DE102013108616A1

DE102013108616A1 - Bioreaktor, Verfahren und seine Verwendung zur Gewinnung von Zellmetaboliten

Info

Publication number: DE102013108616A1
Application number: DE102013108616.0A
Authority: DE
Inventors: Andreas Guber; Lars Wegner
Original assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2015-02-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bioreaktor (1) aus mindestens einem Modul (2, 3, 4, 5), das mit einer Zulauf-Leitung (122, 123, 124, 125) verbunden ist und über eine Ablauf-Leitung (132, 133, 134, 135) verfügt und das mit einer Druck-erzeugenden Quelle verbunden ist. Jedes Modul (2, 3, 4, 5) umfasst einen Boden (20), einen Deckel (21) und einen mit mindestens einem Leitungsbahnensystem (51, 51‘) versehenen Zellverband (50), der das mindestens eine Leitungsbahnensystem (51, 51‘) umgibt und mit ihm in stofflichem Austausch steht. Die Leitungsbahnensysteme (51) weisen ein verzweigtes Netz aus Haupt und Nebenleitungsbahnen auf und verfügen über Zu- und Abflussleitung. Die Erfindung beschreibt ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktors sowie ein Verfahren zur Herstellung von Zellmetaboliten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bioreaktor, Verfahren und dessen Verwendung zur Gewinnung von Zellmetaboliten.
Die überwiegende Zahl pharmazeutisch wirksamer Substanzen sind ihrer Herkunft nach pflanzliche Sekundärmetabolite oder werden aus solchen Substanzen durch chemische Modifikation gewonnen (Newman und Cragg 2012). Viele dieser Substanzen können inzwischen auch vollsynthetisch hergestellt werden; diese Verfahren sind aber oft aufwändig und liefern nur sehr unbefriedigende Ausbeuten. Häufig ist es daher wirtschaftlicher, biologische Herstellungsverfahren zu nutzen oder zumindest einen Teil des Syntheseweges im Organismus ablaufen zu lassen. Für die Gewinnung der Substanzen auf biologischem Weg gibt es eine Reihe von allgemein geläufigen Möglichkeiten. Traditionell werden pharmazeutisch aktive Substanzen durch das Sammeln von Pflanzen oder Teilen von Pflanzen (Rinde, Wurzel) aus der Natur gewonnen. Dieses Verfahren ist allerdings aufwändig und ineffizient. Eine Standardisierung des Produktes ist wegen unkontrolliert wechselnder Umweltbedingungen nicht möglich. Ein weiteres Problem ist die Gefährdung der (lokalen) Existenz von Arten durch exzessives Sammeln. Eine weitere Möglichkeit ist der kontrollierte Feldanbau oder die Anzucht im Gewächshaus der benötigten Arten. Allerdings ist auch hierbei die Ernte meist saisonal eingeschränkt und der gewünschte Naturstoff ist nicht ganzjährig verfügbar. Außerdem werden oft nur geringe Mengen des Stoffes im pflanzlichen Gewebe akkumuliert, da die Synthese für die Pflanze energetisch aufwendig ist oder der Stoff in hohen Konzentrationen für den Organismus eine toxische Wirkung hat. Eine Optimierung durch gentechnische Methoden kann u. U. zu erheblich höheren Ausbeuten führen, sofern die Synthesewege bekannt sind.
In den letzten Jahren wurden große Fortschritte beim Einsatz von transgenen Kulturpflanzen zur heterologen Synthese von medizinisch relevanten Proteinen, z.B. Impfstoffen, erzielt (molecular farming). Die kommerzielle Umsetzung scheitert jedoch bisher meist an den oben diskutierten Einschränkungen, insbesondere an der mangelnden Akzeptanz des Anbaus transgener Pflanzen im Freiland.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Anwendung biotechnologischer Alternativen, die die Nutzung der natürlichen Synthesewege unter kontrollierten Laborbedingungen erlaubt. Die am meisten verbreitete und erfolgreichste Variante ist hierbei der Einsatz pflanzlicher Zellkulturen (Wilson und Roberts 2012). Von vielen pflanzlichen Geweben lassen sich Dauerkulturen etablieren. Oft ist der Zuwachs an Biomasse in solchen Kulturen höher als in der intakten Pflanze. Die synthetisierte Biomasse kann in regelmäßigen Abständen geerntet werden. Pflanzliche Zellkulturen werden in einer Reihe von Fällen schon sehr erfolgreich eingesetzt, z.B. zur Produktion von Taxol, einem von verschiedenen Arten der Gattung Taxus produzierten Cytostatikum.
Der Einsatz von pflanzlichen Zellkulturen ist allerdings auch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet (Wilson und Roberts 2012). So ist die Handhabung von Zellkulturen aufwändig und verlangt umfangreiches Know-How. Hohe Anforderungen sind insbesondere an die Sterilität der Kulturen zu stellen. Auch bei optimaler Handhabung sind die Wachstumsrate, die Stabilität und der Metabolismus der Kultur oft variabel und schwer zu kontrollieren. Durchflusskulturen erfordern zusätzlich eine Immobilisierung der Zellen, was zusätzliche Probleme aufwirft.
Ausgehend hiervon besteht die Aufgabe darin, die Einschränkungen und Nachteile des Standes der Technik zu überwinden. Insbesondere soll ein Bioreaktor bereitgestellt werden, der die technischen Schwierigkeiten bei der Nutzung pflanzlicher Zellen zur Synthese von Zellmetaboliten überwindet.
Des Weiteren soll ein alternatives biotechnologisches Verfahren vorgeschlagen werden, das es ermöglicht mit wenig Aufwand Zellmetaboliten zu gewinnen und die genannten Nachteile der Zellkulturtechniken zu vermeiden.
Eine weitere Aufgabe liegt in der Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktors zur Gewinnung von Zellmetaboliten.
Diese Aufgabe wird im Hinblick auf den Bioreaktor durch die Merkmale des Anspruchs 1, auf das Verfahren zur Gewinnung von Zellmetaboliten durch die Verfahrensschritte des Anspruchs 7 und in Hinblick auf die Verwendung des Bioreaktors durch den Anspruch 12 gelöst. Die Unteransprüche beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Bioreaktor, umfassend mindestens ein Modul, das mit einer Zulauf-Leitung verbunden ist und über eine Ablauf-Leitung verfügt. Das Modul ist derart mit einer druckerzeugenden Vorrichtung, vorzugsweise einer Pumpe oder einer Absaugeeinheit verbunden, dass ein Druckgradient zwischen der Zulaufleitung und der Ablaufleitung besteht, welcher sich über den mit mindestens einem Leitungsbahnensystem versehenen Zellverband ausdehnt. Der Druckgradient innerhalb des Leitungsbahnensystems ist aber möglichst flach. Als flacher Druckgradient wird ein Druckgefälle von der Zulaufleitung zur Ablaufleitung von 0,01 bar bis 10 bar, bevorzugt von 0,01 bar bis 2 bar verstanden.
