DE19952322C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Partikeltrennung - Google Patents

Abstract

In einem Partikelgemisch (1) aus einer Vielzahl von Partikeln in einem fluidischen Mikrosystem werden Zielpartikel (2) mit vorbestimmten Partikeleigenschaften von Restpartikeln (3) getrennt. Es erfolgen ein Positionieren von Partikeln in Beobachtungsfeldern an Funktionselementen (30) in einer ersten Kanalstruktur (10), wobei die Funktionselemente Elektrodenanordnungen aufweisen, an denen inhomogene elektrische Felder erzeugt werden, die dielektrophoretische Kräfte auf die Partikel ausüben, ein Vermessen der Partikel zur Ermittlung der Partikeleigenschaften mit einer Erfassung der Beobachtungsfelder, die die Zielpartikel (2) bzw. die Restpartikel (3) enthalten, ein Ausbilden optischer Käfige an den Beobachtungsfeldern, die die Ziel- oder Restpartikel enthalten, und ein gleichzeitiges Übertragen der Ziel- und Restpartikel in eine benachbarte zweite Kanalstruktur (20), wobei optische Kräfte der optischen Käfige und dielektrische Polarisationskräfte der Funktionselemente (30) zusammenwirken.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen von Partikel­ gemischen nach bestimmten Partikeleigenschaften, insbesondere ein Trennverfahren für Gemische mikroskopisch kleiner Partikel in fluidischen Mikrosystemen, und eine Trenneinrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Eine häufig bei biologischen oder medizinischen Untersuchun­ gen, in der Diagnostik sowie in biotechnologischen Prozessen gestellte Aufgabe besteht in der Trennung von Suspensionsge­ mischen durch Verteilung oder Sortierung von Zellen oder Mi­ kropartikeln aus einer großen Ausgangsmenge in bestimmte Gruppen mit jeweils den gleichen Eigenschaften. Beispielswei­ se kann die Transfektion einer Zellinie oft nur unvollständig durchgeführt werden, so daß vor einer weiteren Bearbeitung oder Nutzung dieser Zellinie die erfolgreich transfizierten Zellen von den nicht erfolgreich bearbeiteten Zellen getrennt werden müssen. Insbesondere das Aussortieren selten vorkom­ mender Individuen stellt eine sehr hohe Anforderung an das Trennverfahren hinsichtlich der Reinheit und Homogenität der Zielfraktion. Ein weiteres Beispiel im medizinischen Bereich ist mit der Knochenmarktransplatation gegeben, bei der Stamm­ zellen von einer großen Zahl anderer Zellen getrennt werden müssen. Auch bei der Analyse von fetalen Zellen im mütterli­ chem Blut müssen einige wenige fetale Zellen von dem Zellen­ gemisch abgetrennt werden, das sich im mütterlichen Blut be­ findet. Eine wichtige Aufgabe in der Tumordiagnostik ist die Erkennung, das Aussortieren und die Analyse von metastasie­ renden Krebszellen im Blut des Patienten. Es sind verschiede­ ne Methoden zur Trennung von Zellgemischen bekannt, die die Trennaufgabe jedoch nur unvollkommen lösen. Hierzu zählen insbesondere die Affinitätschromatographie, Trennverfahren auf der Basis von Fluoreszenzmarkierungen wie zum Beispiel die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), auf der Ba­ sis von Markierung mit ferromagnetischen Partikeln, die Ma­ gnet-aktivierte Zellsortierung (MACS) und mikroskopische Ver­ fahren.

Die Affinitätschromatographie wie auch die MACS (oder: Pan­ ning-Verfahren) sind auf Trennvorgänge beschränkt, bei denen die Zellen an der Zelloberfläche ein Molekül exprimieren, das eine Affinität zu einer weiteren, bekannten oder unbekannten Substanz besitzt. Bei der Affinitätschromatographie wird die­ se Substanz auf eine Chromatographiematrix, zum Beispiel auf der Basis von Beads, aufgebracht. Eine Suspension der zu tren­ nenden Zellen wird über diese Matrix gegeben, so daß die ex­ primierenden Zellen daran haften, während die anderen Zellen fort gespült werden. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht neben der Beschränkung auf zelluläre Systeme mit einer Ober­ flächenexpression von Molekülen, in der hohen mechanischen Belastung der Zellen und der geringen Trennschärfe der Chroma­ tographie. Die Trennschärfe ist schwach, da viele Zellen mit geringer Affinität unspezifisch an der Matrix hängenbleiben, die eigentlich nicht zu den abzutrennenden Zellen gehören. In der Praxis ist die Affinitätschromatographie auf die Trennung von mechanisch wenig empfindlichen Bakterien beschränkt.

Beim Magnet-aktivierten Trennen von Zellen wird die Zellsus­ pension mit mikrometergroßen Magnetpartikeln, auf die die af­ fine Substanz aufgebracht ist, gemischt und die Magnetpartikel zusammen mit den Zielzellen mithilfe eines außerhalb des Reak­ tionsgefäßes befindlichen Magneten abgetrennt. Auch hier ist die Verschleppung unspezifisch anhaftender Zellen an die Ma­ gnetpartikel eine erhebliche Einschränkung des Verfahrens hin­ sichtlich der Reinheit der Zielfraktion.

Beim Fluoreszenz-aktivierten Trennen von Zellen (FACS) werden diese in einem Flüssigkeitsstrom durch eine dünne Kapillare transportiert, wobei in der Regel noch ein weiterer, zell­ freier Hüllstrom vorgesehen ist. Dieser Strom wird von einem Tropfengenerator in Einzeltropfen zerlegt, die aus der Kapil­ lare in einen freien Meßraum emittiert werden. Die Tropfen passieren im Flug eine optische Meßstrecke, in der sie einer Streulicht- und/oder Fluoreszenzlichtmessung unterzogen wer­ den. Hierzu werden ein oder mehrere Laser auf die Flugbahn der Tropfen in der optischen Meßfläche fokussiert. Die gemessenen Streulicht- und/oder Fluoreszenzintensitäten erlauben die Feststellung, ob bestimmte Zelleneigenschaften gegeben sind oder nicht. In Abhängigkeit vom Meßergebnis wird eine nach der Meßstrecke angeordnete Verteilereinrichtung, zum Beispiel auf der Basis einer mechanischen Prallplatte oder einer elek­ trostatischen Ablenkvorrichtung, betätigt.

