WO2023110314A1 - Vorrichtung und verfahren zum splitten dreidimensionaler agglomerate - Google Patents

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agglomerates
fragments
dimensional
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Michael Stumber
Bernd SCHEUFELE
Tabea Hein
Carina Schuessler
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Robert Bosch Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device, a method for operating the same, and to a processing unit and a cartridge comprising the microfluidic device, according to the preamble of the independent claims.
  • microfluidics offers advantages compared to conventional laboratory tests, such as smaller sample volumes and reagents required, shorter analysis times and processes running in parallel.
  • So-called lab-on-a-chip systems are microfluidic systems that accommodate the functionalities of a macroscopic laboratory on a plastic substrate for automated processing. Such systems make it possible to process biochemical processes largely or completely automatically.
  • Lab-on-a-chip systems typically include two main components.
  • the first is a test carrier, for example in the form of a cartridge, which structures and mechanisms for the manipulation of a recorded sample, in particular passive components such as channels, reaction chambers or upstream reagents or active components such as valves, pumps or mixers.
  • the second main component is a control unit for controlling the microfluidic processes in the cartridge.
  • the microfluidic module has a module body with a bottom configured for positioning on a stage of a microscope.
  • a channel is formed in the module body with a constriction, the channel being configured for hydrodynamic positioning of the three-dimensional structure at the constriction when a liquid flows through the channel.
  • Coplanar film electrodes are placed at the ends of the channel to perform an impedance analysis of the three-dimensional structure fixed at the constriction.
  • DE 10 2017 130 518 A1 discloses a measuring device, a measuring method and a high-throughput test device for electrophysiological measurements on cell aggregates.
  • a fixing portion of a microfluidic channel of the measuring device is constricted such that a spheroid guided into the constriction is deformed from a spherical shape to an elongated shape. This serves to ensure that when the cell aggregate is flushed with an insulating medium, this flows through the cell aggregate over the shortest possible path.
  • Perfusion with an insulating medium serves to prevent leakage currents between the cells of the cell aggregate during an electrophysiological measurement.
  • tumor organoids and spheroids are used to research tumor diseases. These enable very good reproduction of various pathological tissue conditions, which is why they are ideal for drug tests to evaluate the effectiveness and dosage of drugs. These observations can then be used, for example, to select a personalized drug-based cancer therapy for the individual patient, which takes individual characteristics into account and thus optimizes the efficiency of the therapy.
  • tumor organoids are thus three-dimensional cell agglomerates, which have a similar composition and architecture to the patient's primary tumor tissue. For example, they have a diameter of 30-500 ⁇ m.
  • Spheroids are three-dimensional cell agglomerates that can be generated by aggregation and organization of a few thousand cells with a diameter of 100 - 800 pm. Compared to organoids, spheroids are less complex and typically have only one type of cell.
  • the main process steps here are the cultivation of organoids or spheroids and their subsequent expansion.
  • the organoids or spheroids are enzymatically and/or mechanically split into organoid or spheroid fragments of a few tens of cells and into individual organoid cells or spheroid cells. Then the split organoid or spheroid fragments and cells are seeded again. In this way, the organoids or spheroids multiply.
  • splitting is understood to mean a dissolution of connections between individual structures of a three-dimensional agglomerate and the resulting dissociation of the three-dimensional agglomerate into agglomerate fragments and/or individual structures.
  • three-dimensional agglomerates is understood to mean, for example, cell agglomerates such as organoids or spheroids.
  • cell agglomerates such as organoids or spheroids.
  • connections between cells in a cell agglomerate are broken, and the cell agglomerate is dissociated as a result into multicellular cell agglomerate fragments or individual cells.
  • the present invention addresses a microfluidic implementation of the processes for splitting three-dimensional agglomerates, such as tumor organoids or tumor spheroids.
  • a microfluidic device for mechanical splitting in particular to support an enzymatic splitting, of three-dimensional agglomerates into individual structures and/or agglomerate fragments with a first fluidic connection and a second fluidic connection and a first microfluidic connection arranged between the first and the second fluidic connection Channel, and a method for operating the same provided with the features of the independent claims.
  • the first microfluidic channel of the microfluidic device has at least one constriction at which three-dimensional agglomerates can be mechanically split open by friction.
  • the advantage here is that the work steps for splitting three-dimensional cell agglomerates can be carried out automatically by means of the microfluidic device. This saves a lot of time due to the savings in manual work steps, shorter analysis times and processes running in parallel. Furthermore, these work steps can not only be carried out by trained and experienced specialists, which relieves them.
  • the three-dimensional agglomerates and the agglomerate fragments, as well as the individual structures, remain viable and can be cultivated.
  • the at least one constriction is formed by an, in particular continuous, narrowing of the diameter of the first microfluidic channel.
  • the first microfluidic channel is tubular, for example, resulting in a round cross section.
  • the at least one constriction is formed by narrowing, in particular continuously, the width and/or height of the first microfluidic channel.
  • the first microfluidic channel is angular, for example, so that a predominantly square or rectangular cross section results, for example.
  • a continuous streamlining of the first microfluidic channel offers the advantage that the constriction has no edges at which the individual structures of the three-dimensional agglomerates can break open or break and the connections between the individual structures of the three-dimensional agglomerates can nevertheless become detached.
  • the cross section of the constriction is narrowed to 1/10 of the cross section of the first microfluidic channel in a central region of the constriction.
  • the at least one constriction of the first microfluidic channel has a curved shape.
  • the first microfluidic channel can be designed in a meandering shape and/or the at least one constriction of the first microfluidic channel is designed in a meandering shape.
  • the cross section of the microfluidic channels is, for example, rectangular or square, it being possible for the corners to be rounded.
  • the cross section of the microfluidic channels is round or oval, for example.
  • the first microfluidic channel and in particular a first section of the first microfluidic channel, can be temperature-controlled, in particular heated and/or cooled, with the at least one constriction.
  • the microfluidic device comprises, for example, a heating device which heats or cools the first microfluidic channel, and in particular a first section of the first microfluidic channel, with the at least one constriction.
  • the advantage here is that in this way an optimal temperature for splitting the three-dimensional agglomerates can be provided.
  • An optimum temperature for the splitting depends, among other things, on the cultivation of the three-dimensional agglomerates, for example.
  • the enzymatic splitting can be further improved by setting an optimal working temperature of the enzyme.
  • the enzyme-containing solution comprises, for example, the enzyme trypsin or TrypLETM Express enzyme (Thermofisher), the optimum temperature of which is 37° Celsius.
  • the microfluidic device comprises a first retaining element, which is formed from semicircular capture structures and/or from capture structures in the form of posts, troughs or pots. It is advantageous here that the three-dimensional agglomerates are held close to the at least one constriction by the named retaining structures when passing through the first microfluidic channel, so that they are in the correct position for subsequent splitting.
  • semicircular capture structures should be understood to mean continuous or non-continuous semicircular obstacles that are arranged next to one another and/or one behind the other in the first microfluidic channel, so that the three-dimensional agglomerates are held in the semicircles and the spaces between the semicircles or not -continuous semicircles the spaces between the semicircles themselves cannot pass in the unsplit state.
  • catch structures in the form of posts should be understood to mean several pillars or posts arranged next to one another, the three-dimensional agglomerates not fitting through the space between the individual posts due to their size, so that only split individual structures or agglomerate fragments can pass through the space .
  • capture structures in the form of troughs or pots should be understood to mean depressions in the first microfluidic channel, which have the shape of elongated troughs or round pots into which the three-dimensional agglomerates sink so that they no longer pass through the microfluidic channel.
  • the first retaining element is designed as a microfilter and/or as a microsieve and/or as a microstructured grid with pores.
  • the pores have a diameter of 20-80 ⁇ m, for example, which is smaller than the diameter of the three-dimensional agglomerates. Pore diameters of this type are therefore particularly advantageous for retaining the three-dimensional agglomerates on the first retaining element, since the three-dimensional agglomerates cannot pass through the first retaining element in the unsplit state.
  • the three-dimensional agglomerates collect on or in front of the first retaining element, as a result of which they are in an optimal starting position for subsequent splitting at the constriction of the first microfluidic channel.
  • the pores of the first retaining element can have a different pore diameter adapted to the respective application.
  • the microfluidic device comprises a second retaining element, which is designed as a microfilter and/or as a microsieve and/or as a microstructured grid with pores.
  • the pores have a diameter of 2-8 ⁇ m, and preferably 2-6 ⁇ m.
  • the second retaining element has a pore diameter smaller than the diameter of the individual structures of the three-dimensional agglomerates.
  • the individual structures and agglomerate fragments can therefore not pass through the second retaining element and accumulate on it.
  • the advantage here is that the second retaining element enables an exchange of liquid, but individual structures and agglomerate fragments are retained so that they cannot leave the microfluidic device unintentionally and are therefore not lost.
  • the split individual structures and/or agglomerate fragments on the retaining element are subjected to an optical and/or microscopic analysis.
  • the advantage here is that the result of the method for splitting the three-dimensional agglomerates can be analyzed directly on the retaining element.
  • the size of the agglomerate fragments can be analyzed, the number of individual structures can be estimated and/or the viability of the individual structures and Agglomerate fragments are analyzed.
  • the individual structures and/or agglomerate fragments are stained, for example on the retaining element, by supplying a staining solution.
  • the three-dimensional agglomerates are stained before being fed into the microfluidic device.
  • the microfluidic device has a second microfluidic channel which, starting from an upper side of the second retaining element, opens into a third microfluidic connection.
  • microfluidic device is thus more flexible and complex, allowing for more flexible handling and more complex microfluidic operations to be performed.
  • the device comprises at least one reservoir for a fluid. It is advantageous here that fluids such as media, rinsing liquids or solutions containing enzymes can be pre-stored in the reservoir. This ensures that these fluids can be supplied quickly and easily.
  • the microfluidic device comprises at least one valve and/or at least one pump, which in particular can be actuated electrically, so that the microfluidic device can be operated electrically.
  • At least one fluidic connection and/or at least one microfluidic channel and/or at least one reservoir for fluids can be individually closed and opened by means of one or more valves, so that the flow through the microfluidic device can be individually defined. In this way, different options for the supply and removal of media and the flow through the microfluidic channels can be easily implemented.