In einer weiteren Ausgestaltung wird der Druckgradient über unterschiedliche Höhenlage des Vorratsgefäßes im Vergleich zum Modul erzeugt. Der angelegte Druck lässt sich auch durch die Flussrate beeinflussen und hängt von dem hydraulischen Widerstand des Leitungsbahnensystems ab.
Das Modul verfügt über einen Boden und einen Deckel zwischen welche der mit mindestens einem Leitungsbahnensystem versehene Zellverband eingebracht wird. Der mit mindestens einem Leitungsbahnensystem versehene Zellverband besteht aus mindestens einer Zelllinie, welche das mindestens eine Leitungsbahnensystem zumindest teilweise umgibt und steht zumindest teilweise mit dem mindestens einem Leitungsbahnensystem in stofflichem Austausch, d.h. neben Wasser können organische Moleküle und Salze entweder durch Diffusion oder über natürliche oder künstliche Transportsysteme aus dem Perfusionsmedium im Leitungsbahnensystem in den Zellverband oder aus dem Zellverband in das Perfusat im Leitungsbahnensystem wandern. Die Leitungsbahnensysteme (51) weisen ein verzweigtes Netz aus Haupt- und Nebenleitungsbahnen auf und verfügen über Zu- und Abflussleitung. Jedes Leitungsbahnensystem hat mindestens eine Hauptleitungsbahn und mindestens ein von der Hauptleitungsbahn abgezweigtes Nebenleitungsbahnensystem mit mindestens einer Nebenleitungsbahn. Die Hauptleitungsbahn ist über das Verbindungsstück mit der Zulauf-Leitung, vorzugsweise gespeist von einem Vorratsgefäß, verbunden und ermöglicht den Zustrom von Flüssigkeit, vorzugsweise aus dem Vorratsgefäß, in das mindestens eine Leitungsbahnensystem. Die mindestens eine Nebenleitungsbahn ist über einen Adapter mit einer Anschlussleitung verbunden ist, welche in die mindestens eine Ablauf-Leitung mündet. Die mindestens eine Ablauf-Leitung ermöglicht den Abfluss von Flüssigkeit vorzugsweise in ein Sammelgefäß oder Auffanggefäß. Jedes Modul ist vorzugsweise so über ein Ventil absperrbar, so dass man einzelne Module vom System entfernen kann ohne den Bioreaktor aus dem Betrieb nehmen zu müssen. Bevorzugt befindet sich das Ventil zum Absperren des Moduls in der Zulaufleitung. Ein Deckel minimiert Verdunstung und verhindert Kontamination des austretenden Perfusats und des Zellverbands. Bei den Leitungen handelt es sich vorzugsweise um Rohrleitungen, in weiteren Ausgestaltungen handelt es sich bei der mindestens einen Anschlussleitung und der mindestens einen Ablaufleitung um Rinnen.
Der Bioreaktor wird vorzugsweise aus einem Vorratsgefäß gespeist. Die aus dem Vorratsgefäß in die einzelnen Module des Bioreaktors beförderte Lösung, das Perfusionsmedium, umfasst vorzugsweise keinen oder mindestens einen Nährstoff, bevorzugt ausgewählt unter NH₃ ⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, NO₃ ^–, SO₄ ^2–, Fe²⁺, Kohlenhydrate, Pyruvat, Aminosäuren, Peptone, Proteine, Fette, Fettsäuren sowie Mikronährstoffe und Spurenelemente, um die Zellen des Zellverbandes mit Nährstoffen zu versorgen. In besonderen Ausgestaltungen umfasst das Perfusionsmedium zusätzliche Komponenten, bevorzugt ausgewählt unter Elicitoren, welche in den Pflanzenzellen den sekundären Stoffwechsel anregen, Hormone, die spezielle Stoffwechselwege ermöglichen, Zucker, um auf den Energiestoffwechsel einzuwirken, Indikatoren und/oder Farbstoffe, zur optischen Kontrolle des pH-Werts oder der Perfusion und weitere Stoffe zur Erhöhung der Membranpermeabilität sowie Hemmstoffen, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu verhindern. Um den pH-Wert stabil einzustellen, werden in bevorzugten Ausführungen Puffersysteme eingesetzt.
Hormone, werden bevorzugt ausgewählt unter Methyl-Jasmonate oder Gibberelline. Farbstoffe, zur Kontrolle der Perfusion werden bevorzugt ausgewählt unter Fluoreszein, Phloxin B, Safranin und Stoffe zur Erhöhung der Membranpermeabilität werden bevorzugt ausgewählt unter Methanol, Aceton und Saponin. Hemmstoffe werden bevorzugt ausgewählt unter Antibiotika oder Chloramphenicol. Das Perfusionsmedium wird vorzugsweise über das Leitungsbahnensystem an den Zellverband abgegeben.
Das Vorratsgefäß wird in einer bevorzugten Ausgestaltung mit einer Durchmischungsvorrichtung, bevorzugt einem Rührwerk oder einem Magnetrührer ausgestattet, um bei Verwendung mehrphasiger Perfusionsmedien eine Entmischung zu vermeiden.
Das Perfusat ist die aus dem Zellverband austretende Flüssigkeit, welche nach dem Durchfließen des Leitungsbahnensystems über die Ablaufleitung aus dem Bioreaktor abgeleitet wird. Der aus dem Zellverband in das Leitungsbahnensystem abgegebene Flüssigkeitsstrom, das Perfusat umfasst keine oder mindestens einen bereits im Flüssigkeitsstrom vorhandenen Nährstoff und/oder Komponente in gleicher oder geringerer Konzentration und mindestens einen durch den Zellverband synthetisierten Zellmetaboliten, ein Syntheseprodukt einer Zelle oder eines Zellverbandes. Das Perfusat wird vorzugsweise erneut über das Leitungsbahnensystem an den Zellverband abgegeben und gelangt dann erneut aus dem Zellverband in das Leitungsbahnensystem. Somit wird der mindestens eine Zellmetabolit angereichert. Der Übergang des mindestens einen Zellmetaboliten aus dem intrazellulären Bereich in das Perfusat in dem Leitungsbahnensystem erfolgt vorzugsweise durch Diffusion oder über natürliche oder künstliche Transportproteine in der Plasmamembran der Zellen, wie ABC Transporter. Die Transportproteine sind in einer Ausgestaltung nativ in den verwendeten Zellen vorhanden. In einer anderen Ausgestaltung werden Transportproteine auf gentechnischem Weg durch heterologe (Über)expression eingeschleust.
Der mit dem Leitungsbahnensystem versehene Zellverband steht teilweise mit den einzelnen Leitungen des Leitungsbahnensystems, vorzugsweise mit der Hauptleitungsbahn oder mit der mindestens einen Nebenleitungsbahn des von der Hauptleitungsbahn abgezweigtes Nebenleitungsbahnensystem, in stofflichen Austausch.
