrichtungen an die Elektroden der zugehörigen Perfusionskammern angeschlossen werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Halteeinrichtung, die Perfusionseinrichtung und die Elektrodeneinrichtung als Mikrofluidikvorrichtung (Mikrofluidikchip) aufgebaut sein. Die Mikrofluidikvorrichtung ist vorteilhafterweise eine kompakte, mehrlagige Konstruktion mit mehreren Plattenelementen, die jeweils zur Bildung der mindestens einen Halteeinrichtung und der mindestens einen Perfusionseinrichtung strukturiert und mit den Elektroden der mindestens einen Elektrodeneinrichtung ausgestattet sind. Die Mikrofluidikvorrichtung weist mehrere Fluidikschnittstellen zur Zufuhr einer Suspensionsflüssigkeit mit Zellproben, des Mess-Perfusionsmediums und optional weiterer Medien und Elektrodenanschlüsse zur Verbindung der Elektroden mit der Messeinrichtung auf. Ein Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass durch die Verwendung von Plattenelementen der Wandbereich der Halteeinrichtung und damit der mindestens eine Fixierabschnitt gestaltet werden kann und die Aggregate dadurch lokal deformiert und besser in Längsrichtung fixiert werden können.
Die Gegenstände jeder bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere die zweistufige Bildung der Halteeinrichtung über der mindestens einen Perfusionsöffnung aus dem oberen Führungsabschnitt und dem unteren Fixierabschnitt, die axiale Anordnung von Mess- und/oder Isolations-Perfusionskammern und/oder die Bereitstellung der Isolations-Perfusionskammer, können einzeln oder in Kombination als separate Gegenstände der Erfindung betrachtet werden, die erfindungsgemäß ohne die kennzeichnenden Merkmale des Hauptanspruchs, insbesondere ohne die oben erwähnte Konfiguration des Fixierabschnitts für eine Deformation der Zellprobe vorgesehen sein können.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

1: eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts;
2: schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts;
3: Illustrationen einer trichterförmigen Halteeinrichtung und einer Rückhalteeinrichtung gemäß weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Messgeräts;
4: schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts, bei der zwei Fixierabschnitte vorgesehen sind;
5: eine schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts, bei der ein Fixierabschnitt die Gestalt eines Trichters hat;
6: eine schematische Teilansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts, bei der ein Fixierabschnitt in Gestalt eines umlaufenden Vorsprungs vorgesehen ist;
7: eine schematische Ansicht einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Hochdurchsatz-Testgeräts;
8: eine schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts, wobei die Untersuchung einer großen Einzelzelle gezeigt wird;
9: schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts, bei der konzentrische Perfusionsöffnungen vorgesehen sind;
10 bis 14: schematische Ansichten von weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Messgeräts; und
15: eine schematische Ansicht eines herkömmlichen planaren „patch-clamp“-Messgeräts (Stand der Technik).

Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf ein elektrophysiologisches Messgerät beschrieben, das mit einer einzigen Halteeinrichtung mit einem oder zwei Fixierabschnitten ausgestattet ist. Die Erfindung ist nicht auf diese Varianten beschränkt, sondern entsprechend mit einem Messgerät oder Hochdurchsatz-Testgerät umsetzbar, das eine Vielzahl von Halteeinrichtungen jeweils mit einem oder mehreren Fixierabschnitten umfasst. Es können beispielweise in einer Mikrofluidikvorrichtung 10 bis 300 Halteeinrichtungen, jeweils gekoppelt mit mindestens einer Perfusionseinrichtung, mindestens einer Elektrodeneinrichtung und mindestens einer Messeinrichtung, vorgesehen sein, so dass eine Vielzahl von Zellproben gleichzeitig bereitgestellt und gleichzeitig oder aufeinanderfolgend untersucht werden können.
Des Weiteren wird beispielhaft auf Messungen von lonenströmen und/oder Aktionspotentialen Bezug genommen. Die Erfindung ist nicht auf diese Anwendung beschränkt ist, sondern entsprechend mit anderen elektrophysiologischen Messungen, wie z. B. Oberflächenpotentialen, oder weiteren Messungen, wie z. B. Fluoreszenz-Messungen oder der Erfassung von intrazellulärem Kalzium oder anderen Ionen, ausführbar. Einzelheiten von elektrophysiologischen Messungen, wie die Auswahl von elektrischen Messparametern, die Ableitung elektrophysiologischer Messsignale von den Elektroden, die Anordnung von Elektroden, die Verstärkertechnik und/oder die Auswahl von Perfusionsmedien, Einzelheiten der Probenpräparation und Einzelheiten der Handhabung von biologischen Zellproben, wie z. B. die Herstellung von Zellaggregaten, werden nicht beschrieben, da diese an sich von herkömmlichen Techniken bekannt sind.
Die Erfindung wird insbesondere in Bezug auf die Halteeinrichtung und deren Zusammenwirkung mit der Perfusionseinrichtung beschrieben. Das Messgerät oder Hochdurchsatz-Testgerät kann weitere Komponenten, wie zum Beispiel Flüssigkeitsreservoire, mehrere Pumpen zur Herstellung unterschiedlicher Drucke an verschiedenen Mess-Perfusionsöffnungen, Steuerelemente (z. B. steuerbare Ventile), Temperierungseinrichtungen, Befeuchtungseinrichtungen und dergleichen aufweisen. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann insbesondere ein autarkes Gerät für Labor- oder Industrieanwendungen zur Untersuchung von Zellproben sein. Alternativ kann die Vorrichtung Teil eines Kultivierungsgerätes für biologische Zellen sein, das insbesondere für die Kultivierung von Zellaggregaten ausgelegt ist.
1 zeigt eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 in schematischer Schnittansicht, wobei ein Fixierabschnitt 12 in Form eines Trichters vorgesehen ist. Das Messgerät umfasst eine Halteeinrichtung 10, eine Perfusionseinrichtung 20, eine Elektrodeneinrichtung 30 und eine Messeinrichtung 40. Das Messgerät 100 ist als Mikrofluidikvorrichtung aus ebenen Plattenelementen 10A, 20 A, 20B (teilweise gezeigt) aufgebaut, in denen jeweils die Halteeinrichtung 10 und die Perfusionseinrichtung 20 als Kanäle oder andere Hohlräume gebildet sind. Alternativ kann die Halteeinrichtung 10 als Aufsatz auf den Plattenelementen 20A, 20B gebildet sein, welche die Perfusionseinrichtung 20 bilden. Die Halteeinrichtung 10 kann von den Plattenelementen 20A, 20B trennbar angeordnet sein. Die Plattenelemente 10A, 20A, 20B erstrecken sich in einer Bezugsebene (horizontale x-y-Ebene) und die Halteeinrichtung 10 erstreckt sich in einer Längsrichtung (vertikale z-Richtung) senkrecht zu der Bezugsebene. Die Plattenelemente 10A, 20A, 20B sind vorzugsweise aus einem elektrisch isolierenden Material, wie z. B. Kunststoff (insbesondere PDMS), Glas und/oder einer Keramik hergestellt. Die Verbindung der Plattenelemente 10A, 20A, 20B erfolgt durch ein Bondverfahren oder mechanisches Klemmen mit einer Klemmeinrichtung (z. B. äußere Klammern) oder durch Kleben.