  • the at least one valve is arranged outside of the microfluidic device.
  • the fluids are supplied and discharged and/or the fluids are conveyed by at least one pump.
  • the at least one pump is a microfluidic pump, for example, so that the complex and expensive fluidic connection of the microfluidic device to an external pump is no longer necessary.
  • the fluid supply, discharge and conveying processes can be simple and be implemented in an uncomplicated manner and the microfluidic device is designed to be space-saving, portable and mobile.
  • the at least one pump is arranged outside of the microfluidic device.
  • the at least one pump is, for example, a syringe pump or a peristaltic pump.
  • the subject matter of the invention is also a method for mechanically splitting, in particular to support an enzymatic splitting, of three-dimensional agglomerates into individual structures and agglomerate fragments using the microfluidic device according to the invention with the following steps: a) supplying a first medium with three-dimensional agglomerates via a first fluidic connection b) conveying the first medium with three-dimensional agglomerates via a first microfluidic channel c) pulsatile back and forth movement of the first medium with three-dimensional agglomerates through at least one constriction of the first microfluidic channel, the three-dimensional agglomerates being split mechanically by friction at the constriction.
  • a pulsatile back-and-forth movement of the first medium means that the conveying direction of the first medium through the microfluidic device is temporarily changed by successive intermittent forward and backward conveying of the first medium.
  • the three-dimensional agglomerates come into physical contact with the channel inner walls of the constriction of the first microfluidic channel as a result of the pulsatile back and forth movement of the first medium and rub against them. Additional friction occurs between the three-dimensional agglomerates and the first medium, which is moved back and forth in a pulsatile manner. This picks up a much higher speed than the three-dimensional agglomerates, particularly in the bottlenecks, which also leads to washing off or detachment of individual structures or agglomerate fragments on the surface of the three-dimensional agglomerates. In addition, the three-dimensional agglomerates themselves meet in the constriction, which creates further friction.
  • the connections between the individual structures that are responsible for holding the three-dimensional agglomerate together continue to dissolve. There are more and more splits Individual structures and agglomerate fragments from the three-dimensional agglomerates. In this way, the three-dimensional agglomerates are mechanically dissociated. The individual structures themselves are not damaged and remain viable and cultivable. The individual structures and agglomerate fragments can then be seeded and cultivated again and grow into three-dimensional agglomerates.
  • the first medium with the three-dimensional agglomerates is moved back and forth through the at least one constriction of the first microfluidic channel, for example at a flow rate of 10-80 pl/s.
  • the flow rate is, for example, constant or varying, in particular pulsating.
  • the three-dimensional agglomerates are conveyed in step b) through a first section of the first microfluidic channel to a first retaining element, which retains them in unsplit form.
  • the advantage here is that the three-dimensional agglomerates cannot pass through the retaining element in the unsplit state. This ensures that only split agglomerate fragments or individual structures and fluids can continue to pass through the microfluidic device.
  • the three-dimensional agglomerates collect on or in front of the first retaining element, whereby they are in an optimal starting position for a subsequent splitting at the constriction of the first microfluidic channel.
  • step b) is followed by the following step: b′) supplying and conveying a first rinsing liquid via the first microfluidic channel for washing the three-dimensional cell agglomerates.
  • any residues of the first medium are removed by the first rinsing liquid and the three-dimensional agglomerates as well as the microfluidic device are cleaned.
  • a washing step using a first rinsing liquid is advantageous, since this removes proteins of the first medium adhering to the three-dimensional agglomerates, which otherwise, for example, inhibit the enzyme reaction.
  • a further advantageous embodiment of the microfluidic method provides that the following step takes place after step b) or after step b′): b”) supplying and conveying an enzyme-containing solution via the first microfluidic channel, and in step c) a pulsatile forward and moving the enzyme-containing solution with the three-dimensional agglomerates through the at least one constriction of the first microfluidic channel, so that the enzymatic splitting of the three-dimensional agglomerates is supported mechanically by friction of the three-dimensional agglomerates at the constriction.
  • the enzyme-containing solution with a splitting effect is first added to the three-dimensional agglomerates until the enzyme-containing solution is at least in the area between the first fluidic connection and the first retaining element.
  • the three-dimensional agglomerates are then incubated with the enzyme-containing solution, for example for a period of ten minutes.
  • the enzyme-containing solution with the three-dimensional agglomerates is moved back and forth in a pulsatile manner through the at least one constriction of the first microfluidic channel in order to mechanically support the splitting process.
  • the first microfluidic channel, and in particular the first section of the first microfluidic channel with the at least one constriction is temperature-controlled.
  • a heating element is integrated into the microfluidic device. The heating or cooling takes place, for example, before and/or during step c) of the microfluidic method, so that the first microfluidic channel, and in particular the first section of the first microfluidic channel with the at least one constriction, has the desired temperature during the splitting process. If an enzymatic splitting within the microfluidic device is supported by a mechanical splitting at the at least one constriction of the first microfluidic channel, then the enzymatic splitting is further improved by setting an optimal active temperature of the enzyme.
  • ultrasonic waves and/or vibrations are generated, which act on the three-dimensional agglomerates in the first microfluidic channel, and in particular in the first section of the first microfluidic channel with the at least one constriction, and support and improve the splitting process.
  • step c) is followed by the following step: d) conveying the split individual structures and/or agglomerate fragments through the first retaining element via a second section of the first microfluidic channel to a second retaining element whose pores have a smaller diameter than the diameter of the split individual structures and agglomerate fragments, so that these are held back.
  • the individual structures and agglomerate fragments cannot pass through the second retaining element and accumulate on or in front of the second retaining element.
  • the advantage here is that the individual structures and agglomerate fragments are retained and cannot leave the microfluidic device unintentionally and are therefore not lost. Fluids, on the other hand, can pass through the second retaining element, so that an exchange of liquid can take place.
  • the split individual structures and agglomerate fragments are conveyed through the first retaining element via the second section of the first microfluidic channel to the second retaining element in a second rinsing liquid, which is fed to the first microfluidic channel and conveyed via it becomes.
  • the advantage here is that, for example, the enzyme-containing solution is removed from the three-dimensional agglomerates and the splitting process is stopped in this way.
  • step d) e) conveying back the individual structures and/or agglomerate fragments via the first microfluidic channel and carrying out the individual structures and/or agglomerate fragments via the first fluidic connection, which here serves as an outlet.
  • step d) is followed by the following step: e′) supplying a second medium via a second microfluidic connection, which serves as an inlet here, and guiding the second medium via a third section of the first microfluidic channel to an underside of the second Retaining element and through it, so that the retained individual structures and/or agglomerate fragments on the upper side of the second retaining element are transferred with the second medium into a second microfluidic channel, which opens into a third fluidic connection, and carrying out the individual structures and/or agglomerate - Fragments about the third fluidic connection, which here serves as an outlet.
  • the individual structures and agglomerate fragments do not have to pass through the first and second section of the first microfluidic channel again, but rather are carried out via a third fluidic connection that is closer.
  • the microfluidic method for mechanically splitting three-dimensional agglomerates can be repeated with new three-dimensional agglomerates, which are supplied via the first fluidic connection, while the individual structures and/or agglomerate fragments are removed at regular intervals via the third fluidic connection. This prevents the second retaining element from being overloaded or clogged by too many individual structures and/or agglomerate fragments accumulating.
  • the three-dimensional agglomerates are cell agglomerates, especially organoids or spheroids
  • the split individual structures are cells, especially organoid cells or spheroid cells
  • the agglomerate fragments are cell agglomerate fragments, especially organoid fragments or spheroid fragments.
  • the subject matter of the invention is also a control unit for controlling the microfluidic method according to the invention, in particular by electrical actuation of the at least one valve and/or the at least one pump.
  • Another subject matter of the invention is a cartridge, in particular a microfluidic cartridge, as described for example in DE102016222072A1 or DE102016222075A1, comprising the microfluidic device according to the invention.
  • FIG. 3 the schematic representation of a cartridge according to the invention comprising the microfluidic device according to FIG. 1, and
  • FIG. 1 shows a first embodiment of the microfluidic device 10 according to the invention for the mechanical splitting of three-dimensional agglomerates.
  • the microfluidic device 10 includes a first fluidic connection la and a second fluidic connection lb.
  • a first microfluidic channel 2 is arranged between the first fluidic connection la and the second fluidic connection lb.
  • the first microfluidic channel 2 has a first section 2a, a second section 2b and a third section 2c.
  • the first microfluidic channel 2 has two constrictions 3 in the first section 2a, at which three-dimensional agglomerates can be broken up mechanically by friction.
  • the first microfluidic channel 2 can also have only one constriction 3 or a plurality of constrictions 3 .
  • the constrictions 3 are formed by narrowing the width of the first microfluidic channel 2 .
  • the narrowing of the width of the first microfluidic channel 2 runs continuously from both directions in the direction of the central area 3a of the constriction 3.
  • the first microfluidic channel 2 has a narrowing with a constant width.
  • the narrowing area of the constriction 3 merges directly into a widening area, so that the constriction 3 does not include an area with a constant width.
  • the temperature of the first microfluidic channel 2 can be controlled in the first section 2a, which includes the constrictions 3 .
  • the microfluidic device 10 has, for example, a heating element, not shown in FIG.
  • the microfluidic device 10 has a first retaining element 4 .
  • the first retaining element 4 is designed, for example, as a microfilter or as a microsieve or as a microstructured grid with pores.
  • the pores of the first retaining element 4 have a diameter of 20-80 ⁇ m, for example.
  • the microfluidic device 10 has a second retaining element 5, which is designed as a microfilter and/or microsieve and/or microstructured grid with pores.
  • the pores of the second retaining element 5 have, for example, a diameter of 2-8 ⁇ m, and preferably 2-6 ⁇ m.
  • the first section 2a of the first microfluidic channel 2 extends from the first fluidic connection la to an upper side 4a of the first retaining element 4.
  • the second section 2b of the first microfluidic channel 2 extends from an underside 4b of the first retaining element 4 to an underside 5b of the second retaining element 5.
  • the third section 2c of the first microfluidic channel 2 extends from an upper side 5a of the second retaining element 5 to the second fluidic connection lb.
  • the microfluidic device 10 also has at least one valve, not shown in FIG. 1, and/or at least one pump, not shown in FIG. 1, which can be controlled electrically, so that the microfluidic device 10 can be operated electrically.
