EP1740296B1 - Verfahren zur herstellung einer lösung, zugehörige anordnung sowie anwendungen des verfahrens und der anordnung - Google Patents

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EP1740296B1 EP05738068A EP05738068A EP1740296B1 EP 1740296 B1 EP1740296 B1 EP 1740296B1 EP 05738068 A EP05738068 A EP 05738068A EP 05738068 A EP05738068 A EP 05738068A EP 1740296 B1 EP1740296 B1 EP 1740296B1
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation

Definitions

  • the invention relates to a method and associated arrangement for producing a solution of at least one solid in a solvent.
  • the invention relates to applications of the arrangement or the method, in particular in the chemical investigations.
  • solids are dissolved in a solvent.
  • Such solids are, for example, reagents which are stored as a dry mixture with negligible vapor pressure and form a storage-stable substance at room temperature. Only when needed, they are resolved for the intended use in the analysis.
  • Such a device is used for example in the WO 02/0072262 A1 described.
  • an analysis device designed as an easy-to-handle chip card, are stored in the dry reagents as solids and dissolved in a solvent as needed.
  • the dry reagents present in the chip card can already be stored in predosed and pre-portioned form for the analysis.
  • a solution with a precisely defined amount of reagent is produced in conjunction with a solvent from a reservoir provided from the pre-portioned reagents.
  • a disposable detector array for real-time fluid analysis in which a liquid sample is automatically analyzed by a disposable sensor and the associated readings are output. It is essential that the analysis reagent is kept ready as a liquid.
  • the preparation of a solution of at least one solid in a solvent can be targeted. It is advantageous that this process can take place in a closed unit and that in this unit the solid is stored.
  • the first solid is a PCR reagent.
  • a second solid may be isolated DNA.
  • DNA is known to be so-called magnetic beads annealed which are suspended in the solvent. They are enriched in a channel or a cavity in which a PCR is to take place.
  • the invention is therefore intended in particular for carrying out the PCR. But other analysis applications that provide solids and solve them as needed are also possible.
  • an examination unit is designated 1.
  • This unit is a so-called cartridge body, which may be part of a portable device.
  • a cavity 2 is present, in which certain reactions can take place.
  • fluidic channels from which a first channel 3 leads to the cavity 2 and a second channel 3 'leads away from the cavity 2. It can be valves or The same may be present with which the Fluidigkanäle 3 and 3 'are lockable at a suitable location.
  • a first solid 5 is stored.
  • the solid 5 is a reagent or a mixture of reagents, wherein the mixture forms a storage-stable substance at room temperature.
  • the solid 5 forms a layer on the bottom of the cavity 2.
  • the surface of the solid 5 is protected by a medium 6 forming a thin film on the solid layer 5.
  • the medium 6 is not soluble in the solvent in which the solid 5 is to be dissolved.
  • Paraffin may advantageously be used as the medium 6, which itself is not soluble in an aqueous solvent. Other insoluble in the solvent media are possible. Instead of a thin film which predominantly covers the first solid 2-dimensionally, a 3-dimensional coating of e.g. spherical solid particles immobilized in the cavity can be used.
  • FIG. 2 It is shown that a solvent 7 flows through the fluidic channel 3 and fills the cavity or flows through it.
  • the protected by the medium 6 solid 5 remains unaffected by the solvent.
  • the protective medium 6 is paraffin in particular, it can be dissolved by heating. This is in FIG. 3 shown. After the melting of the paraffin, the medium 6 no longer has a protective function. It forms, for example, individual beads, which are indicated as 61 and 61 '. On the other hand, the solid has migrated into solution or suspension 8, so that the dissolved reagent is located in cavity 2 for further uses.
  • FIG. 4 otherwise the FIG. 2 corresponds to, such a solvent 17 is introduced into the cavity 2, which contains a second solid 19.
  • the first solid 5 is in the FIG. 4 corresponding Figure 1/2 is protected by the medium 6.
  • the second solid 19 is either dissolved in the solvent or it is present as a suspension.
  • a liquid substance can also be dissolved or present as an emulsion in the solvent.
  • FIG. 5 After heating and melting of the paraffin, the medium 6 no longer has a protective function.
  • FIG. 5 will turn accordingly FIG. 3 Beads 61 and 61 'of the medium formed.
  • a solution or suspension 18 is now formed with the first solid 5 and the second solid 19, which is available for further uses. If the so-called second solid is a liquid, an emulsion will accordingly be formed.