Die Halteeinrichtung 10 hat einen sich in der Längsrichtung (z) erstreckenden Innenraum 11 in Gestalt eines Trichters, der eine Aufnahme für die Zellprobe 1 in einem physiologischen Umgebungsmedium 2 bildet. Der Innenraum 11 weist einen Bodenbereich 14, in dem Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B der Perfusionseinrichtung 20 in den Innenraum 11 münden, und einen seitlichen Wandbereich 15 auf. In einem zur Perfusionseinrichtung 20 weisenden Bereich (unterer Bereich) bildet der Innenraum 11 einen Fixierabschnitt 12 zur Aufnahme der Zellprobe 1 in einem deformierten Zustand. Entgegengesetzt zum Bodenbereich 14 ist der Innenraum 11 offen oder mit einem lösbaren Deckel (nicht gezeigt) versehen.
Die Perfusionseinrichtung 20 umfasst zwei Lagen von Plattenelementen 20A, 20B, von denen im unteren Plattenelement 20B zwei Mess-Perfusionskammern 21A, 21B jeweils zur Aufnahme eines Perfusionsmediums 3A, 3B und im oberen Plattenelement 20A die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B gebildet sind. In abgewandelten Ausführungsformen der Erfindung können Abschnitte der Halteeinrichtung 10 (siehe z. B. 2) und/oder die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B (siehe z. B. 7) in getrennten Plattenelementen angeordnet sein. Die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B sind über die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B mit dem Innenraum 11 der Halteeinrichtung 10 verbunden. Die zum Innenraum 11 weisenden Randflächen der Mess-Perfusionsöffnung 22A, 22B erstrecken sich parallel zur Bezugsebene (x-y-Ebene) und sind aus einem elektrisch isolierenden Material, vorzugsweise durch das Material des oberen Plattenelements 20A gebildet. Jede der Mess-Perfusionskammern 21A, 21B ist über die Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24A, 24B mit Reservoiren der Perfusionsmedien (nicht gezeigt) gekoppelt.
Die Elektrodeneinrichtung 30 umfasst zwei Mess-Elektroden 31A, 31B, die jeweils in den Mess-Perfusionskammern 21A, 21B angeordnet sind, und eine Referenzelektrode 32, die in dem Innenraum 11 der Halteeinrichtung 10 angeordnet ist. Die Messeinrichtung 40 umfasst eine Spannungsmesseinrichtung 41A (Voltmeter mit Messverstärker), die mit der ersten Mess-Elektrode 31A verbunden ist, und eine Strommesseinrichtung 41B (Amperemeter) mit einem Operationsverstärker 42B zur Stromverstärkung, der mit der zweiten Mess-Elektrode 31B verbunden ist. Die Referenzelektrode 32 ist in elektrischem Kontakt mit der extrazellulären Lösung in der Halteeinrichtung 10 in der Umgebung der Zellprobe 1 und an einen Masseanschluss des Operationsverstärkers 42B (so genannte „virtuelle Masse“) angeschlossen.
Die erste Mess-Elektrode 31A steht in Kontakt mit dem Perfusionsmedium (extrazelluläre Lösung), wie z. B. isoosmolare (140 mM) Kaliumlösung (Chlorid oder teilweise Fluorid), die zusätzlich lonophore, wie Nystatin oder Amphotericin B, enthalten kann, in der Mess-Perfusionskammer 21A. Mit diesem Perfusionsmedium wird die Zellprobe 1 über die erste Mess-Perfusionsöffnung 22A (Elektroden-Pore, Durchmesser z. B. 20 µm) perfundiert. Über die erste Mess-Elektrode 31A werden mit der Spannungsmesseinrichtung 41A Membranpotentiale und ggf. Aktionspotentiale gemessen. Über die zweite Mess-Elektrode 31B, die in Kontakt mit dem Perfusionsmedium, z. B. mit physiologische (Ringer) Lösung, in der Mess-Perfusionskammern 21A steht, werden Ionenströme durch den von der Mess-Perfusionsöffnung 22B (patch-Pore, Durchmesser z. B. 20 µm) isolierten Oberflächenabschnitt der Zellprobe 1 gemessen. Die patch-Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22B) wird separat von der Elektroden-Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22A) mit der extrazellulären Lösung perfundiert. Die Verwendung von lonophoren zur Permeabilisierung von Membranen ist als „perforated patch-clamp“ Technik bekannt (Akaike et al. [12]).
Abweichend von der Darstellung in 1 können optional weitere Elektroden (nicht gezeigt) in den Lösungen vorgesehen sein, z. B. um eine Bezugsmasse zu bilden, Aktionspotentiale zu stimulieren und/oder Oberflächenpotentiale (EKG) abzuleiten, wobei diese Messungen unter Verwendung von Differenzverstärkern erfolgen können.
Kontraktionsbedingte Veränderungen im Unterdruck im unteren Fixierabschnitt 12 oder oberhalb von diesem können mit einem Manometer erfasst und als Kontraktionsparameter ausgewertet werden (siehe 12). Es können auch mehrere Fixierabschnitte vorgesehen sein (siehe 4). Des Weiteren können alternativ oder zusätzlich mehrere Mess-Perfusionsöffnungen (Elektroden-Poren) zur Potentialmessung und/oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen (patch-Poren) zur Strommessung im Boden- oder Wandbereich des Fixierabschnitts 12, vorzugsweise zueinander benachbart, angeordnet sein. An den Mess-Perfusionsöffnungen können jeweils spezifische Perfusionsmedien aus getrennten Mess-Perfusionskammern bereitgestellt werden.
1 stellt ein planares „patch-clamp“-Messgerät, insbesondere für Zellaggregate, mit trichterförmiger Halteeinrichtung 10 für das Positionieren der Zellprobe 1 auf mindestens einer patch-Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22B) und/oder mindestens einer Elektroden-Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22A) dar. Die Poren sind mit verschiedenen Kompartimenten oder Mikrofluidkanälen in dem unteren Plattenelement 20B verbunden und können mit verschiedenen Flüssigkeiten perfundiert werden. Das Anhaften (engl. „sealen“) der Zellprobe 1 an den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B ermöglicht die gleichzeitige Messung von Aktionspotentialen und „patch-clamp“-Untersuchungen nach Hamill et al. [2] in der Modifikation nach Zilberter et al. [7].
Zur Durchführung der Messungen an einer Zellprobe 1, umfassend z. B. ein Zellaggregat, wird das Zellaggregat in einer physiologischen Lösung oder einem Nährmedium zunächst mit einer Zufuhreinrichtung, z. B. einer Pipette 3 in die Halteeinrichtung 10 appliziert. Die Zufuhreinrichtung umfasst z. B. ein automatisches Pipettiersystem, wodurch der Vorgang vorteilhafterweise automatisiert werden kann. Alternativ zur Verwendung der Pipette kann das Aggregat direkt mit mechanischen Mitteln von einer Oberfläche, z. B. eines Kultivierungssubstrates, in die Halteeinrichtung 10 zugeführt werden. Durch die Form der Halteeinrichtung 10 wird das absinkende Zellaggregat hin zu den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B im Plattenelement 20A geleitet. Durch schlüssigen Kontakt mit den Innenwänden der Halteeinrichtung 10 und durch einen Unterdruck in den Mess-Perfusionskammern 21A, 21B wird das Zellaggregat in den Fixierabschnitt 12 bis zum Bodenbereich 14 gesaugt und dabei komprimiert, so dass es auch nach Beendigung der Unterdruckerzeugung am Bodenbereich 14 auf den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B sitzt. Dabei wird ein dichter Kontakt zwischen dem Zellaggregat und den Randflächen der Perfusionsöffnungen 22A, 22B im Bodenbereich 14 gebildet.