Der Nachteil der fluoreszenzaktivierten Zelltrennung besteht darin, daß es sich um ein serielles Verfahren handelt. Der optische Aufwand für die Meßstrecke ist so groß, daß eine Par­ allelisierung für praktische Anwendungen zu aufwendig ist. Entsprechendes gilt für die Tropfenerzeugung und die Vertei­ lereinrichtung. Um beispielsweise 10000 Zellen pro Sekunde analysieren zu können, muß bei einer seriellen Verfahrensweise die Meßzeit auf 100 ms oder weniger beschränkt werden. In der­ art kurzen Zeitbereichen sind Messungen zwar möglich, aber auch mit relativ großen Fehlern behaftet, so daß die Trenn­ schärfe des Verfahrens negativ beeinflußt wird.

Die mikroskopische Zelltrennung basiert darauf, eine zweidi­ mensionale Schicht von Zellen (sogenannter Zellrasen) zu bil­ den und mit einem Mikroskop abzurastern. Von jeder Zelle wird ein Bild aufgenommen, das einer Bildauswertung zur Feststel­ lung vorbestimmter Zelleigenschaften unterzogen wird. Je nach dem Auswertungsergebnis wird eine Pickvorrichtung dazu verwendet, einzelne Zellen nach der Messung aus dem Zellrasen zu lösen und einem Zielort zuzuführen. Eine besonders hohe Auflö­ sung bei der Bildaufnahme wird durch Einsatz der konfokalen Mikroskopie erzielt. Auch dieses Verfahren besitzt Beschrän­ kungen vor allem in bezug auf den Durchsatz der Pickvorrich­ tung. Ohne Zellen zu beschädigen, kann maximal im Rhythmus von ca. 10 s jeweils ein Pickvorgang erfolgen, der darüber hinaus eine mechanische Belastung der zu trennenden Zellen darstellt.

Die genannten Probleme treten nicht nur bei der Trennung von Zellgemischen, sondern allgemein bei der Trennung von Parti­ kelgemischen natürlichen und/oder synthetischen Ursprungs auf.

In Fig. 7 ist ein aus der Mikrosystemtechnik allgemein bekann­ tes Prinzip der Verteilung von Partikeln illustriert. Ein fluidisches Mikrosystem 100' enthält eine erste Kanalstruktur 10' und eine zweite Kanalstruktur 20', die aneinandergrenzen­ de, zum Beispiel nebeneinander oder übereinander angeordnete, Kanäle oder Kammern umfassen. Ein in einer Flüssigkeit suspen­ diertes Partikelgemisch 1' wird in der ersten Kammerstruktur 10' zu einem Feldkäfig 30' bewegt. Sobald ein Partikel im Feldkäfig 30' positioniert ist, erfolgen an dieser Beobach­ tungsposition eine Vermessung des Partikels mit elektrischen Mitteln und nach Freigabe des Partikels vom Feldkäfig 30' in Abhängigkeit vom Meßergebnis eine Ansteuerung einer Ablenke­ lektrode 40' derart, daß der Partikel in die zweite Kanal­ struktur 20' überführt oder zur weiteren Bewegung in der er­ sten Kanalstruktur 10' verbleibt (siehe Pfeile). Dieses Ver­ fahren ist wegen der seriellen Trennweise nachteilig. Soll das Trennverfahren gemäß Fig. 5 mit mehreren. Feldkäfigen durchge­ führt werden, so müßten entsprechend mehrere Ablenkelektroden selektiv verstimmt werden. Dies ist jedoch wegen der elektri­ schen Wechselwirkung benachbarter Strukturen in praktisch in­ teressierenden Zeitbereichen nicht zuverlässig durchführbar und es würde zu unerwünschten Fehltrennungen kommen. Ein weiterer Nachteil besteht in der Beschränkung auf die Messung elektrischer Eigenschaften der Partikel im Mikrosystem.

Aus EP 0 827 371 ist ein Gerät zur Manipulierung mikroskopisch kleiner Proben in einer Zellenanordnung mit Hilfe von Laserstrahlen bekannt.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Trennver­ fahren anzugeben, das sich durch einen hohen Durchsatz, eine hohe Trennschärfe und eine geringe mechanische Belastung der zu trennenden Partikel auszeichnet. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, eine Trennvorrichtung zur Implementierung eines derartigen Verfahrens anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß den Patenansprüchen 1 bzw. 17 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung besteht darin, eine Partikeltren­ nung in einem fluidischen Mikrosystem durchzuführen, in dem die zu trennenden Partikel zunächst einzeln oder gruppenweise in einer Vielzahl von Funktionselementen auf der Basis von Feldkäfigen oder anderen geeigneten Feldbarrieren durch nega­ tive Dielektrophorese positioniert und an dieser Beobach­ tungsposition (oder: in diesem Beobachtungsfeld) vermessen werden. Beim Vermessen werden vorbestimmte Eigenschaften der zu trennenden Partikel und dementsprechend die Positionen der Partikel ermittelt, die aus dem Gemisch zu trennen sind bzw. die Positionen der Partikel, die zum Restgemisch gehören. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden die abzutrennen­ den Partikel auch Zielpartikel und die zum übrigen Gemisch gehörenden Partikel Restpartikel genannt. Um die Ziel- oder Restpartikel in eine benachbarte Kanalstruktur des Mikrosys­ tems zu übertragen, werden die Ziel- oder Restpartikel nach der Vermessung einzeln oder simultan einer Laserbestrahlung zur Bildung jeweils eines optischen Käfigs unterzogen. Die Laserbestrahlung kann hierbei innerhalb eines Feldkäfigs, an einer Feldbarriere oder in Fließrichtung unmittelbar hinter einem Feldkäfig oder einer Feldbarriere erfolgen. Dementspre­ chend werden die Ziel- oder Restpartikel zusätzlich zu den elektrischen Feldkräften auch optischen Kräften ausgesetzt. Je nach Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Übertragung der Ziel- oder Restpartikel durch Verschiebung der optischen Käfige in die benachbarte Kanalstruktur oder durch Öffnen des elektrischen Feldkäfige hin zur benachbarten Kanalstruktur bei gleichzeitigem Festhalten der optischen Käfige. Diese Übertragung kann auch für mehrere Ziel- oder Restpartikel gleichzeitig erfolgen. Die Zielpartikel werden entsprechend in der benachbarten oder in der ursprünglichen Kanalstruktur des Mikrosystems gesammelt und weiter bearbeitet.

