DE102021214281A1

DE102021214281A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate

Info

Publication number: DE102021214281A1
Application number: DE102021214281.8A
Authority: DE
Inventors: Michael Stumber; Carina Schuessler
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2023-06-15
Also published as: WO2023110319A1

Abstract

Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung (10) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten (7) zu Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmenten (8) mit einem ersten fluidischen Anschluss (1a) und einem zweiten fluidischen Anschluss (1b) und zumindest einem zwischen dem ersten (1a) und dem zweiten fluidischen Anschluss (1b) angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal (2), beschrieben, wobei der erste mikrofluidische Kanal (2) zumindest eine erste Rückhaltestruktur (3) aufweist, an welcher dreidimensionale Agglomerate (7) durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind, und wobei die zumindest eine erste Rückhaltestruktur (3) in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal (2) so platziert ist, dass dieser für ungesplittete dreidimensionale Agglomerate (7) in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses (1b) nicht weiter passierbar ist.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung, ein Verfahren zum Betrieb derselben sowie auf eine Prozessiereinheit und eine, die mikrofluidische Vorrichtung umfassende Kartusche, nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
Stand der Technik
das Interesse an der Verwendung von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen, hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen, da solche dreidimensionalen Agglomerate zum Beispiel organspezifische Eigenschaften gut abbilden können.
Typischerweise erfolgt deren Handhabung manuell mit Hilfsmitteln wie Pipetten, Reaktionsgefäßen und Laborgeräten. Hier bietet die Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Labortests Vorteile wie beispielsweise geringere benötigte Probenvolumina und Reagenzien, verkürzte Analysezeiten sowie parallel ablaufende Vorgänge.
Bei der Implementierung erforderlicher Prozessschritte in ein mikrofluidischen System gibt es jedoch aufgrund deren Komplexität zahlreiche Herausforderungen, die es zu meistern gilt. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Kultivierung und Vermehrung solcher dreidimensionaler Zellagglomerate in einem mikrofluidischen System.
Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, kurz LoC-Systeme, sind mikrofluidische Systeme, welche Funktionalitäten eines makroskopischen Labors auf einem Kunststoffsubstrat für eine automatisierte Prozessierung unterbringen. Solche Systeme ermöglichen es, biochemische Prozesse weitestgehend oder vollständig automatisiert zu prozessieren. Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen typischerweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle, Reaktionskammern oder vorgelagerte Reagenzien oder auch aktiven Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Steuereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche.
Die WO 2016/183143 A1 beschreibt die Herstellung eines Herzzellenorganoids, welches in einer mikrofluidischen Plattform angeordnet ist, um die Wirkung von Medikamenten auf Herzzellen zu untersuchen. Ein Bioreaktor der Plattform weist röhrenförmigen Stopper auf, an denen das Organoid zurückgehalten wird, um es an einer definierten Position festzuhalten.
Aus der WO 2014/179196 A1 ist eine Vorrichtung zur Zellkultur von Sphäroiden bekannt. Diese kann als mikrofluidische Vorrichtung ausgeführt sein. Die Sphäroide werden in separaten Vertiefungen der Vorrichtung kultiviert. Die Vertiefungen weisen Rückhaltestrukturen in Form von Kanten auf, welche dazu dienen die Bewegung einer Pipettenspitze zu stoppen, um so eine Zugabe oder Entnahme eines flüssigen Mediums an einer definierten Position in der Nähe des Sphäroids zu ermöglichen.
Offenbarung der Erfindung
Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel so genannte Tumor-Organoide und -Sphäroide zum Einsatz. Diese ermöglichen eine sehr gute Reproduktion verschiedener krankhafter Gewebezustände, weswegen sie sich für Medikamententests zur Evaluierung der Wirksamkeit und Dosierung von Medikamenten anbieten. Mittels dieser Beobachtungen kann dann beispielsweise für den einzelnen Erkrankten eine personalisierte medikamentöse Krebstherapie ausgewählt werden, die individuelle Besonderheiten berücksichtigt und so die Effizienz der Therapie optimiert.
Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor-Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung. Hierbei erfolgt eine Differenzierung und Vermehrung dieser Zellen oder Gewebefragmente, die sich schließlich zu dreidimensionalen Strukturen selbstorganisieren. Die daraus entstehenden Tumor-Organoide sind somit dreidimensionale Zellagglomerate, welche eine ähnliche Zusammensetzung und Architektur aufweisen wie das primäre Tumorgewebe des Patienten. Sie weisen beispielsweise einen Durchmesser von 30 - 500 µm auf.
Sphäroide sind dreidimensionale Zellagglomerate, die durch Aggregation und Organisation einiger Tausend Zellen erzeugt werden können, beispielsweise mit einem Durchmesser von 100 - 800 µm. Im Vergleich zu Organoiden sind Sphäroide weniger komplex und weisen in der Regel nur eine Art Zellen auf.
Um über einen längeren Zeitraum von mehreren Wochen oder Monaten mit Organoiden oder Sphäroiden arbeiten zu können, werden aktuell etablierte Methoden der 3D-Zellkultivierung angewandt.
Hauptprozessschritte hierbei sind die Kultivierung von Organoiden oder Sphäroiden und deren anschließende Expansion Bei der Expansion werden die Organoide oder Sphäroide enzymatisch und/oder mechanisch in Organoid- oder Sphäroid-Fragmente aus einigen wenigen zehn Zellen und in einzelne Organoid-Zellen oder Sphäroid-Zellen gesplittet. Anschließend werden die gesplitteten Organoid- oder Sphäroid-Fragmente und -Zellen neu ausgesät. Auf diese Weise erfolgt eine Vermehrung der Organoide oder Sphäroide.
Unter dem Begriff „Splitten“ wird im Sinne der vorliegenden Erfindung also eine Auflösung von Verbindungen zwischen Einzelstrukturen eines dreidimensionalen Agglomerats, und die dadurch entstehende Dissoziierung des dreidimensionalen Agglomerats in Agglomerat-Fragmente und/oder Einzelstrukturen verstanden.
Unter dem Begriff dreidimensionale Agglomerate werden im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise Zellagglomerate wie Organoide oder Sphäroide verstanden.
Bei einem Split-Vorgang erfolgt also beispielsweise eine Auflösung von Verbindungen zwischen Zellen eines Zellagglomerats, und die dadurch entstehende Dissoziierung des Zellagglomerats in multizelluläre Zellagglomerat-Fragmente bzw. einzelne Zellen.
Beim Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden und Sphäroiden, sind mehrere Schritte zur Zugabe und zur Trennung der dreidimensionalen Agglomerate von verschiedenen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Kulturmedien, Enzymlösungen oder Spülflüssigkeiten wie beispielsweise Waschpuffern, mit anschließender Resuspension in weiteren Flüssigkeiten erforderlich, sowie beispielsweise ein Auf- und Abpipettieren der dreidimensionalen Agglomerate zum mechanischen Splitten. Im Labormaßstab werden hierfür die Gefäße gewechselt sowie Zentrifugationsschritte und visuell zu überwachende Pipettiervorgänge realisiert. Diese Prozessschritte zur Kultivierung und Expansion sind sehr arbeits- und zeitintensiv und können nur von ausgebildetem und erfahrenem Fachpersonal in geeignet ausgestatteten Laboren durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung adressiert eine mikrofluidische Implementierung der Prozesse zum Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten, wie beispielsweise von Tumor-Organoiden oder Tumor-Sphäroiden.
Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem ersten fluidischen Anschluss und einem zweiten fluidischen Anschluss und zumindest einem zwischen dem ersten und dem zweiten fluidischen Anschluss angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.
Dies beruht insbesondere darauf, dass der zumindest eine erste mikrofluidische Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung zumindest eine erste Rückhaltestruktur aufweist, an welcher dreidimensionale Agglomerate durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind und dass die zumindest eine erste Rückhaltestruktur in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal so platziert ist, dass dieser für ungesplittete dreidimensionale Agglomerate in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses nicht weiter passierbar ist.
Die zumindest eine erste Rückhaltestruktur ist beispielsweise pfeiler- oder pfostenförmig ausgeführt. Der Querschnitt der zumindest einen ersten Rückhaltestruktur ist beispielsweise rund oder vier- oder mehreckig.
Der erste mikrofluidische Kanal umfasst beispielsweise eine oder mehrere erste Rückhaltestrukturen. Im Fall von mehreren ersten Rückhaltestrukturen sind diese beispielsweise nebeneinander und/oder hintereinander, insbesondere schräg versetzt hintereinander, in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal angeordnet.
Vorteilhaft hierbei ist, dass mittels der mikrofluidischen Vorrichtung die Arbeitsschritte zum Splitten von dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert durchgeführt werden können. Somit wird viel Zeit eingespart aufgrund der Einsparung händischer Arbeitsschritte, verkürzter Analysezeiten und parallel ablaufender Vorgänge. Desweiteren sind diese Arbeitsschritte somit nicht nur von ausgebildetem und erfahrenen Fachpersonal durchführbar, wodurch dieses entlastet wird.
Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate und die Agglomerat-Fragmente, sowie die Einzelstrukturen hierbei viabel und kultivierbar bleiben.
Dadurch, dass die Prozessschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.