Wenn das Zellaggregat im Fixierabschnitt 12 komprimiert fest sitzt, folgen die Strom- und/oder Spannungsmessungen, wobei das Zellaggregat von den Mess-Perfusionskammern 21A, 21B mit Perfusionsmedien gespült und elektrische Signale von den Elektroden 31A, 31B abgeleitet werden. Vorteilhafterweise ermöglicht das Verfahren, dass während der „patch-clamp“-Messung gleichzeitig ein Aktionspotential abgeleitet wird. Über die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B und die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B können Testlösungen mit Substanzen appliziert und bezüglich ihrer Wirkung auf lonenkanäle untersucht werden. Alternativ können Lösungen mit Testsubstanzen direkt in die Halteeinrichtung 10 appliziert werden. Beispielweise kann ein Überlauf aus dem Trichter der Halteeinrichtung 10 in ein den Trichter umgebendes Reservoir vorgesehen sein, wobei die in der Halteeinrichtung 10 vorhandene Lösung durch Zu- und Abfluss verdünnt und/oder ausgetauscht werden kann.
Der Operationsverstärker 42B kann bei Messungen an Zellaggregaten insbesondere in den folgenden zwei Anwendungen genutzt werden. Erstens kann vorgesehen sein, dass das Aggregat ein Aktionspotential generiert. In diesem Fall wird kein Membranpotential vorgegeben, und es werden die Ionenströme während des Aktionspotentials gemessen. Zweitens ist möglich, dass das Aggregat kein Aktionspotential generiert. In diesem Fall wird das Membranpotential, z. B. in Gestalt eines Rechteckimpulses, auf die zentrale Mess-Perfusionsöffnung 21A (patch-Pore) appliziert, und es werden die Ionenströme während der Spannungsänderung registriert. Da sich an der Mess-Perfusionsöffnung 21A mehrere Zellen eines Zellaggregates befinden können, werden die durch die Mess-Perfusionsöffnung 21A isolierten Membanoberflächen auch als „Makropatches“ bezeichnet. Die Messung erfolgt nach der von [7] Y. I. Zilberter et al. für Einzelzellen beschriebenen Methode.
Merkmale von abgewandelten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 mit der Halteeinrichtung 10, der Perfusionseinrichtung 20, der Elektrodeneinrichtung 30, der Messeinrichtung 40 und einer Rückhalteeinrichtung 50 sind schematisch in den 2 bis 6 und 8 bis 14 gezeigt.
In 2A sind die Plattenelemente 10A, 10B, in denen die Halteeinrichtung 10 gebildet ist, schematisch illustriert. Weitere Plattenelemente, in denen die Mess-Perfusionsöffnung und die mikrofluidischen Perfusionskammern der Perfusionseinrichtung 20 gebildet sind, sind in 2A nicht gezeigt. 2B illustriert schematisch das oberste Plattenelement 20A, mit dem die Halteeinrichtung, z. B. durch Kleben, verbunden ist und das die Perfusionskammer (obere Mess-Perfusionskammer 21B oder Isolations-Perfusionskammer 25) aufnimmt. Abweichend von 1 ist die Halteeinrichtung 10 gemäß den 2 und 3 zweistufig mit dem Fixierabschnitt 12 und einem Führungsabschnitt 13 gebildet. Ein weiterer Unterschied besteht in der Anordnung der Perfusionsöffnungen 22B/26 und 22A. Schließlich ist die Elektrodeneinrichtung 30 für verschiedene, vom Nutzer wählbare Mess- und Perfusionsverfahren ausgelegt. Im Übrigen kann das Messgerät 100 der 2 und 3 insbesondere aufgebaut sein, wie oben unter Bezug auf 1 beschrieben ist.
Die Halteeinrichtung 10 ist gemäß den 2A und 3A aus zwei Trichter-Formen zusammengesetzt, die relativ zur x-y-Bezugsebene der Halteeinrichtung 10 verschiedene Neigungswinkel aufweisen. Der obere, zur Perfusionseinrichtung 20 entgegengesetzte Bereich, durch den der Führungsabschnitt 13 gebildet wird, hat das größere Volumen und den flacheren Neigungswinkel. Die Zellprobe 1 in einer physiologischen Lösung oder einem Nährmedium wird im Führungsabschnitt 13 zum Fixierabschnitt 12 gelenkt und in diesen eingesaugt. Der Fixierabschnitt 12 mit dem geringeren Volumen und dem steileren Neigungswinkel nimmt die Zellprobe 1 im fixierten Zustand auf. Die Zellprobe 1 (z. B. ein Spheroid) kann vollständig oder, wie in 2A gezeigt, teilweise im Fixierabschnitt 12 angeordnet sein. Die Zellprobe 1 hat z. B. im nicht deformierten Zustand einen Durchmesser von 200 µm (mit einem Volumen von rd. 4,2*10⁶ µm³), und der Fixierabschnitt 12 hat einen Durchmesser im Bereich von z. B. 50 µm bis 150 µm. Die Höhe des Fixierabschnitts 12 (Länge in Längsrichtung senkrecht zur x-y-Bezugsebene kann geringer (2A) oder größer ( 3A) als der Durchmesser der Zellprobe 1 und z. B. im Bereich von 40 µm bis 100 µm gewählt sein. Die Höhe des Führungsabschnitts 13 kann z. B. im Bereich von 500 µm bis 5 mm gewählt sein. Der Führungsabschnitts 13 kann wesentlich größer als der Fixierabschnitt 12 sein.
Die Perfusionseinrichtung 20, die mit drei oder vier Lagen von Plattenelementen (nicht gezeigt) gebildet ist, umfasst gemäß 2A zwei Perfusionskammern 21A und 21B/25, von denen die untere Perfusionskammer 21A über eine mittig angeordnete Perfusionsöffnung 22A mit dem Bodenbereich 14 und die obere Perfusionskammer 21B/25 axial über der unteren Perfusionskammer 21A über eine ringförmige Perfusionsöffnung 22B/26 mit dem Boden- und Wandbereich 14, 15 der Halteeinrichtung 10 verbunden ist (weitere Gestaltungsvarianten, siehe 3B, 3C und 3D). Die Perfusionskammern und Perfusionsöffnungen können je nach Beaufschlagung mit Perfusionsmedien und Verbindung der Elektroden 31A, 31B und 31C für verschiedene Funktionen als Mess-Perfusionskammern 21A, 21B oder Isolations-Perfusionskammern 25 verwendet werden, wie unten beschrieben ist.
Die 2B und 2C zeigen eine Draufsicht und eine Perspektivansicht auf den Bodenbereich der Halteeinrichtung 10 mit den Perfusionsöffnungen 22A und 22B/26 und einem Teil der quaderförmigen Perfusionskammer 21B/25 im Plattenelement 20A. Die Breite B der quaderförmigen Perfusionskammer 21B/25 beträgt z. B. 300 µm, während der Durchmesser D1 des Bodenbereichs der Halteeinrichtung 100 µm beträgt. Die quaderförmige Perfusionskammer 21B/25 kann somit am Boden des Fixierabschnitts eine Stufe bilden. Alternativ kann D1 gleich der Breite B oder größer als die Breite der quaderförmigen Perfusionskammer 21B/25 sein. Die Die Höhe H der quaderförmigen Perfusionskammer 21B/25 beträgt z. B. 10 µm - 100 µm und für den Fall der Verwendung von Mikro- oder Nanofluidikkanälen 100 nm - 5 µm. Die geringe Höhe von Mikro- oder Nanokanäle hat den Vorteil, dass eine laterale Deformation der Zellprobe 1 vermieden wird (siehe auch 13). Die mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer 21B weist an der umlaufenden Mess-Perfusionsöffnung 22B eine kammerförmige Ausnehmung 23 auf, die durch die Quaderform der Perfusionskammer gebildet wird und die allseitige Zufuhr des Perfusionsmediums fördert.