In einer Ausgestaltung erfolgt der stoffliche Austausch unidirektional, d.h. aus dem Zellverband in das Leitungsbahnensystem. In einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt der stoffliche Austausch bidirektional, aus dem Leitungsbahnensystem in den Zellverband und aus dem Zellverband in das Leitungsbahnensystem. Dabei erfolgt die Versorgung des Zellverbandes mit Nährstoffen und Komponenten vorzugsweise über das Perfusionsmedium.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der Bioreaktor derart aufgebaut, dass der Zellverband direkt mit einer Nährlösung, die mindestens einen Nährstoff und keine oder mindestens eine weiteren Komponente, bevorzugt ausgewählt unter Elicitoren, Hormonen, Zuckern, Hemmstoffen, Farbstoffen und weitere Stoffe zur Erhöhung der Membranpermeabilität gelöst in Lösungsmittel, bevorzugt in Wasser, enthält, beschickt wird, indem die Nährlösung vorzugsweise über den Deckel oder den Boden des mindestens einen Moduls des Bioreaktors an die Zellen abgegeben wird.
Die Perfusionsparameter Druck, Temperatur, Zeit und Durchflussrate sind so zu wählen, dass das gewünschte Produkt über einen möglichst langen Zeitraum kontinuierlich synthetisiert und an das Perfusat abgegeben wird.
Zeichnet den im Bioreaktor zu gewinnenden mindestens einen Zellmetaboliten eine geringere Membranpermeabilität aus den Zellen des Zellverbands in den extrazellulären Bereich aus, sodass er zwar in der Zelle synthetisiert wird, aber nicht in das Perfusat gelangt, werden vorzugsweise gepulste niederfrequente elektrische Felder eingesetzt und/oder Ultraschallwellen, die die Zellmembran zeitweise permeabilisieren, ohne letal zu wirken und ohne den Zellverband zu schädigen. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden Rechteckpulse mit einer Dauer von 1 ns–10 ms, bevorzugt von 10 ns–100 µs bei einer Frequenz von 50–500 mHz und einer Feldstärke von maximal 2 kV/cm eingesetzt. Als Elektroden eignen sich feinmaschige Metallgitter, die den Zellverband sandwichartig umschließen.
An die Ablaufleitung schließt sich in einer Ausgestaltung ein Sammelgefäß an. In einer weiteren Ausgestaltung wird das Perfusat direkt zu mindestens einer Reinigungseinrichtung, ausgewählt unter präparativer oder semipräparativer Chromatographie, Elektrophorese, Extraktion, Fällung, Filtration, Sedimentation oder Evaporation zugeführt. In einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt eine Aufreinigung unmittelbar aus dem Perfusat. Dafür werden die Anlagen, welche die Reinigungsschritte durchführen direkt über die Ablaufleitung des erfindungsgemäßen Bioreaktors versorgt. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird das System direkt in ein Lab-on-the-Chip integriert.
Um einen hohen Durchsatz zu gewährleisten, werden in einer Ausgestaltung mehrere Module hinter- oder nebeneinandergeschaltet. Die Versorgung mit dem Perfusionsmedium erfolgt vorzugsweise aus einem oder mehreren Vorratsgefäßen und das Perfusat vorzugsweise wird in einem oder mehreren Sammelgefäßen gesammelt oder in einer Leitung zusammengeführt und den nachfolgenden Reinigungsschritten zugeführt.
In einer bevorzugten Ausgestaltung sind in den Leitungsbahnen Ventile integriert, die den Rücklauf des Flüssigkeitsstroms in Richtung der Zulaufleitung verhindern, den Ablauf des Flüssigkeitsstroms in Richtung der Ablaufleitung dabei aber nicht blockieren.
In einer weiteren Ausgestaltung liegen zwei oder mehr Leitungsbahnensysteme in dem Zellverband vor, welche über die Hauptleitungsbahnen und/oder über die mindestens eine Nebenleitungsbahn miteinander in Verbindung stehen können.
In einer weiteren Ausgestaltung ist nur eine Auswahl der mehreren Leitungsbahnensysteme miteinander verbunden. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die Verbindung zwischen den einzelnen Leitungsbahnensystemen steuerbar, d.h. es ist frei wählbar, ob die Verbindung geöffnet ist und wie hoch die Durchflussrate ist.
Durch den erfindungsgemäßen Bioreaktor lässt sich die Instabilität und Variabilität vieler Zellkulturen bei geringen Änderungen der Anzuchtbedingungen sowie den Verlust an Ausbeute, der mit der De-Differenzierung der Zellen unter Umständen verbunden ist, vermeiden. Der erfindungsgemäße Bioreaktor teilt Vorteile eines Zellkulturreaktors im Durchflussbetrieb, wie definierte Kulturbedingungen und Anregung des Stoffwechsels durch chemische Stimuli mittels der verwendeten Komponenten. Vielfach ist eine Durchflusskultur, wie beim erfindungsgemäßen Bioreaktor genutzt, vorteilhaft, da die produzierte Substanz durch die Zellen ins Medium sezerniert wird. Durch die kontinuierliche Entfernung der Produkte wird die Gewinnung des mindestens einen Zellmetaboliten im Vergleich zu einer Gesamtverarbeitung von Zellen erleichtert und die Produktionsrate des Zellmetaboliten gesteigert. Der erfindungsgemäße Bioreaktor vermeidet dabei die Nachteile der herkömmlichen Zellkultur im Zellkulturreaktor, wie aufwändige Bedienung, De-Differenzierung spezialisierter Zellen, und damit verbundener Verlust spezieller Stoffwechselwege.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Bioreaktors, dem Pflanzen-Bioreaktor, entspricht der mit einem Leitungsbahnensystem versehene Zellverband einem Gewebe, bzw. einem Organ, vorzugsweise einem Blatt einer natürlichen oder transgenen Pflanze. Das Leitungsbahnensystem entspricht dem Xylem der Pflanze. Der mit dem Leitungsbahnensystem versehene Zellverband wird durch die Zellen des Gewebes der verwendeten Pflanze gebildet.
Bei der Verwendung eines Blattes entspricht die Hauptleitungsbahn der Mittelrippe des Blattes als scheinbare Verlängerung des Blattstiels und das Nebenleitungsbahnenensystem zweigt sich von dieser ab. Die mindestens eine Nebenleitungsbahn der Nebenleitungsbahnensysteme wird durch die Seitenrippen des Blattes dargestellt. Das Gewebe, vorzugsweise das Blatt, wird mit einem Adapter an die Zulaufleitung angeschlossen und mindestens eine Nebenleitungsbahn und/oder die Hauptleitungsbahn wird perfundiert und über einen Adapter an die Anschlussleitung angeschlossen. Es handelt sich um eine Organperfusion.