Es ist vorteilhaft, dass die zumindest eine erste Rückhaltestruktur in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal so platziert ist, dass dieser für dreidimensionalen Agglomerate im ungesplitteten Zustand in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses nicht weiter passierbar ist. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass nur gesplittete Agglomerat-Fragmente und/oder Einzelstrukturen sowie Fluide die mikrofluidische Vorrichtung weiter passieren können. Zudem ist es vorteilhaft, dass sich die dreidimensionalen Agglomerate vor der zumindest einen Rückhaltestruktur ansammeln, wodurch sie sich an einer optimalen Ausgangsposition für ein nachfolgendes Splitten an der zumindest einen Rückhaltestruktur des zumindest einen mikrofluidischen Kanals befinden.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der mikrofluidische Vorrichtung spaltet sich der zumindest eine erste mikrofluidische Kanal in, insbesondere zwei, zweite mikrofluidische Kanäle mit je einem kleineren Durchmesser oder einer geringeren Breite und/oder Höhe als der erste mikrofluidische Kanal auf. Der fluidische Widerstand der zweiten mikrofluidischen Kanäle ist hierbei im Wesentlichen gleich, um eine gleichmäßige Verteilung der Strömung sowie der Organoid-Zellen und/oder Organoid-Agglomerate auf die zweiten mikrofluidischen Kanäle zu gewährleisten.
Jeder zweite mikrofluidische Kanal umfasst zumindest eine zweite Rückhaltestruktur. Die zweite Rückhaltestruktur ist in dem zweiten mikrofluidischen Kanal so platziert, dass dieser für Agglomerat-Fragmente, welche größer sind als der Durchgang zwischen der Kanalinnenwand des zweiten mikrofluidischen Kanals und der zweiten Rückhaltestruktur und/oder welche größer sind als der Durchgang zwischen zwei oder mehreren zweiten Rückhaltestrukturen, in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses, nicht weiter passierbar ist. Nach diesem Muster kann sich beliebig oft ein mikrofluidischer Kanal in, insbesondere zwei, neue mikrofluidische Kanäle mit Rückhaltestruktur aufspalten. Vorteilhaft hierbei ist, dass die einzelnen Verfahrensschritte zum Splitten der dreidimensionalen Agglomerate parallel in jedem der abgespaltenen mikrofluidischen Kanäle erfolgen, sodass das Verfahren schneller, effizienter und mit einer größeren Menge an zu splittenden Agglomerat-Fragmenten durchgeführt werden kann. Zudem vorteilhaft ist, dass die sich abspaltenden mikrofluidischen Kanäle einen kleineren Durchmesser aufweisen als die parentalen Kanäle, sodass ein Agglomerat-Fragment die mikrofluidische Vorrichtung umso weiter in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b passieren kann, desto kleiner es ist und in jedem mikrofluidischen Kanal jeweils auf dessen Größe angepasste optimale Split-Bedingungen vorfindet, wie beispielsweise die Größe der Rückhaltestruktur und die Abmessungen des jeweiligen mikrofluidischen Kanals.
Der Querschnitt der mikrofluidischen Kanäle ist beispielsweise rechteckig oder quadratisch, wobei die Ecken abgerundet ausgeführt sein können. Alternativ ist der Querschnitt der mikrofluidischen Kanäle beispielsweise rund oder oval.
Desweiteren kann der erste mikrofluidische Kanal in einer Ausführungsform mäanderförmig ausgestaltet sein.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform verschlankt sich zumindest ein mikrofluidischer Kanal, insbesondere kontinuierlich, in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses. In einer Ausführung verschlanken sich also beispielsweise der erste mikrofluidische Kanal, sowie alle sich direkt oder indirekt von diesem aufspaltenden mikrofluidischen Kanäle. Die Verschlankung kann hierbei auch stufenweise erfolgen, beispielsweise durch mehrere aufeinanderfolgende Verengungen.
Vorteilhaft hierbei ist, dass dreidimensionale Agglomerate und Agglomerat-Fragmente in eine gewisse Größe aufgesplittet sein müssen, um den Kanal weiter passieren zu können. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass schlussendlich nur Agglomerat-Fragmente mit der gewünschten Größe erhalten werden.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor, dass der Durchmesser und/oder die Breite und/oder die Höhe der zumindest einen Rückhaltestruktur sich mit jeder Aufspaltung des diese beinhaltenden mikrofluidischen Kanals verringert.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Rückhaltestruktur so jeweils eine optimale Größe in Bezug auf die Größe der jeweiligen dreidimensionalen Agglomerate und/oder Agglomerat-Fragmente hat für die Verfahrensschritte zum Splitten dieser. So wird sichergestellt, dass das Verfahren schnell und effizient erfolgt, und die dreidimensionalen Agglomerate und/oder Agglomerat-Fragmente viabel bleiben.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst zumindest einer der mikrofluidischen Kanäle eine richtungsweisende Struktur.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Zellagglomerate oder Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente in die Kanalmitte und/oder in Richtung der zumindest einen Rückhaltestruktur fokussiert werden. Hierdurch wird der Split-Vorgang beschleunigt und verbessert.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor, dass die mikrofluidische Vorrichtung eine Heizeinrichtung aufweist zur Temperierung zumindest eines mikrofluidischen Kanals. Unter einer Heizeinrichtung wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Einrichtung verstanden, welche den zumindest einen mikrofluidischen Kanal mit der zumindest einen Rückhaltestruktur beheizen oder kühlen kann.
Vorteilhaft hierbei ist, dass auf diese Weise eine optimale Temperatur für das Splitten der dreidimensionalen Agglomerate bereitgestellt werden kann.
Eine optimale Temperatur für das Splitten hängt unter anderem beispielsweise von der Kultivierung der dreidimensionalen Agglomerate ab. Bei einer Kultivierung von Organoiden in Matrigel® (Corning) ist es beispielsweise vorteilhaft zumindest einen mikrofluidischen Kanal mit zumindest einer Rückhaltestruktur zu kühlen, da sich Matrigel bei Temperaturen von circa 4°C verflüssigt.
In einer Ausführungsform, in welcher ein enzymatisches Splitten der dreidimensionalen Agglomerate durch ein mechanisches Splitten an der zumindest einen Rückhaltestruktur des zumindest einen mikrofluidischen Kanals unterstützt wird, kann das enzymatische Splitten durch Einstellen einer optimalen Wirk-Temperatur des Enzyms noch weiter verbessert werden.
Bei einem enzymatischen Splitten von Organiden und/oder Sphäroiden umfasst die enzymhaltige Lösung beispielsweise das Enzym Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher), dessen optimale Wirk-Temperatur bei 37° Celsius liegt.
Eine Alternative oder zusätzlich Ausführungsform sieht vor, dass die mikrofluidische Vorrichtung eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung von Ultraschall und/oder eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung einer Vibration in zumindest einen mikrofluidischen Kanal umfasst.
Vorteilhaft bei der Einleitung von Ultraschall und/oder einer Vibration ist, dass die Ultraschallwellen und/oder Vibrationen auf die dreidimensionalen Agglomerate in dem zumindest einen mikrofluidischen Kanal einwirken und den Split-Vorgang unterstützen und verbessern. Desweiteren können die zu splittenden Agglomerate mit Ultraschall auch akustisch fokussiert werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung ein Rückhalteelement, welches als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist. Die Poren weisen insbesondere einen Durchmesser von 2-10 µm, und bevorzugt von 3-6 µm auf.
Das Rückhalteelement weist einen Porendurchmesser kleiner des Durchmessers der Einzelstrukturen der dreidimensionalen Agglomerate auf. Die Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente können das Rückhalteelement somit nicht passieren und sammeln sich auf diesem an. Vorteilhaft hierbei ist, dass durch das Rückhalteelement ein Flüssigkeitsaustausch ermöglicht ist, Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente jedoch festgehalten werden, sodass sie die mikrofluidische Vorrichtung nicht ungewollt verlassen können und somit nicht verloren gehen.
Alternativ weisen die Poren des ersten Rückhalteelements einen anderen, auf die jeweilige Anwendung angepassten Porendurchmesser auf.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist die mikrofluidische Vorrichtung einen zusätzlichen mikrofluidischen Kanal auf, welcher ausgehend von einer Oberseite des Rückhalteelements in einem dritten mikrofluidischen Anschluss mündet.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente somit separat über den zusätzlichen mikrofluidischen Kanal transportiert werden können und über den dritten mikrofluidischen Anschluss ausgeführt werden können. Die mikrofluidische Vorrichtung ist somit flexibler und komplexer, was eine flexiblere Handhabung und die Durchführung komplexerer mikrofluidischer Vorgänge erlaubt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Ventil und/oder zumindest eine Pumpe, welche insbesondere elektrisch ansteuerbar sind, sodass die mikrofluidische Vorrichtung elektrisch betreibbar ist.
Vorteilhaft hierbei ist, dass mittels eines oder mehreren Ventilen zumindest ein fluidischer Anschluss und/oder zumindest ein mikrofluidischer Kanal und/oder zumindest ein Reservoir für Fluide individuell schließ- und öffenbar ist, sodass der Fluss durch die mikrofluidische Vorrichtung individuell festlegbar ist. Auf diese Weise sind verschiedene Möglichkeiten der Zu- und Abführung von Medien sowie des Durchflusses durch die mikrofluidischen Kanäle einfach realisierbar.
In einer alternativen Ausführungsform ist das zumindest eine Ventil außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet.
In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt das Zu- und Abführen der Fluide und/oder das Fördern der Fluide durch zumindest eine Pumpe. Bei der zumindest einen Pumpe handelt es sich beispielsweise um eine mikrofluidischen Pumpe, sodass die komplexe und aufwändige fluidische Verbindung der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer externen Pumpe entfällt. Auf diese Weise können die fluidischen Zu-, Abführ- und Förderprozesse einfach und unkompliziert realisiert werden und die mikrofluidische Vorrichtung platzsparend, portabel und mobil ausgeführt werden.
In einer alternativen Ausführungsform ist die zumindest eine Pumpe außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet. Die zumindest eine Pumpe ist beispielsweise eine Spritzenpumpe oder eine peristaltische Pumpe.
Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst. Vorteilhaft hierbei ist, dass in dem Reservoir Fluide wie beispielsweise Medien, Spülflüssigkeiten, enzymhaltige Lösungen oder Färbelösungen vorlagerbar sind. So ist eine schnelle und einfache Zuführung dieser Fluide sichergestellt.
Die mikrofluidische Vorrichtung 10 ist beispielsweise auf einem Kunststoffsubstrat bzw. Chip untergebracht.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten zu Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmenten mittels der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung mit folgenden Schritten:

a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten über den ersten fluidischen Anschluss
b) Fördern des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten über den ersten mikrofluidischen Kanal, wobei die dreidimensionalen Agglomerate durch die Rückhaltestruktur am weiteren Durchtritt gehindert werden.
c) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten sodass die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch durch Reibung an der zumindest einen Rückhaltestruktur gesplittet werden.

Mit einem pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums ist gemeint, dass die Förderrichtung des ersten Mediums durch die mikrofluidische Vorrichtung temporär gewechselt wird durch aufeinanderfolgendes stoßweises Vorwärts- und Rückwärtsfördern des ersten Mediums.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die dreidimensionalen Agglomerate durch das pulsatile Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit der zumindest einen Rückhaltestruktur des zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanals in physischen Kontakt kommen und an dieser reiben. Desweiteren kommen die dreidimensionalen Agglomerate mit den Kanalinnenwänden des zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanals in physischen Kontakt und reiben an diesen. Zusätzliche Reibung entsteht zwischen den dreidimensionalen Agglomeraten und dem pulsatil hin- und herbewegten ersten Mediums. Dieses nimmt eine höhere Geschwindigkeit auf als die dreidimensionalen Agglomerate, was auch zu einem Abwaschen oder Ablösen von Einzelstrukturen oder Agglomerat-Fragmenten an der Oberfläche der dreidimensionalen Agglomerate führt. Zudem treffen auch die dreidimensionalen Agglomerate selbst aufeinander, wodurch eine weitere Reibung erzeugt wird. Durch diese Reibungsvorgänge lösen sich die Verbindungen zwischen den Einzelstrukturen, die für den Zusammenhalt des dreidimensionalen Agglomerats verantwortlich sind, immer weiter auf. Es spalten sich immer mehr Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente von den dreidimensionalen Agglomeraten ab. Auf diese Weise werden die dreidimensionalen Agglomerate mechanisch dissoziiert. Hierbei werden die Einzelstrukturen selbst nicht beschädigt und bleiben viabel und kultivierbar. Die Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmenten können dann neu ausgesät und kultiviert werden und zu dreidimensionalen Agglomeraten heranwachsen.
Es ist desweiteren vorteilhaft die Arbeitsschritte zum Splitten von dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert mittels des vorgeschlagenen mikrofluidischen Verfahrens durchzuführen. Auf diese Weise wird viel Zeit eingespart aufgrund des Wegfalls händischer Arbeitsschritte, verkürzter Analysezeiten und parallel ablaufender Vorgänge. Desweiteren sind diese Arbeitsschritte nicht nur von ausgebildetem und erfahrenen Fachpersonal durchführbar, wodurch dieses entlastet wird.
Durch die Automatisierung von Prozessschritten, ist wiederum deren Standardisierung möglich, welche insbesondere für klinische und industrielle Anwendungen, beispielsweise im Bereich der Wirkstofftestung und personalisierten Medizin große Vorteile bietet.
Dadurch, dass die Prozessschritte innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung ablaufen, ist zudem die Gefahr von unerwünschten bzw. problematischen Verunreinigungen der Probe reduziert.
Es ist vorteilhaft, dass die zumindest eine erste Rückhaltestruktur in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal so platziert ist, dass dieser für dreidimensionalen Agglomerate im ungesplitteten Zustand in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses nicht weiter passierbar ist. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass nur gesplittete Agglomerat-Fragmente oder Einzelstrukturen sowie Fluide die mikrofluidische Vorrichtung weiter passieren können. Zudem ist es vorteilhaft, dass sich die dreidimensionalen Agglomerate vor der zumindest einen Rückhaltestruktur ansammeln, wodurch sie sich an einer optimalen Ausgangsposition für ein nachfolgendes Splitten an der zumindest einen Rückhaltestruktur des zumindest einen mikrofluidischen Kanals befinden.
Das erste Medium mit den dreidimensionalen Agglomeraten wird beispielsweise mit einer Flussrate von 10 - 80 µl/s durch den zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanals hin- und herbewegt. Hierbei ist die Flussrate beispielsweise konstant oder variierend, insbesondere pulsierend.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens erfolgt nach Schritt b) folgender Schritt:

b') Zuführen und Fördern einer ersten Spülflüssigkeit über den zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal zum Waschen der dreidimensionalen Zellagglomerate.