Am unteren Ende des Fixierabschnitts 12 kann, in die Perfusionsöffnung 22B/26 ragend, eine Rückhalteeinrichtung 50 vorgesehen sein, wie schematisch in den 3C, 3D und 14 gezeigt ist. Durch die Rückhalteeinrichtung 50 kann die Perfusionskammer 21B/25 an der Perfusionsöffnung 22B/26 in horizontale und/oder vertikale Perfusionsfenster unterteilt sein, welche für das jeweilige Perfusionsmedium durchlässig und für die Zellprobe undurchlässig sind. Mit der Rückhalteeinrichtung 50 wird eine Stabilisierung der Zellprobe gegen laterale Strömungskräfte erzielt. Gemäß den 3C, 3D kann die Rückhalteeinrichtung 50 z. B. durch Säulenelemente 51 gebildet werden, die als Verlängerung des Wandbereich 15 oder als Teil der Perfusionskammer in die Perfusionsöffnung 22B/26 ragen. Die Säulenelemente 51 können in die Perfusionskammer 21B/25 ragen oder auf der unteren Begrenzung der Perfusionskammer 21B/25 aufsitzen. Die Säulenelemente 51, z. B. in Gestalt von Quadern oder Zylindern, bilden schlitzartige Unterbrechungen mit einer Breite von rd. 100 nm bis 1 um. Der geringe Abstand der Säulenelemente 51 verhindert, dass die Zellprobe 1 seitlich in die Perfusionskammer gesaugt wird. Durch die Säulenelemente 51 kann die Perfusionskammer gleichzeitig in der Höhe stabilisiert werden. Isolations-Perfusionsmedium kann z. B. selbst durch die 10 µm- Zwischenräume der Säulenelemente 51 und in die Zellprobe eintreten.
Messgeräte mit den Merkmalen gemäß den 2 und 3 können wahlweise für verschiedene elektrophysiologische Messungen verwendet werden. Gemäß einer ersten Variante werden beide Perfusionskammern als Mess-Perfusionskammern 21A, 21B verwendet. Die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B sind über Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24A, 24B mit Reservoiren der Perfusionsmedien für die Messung von Aktionspotentialen und lonenströmen gekoppelt. In diesem Fall werden die Spannungsmesseinrichtung 41A mit der ersten Mess-Elektrode 31A und der Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B mit der dritten Mess-Elektrode 32 verbunden, um gleichzeitig Aktionspotentiale und Ionenströme zu messen. Gemäß einer zweiten Variante wird die obere Perfusionskammer als Isolations-Perfusionskammer 25 verwendet. Die Isolations-Perfusionskammer 25 ist über die Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24B mit einem Reservoir eines Isolations-Perfusionsmediums, wie z. B. einer salzfreien Saccharose-Lösung verbunden. In diesem Fall werden mit einem Umschalter wahlweise die Spannungsmesseinrichtung 41A mit der ersten Mess-Elektrode 31A oder der Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B mit der zweiten Mess-Elektrode 31B verbunden, um abwechselnd Aktionspotentiale oder Ionenströme zu messen. Alternativ kann bei Verwendung der oberen Perfusionskammer als Isolations-Perfusionskammer 25 die untere Perfusionskammer ausschließlich zur Messung entweder von Aktionspotentialen oder von lonenströmen vorgesehen sein. Die Perfusionskammer 21A, welche über die Mess-Perfusionsöffnung 22A mit der Halteeinrichtung verbunden ist, wird bei „patch clamp“-Messungen typischerweise mit einer physiologischen Ringerlösung und bei Aktionspotentialmessungen typischerweise mit einer isotonen Kaliumchloridlösung perfundiert.
Die 4A bis 4C zeigen schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100. Bei dieser Abwandlung der Ausführungsform gemäß 2 weist die Halteeinrichtung 10 zwei getrennte Fixierabschnitte 12A, 12B und zwei getrennte Mess-Perfusionskammern 21A, 21B auf. Im Übrigen ist das Messgerät 100 aufgebaut, wie unter Bezug auf 2 beschrieben ist. Die Halteeinrichtung 10 ist in den Plattenelementen 10A, 10B mit einem oben offenen Führungsabschnitt 13 und den Fixierabschnitten 12A, 12B gebildet. Die Perfusionseinrichtung 20 ist wie in 1 in weiteren Plattenelementen gebildet, von denen nur das obere Plattenelement 20A in 4B schematisch gezeigt ist. Die Fixierabschnitte 12A, 12B haben jeweils eine Trichterform, deren obere, weitere Seite in den Führungsabschnitt 13 mündet und deren untere, engere Seite sich in eine quaderförmige Perfusionskammer öffnet, die als Isolations-Perfusionskammer 25 vorgesehen ist (siehe 4B und 4C).
Die Perfusionseinrichtung 20 umfasst die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B, die jeweils über getrennte Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B mit dem Innenraum der Fixierabschnitte 12A, 12B verbunden sind, und die Isolations-Perfusionskammer 25, die über seitliche, ringförmige Isolations-Perfusionsöffnungen 26A, 26B mit dem Innenraum der Fixierabschnitte 12A, 12B verbunden ist. Für die gleichzeitige Messung des Aktionspotentials und des lonenstroms an der Zellprobe 1 sind die Mess-Elektrode 31A in der Mess-Perfusionskammer 21A mit der Spannungsmesseinrichtung 41A und die Mess-Elektrode 31B in der Mess-Perfusionskammer 21B mit der Strommesseinrichtung 41B verbunden. Jede der Mess-Perfusionskammern 21A, 21B und der Isolations-Perfusionskammer 25 ist über die Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24A, 24B, 28 mit Reservoiren der Perfusionsmedien (nicht gezeigt) gekoppelt. Die quaderförmige Isolations-Perfusionskammer 25 ist im oberen Plattenelement 20A (siehe 4B) der Perfusionseinrichtung 20 gebildet. Die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B sind voneinander getrennt in einem gemeinsamen Plattenelement (nicht gezeigt) gebildet. Die Dimensionen D1, B und H sind wie bei der Ausführungsform gemäß 2 gewählt.
Die Ausführungsform gemäß 4 ist besonders dann von Vorteil, wenn gleichzeitig lonenströme durch größere Membranpatches (Makropatches) und Aktionspotentiale gemessen werden sollen. Die Messungen erfolgen, wie oben beschrieben ist. Um die Membranpatches für Aktionspotentialmessungen und lonenstrommessungen in den jeweiligen Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B der jeweiligen Fixierabschnitte 11A, 11B entsprechend zu isolieren, werden die Widerstände der Zwischenzellkontakte durch Perfusion der quaderförmigen Isolations-Perfusionskammer 25 mit Isolationslösung mit einer nicht-leitenden Lösung erhöht. Als Isolations-Perfusionsmedium wird eine isotone Saccharose-Lösung verwendet. Dies ermöglicht eine deutlich verbesserte Kontrolle der Membranspannung (Spannungsklemme) unter der durch die Mess-Perfusionsöffnungen 22A und 22B isolierten Poren, die ggf. mehrere Zellen und damit Zwischenzellräume umfassen können. Die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B haben bei der gezeigten Ausführungsform verschiedene Durchmesser. Für Aktionspotentialmessungen beträgt der Durchmesser z. B. 20 µm bis 200µm, und für lonenstrommessungen beträgt der Durchmesser z. B. 10 µm bis 100 µm. Alternativ können die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B gleiche Durchmesser aufweisen.