Diese Ausgestaltung macht sich die Existenz des natürlichen mikrofluidischen Systems in den höheren Pflanzen, des Xylems, zu Nutze. Das Xylem ist ein Röhrensystem, das die Organe aller höheren Pflanzen in Form eines kontinuierlichen Netzwerkes durchzieht und dessen Wände mit Lignin versteift sind; der Durchmesser der Röhren variiert stark von Art zu Art und reicht von 10 bis 500 µm. Es ist Teil des extrazellulären Raumes der Pflanzen (Apoplasten) und ermöglicht einen diffusiven Stoffaustausch mit dem Diffusionsraum der angrenzenden Zellwände, in den die pflanzlichen Zellen eingebettet sind. Die physiologische Funktion des Xylems liegt in der effizienten Verteilung von Wasser und Nährstoffen im pflanzlichen Organismus. In den Xylemgefäßen findet ein Massenfluss statt, der zumindest teilweise durch den Wasserverlust an der Blattoberfläche, die Transpiration, angetrieben wird. In den meisten krautigen Pflanzen wird durch einen hydrostatischen Druckgradienten in den Xylemelementen ein Volumenfluss erzeugt. Die Flussgeschwindigkeit wird vorzugsweise mit Hilfe von Farbstoffen, von Wärmeimpulsen (heat pulse bzw. heat balance Methode) oder mit Magnetresonanz-Tomografie quantifiziert und beträgt insbesondere zwischen 0,1 und 2 mm/s, bevorzugt zwischen 0,5 und 1,5 mm/s, besonders bevorzugt zwischen 0,9 und 1,1 mm/s. Es handelt sich in der Regel um einen laminaren Fluss, der dem Hagen-Poiseuille Gesetz folgt und mit einem finite-Elemente-Ansatz erfolgreich modellierbar ist. Der lokale hydrostatische Druck in einzelnen Xylemgefässen wird vorzugsweise mit Hilfe spezieller Sonden abgeleitet. Dazu wird eine mit Wasser gefüllte Glas-Mikrokapillare mit fein ausgezogener Spitze an eine mikrobarische Plexiglas-Kammer mit angeschlossenem Druckwandler angeschlossen. Diese Sonde wird auf einem Mikromanipulator montiert, und die Kapillare wird in das zu untersuchende Gewebe eingestochen, bis ein plötzlicher Druckabfall registriert wird. Der Druckabfall signalisiert, dass die Spitze in ein Xylemgefäß eingeführt wurde (Wegner 2012).
Die physiologische Funktion des Xylems setzt eine enge hydraulische Kopplung der Gefäße mit den angrenzenden Geweben, und einen effizienten Stoffaustausch voraus. Das in den Zellen synthetisierte Substrat wird über die Zellmembran in den Apoplasten, dem extrazellullären Raum, sezerniert. Durch den ständigen Austausch des Inhaltes der Xylemgefäße wird das darin befindliche Substrat abgeführt und vorzugsweise durch Diffusion aus den Zellwänden kontinuierlich ersetzt. Diese Eigenschaften nutzt der Bioreaktor, indem pflanzliches Gewebe, bevorzugt ein Blatt, mit einem Flüssigkeitsstrom versorgt wird, und indem über die perfundierten Leitungsbahnen Zellmetabolite, die durch das Gewebe produziert werden, kontinuierlich abgeführt werden. Hierzu wird vorzugsweise das pflanzliche Gewebe in den Bioreaktor eingebracht und die Hauptleitungsbahn des Xylems des verwendeten pflanzlichen Gewebes mittels Adapter an die Zulaufleitung und die Hauptleitungsbahn des Xylems des verwendeten pflanzlichen Gewebes und/oder die mindestens eine Nebenleitungsbahn des Xylems des verwendeten pflanzlichen Gewebes mittels Adapter an die mindestens eine Anschlussleitung angeschlossen. Der Flüssigkeitsstrom wird vorzugsweise durch die Zulaufleitung durch Anlegen eines Überdruckes in den Zellverband infiltriert. Das Perfusat reichert sich mit Stoffen, die im extrazellulären Raum (Apoplast) des pflanzlichen Gewebes gelöst sind, vorzugsweise durch diffusiven Austausch an. Der Austritt erfolgt entweder an natürlich vorhandenen Strukturen, die wie die Hydathoden des Blattes sozusagen als Überdruckventile fungieren, oder dort, wo die Leitungsbahnen des Xylems des verwendeten pflanzlichen Gewebes durch einen gezielten Schnitt geöffnet wurden und mittels Adapter an die Anschlussleitung angeschlossen sind.
Die lokale Zugspannung in den Xylemgefässen kann insbesondere Werte über 0,1 MPa erreichen, was einem Druckabfall auf Werte unterhalb des Vakuums gleichzusetzen ist. Bei diesen Druckverhältnissen kann es zu einem spontanen Phasenübergang des Wassers vom flüssigen in den gasförmigen Zustand (Cavitation) und nachfolgend zu einer Embolie des betreffenden Gefäßes kommen. Bei Verzweigungen scheint das Xylem dem Gesetz von Murray zu folgen (McCulloh et al. 2003), d.h. in jeder Ebene ist die Summe der Radien aller Gefäße zur Dritten Potenz eine Konstante. Über den Massenfluss wird der Spross auch mit Nährstoffen versorgt. Die Xylemgefäße enthalten eine verdünnte Elektrolytlösung mit den im Spross benötigten Mikro- und Makronährstoffen. Mit Hilfe von multifunktionalen Xylemsonden können einzelne Ionenkonzentrationen im Xylemsaft intakter Pflanzen kontinuierlich gemessen werden (Wegner und Zimmermann 2002).
Probleme können aus der fortschreitenden Seneszenz (Alterung) des Gewebes resultieren, die sich nach Abtrennen eines Gewebes einer Pflanze beschleunigt und schließlich zum Absterben führt. Hierbei kann auf die Ergebnisse umfangreicher Arbeiten zur Konservierung von Schnittblumen zurückgegriffen werden. Die Seneszenz des verwendeten pflanzlichen Gewebes lässt sich durch Zugabe von Seneszenz minimierenden Substanzen zur Nährlösung und /oder zum Perfusionsmedium verringern bis verhindern. Die seneszenzvermindernden Substanzen werden bevorzugt ausgewählt unter Thidiazuron, Gibberellinen und Salicylsäure.