Gemäß einer Grundform der Erfindung erfolgt ein Verteilen der Ziel- bzw. Restpartikel in zwei Gruppen. Durch stufenweises Wiederholen der Trennung jeweils unter Bezug auf andere Parti­ keleigenschaften kann auch ein Sortieren in mehrere Ziel- bzw. Restpartikelgruppen erfolgen.

Eine Vorrichtung zur Partikeltrennung in fluidischen Mikrosy­ stemen umfaßt erfindungsgemäß eine erste Kanalstruktur mit Elektrodeneinrichtungen zur Bildung einer Vielzahl von Funkti­ onselementen (z. B. dielektrische Feldkäfige) eine benachbarte, zweite Kanalstruktur, die an den Positionen der Funktionsele­ mente mit der ersten Kanalstruktur über Öffnungen verbunden ist, eine Lasereinrichtung, die zur Bildung optischer Käfige in jedem dielektrischen Feldkäfig ausgebildet ist, und eine Lichtmodulatoreinrichtung, mit der in jeder vorgegebenen Posi­ tion der jeweilige optische Käfig einzeln ein- bzw. ausge­ schaltet werden kann.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Übertragung der Zielpartikel durch Einschalten der optischen Käfige in oder hinter den Feldkäfigen oder Feldbarrieren mit den Zielpartikeln, Einfangen der Zielpartikel in den optischen Käfigen und Verschieben der optischen Käfige in die zweite Kanalstruktur, während die Restpartikel in der ersten Kanal­ struktur bleiben. Die zweite Kanalstruktur liegt dabei entwe­ der in y-Richtung parallel seitlich zu der ersten (relativ zur Fließrichtung des Partikelstroms) versetzt. In diesem Fall geschieht das Verschieben der in den optischen Käfigen gehal­ tenen Partikel durch Verschieben der Vorrichtung in xy- Richtung relativ zur optischen Achse des Laserstrahls. Oder die zweite Kanalstruktur liegt in z-Richtung entlang der opti­ sche Achse über der ersten Kanalstruktur. In diesem Fall ge­ schieht das Verschieben der Partikel in die zweite Ebene durch Fokusverstellung der optischen Käfige.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die Zielpartikel ebenfalls in den jeweiligen dielektrischen Feld­ käfigen in optischen Käfigen gehalten, während die Restparti­ kel in den übrigen dielektrischen Feldkäfigen unbeleuchtet und somit frei von optischen Kräften bleiben. Zur Partikeltrennung werden sämtliche Feldkäfige derart verstimmt, daß dielektri­ sche Abstoßungskräfte ausgebildet werden, die auf die Partikel in den Feldkäfigen hin zu der zweiten Kanalstruktur gerichtet sind. Darauf hin werden die Restpartikel in die zweite Kanal­ struktur übertragen, während die Zielpartikel unter Wirkung der optischen Kräfte trotz der Feldkäfigverstimmung in der ersten Kanalstruktur verbleiben.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Mit dem erfin­ dungsgemäßen Prinzip des seriellen oder parallelen Vermessens einer Vielzahl von Partikeln mit einer anschließenden paralle­ len Übertragung der Zielpartikel wird der Durchsatz der Parti­ keltrennung im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken erheb­ lich erhöht. Die Vermessung der Partikel in den dielektrischen Feldkäfigen kann schonend ohne nachteilige. Auswirkungen auf die Partikel durchgeführt werden. Für die Vermessung steht genügend Zeit zur Verfügung, um die jeweils gesuchten Eigenschaften der Partikel zuverlässig zu ermitteln. Insbesondere das Aussortieren von selten vorkommenden Partikeln in einer großen Ausgangspopulation kann so mit hoher Zuverlässigkeit erfolgen, da alle Partikel einzeln adressierbar sind. Die dielektrischen Feldkäfige oder Feldbarrieren trennen die ein­ zelnen Partikel während der Prozedur räumlich voneinander. Die optischen Käfige ermöglichen ein Erfassen einzelner Partikel ohne Übersprechen auf andere Partikel. Damit wird die Trenn­ schärfe der Partikeltrennung erheblich verbessert. Die Vermes­ sung kann sich auf elektrische und/oder optische Eigenschaften der Partikel beziehen. Die Erfindung ist mit beliebigen Parti­ keln natürlichen oder synthetischen Ursprungs implementierbar, die in fluidischen Mikrosystemen manipulierbar sind. Ein wei­ terer Vorteil besteht in der Kompatibilität des Trennverfah­ rens mit der verfügbaren Mikrosystemtechnik.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersicht­ lich. Es zeigen:

Fig. 1: eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer erfindungsgemäßen Trennvorrichtung,

Fig. 2: eine schematische Seitenansicht eines Mikrosystems gemäß Fig. 1,

Fig. 3: eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer weiteren erfindungsgemäßen Trennvorrichtung,

Fig. 4: eine schematische Seitenansicht auf ein Mikrosystem gemäß Fig. 3,

Fig. 5: eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer zweidimensionalen, flächigen Matrixanordnung von Feldkäfigen und einem für die erfindungsgemäße Ausführung typi­ schen Strömungsprofil,

Fig. 6: eine schematische Draufsicht eines Mikrosystems mit einer zweidimensionalen, flächigen Matrixanordnung von Feld­ barrieren, und

Fig. 7: eine schematische Draufsicht auf einen herkömmli­ chen Einzelpartikelverteiler (Stand der Technik).