5 zeigt eine schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100. Bei dieser Abwandlung der Ausführungsformen gemäß den 1 oder 2 umfasst die Halteeinrichtung 10 einen einzigen, langgestreckten Trichter, dessen oberer, weiter Bereich einen Führungsabschnitt 13 und dessen unterer, enger Bereich den Fixierabschnitt 12 bildet. Im Übrigen ist das Messgerät 100 aufgebaut, wie oben unter Bezug auf die 1 oder 2 beschrieben ist. Der Durchmesser der Halteeinrichtung 10 verringert sich z. B. von D2 im Bereich von 2 mm bis 5 mm über H2 im Bereich von 1 cm bis 2 cm auf D1 im Bereich von 50 µm bis 700 µm. Vorteilhafterweise können im Fixierabschnitt Zellproben 1 mit einem Durchmesser im nicht-deformierten Zustand im Bereich von 100 µm bis 1 mm fixiert werden.
Merkmale einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 (teilweise gezeigt), bei welcher der Fixierabschnitt 12 einen umlaufenden Vorsprung in der Halteeinrichtung 10 umfasst, sind in 6 schematisch illustriert. Die Halteeinrichtung 10 in Zylinderform weist an ihrem Bodenbereich 14 eine Lochplatte 17 mit einem zentralen, kreisförmigen Loch 17A auf. Die Lochplatte 17 besteht z. B. aus Glas oder Kunststoff, und wird ist bei einem Messgerät 100 in Gestalt eines Mikrofluidikchips durch ein Plattenelement zwischen der Halteeinrichtung und der Perfusionseinrichtung gebildet. Das Loch 17A hat z. B. einen Durchmesser im Bereich von 50 µm bis 300 µm. Unterhalb der Lochplatte 17 befindet sich die Perfusionseinrichtung 20, von der lediglich die Isolations-Perfusionskammer 25 gezeigt ist (siehe 2C). Am Boden der Isolations-Perfusionskammer 25 befindet sich die Mess-Perfusionsöffnung 22A, durch die eine Perfusionsflüssigkeit von der Mess-Perfusionskammer (nicht gezeigt) zuführbar ist. Der Abstand zwischen dem Loch 17A und der Mess-Perfusionsöffnung 22A beträgt z. B. 20 µm bis 80 µm.
Bei Erzeugung eines Unterdrucks in der Isolations-Perfusionskammer 25 wird eine Zellprobe 1 in der Halteeinrichtung 10 durch die Lochplatte 17 gesaugt. Die Zellprobe 1 wird eingeschnürt und im unteren Teil bis zur Mess-Perfusionsöffnung 22A elongiert (siehe Teilbild in 6), bis die deformierte Zellprobe 1 in der Mess-Perfusionsöffnung 22A sitzt. Während der Messung wird der elongierte Teilbereich der Zellprobe mit hoher Wirksamkeit durch ein Isolationsmedium in der Isolations-Perfusionskammer 25 perfundiert.
7 illustriert schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Hochdurchsatz-Testgeräts 200 mit einer Vielzahl von Messgeräten 100 jeweils mit einer Halteeinrichtung 10 und einer Perfusionseinrichtung 20. Des Weiteren sind Elektroden- und Messeinrichtungen (nicht dargestellt) vorgesehen, wie sie unter Bezug auf die anderen Figuren beschrieben sind. Die Messgeräte 100, die aufgebaut sind, sowie unterschiedlich angeordnete Mess-Perfusionsöffnungen wie unter Bezug auf die anderen Figuren beschrieben ist, bilden z. B. eine Reihe oder eine Matrixform mit Reihen und Spalten. Vorzugsweise sind die Messgeräte 100 in einer gemeinsamen Mikrofluidikeinrichtung integriert angeordnet. Perfusionskammern mit gleichen Funktionen sind jeweils miteinander verbunden und mit einem gemeinsamen Perfusionsmedien-Reservoir gekoppelt. Ein Hochdurchsatz-Test mit dem Hochdurchsatz-Testgerät 200 umfasst die gleichzeitige elektrophysiologische Messung an einer Vielzahl von Zellproben mit jeweils einem der Messgeräte 100.
8 zeigt eine weitere Abwandlung der Ausführungsform des Messgeräts 100 gemäß den 1 und 2. Die Halteeinrichtung 10, die wie in 1 aufgebaut sein kann, ist mit einer Zellprobe 1 in Gestalt einer großen Zelle, z. B. ein Oozyt eines afrikanischen Krallenfrosches (Xenopus laevis), gezeigt. Die Zelle sitzt während der Messung im komprimierten Zustand im Fixierabschnitt 12 der Halteeinrichtung 10. Die Perfusionseinrichtung 20 umfasst zwei Perfusionskammern, die wie in 2 als Mess- und/oder Isolations-Perfusionskammern verwendet werden können. Eine zentrale Perfusionskammer, die vorzugsweise als Mess-Perfusionskammer 21B verwendet wird, ist über die Mess-Perfusionsöffnung 22B mit dem Bodenbereich 14 der Halteeinrichtung 10 verbunden. Die erste Mess-Elektrode 31B in der Mess-Perfusionskammer 21B ist für eine lonenstrommessung mit dem Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B verbunden. Alternativ oder zusätzlich kann die Mess-Elektrode 31B für eine Aktionspotentialmessung, ggf. über einen Umschalter, mit einer Spannungsmesseinrichtung (siehe 2) koppelbar sein. Die zweite Perfusionskammer 21A, 25 in Gestalt von zwei Perfusionskanälen ist über eine ringförmige Perfusionsöffnung 22A, 26, welche konzentrisch zur Mess-Perfusionsöffnung 22B angeordnet ist, mit dem Bodenbereich 14 der Halteeinrichtung 10 verbunden. In der zweiten Perfusionskammer 21B, 25 ist eine zweite Mess-Elektrode 31B angeordnet, die wiederum mit dem Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B und/oder der Spannungsmesseinrichtung 41A koppelbar ist. Die zweite Perfusionskammer 21A/25 kann als Isolations-Perfusionskammer 25 verwendet werden, wie oben unter Bezug auf 2 beschrieben wurde. Durch Anlegen eines starken Unterdrucks kann die Membran unter 22B zerstört werden und eine „whole cell“ Konfiguration für lonenstrommessungen nach [2] hergestellt werden.
Bei der Ausführungsform des Messgeräts 100 gemäß 9 enthält die Perfusionseinrichtung 20 drei Perfusionskammern 21A, 21B und 25, von denen die oberste Perfusionskammer eine Mess-Perfusionskammer 21A zur Messung von Aktionspotentialen, die mittlere Perfusionskammer eine Isolations-Perfusionskammer 25 zur Perfusion der Zellprobe 1 mit einem elektrisch isolierenden Isolations-Perfusionsmedium und die untere Perfusionskammer eine Mess-Perfusionskammer 21B zur Messung von lonenströmen umfasst (9A). Die Perfusionsöffnungen 22A, 25 und 22B sind zueinander konzentrisch angeordnet (9B), wobei die Randflächen 27 zwischen den Perfusionsöffnungen 22A, 25 und 22B adhäsive Oberflächen zur Bildung des „seal“-Widerstands mit der Oberfläche der Zellprobe 1 bilden.
Für die gleichzeitige Messung des Aktionspotentials und des lonenstroms an der Zellprobe 1 sind die Mess-Elektrode 31A der Mess-Perfusionskammer 21A mit der Spannungsmesseinrichtung (nicht gezeigt) und die Mess-Elektrode 31B der Mess-Perfusionskammer 21B mit der Strommesseinrichtung 41B verbunden. Die äußerste Perfusionsöffnung 22A wird mit Kaliumlösung perfundiert, während die innerste Perfusionsöffnung 22A mit extrazellulärer Lösung (Ringer-Lösung) perfundiert wird. Über die mittlere Perfusionsöffnung 25 wird die Zellprobe mit dem Isolationsmedium gespült.
