DE102008018170B4

DE102008018170B4 - Mikrofluidisches System und Verfahren zum Aufbau und zur anschließenden Kultivierung sowie nachfolgender Untersuchung von komplexen Zellanordnungen

Info

Publication number: DE102008018170B4
Application number: DE102008018170A
Authority: DE
Inventors: Martin Dr. Stelzle; Brigitte Dr. Angres; Massimo Kubon; Julia Schütte; Britta Dipl.-Inf. Hagmeyer; Felix Holzner
Original assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Current assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Priority date: 2008-04-03
Filing date: 2008-04-03
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2028-04-04
Also published as: US20120199487A1; WO2009121555A3; US20110079513A1; US8268152B2; EP2265706A2; WO2009121555A2; EP2265706B1; US8968543B2; DE102008018170A1

Abstract

Mikrofluidisches System zum Aufbau und zur anschließenden Kultivierung von komplexen Zellanordnungen, mit
– einer dreidimensionalen Mikrostruktur (11), in der die Zellanordnung aufgebaut und kultiviert wird,
– zumindest zwei in der Mikrostruktur (11) verlaufenden, eine Flussrichtung (18, 19) definierenden Mikrokanalabschnitten (16, 17), über die die Mikrostruktur (11) von außen mit einem Medium (21, 22) perfundierbar ist, wobei die Mikrokanalabschnitte (16, 17) zumindest bereichsweise äquidistant zueinander verlaufen,
– einer die zumindest beiden Mikrokanalabschnitte (16, 17) trennenden Wandstruktur (25), in der zumindest eine die zumindest zwei Mikrokanalabschnitte (16, 17) verbindende Öffnung (26) vorgesehen ist, und
– einer in oder an der Mikrostruktur (11) vorgesehenen Elektrodenanordnung (27), um im Bereich der zumindest einen Öffnung (26) ein inhomogenes elektrisches Feld (28) zu erzeugen, wobei das inhomogene elektrische Feld (28) dazu eingerichtet ist, zugeführte Zellen im Bereich der zumindest einen Öffnung (26) aufzukonzentrieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches System zum Aufbau und zur anschließenden Untersuchung von komplexen Zellanordnungen sowie ein entsprechendes Verfahren.
In vielen Bereichen der wissenschaftlichen Forschung sowie der Diagnostik, sei es im Forschungslabor oder im Alltag eines mit Routineuntersuchungen befassten Labors, besteht Bedarf an komplexen Zellanordnungen, die unter möglichst physiologischen Bedingungen, also beispielsweise in der anatomisch korrekten Anordnung der einzelnen Zelltypen zueinander vorliegen und/oder physiologisch funktionell perfundiert werden können.
Ein Anwendungsbeispiel für derartige komplexe Zellanordnungen ist die Bestimmung der Toxizität und des Metabolismus von Medikamenten in der pharmazeutischen Industrie.
Gegenwärtig wird die Toxizität von Medikamenten anhand von 2D-Zellkulturen in vitro bestimmt, was jedoch nur eine geringe Vorhersagekraft für die Wirkung der Medikamente in vivo bietet. Ein Grund hierfür ist die Tatsache, dass die zur Zeit verfügbaren komplexen Zellanordnungen, die in vitro zu entsprechenden Untersuchungen herangezogen werden können, aufgrund ihrer Struktur und Anordnung nicht die gleichen Eigenschaften aufweisen wie entsprechende Zell- bzw. Gewebestrukturen in vivo.
Daraus resultiert nur eine begrenzte Aussagekraft der mit den bekannten Zellkulturen durchgeführten Versuche in Bezug auf das Verhalten (Toxizität, Metabolismus, Wirkmechanismen) in vivo, so dass beispielsweise Nebenwirkungen von Medikamenten oft erst in klinischen Studien entdeckt werden, wenn das Präparat Patienten verabreicht wird und hohe Ausgaben für Forschung und Entwicklung bereits getätigt wurden.
Ein anderer Ansatz für die Bestimmung der Toxizität von Medikamenten sind Tierversuche, die jedoch neben ihrer nur bedingt auf den Menschen übertragbaren Aussagekraft auch aus ethischen Gründen immer weiter in den Hintergrund treten.
Ein weiterer Ansatz besteht darin, die Wirkung von Medikamenten auf vereinzelte Zellen zu untersuchen, wobei wie bei den oben erwähnten 2D-Zellkulturen auch hier die Vorhersagekraft begrenzt ist, da sich einzelne Zellen oder zweidimensionale Zellanordnungen in wesentlichen Funktionen von denen des dreidimensionalen ”natürlichen” Zellverbundes unterscheiden.
Daher besteht ein Bedarf an komplexen, organotypischen Zellkultursystemen, die aus „natürlichen” Zellen bestehen, die in Umgebungen wachsen, die eine Differenzierung über einen entsprechend langen Zeitraum sowie eine zur in vivo-Situation vergleichbare Funktion ermöglichen.
Von besonderem Interesse ist dabei zum einen eine organotypische Leberzellen-Kokultur, mit der Medikamente auf Toxizität und Metabolisierung getestet werden sollen. Die Leber dient unter anderem dem Abbau und der Ausscheidung von Stoffwechselprodukten, Medikamenten und Giftstoffen, die über das Blutkreislaufsystem in die Leber gelangen. Diese Substanzen werden von den Hepatozyten metabolisiert und über die Gallenflüssigkeit abtransportiert. Die von der Leber produzierte Gallenflüssigkeit gelangt über das Gallengangsystem in den Darm und wird auf diese Wiese ausgeschieden. Für eine organotypische Leberzellkultur für die Medikamententestung ist es wichtig, dass die Hepatocyten nach außen von Endothelzellen besetzt werden, wobei die Perfusion der komplexen Zellkultur von der Seite der Endothelzellen her erfolgt. Die Kokultur der Hepatozyten mit Endothelzellen und gegebenenfalls Sternzellen gewährleistet die gewebetypische Differenzierung der Hepatozyten und damit verbundenen Expression von Genen, die zur Metabolisierung der genannten Stoffe erforderlich sind.
Weiter besteht ein Bedarf an einer organotypischen Gewebestruktur, wie sie beispielsweise im Darm zu finden ist. Auch hier ist es für eine physiologisch funktionelle Perfusion erforderlich, dass zwischen ”innen” und ”außen” unterschieden wird. Im Darm werden durch den Verzehr aufgenommene Stoffe enzymatisch gespalten und über das Darmepithel in den Blutkreislauf transportiert. Das Darmepithel besteht aus einer einschichtigen Epithelschicht, die dem Darmlumen zugewendet ist, und einer darunterliegenden Schicht von Mesenchymzellen, die die Differenzierung und Funktion der Epithelzellen aufrecht erhält. An einem solchen in vitro hergestellten Zellverbund, könnten Untersuchungen zur Aufnahme von Medikamenten bei oraler Verabreichung durchgeführt werden.
Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die sogenannte Blut-Hirn Schranke, die den Übertritt von Substanzen aus dem Blut in das Gehirn kontrolliert und dafür sorgt, dass die chemische Zusammensetzung der Intrazellularflüssigkeiten des Gehirns weitgehend konstant bleibt, was für eine präzise Signalübertragung zwischen den Nervenzellen des Zentralnervensystems notwendig ist. Um Blutgefäße herum wird die Blut-Hirn-Schranke durch Endothelzellen und Astrocyten gebildet. Sie sorgen über aktive Transportsysteme für den Transfer von Nährstoffen und Sauerstoff bzw. Metaboliten. Im Zusammenhang mit der Entwicklung von Wirkstoffen sind Kenntnisse über die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für diese Wirkstoffe und damit ihre Verfügbarkeit in Bereichen des Nervensystems von besonderem Interesse.