Durch die erste Spülflüssigkeit werden eventuelle Rückstände des ersten Mediums entfernt und die dreidimensionalen Agglomerate sowie auch die mikrofluidische Vorrichtung gereinigt. In einer Ausführungsform, in welcher das mechanische Splitten der dreidimensionalen Agglomerate zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens ausgeführt wird, ist ein Waschschritt mittels einer ersten Spülflüssigkeit vorteilhaft, da hierdurch an den dreidimensionalen Agglomeraten anhaftende Proteine des ersten Mediums entfernt werden, welche sonst beispielsweise die Enzymreaktion hemmen.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor, dass nach Schritt b) oder nach Schritt

b') folgender Schritt erfolgt:
b'') Zuführen und Fördern einer enzymhaltigen Lösung über den ersten mikrofluidischen Kanal,

Hierzu wird beispielsweise zuerst die enzymhaltige Lösung mit splittender Wirkung zu den dreidimensionalen Agglomeraten gegeben, welche dann mit der enzymhaltigen Lösung, beispielsweise für einen Zeitraum von zehn Minuten, inkubiert werden. Während der Inkubation oder anschließend erfolgt das pulsatile Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal mit der zumindest einen ersten Rückhaltestruktur, um den Split-Vorgang mechanisch zu unterstützen. Durch das enzymatische und mechanische Einwirken lösen sich Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente von den dreidimensionalen Agglomeraten ab, sodass der Split-Vorgang mechanisch unterstützt und verbessert sowie insbesondere beschleunigt wird.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform erfolgen die Schritte b) und c), und optional die Schritte b') und/oder b'') ebenfalls in sich vom ersten mikrofluidischen Kanal direkt oder indirekt abspaltenden mikrofluidischen Kanälen mit zumindest einer Rückhaltestruktur. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Split-Vorgänge parallel in jedem der abgespaltenen mikrofluidischen Kanäle erfolgen, sodass das Verfahren zum Splitten dreidimensionaler Agglomerate schneller, effizienter und mit einer größeren Menge an zu splittenden Agglomerat-Fragmenten durchgeführt werden kann. Zudem vorteilhaft ist, dass die sich abspaltenden mikrofluidischen Kanäle einen kleineren Durchmesser aufweisen als die parentalen Kanäle, sodass ein Agglomerat-Fragment die mikrofluidische Vorrichtung umso weiter in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses passieren kann, desto kleiner es ist und in jedem mikrofluidischen Kanal jeweils auf dessen Größe angepasste optimale Split-Bedingungen vorfindet, wie beispielsweise die Größe der Rückhaltestruktur und die Abmessungen des jeweiligen mikrofluidischen Kanals.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird der zumindest eine mikrofluidische Kanal mit der zumindest einen Rückhaltestruktur temperiert. Hierzu ist beispielsweise ein Heizelement in die mikrofluidische Vorrichtung integriert. Die Beheizung oder Kühlung erfolgt beispielsweise vor und/oder während Schritt c) des mikrofluidischen Verfahrens, sodass der zumindest eine mikrofluidische Kanal mit der zumindest einen Rückhaltestruktur, während des Split-Vorgangs die gewünschte Temperatur aufweist.
Wird ein enzymatisches Splitten innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung durch ein mechanisches Splitten an der zumindest einen Rückhaltestruktur des zumindest einen mikrofluidischen Kanals unterstützt, so wird das enzymatische Splitten durch Einstellen einer optimalen Wirk-Temperatur des Enzyms noch weiter verbessert.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird Ultraschall und/oder eine Vibration in zumindest einen mikrofluidischen Kanal mit der zumindest einen Rückhaltestruktur eingeleitet.
Vorteilhaft bei der Einleitung von Ultraschall und/oder einer Vibration ist, dass diese auf die dreidimensionalen Agglomerate in dem zumindest einen mikrofluidischen Kanal einwirken und den Split-Vorgang unterstützten und verbessern.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform erfolgt nach Schritt c) folgender Schritt:

d) Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente über zumindest einen mikrofluidischen Kanal bis zu einem Rückhalteelement, dessen Poren einen Durchmesser kleiner des Durchmessers der gesplitteten Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente aufweist, sodass diese zurückgehalten werden.

Die Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente können das Rückhalteelement nicht passieren und sammeln sich auf oder vor dem Rückhalteelement an. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente festgehalten werden und die mikrofluidische Vorrichtung nicht ungewollt verlassen können und somit nicht verloren gehen. Fluide hingegen können das zweite Rückhalteelement passieren, sodass ein Flüssigkeitsaustausch erfolgen kann.
Hierbei ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn das Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente über eine zweiten Spülflüssigkeit erfolgt, welche dem ersten mikrofluidischen Kanal zugeführt und über diesen gefördert wird. Vorteilhaft hierbei ist, dass beispielsweise die enzymhaltige Lösung von den dreidimensionalen Agglomeraten entfernt wird und der Split-Vorgang auf diese Weise gestoppt wird.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass die gesplitteten Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente auf dem Rückhalteelement einer optischen und/oder mikroskopischen Analyse unterzogen werden.
Vorteilhaft hierbei ist, dass so das Ergebnis des Verfahrens zum Splitten der dreidimensionalen Agglomerate direkt auf dem Rückhalteelement analysiert werden kann. Es kann beispielsweise die Größe der Agglomerat-Fragmente analysiert werden, die Menge der Einzelstrukturen abgeschätzt werden und/oder die Viabilität der Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente analysiert werden. Hierzu werden die Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente beispielsweise auf dem Rückhalteelement angefärbt durch Zuführen einer Färbelösung. Alternativ werden die dreidimensionalen Agglomerate angefärbt, bevor sie der mikrofluidischen Vorrichtung zugeführt werden.
Weiterhin ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn nach Schritt d) folgender Schritt erfolgt:

e) Rückfördern der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente über den zumindest einen mikrofluidischen Kanal und Ausführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente über den ersten fluidischen Anschluss, welcher hier als Auslass dient. Vorteilhaft hierbei ist, dass die mikrofluidische Vorrichtung hier einen einfachen Aufbau aufweist und keine zusätzlichen Bauteile wie beispielsweise Reservoire oder weitere Kanäle benötigt werden.

In einer alternativen vorteilhaften Ausführungsform erfolgt nach Schritt d) folgender Schritt: e') Zuführen eines zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Anschluss, welcher hier als Einlass dient, und Führen des zweiten Mediums über einen Abschnitt des ersten mikrofluidischen Kanals zu einer Unterseite des Rückhalteelements und durch dieses hindurch, sodass die rückgehaltenen Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente auf einer Oberseite des Rückhalteelements mit dem zweiten Medium in einen zusätzlichen mikrofluidischen Kanal überführt werden, welcher in einen dritten fluidischen Anschluss mündet, und Ausführen der Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente über den dritten fluidischen Anschluss, welcher hier aus Auslass dient.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Einzelstrukturen und Agglomerat-Fragmente den zumindest einen mikrofluidischen Kanal nicht rückwärts passieren müssen, sondern über einen näher gelegenen dritten fluidischen Anschluss ausgeführt werden. Dadurch kann das mikrofluidische Verfahren zum mechanischen Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten wiederholt werden mit neuen dreidimensionalen Agglomeraten, welche über den ersten fluidischen Anschluss zugeführt werden, während über den dritten fluidischen Anschluss in regelmäßigen Abständen die Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente abgeführt werden. Damit wird eine Überlastung oder Verstopfung des Rückhalteelements durch eine zu große Anzahl sich ansammelnder Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente verhindert.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform sind die dreidimensionalen Agglomerate Zellagglomerate, insbesondere Organoide oder Sphäroide und die gesplitteten Einzelstrukturen sind Zellen, insbesondere Organoid-Zellen oder Sphäroid-Zellen
und die Agglomerat-Fragmente sind Zellagglomerat-Fragmente, insbesondere Organoid-Fragmente oder Sphäroid-Fragmente.
Vorteilhaft bei der Verwendung von Zellagglomeraten wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden ist, dass deren Viabilität gut erhalten bleibt und somit weitere Kultivierungs- und Expansionsschritte möglich sind.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Steuereinheit zur Steuerung des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Verfahrens, insbesondere durch eine elektrische Aktuation des zumindest einen Ventils und/oder der zumindest einen Pumpe.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung.
Figurenliste
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:

1: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer ersten Ausführungsform mit einem ersten mikrofluidischen Kanal mit Rückhaltestruktur,
2a: die schematische Darstellung einer Förderung dreidimensionaler Agglomerate in einem Schritts b) eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß 1,
2b: die schematische Darstellung einer Ansammlung von Organoiden vor der Rückhaltestruktur in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß 1,
2c: die schematische Darstellung eines Splittens dreidimensionaler Agglomerate in einem Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß 1,
2d: die schematische Darstellung eines Ausführens gesplitteter Einzelstrukturen und/oder Agglomerat-Fragmente in einem Schritt e'') des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß 1,
3a: die schematische Darstellung einer Aufsicht auf eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer ersten Variante einer zweiten Ausführungsform mit sich aufspaltenden mikrofluidischen Kanälen mit Rückhaltestrukturen,
3b: die schematische Darstellung einer seitlichen Ansicht auf die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung in einer zweiten Variante einer zweiten Ausführungsform mit sich aufspaltenden mikrofluidischen Kanälen mit Rückhaltestrukturen,
4: die schematische Darstellung einer dreidimensionalen technischen Zeichnung eines Teilbereichs einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer dritten Ausführungsform mit einem zusätzlichen mikrofluidischen Kanal,
5: die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Kartusche umfassend die mikrofluidische Vorrichtung gemäß 1, und
6: die schematische Darstellung eines Flussdiagramms eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Ausführungsformen der Erfindung
In 1 ist eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 10 zum mechanischen Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten dargestellt. Die Mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst einen ersten fluidischen Anschluss 1a und einen zweiten fluidischen Anschluss 1b. Zwischen dem ersten fluidischen Anschluss 1a und dem zweiten fluidischen Anschluss 1b ist ein erster mikrofluidischer Kanal 2 angeordnet.
Der erste mikrofluidische Kanal 2 weist eine erste Rückhaltestruktur 3 auf, an welcher dreidimensionale Agglomerate durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind.
Die erste Rückhaltestruktur 3 ist in dem ersten mikrofluidischen Kanal 2 so platziert, insbesondere mittig, dass der erste mikrofluidische Kanal 2 für ungesplittete dreidimensionale Agglomerate in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b nicht weiter passierbar ist.
Die erste Rückhaltestruktur 3 ist beispielsweise pfeiler- oder pfostenförmig ausgeführt. Der Querschnitt der ersten Rückhaltestruktur 3 ist beispielsweise rund oder vier- oder mehreckig. In einer nicht in 1 dargestellten Ausführungsform umfasst der erste mikrofluidische Kanal 2 beispielsweise mehrere erste Rückhaltestrukturen 3. Diese sind beispielsweise nebeneinander und/oder hintereinander, insbesondere schräg versetzt hintereinander, in dem ersten mikrofluidischen Kanal 2 angeordnet.
Der erste mikrofluidische Kanal 2 verschlankt sich kontinuierlich in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b. In einer nicht in 1 dargestellten Ausführungsform erfolgt die Verschlankung stufenweise, beispielsweise durch mehrere aufeinanderfolgende Verengungen.
Optional umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 ein Rückhalteelement 5, welches als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist. Die Poren weisen beispielsweise einen Durchmesser von 2-10 µm, und bevorzugt von 3-6 µm auf. Der Durchmesser der Poren des Rückhalteelements 5 ist somit kleiner als der Durchmesser der Agglomerat-Fragmente und Einzelstrukturen 9, sodass diese das Rückhalteelement 5 nicht passieren können und sich auf einer Oberseite 5a oder auf einer Unterseite 5b des Rückhalteelements 5, welche in 1 nicht sichtbar ist, ansammeln.
Zwischen der Oberseite 5a des Rückhalteelements 5 und dem zweiten fluidischen Anschluss 1b ist ein Abschnitt 22 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 angeordnet.
Der erste mikrofluidische Kanal 2 weist beispielsweise eine nicht in 1 dargestellte richtungsweisende Struktur auf, wie in 3a dargestellt und zu dieser beschrieben.
In einer weiteren nicht in 1 dargestellten Ausführungsform, weist die mikrofluidische Vorrichtung 10 eine Heizeinrichtung auf zur Temperierung des ersten mikrofluidischen Kanals 2. alternativ oder zusätzlich weist die mikrofluidische Vorrichtung 10 eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung von Ultraschall oder/oder eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung einer Vibration in den ersten mikrofluidischen Kanal 2 auf.
Zudem umfasst sie mikrofluidische Vorrichtung 10 in einer Ausführungsform zumindest ein nicht in 1 dargestelltes Ventil und/oder zumindest eine nicht in 1 dargestellte Pumpe, welche elektrisch ansteuerbar sind, sodass die mikrofluidische Vorrichtung 10 elektrisch betreibbar ist. Desweiteren umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise zumindest ein nicht in 1 dargestelltes Reservoir für ein Fluid.
In 2a-d ist ein erfindungsgemäßes Verfahren 500 mit einer mikrofluidischen Vorrichtung 10 gemäß 1 dargestellt, wobei in den 2a-d jeweils der Ausschnitt mit dem ersten mikrofluidischen Kanal 2 und einer Rückhaltestruktur 3 gezeigt ist.
Im Folgenden wird beispielhaft für das mechanische Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten 7 in Einzelstrukturen 9 und/oder Agglomerat-Fragmente 8 das mechanische Splitten von Organoiden 7 in Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 beschrieben.
In einem ersten Schritt a), welcher nicht in den 2a-d dargestellt ist, wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 ein erstes Medium, beispielsweise eine Lösung mit Organoiden 7 über den ersten fluidischen Anschluss 1a zugeführt, welches beispielsweise in einem Reservoir vorgelagert ist.
In einem zweiten Schritt b), welcher in 2a dargestellt ist, wird das erste Medium mit den Organoiden 7 in Strömungsrichtung 12 über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Hierbei passieren die Organoide 7 den ersten mikrofluidischen Kanal 2 bis zu der ersten Rückhaltestruktur 3, welche die Organoide 7 im ungesplitteten Zustand aufgrund ihrer Größe am weiteren Durchtritt hindert.
Wie in 2b dargestellt, sammeln sich die Organoide 7 hinter der ersten Rückhaltestruktur 3 an. Das erste Medium hingegen passiert die erste Rückhaltestruktur 3 und wird schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss 1b abgeführt.
In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 werden die Organoide 7 rein mechanisch ohne enzymatisches Einwirken gesplittet.
Hier erfolgt nach Schritt b) folgender Schritt c), welcher in 2c dargestellt ist. Die Organoide 7 werden mechanisch durch pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums durch Reibung an der ersten Rückhaltestruktur 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 gesplittet. Die Strömungsrichtung 12 wird hierbei stoßweise gewechselt. Durch die Reibung der Organoide 7 an der ersten Rückhaltestruktur 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 und durch eine Reibung der Organoide 7 aneinander, an dem diese beinhaltenden ersten Medium, sowie an den Kanalinnenwänden werden Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 von den Organoiden 7 abgespaltet bis die Organoide 7 insbesondere vollständig in Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 aus einigen wenigen Organoid-Zellen 9, beispielsweise aus 2-15 Organoid-Zellen 9, aufgesplittet sind.
Zum Ausführen der gesplitteten Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 gibt es verschiedene Möglichkeiten.