  • the microfluidic device 10 comprises, for example, at least one reservoir for a fluid, not shown in FIG.
  • the microfluidic device 10 is designed to carry out a method 500 for mechanically splitting three-dimensional agglomerates into individual structures and agglomerate fragments.
  • organoids into organoid cells and/or organoid fragments to support an enzymatic splitting
  • a first medium for example a solution with organoids
  • the first fluidic connection la which medium is stored upstream, for example in a reservoir not shown in FIG.
  • the first medium with the organoids is conveyed via the first microfluidic channel 2 .
  • the organoids pass through the bottlenecks 3 of the first microfluidic channel 2 and are finally retained by the first retaining element 4, since the diameter of the organoids is larger than the diameter of the pores of the first retaining element 4.
  • the first medium passes through the first retaining element 4 and the second Section 2b of the first microfluidic channel 2, the second retaining element 5 and the third section 2c of the first microfluidic channel 2 and is finally discharged via the second fluidic connection lb. Then, for example, a valve is switched to another reservoir, not shown in FIG. 1, containing a first rinsing liquid.
  • the first rinsing liquid is fed to the microfluidic device 10 via the first fluidic connection 1a and conveyed via the first microfluidic channel 2 .
  • the first rinsing liquid washes the organoids, removing any residue from the first medium.
  • the first rinsing liquid is, for example, a phosphate-buffered saline solution (PBS for short).
  • PBS phosphate-buffered saline solution
  • the first rinsing liquid is discharged again via the second microfluidic connection 1b. Then, for example, a valve is switched to another reservoir, not shown in FIG. 1, with an enzyme-containing solution.
  • a step b”) the enzyme-containing solution is fed to the microfluidic device 10 via the first fluidic connection la and via the first microfluidic channel 2 promoted.
  • the enzyme-containing solution includes, for example, the enzyme trypsin or TrypLETM Express enzyme (Thermofisher), which leads to an enzymatic splitting of the organoids. If the enzyme-containing solution is in the entire first section 2a of the first microfluidic channel 2, the enzymatic splitting of the organoids is carried out mechanically in step c) by pulsatile moving the enzyme-containing solution with the organoids back and forth through the constrictions 3 of the first microfluidic channel 2 supported.
  • organoid cells and/or organoid fragments are cleaved from the organoids until the organoids have completely split into organoid cells and/or organoid fragments a few tens of organoid cells are split.
  • the organoid cells and/or organoid fragments now have a diameter smaller than the pore diameter of the first retaining element 4 .
  • the first section 2a of the first microfluidic channel 2 with the constrictions 3 is heated, for example, in particular in order to set an ideal temperature for the enzyme effect.
  • a valve is switched to another reservoir, not shown in FIG. 1, with a second rinsing liquid.
  • the second rinsing liquid is fed to the microfluidic device 10 via the first fluidic connection 1a and conveyed via the first microfluidic channel 2 .
  • the enzyme-containing solution is removed by the second rinsing liquid, stopping the splitting process.
  • the organoid cells and organoid fragments are transported with the second rinsing liquid through the first retaining element 4 and over the second section 2b of the first microfluidic channel 2 until they are finally retained on an underside 5b of the second retaining element 5 .
  • the pores of the second retaining element 5 have a smaller diameter than the organoid cells and organoid fragments. Only the second rinsing liquid passes through the second retaining element 5 and the third section 2c of the first microfluidic channel 2 and is finally discharged via the second fluidic connection 1b.
  • a second medium is fed to the microfluidic device 10 via the second fluidic connection 1b and conveyed via the first microfluidic channel 2 to the first fluidic connection 1a, which serves as an outlet here.
  • the second medium first passes through the third section 2c of the first microfluidic channel 2 and the second retaining element 5.
  • the organoid cells and organoid fragments that have accumulated on the underside 5b of the second retaining element 5 are removed in step e) carried along with the second medium via the first microfluidic channel 2, so that the organoid Cells and organoid fragments are also carried out via the first fluidic connection la.
  • organoid cells and organoid fragments can be forwarded, divided and/or seeded again, if necessary, for renewed growth of organoids.
  • a method for splitting spheroids into spheroid cells and/or spheroid fragments to support enzymatic splitting takes place analogously to this.
  • FIG. 2 shows the microfluidic device 10 according to the invention in a second embodiment.
  • the microfluidic device 10 is constructed analogously to the microfluidic device 10 in FIG. 1 with the differences described below.
  • the second section 2b of the first microfluidic channel 2 is subdivided into two areas—a first area 2b′ of the second section 2b and a second area 2b′′ of the second section 2b.
  • the first area 2b′ is on a lower level and the second area 2b′′ is on a higher level.
  • a structure 6 is arranged between the first area 2b′ and the second area 2b′′ of the second section 2b of the first microfluidic channel 2, which structure provides a vertically aligned passage between the lower-lying first area 2b′ of the second section 2b to the higher-lying second area 2b” of the second section 2b.
  • the microfluidic device 10 has a second microfluidic channel 2′, which, starting from an upper side 5a of the second retaining element 5, opens into a third microfluidic connection 1c.
  • the second retainer 5 is arranged at an intermediate level in the vertical direction with respect to the upper level and the lower level
  • FIG. 2 indicates, as an example for all embodiments of the microfluidic devices 10 according to the invention, that the microfluidic device 10 is accommodated, for example, on a plastic substrate 20 or chip. (as relaxed as in parallel registration)
  • the split organoid cells and organoid fragments pass in step d) the first retaining element 4 and, after passing through it, reach a first area 2b' of the second section 2b of the first microfluidic channel 2, which is located on a deep lying level.
  • the organoid cells and organoid fragments are guided upwards by the vertically aligned structure 6, so that they reach a second area 2b′′ of the second section 2b, which is located on a higher level. From there the organoid cells and organoid fragments are flushed directly onto the upper surface 5a of the second retaining element 5, which in turn lies at the intermediate level slightly lower in relation to the higher level and slightly higher in relation to the lower level.
  • the second retaining element 5 prevents the organoid cells and organoid fragments from passing through so that they accumulate on the top surface 5a thereof. Only the second rinsing liquid passes through the second retaining element 5 and the third section 2c of the first microfluidic channel 2 and is finally discharged via the second fluidic connection 1b. In this case, the second microfluidic channel 2′ is closed, for example by a valve that is not shown.
  • the second section 2b of the first microfluidic channel 2 adjacent to the second retaining element 5 is closed, for example by a valve not shown, and the second microfluidic channel 2' is opened, for example by opening a not shown valve.
  • a second medium is fed in via the second fluidic connection 1b, which serves as an inlet here.
  • the second medium is conveyed via the third section 2c of the first microfluidic channel 2 , passes the second retaining element 5 , being conveyed through it from an underside 5b of the second retaining element 5 to an upper side 5a of the second retaining element 5 .
  • organoid cells and organoid fragments that have accumulated on the upper side 5a of the second retaining element 5 are carried along with the second medium, directed into the second microfluidic channel 2' and via the third fluidic connection 1c, which serves as an outlet here , executed.
  • organoid cells and organoid fragments can be forwarded, divided and/or seeded again, if necessary, for renewed growth of organoids.
  • the microfluidic device 10 that can be used for this purpose and is not shown in the figures comprises only the first 1a and the second fluidic connection 1b and one between them arranged first microfluidic channel 2.
  • the first microfluidic channel 2 comprises only the first section 2a of the first microfluidic channel 2 with at least one constriction 3.
  • a first medium for example a solution with three-dimensional agglomerates
  • the microfluidic device 10 is fed to the microfluidic device 10 via the first fluidic connection la, which medium is stored upstream in a reservoir, for example.
  • the first medium with the three-dimensional agglomerates is conveyed via the first microfluidic channel 2 until the first medium with the three-dimensional agglomerates is in the first microfluidic channel 2 from the first fluidic connection la to the second fluidic connection lb.
  • the three-dimensional agglomerates are split mechanically by pulsatile back and forth movement of the first medium with the three-dimensional agglomerates through the bottlenecks 3 of the first microfluidic channel 2 . Due to the friction of the three-dimensional agglomerates at the bottlenecks 3 of the first microfluidic channel 2, individual structures and/or agglomerate fragments are split off from the three-dimensional agglomerates until the three-dimensional agglomerates are completely split up into individual structures and/or agglomerate fragments of a few ten individual structures .
  • the microfluidic device 10 is supplied in a step e) via the second fluidic connection lb, for example, the first medium without three-dimensional agglomerates and this is conveyed via the first microfluidic channel 2 to the first fluidic connection la, which here serves as an outlet.
  • the individual structures and agglomerate fragments are carried along with the first medium via the first microfluidic channel 2, so that the individual structures and agglomerate fragments are also carried out via the first fluidic connection 1a.
  • the individual structures and agglomerate fragments can then be passed on, divided up and/or seeded again, if necessary, for renewed growth of three-dimensional agglomerates.
  • FIG. 3 shows a cartridge 100 according to the invention, which, by way of example for all embodiments of the microfluidic device 10 according to the invention, includes a microfluidic device 10 in the first embodiment according to FIG.
  • FIG. 4 shows a flowchart with exemplary embodiments of the method 500 according to the invention for mechanical splitting, in particular to support a enzymatic splitting, from three-dimensional agglomerates to individual structures and/or agglomerate fragments, for example in connection with the exemplary embodiments and process steps described for FIGS.

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Abstract

Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung (10) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmenten beschrieben, mit einem ersten fluidischen Anschluss (1a) und einem zweiten fluidischen Anschluss (1b) und einem zwischen dem ersten (1a) und dem zweiten fluidischen Anschluss (1b) angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal (2), welcher zumindest eine Engstelle (3) aufweist, an welcher dreidimensionale Agglomerate durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind.

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung und Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung, ein Verfahren zum Betrieb derselben sowie auf eine Prozessiereinheit und eine, die mikrofluidische Vorrichtung umfassende Kartusche, nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
Stand der Technik das Interesse an der Verwendung von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen, hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen, da solche dreidimensionalen Agglomerate zum Beispiel organspezifische Eigenschaften gut abbilden können.
