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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Einzelzellanalyse von Mikroorganismen.
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Mikroorganismen werden in der Biotechnologie für die Produktion von verschiedenen Stoffen eingesetzt. Die Mikroorganismen werden für diesen Zweck häufig gentechnisch optimiert, um sie in ihrer Eigenschaft als Produktionsorganismen zu verbessern. Einzelne Mikroorganismen können unterschiedliche Eigenschaften haben, weswegen einzelne Mikroorganismen besonders geeignet sein können, um als Ausgangs- bzw. Mutterorganismus für Zellpopulationen zu dienen, die besonders gute Eigenschaften für die Anforderungen in der Biotechnologie haben.
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Daher ist es von Interesse, einzelne Mikroorganismen zu identifizieren, die besondere Eigenschaften haben.
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Hierzu werden nach dem Stand der Technik Verfahren und Vorrichtungen eingesetzt, die eine Analyse von einzelnen Zeilen von Mikroorganismen ermöglichen. Diese Vorrichtungen haben eine Zufuhr für Mikroorganismen zu Kanälen, in die die Mikroorganismen eingeführt werden, um dort beobachtet werden zu können. Die Kanäle haben einen Durchmesser, in den, bezogen auf den Durchmesser oder Querschnitt des Kanals, nur eine Zelle aufgenommen werden kann. Sie sind als Sackgasse ausgebildet, so dass ein Mikroorganismus zwar in einen Kanal eingeführt werden kann, den Kanal jedoch nur an der Eingangsseite verlassen kann. Teilt sich der Mikroorganismus, so können die durch Teilung neu entstandenen Zellen den Kanal zur Eingangsseite hin verlassen. Eine Vorrichtung dieser Art ist in der Veröffentlichung von Wang, P., Robert, L., Pelletier, J., Dang, W. L., Taddei, F., Wright, A., Jun, S. „Robust growth of escherichia coli”, (2010) Current Biology, 20 (12), pp. 1099–1103 beschrieben.
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Die Schrift
DE 197 12 309 A1 offenbart eine Mikroelementanordnung, bei der ein Flüssigkeitsstrom mit Zellen durch Mikroküvetten geleitet wird. Eine vergleichbare Vorrichtung wird in der
US 2006/0128006 A1 beschrieben.
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Die
DE 10 2012 219 866 A1 offenbart einen Chip, bei dem eine dreidimensionale Struktur in einem Flüssigkeitsstrom zu einem Engpass geleitet wird.
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Mit den Vorrichtungen nach dem Stand der Technik ist das Inocculieren der Zellen in die Kanäle, die als Kultivierungskammer dienen, schlecht reproduzierbar, wenig kontrollierbar und findet nur in geringem Umfang statt.
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Es ist daher die Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zu schaffen, mit denen einzelne Mikroorganismen schnell, reproduzierbar und kontrollierter in die Kultivierungskammern eingeführt werden können. Die Fülleffizienz soll erhöht werden. Es soll eine größere Anzahl von Kultivierungskanälen mit Zellen befüllt werden können.
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Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 und des nebengeordneten Anspruchs wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 und des nebengeordneten Anspruchs angegebenen Merkmalen.
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Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, die Mikroorganismen leicht für die Einzelzellanalyse in die Kultivierungskammern einzubringen, die Befüllung reproduzierbarer zu gestalten und besser zu kontrollieren, sowie den Befüllungsgrad zu steigern.
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Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Im Folgenden soll die Erfindung in ihrer allgemeinen Form erläutert werden.
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Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur Einzelzellanalyse zur Verfügung gestellt, bei der die Kultivierungskammern als Kultivierungskanäle ausgebildet sind, welche einen Querschnitt aufweisen, der die Aufnahme einer einzelnen Zelle ermöglicht und die an der, der Eingangsseite für den Mikroorganismus gegenüberliegenden Seite des Kultivierungskanals, einen Durchlass bzw. einen Verbindungskanal aufweist, der gegenüber dem Querschnitt des Kultivierungskanals verjüngt ist, so dass der Mikroorganismus nicht durch den Verbindungskanal heraustreten kann und der in einen Abflusskanal mündet. Durch den Verbindungskanal bzw. den Durchlass kann Flüssigkeit hindurchtreten, jedoch keine ganze Zelle. Unter Ermöglichung der Aufnahme einer einzelnen Zelle im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass eine einzelne Zelle so in den Kultivierungskanal aufgenommen werden kann, dass sie den Querschnitt des Kultivierungskanals so ausfüllt, dass bezogen auf den Querschnitt keine weitere Zelle daneben, darüber oder darunter positioniert sein kann, so dass sich eine Zelllage „monolayer” ergeben kann. Der Kultivierungskanal kann, bezogen auf seinen Durchmesser bzw. seinen Querschnitt nur eine einzelne Zelle aufnehmen. Dabei ist es nicht ausgeschlossen, dass sich entlang der Länge des Kultivierungskanals eine weitere oder mehrere Zellen befinden, die den Kultivierungskanal ggf. auch wieder durch den Eingangsbereich verlassen können.