Aus der Veröffentlichung ”Rapid Heterogenous Liver-Cell On-Chip Patterning via the Enhanced Field-induced Dielectrophoresis Trap” von Ho et al., Lab Chip, 2006, 6, 724–734, ist ein mikrofluidischer Chip bekannt, auf dem eine planare Struktur von Leberzellen, d. h. eine 2D-Anordnung, etablierbar ist. Durch die geometrische Struktur und Anordnung der Elektroden wird ein inhomogenes elektrisches Feld mit definierten Gradienten erzeugt, das in einer Kammer randomisiert vorliegende Zellen von zwei Zelltypen zu einem gewünschten planaren Gewebemuster zusammenführt.
Die Autoren erwähnen, dass mikrofluidische Musterbildung mit Mikrokanälen und laminarem Fluss für Leberzellen nicht anwendbar ist, da dieses Verfahren in seiner Wirkung zu grob strukturiert ist. Ferner wird positive Dielektrophorese als Möglichkeit beschrieben, um Zellen aktiv zu manipulieren. Die Autoren erwähnen jedoch, dass dieses Verfahren noch nicht erfolgreich eingesetzt wurde, um komplexe Zellanordnungen aufzubauen.
Vor diesem Hintergrund schlagen die Autoren vor, die Mikrofluidik zusammen mit einem räumlich strukturierten elektrischen Feld einzusetzen, um gewünschte Gewe bemuster herzustellen. Der Chip enthält dazu eine Zellstrukturkammer, der über Mikrokanäle kontinuierlich Zellen zugeführt werden, die über das in der Kammer ausgebildete elektrische Feld zu der komplexen Struktur zusammengelagert werden. Danach wird das elektrische Feld ausgeschaltet und reines Medium wird durch bzw. in den Chip gepumpt.
Die mit der bekannten Vorrichtung erzeugbare Zellanordnung ist jedoch planar, so dass sich für den Einsatz in der pharmakologischen Forschung die oben beschriebenen Nachteile ergeben. Eine physiologisch funktionell perfundierbare, komplexe Zellanordnung, die als organotypisches Gewebe beispielsweise für Toxizitätsmessungen eingesetzt werden kann, lässt sich mit der Vorrichtung und dem Verfahren von Ho et al. nicht erzeugen.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren der eingangs genannten Art bereitzustellen, mit der bzw. dem organotypische Gewebe aufgebaut werden können, die dann perfundiert und unter vorzugsweise physiologischen Bedingungen untersucht werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein mikrofluidisches System zum Aufbau und zur anschließenden Kultivierung von komplexen Zellanordnungen, mit

– einer dreidimensionalen Mikrostruktur, in der die Zellanordnung aufgebaut und kultiviert wird,
– zumindest zwei in der Mikrostruktur verlaufende, eine Flussrichtung definierende Mikrokanalabschnitte, über die die Mikrostruktur von außen mit einem Medium perfundierbar ist, wobei die Mikrokanalabschnitte zumindest bereichsweise annähernd parallel oder äquidistant zueinander verlaufen,
– einer die zumindest beiden Mikrokanalabschnitte trennenden Wandstruktur, in der zumindest eine die zumindest zwei Mikrokanalabschnitte verbindende Öffnung vorgesehen ist, und
– einer in oder an der Mikrostruktur vorgesehenen Elektrodenanordnung, um im Bereich der zumindest einen Öffnung ein inhomogenes elektrisches Feld zu erzeugen, wobei das inhomogene elektrische Feld dazu eingerichtet ist, zugeführte Zellen im Bereich der zumindest einen Öffnung aufzukonzentrieren.

Ferner wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Aufbau und Kultivieren von komplexen Zellanordnungen, bei dem

– in dem zuvor beschriebenem mikrofluidischem System zunächst die komplexe Zellanordnung aufgebaut wird, indem • der Mikrostruktur Medium mit Zellen zum Aufbau der Zellanordnung zugeführt wird, und • in der Mikrostruktur ein durch die Mikrostruktur bestimmtes inhomogenes elektrisches Feld erzeugt wird, das den Aufbau einer Zellanordnung aus den zugeführten Zellen bewirkt,
– und anschließend die Zellanordnung in der dreidimensionalen Mikrostruktur kultiviert wird, indem sie mit Medium perfundiert wird.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Untersuchung von komplexen Zellanordnungen, bei dem

– in dem neuen mikrofluidischem System eine Zellanordnung gemäß dem neuen Verfahren aufgebaut und kultiviert wird, und die Untersuchung des Stoffwechsels oder gerichteten Transports von zugeführten Stoffen an einer so etablierten Zellanordnung anhand von abgeführten Stoffwechselprodukten und/oder über mit dem Medium zugeführte Marker erfolgt, die im Zusammenwirken mit der Zellanordnung ein messbares Signal erzeugen.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nämlich erkannt, dass es bei einer entsprechenden Auslegung der Kanalstruktur und Anwendung der Prinzipien der Dielektrophorese möglich ist, komplexe organotypische Zellanordnungen zu assemblieren.
Die Erfindung basiert dabei einerseits auf der Positionierung von Zellen mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte. Da diese Kräfte in Richtung maximaler Feldstärke gerichtet sind, kann durch ein geeignetes inhomogenes Feld die Form und Position des entstehenden Mikrogewebes vordefiniert werden.
Die Erfinder machen sich dabei eine spezielle Kanalstruktur zunutze, durch die der Ort maximaler Feldstärke definiert wird. Dazu sind in der Mikrostruktur zumindest zwei Mikrokanalabschnitte vorgesehen, die durch eine Wandstruktur voneinander getrennt sind, in der zumindest eine Öffnung vorgesehen ist. Die Mikrokanalabschnitte verlaufen im Bereich der Wandstruktur dabei entweder gerade und annähernd parallel zueinander, wobei auch gebogene oder gekrümmte Mikrokanalabschnitte möglich sind, sofern sie bereichsweise äquidistant zueinander verlaufen.
Die Erfinder konnten in ersten Versuchen zeigen, dass es mit der erfindungsgemäßen Mikrostruktur möglich ist, Leber-ähnliche oder membranartige Zellanordnungen aufzubauen, die unter physiologischen Bedingungen kultiviert und untersucht werden können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht dabei darin, die Inhomogenität der elektrischen Felder durch die Mikrostruktur vorzugeben und durch die sich aufbauende Zellanordnung selbst zu beeinflussen. Die Akkumulation der Zellen am Ort der höchsten Feldstärke erhöht in diesem Bereich nämlich die elektrische Impedanz, so dass in der Umgebung dieses Aggregates die Feldstärke abnimmt und dadurch eine geringere Tendenz für weitere Anlagerung von Zellen besteht. Die Assemblierung von Zellen wird also durch diese Rückkopplung geregelt.
Die Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, dass durch zwei abschnittsweise annähernd parallel oder äquidistant verlaufende Mikrokanalabschnitte, die durch eine Wandstruktur mit zumindest einer Öffnung voneinander getrennt sind, ein definiert inhomogenes elektrisches Feld aufgebaut werden kann, dessen höchste Feldstärke im Bereich der Öffnung in der Wandstruktur liegt, und das für die Assemblierung komplexer Zellanordnungen geeignet ist.
Weil das elektrische Feld im Bereich der Öffnungen seine höchste Feldstärke aufweist, werden die durch beide Mikrokanäle zugeführten Zellen im Bereich dieser Öffnungen aufkonzentriert und dort assembliert. Aufgrund dieser Feldstruktur können die Zellen dabei nicht von dem einen Mikrokanal in den anderen gelangen.
Schließlich bietet das neue mikrofluidische System die Möglichkeit, die etablierte komplexe Zellanordnung optisch und/oder biochemisch zu analysieren.
Nach dem Aufbau der komplexen Zellanordnung in der Mikrostruktur kann das inhomogene elektrische Feld abgeschaltet werden, es kann aber auch unverändert oder mit veränderten Feldstärken und/oder Frequenzen weiterhin angelegt bleiben.
Der Stand der Technik beschreibt mikrofluidische Systeme mit Mikrokanalabschnitten, welche durch Wandstrukturen voneinander getrennt sind und durch Öffnungen in diesen Wandstrukturen miteinander verbunden sind.