Der Einsatz von Geweben gentechnisch veränderter Organismen, vorzugsweise transgener Pflanzen, im erfindungsgemäßen Bioreaktor ist denkbar. Oft treten bei der herkömmlichen Zellkultur Probleme bei der Aufreinigung des Zellmetaboliten auf, da sich neben den Zellmetaboliten, Nährstoffen und anderen Komponenten auch Bruchstücke der Zellen in dem Aufarbeitungsmedium befinden. Daher setzt man vermehrt auf Zellkulturen, die aus transgenen Pflanzen gewonnen werden und die das gewünschte Produkt stabil exprimieren und sekretieren. Die Sekretion wird vorzugsweise durch den gezielten Einbau von entsprechenden Peptid-Signalsequenzen herbeigeführt werden, die zu einer Anreicherung des heterologen Proteins im endoplasmatischen Retikulum führen. Ein großer Teil dieser Proteine wird anschließend durch Exocytose in den extrazellulären Raum abgegeben. Hier kommt wiederum die Organperfusion, die Verwendung des Pflanzen-Bioreaktors, als interessante Alternative zur Zellkultur ins Spiel, z.B. insbesondere dann, wenn in Kallus- oder Zellkultur keine stabile heterologe Expression gelingt oder wenn die Immobilisierung der Kulturzellen problematisch ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Pflanzen-Bioreaktors wird nach Abtrennen des Blattrandes ein Blatt in das Modul eingespannt, indem über den Blattstiel ein Anschluss, bevorzugt ein Silikonschlauch gestülpt wird, der an die Zufluss-Leitung angeschlossen wird. Jeder Anschluss ist in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung mit einem Ventil versehen, so dass ein Modul im Bedarfsfall schnell an- und abgekoppelt werden kann, ohne den Gesamtprozess zu unterbrechen. Am Rande jedes Bodenelementes ist eine Ablauf-Leitung in Form einer Rinne oder Rohrleitung angebracht, über die am Blattrand austretendes Perfusat abgeführt werden kann. Der anliegende Druckgradient kann am Vorratsgefäß justiert werden. Aus dem Ablauf wird das Produkt isoliert und aufgereinigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltungsform des Bioreaktors, dem biohybriden Bioreaktor, wird das Leitungsbahnensystem eines natürliches oder transgenes Blatt plastiniert, d.h. so fixiert oder eingebettet und konserviert, dass die Struktur und die Eigenschaften des Leitungsbahnensystems des verwendeten Organs der Pflanze, des Xylems, auch nach Entfernung der natürlichen Umgebung, der pflanzlichen Zellen des Gewebes bestehen bleibt. Die Zellen des natürlichen Leitungsbahnensystems, des Xylems werden vorzugsweise mit plastiniert, d.h. sie sind noch vorhanden, erfüllen aber ihre natürliche Funktion nicht mehr. Das mindestens eine Leitungsbahnensystem in dieser Ausgestaltung ist das zumindest teilweise permeable, plastinierte Xylem eines Gewebes, bevorzugt eines Blattes einer natürlichen oder transgenen Pflanze und der Zellverband besteht aus mindestens einer pflanzlichen oder tierischen Zelllinie.
Das Gewebe einer natürlichen oder transgenen Pflanze stellt eine komplexe, 3-dimensionale mikrofluidische Struktur dar. Die vorhandene biologische Struktur wird in ein Trägerpolymer eingegossen, d.h. fixiert. Hierzu bedarf es geeigneter Plastinierungs-, bzw. Fixierungs- und Einbettungsverfahren, die

• möglichst einfach in der Handhabung sowie
• preisgünstig sein sollten, und
• in möglichst kurzer Zeit zum gewünschten Ergebnis führen.

Das für die Plastinierung verwendete Material muss neben einer ausreichenden Fixierung und Konservierung der Struktur auch den Aufwuchs der mindestens einen Zelllinie des Zellverbandes ermöglichen und zumindest teilweise permeabel für die im Perfusat enthaltenen Zellmetaboliten sein. In einer Ausgestaltung wird das Plastinationsmaterial mit einem Zellkulturmaterial überzogen, wobei beide Materialien den unidirektionalen stofflichen Austausch aus dem Zellverband in das Leitungsbahnensystem ermöglichen und das Perfusat mit dem mindestens einen Zellmetaboliten abtransportiert wird. In einer bevorzugten Ausgestaltung ermöglichen das Plastinationsmaterial und das Zellkulturmaterial den bidirektionalen stofflichen Austausch von organischen Molekülen, Salzen, Wachstumsfaktoren und Hormonen. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ermöglicht das Plastinationsmaterial den bidirektionalen stofflichen Austausch und die mindestens eine verwendete Zelllinie wird direkt auf diesem Plastinationsmaterial angezüchtet, so dass kein zusätzliches Zellkulturmaterial notwendig ist.
Bei der Fixierung und Einbettung ist insbesondere darauf zu achten, dass die Leitungsbahnen des Xylems frei und Flüssigkeit-leitend bleiben. Besonders kritisch ist es Tüpfelfelder in der Kontaktfläche zwischen zwei Tracheen offen zu halten. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die Gefäße während der Infiltration mit dem Einbettungsmitteln derart unter Überdruck gesetzt, dass der Eintritt der Chemikalien in die Leitungsbahnen des Xylems und ein dauerhaftes Verstopfen der Tüpfelstrukturen verhindert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird ein permanenter Luftstrom in den Leitungsbahnen des Xylems erzeugt, der die Leitungsbahnen während der Plastination offen hält.
Zur Plastinierung pflanzlichen Materials, z.B. für ultrastrukturelle Untersuchungen, wird auf eine umfangreiche Literatur zurückgegriffen. Auch die Plastinationstechnik, die ursprünglich für die medizinische Präparation entwickelt wurde, ist auf pflanzliche Gewebe anwendbar.
Die Einbettung erfolgt in einer bevorzugten Ausgestaltung des biohybriden Bioreaktors mit Polyethylenglycol-Diacrylat. Dieses Polymer bildet in wässriger Umgebung ein Hydrogel und ist auch für die Kultur von Zellen auf seiner Oberfläche geeignet. Eine vorausgehende Entwässerung des pflanzlichen Gewebes ist nicht erforderlich, wodurch die Präparation erleichtert wird. Nach der Infiltration des Gewebes werden die Momomere vorzugsweise durch Fotocuring zur Polymerisation gebracht werden.
In einer weiteren Ausgestaltung des biohybriden Bioreaktors werden Epoxyharze zur Plastination verwendet, wobei hinsichtlich der Einbettung von pflanzlichem Gewebe in Epoxyharze für die Elektronenmikroskopie unzählige Literatur verfügbar ist.
In einer weiteren Ausgestaltung des biohybriden Bioreaktors wird das pflanzliche Gewebe durch Gefriersubstitution plastiniert. Entsprechende Verfahren wurden für die Elektronenmikroskopie entwickelt. Pflanzliche Gewebe werden durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff fixiert und Eis gegen ein Einbettungsmittel sukzessive ausgetauscht, wobei eine vorangehende Entwässerung erforderlich ist. Dieser Austausch ist zwar sehr zeitaufwändig, das Verfahren ist aber gut geeignet, um leere, embolisierte Xylemgefässe vom Einbettungsmittel frei zu halten.
