-
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrofluidisches Modul zur Analyse dreidimensionaler Strukturen sowie ein System zur Analyse dreidimensionaler Strukturen mit einem solchen mikrofluidischen Modul und ein Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen unter Verwendung eines solchen mikrofluidischen Moduls. Beispiele der Erfindung beziehen sich insbesondere auf entsprechende Module, Systeme und Verfahren, die zur Analyse organischer Materialen, wie z. B. von Zellverbänden, Gewebeproben, Biopsiematerial, großen Einzellern und/oder Kleinstlebewesen geeignet sind.
-
Die meisten zellbasierten biomedizinischen Studien basieren auf dem Einsatz zweidimensionaler Zellkulturen, die als Monoschicht bzw. Monolayer auf Glas- oder Kunststoffoberflächen kultiviert und untersucht werden. Für viele Fragestellungen hat sich eine solche Vorgehensweise jedoch als zu artifiziell erwiesen, da die fehlende dreidimensionale Architektur des Gewebes eine zu große Vereinfachung darstellt. Dies äußert sich z. B. darin, dass Zellen, die in Zell-Monoschichten kultiviert werden, häufig ein verändertes Expressionsmuster von Zelladhäsionsmolekülen und gewebespezifischen Proteinen zeigen, eine veränderte interzelluläre Kommunikation aufweisen und nur noch rudimentär die In-Vivo-Situation widerspiegeln. Die Diffusionsverhältnisse und die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sind gänzlich anders als in realen Geweben. 3D-Zellverbände, wie beispielsweise nicht-vaskularisierte multizelluläre Sphäroide (MCS), d. h. sphärische Zellaggregate aus mehreren Tausend Zellen, gelten heute als das deutlich bessere, wenngleich komplexere Gewebe- und auch Tumormodell und werden als Brückentechnologie zwischen 2D-Zellkulturen und Tierversuchen angesehen. Diesbezüglich sei beispielsweise auf Pampaloni, F., E.G. Reynaud, und E.H. Stelzer, Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(10): S. 839–845, verwiesen Bei diesem Modell interagieren die Zellen nicht mit einer künstlichen In-Vitro-Oberfläche, sondern ausschließlich mit den im Sphäroid benachbarten Zellen oder dem umgebenden Medium. Im Inneren des multizellulären Sphäroids bildet sich eine gewebeähnliche Mikroumgebung, die jedoch wegen der fehlenden Vaskularisierung und der alleinigen Versorgung über die Oberfläche lokal sehr verschieden ist.
-
In den vergangenen Jahren haben sich drei grundsätzlich Ansätze zur Untersuchung von Sphäroiden herauskristallisiert.
-
Der erste Ansatz besteht in der Einführung von Mikroelektroden in das Sphäroid, um durch ortsaufgelöste elektrochemische Detektion die Analytverteilungen, vornehmlich Sauerstoff, zu bestimmen. Diesbezüglich wird auf Kunz-Schughart, L.A., et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278(4): S. C765–780 und Schwachhofer, J.H., et al., Anticancer Res, 1991. 11(1): S. 273–279, verwiesen.
-
Der zweite Ansatz besteht darin, Sphäroide nach einer schnellen Kryofixierung mithilfe eines Mikrotoms in μm-dicke Scheiben zu schneiden, was als sogenanntes Cryo-Sectioning bezeichnet wird, und die Analytverteilung zweidimensional in den viel besser zugänglichen Schnitten fixierter Proben zu bestimmen. Unter Einsatz entsprechend spezifischer Enzymreaktionen lässt sich so die Verteilung wichtiger Metabolite im Inneren des Sphäroids bestimmen, wie bei Kunz-Schughart, L.A., et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278(4): S. C765–C780, beschrieben ist. Durch Anfertigung von Kryoschnitten werden auch ultrastrukturelle, morphologische Untersuchungen an den Zellen im Inneren des multizellulären Sphäroids vorgenommen, um beispielsweise den Vitalzustand der Zellen, beispielsweise hinsichtlich des Vorliegens von Anzeichen von Apoptose oder Nekrose, positionsabhängig zu dokumentieren.
-
Der dritte Ansatz bezieht sich auf integrale nicht analyt-spezifische Ausleseverfahren, wie die elektrochemische Impedanzanalyse, wie sie bei Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369(1): S. 23–29 und Kyle, A.H., C.T. Chan, und A.I. Minchinton, Biophys J, 1999. 16(5): S. 2640–2648, beschrieben ist, oder die digitale Holographie, wie sie beispielsweise bei Nolte, D.D., et al., J Lab Autom, 2011. 16(6): S. 431–442 und Yu, P., et al., Opt Lett, 2004. 29(1): S. 68–70, beschrieben ist. Solche integralen, nicht analyt-spezifischen Ausleseverfahren werden genutzt, um die innere dielektrische Struktur eines Sphäroids respektive seine dreidimensionale Morphologie zeitaufgelöst und mit hoher Präzision zu verfolgen und eine biologische Antwort auf einen gegebenen Stimulus zu quantifizieren.
-
Während die genannten ersten und zweiten Ansätze invasiv sind und/oder eine angemessene zeitlich aufgelöste Untersuchung der Sphäroide erlauben, sind die Techniken gemäß dem dritten Ansatz ohne Ortsauflösung (Impedanzanalyse) oder ohne Zugang zum Inneren des Sphäroids (Holographie).