Die DE 198 15 882 A1 beschreibt ein mikrofluidisches System, bei dem Elektroden auf den jeweils den Lumen zugewandten Seiten des Boden- und Decksubstrats angeordnet sind. Diese erzeugen ein Dielektrophoresefeld, das als Deflektor wirkt und dazu vorgesehen ist, Partikel von einem Kanal in einen anderen Kanal zu bewegen. Die DE 198 53 658 A1 beschreibt ein vergleichbares System, bei dem Partikel mit Hilfe einer ähnlichen Elektrodenanordnung unter Zuhilfenahme von Zentrifugalkräften fraktioniert werden.
Gemäß DE 199 52 322 C2 werden Partikel durch eine im Lumen des einen Kanals angeordnete Elektrodenanordnung mittels eines negativen Dielektrophoresefeldes eingefangen und anschließend mittels eines optischen Käfigs durch eine Öffnung in einen anderen Mikrokanalabschnitt überführt.
Gemäß der US 2002/0164780 A1 werden Zellen in einem Mikrokanalabschnitt innerhalb eines mechanischen Gitters kultiviert. Auch sind in dieser Anordnung Elektroden vorgesehen, welche als Filter dem Eindringen partikulärer Schadstoffe sowie als elektrohydrodynamische und elektroosmotische Pumpen wirken.
Die US 2004/0197931 A1 beschreibt eine Vorrichtung mit einer Reihe parallel verlaufender Mikrokanäle mit Öffnungen, welche dazu vorgesehen sind, einen Sensor von einem Kanal in einen anderen Kanal zu bewegen, um schnell die jeweiligen Charakteristika der verschiedenen die Kanäle durchströmenden Medien zu messen.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn die Mikrokanalabschnitte entweder jeweils Teil eines gesonderten Mikrokanals sind, der durch die Mikrostruktur verläuft, oder vor und hinter der Wandstruktur in einen gemeinsamen Mikrokanal übergehen.
Wenn ein gemeinsamer Mikrokanal vorgesehen ist, werden beide Mikrokanalabschnitte von demselben Medium durchströmt. Hier ist von Vorteil, dass bspw. zum Aufbau einer Leberstruktur Zellen desselben Zelltyps von beiden Mikrokanalabschnitten aus in den Bereich der Öffnung(en) wandern und dort assembliert werden. Nachdem so eine innere Zellanordnung aus Zellen eines ersten Zelltyps aufgebaut wurde, können mit dem Medium Zellen eines zweiten Zelltyps zugeführt werden, die sich von beiden Mikrokanalabschnitten aus an der inneren Zellanordnung anlagern und eine äußere Zellanordnung bilden. Danach können Zellen eines dritten Zelltyps zugeführt werden, die eine zweite äußere Zellanordnung bilden, und so weiter.
Es versteht sich, dass zum Aufbau der inneren und jeder sich außen anschließenden äußeren Zellanordnung auch jeweils Gemische aus verschiedenen Zelltypen zugeführt werden können.
Sind gesonderte Mikrokanäle vorgesehen, so kann auf beiden Seiten der Wandstruktur unterschiedliches Medium zugeführt werden. Hier ist von Vorteil, dass bspw. zum Aufbau einer schichtartigen Zellanordnung zeitgleich auf den voneinander abgelegenen Seiten der Öffnung(en) Zellen unterschiedlicher Zelltypen zugeführt und abgelagert werden können, die auf ihrer jeweiligen Seite dann eigene Zellanordnungen aufbauen, die jeweils aus Zellen eines oder mehrerer Zelltypen bestehen können.
Ferner ist von Vorteil, dass über einen der gesonderten Mikrokanäle bspw. Medium mit Nährstoffen und ggf. Testsubstanzen zugeführt werden kann, während durch den anderen Mikrokanal Stoffwechselprodukte abgeführt und einer Analyse zugeleitet werden können.
Bei dem neuen mikrofluidischen System ist es dabei einerseits bevorzugt, wenn die zumindest eine Öffnung einen sich in Flussrichtung der beiden Mikrokanalabschnitte erstreckenden Spalt aufweist, wobei vorzugsweise in Flussrichtung mehrere Spalte hintereinander angeordnet sind.
Andererseits ist es bevorzugt, wenn mehrere Öffnungen vorgesehen sind, die in Flussrichtung der beiden Mikrokanalabschnitte sowie quer zur Flussrichtung in der Wandstruktur verteilt angeordnet sind.
Wenn die Öffnung in Form eines oder mehrerer sich in Flussrichtung der Mikrokanäle bzw. Mikrokanalabschnitte erstreckender Spalte ausgebildet ist, lässt sich beispielsweise eine dreidimensionale Leberstruktur aufbauen. Wenn jedoch viele porenartige Öffnungen gleichmäßig oder ungleichmäßig über die Wandstruktur verteilt angeordnet sind, so kann sich eine schichtartige Zellanordnung ausbilden.
Weiter ist es bevorzugt, wenn die Elektrodenanordnung zumindest eine in dem ersten Mikrokanalabschnitt und zumindest eine weitere, in dem zweiten Mikrokanalabschnitt vorgesehene Kanal-Elektrode aufweist, wobei die beiden Kanal-Elektroden in der Nähe der zumindest einen Öffnung vorgesehen sind, wobei vorzugsweise in jedem Mikrokanalabschnitt zumindest eine Kanal-Elektrode an einer der Wandstruktur gegenüberliegenden Wand angeordnet ist, weiter vorzugsweise in jedem Mikrokanalabschnitt zumindest eine Kanal-Elektrode an einer an die Wandstruktur angrenzenden Wand angeordnet ist.
In Abhängigkeit von der zu etablierenden Zellanordnung und unter Abstimmung auf die Formgebung der Öffnung(en) kann so das für den jeweiligen Anwendungsfall optimale inhomogene Feld erzeugt werden, durch das Zellen aus den Mikrokanalabschnitten in die Öffnung(en) transportiert und dort assembliert werden.
Schließlich ist es bevorzugt, wenn die Wandstruktur zwei mit ihrer Stirnfläche aufeinander zu weisende Stege aufweist, die zwischen sich zumindest einen Spalt definieren, wobei vorzugsweise zumindest einer der beiden Stege im Querschnitt rechteckförmig, trapezförmig, dreieckförmig oder ballig ausgebildet ist und/oder zumindest einer der beiden Stege auf seiner Stirnfläche einen in Flussrichtung verlaufenden Grat aufweist.
Hier ist von Vorteil, dass die Form des inhomogenen elektrischen Feldes durch die sich aus der Stegform ergebende Form des Spaltes mit bestimmt wird. Der Bereich maximaler Feldstärke kann so für den Anwendungsfall optimal eingestellt werden.
Ferner ist es bevorzugt, wenn die Elektrodenanordnung zumindest zwei an den Stegen vorgesehene Steg-Elektroden aufweist, die vorzugsweise in Flussrichtung gegenüberliegend angeordnet und/oder zumindest auf der Stirnfläche eines der beiden Stege angeordnet sind.
Hier ist von Vorteil, dass auf oder an den Stegen Zellen aufkonzentriert werden, die zwischen den Steg-Elektroden bspw. wie eine Perlenschnur aufgereiht werden.
Dann ist es bevorzugt, wenn zwischen den zumindest zwei Mikrokanalabschnitten zumindest ein weiterer Mikrokanal verläuft, der in fluidischer Verbindung zu der zumindest einen Öffnung steht.
Hier ist von Vorteil, dass aus der Öffnung Stoffwechselprodukte abtransportiert werden können. Bei einer Leberstruktur steht der weitere Mikrokanal dabei nur mit den Hepatocyten in Verbindung. In einer dem Lebersinusoid ähnlichen Gewebestruktur verbinden sich nämlich die Gallenkanälchen der einzelnen Hepatozyten zu einem gemeinsamen Gallenkanal mit einer zur (äußeren) Perfusionrichtung entlang der Endothelzellen parallelen Achse.