Die Vorteile der Nutzung biohybrider Strukturen gegenüber einer rein technischen Lösung beruhen vor allem bei der Realisierung sehr kleiner, komplexer dreidimensionaler Strukturen darauf, dass die Herstellung solcher Strukturen unter Verwendung von Biotemplaten kostengünstiger und weniger zeitintensiv ist als die technisch-gestützte Herstellung einer vergleichbaren Struktur. Zudem ist die Herstellung biohybrider Mikrostrukturen mit einem relativ geringen apparativen Aufwand verbunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des Bioreaktor, dem biomimetischen Bioreaktor ist das Leitungsbahnensystem ein künstlich erzeugtes, zumindest teilweise permeables mikrofluidisches System. Das künstlich erzeugte mikrofluidische System folgt der Natur, d.h. ist vom Gewebe einer natürlichen oder transgenen Pflanze übernommen oder abstrahiert die in der Natur vorkommenden Xylem-Strukturen. Bio-mimetisch bedeutet dabei, dass es sich um eine technische Nachbildung der biologischen Blaupause, z.B. der Architektur des Gefäßsystems eines Blatte, bzw. um eine technische Nachbildung von Strukturen, die dem biologischen Vorbild entsprechen, handelt. Die mikrofluidische Struktur wird also nach dem Vorbild der räumlichen Anordnung des Leitungsbahnensystems eines Gewebes einer Pflanze, bevorzugt eines Blattes, der Blattnervatur, auf mikrostrukuturtechnischem Weg hergestellt, ohne dass das pflanzliche Gewebe auch die direkte materielle Grundlage liefert. Gegebenenfalls kann auch gefriergetrocknetes pflanzliches Gewebe als Biotemplat eingesetzt werden.
Xylemgefäße besitzen einen zirkularen Querschnitt. Komplexe mikrofluidische Strukturen werden vor allem mit lithografischen Verfahren hergestellt, die zu Kanalstrukturen mit viereckigem Querschnitt führen. Mit alternativen Techniken ist die Herstellung komplexer Strukturen verhältnismäßig aufwändig und kostenintensiv.
Die Erzeugung der Mikrostruktur erfolgt vorzugsweise durch mindestens eine der folgenden Herstellungsverfahren:

• Lithografie
• Mikrospritzguss
• Projektionsverfahren (Waldbaur et al. 2011)
• Spangebende Fertigung
• Heißprägen / Nanoprägen
• Direktschreibende Verfahren (Rapid Prototyping Verfahren)

Die Herstellung einer Schablone aus dem biologischen Vorbild erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von speziell für die Analyse der Blattnervatur entwickelten Computer-Programmen (Rolland-Lagan et al. 2009, Price et al. 2011) oder durch direkte Projektion.
Die biomimetische Struktur ist frei skalierbar und die biologische Vorlage wird für eine spezifische Anwendung modifiziert. Für 2-dimensionale Strukturen wie Blätter ist die indirekte Nutzung des Bio-Templates der direkten vorzuziehen, es sei denn, die erwünschten Eigenschaften des biologischen Vorbildes, der zirkularer Gefäßquerschnitt und die 3-dimensionale Struktur würden durch das Projektionsverfahren verloren gehen.
Das für die Erzeugung des mikrofluidischen Leitungsbahnensystem verwendete Material, vorzugsweise ausgewählt unter Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylenglycol-Diacrylat, cyclische Olefine (COC), Polycarbonat, Polysulfonat, Silicon, Thiolene, muss den Aufwuchs der mindestens einen Zelllinie des Zellverbandes ermöglichen und zumindest teilweise permeabel für den mindestens einen Zellmetaboliten sein, damit dieser vom Zellverband mit dem Perfusat abgegeben wird. In einer Ausgestaltung wird das Material mit einem Zellkulturmaterial überzogen, wobei beide Materialien den unidirektionalen stofflichen Austausch aus dem Zellverband in das Leitungsbahnensystem ermöglichen und das Perfusat mit dem mindestens einem Zellmetaboliten abtransportiert wird. Sowohl beim biohybriden als auch beim biomimetischen Bioreaktor muss der künstlich um das erzeugte Leitungsbahnensystem angelegte Zellverband aus mindestens einer Zelllinie mit Wasser und Nährstoffen versorgt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung ermöglichen das Material und das Zellkulturmaterial den bidirektionalen Austausch von organischen Molekülen, Nährstoffen, Salzen, Hemmstoffen, Wachstumsfaktoren und Hormonen. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ermöglicht das Material den bidirektionalen Stoffaustausch und die mindestens eine verwendete Zelllinie wird direkt auf diesem Material angezüchtet, so dass kein zusätzliches Zellkulturmaterial notwendig ist. In einer weiteren Ausgestaltung erfolgt die Zugabe der Nährlösung direkt zu dem Zellverband und nicht oder zusätzlich über das Leitungsbahnsystem.
Von der biologischen Funktion her ist die Blattnervatur für eine gleichmäßige Allokation von Wasser und Nährstoffen über die Oberfläche der Lamina bei möglichst flachen Druckgradienten ausgelegt. Daher ist es sinnvoll, bei der Anfertigung von Trägerstrukturen für Zellrasen auf biologische Vorlagen zurückzugreifen. Als Material für die Herstellung solcher Strukturen bietet sich Polyethylenglycol-Diacrylat an, da auf diesem Substrat Zellen gut aufwachsen können. Die Nährlösung wird über das mindestens eine Leitungsbahnensystem, welches sich an die Nervatur des pflanzlichen Gewebes, z.b. des Blattes anlehnt, verteilt und erreicht diffusiv die aufwachsenden Zellen durch das Polyethylenglycol-Diacrylat-Hydrogel. Das mindestens eine Leitungsbahnensystem ist auch für einen ungleichmäßigen Flüssigkeitsverbrauch, z.B. durch lokale Unterschiede in den Wachstumsraten der aufwachsenden Zellen auch bei zeitlich wechselnden Mustern, ausgelegt, da ein vergleichbares Phänomen auch in der Natur auftritt („Patchiness“ der stomatären Leitfähigkeit). Modellierungen der Fluss- und Druckprofile haben gezeigt, dass Blätter mit einem hohen Vernetzungsgrad der Hauptadern (und redundanten Transportwegen) die höchste Effizienz aufweisen. Demzufolge ist eine hohe verzweigungsrate der Nebenleitungssysteme für den biomimetischen und den biohybriden Ansatz wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung befasst sich ebenfalls mit einem Verfahren zur Gewinnung von Zellmetaboliten, vorzugsweise im erfindungsgemäßen Bioreaktor. Zunächst wird nach einem Verfahrensschritt a) der mit mindestens einem Leitungsbahnensystem versehenen Zellverbandes in den Bioreaktor eingebracht und anschließend nach Verfahrensschritt b) die Hauptleitungsbahn des Leitungsbahnensystems über das Verbindungsstück an die Zulauf-Leitung angeschlossen. Die mindestens eine Nebenleitungsbahn und/oder die Hauptleitungsbahn wird perfundiert und mit dem Sammelgefäß vorzugsweise durch Anschluss einer Anschlussleitung über einen Adapter in Verbindung gebracht. Anschließend wird nach Verfahrensschritt d) das Modul durch Zusammenführen des Deckels und des Bodens verschlossen. Durch Anlegen eines Flüssigkeitsstroms vorzugsweise vom Vorratsgefäß durch den mit mindestens einem Leitungsbahnensystem versehenen Zellverband vorzugsweise in das Sammelgefäß oder eine Reinigungsanlage, wobei vorzugsweise durch eine Druck-erzeugende Quelle ein flacher Druckgradient zwischen der Zulauf-Leitung und der Ablauf-Leitung erzeugt wird, wird die Produktion des gewünschten Zellmetaboliten gestartet. Der Zellmetabolit wird vom Zellverband in das Perfusat abgegeben und mit diesem in das Leitungsbahnensystem transportiert. Das Perfusat wird über die Ablaufleitung vorzugsweise in ein Sammelgefäß geleitet. Dort wird der Zellmetabolit nach Verfahrensschritt f) entnommen.