In einem Schritt e''), welcher in 2d dargestellt ist, wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den ersten fluidischen Anschluss 1a beispielsweise das erste Medium zugeführt. Dieses wird über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 in Strömungsrichtung 12 gefördert bis zu dem zweiten fluidischen Anschluss 1b, welcher hier als Auslass dient. Die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 werden mit dem ersten Medium mitgeführt und über den zweiten fluidischen Anschluss 1b ausgeführt. Hierbei kann vor dem zweiten fluidischen Anschluss 1b ein Rückhalteelement 5 angeordnet sein, welches Poren mit einem Durchmesser größer der Durchmesser der Organoid-Zellen 9 und kleinerer Organoid-Fragmente 8 gewünschter Größe ist, sodass diese das Rückhalteelement 5 passieren können. Alternativ kann das Rückhalteelement 5 auch einen Porendurchmesser kleiner des Durchmessers der Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 aufweisen, sodass diese das Rückhalteelement 5 nicht passieren können und sich in einem Schritt d) auf dessen Oberseite 5a oder Unterseite 5b ansammeln. Über den zweiten fluidischen Anschluss 1b wird in einem Schritt e) beispielsweise das erste Medium zugeführt und durch das Rückhalteelement 5 bis zum ersten fluidischen Anschluss 1a gefördert, wobei die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 mitgeführt werden.
In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 erfolgt das mechanische Splitten zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens der Organoide 7 zu Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmenten 8. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst ein Rückhalteelement 5 mit Poren kleiner des Durchmessers der Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8, sodass diese das Rückhalteelement 5 nicht passieren können. Wenn sich die Organoide 7 wie in 2b dargestellt hinter der ersten Rückhaltestruktur 3 angesammelt haben erfolgt nach Schritt b) der Schritt b'). In Schritt b') wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 eine erste Spülflüssigkeit, beispielsweise durch Umstellen eines Ventils auf ein nicht in 2a-d dargestelltes anderes Reservoir mit der ersten Spülflüssigkeit, zugeführt. Die erste Spülflüssigkeit wird über den ersten fluidischen Anschluss 1a zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Durch die erste Spülflüssigkeit werden die Organoide 7 gewaschen, wobei eventuelle Rückstände des ersten Mediums entfernt werden.
Die erste Spülflüssigkeit ist beispielsweise eine Phosphat-gepufferte Salzlösung (kurz: PBS, engl.: phosphate buffered saline). Die erste Spülflüssigkeit wird schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss 1b wieder abgeführt.
In einem Schritt b''), welcher nach Schritt b) oder nach Schritt b') erfolgt, wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 eine enzymhaltige Lösung, beispielsweise durch Umstellen eines Ventils auf ein nicht in 2a-d dargestelltes anderes Reservoir mit der enzymhaltigen Lösung, zugeführt. Die enzymhaltige Lösung wird über den ersten fluidischen Anschluss 1a zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Die enzymhaltige Lösung umfasst beispielsweise das Enzym Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher), welches zu einem enzymatischen Splitten der Organoide 7 führt.
In einem nächsten Schritt c) wird das enzymatische Splitten der Organoide 7 mechanisch durch pulsatiles Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den Organoiden 7 an der ersten Rückhaltestruktur 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 unterstützt. Durch das Einwirken des Enzyms sowie eine Reibung der Organoide 7 an der ersten Rückhaltestruktur 3, eine Reibung der Organoide 7 aneinander und an der diese beinhaltenden enzymhaltigen Lösung sowie eine Reibung an den Kanalinnenwänden des ersten mikrofluidischen Kanals 2, werden Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 von den Organoiden 7 abgespaltet bis die Organoide 7 insbesondere vollständig in Organoid-Zellen 9 und/oder Organoid-Fragmente 8 aus einigen wenigen Organoid-Zellen 9, beispielsweise aus 2-15 Organoid-Zellen 9, aufgesplittet sind.
Vor und/oder während des Split-Vorgangs wird der erste mikrofluidische Kanal 2 mit der ersten Rückhaltestruktur 3 beispielsweise beheizt, insbesondere um eine ideale Temperatur für die Enzymwirkung einzustellen.
Dann wird beispielsweise ein Ventil auf ein nicht in den Figuren dargestelltes anderes Reservoir mit einer zweiten Spülflüssigkeit umgestellt.
In einem nächsten Schritt d) wird die zweite Spülflüssigkeit der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den ersten fluidischen Anschluss 1a zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert. Durch die zweite Spülflüssigkeit wird die enzymhaltige Lösung entfernt und so der Split-Vorgang gestoppt. Mit der zweiten Spülflüssigkeit werden die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 über den ersten mikrofluidischen Kanals 2 transportiert, bis sie schließlich auf einer Unterseite 5b des Rückhalteelements 5 zurückgehalten werden. Lediglich die zweite Spülflüssigkeit passiert das Rückhalteelement 5 sowie den Abschnitt 22 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 und wird schließlich über den zweiten fluidischen Anschluss 1b abgeführt.
Zum Ausführen der Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 wird der mikrofluidischen Vorrichtung 10 über den zweiten fluidischen Anschluss 1b in einem Schritt e) ein zweites Medium zugeführt und über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 gefördert bis zu dem ersten fluidischen Anschluss 1a, welcher hier als Auslass dient. Hierbei passiert das zweite Medium den Abschnitt 22 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 sowie das Rückhalteelement 5. Die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8, welche sich auf der Unterseite 5b des Rückhalteelements 5 angesammelt haben, werden in Schritt e) mit dem zweiten Medium über den ersten mikrofluidischen Kanal 2 mitgeführt, sodass die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 ebenfalls über den ersten fluidischen Anschluss 1a ausgeführt werden.
In 3a ist eine Aufsicht auf eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 in einer ersten Variante der zweiten Ausführungsform dargestellt.
Im Unterschied zu der in 1 dargestellten mikrofluidischen Vorrichtung 10 spaltet sich der erste mikrofluidische Kanal 2 in zwei zweite mikrofluidische Kanäle 2a, 2a' auf. Die zwei zweiten mikrofluidischen Kanäle 2a, 2a' weisen jeweils einen kleineren Durchmesser oder eine geringere Breite und/oder Höhe auf, als der erste mikrofluidische Kanal 2. Jeder zweite mikrofluidische Kanal 2a, 2a' umfasst eine zweite Rückhaltestruktur 3'. Die zweiten Rückhaltestrukturen 3' sind in den zweiten mikrofluidischen Kanälen 2a, 2a' mittig platziert. Für Agglomerat-Fragmente 8, welche größer sind als der Durchgang zwischen der Kanalinnenwand des zweiten mikrofluidischen Kanals 2a, 2a' und der zweiten Rückhaltestruktur 3' sind die zweiten mikrofluidischen Kanäle 2a, 2a' in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b nicht weiter passierbar.
Der zweite mikrofluidische Kanal 2a wiederum spaltet sich in zwei dritte mikrofluidische Kanäle 2b, 2b' auf und der zweite mikrofluidische Kanal 2a' spaltet sich in zwei weitere dritte mikrofluidische Kanäle 2b'', 2b''' auf.
Die dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' weisen jeweils einen kleineren Durchmesser oder eine geringere Breite und/oder Höhe auf als die zweiten mikrofluidischen Kanäle 2a, 2a'.
Jeder dritte mikrofluidische Kanal 2b, 2b', 2b'', 2b''' umfasst eine dritte Rückhaltestruktur 3''. Die dritten Rückhaltestrukturen 3" sind in den dritten mikrofluidischen Kanälen 2b, 2b', 2b'', 2b''' mittig platziert, sodass die dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' für Agglomerat-Fragmente 8, welche größer sind als der Durchgang zwischen der Kanalinnenwand des dritten mikrofluidischen Kanals 2b, 2b', 2b'', 2b''' und der dritten Rückhaltestruktur 3" in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b nicht weiter passierbar sind.
Die dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' münden jeweils auf einer Oberseite 5a des Rückhalteelements 5.
Nach dem beschriebenen Muster spaltet sich beispielsweise beliebig oft ein mikrofluidischer Kanal 2, 2a, 2a' in, insbesondere zwei, neue mikrofluidische Kanäle 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' auf. In 3a ist der Durchmesser oder die Breite und/oder Höhe der mikrofluidischen Kanäle 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' jeweils konstant. In einer zweiten Variante der zweiten Ausführungsform, wie beispielsweise in 3b gezeigt, verschlankt sich der Durchmesser und/oder die Breite und/oder die Höhe der mikrofluidischen Kanäle 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' kontinuierlich in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b.