  • First and second solids can be chosen so that they can react with each other after removal of the protective medium and, if necessary, their properties, e.g. Solubility can change.
  • first solid is a PCR reagent and the second solid is DNA
  • PCR reactions can occur in the well.
  • suitable means for thermal cycling are necessary.
  • Paraffin is particularly suitable here as a protective medium, since in the PCR a first heating process is required anyway and thereby melts the paraffin protective layer.
  • hot-start PCR, which prevents the PCR enzyme polymerase from becoming unspecific and therefore disadvantageously effective even below a certain temperature (paraffin melting temperature).
  • the DNA as a second solid is usually bound in the prior art to so-called magnetic beads and is thus present as a suspension.
  • the magnetic bead-bound DNA can be collected by magnetic means and selectively brought into the cavity 2.
  • the above-described method and the associated device are particularly suitable for carrying out a PCR. But also for other applications in biomedical technology, especially if at certain times, especially immediately before an analysis to be carried out, quantitative solutions of individual dry reagents are to be formed, the invention is applicable.
  • Examples of the preparation of defined reagent solutions include an enzyme-label solution, an enzyme-substrate solution or general calibration solutions.

Abstract

Zur Herstellung einer Lösung von mindestens einem Feststoff in einem Lösungsmittel wird der Feststoff in einer Kavität (12) bevorratet. Dabei wird der im Lösungsmittel lösliche Feststoff zunächst in der Kavität mit einem im Lösungsmittel unlöslichen Medium (6) abgedeckt bzw. umhüllt, so dass eine Auflösung des Feststoffes verhindert wird. Anschließend wird das Lösungsmittel der Kavität zugeführt und das im Lösungsmittel unlösliche Medium derart behandelt, dass ein Kontakt zwischen Lösungsmittel und löslichem Feststoff und somit ein Auflösen des Feststoffes im Lösungsmittel ermöglicht wird. Vorteilhafterweise können Lösungen mit zwei und mehr Feststoffen hergestellt werden.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und zugehörige Anordnung zur Herstellung einer Lösung von mindestens einem Feststoff in einem Lösungsmittel. Daneben bezieht sich die Erfindung auf Anwendungen der Anordnung bzw. des Verfahrens, insbesondere in den chemischen Untersuchungen.
  • In der biomedizinischen Technik sollen Feststoffe in einem Lösungsmittel gelöst werden. Solche Feststoffe sind beispielsweise Reagenzien, die als trockenes Gemisch mit vernachlässigbarem Dampfdruck gelagert werden und bei Raumtemperatur eine lagerstabile Substanz bilden. Erst bei Bedarf werden sie zur bestimmungsgemäßen Verwendung bei der Analyse gelöst.
  • Eine derartige Einrichtung wird beispielsweise in der WO 02/0072262 A1 beschrieben. Insbesondere ist dort eine Analyseneinrichtung als leicht handhabbare Chipkarte ausgebildet, in der Trockenreagenzien als Feststoffe gelagert sind und bei Bedarf in einem Lösungsmittel gelöst werden.
  • Wenn vor der eigentlichen bestimmungsgemäßen Verwendung der Trockenreagenzien Spülungsschritte und andere Maßnahmen vorgeschaltet sind, wird gefordert, die Auflösung des im Lösungsmittel löslichen Feststoffes zunächst zu verhindern und erst bei Bedarf die in ihrer Zusammensetzung genau definierte, quantitativ einzustellende Lösung herzustellen. Dies ist insbesondere bei der PCR-Reaktion (Polymerase Chain Reaction) der Fall, bei der zunächst das PCR-Reagenz in der Reaktionskammer geschützt werden muss und erst nach der Zuführung der DNA und deren Aufkonzentration sowie Reinigung freigegeben werden soll.
  • Bei der Analyseeinrichtung gemäß der WO 02/072262 A1 können zur Anwendung in der biochemischen Analytik die in der Chipkarte vorhandenen Trockenreagenzien für die Analyse bereits in vordosierter und vorportionierter Form gelagert sein. Dabei wird in Verbindung mit einem Lösungsmittel aus einem bereitgestellten Reservoir aus den vorportionierten Reagenzien eine Lösung mit einer genau definierten Menge an Reagenz erzeugt. Des Weiteren ist aus der EP 0 434 742 B1 eine wegwerfbare Detektoranordnung für eine Flüssigkeitsanalyse in Realzeit bekannt, bei der eine flüssige Probe automatisch mittels eines Einmalsensors analysiert wird und die zugehörigen Messwerte ausgegeben werden. Wesentlich ist dabei, dass das Analysereagenz als Flüssigkeit bereitgehalten wird.