-
Mithilfe von elektrischem Wechselstrom ist es möglich, nicht-invasiv in das Innere von Geweben oder auch Sphäroiden vorzudringen, um durch Messung ihrer dielektrischen Eigenschaften Rückschlüsse auf Vitalität und Zellstruktur zu ziehen, wie beispielsweise bei Fricke, H. und H.J. Curtis, J Gen Physiol, 1935. 18(6): S. 821–836 und Fricke, H. und S. Morse, J Gen Physiol, 1925. 9(2): S. 153–167, beschrieben ist.
-
Der Einsatz der Impedanzanalyse zur Untersuchung von Sphäroiden im Wirkstoff-Screening wurde erste durch sehr viel spätere technische Entwicklungen möglich, die es erlauben, einzelne Sphäroide zu untersuchen. Hierfür sind in der Literatur im Wesentlichen drei Lösungen beschrieben. Die erste Lösung betrifft die Positionierung des Sphäroids an einer Engstelle einer konischen Glaskapillare, wobei mit Elektroden an beiden Enden der Kapillare eine impedanzspektroskopische Untersuchung des Sphäroids möglich wird, wie beispielsweise bei
Bartholoma, P., et al., J Biomol Screen, 2005. 10(7): S. 705–714 und
Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Biosens Bioelectron, 2001. 16(4–5): S. 261–269 sowie der
US 2006/0199173 A1 , beschrieben ist. Eine zweite Lösung besteht in der Platzierung eines Sphäroids auf planaren Elektrodenstrukturen, siehe
Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369(1): S. 23–29. Eine dritte Lösung besteht in der Platzierung eines Sphäroids in einer Kavität eines Siliziumchips mit Elektroden, die in die Seitenwände der Kavität integriert sind, siehe
Kloss, D., et al., Biosens Bioelectron, 2008. 23(10): S. 1473–1480 und
Kloss, D., et al., Lab Chip, 2008. 8(6): S. 879–884.
-
Die Erfinder haben festgestellt, dass technisch mit dem Kapillaraufbau gemäß der ersten Lösung die Gefahr von Leckströmen an dem Sphäroid vorbei am besten zu eliminieren ist, wobei jedoch eine Parallelisierung von Experimenten im Sinne eines Screenings oder die Kombination mit einer mikroskopischen Analyse technisch schwierig sind. Eine solche Parallelisierung oder mikroskopische Analyse könnten mit planaren Elektroden gemäß der zweiten Lösung oder Siliziumchips gemäß der dritten Lösung weitaus besser erreicht werden, wobei hier jedoch eine unter Umständen sehr viel aufwendigere, manuelle Positionierung der Sphäroide hinzutritt. In allen oben genannten Studien konnte jedoch klar gezeigt werden, dass die elektrische Impedanzanalyse geeignet ist, den Einfluss von verschiedenen Stimulanzien auf die innere Struktur von Sphäroiden zu detektieren.
-
Es besteht weiterhin ein Bedarf nach einem effizienten biomedizinischen Erkenntnisgewinn durch Untersuchungen an Sphäroidmodellen oder anderen 3D-Zellverbänden, wobei bioanalytische Verfahren erforderlich sind, mit denen die Reaktion der Zellverbände oder eine Änderung des inneren chemischen Milieus in Folge eines äußeren Stimulus, beispielsweise eines Toxins oder eines Wirkstoffkandidaten, quantitativ erfasst werden kann. Aus bioanalytischer Sicht ist dabei die Größe der Zellverbände und die gute Abschirmung des inneren Milieus durch die Zellen der Peripherie eine große Herausforderung. Bislang ist eine angemessene aussagekräftige Untersuchungsmethode für 3D-Zellverbände, wie beispielsweise Sphäroide, mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung nicht verfügbar.
-
Es existiert somit ein Bedarf nach einer verbesserten Analytik dreidimensionaler Strukturen, beispielsweise dreidimensionaler Zellverbände, wie z. B. multizellulärer Sphäroide, im Hinblick auf eine parallele zeitliche und örtliche Auflösung. Das Fehlen einer solchen Analytik ist eine der Limitierungen, die einem noch umfassenderen Einsatz von multizellulären Sphäroiden in der biomedizinischen Forschung und einem besseren grundlegenden Verständnis über Analytverteilung, Analytdynamik und strukturelle Dynamik in multizellulären Sphäroiden entgegensteht.
-
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine mikrofluidisches Modul, ein System und ein Verfahren zu schaffen, die eine Untersuchung von dreidimensionalen Strukturen mit paralleler zeitlicher und örtlicher Auflösung ermöglichen.
-
Diese Aufgabe wird durch ein mikrofluidisches Modul nach Anspruch 1, ein System nach Anspruch 9 und ein Verfahren nach Anspruch 11 gelöst.