Anstelle eines Sammelgefäßes besteht auch die Möglichkeit, das Perfusat des mindestens einen Moduls in einer Leitung zusammenzuführen und direkt weiteren Reinigungsschritten zu unterziehen.
Der vom Vorratsgefäß in die einzelnen Module geleitete Flüssigkeitsstrom enthält in einer Ausgestaltung eine Nährlösung, um den Zellverband zu versorgen und lebendig zu halten. In einer anderen Ausgestaltung wird die Nährlösung direkt zu den Zellen gegeben.
Der Flüssigkeitsstrom enthält in einer bevorzugten Ausgestaltung mindestens einen Zusatzstoff, bevorzugt ausgewählt unter Elicitoren, Hormonen, Zuckern, Hemmstoffen, Farbstoffen und Stoffen zur Erhöhung der Membranpermeabilität. Die jeweilige Konzentration der Komponente im Flüssigkeitsstrom ist dabei so zu optimieren, dass eine anhaltende, möglichst konstante Wirkstoffsynthese gewährleistet ist und der Zellverband nicht geschädigt wird.
Ist der mindestens eine Zellmetabolit nur in geringem Umfang wasserlöslich, reichert er sich also im Bereich der Zellwand an, werden die Zellen mit einem 2-Phasensystem perfundiert, wobei zusätzlich zu Wasser ein organisches Lösungsmittel, bevorzugt ausgewählt unter Dibutylphtalat, Hexadecan, Tricaprylin eingesetzt wird. Der Anteil des organischen Lösungsmittels beträgt dabei 1 vol% bis 50 vol%, bevorzugt 5 vol% bis 20 vol%. Es wird dabei eine einheitliche Tröpfchengröße der organischen Phase von weniger als 3 µm bevorzugt von weniger als 1 µm angestrebt, da sich Tröpfchen dieser Größe ungehindert durch die mikrofluidischen Kanäle des natürlichen oder nachgebildeten Xylems bewegen können.
In einer bevorzugten Ausgestaltung werden Wasser und Dibuthylphtalat als 2-Phasensystem eingesetzt, wobei der Anteil an Dibuthylphtalat bei 5 vol% bis 20 vol% liegt. Dieses mit Wasser kaum mischbare Lösungsmittel hat keine cytotoxischen Eigenschaften.
Bei der Rezeptur des Perfusionsmediums muss auf die Einstellung eines für den verwendeten Zellverband geeigneten pH Wertes, bevorzugt im Bereich von 4.5–6.5 sowie auf die Einstellung eines geeigneten Redoxpotentials geachtet werden, damit unter anderem Disulfitbrücken stabilisiert bleiben und die jeweils für die Synthese des gewünschten Zellmetaboliten verantwortlichen Enzyme optimal arbeiten.
In bevorzugten Ausgestaltungen wird auch mindestens ein Protease-Inhibitor und/oder Protein-Stabilisator, bevorzugt Polyvinylpyrolidon dem Flüssigkeitsstrom zugefügt, um Phenole zu binden und sie dadurch unschädlich zu machen. Der Protease Inhibitor bzw. Protein-Stabilisator darf kaum, bzw. keine Interaktionen mit dem zu gewinnenden Zellmetabolit eingehen.
Verschiedene Ausgestaltungsformen können frei miteinander kombiniert werden.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von den Figuren näher erläutert. Hierbei zeigen:
1 Schematische Darstellung einer seriellen Verschaltung mehrerer Module zu einem Bioreaktor.
2 Schematische Darstellung einer paralellen Verschaltung mehrerer Module zu einem Bioreaktor.
3 Schematischer Aufbau eines Moduls.
4 Aufsicht auf den Boden eines mit zwei miteinander verbundenen Leitungsbahnensystemen versehenen Moduls.
In 1 ist die serielle Verschaltung mehrerer Module zu dem erfindungsgemäßen Bioreaktor 1 schematisch dargestellt. Die einzelnen Module 2, 3, 4, die jeweils einen Boden 20 und einen Deckel 21 umfassen, werden in Reihe mit einer Zulaufleitung 122 verbunden. Eine druckerzeugende Quelle 10 erzeugt den nötigen Druckgradienten, um mit dem Flüssigkeitsstrom von dem Vorratsgefäß 11 über die Zulaufleitung 122 die angeschlossenen Module zu speisen. Das Modul 2 wird über das Verbindungsstück 23 an die Zulaufleitung gekoppelt. Die Ablaufleitung 132 wird von den Modulen 2, 3, 4 gespeist und mündet im Sammelgefäß 14.
2 zeigt die parallele oder sternförmige Verschaltung der einzelnen Module 2, 3, 4, 5, zu dem erfindungsgemäßen Bioreaktor 1, die es ermöglicht alle Module gleichzeitig zu adressieren. Dabei wird der Flüssigkeitsstrom von dem Vorratsgefäß 11 durch die druckerzeugende Quelle 10 über die Zulaufleitungen 122, 123, 124, 125 zu den einzelnen Modulen 2, 3, 4, 5 geleitet, die an diese mittels Verbindungsstücke 23 verbunden werden. Die Ablaufleitungen 132, 133, 134, 135 sammeln dann den Flüssigkeitsstrom nach dem Durchlaufen der jeweiligen Module 2, 3, 4, 5 auf.
3 zeigt die schematische Darstellung des Moduls 2, wobei der Deckel 21 und der Boden 20 des Moduls in dieser Ansicht nicht zusammengeschlossen sind. Die Zuleitungsbahn 122 wird über das Verbindungsstück 23 an das Leitungsbahnensystem 51 des Zellverbands 50 angeschlossen. Der Flüssigkeitsstrom fließt dann über die Hauptleitungsbahn 511 in das Nebenleitungsbahnsystem 512, 513 mit der mindestens einen Nebenleitungsbahn 5112, 5113, 5114 bis dieser über die Anschlussleitungen 221, 222, 223 in die Ablaufleitung 132 abgeführt wird. Die Anschlussleitungen 221, 222, 223 sind über die Adapter 241, 242, 243 an die mindestens eine Nebenleitungsbahn 5112, 5113, 5114 des Nebenleitungsbahnensystems 512, 513 angeschlossen.