Typischerweise erfolgt deren Handhabung manuell mit Hilfsmitteln wie Pipetten, Reaktionsgefäßen und Laborgeräten. Hier bietet die Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Labortests Vorteile wie beispielsweise geringere benötigte Probenvolumina und Reagenzien, verkürzte Analysezeiten sowie parallel ablaufende Vorgänge.
Bei der Implementierung erforderlicher Prozessschritte in ein mikrofluidischen System gibt es jedoch aufgrund deren Komplexität zahlreiche Herausforderungen, die es zu meistern gilt. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Kultivierung und Vermehrung solcher dreidimensionaler Zellagglomerate in einem mikrofluidischen System.
Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, kurz LoC-Systeme, sind mikrofluidische Systeme, welche Funktionalitäten eines makroskopischen Labors auf einem Kunststoffsubstrat für eine automatisierte Prozessierung unterbringen. Solche Systeme ermöglichen es, biochemische Prozesse weitestgehend oder vollständig automatisiert zu prozessieren.
Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen typischerweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle, Reaktionskammern oder vorgelagerte Reagenzien oder auch aktiven Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Steuereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche.
Die DE 1020122198660 Al beschreibt ein mikrofluidisches Modul, ein System und ein Verfahren zur Analyse dreidimensionaler Strukturen. Das mikrofluidische Modul weist einen Modulkörper mit einer Unterseite, die für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist auf. In dem Modulkörper ist ein Kanal gebildet mit einer Engstelle, wobei der Kanal für eine hydrodynamische Positionierung der dreidimensionalen Struktur an der Engstelle beim Durchströmen des Kanals mit einer Flüssigkeit konfiguriert ist.
Es sind koplanare Filmelektroden an den Enden des Kanals angeordnet, um eine Impedanzanalyse der an der Engstelle fixierten dreidimensionalen Struktur durchzuführen.
Aus der DE 10 2017 130 518 Al sind ein Messgerät, ein Messverfahren und ein Hochdurchsatz-Testgerät für elektrophysiologische Messungen an Zellaggregaten bekannt. Ein Fixierabschnitt eines mikrofluidischen Kanals des Messgeräts ist so verengt, dass ein in die Engstelle geleitetes Sphäroid von einer Kugelform in eine elongierte Form verformt wird. Dies dient dazu, dass bei einer Durchspülung des Zellaggregats mit einem Isolationsmedium dieses mit einem möglichst kurzen Weg durch das Zellaggregat fließt. Die Perfusion mit einem isolierenden Medium dient dazu, Leckströme zwischen den Zellen des Zellaggregats während einer elektrophysiologischen Messung zu verhindern.
Offenbarung der Erfindung
Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel so genannte Tumor- Organoide und -Sphäroide zum Einsatz. Diese ermöglichen eine sehr gute Reproduktion verschiedener krankhafter Gewebezustände, weswegen sie sich für Medikamententests zur Evaluierung der Wirksamkeit und Dosierung von Medikamenten anbieten. Mittels dieser Beobachtungen kann dann beispielsweise für den einzelnen Erkrankten eine personalisierte medikamentöse Krebstherapie ausgewählt werden, die individuelle Besonderheiten berücksichtigt und so die Effizienz der Therapie optimiert.
Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor-Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung. Hierbei erfolgt eine Differenzierung und Vermehrung dieser Zellen oder Gewebefragmente, die sich schließlich zu dreidimensionalen Strukturen selbstorganisieren. Die daraus entstehenden Tumor-Organoide sind somit dreidimensionale Zellagglomerate, welche eine ähnliche Zusammensetzung und Architektur aufweisen wie das primäre Tumorgewebe des Patienten. Sie weisen beispielsweise einen Durchmesser 30 - 500 pm auf.
Sphäroide sind dreidimensionale Zellagglomerate, die durch Aggregation und Organisation einiger Tausend Zellen erzeugt werden können mit einem Durchmesser von 100 - 800 pm. Im Vergleich zu Organoiden sind Sphäroide weniger komplex und weisen in der Regel nur eine Art Zellen auf.
Um über einen längeren Zeitraum von mehreren Wochen oder Monaten mit Organoiden oder Sphäroiden arbeiten zu können, werden aktuell etablierte Methoden der 3D-Zellkultivierung angewandt.
Hauptprozessschritte hierbei sind die Kultivierung von Organoiden oder Sphäroiden und deren anschließende Expansion Bei der Expansion werden die Organoide oder Sphäroide enzymatisch und/oder mechanisch in Organoid- oder Sphäroid- Fragmente aus einigen wenigen zehn Zellen und in einzelne Organoid-Zellen oder Sphäroid-Zellen gesplittet. Anschließend werden die gesplitteten Organoid- oder Sphäroid- Fragmente und -Zellen neu ausgesät. Auf diese Weise erfolgt eine Vermehrung der Organoide oder Sphäroide.
Unter dem Begriff „Splitten“ wird im Sinne der vorliegenden Erfindung also eine Auflösung von Verbindungen zwischen Einzelstrukturen eines dreidimensionalen Agglomerats, und die dadurch entstehende Dissoziierung des dreidimensionalen Agglomerats in Agglomerat- Fragmente und/oder Einzelstrukturen verstanden.
Unter dem Begriff dreidimensionale Agglomerate werden im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise Zellagglomerate wie Organoide oder Sphäroide verstanden. Bei einem Split- Vorgang erfolgt also beispielsweise eine Auflösung von Verbindungen zwischen Zellen eines Zellagglomerats, und die dadurch entstehende Dissoziierung des Zellagglomerats in multizelluläre Zellagglomerat- Fragmente bzw. einzelne Zellen.
Beim Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden und Sphäroiden, sind mehrere Schritte zur Zugabe und zur Trennung der dreidimensionalen Agglomerate von verschiedenen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Kulturmedien, Enzymlösungen oder Spülflüssigkeiten wie beispielsweise Waschpuffern, mit anschließender Resuspension in weiteren Flüssigkeiten erforderlich, sowie beispielsweise ein Auf- und Abpipettieren der dreidimensionalen Agglomerate zum mechanischen Splitten. Im Labormaßstab werden hierfür die Gefäße gewechselt sowie Zentrifugationsschritte und visuell zu überwachende Pipettiervorgänge realisiert. Diese Prozessschritte zur Kultivierung und Expansion sind sehr arbeits- und zeitintensiv und können nur von ausgebildetem und erfahrenem Fachpersonal in geeignet ausgestatteten Laboren durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung adressiert eine mikrofluidische Implementierung der Prozesse zum Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Tumor- Organoiden oder Tumor-Sphäroiden.
Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten mit einem ersten fluidischen Anschluss und einem zweiten fluidischen Anschluss und einem zwischen dem ersten und dem zweiten fluidischen Anschluss angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.
Dies beruht insbesondere darauf, dass der erste mikrofluidische Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung zumindest eine Engstelle aufweist, an welcher dreidimensionale Agglomerate durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind.
Vorteilhaft hierbei ist, dass mittels der mikrofluidischen Vorrichtung die Arbeitsschritte zum Splitten von dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert durchgeführt werden können. Somit wird viel Zeit eingespart aufgrund der Einsparung händischer Arbeitsschritte, verkürzter Analysezeiten und parallel ablaufender Vorgänge. Desweiteren sind diese Arbeitsschritte somit nicht nur von ausgebildetem und erfahrenen Fachpersonal durchführbar, wodurch dieses entlastet wird.
Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate und die Agglomerat- Fragmente, sowie die Einzelstrukturen hierbei viabel und kultivierbar bleiben.
Dadurch, dass die Prozessschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die zumindest eine Engstelle durch eine, insbesondere kontinuierliche, Verschlankung des Durchmessers des ersten mikrofluidischen Kanals gebildet. In dieser Ausführung ist der erste mikrofluidische Kanal beispielsweise röhrenförmig ausgeführt, sodass sich ein runder Querschnitt ergibt. Alternativ ist die zumindest eine Engstelle durch eine, insbesondere kontinuierliche, Verschlankung der Breite und/oder Höhe des ersten mikrofluidischen Kanals gebildet. In dieser Ausführung ist der erste mikrofluidische Kanal beispielsweise eckig ausgeführt, sodass sich beispielsweise ein vornehmlich quadratischer oder rechteckiger Querschnitt ergibt.
Vorteilhaft bei einer, insbesondere kontinuierlichen, Verschlankung des ersten mikrofluidischen Kanals zur Bildung der Engstelle ist, dass die Engstelle auf diese Weise herstellungstechnisch einfach realisierbar ist. Eine kontinuierliche Verschlankung des ersten mikrofluidischen Kanals bietet den Vorteil, dass die Engstelle keine Kanten aufweist, an welchen die Einzelstrukturen der dreidimensionalen Agglomerate aufbrechen oder kaputt gehen können und sich die Verbindungen zwischen den Einzelstrukturen der dreidimensionalen Agglomerate dennoch lösen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist der Querschnitt der Engstelle in einem mittigen Bereich der Engstelle auf 1/10 des Querschnitts des ersten mikrofluidischen Kanals verschlankt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist die zumindest eine Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals eine Kurvenform auf. Desweiteren kann der erste mikrofluidische Kanal mäanderförmig ausgestaltet sein und/oder die zumindest eine Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals ist mäanderförmig ausgestaltet.
Der Querschnitt der mikrofluidischen Kanäle ist beispielsweise rechteckig oder quadratisch, wobei die Ecken abgerundet ausgeführt sein können. Alternativ ist der Querschnitt der mikrofluidischen Kanäle beispielsweise rund oder oval.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist der erste mikrofluidische Kanal, und insbesondere ein erster Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals, mit der zumindest einen Engstelle temperierbar, insbesondere beheizbar und/oder kühlbar.
Hierzu umfasst die mikrofluidische Vorrichtung beispielsweise eine Heizeinrichtung, welche den ersten mikrofluidischen Kanal, und insbesondere ein erster Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals, mit der zumindest einen Engstelle beheizt oder kühlt.
Vorteilhaft hierbei ist, dass auf diese Weise eine optimale Temperatur für das Splitten der dreidimensionalen Agglomerate bereitgestellt werden kann. Eine optimale Temperatur für das Splitten hängt unter anderem beispielsweise von der Kultivierung der dreidimensionalen Agglomerate ab. Bei einer Kultivierung von Organoiden in Matrigel® (Corning) ist es beispielsweise vorteilhaft, den ersten mikrofluidischen Kanal, und insbesondere einen ersten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals, mit der zumindest einen Engstelle zu kühlen, da sich Matrigel bei Temperaturen von circa 4°C verflüssigt.