-
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung schaffen ein mikrofluidisches Modul zur Analyse dreidimensionaler Strukturen, mit folgenden Merkmalen:
einem Modulkörper mit einer Unterseite, die für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist;
einem in dem Modulkörper gebildeten Kanal, der einen Kanaleinlass, eine Engstelle und einen Kanalauslass aufweist, wobei der Kanal für eine hydrodynamische Positionierung der dreidimensionalen Struktur an der Engstelle beim Durchströmen des Kanals von dem Kanaleinlass zu dem Kanalauslass mit einer Flüssigkeit konfiguriert ist; und
einer strömungsmäßig vor der Engstelle an den Kanal angrenzenden ersten Elektrode und einer strömungsmäßig nach der Engstelle an den Kanal angrenzenden zweiten Elektrode, die konfiguriert sind, um impedimetrische Messungen bezüglich der an der Engstelle hydrodynamisch positionierten dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen,
wobei zumindest Abschnitte des Modulkörpers aus einem lichtdurchlässigen Material gebildet sind und wobei der Modulkörper konfiguriert ist, um eine mikroskopische Untersuchung der an der Engstelle hydrodynamisch positionierten dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein System zur Analyse dreidimensionaler Strukturen mit einem solchen mikrofluidischen Modul und folgenden Merkmalen:
einem Fluidkreislauf, der mit dem Kanal fluidisch gekoppelt ist und konfiguriert ist, um den Kanal mit einer Flüssigkeit zu durchströmen, so dass ein dreidimensionaler Körper hydrodynamisch an der Engstelle in dem Kanal positioniert wird;
einem Mikroskop mit einem Objekttisch, wobei das Mikroskop ausgelegt ist, um mikroskopische Aufnahmen der dreidimensionalen Struktur zu machen, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist; und
einer Schaltungsanordnung zum Durchführen impedimetrischer Messungen unter Verwendung der ersten und der zweiten Elektrode, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen unter Verwendung eines entsprechenden mikrofluidischen Moduls, mit folgenden Merkmalen:
Positionieren des mikrofluidischen Moduls auf dem Objekttisch eines Mikroskops;
Durchströmen des Kanals mit einer Flüssigkeit, so dass eine dreidimensionale Struktur hydrodynamisch an der Engstelle in dem Kanal positioniert wird;
Durchführen impedimetrischer Messungen unter Verwendung der ersten und der zweiten Elektrode, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist; und
Erzeugen mikroskopischer Aufnahmen der dreidimensionalen Struktur, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen somit Vorrichtungen und Verfahren, die eine Impedanzanalyse und simultan eine Mikroskopie von dreidimensionalen Strukturen, wie z. B. organischem Material, ermöglichen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird dabei ein mikrofluidisches Modul verwendet, das einen Modulkörper aufweist, dessen Unterseite für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist die Unterseite konfiguriert, um eine stabile, verkippungsfreie Auflage des Moduls auf dem Objekttisch zu ermöglichen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Unterseite eine ebene Oberfläche aufweisen, so dass das mikrofluidische Modul ohne Weiteres stabil und ohne Verkippungen direkt auf dem Objekttisch platziert werden kann. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weist der Kanal eine Engstelle auf, an der eine dreidimensionale Struktur, beispielsweise ein Zellverband, hydrodynamisch platziert werden kann, so dass neben einer einfachen Positionierung der dreidimensionalen Struktur parallel eine Impedanzanalyse und eine Mikroskopie durchgeführt werden können, so dass Untersuchungen mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung möglich sind.
-
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung erstreckt sich der Kanal zumindest außerhalb der Engstelle zwischen zwei ebenen Flächen und parallel zur Unterseite des Modulkörpers und weist eine Kanalbreite und eine Kanalhöhe auf, wobei an der Engstelle die Kanalbreite und/oder die Kanalhöhe reduziert sind. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weist der Kanal bzw. das mikrofluidische Modul an der Engstelle in Strömungsrichtung schräg in Richtung Kanalmitte auf eine Position, an der die dreidimensionale Struktur hydrodynamisch positioniert werden soll, zulaufende Kanalwände auf. Somit ist es möglich, die dreidimensionale Struktur, beispielsweise den Zellverbund oder multizellulären Sphäroid, sicher an der gewünschten Position hydrodynamisch zu positionieren.
-
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann der Modulkörper eine Bodenplatte aufweisen, wobei die erste und die zweite Elektrode durch mit einem leitfähigen Material beschichtete Bereiche der Bodenplatte gebildet sind. Bei Ausführungsbeispielen kann der Kanal in einem Materialblock gebildet sein, der an der Bodenplatte angebracht ist, wobei Abschnitte der ersten und der zweiten Elektrode an den Kanal angrenzen und wobei der Materialblock Kontaktabschnitte der ersten und der zweiten Elektrode zum elektrischen Kontaktieren der ersten und der zweiten Elektrode freilässt. Bei Ausführungsbeispielen kann der Kanal in einer Unterseite des Materialblocks gebildet sein, und der Kanaleinlass und der Kanalauslass können Öffnungen in einer von der Bodenplatte abgewandeten Oberseite des mikrofluidischen Moduls aufweisen. Somit ist es bei Ausführungsbeispielen möglich, das mikrofluidische Modul auf einfache Weise herzustellen.
-
Bei Ausführungsbeispielen können der Kanaleinlass und der Kanalauslass mit Fluidanschlüssen versehen sein, die konfiguriert sind, um den Kanal an einen externen Fluidkreislauf anzuschließen, um ein Durchströmen des Kanals mit einer Flüssigkeit bewirken zu können. Der Fluidkreislauf kann Teil eines Systems zur Analyse dreidimensionaler Strukturen sein, das ferner ein Mikroskop und eine Schaltunganordnung zum Durchführen impedimetrischer Messungen aufweist. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann das System eine Steuerung aufweisen, die ausgelegt ist, um das Mikroskop und die Schaltungsanordnung zu steuern, um die mikroskopischen Aufnahmen und die impedimetrischen Messungen gleichzeitig durchzuführen, während die dreidimensionale Struktur an der Engstelle hydrodynamisch positioniert ist. Somit ermöglichen Ausführungsbeispiele auf vorteilhafte Weise eine parallele Auswertung in Form einer Impedanzanalyse und einer simultanen Mikroskopie, so dass eine Untersuchung mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung möglich ist.