Der weitere Mikrokanal kann dabei entweder „durch die Öffnung” hindurch verlaufen, oder nur einseitig mit der Öffnung in Verbindung stehen. Im Falle einer dem Lebersinusoid ähnlichen Gewebestruktur ist es bevorzugt, wenn der weitere Mikrokanal als Gallenkanal nur einseitig mit der Öffnung in Verbindung steht, um die Galle „physiologisch”, also entgegen der Flussrichtung des Mediums in den beiden Mikrokanalabschnitten, abzuführen.
Das neue mikrofluidisches System ist vorzugsweise mit Anschlüssen zur fluidischen Steuerung versehen.
Hier ist von Vorteil, dass der Fluss durch die beiden Mikrokanalabschnitte so gesteuert werden kann, dass keine Querströmung durch die Öffnung(en) hindurch erzwungen wird. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Zuflussraten für beide Mikrokanalabschnitte sowie die Abflussrate für einen der beiden Mikrokanalabschnitte gesteuert wird, wodurch sich zwangsläufig die Abflussrate in dem anderen Mikrokanalabschnitt ergibt. Bei entsprechender Einstellung dieser Flussraten ist eine Querströmung durch die Öffnung(en) in der Wandstruktur ausgeschlossen.
Ferner ist es bevorzugt, wenn die Mikrostruktur in unterschiedlichen Bereichen mit unterschiedlichen selektiven Beschichtungen versehen ist.
Hier ist von Vorteil, dass die Besiedelung bestimmter Bereiche der Mikrostruktur durch eine adhäsive Beschichtung unterstützt oder durch eine non-adhäsive Beschichtung – z. B. in den Kanalabschnitten – vermieden werden kann. Ferner kann eine Beschichtung mit Extrazellulärmatrix vorgesehen sein, um Zellwachstum und – differenzierung zu unterstützen. Weiterhin kann nach der Assemblierung einer ersten Zellsorte ein Medium mit Zell-Zell Interaktion vermittelnden (Extrazellulärmatrix-)Molekülen eingespült werden, um einen funktionellen Kontakt zu Zellen eines weiteren Zelltyps herzustellen, die in einem weiteren, darauf folgenden Schritt in das Mikrosystem eingebracht werden.
Allgemein ist es noch bevorzugt, wenn im Bereich der zumindest einen Öffnung zumindest eine dielektrische Struktur zur Beeinflussung des elektrischen Feldes vorgesehen ist.
Bei dieser Maßnahme ist von Vorteil, dass die Feldstärke im Bereich der Öffnung(en) gezielt moduliert werden kann, um eine bestimmte Anordnung der Zellen zu erreichen.
Bei dem neuen Verfahren ist es bevorzugt, wenn der Mikrostruktur über beide Mikrokanalabschnitte zunächst erste Zellen zum Aufbau einer Zellanordnung zugeführt werden, und danach von den ersten Zellen verschiedene zweite Zellen zugeführt werden, um auf der Zellanordnung aus den ersten Zellen eine Zellanordnung aus den zweiten Zellen aufzubauen, wobei die ersten Zellen Hepatocyten und die zweiten Zellen Endothelzellen sein können.
Nachdem so beispielsweise ein erster Zelltyp in einen Spalt oder in Öffnungen assembliert wurde, kann ein zweiter Zelltyp durch die Mikrokanalabschnitte geleitet werden, der sich dann außen an dem Aggregat aus den ersten Zellen ansammelt, so dass die ersten Zellen zum ersten und zum zweiten Mikrokanal hin durch die zweiten Zellen vollständig abgeschirmt sind.
Auf diese Weise lässt sich bspw. ein organotypisches Lebergewebe erzeugen, bei dem die ersten Zellen Hepatozyten und die zweiten Zellen Endothelzellen sind. Nachdem diese komplexe Struktur aufgebaut wurde, wird sie dann durch beide Mikrokanäle mit Nährflüssigkeit perfundiert und somit über längere Zeiträume kultiviert. Wenn dem Medium jetzt Medikamente zugesetzt werden, können sie auf Toxizität und Metabolisierung getestet werden. Dabei ist es von Vorteil, dass die Hepatocyten nach außen vollständig von Endothelzellen besetzt werden, so dass die Perfusion der komplexen Zellkultur von der Seite der Endothelzellen her erfolgt, wie es im intakten Lebergewebe der Fall ist.
Andererseits ist es bevorzugt, wenn der Mikrostruktur über den ersten Mikrokanalabschnitt erste Zellen und über den zweiten Mikrokanalabschnitt von den ersten Zellen verschiedene zweite Zellen zugeführt werden, wobei die ersten Zellen Astrocyten oder darmtypische Mesenchymzellen und die zweiten Zellen Epithelzellen sein können.
Hier werden in den beiden Mikrokanalabschnitten voneinander verschiedene Zelltypen zeitgleich oder zeitlich nacheinander zugeführt, so dass sich vom ersten Mikrokanalabschnitt aus erste Zellen und vom zweiten Mikrokanalabschnitt aus zweite Zellen in und an der Öffnung assemblieren und eine zweilagige Gewebestruktur aus zwei verschiedenen Zelltypen entsteht. Nach Aufbau dieser komplexen Zellanordnung gelangen die ersten Zellen nur mit dem Medium im ersten Mikrokanalabschnitt und die zweiten Zellen nur mit Medium im zweiten Mikrokanalabschnitt in Kontakt.
Auf diese Weise kann die Barriere der Blut-Hirn-Schranke durch Endothelzellen und Astrocyten etabliert werden. Im Zusammenhang mit der Entwicklung von Wirkstoffen kann jetzt die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für diese Wirkstoffe und damit ihre Verfügbarkeit in Bereichen des Nervensystems bestimmt werden.
Ferner kann die Struktur des Darmepithels aus Mesenchymzellen und Epithelzellen etabliert werden, und der Transport von Wirkstoffen durch das Darmepithel und damit ihre Verfügbarkeit für den Eintritt in das Blutgefäßsystem gemessen werden.
Unter „ersten Zellen” bzw. „zweiten Zellen” werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht nur Zellen eines einzigen Zelltyps sondern auch Mischungen aus Zellen verschiedener Zelltypen verstanden. So können bei dem Aufbau einer Leberstruktur den Endothelzellen bspw. Sternzellen beigemischt werden.
Allgemein ist es bevorzugt, wenn der Zellanordnung mit dem Medium Nährstoffe und/oder Testsubstanzen zugeführt werden, und/oder wenn über einen der beiden Mikrokanäle oder einen weiteren Mikrokanal Stoffwechselprodukte von der Zellanordnung abgeführt werden.
Der Nährflüssigkeit können somit Marker zugegeben werden, um die Reaktion des organotypischen Zellgewebes auf diese Substanzen zu untersuchen. Dies können Fluoreszenzmarker wie bspw. Antikörper sein, die zellspezifisch binden und somit eine Untersuchung der tatsächlichen Zellanordung ermöglichen.