In einer Ausführungsform, in welcher ein enzymatisches Splitten der dreidimensionalen Agglomerate durch ein mechanisches Splitten an der zumindest einen Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals unterstützt wird, kann das enzymatische Splitten durch Einstellen einer optimalen Wirk-Temperatur des Enzyms noch weiter verbessert werden.
Bei einem enzymatischen Splitten von Organiden und/oder Sphäroiden umfasst die enzymhaltige Lösung beispielsweise das Enzym Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher), dessen optimale Wirk-Temperatur bei 37° Celsius liegt.
Weiterhin ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die mikrofluidische Vorrichtung ein erstes Rückhalteelement umfasst, welches aus halbkreisförmigen Fangstrukturen und/oder aus Fangstrukturen in Form von Pfosten, Wannen oder Töpfen gebildet ist. Vorteilhaft hierbei ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate durch die genannten Fangstrukturen beim Durchtritt durch den ersten mikrofluidischen Kanal nahe der zumindest einen Engstelle festgehalten werden, sodass sie sich für ein anschließendes Splitten an der richtigen Position befinden.
Unter halbkreisförmigen Fangstrukturen sollen im Rahmen dieser Anmeldung durchgehende oder nicht-durchgehende halbkreisförmige Hindernisse verstanden werden, welche in dem ersten mikrofluidischen Kanal nebeneinander und/oder hintereinander angeordnet sind, sodass die dreidimensionalen Agglomerate in den Halbkreisen festgehalten werden und die Zwischenräume zwischen den Halbkreisen oder bei nicht-durchgehenden Halbkreisen die Zwischenräume der Halbkreise selbst, im ungesplitteten Zustand nicht passieren können. Unter Fangstrukturen in Form von Pfosten sollen im Rahmen dieser Anmeldung mehrere nebeneinander angeordnete Pfeiler oder Pfosten verstanden werden, wobei die dreidimensionalen Agglomerate aufgrund ihrer Größe nicht durch den Zwischenraum zwischen den einzelnen Pfosten passen, sodass nur gesplittete Einzelstrukturen oder Agglomerat- Fragmente durch den Zwischenraum hindurchtreten können.
Unter Fangstrukturen in Form von Wannen oder Töpfen sollen im Rahmen dieser Anmeldung Vertiefungen des ersten mikrofluidischen Kanals verstanden werden, welche die Form von länglichen Wannen oder runden Töpfen aufweisen, in welche die dreidimensionalen Agglomerate absinken, sodass sie den mikrofluidischen Kanal nicht weiter passieren. In einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform ist das erste Rückhalteelement als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet. Die Poren weisen beispielsweise einen Durchmesser von 20-80 pm auf, welcher kleiner ist, als der Durchmesser der dreidimensionalen Agglomerate. Derartige Porendurchmesser sind somit für die Rückhaltung der dreidimensionalen Agglomerate auf dem ersten Rückhalteelement besonders vorteilhaft, da die dreidimensionalen Agglomerate das erste Rückhalteelement im ungesplitteten Zustand nicht passieren können.
Auf diese Weise wird sichergestellt, dass nur gesplittete Agglomerat- Fragmente oder Einzelstrukturen sowie Fluide die mikrofluidische Vorrichtung weiter passieren können. Zudem ist es vorteilhaft, dass sich die dreidimensionalen Agglomerate auf oder vor dem ersten Rückhalteelement sammeln, wodurch sie sich an einer optimalen Ausgangsposition für ein nachfolgendes Splitten an der Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals befinden.
Alternativ können die Poren des ersten Rückhalteelements einen anderen, auf die jeweilige Anwendung angepassten Porendurchmesser aufweisen.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor, dass die mikrofluidische Vorrichtung ein zweites Rückhalteelement umfasst, welches als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist. Die Poren weisen insbesondere einen Durchmesser von 2-8 pm, und bevorzugt 2-6 pm auf.
Das zweite Rückhalteelement weist einen Porendurchmesser kleiner des Durchmessers der Einzelstrukturen der dreidimensionalen Agglomerate auf. Die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente können das zweite Rückhalteelement somit nicht passieren und sammeln sich auf diesem an. Vorteilhaft hierbei ist, dass durch das zweite Rückhalteelement ein Flüssigkeitsaustausch ermöglicht ist, Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente jedoch festgehalten werden, sodass sie die mikrofluidische Vorrichtung nicht ungewollt verlassen können und somit nicht verloren gehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass die gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente auf dem Rückhalteelement einer optischen und/oder mikroskopischen Analyse unterzogen werden.
Vorteilhaft hierbei ist, dass so das Ergebnis des Verfahrens zum Splitten der dreidimensionalen Agglomerate direkt auf dem Rückhalteelement analysiert werden kann. Es kann beispielsweise die Größe der Agglomerat- Fragmente analysiert werden, die Menge der Einzelstrukturen abgeschätzt werden und/oder die Viabilität der Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente analysiert werden. Hierzu werden die Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente beispielsweise auf dem Rückhalteelement angefärbt durch Zuführen einer Färbelösung. Alternativ werden die dreidimensionalen Agglomerate angefärbt, bevor sie der mikrofluidischen Vorrichtung zugeführt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist die mikrofluidische Vorrichtung einen zweiten mikrofluidischen Kanal auf, welcher ausgehend von einer Oberseite des zweiten Rückhalteelements in einem dritten mikrofluidischen Anschluss mündet.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Einzelstrukturen somit separat über den zweiten mikrofluidischen Kanal transportiert werden können und über den dritten mikrofluidischen Anschluss ausgeführt werden können. Die mikrofluidische Vorrichtung ist somit flexibler und komplexer, was eine flexiblere Handhabung und die Durchführung komplexerer mikrofluidischer Vorgänge erlaubt.
Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die Vorrichtung zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst. Vorteilhaft hierbei ist, dass in dem Reservoir Fluide wie beispielsweise Medien, Spülflüssigkeiten oder enzymhaltige Lösungen vorlagerbar sind. So ist eine schnelle und einfache Zuführung dieser Fluide sichergestellt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Ventil und/oder zumindest eine Pumpe, welche insbesondere elektrisch ansteuerbar sind, sodass die mikrofluidische Vorrichtung elektrisch betreibbar ist.
Vorteilhaft hierbei ist, dass mittels eines oder mehreren Ventilen zumindest ein fluidischer Anschluss und/oder zumindest ein mikrofluidischer Kanal und/oder zumindest ein Reservoir für Fluide individuell schließ- und öffenbar ist, sodass der Fluss durch die mikrofluidische Vorrichtung individuell festlegbar ist. Auf diese Weise sind verschiedene Möglichkeiten der Zu- und Abführung von Medien sowie des Durchflusses durch die mikrofluidischen Kanäle einfach realisierbar.
In einer alternativen Ausführungsform ist das zumindest eine Ventil außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet.
In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt das Zu- und Abführen der Fluide und/oder das Fördern der Fluide durch zumindest eine Pumpe. Bei der zumindest einen Pumpe handelt es sich beispielsweise um eine mikrofluidischen Pumpe, sodass die komplexe und aufwändige fluidische Verbindung der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer externen Pumpe entfällt. Auf diese Weise können die fluidischen Zu-, Abführ- und Förderprozesse einfach und unkompliziert realisiert werden und die mikrofluidische Vorrichtung platzsparend, portabel und mobil ausgeführt werden.
In einer alternativen Ausführungsform ist die zumindest eine Pumpe außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet. Die zumindest eine Pumpe ist beispielsweise eine Spritzenpumpe oder eine peristaltische Pumpe.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmenten mittels der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung mit folgenden Schritten: a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten über einen ersten fluidischen Anschluss b) Fördern des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten über einen ersten mikrofluidischen Kanal c) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten durch zumindest eine Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals, wobei die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch durch Reibung an der Engstelle gesplittet werden.
Mit einem pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums ist gemeint, dass die Förderrichtung des ersten Mediums durch die mikrofluidische Vorrichtung temporär gewechselt wird durch aufeinanderfolgendes stoßweises Vorwärts- und Rückwärtsfördern des ersten Mediums.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate durch das pulsatile Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit den Kanalinnenwänden der Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals in physischen Kontakt kommen und an diesen reiben. Zusätzliche Reibung entsteht zwischen den dreidimensionalen Agglomeraten und dem pulsatil hin- und herbewegten ersten Medium. Dieses nimmt insbesondere in den Engstellen eine sehr viel höhere Geschwindigkeit auf als die dreidimensionalen Agglomerate, was auch zu einem Abwaschen oder Ablösen von Einzelstrukturen oder Agglomerat- Fragmenten an der Oberfläche der dreidimensionalen Agglomerate führt. Zudem treffen auch die dreidimensionalen Agglomerate selbst in der Engstelle aufeinander, wodurch eine weitere Reibung erzeugt wird. Durch diese Reibungsvorgänge lösen sich die Verbindungen zwischen den Einzelstrukturen, die für den Zusammenhalt des dreidimensionalen Agglomerats verantwortlich sind, immer weiter auf. Es spalten sich immer mehr Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente von den dreidimensionalen Agglomeraten ab. Auf diese Weise werden die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch dissoziiert. Hierbei werden die Einzelstrukturen selbst nicht beschädigt und bleiben viabel und kultivierbar. Die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmenten können dann neu ausgesät und kultiviert werden und zu dreidimensionalen Agglomeraten heranwachsen.
Es ist desweiteren vorteilhaft die Arbeitsschritte zum Splitten von dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert mittels des vorgeschlagenen mikrofluidischen Verfahrens durchzuführen. Auf diese Weise wird viel Zeit eingespart aufgrund des Wegfalls händischer Arbeitsschritte, verkürzter Analysezeiten und parallel ablaufender Vorgänge. Desweiteren sind diese Arbeitsschritte nicht nur von ausgebildetem und erfahrenen Fachpersonal durchführbar, wodurch dieses entlastet wird.
Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.