-
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann die Flüssigkeit eine Pufferlösung sein und die dreidimensionale Struktur kann ein organisches Material, ein Zellverband, ein Biopsiematerial, eine Gewebeprobe, ein Einzeller und/oder Kleinstlebewesen aufweisen. Ausführungsbeispiele ermöglichen somit insbesondere die Durchführung bioanalytischer Verfahren, mit denen die Reaktion von Zellverbänden oder die Änderung innerer chemischer Milieus in Folge eines äußeren Stimulus, beispielsweise eines Toxins oder eines Wirkstoffkandidats, quantitativ erfasst werden kann. Um eine lichtmikroskopische Untersuchung zu ermöglichen, kann die dreidimensionale Struktur Indikatorfarbstoffe, beispielsweise fluoreszente Indikatorfarbstoffe, oder aus Sensormaterial aufgebaute Partikel aufweisen, die mikroskopisch detektierbar und zeitaufgelöst verfolgbar sind.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung resultieren somit aus einer Kombination zweier unterschiedlicher analytischer Ansätze miteinander, was eine Analyse mit gleichzeitig hoher zeitlicher und örtlicher Auflösung ermöglicht.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
-
1a eine schematische Draufsicht auf ein mikrofluidisches Modul gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
-
1b eine schematische Querschnittansicht des mikrofluidischen Moduls gemäß 1a; und
-
2 eine schematische Darstellung eines Systems gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
-
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung schaffen einen neuartigen mikrofluidischen Chip (MF-Chip) zur Impedanzanalyse und simultanen Mikroskopie für die Untersuchung von einzelnen Zellverbänden, wie z. B. nativen, gelabelten oder mit Sensormaterial beladenen Sphäroiden. Dabei werden Vorteile bekannter Techniken miteinander kombiniert, nämlich die Positionierung eines multizellulären Sphäroids an einer Engstelle eines mikrofluidischen Kanals mit koplanaren Filmelektroden an den Enden des Kanals, so dass eine Parallelisierung von Experimenten sowie eine simultane mikroskopische Untersuchung der Sphäroide technisch sehr leicht möglich wird. Mit Hilfe von analyt-spezfischen, im Sphäroid befindlichen Indikatorfarbstoffen, beispielsweise fluoreszenten Indikatorfarbstoffen oder Partikeln, beispielsweise Nano- oder Mikropartikeln, die in die Sphäroide eingebracht werden, wird die Verteilung von Analyten bzw. Schlüsselmetalboliten in intakten Sphäroiden mikroskopisch detektierbar und zeitaufgelöst verfolgbar. Durch die nichtinvasive Experimentführung lassen sich lokale Analytkonzentrationen in der Mikroumgebung des Sphäroids erfassen und Änderungen zeitlich verfolgen. Auch native Zellverbände, wie z. B. Sphäroide oder Verbände aus Zellen, die fluoreszente Proteine exprimieren oder anderweitig gelabelt sind, sind auf diese Weise einer mikroskopischen Untersuchung zugänglich. Wie ausgeführt wurde, können mikroskopische Studien durch simultan durchgeführte Impedanzmessungen des unter Beobachtung stehenden Sphäroids begleitet werden, um mit hoher Sensitivität Änderungen der inneren Struktur der dreidimensionalen Struktur (beispielsweise des Sphäroids) zu dokumentieren und gleichzeitig eine Analytverteilung bzw. Änderungen der Analytverteilung im Inneren der Struktur ortsaufgelöst optisch anzuzeigen. Das Auslösen apoptischer oder nekrotischer Prozesse lässt sich dadurch beispielsweise mit der damit einhergehenden Analytverteilung in Zusammenhang bringen.
-
Die 1a und 1b zeigen ein Ausführungsbeispiel eines Konzepts eines mikrofluidischen Moduls bzw. Chips zur simultanen impedanzspektroskopischen und mikroskopischen Analyse eines einzelnen Zellverbandes, wie beispielsweise eines multizellulären Sphäroids, in einer zentralen Verengung eines Kanals. Das Modul weist eine Bodenplatte 10 auf. Auf der Bodenplatte sind abschnittsweise eine erste Elektrode 12 und eine zweite Elektrode 14 gebildet. An der Bodenplatte ist ein Materialkörper 16 fixiert, in dem fluidische Strukturen in Form eines Kanals 18 mit einem Kanaleinlass 20 und einem Kanalauslass 22 strukturiert sind. Der Kanal 18 weist eine Engstelle 24 mit einem verringerten Strömungsquerschnitt auf. Der verringerte Strömungsquerschnitt der Engstelle 24 ist derart, dass eine zu untersuchende dreidimensionale Struktur 26 bei einer Durchströmung des Kanals mit einer Flüssigkeit an der Engstelle 24 hängen bleibt. Wie in den 1a und 1b gezeigt ist, kann die Verengung durch seitlich in den Kanal vorstehende Abschnitte 28 und 30 und einen von oben in den Kanal vorstehenden Abschnitt 32 des Materialblocks 16 gebildet sein. Wie in 1a zu sehen ist, können die Vorsprünge 28 und 30 Kanalwände 28a und 30a aufweisen, die schräg auf die Position, an der die Struktur 26 positioniert ist, zulaufen. Wird der Kanal 18 von einer Flüssigkeit durchströmt, wird somit die Struktur 26 sicher an der Engstelle positioniert. Wie in 1b zu erkennen ist, ist der Kanal 18 zumindest im Bereich der Engstelle zwischen zwei parallelen planaren äußeren Flächen des Modulkörpers gebildet. Auf der Unterseite des Abschnitts des Modulkörpers, der die obere planare äußere Fläche bildet, ist die Struktur 32, die zu Erzeugung der Engstelle 24 von oben in den Kanal 18 ragt, gebildet, während auf der Oberseite des Abschnitts des Modulkörpers, der die untere planare äußere Fläche bildet, die Elektroden 12 und 14 gebildet sind. Auch die Oberseite und Unterseite des Kanals können, mit Ausnahme der Struktur 32, in dem Bereich, in dem die zu untersuchende Struktur aufgrund der Engstelle positioniert wird, planar und parallel sein.