Ferner können die Zellanordnungen mit Testsubstanzen und/oder Medikamenten perfundiert werden, deren Wirkung, Transport oder Metabolisierung bei der etablierten Zellanordnung untersucht werden sollen.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen und im Zusammenhang mit den Zeichnungen, in denen
1 eine schematische, nicht maßstabsgetreue, ausschnittsweise Draufsicht auf ein Unterteil eines ersten Ausführungsbeispiels einer Mikrostruktur des neuen mikrofluidischen Systems längs der Linie I-I aus 2 zeigt;
2 eine schematische, nicht maßstabsgetreue Schnittdarstellung durch die Mikrostruktur aus 1 längs der dortigen Linie II-II zeigt;
3 in einer Darstellung wie 1 eine Gesamtdraufsicht auf das neue mikrofluidische System der 1 und 2 mit abgenommenen Oberteil zeigt, bei dem mehrere Spalte seriell hintereinander angeordnet sind;
4 in einer Darstellung wie 3 ein mikrofluidisches System zeigt, bei dem der weitere Mikrokanal nur einseitig mit dem Spalt verbunden ist;
5 in einer ausschnittsweisen Darstellung wie 3 oder 4 ein mikrofluidisches System zeigt, bei dem mehrere Spalte parallel zueinander angeordnet sind;
6 in einer Darstellung wie 2 eine perspektivische Ansicht eines weiteren Ausführungsbeispiels des neuen mikrofluidischen Systems im Bereich der Wandstruktur zeigt, wobei Kanalelektroden an Kanalboden und -deckel vorgesehen sind;
7 in einer Darstellung wie 6 ein weiteres Ausführungsbeispiel des neuen mikrofluidischen Systems im Bereich der Wandstruktur zeigt, wobei Kanalelektroden an den Seitenwänden vorgesehen sind;
8 vier schematische, nicht maßstabsgetreue Schnittdarstellungen für unterschiedliche Stegformen bei dem Ausführungsbeispiel der 6 oder 7 zeigt;
9 in einer Darstellung wie 8 beispielhaft die Assemblierung von Zellen auf den Stegen der Wandstruktur zeigt;
10 in einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem auf dem Steg Steg-Elektroden angeordnet sind;
11 in einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel der Mikrostruktur des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem sich die beiden Mikrokanäle vor und hinter der Wandstruktur zu einem Mikrokanal vereinigen;
12 in einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem auf dem Steg dielektrische Strukturen zur Modulation der Feldstärke vorgesehen sind;
13 in einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem die Wandstruktur mehrere Trennwände aufweist;
14 in einer Darstellung wie 1 ein weiteres Ausführungsbeispiel des neuen mikrofluidischen Systems zeigt, bei dem mehrer Öffnungen in der Wandstruktur vorgesehen sind, und über beide Mikrokanalabschnitte voneinander verschiedene Zelltypen zeitgleich zugeführt werden, um eine schichtartige Zellanordnung aufzubauen; und
15 bis 18 Fluoreszenzaufnahmen zu dem allmählichen Aufbau von Aggregaten der Zelllinie LCL 17001 in einem mikrofluidischen System zeigen, das in 15 unten prinzipiell dargestellt ist.
In 1 ist eine schematische, nicht maßstabsgetreue, ausschnittsweise Draufsicht auf ein Unterteil 10 eines ersten Ausführungsbeispiels einer Mikrostruktur 11 eines mikrofluidischen Systems dargestellt.
2 zeigt einen Schnitt quer durch das mikrofluidische System 12 längs der Linie II-II aus 1, während die Draufsicht der 1 längs der Linie I-I aus 2 gesehen ist.
Die Mikrostruktur 11 weist ein vom geometrischen Aufbau her dem Unterteil 10 entsprechendes Oberteil 14 auf, das das Unterteil 10 verschließt.
Durch die Mikrostruktur 11 verlaufen parallel und im Abstand zueinander zwei Mikrokanalabschnitte 16, 17, die in dem gezeigten Beispiel teilweise im Unterteil 10 und teilweise im Oberteil 14 ausgebildet sind. Selbstverständlich können die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 auch gänzlich im Unterteil 10 oder im Oberteil 14 ausgebildet sein, das Oberteil 14 bzw. das Unterteil 10 bilden dann lediglich einen Kanaldeckel bzw. Kanalboden.
Über die Mikrokanalabschnitte 16, 17 wird die Mikrostruktur 11 von außen in durch die Mikrokanalabschnitte 16, 17 definierten Flussrichtungen 18 und 19 mit Medium perfundiert, das in 2 bei 21 und 22 angedeutet ist. Mit dem Medium 21, 22 können Nährstoffe und Testsubstanzen zu- sowie Stoffwechselprodukte abgeführt werden. Ferner können in dem Medium 21, 22 Zellen 23, 24 transportiert werden, die in noch zu beschreibender Weise eine komplexe Zellanordnung aufbauen.
Die Mikrokanalabschnitte 16, 17 werden durch eine Wandstruktur 25 voneinander getrennt, in der eine die beiden Mikrokanalabschnitte 16, 17 miteinander verbindende Öffnung 26 vorgesehen ist.
Ferner ist in der Mikrostruktur 11 eine Elektrodenanordnung 27 vorgesehen, über die im Bereich der Öffnung 26 ein inhomogenes elektrisches Feld 28 erzeugt wird, von dem in 2 einige Feldlinien 29 beispielhaft gestrichelt dargestellt sind.
Durch dieses Feld 28 werden die Zellen 23, 24 zu der Öffnung 26 hin bewegt, wo sie assemblieren und eine in 2 nicht gezeigte komplexe Zellanordnung bilden. Dabei wird der bspw. in der eingangs genannten Veröffentlichung von Ho et al. beschriebene Effekt der Feld-induzierten Dielektrophorese genutzt.
In 1 und 2 ist zu erkennen, dass das Unterteil 10 sich vom jeweiligen Kanalboden 31, 32 nach oben erstreckende Außenwände 33, 34 aufweist, denen am Oberteil 14 Außenwände 35, 36 entsprechen, die sich vom jeweiligen Kanaldeckel 37 bzw. 38 aus erstrecken. Die Außenwände 33, 34, 35, 36 liegen mit ihren aufeinander zu weisenden Stirnflächen aufeinander auf.
In oder an den Außenwänden 33, 34, 35, 36 sind gegenüber der Öffnung 26 Kanal-Elektroden 39 und 40 der Elektrodenanordnung 27 angeordnet, die über Zuleitungen 41 bzw. 42 an einen in 3 zu sehenden elektrischen Wechselspannungsgenerator 43 mit variabler Frequenz f und variablem Spannungshub Upp angeschlossen werden können.
Die Wandstruktur 25 umfasst eine Trennwand 44, die durch entsprechende Bereiche von Oberteil 14 und Unterteil 10 gebildet wird, die wie die Außenwände 33, 34, 35, 36 aufeinander aufliegen. Im Bereich der Öffnung 26 ist die Trennwand 44 mit gegenüber der Auflagefläche zurückgesetzten Stegen 45, 46 ausgebildet, deren Stirnflächen 47 bzw. 48 aufeinander zuweisen und zwischen sich die Öffnung 26 begrenzen.
Die Stege 45, 46 verlaufen in Flussrichtung 18, 19 so dass die Öffnung 25 die Form eines langgestreckten Spaltes 49 aufweist.
In der Trennwand 44 verläuft parallel zu und zwischen den Mikrokanalabschnitten 16, 17 ein weiterer Mikrokanal 51, der in fluidischer Verbindung mit dem Spalt 49 steht, so dass Material aus dem Bereich des Spaltes 49 abgeführt werden kann.
Der weitere Mikrokanal 51 kann dabei – wie in 1 gezeigt – den Spalt 49 durchsetzen, also beidseits an den Spalt 49 bzw. die Öffnung 26 angeschlossen sein, er kann aber auch nur an einer Seite des Spaltes 49 vorgesehen sein, was insbesondere für die Untersuchung von organotypischen Leberstrukturen von Vorteil ist, wenn der weitere Mikrokanal 51 als Gallenkanal dient.
Die Mikrostruktur 11 ist aus einem dielektrischen Material gefertigt, so dass durch die insoweit beschriebene Geometrie die Feldstruktur mit bestimmt wird. Das Feld 28 weist im Bereich des Spaltes 49 seine höchste Felddichte auf, wobei die Form des Feldes im Wesentlichen durch diese Geometrie, die Feldstärke durch den Spannungshub Upp bestimmt wird.
Als geeignetes Material für die Mikrostruktur 11 hat sich Glas, Silizium, ggf. mit einer isolierenden Schicht z. B. aus Siliziumoxid oder Siliziumnitrid beschichtet, sowie Polymere wie beispielsweise PMMA, Polystyrol, PEEK, COC (cyclic olefin copolymer) erwiesen. Vorzugsweise werden transparente, nichtleitende Materialien eingesetzt, wobei die obige Aufzählung nur als beispielhaft zu verstehen ist.
Hergestellt werden kann die Mikrostruktur 11 mit geeigneten, an sich bekannten Verfahren zur Mikrostrukturierung, wie bspw. Photolithographie in Kombination mit Plasmaätzverfahren oder nasschemischen Ätzverfahren sowie im Falle von Polymermaterialien durch Mikrospritzguss oder Heißprägen.