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Die Vorrichtung besitzt mindestens einen Kultivierungskanal, der einen Mikroorganismus aufnehmen kann. Vorzugsweise sind mehrere Kultivierungskanäle vorhanden, die vorzugsweise parallel zueinander angeordnet sind. Die mögliche Anzahl der Kultivierungskanäle ist nach oberen Werten offen, wird jedoch lediglich durch praktische Gegebenheiten beschränkt. Diese ergeben sich beispielsweise dadurch dass die erfindungsgemäße Vorrichtung in ein Mikroskop gelegt werden kann und praktikabel dimensioniert sein soll. Es können bis zu mehreren Tausend Kultivierungskanäle parallel zueinander angeordnet sein.
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Der Kultivierungskanal kann einen Querschnitt unterschiedlicher Geometrie haben. So kann der Querschnitt rechteckig, quadratisch, polygonal, kreisförmig, oval oder anders geformt sein. Der Verbindungskanal kann grundsätzlich einen Querschnitt der genannten Geometrien haben. Dabei kann die Querschnittsgeometrie von Kultivierungskanal und Verbindungskanal gleich oder unterschiedlich sein.
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Die Dimensionierung der Kultivierungskanäle liegt in der Größenordnung von Mikroorganismen, also im Mikrometerbereich. Der Querschnitt des Kultivierungskanals ist so dimensioniert, dass er einen einzelnen Mikroorganismus als Monolayer aufnehmen kann. So kann der Querschnitt des Kultivierungskanals, beispielsweise bei einem rechteckigen Querschnitt, zwischen 0,5 μm und 2 μm für die Höhe H und 0,5 μm bis 2 μm für die Breite B liegen.
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Die Querschnitte der Verbindungskanäle können beispielsweise zwischen 0,3 μm und 0,8 μm für die Breite b liegen. Sie sollen so dimensioniert sein, dass sie keine Zelle durchlassen können, also kleiner sind als der Zelldurchmesser bzw. der Zellquerschnitt.
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Die Länge der Kultivierungskanäle kann unterschiedlich ausgestaltet sein. Die Länge der Kultivierungskanäle oder des Kultivierungskanals sollte so bemessen sein, dass ein Mikroorganismus vollständig hineinpasst. Sie kann auch so ausgestaltet sein, dass mindestens zwei, beispielsweise 3, 4, 5, 6 oder mehr Mikroorganismen, beispielsweise 50 Mikroorganismen in einer Linie angeordnet sein können. Die Kultivierungskanäle können eine Länge L von beispielsweise 5 μm bis 30 μm haben. Sie soll so bemessen sein, dass die Nährstoffversorgung der Zelle noch durch Diffusion erfolgen kann. Dann kann sich ein Mikroorganismus an der Ausgansseite des Kultivierungskanals, an dem sich die Verjüngung befindet, positionieren. Wenn eine Zellteilung stattfindet, bleibt dieser Mikroorganismus, der als Mutterzelle bezeichnet werden kann, in dieser Position und die durch Zellteilung entstandenen Zellen können durch das Eintrittsende des Kultivierungskanals austreten. Die Mutterzelle verbleibt dann in dem Kultivierungskanal und kann beobachtet werden.
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Die Querschnitte der Kultivierungskanäle können so dimensioniert sein, dass sie beispielsweise Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen oder Mikroalgen aufnehmen können.
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Die Vorrichtung besitzt einen Versorgungskanal, welcher die Eingangsseite des Kultivierungskanals mit einer Flüssigkeit versorgt, in der sich die Mikroorganismen befinden. Der Versorgungskanal kann eine Breite BV von ca. 50 μm und eine Höhe HV von ca. 10 μm haben.
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Dem gegenüber dem Kultivierungskanal verjüngten Verbindungskanal schließt sich ein Abflusskanal an, durch den die Flüssigkeit in der sich die Mikroorganismen befinden abfließen kann. Der Abflusskanal kann gegenüber den Verbindungskanälen oder dem Verbindungskanal orthogonal angeordnet sein, es sind aber auch andere Winkel möglich, beispielsweise 35° bis 90°.