-
An dieser Stelle sei angemerkt, dass in 1a der Materialblock 16 durchsichtig dargestellt ist, so dass die jeweiligen darunterliegenden Strukturen in der Draufsicht von 1a erkennbar bleiben. Wie in 1b zu erkennen ist, weist der Materialblock 16 bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel jeweilige dünne Wandabschnitte auf, die die Fluidikstrukturen definieren. Der Materialblock 16 ist derart auf der Bodenplatte 10 mit den Elektroden 12 und 14 fixiert, dass der Kanal 18 mit Ausnahme des Kanaleinlasses 20 und des Kanalauslasses 22 abgedichtet ist. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann der Materialblock 16 eine massive Struktur aufweisen, in der Ausnehmungen bzw. Öffnungen erzeugt sind, die den Kanal mit Kanaleinlass und Kanalauslass definieren. Der Block ist derart strukturiert, dass nach Fixierung desselben an der Bodenplatte ein mit Ausnahme des Kanaleinlasses und des Kanalauslasses fluiddichter Kanal erzeugt wird.
-
Der Materialblock 16 kann solche Abmessungen aufweisen, dass nach Fixieren desselben an der Bodenplatte 10 Abschnitte 12a und 14a der Elektroden 12 und 14 an den Kanal 18 angrenzen, während Abschnitte 12b und 14b der Elektroden 12 und 14 frei bleiben. Die Abschnitte 12b und 14b können zur elektrischen Kontaktierung der Elektroden 12 und 14, um eine Impedanzmessung zu ermöglichen, dienen.
-
Eine Strömungsrichtung ist von dem Kanaleinlass 20 zu dem Kanalauslass 22, so dass die Elektrode 12 (bzw. der Abschnitt 12a derselben) strömungsmäßig vor der Engstelle 24 an den Kanal 18 angrenzt, während die Elektrode 14 (bzw. der Abschnitt 14a derselben) strömungsmäßig nach der Engstelle 24 an den Kanal 18 angrenzt.
-
Die Bodenplatte 10 weist eine ebene Oberfläche auf, so dass das Modul verkippungssicher und stabil auf einem Objekttisch eines Mikroskops platziert bzw. positioniert werden kann. Bei alternativen Ausführungsbeispielen muss die Unterseite keine ebene Oberfläche aufweisen, sondern kann eine Mehrzahl von voneinander beabstandeten Auflagebereichen aufweisen, durch die das Modul auf dem Objekttisch plaziert werden kann, beispielsweise zwei längliche voneinander beabstandete Auflageflächen oder vier an voneinander beabstandeten Enden des Moduls angeordnete Auflageflächen.
-
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung besteht das mikrofluidische Modul somit aus zwei Bestandteilen, die aneinander fixiert sind. Ein Bestandteil besteht aus einer Bodenplatte und an derselben angebrachten Elektroden und in dem zweiten Bestandteil sind die Kanalstrukturen gebildet. Bei Ausführungsbeispielen ist der Kanal, der die Engstelle aufweist, in einer Unterseite dieses zweiten Bestandteils gebildet, so dass nach Fixierung des zweiten Bestandteils an dem ersten Bestandteil ein mit Ausnahme des Kanaleinlasses und des Kanalauslasses geschlossener Fluidkanal gebildet ist. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann der Modulkörper auf eine beliebige Art und Weise gebildet sein, solange er stabil auf seiner Unterseite abgelegt werden kann, d. h. solange derselbe für eine Positionierung auf einem Objekttisch eines Mikroskops konfiguriert ist.
-
Ein System zur Analyse bzw. ein Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen werden nachfolgend Bezug nehmend auf 2 erläutert. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Systems zur Analyse dreidimensionaler Strukturen, bei dem ein mikrofluidisches Modul 2, wie es beispielsweise oben Bezug nehmend auf die 1a und 1b beschrieben wurde, auf einem Objekttisch 50 eines Mikroskops 52 positioniert ist. Das Mikroskop 52 kann, wie Fachleuten geläufig ist, eine oder mehrere geeignete Lichtquellen zur Beleuchtung des mikrofluidischen Moduls 2 bzw. von Abschnitten desselben sowie eine Kamera zur Aufnahme mikroskopischer Aufnahmen des mikrofluidischen Moduls bzw. von Abschnitten desselben aufweisen. Das Mikroskop 52 ist mit einer Steuerung 54 gekoppelt. Die Steuerung 54 ist ferner mit einem Fluidkreislauf 56 sowie einer Schaltungsanordnung 58 zum Durchführen impedimetrischer Messungen gekoppelt. Die Steuerung 54 ist ausgelegt, um das Mikroskop 52, den Fluidkreislauf 56 und die Schaltungsanordnung 58 zum Durchführen impedimetrischer Messungen zu steuern.