  • Für medizinische Anwendungen sind weiterhin aus der US 1 572 323 A und der US 1 603 877 Probengehälter bekannt, die einerseits im abgeschlossenen System eine Flüssigkeit und davon zunächst getrennt Reagenzien enthalten. Durch geeignete Maßnahmen können die festen Reagenzien in der Flüssigkeit aufgelöst werden. Des Weiteren ist aus der US 2002/0187560 A1 eine mikrofluidische Einrichtung bekannt, die geeignet ist, um diskrete Flüssigkeitsvolumen miteinander in Kanälen zu kombinieren und einer Probenkammer zuzuführen. Dabei kann die Betätigung dieser mikrofluidischen Einrichtungen pneumatisch oder magnetisch erfolgen. Des Weiteren ist aus der nicht vorveröffentlichten US 2004/0171170 A1 eine Einrichtung mit einer Vielzahl von Kavitäten bekannt, bei denen jeweils zwei Arten von Kavitäten parallel mit Flüssigkeitsvolumen bestückbar sind. Dies bedeutet, dass einzelne Mikrokavitäten jeweils separat über Fluidkanäle mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden sind.
  • Von letzterem Stand der Technik ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren vorzuschlagen, mit der speziell Feststoffe gezielt in Lösung gebracht werden können, und zugehörige Anwendungen anzugeben. Weiterhin soll eine zugehörige Anordnung geschaffen werden.
  • Die Aufgabe ist erfindungsgemäß durch die Maßnahmen des Patentanspruches 1 gelöst. Eine zugehörige Anordnung zur Durchführung des Verfahrens ist Gegenstand des Patentanspruches 14.
  • Weiterbildungen der Anordnung, insbesondere in der Anwendung zur Durchführung einer PCR, sind Gegenstand der abhängigen Sachansprüche.
  • Mit der Erfindung kann die Herstellung einer Lösung von mindestens einem Feststoff in einem Lösungsmittel gezielt erfolgen. Vorteilhaft ist dabei, dass dieser Vorgang in einer abgeschlossenen Einheit erfolgen kann und dass in dieser Einheit der Feststoff bevorratet ist.
  • Bei der Erfindung ist der erste Feststoff beispielsweise ein PCR-Reagenz. Ein zweiter Feststoff kann dagegen isolierte DNA sein. Derartige DNA wird bekanntermaßen an so genannte Magnet-Beads angelagert die im Lösungsmittel suspendiert sind. Sie werden in einem Kanal bzw. einer Kavität angereichert, in der eine PCR stattfinden soll.
  • Die Erfindung ist also insbesondere zur Durchführung der PCR vorgesehen. Aber auch andere Analyseanwendungen, bei denen Feststoffe bereitgestellt und bei Bedarf gelöst werden, sind möglich.
  • Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung anhand der Ausführungsbeispiele in Verbindung mit den Patentansprüchen. Es zeigen
    • Figur 1
    im Schnitt einen Behälter mit einer Kavität, in der ein erster Feststoff gelagert ist, die
    Figuren 2 und 3
    zwei Funktionsschritte der Einrichtung gemäß Figur 1 beim Arbeiten mit einem Feststoff und zugehörigem Lösungsmittel und die
    Figuren 4 und 5
    zwei Funktionsschritte beim Arbeiten mit einer Einrichtung gemäß Figur 1 mit zwei Feststoffen und zugehörigem Lösungsmittel.
  • In den Figuren ist eine Untersuchungseinheit mit 1 bezeichnet. Diese Einheit ist ein so genannter Cartridge-Körper, der Teil einer tragbaren Einrichtung sein kann.
  • Im Cartridge-Körper 1 ist eine Kavität 2 vorhanden, in der bestimmte Reaktionen stattfinden können. Es sind Fluidik-Kanäle vorhanden, von dem ein erster Kanal 3 zur Kavität 2 hinführt und ein zweiter Kanal 3' von der Kavität 2 wegführt. Es können Ventile oder dergleichen vorhanden sein, mit denen die Fluidigkanäle 3 bzw. 3' an geeigneter Stelle abschließbar sind.
  • In der Kavität 2 ist ein erster Feststoff 5 gelagert. Der Feststoff 5 ist ein Reagenz bzw. ein Gemisch von Reagenzien, wobei das Gemisch bei Raumtemperatur eine lagerstabile Substanz bildet. Der Feststoff 5 bildet eine Schicht auf dem Boden der Kavität 2. Die Oberfläche des Feststoffes 5 ist durch ein Medium 6, das einen dünnen Film auf der Feststoffschicht 5 bildet, geschützt. Das Medium 6 ist im Lösungsmittel, in welchem der Feststoff 5 gelöst werden soll, nicht löslich.