Die Ausführungsform gemäß 9 ist besonders dann von Vorteil, wenn Ionenströme durch größere Membranpatches (Makropatches) gemessen werden sollen, die von mehreren Zellen an der Oberfläche eines Zellaggregates gebildet werden. In diesem Fall befinden sich unter der Öffnung der mittleren Mess-Perfusionsöffnung 22B mehr als eine Zelle mit Zwischenzellkontakten. Um den Membranpatch in der Mess-Perfusionsöffnung 22B entsprechend zu isolieren, werden die Widerstände der Zwischenzellkontakte durch Perfusion der Isolations-Perfusionsöffnung 26 mit einer nicht-leitenden Lösung erhöht. Als Isolations-Perfusionsmedium wird eine isotone Saccharose-Lösung verwendet. Dies ermöglicht eine deutlich verbesserte Kontrolle der Membranspannung (Spannungsklemme) unter der durch die Mess-Perfusionsöffnung 22B isolierten zentrischen Pore, die ggf. mehrere Zellen und damit Zwischenzellräume umfassen kann. Durch einen geeignet gewählten Unterdruck und die zusätzliche Isolation der Mess-Perfusionsöffnung 22B durch die konzentrische Isolations-Perfusionsöffnung 26 werden die Randflächen 16 der Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B voneinander isoliert.
10 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100, bei der die Halteeinrichtung 10 als Ansaugeinrichtung verwendet wird. Die Halteeinrichtung 10 hat die Gestalt eines Trichters, dessen engerer Bereich einen Fixierabschnitt 12 zur Aufnahme der Zellprobe 1 im komprimierten Zustand bildet. Anders als bei den übrigen Ausführungsformen ist der Fixierabschnitt 12 nicht durch einen Bodenbereich geschlossen, sondern mit einer Saugleitung 16 verbunden, die mit einer Unterdruck-Kammer oder Saugpumpe (nicht dargestellt) koppelbar ist. Die Perfusionskammern 21A, 21B, die jeweils eine Mess-Elektrode 31A oder 31B enthalten, münden am Fixierabschnitt 12 in den Innenraum 11 der Halteeinrichtung 10. Die Mess-Elektrode 31A der Mess-Perfusionskammer 21A ist mit der Spannungsmesseinrichtung (nicht gezeigt) und die Mess-Elektrode 31B der Mess-Perfusionskammer 21B ist mit der Strommesseinrichtung 41B verbunden, so dass gleichzeitige Messungen von Aktionspotentialen und lonenströmen möglich sind. Alternativ kann eine einzige Perfusionskammer vorgesehen sein, die für die Messung Aktionspotentialen oder lonenströmen konfiguriert ist.
Die Halteeinrichtung 10 ist z. B. so bemessen, dass Zellaggregate oder Einzelzellen, insbesondere Oozyten, mit einem Durchmesser von rd. 50 µm bis 1000 µm angesaugt und komprimiert fixiert werden können. Mit dem Messgerät 100 gemäß 10 wird die Zellprobe 1 von einer Oberfläche in die Röhren- oder Trichter-förmige Öffnung der Halteeinrichtung 10 gesaugt, wo sie im Fixierabschnitt 12 mit den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B einen seal-Kontakt herstellt.
Der Fixierabschnitt 12 des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 kann mit einem Fixierelement oder mit mehreren Fixierelementen ausgestattet sein, welche die Zellprobe 1 im Fixierabschnitt 12 verankern. Gemäß 11 wird ein Fixierelement 19 durch ein Ringprofil der Innenwand der Halteeinrichtung 10 im Fixierabschnitt 12 gebildet. Mit dem Ringprofil hat die Innenwand eine Gestalt derart, dass sich der Fixierabschnitt 12 zum Bodenbereich 14 hin wie bei den anderen Ausführungsformen der Erfindung zunächst verjüngt und unmittelbar am Bodenbereich 14 wieder erweitert. Das Fixierelement 19 kann auch einen Fixierabschnitt in Gestalt eines umlaufenden Vorsprungs darstellen (siehe 6), wobei in diesem Fall die Gestalt des übrigens Innenraums der Halteeinrichtung nicht als Fixierabschnitt konfiguriert sein muss.
11 illustriert des Weiteren, dass mindestens eine Perfusionskammer 21A der Perfusionseinrichtung 20 im Wandbereich 15 in den Fixierabschnitt 12 der Halteeinrichtung 10 münden kann. Vorteilhafterweise wird in diesem Fall die Perfusionskammer 21A in dem gleichen Plattenelement 10A wie die Halteeinrichtung 10 gebildet. Die Perfusionskammer 21A umfasst zwei Perfusionskanäle, durch die der untere, erweiterte Bereich des Fixierabschnitts 12 spülbar ist. Eine Mess-Elektrode 31A ist in der Perfusionskammer 21A angeordnet, um Signale für Messungen von Aktionspotentialen und/oder lonenströmen abzuleiten. Alternativ ist die Perfusionskammer 21A als Isolations-Perfusionskammer verwendbar. Eine weitere Mess-Perfusionskammer 21B der Perfusionseinrichtung 20 ist unterhalb der Halteeinrichtung 10 angeordnet und mit dem Fixierabschnitt 12 über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung 22B verbunden. Die Mess-Perfusionskammer 21B enthält mindestens eine Mess-Elektrode 31B, 31C, die mit der Spannungsmesseinrichtung 41A und/oder dem Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B koppelbar ist. Die Ausführungsform der 11 kann so modifiziert werden, dass wie in 9 unterhalb der Halteeinrichtung 10 zusätzlich eine oder mehrere Isolations-Perfusionskammern (nicht gezeigt) mit einer ringförmigen Isolations-Perfusionsöffnung angeordnet sind.
Da sich das Ringprofil des Fixierabschnitts 12 gemäß 11 unmittelbar am Bodenbereich 14 erweitert, wird eine umlaufende kammerförmige Ausnehmung 23 mit dreieckiger Querschnittsform am Bodenbereich 14 der Halteeinrichtung 10 gebildet. Vorteilhafterweise wird damit die gleiche Wirkung erzielt wie mit der quaderförmigen Perfusionskammer in 2B. Diese Ausnehmung bildet einen umlaufenden Perfusionskanal zur Aufnahme eines Mess- oder Isolations-Perfusionsmediums.
In 12 ist eine weitere Abwandlung der Ausführungsform gemäß 1 gezeigt, bei der die Halteeinrichtung 10 des Messgeräts 100 an ihrer Innenseite mindestens eine extrazelluläre Anregungs-Elektrode 18. Mit der Anregungs-Elektrode 18 kann die Zellprobe 1 durch ein Potential eines Stimulators (nicht gezeigt) gereizt werden, um Kontraktionen der Zellprobe 1 (z. B. von Muskelzellen) auszulösen. Zur Messung der Kontraktionen kann eine Manometereinrichtung 44 zur Messung von Druckvariationen als Kontraktionsparameter in einer der Perfusionskammern 21A, 21B der Perfusionseinrichtung 20 angeordnet sein. Alternativ oder zusätzlich kann die Anregungs-Elektrode 18 verwendet werden, um mit einer Spannungsmesseinrichtung 43 Oberflächenpotentiale der Zellprobe 1 zu erfassen. Wenn mehrere Elektrode 18 in der Halteeinrichtung 10 angeordnet sind, können Oberflächenpotentiale an verschiedenen Positionen der Zellprobe 1 registriert werden können.