-
Die Schaltungsanordnung 58 zum Durchführen impedimetrischer Messungen ist über elektrische Zuleitungen 60 und 62 mit den freiliegenden Abschnitten 12b und 14b der ersten und zweiten Elektrode 12 und 14 verbunden. Der Fluidkreislauf 56 weist Fluidleitungen 66 und 68 auf, die über Fluidanschlüsse 70 und 72 mit dem Kanaleinlass 20 und dem Kanalauslass 22 fluidisch gekoppelt sind. Der Fluidkreislauf 56 kann ferner eine Pumpeinrichtung aufweisen, um eine Durchströmung des Kanals 18 in einer Richtung von dem Kanaleinlass 20 zu dem Kanalauslass 22 zu ermöglichen. Der Fluidkreislauf 56 kann ferner ausgebildet sein, um entsprechende, zu untersuchende dreidimensionale Strukturen in den Kanal 18 einzubringen.
-
Im Betrieb des Systems bzw. bei einem Verfahren zum Analysieren dreidimensionaler Strukturen wird das mikrofluidische Modul 2 auf dem Objekttisch 50 positioniert und der Kanal 18 wird mit einer Flüssigkeit durchströmt, so dass die dreidimensionale Struktur hydrodynamisch an der Engstelle 24 in dem Kanal 18 positioniert wird. Zu diesem Zweck kann der Fluidkreislauf 56 über die Steuerung 54 entsprechend gesteuert werden, um eine Durchströmung des Kanals 18 zu bewirken. Ist die zu untersuchende dreidimensionale Struktur an der Verengung 24 positioniert, werden impedimetrische Messungen unter Verwendung der ersten und der zweiten Elektrode durchgeführt. Zu diesem Zweck kann die Schaltungsanordnung 58 durch die Steuerung 54 entsprechend gesteuert werden. Gleichzeitig werden durch das Mikroskop mikroskopische Aufnahmen der dreidimensionalen Struktur gemacht, wobei das Mikroskop zu diesem Zweck durch die Steuerung 54 entsprechend gesteuert werden kann. Entsprechende Aufnahmen können zur mikroskopischen Untersuchung der dreidimensionalen Struktur verwendet werden, wobei die Steuerung 54 ausgelegt sein kann, um entsprechende mikroskopische Untersuchungen durchzuführen.
-
Der mikrofluidische Kanal 18 weist somit, beispielsweise an zentraler Position, eine Verengung auf, um eine zu untersuchende zweidimensionale Struktur aufnehmen zu können. Bei diesen zu untersuchenden Strukturen kann es sich beispielsweise um organisches Material handeln. Neben Zellverbänden, wie Sphäroiden, ist auch die Untersuchung von Biopsiematerial, anderen Gewebeproben, großen Einzellern und anderen Kleinstlebewesen mit einem solchen Aufbau möglich und technisch umsetzbar. Es ist für Fachleute offensichtlich, wie der Querschnitt der an der Engstelle verbleibenden Durchströmungsöffnung für unterschiedliche zu untersuchende Strukturen zu dimensionieren ist, um die Strukturen an der Engstelle in Position zu halten.
-
Beispielsweise können der mikrofluidische Kanal und die Engstelle ausgebildet sein, um ein multizelluläres Sphäroid aufnehmen zu können, um integral messbare Parameter zur Beschreibung der physikalischen Beschaffenheit des Sphäroids durch die Erstellung spezieller impedimetrischer Profile bestimmen zu können. Beispielsweise können über die an beiden Enden des Kanals eingebrachten Elektroden impedimetrische Messungen entlang des Kanals durchgeführt werden, deren Ergebnis durch die Sphäroid bedeckte Verengung bestimmt wird. Die Geometrie des Moduls, d. h. des Chips, und der Zuleitungen können dabei gewährleisten, dass die mit der zu untersuchenden Struktur, z. B. dem Sphäroid, verschlossene Verengung des Kanals die Gesamtimpedanz des Systems dominiert.
-
Der Kanal ist in einem Modulkörper aus einem transparenten Material gebildet, der auf beiden Seiten parallele Oberflächen aufweisen kann, damit die im Kanal befindlichen Objekte einer hochauflösenden Mikroskopie zugänglich sind. Ein beispielhafter Aufbau eines solchen mikrofluidischen Chips zur impedimetrischen Untersuchung von einzelnen Zellverbänden, wie beispielsweise Sphäroiden, wurde oben bezugnehmend auf die 1a und 1b beschrieben.