  • Als Medium 6 kann vorteilhafterweise Paraffin verwendet werden, welches selbst nicht in einem wässrigen Lösungsmittel löslich ist. Auch andere im Lösungsmittel unlösliche Medien sind möglich. Anstelle eines dünnen Filmes, der den ersten Feststoff vorwiegend 2-dimensional überzieht, kann auch eine 3-dimensionale Umhüllung von z.B. sphärischen FeststoffPartikeln, die in der Kavität immobilisiert sind, verwendet werden.
  • In Figur 2 ist gezeigt, dass ein Lösungsmittel 7 durch den Fluidik-Kanal 3 strömt und die Kavität ausfüllt, bzw. diese durchströmt. Der durch das Medium 6 geschützte Feststoff 5 bleibt vom Lösungsmittel unberührt.
  • Da das schützende Medium 6 insbesondere Paraffin ist, kann es durch Erwärmung gelöst werden. Dies ist in Figur 3 dargestellt. Nach dem Aufschmelzen des Paraffins hat das Medium 6 nunmehr keine Schutzfunktion mehr. Es bildet beispielsweise einzelne Kügelchen, die als 61 bzw. 61' angedeutet sind. Der Feststoff ist dagegen in Lösung oder in Suspension 8 übergegangen, so dass sich in der Kavität 2 für weitere Verwendungszwecke das gelöste Reagenz befindet.
  • In der Figur 4, die ansonsten der Figur 2 entspricht, ist in die Kavität 2 ein solches Lösungsmittel 17 eingebracht, das einen zweiten Feststoff 19 enthält. Der erste Feststoff 5 ist in der Figur 4 entsprechend Figur 1/2 ist durch das Medium 6 geschützt. Der zweite Feststoff 19 ist im Lösungsmittel entweder gelöst oder er liegt als Suspension vor. Anstelle eines zweiten Feststoffes kann auch ein flüssiger Stoff gelöst oder als Emulsion im Lösungsmittel vorliegen.
  • Nach Erwärmung und Aufschmelzen des Paraffins hat nunmehr das Medium 6 keine Schutzfunktion mehr. In Figur 5 werden wiederum entsprechend Figur 3 Kügelchen 61 bzw. 61' des Mediums gebildet. Vom Lösungsmittel 17 wird nunmehr mit dem ersten Feststoff 5 und dem zweiten Feststoff 19 eine Lösung oder Suspension 18 gebildet, die für weitere Verwendungen zur Verfügung steht. Ist der sog. zweite Feststoff eine Flüssigkeit, so wird entsprechend eine Emulsion entstehen.
  • Erster und zweite Feststoff (bzw. Flüssigkeit) können so gewählt werden, dass diese nach Entfernung des Schutz-Mediums miteinender reagieren können und gegebenenfalls ihre Eigenschaften, wie z.B. Löslichkeiten ändern können.
  • Wenn der erste Feststoff ein PCR-Reagenz ist und der zweite Feststoff DNA, können in der Kavität PCR-Reaktionen stattfinden. Hierzu sind geeignete Mittel zur Thermozyklisierung notwendig. Paraffin ist hier als Schutz-Medium besonders gut geeignet, da bei der PCR ein erster Aufheizvorgang ohnehin erforderlich ist und dabei die Paraffin-Schutzschicht aufschmilzt. Weiterhin vorteilhaft ist somit die Realisierung einer sog. "hot-start"-PCR, die verhindert, dass das PCR-Enzym Polymerase bereits unterhalb einer bestimmten Temperatur (Paraffin-Schmelztemperatur) unspezifisch und damit nachteilhaft wirksam wird.
  • Die DNA als zweiter Feststoff wird beim Stand der Technik üblicherweise an so genannte Magnet-Beads gebunden und liegt somit als Suspension vor. Die Magnet-Bead-gebundene DNA kann über magnetische Mittel gesammelt und gezielt in die Kavität 2 gebracht werden.