Eine erste Ausführungsform der Erfindung, die in den Fig. 1 und 2 illustriert ist, basiert auf der Kombination von dielek­ trischen Feldkäfigen mit verstellbaren optischen Käfigen. Eine erfindungsgemäße Trennvorrichtung 200, die in ein fluidisches Mikrosystem 100 integriert ist, umfaßt eine Vielzahl dielek­ trischer Feldkäfige 30, in denen mit der Lasereinrichtung 40 und der Optik 42 jeweils ein optischer Käfig mit verstellbarem Fokus 41 gebildet ist. Das Bezugszeichen 43 weist auf einen Lichtmodulator, mit dem die optischen Käfige in den Feldkäfi­ gen 30 selektiv ein- bzw. ausgeschaltet werden können.

Die Erzeugung optischer Käfige und deren Verwendung zur Mani­ pulierung mikroskopisch kleiner Partikel ist an sich bekannt (s. z. B. A. Ashkin et al. in "Nature", Bd. 330, 1987, S. 796 ff., und G. Weber et al in "International Review of Cytology", Bd. 133, 1992, S. 1 ff.). Einzelheiten des Laser­ betriebs (z. B. Leistung, Wellenlänge etc.) und der Strahlfo­ kussierung können bei der Realisierung des erfindungsgemäßen Systems auf der Grundlage der bekannten Techniken an die kon­ krete Trennaufgabe angepaßt werden.

Das Mikrosystem 100 umfaßt mindestens zwei Kanalstrukturen 10, 20. Die Kanalstrukturen 10, 20 umfassen jeweils Mikroka­ näle oder Mikrokammern mit anwendungsabhängig gewählter Ge­ stalt. Beim dargestellten Beispiel sind beispielsweise zwei in Betriebsfunktion übereinander angeordnete Kanäle vorgese­ hen. Sie können aber auch nebeneinander angeordnet sein. Die Kanäle sind aus Kunststoff-, Glas oder Halbleitermaterialien mit aus der Mikrosystemtechnik an sich bekannten Verfahren hergestellt und dazu ausgelegt, von Flüssigkeiten mit suspen­ dierten Partikeln durchströmt zu werden. Die Kanäle besitzen charakteristische Dimensionen, die in Abhängigkeit von der Anwendung so gewählt sind, daß ein unbehinderter Suspensions­ durchsatz möglich ist. Dient das Mikrosystem beispielsweise der Manipulierung biologischer Zellen (charakteristische Grö­ ße: 10 µm), so besitzt jeder Kanal einen typischen Quer­ schnitt, der größer als 10 µm ist und beispielsweise bis zu 50 µm beträgt. Zum Trennen synthetischer Partikel (beads), zum Beispiel bei Anwendungen in der kombinatorischen Chemie, können die Kanäle aber auch charakteristische Querschnittsdi­ mensionen im Bereich von 100 bis 200 µm besitzen. Um eine op­ tische Partikelvermessung in den Feldkäfigen zu gewährlei­ sten, werden die Wände des Mikrosystems 100 entsprechend min­ destens teilweise transparent gestaltet.

In der ersten Kanalstruktur 10 des Mikrosystems 100 ist eine Vielzahl von Feldkäfigen 30 gebildet. Jeder Feldkäfig 30 um­ faßt eine Gruppe von schematisch dargestellten Mikroelektroden 31, die an den Deck- und Bodenflächen der jeweiligen Kanal­ struktur angebracht sind. Die Mikroelektroden 31 sind dazu ausgelegt, mit Hochfrequenzfeldern derart beaufschlagt zu wer­ den, daß sich zwischen den Mikroelektroden 31 eine Feldvertei­ lung ergibt, in der auf dielektrische Partikel Polarisations­ kräfte erzeugt werden, die die Partikel im Inneren des Feldkä­ figs halten. Einzelheiten des Aufbaus und der Ansteuerung von dielektrischen Feldkäfigen und Feldbarrieren sind an sich be­ kannt (s. z. B. G. Fuhr et al. in "Electromanipulation of Cells", CRT Press Inc., 1996, S. 259 ff.).

Im Mikrosystem 100 ist ferner eine Ladeeinrichtung 50 vorgese­ hen, die zur Verteilung von Partikeln auf die Feldkäfige 30 der Trennvorrichtung 200 ausgelegt ist. Die Ladeeinrichtung 50, deren Funktion im einzelnen unten erläutert wird, ist je­ doch kein zwingendes Merkmal der Erfindung und kann alternativ auch durch andere Lade- oder Aufreihglieder ersetzt werden.

Die Beladung der Beobachtungspositionen oder -felder kann beispielsweise auch passiv durch Transport der Partikelsus­ pension über den laminaren Flüssigkeitsstrom vorgenommen wer­ den. Das Strömungsprofil in den Mikrokanälen der Vorrichtung ist nicht parabolisch, sondern verläuft über den größten Teil des Kanals - mit Ausnahme der äußersten Randbereiche - gerad­ linig (siehe Fig. 5), da der Kanal erheblich breiter ist, als hoch. So werden die Partikel über den größten Teil des Kanals gleichmäßig schnell transportiert und die Feldkäfige oder Feldbarrieren werden statistisch gleichmäßig beladen. Ablen­ kelektroden 63 am Rand des Kanals dienen dazu, Partikel aus den strömungsberuhigten Randzonen des Kanals in Zonen mit gleichförmiger Strömung zu befördern. Die Ablenkelektroden können dabei auch Teil von Feldkäfig- oder Feldbarrierenelek­ troden sein. Sollte eine Beobachtungsposition einmal unbe­ setzt bleiben, ist dies für das weitere Verfahren unerheb­ lich.