4 stellt eine schematische Aufsicht auf den mit mehreren Leitungsbahnen versehenen Zellverband 50 mit den Zellen 501 mit zwei miteinander verbundenen Leitungsbahnensystemen 51, 51´ versehenen Moduls dar. Die zwei Leitungsbahnensysteme 51, 51´ werden von den Zulaufleitungen 122, 123 getrennt gespeist und sind über die Nebenleitungsbahnen 512, 513 miteinander verbunden, sodass der austretende Flüssigkeitsstrom über einen gemeinsamen oder über getrennte Anschlussleitungen 221, 222, 223 in den Ablauf gelangt.
Literatur

McCulloh et al 2003: McCulloh KJ, Sperry J, Adler F (2003) Water transport in plants obeys Murray’s law. Nature 421, 939–942
Newman und Cragg 2012: Newman, D. J., Cragg, G. M. (2012) Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J. Nat. Prod. 75, 311–335
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Waldbaur et al. 2011: Waldbaur A, Rapp H, Länge K, Rapp BE (2011) Let there be chip – towards rapid prototyping of microfluidic devices: one-step manufacturing processes. Analytical Methods, DOI:10.1039/ C1AY05253E
Wegner und Zimmermann 2002: Wegner LH, Zimmermann U (2002) On-line measurements of K+ activity in the tensile water of the xylem conduit of higher plants. The Plant Journal 32, 409–417
Wegner 2012: Wegner, L. H. (2012). Using the multifunctional xylem probe for in situ studies of plant water and ion relations under saline conditions. In: S. Shabala, T. A. Cuinn, eds, Salt tolerance – methods and protocols. Methods in Molecular Biology 913, 35–66
Wilson und Roberts 2012: Wilson, S. A., Roberts, S. C. (2012) Recent advances towards development and commercialization of plant cell culture processes for the synthesis of biomolecules. Plant Biotechnology Journal 10, 249–268

Bezugszeichenliste

1: Bioreaktor
2,3,4,5: Modul
10: druckerzeugende Quelle
11: Vorratsgefäß
14: Sammelgefäß
20: Boden
21: Deckel
23: Verbindungsstück
50: Zellverband
51, 51‘: Leitungsbahnensystem
122, 123, 124, 125: Zulaufleitung
132, 133, 134, 135: Ablaufleitung
221, 222, 223: Anschlussleitungen
241, 242, 243: Adapter
501: Zelle
511: Hauptleitungsbahn
512, 513: Nebenleitungsbahnsystem
5112, 5113, 5114: Nebenleitungsbahn

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Newman und Cragg 2012 [0002]
Wilson und Roberts 2012 [0004]
Wilson und Roberts 2012 [0005]
Wegner 2012 [0030]
McCulloh et al. 2003 [0032]
Wegner und Zimmermann 2002 [0032]
Waldbaur et al. 2011 [0047]
Rolland-Lagan et al. 2009 [0048]
Price et al. 2011 [0048]

Claims

Bioreaktor (1) umfassend mindestens ein Modul (2, 3, 4, 5), das mit einer Zulauf-Leitung (122, 123, 124, 125) verbunden ist und über eine Ablauf-Leitung (132, 133, 134, 135) verfügt und das mit einer Druckerzeugenden Quelle verbunden ist, wobei jedes Modul (2, 3, 4, 5) einen Boden (20), einen Deckel (21) und einen mit mindestens einem Leitungsbahnensystem (51, 51‘) versehenen Zellverband (50) umfasst, wobei der mit mindestens einem Leitungsbahnensystem (51, 51‘) versehene Zellverband (50) mindestens eine Zelllinie (501) umfasst, die das mindestens eine Leitungsbahnensystem (51, 51‘) zumindest teilweise umgibt und zumindest teilweise mit dem mindestens einem Leitungsbahnensystem (51, 51‘) in stofflichem Austausch steht, und wobei jedes Leitungsbahnensystem (51) eine Hauptleitungsbahn (511) und mindestens ein von der Hauptleitungsbahn (511) abgezweigtes Nebenleitungsbahnensystem (512, 513) mit mindestens einer Nebenleitungsbahn (5112, 5113, 5114) umfasst und die Hauptleitungsbahn (511) über das Verbindungsstück (23) mit der Zulaufleitung (122, 123, 124) verbunden ist und die mindestens eine Nebenleitungsbahn (5112, 5113, 5114) und/oder die Hauptleitungsbahn über je einen Adapter (241, 242, 243) mit einer Anschlussleitung (221, 222, 223) verbunden ist, welche in die mindestens eine Ablauf-Leitung (132, 133, 134) mündet.
Bioreaktor (1) nach Anspruch 1, wobei der mit einem Leitungsbahnensystem (51) versehene Zellverband (50) aus mindestens einer pflanzlichen oder tierischen, natürlichen oder genetisch veränderten Zelllinie besteht.
Bioreaktor (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei der mit einem Leitungsbahnensystem (51) versehene Zellverband (50) ein Blatt einer natürlichen oder transgenen Pflanze ist, und die Hauptleitungsbahn (511) die Mittelrippe des Blattes und die Nebenleitungsbahnen (5112, 5113, 5114) die Seitenrippen des Blattes darstellen.
Bioreaktor (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das mindestens eine Leitungsbahnensystem (51) das zumindest teilweise permeable, plastinierte Xylem eines Gewebes einer natürlichen oder transgenen Pflanze ist.
Bioreaktor (1) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das mindestens eine Leitungsbahnensystem (51) ein künstlich erzeugtes, zumindest teilweise permeables mikrofluidisches System ist.
Bioreaktor (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Bioreaktor ein Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Feldes oder zur Erzeugung von Ultraschallwellen aufweist.
Verfahren zur Gewinnung von Zellmetaboliten in einem Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit den Verfahrensschritten a) Einbringen des mit mindestens einem Leitungsbahnensystem (51) versehenen Zellverbandes (50) in ein Modul des Bioreaktors(1) und b) Anschließen der Hauptleitungsbahn (511) des Leitungsbahnensystems (51) über das Verbindungsstück (23) mit der Zulauf-Leitung (122, 123, 124) und c) Verbinden der mindestens einen Nebenleitungsbahn (5112, 5113, 5114) und/oder der Hauptleitungsbahn mit einer Anschlussleitung (221, 222, 223) über einen Adapter (241, 242, 243) und d) Zusammenführen des Deckels (20) und des Bodens (21) und e) Anlegen eines Flüssigkeitsstroms durch den mit mindestens einem Leitungsbahnensystem (51) versehenen Zellverband (50) und Auffangen des Perfusats f) Entnahme des mindestens einen Zellmetaboliten aus dem Perfusat (14).
Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine Nährlösung direkt zu der mindestens einen Zelllinie (501) gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei mindestens während Verfahrensschritt e) ein gepulstes elektrisches Feld angelegt wird.
Verwendung eines Bioreaktors (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Gewinnung von Zellmetaboliten.