Die Länge des Spaltes 49 in Flussrichtung 18, 19 beträgt bspw. 20 bis 2000 μm, vorzugsweise ca. 1500 μm. Die Höhe des Spaltes 49 zwischen den Stirnflächen 47, 48 beträgt bspw. 10 bis 100 μm, vorzugsweise ca. 50 μm. Die Breite des Spaltes 49 an der Stirnfläche 47, 48 quer zur Flussrichtung 18, 19 beträgt bspw. 10 bis 200 μm, vorzugsweise ca. 100 μm.
Die Höhe der Mikrokanalabschnitte 16, 17 zwischen Kanalboden 31, 32 und Kanaldeckel 37, 38 beträgt bspw. 50 bis 2000 μm, vorzugsweise ca. 500 μm. Die Breite der der Mikrokanalabschnitte 16, 17 zwischen Außenwand 33, 34, 35, 36 und Trennwand 44 beträgt bspw. 20 bis 2000 μm, vorzugsweise ca. 200 μm.
Die Breite des weiteren Mikrokanals 51 quer zur Flussrichtung beträgt ca. 5 bis 10 μm. Die Länge der Kanal-Elektroden 39, 40 in Flussrichtung 18, 19 ist größer als die Länge des Spaltes 49, wobei die Höhe der Kanal-Elektroden 39, 40 quer zur Flussrichtung größer ist als die Höhe des Spaltes 49 zwischen den Stirnflächen 47, 48.
Diese Maßangaben und Größenverhältnisse sind lediglich beispielhaft zu verstehen, sie können in Abhängigkeit von den zu assemblierenden Zellen 23, 24 variieren.
Wichtig ist dabei, dass durch die Geometrie der Mikrostruktur 11 ein inhomogenes Feld aufgebaut wird, wozu es nicht zwingend erforderlich ist, dass die Abmaße der Kanal-Elektroden 39, 40 größer sind als die des Spaltes 49. Wenn die Mikrostruktur 11 mit Medium gefüllt ist, variiert der elektrischen Widerstand zwischen den Kanal-Elektroden 39, 40 über dem Abstand zwischen den Kanal-Elektroden 39, 40, was dazu führt, dass sich ein inhomogenes Feld 28 einstellt.
Wie bereits erwähnt, ist die Mikrostruktur 11 bspw. für die Etablierung einer organotypischen Leberstruktur geeignet. Hepatocyten haben einen Durchmesser von ca. 50 μm, wobei in einem Lebersinusoid zwei Reihen von je ca. 20 bis 30 Hepatocyten hintereinander angeordnet sind. Für den Spalt 49 ergeben sich daraus als Optimalmaße eine Breite von 100 μm, eine Höhe von 50 μm, und eine Länge von 1000 bis 1500 μm.
In 3 ist ein Ausführungsbeispiel zu erkennen, bei dem die Mikrokanalabschnitte 16, 17 insgesamt vier Spalte 49 in Flussrichtung hintereinander aufweisen, zu denen jeweils eigene Zuleitungen 41 bzw. 42 für Kanal-Elektroden 39, 40 führen.
Die Mikrokanalabschnitte 16, 17 sind dabei jeweils Teil eines gesonderten Mikrokanals 52 bzw. 53, zwischen denen der weitere Mikrokanal 51 verläuft, der alle vier Spalte 49 miteinander verbindet.
Alle drei Mikrokanäle 51, 52, 53 weisen an ihren Enden Anschlüsse 54 zur fluidischen Steuerung auf, um die Flussrate des Mediums in den Mikrokanälen 51, 52, 53 individuell einstellen zu können.
Der Fluss des Mediums durch die beiden Mikrokanäle 52, 53 kann dabei so gesteuert werden, dass keine Querströmung durch die Spalte 49 hindurch erzwungen wird.
Die Mikrostruktur 11 ist dabei in unterschiedlichen Bereichen mit unterschiedlichen selektiven Beschichtungen versehen. Dabei kann die Besiedelung im Bereich der Spalte 49 durch eine adhäsive Beschichtung unterstützt und durch eine non-adhäsive Beschichtung in den Mikrokanälen 52, 53 vermieden werden. Ferner kann eine Beschichtung mit Extrazellulärmatrix vorgesehen sein, um Zellwachstum und -differenzierung zu unterstützen.
Mit dem insoweit beschriebenen mikrofluidischen System 12 lässt sich jetzt eine organotypische, komplexe Zellanordnung aufbauen. Soll beispielsweise eine Leberstruktur etabliert werden, so werden in beiden Mikrokanälen 52 und 53 dem Medium 21 bzw. 22 zunächst Hepatocyten zugegeben, die sich aufgrund der Struktur des inhomogenen Feldes 28 in den Spalten 49 ablagern. Wie bereits eingangs erwähnt, führen die dielektrophoretischen Kräfte dazu, dass die Zellen in Richtung der größten Felddichte bewegt werden.
Nachdem sich so Hepatocyten in den Spalten 49 assembliert haben, wird dem Medium 21 bzw. 22 jetzt ein zweiter Zelltyp, im vorliegenden Fall also Endothelzellen, hinzugegeben, die sich außen an der Hepatocytenstruktur anlagern und diese schließlich vollständig gegenüber den Medien 21, 22 isolieren.
Jetzt können über die Mikrokanäle 52 und 53 Nährstoffe und Testsubstanzen hinzugegeben werden, während die Stoffwechselprodukte aus den seriell über den Mikrokanal 51 miteinander verbundenen Spalten 49, in denen sich die Zellanordnungen assembliert haben, abgeführt werden.
Selbstverständlich ist der Aufbau einer organotypischen Leberstruktur nur ein Beispiel für die Anwendung des neuen mikrofluidischen Systems.
In 3 sind vier seriell hintereinander geschaltete Spalte 49 vorgesehen, die über einen gemeinsamen Mikrokanal 51 miteinander verbunden sind. Es kann jedoch – wie oben schon erwähnt – auch nur ein Spalt 49 vorgesehen sein, der nur einseitig an den Mikrokanal 51 angeschlossen ist, wie dies in 4 gezeigt ist. Der Mikrokanal 51 verläuft dann entgegen der Flussrichtung 18, 19.
Andererseits ist es auch möglich, die Spalte 49 parallel zueinander vorzusehen, indem mehrere Wandstrukturen bzw. Trennwände 44 quer zur Flussrichtung 18, 19 nebeneinander angeordnet werden, wie dies ausschnittsweise in 5 für drei Spalte 49 gezeigt ist. Jeder Spalt 49 ist dann über einen eigenen Mikrokanal 51' mit dem gemeinsamen Mikrokanal 51 verbunden.
In 5 sind die Zuleitungen zu den Kanal-Elektroden 39, 40 und die Mikrokanäle 52, 53 aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeigt. Die Mikrokanalabschnitte 16, 17 und die Mikrokanäle 51, 51' sowie die nicht gezeigten Zuleitungen zu den Elektroden müssen ggf. in verschiedenen Ebenen – parallel zur Zeichnungsebene – angeordnet sein, um Probleme bei möglichen Kreuzungspunkten zu vermeiden.
Während bei dem Ausführungsbeispiel der 1 bis 5 die Stege 45 und 46 im Querschnitt rechteckförmig sind, können die Stege auch trapezförmig ausgebildet sein, wie dies in den 6 und 7 gezeigt ist. Durch die trapezförmige Stegstruktur lässt sich das inhomogene elektrische Feld weiter beeinflussen, so dass eine Feldstruktur entsteht, die für die Assemblierung von Zellen besonders geeignet ist.
Während in 7 die Kanalelektroden 39, 40 wie in den 1 und 2 an den in 7 nicht gezeigten Außenwänden angeordnet sind, sind in dem Ausführungsbeispiel gemäß 6 Kanalelektroden 55 am Kanalboden 31, 32 sowie am Kanaldeckel 35, 38 angeordnet.
Selbstverständlich ist es auch möglich, Kanalelektroden sowohl an den Außenwänden als auch am Kanalboden und am Kanaldeckel vorzusehen.