Dadurch, dass die Prozessschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Das erste Medium mit den dreidimensionalen Agglomeraten wird hierbei beispielsweise mit einer Flussrate von 10 - 80 pl/s durch die zumindest eine Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals hin- und herbewegt. Hierbei ist die Flussrate beispielsweise konstant oder variierend, insbesondere pulsierend.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des mikrofluidischen Verfahrens werden die dreidimensionalen Agglomerate in Schritt b) durch einen ersten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals bis zu einem ersten Rückhalteelement gefördert, welches diese in ungesplitteter Form zurückhält.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate das Rückhalteelement im un gesplitteten Zustand nicht passieren können. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass nur gesplittete Agglomerat- Fragmente oder Einzelstrukturen sowie Fluide die mikrofluidische Vorrichtung weiter passieren können. Zudem ist es vorteilhaft, dass sich die dreidimensionalen Agglomerate auf oder vor dem ersten Rückhalteelement sammeln, wodurch sie sich an einer optimalen Ausgangsposition für ein nachfolgendes Splitten an der Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals befinden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform erfolgt nach Schritt b) folgender Schritt: b') Zuführen und Fördern einer ersten Spülflüssigkeit über den ersten mikrofluidischen Kanal zum Waschen der dreidimensionalen Zellagglomerate.
Durch die erste Spülflüssigkeit werden eventuelle Rückstände des ersten Mediums entfernt und die dreidimensionalen Agglomerate sowie auch die mikrofluidische Vorrichtung gereinigt. In einer Ausführungsform, in welcher das mechanische Splitten der dreidimensionalen Agglomerate zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens ausgeführt wird, ist ein Waschschritt mittels einer ersten Spülflüssigkeit vorteilhaft, da hierdurch an den dreidimensionalen Agglomeraten anhaftende Proteine des ersten Mediums entfernt werden, welche sonst beispielsweise die Enzymreaktion hemmen.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des mikrofluidischen Verfahrens sieht vor, dass nach Schritt b) oder nach Schritt b') folgender Schritt erfolgt: b”) Zuführen und Fördern einer enzymhaltigen Lösung über den ersten mikrofluidischen Kanal, und wobei in Schritt c) ein pulsatiles Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten durch die zumindest eine Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals erfolgt, sodass das enzymatische Splitten der dreidimensionalen Agglomerate mechanisch durch Reibung der dreidimensionalen Agglomerate an der Engstelle unterstützt wird.
Hierzu wird beispielsweise zuerst die enzymhaltige Lösung mit splittender Wirkung zu den dreidimensionalen Agglomeraten gegeben, bis sich die enzymhaltige Lösung zumindest im Bereich zwischen dem ersten fluidischen Anschluss und dem ersten Rückhalteelement befindet. Die dreidimensionalen Agglomerate werden dann mit der enzymhaltigen Lösung inkubiert, beispielsweise für einen Zeitraum von zehn Minuten. Während der Inkubation oder anschließend erfolgt das pulsatile Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten durch die zumindest eine Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals, um den Split-Vorgang mechanisch zu unterstützen. Durch das enzymatische und mechanische Einwirken lösen sich Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente von den dreidimensionalen Agglomeraten ab, sodass der Split- Vorgang mechanisch unterstützt und verbessert sowie insbesondere beschleunigt wird. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird der erste mikrofluidische Kanal, und insbesondere der erste Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals mit der zumindest einen Engstelle, temperiert. Hierzu ist beispielsweise ein Heizelement in die mikrofluidische Vorrichtung integriert. Die Beheizung oder Kühlung erfolgt beispielsweise vor und/oder während Schritt c) des mikrofluidischen Verfahrens, sodass der erste mikrofluidische Kanal, und insbesondere der erste Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals mit der zumindest einen Engstelle, während des Split-Vorgangs die gewünschte Temperatur aufweist. Wird ein enzymatisches Splitten innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung durch ein mechanisches Splitten an der zumindest einen Engstelle des ersten mikrofluidischen Kanals unterstützt, so wird das enzymatische Splitten durch Einstellen einer optimalen Wirk- Temperatur des Enzyms noch weiter verbessert.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführung werden Ultraschallwellen und/oder Vibrationen erzeugt, welche auf die dreidimensionalen Agglomerate im ersten mikrofluidischen Kanal, und insbesondere im dem ersten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals mit der zumindest einen Engstelle wirken und den Split- Vorgang unterstützten und verbessern.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform erfolgt nach Schritt c) folgender Schritt: d) Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente durch das erste Rückhalteelement über einen zweiten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals bis zu einem zweiten Rückhalteelement, dessen Poren einen Durchmesser kleiner des Durchmessers der gesplitteten Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente aufweist, sodass diese zurückgehalten werden.
Die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente können das zweite Rückhalteelement nicht passieren und sammeln sich auf oder vor dem zweiten Rückhalteelement an. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente festgehalten werden und die mikrofluidische Vorrichtung nicht ungewollt verlassen können und somit nicht verloren gehen. Fluide hingegen können das zweite Rückhalteelement passieren, sodass ein Flüssigkeitsaustausch erfolgen kann.
Hierbei ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn das Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente durch das erste Rückhalteelement über den zweiten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals bis zum zweiten Rückhalteelement in einer zweiten Spülflüssigkeit erfolgt, welche dem ersten mikrofluidischen Kanal zugeführt und über diesen gefördert wird. Vorteilhaft hierbei ist, dass beispielsweise die enzymhaltige Lösung von den dreidimensionalen Agglomeraten entfernt wird und der Split-Vorgang auf diese Weise gestoppt wird. Weiterhin ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn nach Schritt d) folgender Schritt erfolgt: e) Rückfördern der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente über den ersten mikrofluidischen Kanal und Ausführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente über dem ersten fluidischen Anschluss, welcher hier als Auslass dient.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die mikrofluidische Vorrichtung hier einen einfachen Aufbau aufweist und keine zusätzlichen Bauteile wie beispielsweise Reservoire oder gegebenenfalls weiterführende Kanäle und Strukturen zum Transport der Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente benötigt werden. in einer alternativen vorteilhaften Ausführungsform erfolgt nach Schritt d) folgender Schritt: e') Zuführen eines zweiten Mediums über einen zweiten mikrofluidischen Anschluss, welcher hier als Einlass dient, und Führen des zweiten Mediums über einen dritten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals zu einer Unterseite des zweiten Rückhalteelement und durch dieses hindurch, sodass die rückgehaltenen Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente auf der Oberseite des zweiten Rückhalteelements mit dem zweiten Medium in einen zweiten mikrofluidischen Kanal überführt werden, welcher in einem dritten fluidischen Anschluss mündet, und Ausführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente über den dritten fluidischen Anschluss, welcher hier als Auslass dient.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente den ersten und zweiten Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals nicht erneut passieren müssen, sondern über einen näher gelegenen dritten fluidischen Anschluss ausgeführt werden. Dadurch kann das mikrofluidische Verfahren zum mechanischen Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten wiederholt werden mit neuen dreidimensionalen Agglomeraten, welche über den ersten fluidischen Anschluss zugeführt werden, während über den dritten fluidischen Anschluss in regelmäßigen Abständen die Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente abgeführt werden. Damit wird eine Überlastung oder Verstopfung des zweiten Rückhalteelements durch eine zu große Anzahl sich ansammelnder Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente verhindert.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform sind die dreidimensionalen Agglomerate Zellagglomerate, insbesondere Organoide oder Sphäroide und die gesplitteten Einzelstrukturen sind Zellen, insbesondere Organoid-Zellen oder Sphäroid-Zellen und die Agglomerat- Fragmente sind Zellagglomerat- Fragmente, insbesondere Organoid- Fragmente oder Sphäroid- Fragmente. Vorteilhaft bei der Verwendung von Zellagglomeraten wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden ist, dass deren Viabilität gut erhalten bleibt und somit weitere Kultivierungsund Expansionsschritte möglich sind.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Steuereinheit zur Steuerung des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Verfahrens, insbesondere durch eine elektrische Aktuation des zumindest einen Ventils und/oder der zumindest einen Pumpe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer ersten Ausführungsform mit einem ersten mikrofluidischen Kanal mit Engstellen,
Fig. 2: die schematische Darstellung einer dreidimensionalen technischen Zeichnung einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer zweiten Ausführungsform mit einem ersten mikrofluidischen Kanal mit Engstellen und einem zweiten mikrofluidischen Kanal,
Fig. 3: die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Kartusche umfassend die mikrofluidische Vorrichtung gemäß Figur 1, und
Fig. 4: die schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung In Figur 1 ist eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 10 zum mechanischen Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten dargestellt. Die Mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst einen ersten fluidischen Anschluss la und einen zweiten fluidischen Anschluss lb. Zwischen dem ersten fluidischen Anschluss la und dem zweiten fluidischen Anschluss lb ist ein erster mikrofluidischer Kanal 2 angeordnet. Der erste mikrofluidische Kanal 2 weist einen ersten Abschnitt 2a, einen zweiten Abschnitt 2b und einen dritten Abschnitt 2c auf.
Der erste mikrofluidische Kanal 2 weist in dem ersten Abschnitt 2a zwei Engstellen 3 auf, an welchen dreidimensionale Agglomerate durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind. Alternativ und nicht in Figur 1 dargestellt kann der erste mikrofluidische Kanal 2 auch nur eine Engstelle 3 oder mehrere Engstellen 3 aufweisen.
Die Engstellen 3 sind durch eine Verschlankung der Breite des ersten mikrofluidischen Kanals 2 gebildet. Hierbei verläuft die Verschlankung der Breite des ersten mikrofluidischen Kanals 2 aus beiden Richtungen kommend kontinuierlich in Richtung des mittigen Bereichs 3a der Engstelle 3. Im mittigen Bereich 3a der Engstelle 3 weist der erste mikrofluidische Kanal 2 eine Verschlankung mit einer konstanten Breite auf.
Alternativ, und nicht in Figur 1 dargestellt, geht der sich verschlankende Bereich der Engstelle 3 direkt in einen sich verbreiternden Bereich über, sodass die Engstelle 3 keinen Bereich mit konstanter Breite umfasst. Der erste mikrofluidische Kanal 2 ist im ersten Abschnitt 2a, welcher die Engstellen 3 umfasst, temperierbar. Hierzu weist die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise ein in Figur 1 nicht dargestellten Heizelement auf.