-
Die Bodenplatte 10 eines solchen mikrofluidischen Chips kann aus einem durchsichtigen Material, wie beispielsweise kommerziell erhältlichen Deckgläsern bestehen, die abschnittsweise mit einer Schicht aus leitfähigem Material, wie beispielsweise Gold, Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder leitfähigen Polymeren und Co-Polymeren (wie z. B. Polyanilin, Polypyrol, Polythiophen, PEDOT sowie deren dotierten Varianten) beschichtet sein können. Bei einem Ausführungsbeispiel sind die Elektroden auf der Bodenplatte durch eine ITO-Beschichtung gebildet, wobei ITO optisch transparent bis zu einer Wellenlänge von etwa 350 nm (abhängig vom Trägermaterial), kratzfest, chemisch weitgehend inert und je nach Schichtdicke sehr gut elektrisch leitfähig ist. Die Grenzflächenimpedanz von ITO entspricht in guter Näherung der einer ideal polarisierbaren Elektrode. Bei der Herstellung eines entsprechenden mikrofluidischen Chips kann zunächst eine vollständig mit einer elektrisch leitfähigen Schicht versehene Bodenplatte bereitgestellt werden, wobei durch Photolithographie und nasschemisches Ätzen (beispielsweise mit Zink/Salzsäure im Fall von ITO) die ITO-Schicht im Zentrum der Bodenplatte (beispielsweise des Deckgläschens) weggeätzt werden kann, so dass nur noch an beiden Längsseiten des Chips eine Beschichtung vorhanden ist, die außerhalb der beiden fluidischen Zugänge zur elektrischen Kontaktierung an die Messelektronik genutzt werden kann.
-
Der fluidische Kanal inklusive der für das zu untersuchende Material passend dimensionierten Verengung, die aus einem entsprechenden Materialblock gefertigt sind, sind auf der mit den ITO-Elektroden versehenen Bodenplatte fixiert. Die Impedanzanalyse kann unter Verwendung der Elektroden mithilfe kommerzieller Impedanzanalysatoren erfolgen. Zur Durchführung der Messung wird der fertiggestellte Chip beispielsweise mit einer Pufferlösung befüllt, die einen einzelnen multizellulären Zellverband, beispielsweise ein einzelnes Sphäroid, enthält. Beim hydrostatisch getriebenen Durchströmen des Puffers durch den Kanal wird das Sphäroid bis zur Verengung mitgeführt und dort automatisch hydrodynamisch platziert, so dass ohne jede weitere Manipulation (Mikromanipulation) eine impedanzspektroskopische Untersuchung des Sphäroids möglich ist. Der auf diese Weise positionierte Zellverband wird aufgrund der Geometrie des Chips einer simultanen mikroskopischen Untersuchung zugänglich. Der Zellverband kann beispielsweise ein Farbstofftragendes oder Partikel-tragendes Sphäroid sein, wobei es sich bei dem Farbstoff beispielsweise um fluoreszente Indikatorfarbstoffe und bei den Partikeln beispielsweise um Nano- oder Mikropartikel handeln kann. Diese Kombination von mikroskopischen Studien mit simultan durchgeführten Impedanzmessungen des unter Beobachtung stehenden Zellverbandes erlaubt mit hoher Sensitivität, dass Änderungen der inneren Struktur des Sphäroids dokumentiert werden, während gleichzeitig die Analytverteilung und/oder Änderungen der Analytverteilungen innerhalb des Zellverbandes ortsaufgelöst optisch bestimmt werden können.
-
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung ermöglichen somit vorteilhaft die Kombination zweier analytischer Ansätze miteinander. Auf der Basis von im Zellverband befindlichen Sensormaterial, wie z. B. Farbstoffen oder sensorisch-funktionalisierten, beispielsweise fluoreszierenden Partikeln (z. B. Nano- oder Mikropartikeln), wird in den Zellen des Zellverbandes, beispielsweise des Sphäroids, sowie auch in den Zellzwischenräumen eine ortsaufgelöste kontinuierliche Detektion von Analyten oder anderweitig gelabelten Molekülen ermöglicht, so dass deren Verteilung in dem 3D-Gewebe-Modell mikroskopisch studierbar ist. Parallel dazu werden durch label-freie Impedanzmessungen mit hoher zeitlicher Auflösung Veränderungen der dielektrischen Struktur desselben Zellverbandes aufgezeichnet, um Rückschlüsse auf dessen integrale Vitalität sowie beispielsweise einsetzende apoptotische oder nekrotische Prozesse zu ziehen. Die Durchführung und Analyse derartiger Impedanzmessungen kann auf an sich bekannte Art und Weise erfolgen.
-
Ausführungsbeispielen der Erfindung ermöglichen somit eine Kombination von ortsaufgelösten, spezifisch-chemischen Information von Zellverbänden mit integral messbaren Parametern der physikalischen Beschaffenheit der Zellverbände. Somit können die Vorteile bekannter Techniken durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise und insbesondere das neuartige mikrofluidische Modul miteinander kombiniert werden. Ein einzelner Zellverband, beispielsweise ein Sphäroid, wird an einer Engstelle eines mikrofluidischen Kanals mit koplanaren Filmelektroden an den Enden des Kanals positioniert, so dass eine Parallelisierung von Experimenten sowie eine simultane mikroskopische Untersuchung der Zellverbände möglich wird. An einem mit einer Kamera ausgestatteten Mikroskop bietet sich die Möglichkeit, Filme oder Zeitraffer-Aufnahmen durchzuführen, wodurch beispielsweise die Änderungen der Morphologie, der Struktur oder der Analytverteilung innerhalb der Probe sichtbar gemacht werden können.