Die Kanalstrukturen 10, 20 sind, abgesehen von Öffnungen 11 im Bereich jedes Feldkäfigs 30, durch eine durchgehende Wandung voneinander getrennt. Die Aufgabe des Trennverfahrens besteht nun darin, ein in der ersten Kanalstruktur 10 entsprechend der Pfeilrichtung A eingeströmtes Partikelgemisch 1 in Zielparti­ kel 2, die bei dieser Ausführungsform der Erfindung in die zweite Kanalstruktur 20 übertragen werden sollen, und Restpar­ tikel 3 zu trennen, die in der ersten Kanalstruktur 10 ver­ bleiben sollen. So werden zunächst die Partikel 2 einzeln oder gruppenweise z. B. unter Verwendung der Ladeeinrichtung 50 in die in einer Reihe (siehe Fig. 1) angeordneten Beobachtungspo­ sitionen (Feldkäfige oder Feldbarrieren) 30 geladen. Die Lade­ einrichtung 50 umfaßt zwei gerade, an den oberen und unteren Kanalseiten angeordnete, streifenförmige Mikroelektroden, die bei Beaufschlagung mit hochfrequenten elektrischen Feldern un­ ter Wirkung negativer Dielektrophorese Abstoßungskräfte auf die anströmenden Teilchen ausüben und damit eine schräg zur Strömungsrichtung (Pfeil A) verlaufende Feldbarriere bilden. Der erste anströmende Partikel 1a läuft bei eingeschalteter Feldbarriere zunächst entlang der Pfeilrichtung B bis zum Ende der Ladeeinrichtung 50 und dann in den Feldkäfig 30a (siehe Fig. 2). In diesem Zustand ist der Feldkäfig 30a auf der stromaufwärts gelegenen Seite offen, so daß der Partikel frei bis zum Mittelpunkt 31a des Feldkäfigs 30a gelangt. Sobald das Eintreffen des Partikels zum Beispiel mit optischen oder elek­ trischen Mitteln erfaßt ist, wird der Feldkäfig 30a auch auf der stromaufwärts gelegenen Seite geschlossen. Die übrigen Feldkäfige 30b, 30c, . . . werden analog durch Einströmen von Partikeln beladen. Die Ladeeinrichtung 50 wird synchron zum Beladungszustand der Feldkäfige betätigt. An der Ladeeinrich­ tung 50 sind ggf. weitere Aufreihglieder, Feldkäfige oder Bar­ rieren zur Anordnung der anströmenden Partikel vorgesehen.

Wenn alle Feldkäfige mit Partikeln beladen sind, erfolgt die Vermessung zur Bestimmung physikalischer und/oder biologisch- chemischer Parameter der Partikel. Diese Vermessung erfolgt beispielsweise auf optischem Wege (zum Beispiel Fluoreszenz- oder Streulichtmessung) und/oder auf elektrischem Wege (zum Beispiel Elektrorotationsmessung in den Feldkäfigen). Es kann auch vorgesehen sein, mit der Suspensionsflüssigkeit im Mikro­ system Zusatzstoffe zu den Feldkäfigen zu spülen, deren Wech­ selwirkung mit den gehalterten Partikeln optisch und/oder elektrisch erfaßt wird. Die Feldkäfige, in denen sich die Zielpartikel mit vorbestimmten Parametern befinden, werden zur Vorbereitung des folgenden Trennschrittes erfaßt.

Zur gleichzeitigen Übertragung der Zielpartikel in die zweite Kanalstruktur 20 wird der Lichtmodulator 43 derart betätigt, daß eine Laserbestrahlung in die erfaßten Feldkäfige mit den Zielpartikeln freigegeben wird. Durch diese Bestrahlung wird jeweils ein optischer Käfig gebildet, dessen Fokus 41 mit dem Zentrum (z. B. 31a) des dielektrischen Feldkäfigs 30 überein­ stimmt. Die Zielpartikel werden in den optischen Käfigen wie mit einer Laserpinzette gefangen. Anschließend wird gleichzei­ tig für alle optischen Käfige der Fokus 41 durch die Öffnung 11 zwischen den Kanalstrukturen (Pfeil C) verschoben. Diese Verschiebung erfolgt beispielsweise durch Verstellung der Op­ tik 42. Sobald die Zielpartikel mit dem verschobenen Fokus in die zweite Kanalstruktur 20 übertragen worden sind, wird mit dem Lichtmodulator 43 die Laserstrahlung abgeschaltet. Dadurch werden die Zielpartikel freigegeben, um einer weiteren Bewe­ gung und/oder Bearbeitung in der zweiten Kanalstruktur 20 un­ terzogen zu werden. Simultan werden die Feldkäfige 30 in der ersten Kanalstruktur 10 auf der stromabwärts gelegenen Seite geöffnet, so daß die Restpartikel 3 ebenfalls freigegeben wer­ den. Die Ziel- bzw. Restpartikel 2, 3 können jeweils einer oder mehreren weiteren Trennungen nach dem erläuterten Prinzip unterzogen werden, um eine Sortierung in eine Vielzahl von Partikelgruppen vorzunehmen.

Die Trennvorrichtung 200 umfaßt insbesondere die Lasereinrich­ tung 40, deren Licht mit der Optik 42 zur Bildung des Fokus 41 gebündelt wird, und den Lichtmodulator 43. Die Lasereinrich­ tung 40 umfaßt eine Laserdiodenanordnung oder einen einzelnen Laser mit einer Strahlaufweitungsoptik. Es können auch mehrere Laserstrahlen zur Bildung jeweils eines optischen Käfigs vor­ gesehen sein. Bei der Laserdiodenanordnung sind eine Vielzahl von Laserdioden entsprechend der Position der Feldkäfige oder Feldbarrieren im Mikrosystem ausgerichtet. Beim Einsatz eines einzelnen Lasers hingegen wird die gesamte Anordnung der Feldkäfige mit dem einzelnen aufgeweiteten Strahl beleuchtet. Die Lasereinrichtung 40 wird vorzugsweise bei einer Wellenlänge betrieben, die sich zur Ausbildung effektiver optischer Käfige bei möglichst geringer Lichtleistung besonders gut eignet. Bei den meisten Anwendungen wird die Wellenlänge im infraroten oder roten Spektralbereich gewählt.