  • Vorstehend beschriebenes Verfahren und die zugehörige Einrichtung eignen sich in besonderer Weise zur Durchführung einer PCR. Aber auch für andere Anwendungen in der biomedizinischen Technik, insbesondere dann, wenn zu bestimmten Zeitpunkten, insbesondere unmittelbar kurz vor einer durchzuführenden Analyse, quantitative Lösungen von einzelnen Trockenreagenzien gebildet werden sollen, ist die Erfindung anwendbar. Als Beispiele für die Herstellung definierter Reagenzlösungen sind eine Enzym-Label-Lösung, eine Enzym-SubstratLösung oder allgemeine Kalibrierlösungen zu nennen.

Claims (20)

  1. Verfahren zur Herstellung einer Lösung (8, 18) von mindestens einem Feststoff (5, 19) in einem Lösungsmittel (7, 17),
    wobei das Lösungsmittel (7, 17) aus einem Reservoir über Mikrokanäle (3, 3') einer Kavität (2) zugeführt wird, mit folgenden Maßnahmen:
    - Der im Lösungsmittel (7, 17) lösliche Feststoff (5, 19) wird in der Kavität (2) gelagert und mit einem im Lösungsmittel (7) unlöslichen Medium (6) abgedeckt bzw. umhüllt, so dass eine Auflösung des im Lösungsmittel (7, 17) löslichen Feststoffes (5, 19) verhindert wird,
    - die Kavität (2) wird mit einem Spülmittel durchströmt,
    - das Lösungsmittel (7, 17) wird der Kavität (2) zugeführt,
    - das im Lösungsmittel (7, 17) unlösliche Medium wird derart behandelt, dass ein Kontakt zwischen Lösungsmittel (7) und löslichem Feststoff (5, 19) und somit ein Auflösen des Feststoffs (5, 19) im Lösungsmittel (7) ermöglicht und die Lösung gebildet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei Feststoffe (5, 19) vorhanden sind und der erste Feststoff (5) in der Kavität (2) bevorratet und der zweite Feststoff (19) im Lösungsmittel (17) enthalten ist, mit folgenden weiteren Maßnahmen:
    - der im Lösungsmittel (17) lösliche erste Feststoff (5) wird in der Kavität (2) mit einem im Lösungsmittel (17) unlöslichen Medium (6) abgedeckt bzw. umhüllt, so dass eine Auflösung des im Lösungsmittel (17) löslichen Feststoffes verhindert wird,
    - das den zweiten Feststoff (19) enthaltende Lösungsmittel (17) wird der Kavität (2) zugeführt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine vollständige Integration aller Verfahrensschritte in einer einmal verwendbaren Einheit, in welcher der wenigstens eine Feststoff (5, 19) in der Kavität (2) bevorratet wird, erfolgt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kavität (2) mit Ventilen verschlossen wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel (7) Wasser verwendet wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Feststoff (19) im Lösungsmittel (17) suspendiert ist.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Feststoff (5) ein PCR-Reagenz ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das PCR-Reagenz (5) aus Polymerase, Nukleotiden, Primern, Puffer sowie Hilfsstoffen besteht.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das PCR-Reagenz (5) einen Film an der Wandung der Kavität (2) bildet.
  10. Verfahren nach Anspruch 2 und Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Feststoff (19) gelöste oder suspendierte zu amplifizierende DNA ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zu amplifizierende DNA (19) an Magnet-Beads gebunden sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Einsammeln von Magnet-Beads in der PCR-Kavität (2) vorhanden sind.
  13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium (6), das im Lösungsmittel nicht löslich ist, Paraffin ist.
  14. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 4, mit einer Einheit, welche als Einmalprodukt ausgeführt ist, wobei wenigstens ein Mikrokanal (3, 3') bzw. eine Mikrokavität (2) zur Aufnahme wenigstens eines in einem Lösungsmittel löslichen Feststoffes (5, 19) vorhanden ist, wobei sich zumindest der erste Feststoff (5, 19) an einer Wandung der Mikrokavität (2) befindet und von einer dünnen Schicht eines im Lösungsmittel nichtlöslichen Mediums abgedeckt ist.
  15. Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kavität eine für eine Thermozyklisierung geeignete PCR-Kavität (2) ist.
  16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden sind.
  17. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Kavität (2) mit Zufluss (3) und Abfluss (3') ausgestattet ist.
  18. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Zufluss (3) und Abfluss (3') mit Ventilen ausgestattet sind.
  19. Verwendung der Anordnung nach Anspruch 14 bei einer PCR (Polymerase Chain Reaction) für biochemische Untersuchungen.
  20. Verwendung der Anordnung nach Anspruch 14 bei einer quantitativen Auflösung von Trockenreagenzien im Lösungsmittel zur Herstellung eines Reagenz für eine Analyseeinrichtung.
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