-
Ausführungsbeispiele des mikrofluidischen Moduls können aus beliebigen geeigneten Materialien erzeugt werden, die ausreichend optisch transparent sind, um eine mikroskopische Erfassung einer in dem Modul angeordneten dreidimensionalen Struktur zu ermöglichen. Beispielsweise können die Bestandteile des mikrofluidischen Moduls aus einem geeigneten Glas, aus geeigneten Polymermaterialien, aus geeigneten Halbleitermaterialien, wie z. B. Silizium, und dergleichen bestehen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann beispielsweise der Materialblock, in dem der Kanal gebildet ist, durch Strukturieren einer Siliziumscheibe gebildet werden. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann das mikrofluidische Modul oder Bestandteile desselben durch Kunststoffspritzguss hergestellt werden, wobei die für die Impedanzmessung erforderlichen Elektroden eingegossen werden können.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen somit ein mikrofluidisches Modul bzw. einen Mikrofluidik-Chip zur simultanen mikroskopischen und impedimetrischen Untersuchung von dreidimensionalen Strukturen, die hydrodynamisch positioniert und kontinuierlich untersucht werden können. Bei den zu untersuchenden Strukturen kann es sich insbesondere um lebende Zellverbände (nativ, gelabelt bzw. Sensormaterial in Form von Partikeln und/oder Farbstoffen beinhaltend) handeln. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung können insbesondere technische Anwendung im Medizinbereich finden. Multizelluläre Sphäroide werden wegen der verbesserten Modellierung der In-Vivo-Situation vorteilhaft als Testobjekte in der Tumorforschung, dem Wirkstoff-Screening und der Toxizitätsprüfung eingesetzt und liefern in anerkannter Weise relevante biomedizinische Informationen. Die multizellulären Sphäroide können heutzutage nach unterschiedlichen Verfahren in großer Zahl und guter Reproduzierbarkeit aus verschiedenen Zelllinien hergestellt werden, so dass ihr Einsatz auch im Hochdurchsatz-Screening möglich geworden ist, wobei diesbezüglich auf Kunz-Schughart, L.A., et al., J Biomol Screen, 2004. 9(4): S. 273–285, verwiesen wird.
-
Ein weiteres technisches Anwendungsgebiet ist die Untersuchung von Zellverbänden, wie Biopsieproben, anderen Gewebestücken, Einzellern und Kleinstlebewesen, wobei wertvolle Informationen in der biomedizinischen Forschung und der Diagnostik geliefert werden können, beispielsweise bei der Untersuchung von entzündlich verändertem Gewebe oder Tumoren. Auch für die Grundlagenforschung ist eine Anwendung des beschriebenen mikrofluidischen Moduls von erheblicher Bedeutung, da mithilfe der multiparametrischen, bioanalytischen Untersuchung Zellverbände, wie z. B. 3D-Sphäroidmodelle unter dem Einfluss verschiedener chemischer oder biologischer Stimulanzien studiert werden können. Neben dem neuen biomedizinischen Erkenntnisgewinn ist es auch denkbar, dass biologische Untersuchungsmaterialien, wie beispielsweise multizelluläre Organismen oder Proben aus dem Tier- und Pflanzenreich oder andere, impedimetrisch untersuchbare Objekte, Materialien und Proben analysiert werden können.
-
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine entsprechende Vorgehensweise durch eine entsprechende Ausgestaltung der Auflagefläche eines Mikrofluidik-Chips, wobei die zu untersuchende dreidimensionale Struktur, beispielsweise das Sphäroid, zwischen zwei planaren Flächen hydrodynamisch platziert werden kann, die aus optisch transparenten Materialien bestehen, so dass eine simultane zeit- und ortsaufgelöste Messung möglich wird.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- US 2006/0199173 A1 [0009]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- Pampaloni, F., E.G. Reynaud, und E.H. Stelzer, Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(10): S. 839–845 [0002]
- Kunz-Schughart, L.A., et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278(4): S. C765–780 [0004]
- Schwachhofer, J.H., et al., Anticancer Res, 1991. 11(1): S. 273–279 [0004]
- Kunz-Schughart, L.A., et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2000. 278(4): S. C765–C780 [0005]
- Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369(1): S. 23–29 [0006]
- Kyle, A.H., C.T. Chan, und A.I. Minchinton, Biophys J, 1999. 16(5): S. 2640–2648 [0006]
- Nolte, D.D., et al., J Lab Autom, 2011. 16(6): S. 431–442 [0006]
- Yu, P., et al., Opt Lett, 2004. 29(1): S. 68–70 [0006]
- Fricke, H. und H.J. Curtis, J Gen Physiol, 1935. 18(6): S. 821–836 [0008]
- Fricke, H. und S. Morse, J Gen Physiol, 1925. 9(2): S. 153–167 [0008]
- Bartholoma, P., et al., J Biomol Screen, 2005. 10(7): S. 705–714 [0009]
- Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Biosens Bioelectron, 2001. 16(4–5): S. 261–269 [0009]
- Thielecke, H., A. Mack, und A. Robitzki, Fresenius J Anal Chem, 2001. 369(1): S. 23–29 [0009]
- Kloss, D., et al., Biosens Bioelectron, 2008. 23(10): S. 1473–1480 [0009]
- Kloss, D., et al., Lab Chip, 2008. 8(6): S. 879–884 [0009]
- Kunz-Schughart, L.A., et al., J Biomol Screen, 2004. 9(4): S. 273–285 [0046]