13 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das Messgerät 100 übereinander eine untere Mess-Perfusionskammer 21A mit einer zentralen Mess-Perfusionsöffnung 22A, eine mittlere Mess-Perfusionskammer 21B und eine Isolations-Perfusionskammer 25 aufweist. Die mittlere Mess-Perfusionskammer 21B und die zugehörige umlaufende Mess-Perfusionsöffnung 22B können mit einer derart geringen Höhe, z. B. 20 µm, gebildet sein, dass die Zellprobe 1 vorteilhafterweise nicht in die seitlich einmündende Perfusionskammer gesaugt oder gedrückt werden kann.
Eine weitere Variante des Messgeräts 100 gemäß 2 ist in 14 mit einer Rückhalteeinrichtung illustriert, die ein poröses Material 53 umfasst. Das poröse Material 53, das für das Perfusionsmedium durchlässig und die Zellprobe 1 undurchlässig ist, kann die Säulenelemente 51, 52 gemäß den 3C und 3D ersetzen oder ergänzen. Das poröse Material 53 wirkt wie ein Filter, der in der umlaufenden Perfusionsöffnung 22B/26 sitzt. Die untere Perfusionsöffnung 22A ist somit von der Rückhalteeinrichtung umgeben, oder die Mess- oder Isolations-Perfusionskammer 21B/25 ist mit der Rückhalteeinrichtung ausgestattet. Das poröse Material 53 kann aus einem Granulat, einem porösen Glas, insbesondere einem Aerogel mit einer Porengröße im Bereich von 100 nm bis 1 um, einem porösen Kunststoff und/oder aus einem Mikrosieb bestehen, dessen Poren durch Schlitze mit einem Abstand von 1 - 10 µm oder durch ein Bündel von Mikrofasern mit einem Innendurchmesser von 1-10 µm gebildet werden. Das poröse Material 53 kann als Teil von einem der Plattenelemente, z. B. mit Photolithographie-Technik gebildet sein.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 1040349 B1 [0002]
EP 1349916 A2 [0002]
EP 1311655 B1 [0002]
US 2002/0064841 A1 [0002]
EP 0938674 B1 [0002]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

O. P. Hamill et al. in „Pflugers Arch.“ 1981 Aug; 391(2):85-100 [0002]
Y. I. Zilberter et al. in „Pflugers Arch.“ 1982 Aug;394(2):150-5 [0002]
B. Schubert, R. Bodewei, S. Hering, A. Wollenberger in „J. Mol. Cell. Cardiol.“ 1987 Nov; 19(11):1129-39 [0002]
M. Huch et al. in „Development“ 2017 Mar 15; 144(6) [0002]
P. Saxena et al. in „Br. J. Pharmacol.“ 2017 Jul 6. doi: 10.1111/bph.13942 [0002]
M. Hencek et al. in „Pflugers Arch.“ 1969;313(1):71-9 [0002]
N. Akaike et al. in „Jpn. J. Physiol.“ 1994;44(5):433-73 [0002]

Claims

Elektrophysiologisches Messgerät (100), das zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1), insbesondere mit einer Querschnittsdimension im Bereich von 50 µm bis 1 mm, eingerichtet ist, umfassend - eine Halteeinrichtung (10) mit einem Innenraum (11), der einen Bodenbereich (14) und einen Wandbereich (15) aufweist und zur Aufnahme der Zellprobe (1) in einem physiologischen Umgebungsmedium (2) konfiguriert ist, - eine Perfusionseinrichtung (20) mit mindestens einer Mess-Perfusionskammer (21A, 21B), die zur Aufnahme eines Perfusionsmediums (3A, 3B) konfiguriert ist und über mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei eine zum Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) weisende Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet ist, - eine Elektrodeneinrichtung (30) mit mindestens einer Mess-Elektrode (31A, 31B), die jeweils für einen elektrischen Kontakt mit dem Perfusionsmedium in der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, und - eine Messeinrichtung (40), die zur Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der mindestens einen Mess-Elektrode (31A, 31B) verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass - die Halteeinrichtung (10) mindestens einen Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) aufweist, der benachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, wobei - geometrische Eigenschaften des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) so gewählt sind, dass die Zellprobe (1) mittels des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) in einem deformierten Zustand in der Halteeinrichtung (10) fixierbar ist.
Messgerät gemäß Anspruch 1, bei dem - der Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) einen Führungsabschnitt (13) aufweist, der an den Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) angrenzt und ein größeres Volumen als der Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) aufweist.
Messgerät gemäß Anspruch 2, bei dem - der Führungsabschnitt (13) eine Trichterform aufweist und für eine Zuführung der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand zu dem Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) eingerichtet ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) im Bodenbereich (14) der Halteeinrichtung (10) und/oder am Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) in den Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) mündet.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Perfusionseinrichtung (20) mindestens zwei Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) aufweist, die übereinander angeordnet sind, wobei - eine untere Mess-Perfusionskammer (21A) über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung (22A) im Bodenbereich (14) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, und - mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer (21B) über eine umlaufende Mess-Perfusionsöffnung (22B) am Wandbereich (15) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist.
Messgerät gemäß Anspruch 5, bei dem - die mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer (21B) an der umlaufenden Mess-Perfusionsöffnung (22B) eine kammerförmige Ausnehmung (23) aufweisen, die so angeordnet ist, dass Perfusionsmedium in der kammerförmigen Ausnehmung (23) die Zellprobe (1) allseits umspülen kann.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Perfusionseinrichtung eine Isolations-Perfusionskammer (25) aufweist, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden Isolationsmediums konfiguriert ist und über mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) mit der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei - die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) benachbart zu der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, und - bei Beaufschlagung der Isolations-Perfusionskammer (25) mit einem Überdruck die mittels des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) fixierte Zellprobe (1) mit dem Isolationsmedium perfundierbar ist.
Messgerät gemäß Anspruch 7, bei dem - die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) im Bodenbereich (14) der Halteeinrichtung (10) und/oder für eine laterale Perfusion der Zellprobe (1) am Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) in den Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) mündet.
Messgerät gemäß Anspruch 7 oder 8, bei dem - die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) und die Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) zueinander konzentrisch angeordnet sind.
Messgerät gemäß Anspruch 7 oder 8, bei dem - die Isolations-Perfusionskammer (25) und die mindestens eine Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) übereinander angeordnet sind, wobei - eine untere Mess-Perfusionskammer (21A) über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung (22A) im Bodenbereich (14) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, und - die Isolations-Perfusionskammer (25) oberhalb der unteren Mess-Perfusionskammer (21A) über eine umlaufende Isolations-Perfusionsöffnung (26) am Wandbereich (15) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist.
Messgerät gemäß Anspruch 10, bei dem - die Perfusionseinrichtung (20) mindestens zwei Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) aufweist, die übereinander angeordnet sind, wobei - zwischen der unteren Mess-Perfusionskammer (21A) und der Isolations-Perfusionskammer (25) eine mittlere Mess-Perfusionskammer (21B) über eine umlaufende Mess-Perfusionsöffnung (22B) am Wandbereich (15) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist.
Messgerät gemäß Anspruch 10 oder 11, bei dem - die Isolations-Perfusionskammer (25) oder die mittlere Mess-Perfusionskammer (21B) an der umlaufenden Mess-Perfusionsöffnung (22B) eine kammerförmige Ausnehmung (23) aufweisen, die so angeordnet ist, dass Perfusionsmedium in der kammerförmigen Ausnehmung (23) die Zellprobe (1) allseits umspülen kann.