Der Lichtmodulator 43 ist ein Transmissions- oder Reflektions- Modulator. Als Transmissions-Modulator sind an sich bekannte Mikroshutteranordnungen verwendbar, bei denen eine Vielzahl von Mikroshuttern entsprechend der Position der Feldkäfige ausgerichtet ist. Es werden mechanische Mikroshutter oder schaltbare Flüssigkristall-Anordnungen verwendet. Als Reflek­ tions-Modulator kann eine schaltbare Matrix von Spiegelelemen­ ten (sog. Digital Mirror Array) verwendet werden. Alternativ ist es bei Ausbildung der Lasereinrichtung 40 mit einer Laser­ diodenanordnung auch möglich, den Lichtmodulator in die Lasereinrichtung 40 zu integrieren. In diesem Fall ist der Lichtmodulator eine Steuerschaltung, mit der die einzelnen Laserdioden individuell ein- bzw. ausgeschaltet werden können.

Die Optik 42 umfaßt eine Mikrolinsen-Anordnung aus einer Viel­ zahl von Mikrolinsen, die entsprechend den Positionen der Feldkäfige ausgerichtet sind. Die Mikrolinsenanordnung ist zur Verstellung des Fokus 41 vertikal beweglich angebracht, wie es an sich von Laserpinzetten bekannt ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Vermessung der Partikel in den Feldkäfigen unter Verwendung einer optischen Detektoreinrichtung, die beispielsweise durch einen Array-Detektor auf der Basis von CCD-, CID- (Charge Injection Device), CMOS-, APD- (Avalanche Photodiode) oder PD- (Photodiode) Anordnungen gebildet ist. Die Detektoreinrichtung wird vorzugsweise auf der relativ zur Lasereinrichtung 40 gegenüber­ liegenden Seite des Mikrosystems 100 angebracht. Die Detektor­ elemente der Detektoreinrichtung sind vorzugsweise für eine wellenlängenselektive Lichterfassung ausgelegt. Hierzu sind Filtereinrichtungen, die ggf. in die Detektoreinrichtung inte­ griert sind, vorgesehen. Die wellenlängenselektive Messung dient insbesondere der Fluoreszenzmessung an den Partikeln.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die ebenfalls mit der in den Fig. 1 und 2 illustrierten Anordnung implemen­ tiert werden kann, basiert auf der Kombination optischer Käfi­ ge mit verstellbaren dielektrischen Feldkäfigen. Bei dieser Gestaltung werden zunächst, wie oben beschrieben wurde, die Partikel des Ausgangsgemisches 1 in den Feldkäfigen 30 posi­ tioniert und vermessen. Um nun die Ziel- und Restpartikel von­ einander zu trennen, wird in Abhängigkeit vom Meßergebnis für eine Gruppe von Feldkäfigen 30, die beispielsweise die Ziel­ partikel enthält, mit dem Lichtmodulator 43 die Laserbestrah­ lung freigegeben. Dadurch wird jeder Zielpartikel in einem optischen Käfig gefangen. Zur Trennung der Partikel werden nun sämtliche Feldkäfige 30 derart verstimmt, daß eine resultie­ rende dielektrische Kraft auf die Partikel durch die Öffnung 11 hin in die zweite Kanalstruktur 20 ausgeübt wird. Dieser Kraftwirkung folgen alle Partikel, die nicht zusätzlich durch den optischen Käfig gehaltert werden, so daß sich eine ent­ sprechende Sammlung in der zweiten Kanalstruktur 20 ergibt. Die beleuchteten Partikel (z. B. Zielpartikel) bleiben in die­ sem Fall in der ersten Kanalstruktur 10. Nach Freigabe der optischen bzw. dielektrischen Kräfte werden die Ziel- bzw. Restpartikel in der ersten bzw. zweiten Kanalstruktur 10, 20 weiter transportiert.

Eine weitere abgewandelte Ausführungsform der Erfindung, die entsprechend einem der beiden oben genannten Kombinationsprin­ zipien betrieben werden kann, ist in den Fig. 3 und 4 illu­ striert. Das Mikrosystem 100 enthält wiederum zwei übereinan­ der angeordnete Kanalstrukturen 10, 20 mit zumindest teilweise transparenten Kanalwänden. Auf den inneren Deck- bzw. Bodenflächen der Kanalstrukturen sind anwendungsabhängig gestaltete Mikroelektroden zur Erzeugung von Feldkäfigen und/oder Barrieren ausgebildet. Im Unterschied zu der in Fig. 1 ge­ zeigten Feldkäfigreihe umfaßt die Trennvorrichtung 200 bei dieser Ausführungsform eine flächige Matrixanordnung von Feldkäfigen 30 in geraden Reihen und Spalten. So sind mehrere Reihen von Beobachtungspositionen in Strömungsrichtung hin­ tereinander angeordnet. Dies hat einerseits den Vorteil, daß individuelle Partikel mehrmals hintereinander bewertet werden können, was die Zuverlässigkeit der Analyse und damit auch der Trennung beträchtlich verbessert. Auf der anderen Seite erhöht ein solches zweidimensionales Array an Beobachtungs­ feldern erheblich den Durchsatz an Partikeln, die gleichzei­ tig bewertet werden.

Eine weitere abgewandelte Ausführungsform der Erfindung hin­ sichtlich der Form der Elektroden zur Ausbildung von Feldkä­ figen 60 zeigt die Fig. 5. Hier werden die einzelnen Feldkä­ fige durch Zinken- oder Kamm-artige Elektroden (61a, 61b, 61c . . .) gebildet. Die Partikel 62a, 62b, 62c . . . ordnen sich in einer solchen Anordnung in den Zwischenräumen der Zinken an. Diese Elektrodenform hat vor allem Vorteile hinsichtlich einer einfachen Elektrodenprozessierung mit verbundenen Zu­ leitungen.