Die mikrofluidische Vorrichtung 10 weist ein erstes Rückhalteelement 4 auf. Das erste Rückhalteelement 4 ist beispielsweise als Mikrofilter oder als Mikrosieb oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet. Die Poren des ersten Rückhalteelements 4 weisen beispielsweise einen Durchmesser von 20-80 pm auf.
Desweiteren weist die mikrofluidische Vorrichtung 10 ein zweites Rückhalteelement 5 auf, welches als Mikrofilter und/oder Mikrosieb und/oder mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist. Die Poren des zweiten Rückhalteelements 5 weisen beispielsweise einen Durchmesser von 2-8 pm, und bevorzugt von 2-6 pm auf.
Der erste Abschnitt 2a des ersten mikrofluidischen Kanals 2 reicht von dem ersten fluidischen Anschluss la bis zu einer Oberseite 4a des ersten Rückhalteelements 4. Der zweite Abschnitt 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2 reicht von einer Unterseite 4b des ersten Rückhalteelements 4 bis zu einer Unterseite 5b des zweiten Rückhalteelements 5. der dritte Abschnitt 2c des ersten mikrofluidischen Kanals 2 reicht von einer Oberseite 5a des zweiten Rückhalteelements 5 bis zu dem zweiten fluidischen Anschluss lb. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 weist außerdem zumindest ein nicht in Figur 1 dargestellten Ventil und/oder zumindest eine nicht in Figur 1 dargestellte Pumpe auf, welche elektrisch ansteuerbar sind, sodass die mikrofluidische Vorrichtung 10 elektrisch betreibbar ist. Desweiteren umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise zumindest ein nicht in Figur 1 dargestelltes Reservoir für ein Fluid.
Die mikrofluidische Vorrichtung 10 ist ausgebildet, ein Verfahren 500 durchzuführen zum mechanischen Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmenten.
Im Folgenden wird beispielhaft das mechanische Splitten von Organoiden in Organoid-Zellen und/oder Organoid- Fragmente zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens beschrieben.
In einem ersten Schritt a) wird über den ersten fluidischen Anschluss la der mikrofluidischen Vorrichtung 10 ein erstes Medium, beispielsweise eine Lösung mit Organoiden zugeführt, welches beispielsweise in einem nicht in Figur 1 dargestellten Reservoir vorgelagert ist. In einem zweiten Schritt b) wird das erste Medium mit den Organoiden über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Die Organoide passieren die Engstellen 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 und werden schließlich von dem ersten Rückhalteelement 4 zurückgehalten, da der Durchmesser der Organoide größer ist als der Durchmesser der Poren des ersten Rückhalteelements 4. Das erste Medium hingegen passiert das erste Rückhalteelement 4 sowie den zweiten Abschnitt 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2, das zweite Rückhalteelement 5 und den dritten Abschnitt 2c des ersten mikrofluidischen Kanals 2 und wird schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss lb abgeführt. Dann wird beispielsweise ein Ventil auf ein nicht in Figur 1 dargestelltes anderes Reservoir mit einer ersten Spülflüssigkeit umgestellt.
In einem weiteren Schritt b') wird die erste Spülflüssigkeit der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den ersten fluidischen Anschluss la zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Durch die erste Spülflüssigkeit werden die Organoide gewaschen, wobei eventuelle Rückstände des ersten Mediums entfernt werden.
Die erste Spülflüssigkeit ist beispielsweise eine Phosphat-gepufferte Salzlösung (kurz: PBS, engl.: phosphate buffered saline). Die erste Spülflüssigkeit wird schließlich über den zweiten mikrofluidischen Anschluss lb wieder abgeführt. Anschließend wird beispielsweise ein Ventil auf ein nicht in Figur 1 dargestelltes anderes Reservoir mit einer enzymhaltigen Lösung umgestellt.
In einem Schritt b”) wird die enzymhaltige Lösung der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den ersten fluidischen Anschluss la zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Die enzymhaltige Lösung umfasst beispielsweise das Enzym Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher), welches zu einem enzymatischen Splitten der Organoide führt. Wenn sich die enzymhaltige Lösung im gesamten ersten Abschnitt 2a des ersten mikrofluidischen Kanals 2 befindet, so wird in einem Schritt c) das enzymatische Splitten der Organoide mechanisch durch pulsatiles Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den Organoiden durch die Engstellen 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 unterstützt. Durch das Einwirken des Enzyms sowie eine Reibung der Organoide an den Engstellen 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2, werden Organoid- Zellen und/oder Organoid- Fragmente von den Organoiden abgespalten bis die Organoide insbesondere vollständig in Organoid-Zellen und/oder Organoid- Fragmente aus einigen wenigen zehn Organoid-Zellen aufgesplittet sind. Die Organoid-Zellen und/oder Organoid- Fragmente weisen nun einen Durchmesser kleiner der Porendurchmesser des ersten Rückhalteelements 4 auf.
Vor und/oder während des Split- Vorgangs wird der erste Abschnitt 2a des ersten mikrofluidischen Kanals 2 mit den Engstellen 3 beispielsweise beheizt, insbesondere um eine ideale Temperatur für die Enzymwirkung einzustellen.
Dann wird beispielsweise ein Ventil auf ein nicht in Figur 1 dargestelltes anderes Reservoir mit einer zweiten Spülflüssigkeit umgestellt.
In einem nächsten Schritt d) wird die zweite Spülflüssigkeit der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den ersten fluidischen Anschluss la zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Durch die zweite Spülflüssigkeit wird die enzymhaltige Lösung entfernt und so der Split-Vorgang gestoppt. Mit der zweiten Spülflüssigkeit werden die Organoid- Zellen und Organoid- Fragmente durch das erste Rückhalteelement 4 sowie über den zweiten Abschnitt 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2 transportiert, bis sie schließlich auf einer Unterseite 5b des zweiten Rückhalteelements 5 zurückgehalten werden. Die Poren des zweiten Rückhalteelements 5 weisen einen kleineren Durchmesser auf als die Organoid- Zellen und Organoid- Fragmente. Lediglich die zweite Spülflüssigkeit passiert das zweite Rückhalteelement 5 sowie den dritten Abschnitt 2c des ersten mikrofluidischen Kanals 2 und wird schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss lb abgeführt.
Zum Ausführen der Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den zweiten fluidischen Anschluss lb ein zweites Medium zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanals 2 gefördert bis zu dem ersten fluidischen Anschluss la, welcher hier als Auslass dient. Hierbei passiert das zweite Medium zunächst den dritten Abschnitt 2c des ersten mikrofluidischen Kanals 2, sowie das zweite Rückhalteelement 5. Die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente, welche sich auf der Unterseite 5b des zweiten Rückhalteelements 5 angesammelt haben, werden in einem Schritt e) mit dem zweiten Medium über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 mitgeführt, sodass die Organoid- Zellen und Organoid- Fragmente ebenfalls über den ersten fluidischen Anschluss la ausgeführt werden.
Anschließend können die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente weitergeleitet, aufgeteilt und/oder gegebenenfalls erneut ausgesät werden für ein erneutes Anzüchten von Organoiden.
Analog hierzu erfolgt beispielsweise ein Verfahren zum Splitten von Sphäroiden in Sphäroid- Zellen und/oder Sphäroid- Fragmente zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens.
In Figur 2 ist die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 in einer zweiten Ausführungsform dargestellt. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 ist analog zu der mikrofluidischen Vorrichtung 10 in Figur 1 aufgebaut mit den im Folgenden beschrieben Unterschieden.
Der zweite Abschnitt 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2 ist in zwei Bereiche untergliedert - einen ersten Bereich 2b' des zweiten Abschnitts 2b und einen zweiten Bereich 2b” des zweiten Abschnitts 2b. Hierbei befindet sich der erste Bereich 2b' auf einer tiefer liegenden Ebene und der zweite Bereich 2b” auf einer höher liegenden Ebene. Zwischen dem ersten Bereich 2b' und dem zweiten Bereich 2b” des zweiten Abschnitts 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2 ist eine Struktur 6 angeordnet, welche einen vertikal ausgerichteten Durchgang zwischen dem tiefer liegenden ersten Bereich 2b' des zweiten Abschnitts 2b zu dem höher liegenden zweiten Bereich 2b” des zweiten Abschnitts 2b bildet. Desweiteren weist die mikrofluidische Vorrichtung 10 einen zweiten mikrofluidischen Kanal 2' auf, welcher ausgehend von einer Oberseite 5a des zweiten Rückhalteelements 5 in einem dritten mikrofluidischen Anschluss lc mündet.
Das zweite Rückhalteelement 5 ist in vertikaler Richtung in Bezug auf die höher liegende Ebene und die tiefer liegende Ebene auf einer Zwischenebene angeordnet
In Figur 2 ist beispielhaft für alle Ausführungsformen der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtungen 10 angedeutet, dass die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise auf einem Kunststoffsubstrat 20 bzw. Chip untergebracht ist. (so gelassen, wie in paralleler Anmeldung)
Die Unterschiede zu dem zu Figur 1 beschriebenen Verfahren zum mechanischen Splitten von Organoiden in Organoid-Zellen und/oder Organoid- Fragmente zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens werden im Folgenden unter Verwendung der in Figur 2 dargestellten mikrofluidischen Vorrichtung 10 beschrieben. Mit der zweiten Spülflüssigkeit passieren die gesplitteten Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente in Schritt d) das erste Rückhalteelement 4 und gelangen nach dem Durchtritt durch dieses in einen ersten Bereich 2b' des zweiten Abschnitts 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2, welcher sich auf einer tiefen liegenden Ebene befindet. Durch die vertikal ausgerichtete Struktur 6 werden die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente nach oben geführt, sodass sie in einen zweiten Bereich 2b” des zweiten Abschnitts 2b gelangen, welcher sich auf einer höher liegenden Ebene befindet. Von dort werden die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente direkt auf die Oberseite 5a des zweiten Rückhalteelements 5 gespült, welches wiederum auf der Zwischenebene etwas tiefer liegt in Bezug auf die höher liegende Ebene und etwas höher in Bezug auf die tiefer liegende Ebene.