Messgerät gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 oder 10 bis 12, bei dem - die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) und/oder die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) für eine laterale Perfusion der Zellprobe (1) am Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) in den Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) mündet, und - an der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) und/oder der mindestens einen Isolations-Perfusionsöffnung (26) eine Rückhalteeinrichtung (50) angeordnet ist, die für Perfusionsflüssigkeiten durchlässig und für die Zellprobe (1) undurchlässig ist.
Messgerät gemäß Anspruch 13, bei dem - die Rückhalteeinrichtung (50) mindestens eines von einem porösen Material (53), insbesondere mit Porengrößen im Bereich von 100 nm bis 1 um, einem Material mit durchgehenden Kanälen, insbesondere mit Durchmessern im Bereich von 100 nm bis 1 um, einem Filtermaterial und einer Verteilung von Säulenelementen (50) umfasst.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Perfusionseinrichtung zusätzlich eine Test-Perfusionskammer aufweist, die zur Aufnahme einer Testsubstanz konfiguriert ist und über eine Test-Perfusionsöffnung mit der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei - die Test-Perfusionsöffnung in dem Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) benachbart zu der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Halteeinrichtung (10) oder die Perfusionseinrichtung (20) zusätzlich mindestens eine Unterdruck-Kammer aufweist, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden Druckmediums konfiguriert ist und über mindestens eine Saugleitung (16) mit der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei - bei Beaufschlagung der mindestens einen Unterdruck-Kammer mit einem Unterdruck die Zellprobe (1) in Eingriff mit dem Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) ansaugbar ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Messeinrichtung (40) für die Erfassung von einem Aktionspotential der Zellprobe (1) und/ oder einem lonenstrom durch eine Membran der Zellprobe (1) konfiguriert ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Perfusionseinrichtung zwei Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) und die Messeinrichtung (40) zwei Messkreise aufweist.
Messgerät gemäß Anspruch 18, bei dem - die Messkreise jeweils für die Erfassung des Aktionspotentials der Zellprobe (1) oder des lonenstroms durch eine Membran der Zellprobe (1) konfiguriert sind.
Messgerät gemäß Anspruch 18 oder 19, bei dem - die Halteeinrichtung (10) zwei Fixierabschnitte (12A, 12B) aufweist.
Messgerät gemäß Anspruch 20, bei dem - die Mess-Perfusionsöffnungen (22A, 22B) der Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) und die Fixierabschnitte (12A, 12B) zueinander benachbart angeordnet sind.
Messgerät gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem - die Mess-Perfusionsöffnungen (22A, 22B) der Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) zueinander konzentrisch angeordnet sind.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) die Form eines Hohlzylinders oder eines Trichters aufweist.
Messgerät gemäß Anspruch 23, bei dem - der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) in Längsrichtung des Hohlzylinders oder Trichters eine Länge aufweist, die mindestens gleich dem 0,3-fachen Durchmesser, insbesondere mindestens gleich dem 1,5-fachen Durchmesser der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand ist.
Messgerät gemäß einem der Ansprüche 23 oder 24, bei dem - der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) die Form des Trichters aufweist, wobei - der Trichter einen Trichterwinkel relativ zur Ebene der Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) aufweist, der im Bereich von 50° bis 85° gewählt ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) einen umlaufenden Vorsprung (17) in der Halteeinrichtung (10) umfasst, wobei der umlaufende Vorsprung (17) für eine Verankerung der Zellprobe (1) eingerichtet ist.
Messgerät gemäß Anspruch 26, bei dem - der umlaufende Vorsprung (17) eine Dicke aufweist, die mindestens gleich dem 0,1-fachen Durchmesser und höchstens gleich dem 0,5-fachen Durchmesser der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) einen Innendurchmesser aufweist, der höchstens gleich dem 0,9-fachen Durchmesser, insbesondere höchstens gleich dem 0,7-fachen Durchmesser der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) einen Durchmesser im Bereich von 5 µm bis 100 µm aufweist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - eine Innenoberfläche des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) aus einem elektrisch leitenden Material gebildet ist, und/oder - in der Halteeinrichtung (10) eine Anregungs-Elektrode (18) angeordnet ist, die für eine extrazelluläre elektrische Anregung der Zellprobe (1) konfiguriert ist.
Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Halteeinrichtung (10), die Perfusionseinrichtung und die Elektrodeneinrichtung (30) als Mikrofluidikvorrichtung aufgebaut sind.
Hochdurchsatz-Testgerät, das eine Vielzahl von Messgeräten gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst.
Elektrophysiologisches Messverfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1), insbesondere mit einer Querschnittsdimension im Bereich von 50 µm bis 1 mm, unter Verwendung eines Messgeräts oder eines Hochdurchsatz-Testgeräts gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30, umfassend die Schritte - Bereitstellung der Zellprobe (1) an der Halteeinrichtung (10), - Beaufschlagung der Perfusionseinrichtung mit einem Unterdruck derart, dass die Zellprobe (1) in den Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) gezogen und mit diesem fixiert wird, - Beaufschlagung der Perfusionseinrichtung mit einem Überdruck derart, dass die Zellprobe (1) mit mindestens einem Perfusionsmedium perfundiert wird, und - Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der Messeinrichtung (40).
Messverfahren gemäß Anspruch 33, bei dem - die Zellprobe (1) ein Spheroid-Aggregat oder eine Einzelzelle umfasst.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 34, bei dem - die Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts die Erfassung eines Aktionspotentials der Zellprobe (1) und/oder eines lonenstroms durch eine Membran der Zellprobe (1) umfasst.
Messverfahren gemäß Anspruch 35, bei dem - das Aktionspotential der Zellprobe (1) und der lonenstrom durch eine Membran der Zellprobe (1) gleichzeitig erfasst werden.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 36, bei dem - die Zellprobe (1) mit einem elektrisch nicht-leitenden Isolationsmedium perfundiert wird.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 37, bei dem - die Perfusionseinrichtung die Test-Perfusionskammer aufweist, und - die mindestens eine Test-Perfusionskammer aufeinanderfolgend mit Testsubstanzen beaufschlagt wird und die Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts in Abhängigkeit von der jeweiligen Testsubstanz erfolgt.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 38, mit dem Schritt - Kontraktionsmessung an der Zellprobe (1), insbesondere mittels einer Druck- und/oder Impedanzmessung.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 39, bei dem - der in dem Fixierabschnitt fixierte Teil der Zellprobe (1) an eine unterhalb des Fixierabschnitts angeordnete Mess-Perfusionsöffnung gesaugt wird, die mit einer separaten Saugleitung und separaten Unterdruckkammer oder Mikrofluidkanälen (21 A/B) verbunden ist.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 40, bei dem - der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) eine Durchmischung einer Suspensionsflüssigkeit in der Halteeinrichtung und eines Perfusionsmediums (3A, 3B) behindert.
Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 41, bei dem - nach der Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts die Zellprobe aus dem elektrophysiologischen Messgerät (100) entnommen und für biochemische und molekularbiologische Untersuchungen aufgearbeitet und/oder in ein Zellkulturgefäß überführt wird.
Messkit, das für pharmakologische Untersuchungen, insbesondere Toxizitätstests, an Zellaggregaten ausgelegt ist, umfassend - das Messgerät gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32, und - mindestens eine Testsubstanz mit einer physiologischen, insbesondere arrhythmogenen, Wirkung auf die Zellprobe.
Messkit gemäß Anspruch 43, bei dem - die mindestens eine Testsubstanz zur Beeinflussung von Parameter des Aktionspotentials, insbesondere Anstiegssteilheit, Länge und/oder Auftreten von Nachpotentialen, und/oder von lonenströmen (Hemmung-Stimulation) geeignet ist.