Eine weitere Abwandlung der Erfindung ist in Fig. 6 demon­ striert. Hier werden keine vollständigen Feldkäfige geformt, sondern Feldbarrieren 70 mithilfe von Elektroden, wie bei 70a, 70b, 70c . . . gezeigt. Die Partikel 71a, 71b, 71c . . . wer­ den durch einen stetigen Flüssigkeitsstrom 72 gegen die die­ lektrischen Feldbarrieren gedrückt und so an den jeweiligen Beobachtungspositionen gehalten.

Erfindungsgemäß können verschiedene Richtungen der Bestrahlung durch die Lasereinrichtung 40 vorgesehen sein. Gemäß Fig. 4 erfolgt die Bestrahlung von der Unterseite des Mikrosystems, d. h. von der Seite der ersten Kanalstruktur 10 her. Dement­ sprechend besteht mindestens der Kanalboden 12 aus einem transparenten Material. Eine optische Vermessung der in den Feldkäfigen 30 gefangenen Partikel kann ebenfalls von der Un­ terseite des Mikrosystems 100 her oder auch von der entgegen­ gesetzten Seite her erfolgen. Das Licht von der Lasereinrich­ tung 40 wird wiederum über einen Lichtmodulator 43 und über eine Optik 42 in die Feldkäfige 30 fokussiert.

Bei der in den Fig. 3 und 4 gezeigten Ausführungsformen ist als Ladeeinrichtung 50 eine Aufreihung von Feldkäfigen vorge­ sehen. Die in der ersten Kanalstruktur 10 anströmenden Parti­ kel 1 (zu trennendes Gemisch) werden zunächst in der Ladeein­ richtung 50 positioniert. Sobald jeder Feldkäfig 51 der Lade­ einrichtung 50 einen Partikel enthält, wird die gesamte Reihe der Feldkäfige 51 und die benachbarte Reihe der Feldkäfige 30a so angesteuert, daß die Partikel in die Feldkäfige 30a über­ nommen werden. Anschließend werden die Feldkäfige 51 der Lade­ einrichtung 50 erneut beschickt. Wiederum werden die Partikel an die Feldkäfige 30a und von dieser zur Reihe der Feldkäfige 30b weitergegeben, bis schrittweise alle Reihen der Feldkäfige 30 gefüllt sind. Anschließend erfolgt die Vermessung und die Trennung der Partikel nach den oben erläuterten Prinzipien.

Ein wichtiger Vorteil der in den Fig. 1 bis 6 gezeigten Ausführungsformen der Erfindung besteht darin, daß sämtliche dielektrischen Feldkäfige simultan angesteuert werden. Dadurch werden Störfelder oder ein Übersprechen zwischen den Feldkäfi­ gen vermieden, wodurch die Genauigkeit der erfindungsgemäßen Trennung insbesondere im Vergleich zu der unter Bezug auf Fig. 5 erläuterten herkömmlichen Technik erheblich verbessert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Partikeltrennung ausschließlich unter der Wirkung optischer Kräfte. Bei dieser (nicht dargestellten) Ausführungsform wer­ den die zu trennenden Partikel nicht in dielektrischen Feldkä­ figen, sondern an mechanisch ausgebildeten Halterungen im Mi­ krosystem positioniert. Derartige Halterungen werden bei­ spielsweise durch Löcher in der Kanalwandung gebildet. Nach der Partikelvermessung wird die Gruppe der Zielpartikel in entsprechende optische Käfige aufgenommen und mit diesen von den Halterungen weg in die benachbarte Kanalstruktur gehoben.

Bei einer weiteren Abwandlung des oben erläuterten Trennprin­ zips ist vorgesehen, daß drei Kanalstrukturen zueinander be­ nachbart angeordnet sind, wobei das Positionieren und Vermes­ sen der Partikel in der mittleren Kanalstruktur und das Über­ tragen von Zielpartikeln in die benachbarten Kanalstruktur erfolgt, indem zunächst eine erste Gruppe von Zielpartikeln z. B. in die obere Kanalstruktur und anschließend eine weitere Gruppe von Zielpartikeln in die untere Kanalstruktur übertra­ gen wird.

Claims (26)

1. Verfahren zur Partikeltrennung, bei dem aus einem Partikel­ gemisch (1) aus einer Vielzahl von Partikeln in einem fluidi­ schen Mikrosystem Zielpartikel (2) mit vorbestimmten Parti­ keleigenschaften von Restpartikeln (3) getrennt werden, mit den Schritten:

• - Positionieren von Partikeln des Partikelgemisches (1) in Be­ obachtungsfeldern an Funktionselementen (30) in einer ersten Kanalstruktur (10) des Mikrosystems (100), wobei die Funkti­ onselemente Elektrodenanordnungen aufweisen, an denen inhomo­ gene elektrische Felder erzeugt werden, die abstoßende oder anziehende dielektrophoretische Kräfte auf die Partikel aus­ üben,
• - Vermessen der Partikel in den Beobachtungsfeldern zur Er­ mittlung der Partikeleigenschaften und Erfassen der Beobach­ tungsfelder, die die Zielpartikel (2) oder die Restpartikel (3) enthalten,
• - Ausbilden optischer Käfige an den Beobachtungsfeldern, die die Ziel- oder Restpartikel enthalten, unter Verwendung einer Lichtmodulatoreinrichtung, mit der die optischen Käfige ein­ zeln ein- oder ausgeschaltet werden können, und
• - gleichzeitiges Übertragen der Ziel- oder Restpartikel von ihren jeweiligen Beobachtungsfeldern in eine benachbarte zwei­ te Kanalstruktur (20) des Mikrosystems, wobei optische Kräfte der optischen Käfige und dielektrische Polarisationskräfte der Funktionselemente (30) zusammenwirken.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zum Übertragen der Par­ tikel die Fokuspunkte (41) der optischen Käfige mit den Ziel- oder Restpartikeln simultan von der ersten in die zweite Kanalstruktur (20) verschoben werden, während die jeweils übrigen Partikel in der ersten Kanalstruktur (10) bleiben.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Funktionselemente als dielektrische Feldkäfige (30) verwendet werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem zum Übertragen der Par­ tikel die dielektrischen Feldkäfige (30) einseitig hin zur zweiten Kanalstruktur (20) geöffnet und die Ziel- oder Rest­ partikel mit den optischen Käfigen in den dielektrischen Feld­ käfigen gehalten werden, während sich die jeweils übrigen Par­ tikel in die zweite Kanalstruktur (20) bewegen.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zum Vermessen der Partikel optische Messungen und/oder elek­ trische Messungen durchgeführt werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem die optischen Messungen Fluoreszenz- und Streulichtmessungen umfassen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem zu den optischen Mes­ sungen eine Lasereinrichtung verwendet wird, die auch zur Bil­ dung der optischen Käfige ausgelegt ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem die elektrischen Mes­ sungen Elektrorotationsmessungen an den Partikeln umfassen.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem als Lichtmodulatoreinrichtung zur Bildung der optischen Käfige eine Mikroshutteranordnung und/oder eine schaltbare Matrix aus Spiegelelementen an den jeweils erfaßten Funktionselementen oder dielektrischen Feldkäfigen (30) mit den Ziel- oder Rest­ partikeln betätigt wird.