Der Durchmesser der Rückhaltestrukturen 3, 3', 3'' verringert sich mit jeder Aufspaltung des diese beinhaltenden mikrofluidischen Kanals 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b'''. In einer alternativen nicht in den Figuren dargestellten Ausführungsform ist der Durchmesser oder die Breite und/oder Höhe der Rückhaltestrukturen 3, 3', 3" in allen mikrofluidischen Kanälen 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' gleich. In einer weiteren alternativen nicht in den Figuren dargestellten Ausführungsform verschlankt sich der Durchmesser und/oder die Breite und/oder die Höhe der mikrofluidischen Kanäle 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' stufenweise in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b, beispielsweise durch mehrere aufeinanderfolgende Verengungen.
Der erste mikrofluidische Kanal 2 umfasst eine richtungsweisende Struktur 11 zur Fokussierung der dreidimensionalen Aagglomerate 7 oder Einzelstrukturen 9 und/oder Agglomerat-Fragmente 8, in die Kanalmitte in Richtung der zumindest einen Rückhaltestruktur (3, 3', 3''). Alternativ weist beispielsweise jeder mikrofluidische Kanal 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' eine richtungsweisende Struktur 11 auf.
In 3b ist eine seitliche Ansicht auf die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 in einer zweiten Variante der zweiten Ausführungsform dargestellt. Diese entspricht der in 3a dargestellten ersten Variante der zweiten Ausführungsform mit dem Unterschied, dass sich die mikrofluidischen Kanäle 2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''' kontinuierlich in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b verschlanken.
In der seitlichen Ansicht sind der erste mikrofluidische Kanal 2, der zweite mikrofluidische Kanal 2a, und der dritte mikrofluidische Kanal 2b sichtbar, welche sich jeweils voneinander abspalten wie in 3A gezeigt.
Die mikrofluidische Vorrichtung 10 in der zweiten Ausführungsform ist ausgebildet, ein Verfahren 500 durchzuführen zum mechanischen Splitten von dreidimensionalen Agglomeraten 7 zu Einzelstrukturen 9 und Agglomerat-Fragmenten 8 und wird im Folgenden beispielhaft für ein mechanisches Splitten von Organoiden 7 zu Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmenten 8 beschrieben.
Das Verfahren 500 läuft analog ab zu dem zu den 2a-d beschriebenen Verfahren 500 mit Rückhalteelement 5, dessen Poren einen kleineren Durchmesser aufweisen als der Durchmesser der Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8. Im Unterschied zu diesem spalten sich die mikrofluidischen Kanäle auf. Die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8, welche in Schritt c) an der ersten Rückhaltestruktur 3 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 aufgesplittet wurden passieren den ersten mikrofluidischen Kanal 2 und teilen sich nun auf die zwei zweiten mikrofluidische Kanäle 2a, 2a' auf. In den zweiten mikrofluidischen Kanälen 2a, 2a' werden die Organoid-Fragmente 8, welche größer sind, als ein Durchgang zwischen den Kanalinnenwänden und der zweiten Rückhaltestruktur 3' von der zweiten Rückhaltestruktur 3' zurückgehalten und sammeln sich vor dieser an. In einem erneuten Schritt c) erfolgt das Splitten der zurückgehaltenen Organoid-Fragmente 8 zu Organoid-Zellen 9 und kleinen Organoid-Fragmenten 8. Die Einzelstrukturen 9 und kleinen Organoid-Fragmente 8 passen nun durch den Durchgang zwischen den Kanalinnenwänden der zweiten mikrofluidischen Kanäle 2a, 2a' und der zweiten Rückhaltestruktur 3' und passieren die zweiten mikrofluidischen Kanäle 2a, 2a' weiter in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b. Die zweiten mikrofluidischen Kanäle 2a, 2a' zweigen sich weiter ab in dritte mikrofluidische Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' mit dritten Rückhaltestrukturen 3". Die Organoid-Zellen 9 und kleinen Agglomerat-Fragmente 8 teilen sich auf die vier dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' auf. In den dritten mikrofluidischen Kanälen 2b, 2b', 2b'', 2b''' werden die kleinen Agglomerat-Fragmente 8, welche größer sind als ein Durchgang zwischen den Kanalinnenwänden der dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' und der dritten Rückhaltestruktur 3" von der dritten Rückhaltestruktur 3" zurückgehalten und sammeln sich vor dieser an. In einem erneuten Schritt c) erfolgt das Splitten der zurückgehaltenen kleinen Organoid-Fragmente 8 zu Organoid-Zellen 9 und sehr kleinen Organoid-Fragmenten 8. Die Organoid-Zellen 9 und sehr kleinen Organoid-Fragmente 8 passen nun durch den Durchgang zwischen den Kanalinnenwänden der dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' und der dritten Rückhaltestruktur 3'' und können die dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' weiter in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses 1b passieren. Die dritten mikrofluidischen Kanäle 2b, 2b', 2b'', 2b''' münden auf der Oberseite 5a des Rückhalteelements 5, auf welcher sich die Organoid-Zellen 9 und sehr kleinen Organoid-Fragmente 8 ansammeln. Hier werden die Organoid-Zellen 9 und sehr kleinen Organoid-Fragmente 8 beispielswiese einer optischen Analyse unterzogen.
Das Ausführen der Organoid-Zellen 9 und sehr kleinen Organoid-Fragmente 8 erfolgt beispielsweise wie in der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zu 2 beschrieben.
In 4 ist ein Teilbereich 15 einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 10 in einer dritten Ausführungsform dargestellt. Dieser Teilereich 15 ist beispielsweise in die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 in der ersten Ausführungsform, welche in 1 dargestellt ist, oder in die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 in der zweiten Ausführungsform, welche in den 3a und 3b dargestellt ist, integriert.
Mittels einer Vorrichtung 10 mit integriertem Teilbereich 15 ist ein alternatives Ausführen der auf der Oberseite 5a des Rückhalteelements 5 zurückgehaltenen Einzelstrukturen 9 und Agglomerat-Fragmenten 8 über einen zusätzlichen mikrofluidischen Kanal 2' möglich, welcher ausgehend von einer Oberseite 5a des Rückhalteelements 5 in einem dritten fluidischen Anschluss 1c mündet.
Zum Ausführen der Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8 ist der an das Rückhalteelement 5 in Richtung des ersten fluidischen Anschlusses 1a angrenzende erste mikrofluidische Kanals 2 geschlossen, beispielsweise durch ein nicht dargestelltes Ventil, und der zusätzliche mikrofluidische Kanal 2' ist geöffnet, beispielsweise durch Öffnen eines nicht dargestellten Ventils.
In einem Schritt e') wird über den zweiten fluidischen Anschluss 1b, welcher hier als Einlass dient, ein zweites Medium zugeführt. Das zweite Medium wird über den Bereich 22 des ersten mikrofluidischen Kanals 2 gefördert, passiert das Rückhalteelement 5, wobei es von einer Unterseite 5b des Rückhalteelements 5 durch dieses hindurch auf eine Oberseite 5a strömt. Die Organoid-Zellen 9 und Organoid-Fragmente 8, welche sich auf der Oberseite 5a des Rückhalteelements 5 angesammelt haben, werden mit dem zweiten Medium mitgeführt, in den zusätzlichen mikrofluidischen Kanal 2' geleitet und über den dritten fluidischen Anschluss 1c, welcher hier als Auslass dient, ausgeführt.
In allen beschriebenen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 können die ausgeführten Organoid-Zellen 9 und Agglomerat-Fragmente 8 analysiert, weitergeleitet, aufgeteilt und/oder neu ausgesät werden für ein erneutes Anzüchten von Organoiden 7.
Analog zu den beschriebenen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zum Splitten von Organoiden 7 erfolgt beispielsweise ein Verfahren 500 zum Splitten von Sphäroiden in Sphäroid-Zellen und/oder Sphäroid-Fragmente, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens.
In 5 ist eine erfindungsgemäße Kartusche 100 dargestellt, welche beispielhaft für alle erfindungsgemäßen Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung 10, eine mikrofluidische Vorrichtung 10 in der ersten Ausführungsform gemäß 1 umfasst.
6 zeigt ein Flussdiagramm mit Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten 7 zu Einzelstrukturen 9 und/oder Agglomerat-Fragmenten 8, beispielsweise in Verbindung mit den zu den 1 - 4 beschriebenen Ausführungsbeispielen und Verfahrensschritten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2016/183143 A1 [0004]
WO 2014/179196 A1 [0005]
DE 102016222072 A1 [0047]
DE 102016222075 A1 [0047]