Das zweite Rückhalteelement 5 hindert die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente am Durchtritt, sodass sie sich auf dessen Oberseite 5a ansammeln. Lediglich die zweite Spülflüssigkeit passiert das zweite Rückhalteelement 5 sowie den dritten Abschnitt 2c des ersten mikrofluidischen Kanals 2 und wird schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss lb abgeführt. Hierbei ist der zweite mikrofluidische Kanal 2' geschlossen, beispielsweise durch ein nicht dargestelltes Ventil.
Zum Ausführen der Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente ist der an das zweite Rückhalteelement 5 angrenzende zweite Abschnitt 2b des ersten mikrofluidischen Kanals 2 geschlossen, beispielsweise durch ein nicht dargestelltes Ventil, und der zweite mikrofluidische Kanal 2' ist geöffnet, beispielsweise durch Öffnen eines nicht dargestellten Ventils. In einem nächsten Schritt e') wird über den zweiten fluidischen Anschluss lb, welcher hier als Einlass dient, ein zweites Medium zugeführt. Das zweite Medium wird über den dritten Abschnitt 2c des ersten mikrofluidischen Kanals 2 gefördert, passiert das zweite Rückhalteelement 5, wobei es von einer Unterseite 5b des zweiten Rückhalteelements 5 durch dieses hindurch auf eine Oberseite 5a des zweiten Rückhalteelements 5 gefördert wird. Die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente, welche sich auf der Oberseite 5a des zweiten Rückhalteelements 5 angesammelt haben, werden mit dem zweiten Medium mitgeführt, in den zweiten mikrofluidischen Kanal 2' geleitet und über den dritten fluidischen Anschluss lc, welcher hier als Auslass dient, ausgeführt.
Anschließend können die Organoid-Zellen und Organoid- Fragmente weitergeleitet, aufgeteilt und/oder gegebenenfalls erneut ausgesät werden für ein erneutes Anzüchten von Organoiden.
In der einfachsten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die hierfür verwendbare und nicht in den Figuren dargestellte mikrofluidische Vorrichtung 10 lediglich den ersten la und den zweiten fluidischen Anschluss lb und eine zwischen diesen angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal 2. Der erste mikrofluidische Kanal 2 umfasst in dieser Ausführung lediglich den ersten Abschnitt 2a des ersten mikrofluidischen Kanals 2 mit zumindest einer Engstelle 3.
In einem ersten Schritt a) wird über den ersten fluidischen Anschluss la der mikrofluidischen Vorrichtung 10 ein erstes Medium, beispielsweise eine Lösung mit dreidimensionalen Agglomeraten zugeführt, welches beispielsweise in einem Reservoir vorgelagert ist. Das erste Medium mit den dreidimensionalen Agglomeraten wird in einem zweiten Schritt b) über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert, bis sich das erste Medium mit den dreidimensionalen Agglomeraten im ersten mikrofluidischen Kanal 2 vom ersten fluidischen Anschluss la bis zum zweiten fluidischen Anschluss lb befindet.
Anschließend werden in einem weiteren Schritt c) die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch durch pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit den dreidimensionalen Agglomeraten durch die Engstellen 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 gesplittet. Durch die Reibung der dreidimensionalen Agglomerate an den Engstellen 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2, werden Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente von den dreidimensionalen Agglomeraten abgespalten bis die dreidimensionalen Agglomerate insbesondere vollständig in Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente aus einigen wenigen zehn Einzelstrukturen aufgesplittet sind.
Zum Ausführen der Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 in einem Schritt e) über den zweiten fluidischen Anschluss lb beispielsweise das erste Medium ohne dreidimensionale Agglomerate zugeführt und dieses über den ersten mikrofluidischen Kanals 2 gefördert bis zu dem ersten fluidischen Anschluss la, welcher hier als Auslass dient. Die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente werden mit dem ersten Medium über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 mitgeführt, sodass die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente ebenfalls über den ersten fluidischen Anschluss la ausgeführt werden.
Anschließend können die Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente weitergeleitet, aufgeteilt und/oder gegebenenfalls erneut ausgesät werden für ein erneutes Anzüchten von dreidimensionalen Agglomeraten.
In Figur 3 ist eine erfindungsgemäße Kartusche 100 dargestellt, welche beispielhaft für alle erfindungsgemäßen Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung 10, eine mikrofluidische Vorrichtung 10 in der ersten Ausführungsform gemäß Figur 1 umfasst.
Figur 4 zeigt ein Flussdiagramm mit Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten, beispielsweise in Verbindung mit den zu den Fig. 1 und 2 beschriebenen Ausführungsbeispielen und Verfahrensschritten.

Claims

22 Ansprüche
1. Mikrofluidische Vorrichtung (10) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten mit einem ersten fluidischen Anschluss (la) und einem zweiten fluidischen Anschluss (lb) und einem zwischen dem ersten (la) und dem zweiten fluidischen Anschluss (lb) angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal (2), wobei der erste mikrofluidische Kanal (2) zumindest eine Engstelle (3) aufweist, an welcher dreidimensionale Agglomerate durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind.
2. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Engstelle (3) durch eine, insbesondere kontinuierliche, Verschlankung des Durchmessers oder durch eine, insbesondere kontinuierliche, Verschlankung der Breite und/oder Höhe des ersten mikrofluidischen Kanals (2) gebildet ist.
3. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Engstelle (3) einen verschlankten mittigen Bereich (3a) aufweist mit einem konstanten Durchmesser oder mit einer konstanten Breite und/oder Höhe.
4. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste mikrofluidische Kanal (2), insbesondere ein erster Abschnitt (2a) des ersten mikrofluidischen Kanals (2), mit der zumindest einen Engstelle (3) beheizbar oder kühlbar ist.
5. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) ein erstes Rückhalteelement (4) umfasst, welches aus halbkreisförmigen Fangstrukturen und/oder aus Fangstrukturen in Form von Pfosten, Wannen oder Töpfen gebildet ist oder wobei das erste Rückhalteelement (4) als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist, und wobei die Poren insbesondere einen Durchmesser von 20-80 pm aufweisen. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (10) ein zweites Rückhalteelement (5) umfasst, welches als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist, und wobei die Poren insbesondere einen Durchmesser von 2-8 pm aufweisen. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) einen zweiten mikrofluidischen Kanal (2') aufweist, welcher ausgehend von einer Oberseite (5a) des zweiten Rückhalteelements (5) in einem dritten mikrofluidischen Anschluss (lc) mündet. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) zumindest ein Ventil und/oder zumindest eine Pumpe umfasst, welche elektrisch ansteuerbar sind, sodass die mikrofluidische Vorrichtung (10) elektrisch betreibbar ist und/oder dass die Vorrichtung (10) zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst. Mikrofluidisches Verfahren zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmenten mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit folgenden Schritten: a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten über den ersten fluidischen Anschluss (la) b) Fördern des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten über den ersten mikrofluidischen Kanal (2) c) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten durch die zumindest eine Engstelle (3) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) wobei die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch durch Reibung an der Engstelle (3) gesplittet werden. Mikrofluidisches Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Agglomerate in Schritt b) durch einen ersten Abschnitt (2a) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) bis zu einem ersten Rückhalteelement (4) gefördert werden, welches diese in un gesplitteter Form zurückhält. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) folgender Schritt erfolgt: b') Zuführen und Fördern einer ersten Spülflüssigkeit über den ersten mikrofluidischen Kanal (2) zum Waschen der dreidimensionalen Agglomerate. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9-11, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) oder nach Schritt b') folgender Schritt erfolgt: b”) Zuführen und Fördern einer enzymhaltigen Lösung über den ersten mikrofluidischen Kanal (2), und wobei in Schritt c) ein pulsatiles Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten durch die zumindest eine Engstelle (3) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) erfolgt, sodass das enzymatische Splitten der dreidimensionalen Agglomerate mechanisch durch Reibung der dreidimensionalen Agglomerate an der Engstelle (3) unterstützt wird. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9-12, dadurch gekennzeichnet, dass der erste mikrofluidische Kanal (2), insbesondere der erste Abschnitt (2a) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) mit der zumindest einen Engstelle (3), temperiert, insbesondere beheizt oder gekühlt, wird. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9-13 dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt c) folgender Schritt erfolgt: d) Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente durch das erste Rückhalteelement (4) über einen zweiten Abschnitt (2b) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) bis zu einem zweiten Rückhalteelement (5), dessen Poren einen Durchmesser kleiner des Durchmessers der gesplitteten Einzelstrukturen und Agglomerat- Fragmente aufweist, sodass diese zurückgehalten werden, wobei das Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente insbesondere über eine zweiten Spülflüssigkeit erfolgt. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9-14 dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt d) folgender Schritt erfolgt: e) Rückfördern der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente über den ersten mikrofluidischen Kanal (2) und Ausführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente über dem ersten fluidischen Anschluss (la), welcher hier als Auslass dient. 25 Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9-14 dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt d) folgender Schritt erfolgt: e') Zuführen eines zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Anschluss (lb), welcher hier als Einlass dient, und Führen des zweiten Mediums über einen dritten Abschnitt (2c) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) zu einer Unterseite (5b) des zweiten Rückhalteelement (5) und durch dieses hindurch, sodass die rückgehaltenen Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente auf der Oberseite (5a) des zweiten Rückhalteelements (5) mit dem zweiten Medium in einen zweiten mikrofluidischen Kanal (2') überführt werden, welcher in einem dritten fluidischen Anschluss (lc) mündet, und Ausführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat- Fragmente über den dritten fluidischen Anschluss (lc), welcher hier aus Auslass dient. Mikrofluidisches Verfahren nach einem der Ansprüche 9-16 dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Agglomerate Zellagglomerate, insbesondere Organoide oder Sphäroide sind und wobei die gesplitteten Einzelstrukturen Zellen, insbesondere Organoid-Zellen oder Sphäroid-Zellen sind und wobei die Agglomerat- Fragmente Zellagglomerat- Fragmente, insbesondere Organoid- Fragmente oder Sphäroid- Fragmente sind. Steuereinheit zur Steuerung des mikrofluidischen Verfahrens nach einem der Ansprüche 9-17, insbesondere durch eine elektrische Aktuation des zumindest einen Ventils und/oder der zumindest einen Pumpe. Kartusche (100), insbesondere mikrofluidische Kartusche, umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1-8.
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