10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Partikel in einer Flüssigkeit suspendiert sind, die mit einem Flüssigkeitstransportsystem durch das Mikrosystem befördert wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei der als Flüssig­ keitstransportsystem eine Spritzenpumpe, eine peristaltische Pumpe, eine Membranpumpe, eine Zahnradpumpe, eine elektroosmo­ tische Pumpe und/oder eine piezolektrische Pumpe verwendet werden.

12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Partikel Strömungskräften und elektrischen Kräften der Elektrodenanordnungen ausgesetzt sind, um die Partikel aufge­ reiht und/oder vereinzelt an die Beobachtungsfelder zu füh­ ren.

13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Ziel- oder Restpartikel (2, 3) nach der Partikeltren­ nung in verschiedene Auffangeinheiten überfördert werden.

14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Partikel synthetische Partikel, biologische Zellen, Zellverbände, Zellbestandteile, Makromoleküle, Makromolekülver­ bände, Bakterien, Viren, Alginat-Beads oder Verbundpartikel aus synthetischen und natürlichen Teilen umfassen.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem die Partikel sphäri­ sche Polymere (Beads) aus organischem (z. B. Polystyrol, Algi­ nat) oder anorganischem (z. B. Silikagel) Material, eukarioti­ sche oder prokariotische Zellen, Zellverbände und/oder Aggre­ gate aus diesen umfassen, wobei die Aggregate sowohl aus glei­ chen als auch unterschiedlichen Spezies bestehen können.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem die Partikel vor dem Einbringen in das Mikrosystem oder im Mikrosystem mit einer magnetischen oder einer fluoreszierenden Sondensubstanz mar­ kiert werden.

17. Trennvorrichtung zum Trennen eines Partikelgemisches (1) aus Zielpartikeln (2) mit vorbestimmten Partikeleigenschaften und Restpartikeln (3) in einem fluidischen Mikrosystem, die umfaßt:

• - eine erste Kanalstruktur (10) mit einer Vielzahl von Funkti­ onselementen (30) und einer Ladeeinrichtung (50) zum Positio­ nieren von Partikeln des Partikelgemisches (1) an den Funkti­ onselementen (30), wobei die Funktionselemente Elektrodenan­ ordnungen aufweisen, die zur Erzeugung inhomogener elektri­ scher Felder eingerichtet sind, mit denen abstoßende oder an­ ziehende dielektrophoretische Kräfte auf die Partikel ausgeübt werden können,
• - eine zweite Kanalstruktur (20), die an den Positionen der Funktionselemente (30) mit der ersten Kanalstruktur (10) über Öffnungen (11) verbunden ist,
• - eine Lasereinrichtung (40), die zur Bildung jeweils eines optischen Käfigs an jedem Funktionselement (30) ausgelegt ist, und
• - einen Lichtmodulator (43), mit dem die optischen Käfige an den Funktionselementen (30) ein- oder ausgeschaltet werden können.

18. Trennvorrichtung gemäß Anspruch 17, bei der eine verstell­ bare Optik (42) vorgesehen ist, mit der die Fokuspunkte (41) der optischen Käfige von den Funktionselementen (30) in der ersten Kanalstruktur (10) in die zweite Kanalstruktur (20) verstellbar sind.

19. Trennvorrichtung gemäß Anspruch 17 oder 18, bei der eine Meßvorrichtung zur Ermittlung optischer und/oder elektrischer Partikeleigenschaften vorgesehen ist.

20. Trennvorrichtung gemäß Anspruch 19, bei der die Meßvor­ richtung eine Detektoreinrichtung umfaßt, die relativ zur Lasereinrichtung (40) auf der entgegengesetzten Seite des Mikro­ systems (100) angeordnet ist.

21. Trennvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20, bei der der Lichtmodulator (43) eine Mikroshutteranordnung oder eine schaltbare Matrix von Spiegelelementen umfaßt.

22. Trennvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei der die Elektrodenanordnungen dielektrische Feldkäfige (30, 60) oder dielektrische Feldbarrieren (70) bilden.

23. Trennvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22, die ein Flüssigkeitstransportsystem auf der Basis einer Spritzen­ pumpe, einer peristaltischen Pumpe, einer Membranpumpe, einer Zahnradpumpe, einer elektroosmotischen Pumpe und/oder einer piezoelektrischen Pumpe aufweist.

24. Trennvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23, bei dem die Meßvorrichtung einen optischen Array-Detektor auf der Basis eines CCD-, CID (Charge Injection Device)-, CMOS-, APD (Avalanche-Photodiode)- oder PD (Photodiode)-Arrays umfaßt.

25. Trennvorrichtung gemäß Anspruch 24, bei der der Array- Detektor eine Vielzahl von Detektorelementen umfasst, die zu­ mindest zum Teil mit wellenlängenselektiven Schichten versehen sind.

26. Verwendung eines Verfahrens oder einer Trennvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Trennung von Par­ tikelgemischen in fluidischen Mikrosystemen.