Claims

Mikrofluidische Vorrichtung (10) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten (7) zu Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmenten (8) mit einem ersten fluidischen Anschluss (1a) und einem zweiten fluidischen Anschluss (1b) und zumindest einem zwischen dem ersten (1a) und dem zweiten fluidischen Anschluss (1b) angeordneten ersten mikrofluidischen Kanal (2), wobei der erste mikrofluidische Kanal (2) zumindest eine erste Rückhaltestruktur (3) aufweist, an welcher dreidimensionale Agglomerate (7) durch Reibung mechanisch aufsplittbar sind, und wobei die zumindest eine erste Rückhaltestruktur (3) in dem zumindest einen ersten mikrofluidischen Kanal (2) so platziert ist, dass dieser für ungesplittete dreidimensionale Agglomerate (7) in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses (1b) nicht weiter passierbar ist.
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich der zumindest eine erste mikrofluidische Kanal (2) in, insbesondere zwei, zweite mikrofluidische Kanäle (2a, 2a') mit je einem kleineren Durchmesser oder einer geringeren Breite und/oder Höhe als der erste mikrofluidische Kanal (2) aufspaltet, und wobei jeder zweite mikrofluidische Kanal (2a, 2a') zumindest eine zweite Rückhaltestruktur (3') umfasst, welche in dem zweiten mikrofluidische Kanal (2a, 2a') so platziert ist, dass dieser für Agglomerat-Fragmente (8), welche größer sind als der Durchgang zwischen der Kanalinnenwand des zweiten mikrofluidischen Kanals (2a, 2a') und der zweiten Rückhaltestruktur (3') und/oder welche größer sind als der Durchgang zwischen zweiten Rückhaltestrukturen (3'), in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses (1b) nicht weiter passierbar ist, und wobei sich nach diesem Muster beliebig oft ein mikrofluidischer Kanal (2, 2a, 2a') in, insbesondere zwei, neue mikrofluidische Kanäle (2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') mit Rückhaltestruktur (3, 3', 3'') aufspaltet.
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich zumindest ein mikrofluidischer Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') insbesondere kontinuierlich, in Richtung des zweiten fluidischen Anschlusses (1b) verschlankt.
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser und/oder die Breite und/oder die Höhe der zumindest einen Rückhaltestruktur (3, 3', 3'') sich mit jeder Aufspaltung des diese beinhaltenden mikrofluidischen Kanals (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') verringert.
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein mikrofluidischer Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') eine richtungsweisende Struktur (11) umfasst zur Fokussierung der dreidimensionalen Agglomerate (7) oder Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8), insbesondere in die Kanalmitte und/oder in Richtung der zumindest einen Rückhaltestruktur (3, 3', 3").
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) eine Heizeinrichtung aufweist zur Temperierung zumindest eines mikrofluidischen Kanals (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') und/oder eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung von Ultraschall oder/oder eine Einrichtung zur Erzeugung und Einleitung einer Vibration in zumindest einen mikrofluidischen Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''').
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) ein Rückhalteelement (5) umfasst, welches als Mikrofilter und/oder als Mikrosieb und/oder als mikrostrukturiertes Gitter mit Poren ausgestaltet ist, und wobei die Poren insbesondere einen Durchmesser von 2-10 µm aufweisen.
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) einen zusätzlichen mikrofluidischen Kanal (2') aufweist, welcher ausgehend von einer Oberseite (5a) des Rückhalteelements (5) in einem dritten mikrofluidischen Anschluss (1c) mündet.
Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Vorrichtung (10) zumindest ein Ventil und/oder zumindest eine Pumpe umfasst, welche elektrisch ansteuerbar sind, sodass die mikrofluidische Vorrichtung (10) elektrisch betreibbar ist und/oder dass die Vorrichtung (10) zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst.
Mikrofluidisches Verfahren (500) zum mechanischen Splitten, insbesondere zur Unterstützung eines enzymatischen Splittens, von dreidimensionalen Agglomeraten (7) zu Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmenten (8) mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit folgenden Schritten: a) Zuführen eines ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7) über den ersten fluidischen Anschluss (1a) b) Fördern des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7) über den ersten mikrofluidischen Kanal (2), wobei die dreidimensionalen Agglomerate (7) durch die zumindest eine erste Rückhaltestruktur (3) am weiteren Durchtritt gehindert werden. c) pulsatiles Hin- und Herbewegen des ersten Mediums mit dreidimensionalen Agglomeraten (7) sodass die dreidimensionalen Agglomerate (7) mechanisch durch Reibung an der zumindest einen ersten Rückhaltestruktur (3) gesplittet werden.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) folgender Schritt erfolgt: b') Zuführen und Fördern einer ersten Spülflüssigkeit über den ersten mikrofluidischen Kanal (2) zum Waschen der dreidimensionalen Agglomerate (7).
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt b) oder nach Schritt b') folgender Schritt erfolgt: b'') Zuführen und Fördern einer enzymhaltigen Lösung über den ersten mikrofluidischen Kanal (2), und wobei in Schritt c) ein pulsatiles Hin- und Herbewegen der enzymhaltigen Lösung mit den dreidimensionalen Agglomeraten (7) erfolgt, sodass das enzymatische Splitten der dreidimensionalen Agglomerate (7) mechanisch durch Reibung an der zumindest einen ersten Rückhaltestruktur (3) unterstützt wird.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte b) und c), und optional die Schritte b') und/oder b'') ebenfalls in, sich vom ersten mikrofluidischen Kanal (2) direkt oder indirekt abspaltenden, mikrofluidischen Kanälen (2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') mit zumindest einer Rückhaltestruktur (3, 3', 3'') erfolgen.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 10-13, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein mikrofluidischer Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') mit der zumindest einen Rückhaltestruktur (3, 3', 3'') temperiert, insbesondere beheizt oder gekühlt, wird und/oder wobei Ultraschall und/oder eine Vibration in zumindest einen mikrofluidischen Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') mit der zumindest einen Rückhaltestruktur (3, 3', 3") eingeleitet wird.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 10-14 dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt c) folgender Schritt erfolgt: d) Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) über zumindest einen mikrofluidischen Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') bis zu einem Rückhalteelement (5), dessen Poren einen Durchmesser kleiner des Durchmessers der gesplitteten Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) aufweist, sodass diese zurückgehalten werden, wobei das Fördern der gesplitteten Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) insbesondere über eine zweite Spülflüssigkeit erfolgt.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die gesplitteten Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) auf dem Rückhalteelement (5) einer optischen und/oder mikroskopischen Analyse unterzogen werden.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 10-16 dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt d) folgender Schritt erfolgt: e) Rückfördern der Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) über zumindest einen mikrofluidischen Kanal (2, 2a, 2a', 2b, 2b', 2b'', 2b''') und Ausführen der Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) über den ersten fluidischen Anschluss (1a), welcher hier als Auslass dient.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach Anspruch 15 oder 16 dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt d) folgender Schritt erfolgt: e') Zuführen eines zweiten Mediums über den zweiten mikrofluidischen Anschluss (1b), welcher hier als Einlass dient, und Führen des zweiten Mediums über einen Abschnitt (22) des ersten mikrofluidischen Kanals (2) zu einer Unterseite (5b) des Rückhalteelement (5) und durch dieses hindurch, sodass die rückgehaltenen Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) auf einer Oberseite (5a) des Rückhalteelements (5) mit dem zweiten Medium in einen zusätzlichen mikrofluidischen Kanal (2') überführt werden, welcher in einem dritten fluidischen Anschluss (1c) mündet, und Ausführen der Einzelstrukturen (9) und/oder Agglomerat-Fragmente (8) über den dritten fluidischen Anschluss (1c), welcher hier aus Auslass dient.
Mikrofluidisches Verfahren (500) nach einem der Ansprüche 10-18 dadurch gekennzeichnet, dass die dreidimensionalen Agglomerate (7) Zellagglomerate, insbesondere Organoide (7) oder Sphäroide sind und wobei die gesplitteten Einzelstrukturen (9) Zellen, insbesondere Organoid-Zellen (9) oder Sphäroid-Zellen sind und wobei die Agglomerat-Fragmente (8) Zellagglomerat-Fragmente, insbesondere Organoid-Fragmente (8) oder Sphäroid-Fragmente sind.
Steuereinheit zur Steuerung des mikrofluidischen Verfahrens (500) nach einem der Ansprüche 10-19, insbesondere durch eine elektrische Aktuation des zumindest einen Ventils und/oder der zumindest einen Pumpe.
Kartusche (100), insbesondere mikrofluidische Kartusche, umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1-9.