Durch die gewählte Anordnung der Kanalelektroden 39, 40, 55 kann das sich ausbildende inhomogene Feld weiter beeinflusst werden.
In den 8 und 9 sind jeweils vier Stegformen im Querschnitt gezeigt, oben links ist der Steg 46, 47 jeweils im Querschnitt trapezförmig, oben rechts ballig, unten rechts dreieckförmig und unten links trapezförmig mit in Flussrichtung verlaufenden Graten 56.
In den 8 und 9 sind gestrichelt wieder Feldlinien 29 des sich ausbildenden inhomogenen elektrischen Feldes 28 gezeigt, wobei in 9 ferner zu sehen ist, wie sich Zellen 23, 24 in dem jeweiligen Spalt 49 anordnen. Allen Strukturen ist das Prinzip gemeinsam, dass sich in der oder den Engstellen ein oder mehrere Feldmaxima ausbilden, durch die die Position der Zellen 23, 24 definiert wird.
10 zeigt in einer Darstellung wie 1 ein Unterteil 10 einer Mikrostruktur, wobei dort auf der Stirnfläche 47 des Steges 45 in Flussrichtung 18, 19 aufeinander zu weisende Stegelektroden 57 vorgesehen sind, zwischen denen sich Zellen 23 perlenschnurartig anordnen. Durch die zusätzlichen Stegelektroden 57 kann also die Struktur des sich in dem Spalt 49 ausbildenden organotypischen Gewebes beeinflusst werden.
In 11 ist in einer Darstellung wie in den 1 und 10 ein weiteres Ausführungsbeispiel der neuen Mikrostruktur 11 gezeigt, bei dem sich die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 vor und hinter der Wandstruktur bzw. Trennwand 44 zu einem gemeinsamen Mikrokanal 58 vereinigen.
Während es mit den Mikrostrukturen aus den 1 und 10 möglich ist, zeitgleich über die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 Zellen verschiedener Zelltypen zuzuführen, so dass sich erste Zellen vom Mikrokanalabschnitt 16 aus und zeitgleich zweite Zellen 24 vom Mikrokanalabschnitt 17 aus in den Spalt 49 assemblieren, werden bei der Mikrokanalstruktur 11 aus 11 nur Zellen 23 eines Zelltyps zeitgleich zugeführt, wie dies beim Aufbau einer organotypischen Leberstruktur erfolgen kann.
In 12 ist in einer Darstellung wie 1 eine Mikrokanalstruktur gezeigt, bei der auf der Stirnfläche 47 des Steges 45 insgesamt fünf weitere dielektrische Strukturen 59 vorgesehen sind, die hier als runde Pfosten ausgebildet sind und das inhomogene elektrische Feld 28 weiter beeinflussen, wie aus dem Verlauf der Feldlinien 29 zu ersehen ist, und eine entsprechende Anordnung der Zellen 23, 24 bewirken.
13 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel, bei dem die Wandstruktur 25 eine Vielzahl von Trennwänden 44 mit jeweils einem darin vorgesehen Spalt 49 aufweist. Bei dieser Mikrostruktur 11 ist der eine Mikrokanal 58 also in viele Mikrokanalabschnitte 16, 17 aufgespalten, zwischen denen jeweils eine Trennwand 44 verläuft, ansonsten entspricht er dem in 11 gezeigten Aufbau, wo nur ein Mikrokanal 58 für die Perfusion vorgesehen ist.
Allen insoweit beschriebenen Mikrostrukturen 11 ist gemeinsam, dass durch die Formgebung im Bereich der Öffnung 26 bzw. des Spaltes 49 die Struktur des inhomogenen elektrischen Feldes 28 beeinflusst wird, um je nach gewünschter, zu assemblierender Zellanordnung unterschiedliche Positionen für die Ansammlung der Zellen zu bevorzugen.
In 14 schließlich ist wie in der Darstellung der 1, 10, 11, 12 und 13 eine Mikrostruktur 11 gezeigt, bei der die Mikrokanalabschnitte 16 und 17 durch eine Trennwand 44 voneinander getrennt sind, in der mehrere Öffnungen 26 vorgesehen sind, die in Flussrichtung 18, 19 nebeneinander sowie – in 14 nicht dargestellt – auch übereinander, also parallel zur Zeichnungsebene angeordnet sind. Die Kanalelektroden 38 und 39 erstrecken sich über den gesamten Bereich der Trennwand 44, der mit Öffnungen 26 versehen ist.
Diese Struktur ist dazu geeignet, um eine zweilagige schichtartige Zellanordnung aus Zellen 23 und 24 aufzubauen, die sich von den beiden Mikrokanalabschnitten 16 und 17 her an den Öffnungen 26 anlagern.
Wie eingangs geschildert, ist es auf diese Weise möglich, die Struktur des Darmepithels oder der Blut-Hirn-Schranke nachzubilden.
In den Mikrokanalabschnitt 16 kann dann beispielsweise Medium mit Nährstoffen und Testsubstanzen zugeführt werden, während aus dem Mikrokanalabschnitt 17 dann Medium abtransportiert wird, indem nachgewiesen werden kann, ob die Testsubstanzen die aus den Zellen 23 und 24 gebildete Membran durchdringen können.
In den 15 bis 18 ist beispielhaft von a nach g fortschreitend die Assemblierung von Zellen in einem Spalt gezeigt. Die Struktur des Spaltes 49 ist in 15 unten gezeigt, die Kanalelektroden 39 und 40 sind im Querschnitt bauchig ausgeführt.
An die Kanalelektroden wurde ein elektrisches Feld der Frequenz 90 kHz und der Spannung U = 54 V pp angelegt. Die Fluoreszenzaufnahmen a bis g wurden im Abstand von ca. 30 Sekunden aufgenommen. Von a nach g fortschreitend ist an den Fluoreszenzaufnahmen zu erkennen, dass sich im Bereich des Spaltes 49 immer mehr Zellen ansammeln, die als helle Punkte erscheinen.
In dem gezeigten Beispiel wurden Zellen der lymphoiden Zelllinie des Typs LCL17001 verwendet. Die Medien enthielten Zellen in einer Dichte von 1 × 10⁶ pro ml Kulturmedium, das 480 mM Saccharose in einem Puffer bei ca. pH 7,0 enthielt. Zur Analyse der Viabilität wurde 3 μl des Fluoreszenzfarbstoffes Calcein-AM zu 4 ml der Saccharose-Zellsuspension zugegeben.
Die obigen Experimente wurden in Zellkulturmedien für proof-of-principle Experimente unter Verwendung der Zelllinie LCL 17001 durchgeführt.
In den tatsächlichen Versuchen wird dann ein Zellkulturmedium speziell für Hepatozyten bzw. die jeweils verwendeten anderen Zelltypen eingesetzt.
Mit Kulturmedium wird nachstehend jeweils das Medium bezeichnet, in dem die Zellen optimal wachsen, während Suspensionsmedium das auf die Erfordernisse der positiven Dielektrophorese optimierte Medium bezeichnet, das insbesondere eine niedrige Leitfähigkeit aufweist und die Viabilität der Zellen für einen relativ kurzen Zeitraum von einigen Minuten bis Stunden sicherstellt.
Für LCL (lymphoid cell line) wird als Kulturmedium 500 ml RPMI 1640 Kulturmedium, + 20% (120 ml) FBS (Fetal Bovine Serum), + 6 ml Penstrep (Antibiotika), + 2 mmol L-Glutamin verwendet; siehe Lindl, T., Zell- und Gewebekultur. 4. Auflage ed. 2000, Berlin/Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag.
Als Suspensionsmedium wird DI-Wasser, + 480 mmol D-Saccharose verwendet, es erfolgt keine Pufferkorrektur, da der pH-Wert nur um 0,4 vom Kulturmedium ab weicht, siehe auch Sebastian, A., A. -M. Buckle, and G. H. Markx, Formation of multilayer aggregates of mammalian cells by dielectrophoresis. Journal of Micromechanics and Microengineering, 2006. 16(9): p. 1769.
Aufbau und Wachstumsverhalten der LCL Zellen werden in einer Publikation von Nilsson dargestellt; Nilsson, K., Human B-lymphoid cell lines. Hum Cell, 1992. 5(1): p. 25–41.
Für Hepatozyten wird als Kulturmedium DMEM (Dulbecco's modified Eagle – Medium), +10% FBS (fetal bovine serum), +0.5 U/ml insulin, +7 ng/ml Glucagon, +20 ng/ml epidermal growth factor, +7.5 μg/ml hydrocortisone, +100 U/ml Penicillin, +100 μg/ml Streptomycin verwendet.
Zu dem verwendeten Suspensionsmedium ist noch zu erwähnen, dass für positive Dielektrophorese (DEP) Medien mit einer besonders niedrigen Leitfähigkeit erforderlich sind. Diese werden hergestellt, indem die Salz- bzw. Pufferkonzentration der Kulturmedien möglichst weit reduziert wird. Kulturmedien basieren meist auf einer PBS (phosphate buffered saline) Lösung, die ca. 150 mM NaCl enthält, welches eine für die DEP zu hohe Leitfähigkeit bewirkt. Zur Kompensation der im Falle des Weglassens des Salzes reduzierten Osmolarität, d. h. um ein Platzen der Zellen infolge des Konzentrationsunterschiedes zwischen Cytosol und Medium zu vermeiden, wird dem Medium ein Zucker, z. B. Sacharose oder Sorbitol anstelle des Salzes in einer Konzentration von bis zu 500 mM zugesetzt.

Claims

Mikrofluidisches System zum Aufbau und zur anschließenden Kultivierung von komplexen Zellanordnungen, mit – einer dreidimensionalen Mikrostruktur (11), in der die Zellanordnung aufgebaut und kultiviert wird, – zumindest zwei in der Mikrostruktur (11) verlaufenden, eine Flussrichtung (18, 19) definierenden Mikrokanalabschnitten (16, 17), über die die Mikrostruktur (11) von außen mit einem Medium (21, 22) perfundierbar ist, wobei die Mikrokanalabschnitte (16, 17) zumindest bereichsweise äquidistant zueinander verlaufen, – einer die zumindest beiden Mikrokanalabschnitte (16, 17) trennenden Wandstruktur (25), in der zumindest eine die zumindest zwei Mikrokanalabschnitte (16, 17) verbindende Öffnung (26) vorgesehen ist, und – einer in oder an der Mikrostruktur (11) vorgesehenen Elektrodenanordnung (27), um im Bereich der zumindest einen Öffnung (26) ein inhomogenes elektrisches Feld (28) zu erzeugen, wobei das inhomogene elektrische Feld (28) dazu eingerichtet ist, zugeführte Zellen im Bereich der zumindest einen Öffnung (26) aufzukonzentrieren.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokanalabschnitte (16, 17) entweder jeweils Teil eines gesonderten Mikrokanals (52, 53) sind, der durch die Mikrostruktur (11) verläuft, oder vor und hinter der Wandstruktur (25) in einen gemeinsamen Mikrokanal (58) übergehen.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Öffnung (26) einen sich in Flussrichtung (18, 19) der beiden Mikrokanalabschnitte (16, 17) erstreckenden Spalt (49) aufweist.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Flussrichtung (18, 19) mehrere Spalte (49) hintereinander angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Öffnungen (26) vorgesehen sind, die in Flussrichtung (18, 19) der beiden Mikrokanalabschnitte (16, 17) sowie quer zur Flussrichtung (18, 19) in der Wandstruktur (25) verteilt angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (27) zumindest eine in dem ersten Mikrokanalabschnitt (16) und zumindest eine weitere, in dem zweiten Mikrokanalabschnitt (17) vorgesehene Kanal-Elektrode (39, 40) aufweist, wobei die beiden Kanal-Elektroden (39, 40) in der Nähe der zumindest einen Öffnung (26) vorgesehen sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in jedem Mikrokanalabschnitt (16, 17) zumindest eine Kanal-Elektrode (39, 40) an einer der Wandstruktur (25) gegenüberliegenden Wand (33, 34, 35, 36) angeordnet ist.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass in jedem Mikrokanalabschnitt (16, 17) zumindest eine Kanal-Elektrode (55) an einer an die Wandstruktur (25) angrenzenden Wand (31, 32, 37, 38) angeordnet ist.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Wandstruktur (25) zwei mit ihrer Stirnfläche (47, 48) auf einander zu weisende Stege (45, 46) aufweist, die zwischen sich zumindest einen Spalt (49) definieren.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der beiden Stege (45, 46) im Querschnitt rechteckförmig, trapezförmig, dreieckförmig oder ballig ausgebildet ist.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der beiden Stege (45) auf seiner Stirnfläche (47) einen in Flussrichtung verlaufenden Grat (56) aufweist.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (27) zumindest. zwei an den Stegen (45, 46) vorgesehene Steg-Elektroden (57) aufweist.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Steg-Elektroden (57) in Flussrichtung (18, 19) gegenüberliegend angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Steg-Elektroden (57) zumindest auf der Stirnfläche (47) eines der beiden Stege (46) angeordnet sind.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den zumindest zwei Mikrokanalabschnitten (16, 17) zumindest ein weiterer Mikrokanal (51) verläuft, der in fluidischer Verbindung zu der zumindest einen Öffnung (26) steht.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Anschlüssen (54) zur fluidischen Steuerung versehen ist.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrostruktur (11) in unterschiedlichen Bereichen mit unterschiedlichen selektiven Beschichtungen versehen ist.
Mikrofluidisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass im Bereich der zumindest einen Öffnung (26) zumindest eine dielektrische Struktur (59) zur Beeinflussung des elektrischen Feldes (28) vorgesehen ist.
Verfahren zum Aufbau und Kultivieren von komplexen Zellanordnungen, bei dem in dem mikrofluidischem System (12) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zunächst eine komplexe Zellanordnung aufgebaut wird, indem – der Mikrostruktur (11) Medium (21, 22) mit Zellen (23, 24) zum Aufbau der Zellanordnung zugeführt wird, und – in der Mikrostruktur (11) ein durch die Mikrostruktur (11) bestimmtes inhomogenes elektrisches Feld (28) erzeugt wird, das den Aufbau einer Zellanordnung aus den zugeführten Zellen bewirkt, wobei anschließend die Zellanordnung in der dreidimensionalen Mikrostruktur (11) kultiviert wird, indem sie mit Medium (21, 22) perfundiert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrostruktur (11) über beide Mikrokanalabschnitte (16, 17) zunächst erste Zellen (23) zum Aufbau einer Zellanordnung zugeführt werden, und danach von den ersten Zellen (23) verschiedene zweite Zellen (24) zugeführt werden, um auf der Zellanordnung aus den ersten Zellen (23) eine Zellanordnung aus den zweiten Zellen (24) aufzubauen.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Zellen (23) Hepatocyten und die zweiten Zellen (24) Endothelzellen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrostruktur (11) über den ersten Mikrokanalabschnitt (16) erste Zellen (23) und über den zweiten Mikrokanalabschnitt (17) von den ersten Zellen (23) verschiedene zweite Zellen (24) zugeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Zellen (23) Mesenchymzellen und die zweiten Zellen (24) Epithelzellen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Zellen (23) Astrocyten und die zweiten Zellen (24) Epithelzellen aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Zellanordnung mit dem Medium (21, 22) Nährstoffe und/oder Testsubstanzen zugeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass über einen der beiden Mikrokanalabschnitte (16, 17) oder einen weiteren Mikrokanal (51) Stoffwechselprodukte von der Zellanordnung abgeführt werden.
Verfahren zur Untersuchung von komplexen Zellanordnungen, bei dem in dem mikrofluidischen System (12) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zunächst eine Zellanordnung gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 26 aufgebaut und kultiviert wird, wobei die Untersuchung der so etablierten Zellanordnung anhand von abgeführten Stoffwechselprodukten und/oder über mit dem Medium (21, 22) zuge führte Marker erfolgt, die im Zusammenwirken mit der Zellanordnung ein messbares Signal erzeugen.