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Der Abflusskanal ermöglicht ausgangsseitig ein Austreten der Flüssigkeit. Der Abflusskanal kann an einem Ende vor dem Eintritt des ersten Verbindungskanals geschlossen sein. Alternativ kann der Verbindungskanal vor dem Eintritt des ersten Verbindungskanals an eine Flüssigkeitszufuhr, beispielsweise einem Schlauch mit einem Ventil, angeschlossen sein, die einen Flüssigkeitsstrom in dem Abflusskanal ermöglicht, so dass die durch den Verbindungskanal austretende Flüssigkeit abgeleitet werden kann. Dadurch kann eine Druckdifferenz entstehen, die zu einer Strömung führt und eine Lokalisation der Zelle in dem Bereich des Kultivierungskanals ermöglicht, die direkt vor dem Eingang des Verbindungskanals ist. Weiterhin wird eine Druckdifferenz gebildet, welcher das Eintreten der Mikroorganismen in den Kultivierungskanal erleichtert. Die Abmessungen für den Abflusskanal können mit denen des Versorgungskanals übereinstimmen oder in der gleichen Größenordnung liegen. Beispielsweise kann der Abflusskanal eine Breite BA von ca. 50 μm und eine Höhe HA von ca. 10 μm haben.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Versorgungskanal orthogonal zu den Kultivierungskanälen oder dem Kultivierungskanal ausgerichtet. Der Versorgungskanal kann zu dem Kultivierungskanal oder den Kultivierungskanälen in einem anderen Winkel angeordnet sein.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung befindet sich zwischen dem Versorgungskanal, der vorzugsweise orthogonal zu den Kultivierungskanälen oder dem Kultivierungskanal verläuft, eine Ausbuchtung des Versorgungskanals, in der gegenüber dem Versorgungskanal ein geringerer Volumenstrom der die Mikroorganismen enthaltenden Flüssigkeit vorliegt, da die Flüssigkeitsströmung im Versorgungskanal eine laminare Strömung besitzt, der Volumenstrom in der Ausbuchtung jedoch verringert ist. Die Ausbuchtung hat einen höheren hydrodynamischen Widerstand als der Versorgungskanal, so dass ein geringerer Volumenstrom entsteht.
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Dies ermöglicht ein besseres Einführen der Mikroorganismen in die Kultivierungskanäle, da die Verweildauer der Mikroorganismen im Eingangsbereich des Kultivierungskanal länger ist.
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Die Kombination von eingangsseitiger Ausbuchtung und ausgangsseitigem Verbindungskanal führt zu einem nochmals verbesserten Einführen der Mikroorganismen in den Kultivierungskanal, da Synergismen auftreten.
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Die Vorrichtung ist vorzugsweise als mikrofluidischer Chip ausgebildet, die nach oben geschlossen ist und in die der Versorgungskanal, der oder die Kultivierungskanäle, der Verbindungskanal und der Abfluss eingebettet sind.
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Die Querschnitte von Versorgungskanal, Kultivierungskanal, Verbindungskanal und Abflusskanal können unterschiedlich gestaltet sein. Sie können kreisförmig, oval, mehreckig, rechteckig oder quadratisch ausgebildet sein. Es ist auch jede beliebige Unterkombination von Querschnittsgeometrien der einzelnen Kanalarten möglich. Entsprechend können andere Querschnitte, als die in den Figuren dargestellten rechteckigen, gleiche oder ähnliche Abmessungen haben.
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Die Vorrichtung ist vorzugsweise aus transparentem, Material, das eine klare Durchsicht ermöglicht, so dass die Zellen visuell beobachtet werden können. Insbesondere die Kultivierungskanäle sollen transparent, vorzugsweise klar durchsichtig, sein und eine visuelle Beobachtung ermöglichen. Dazu kann die Vorrichtung, insbesondere die Kultivierungskanäle, mindestens teilweise aus Glas, Plexiglas oder durchsichtigem Silikon sein.
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Die Figuren zeigen die erfindungsgemäße Vorrichtung in schematischer Form.
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Es zeigt:
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1: Eine Aufsicht auf die erfindungsgemäße Vorrichtung.
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2a/b: Einen Strömungsverlauf der die Zellen enthaltenen Flüssigkeit in einem einzelnen Kultivierungskanal.
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3: Eine Darstellung der Abmessungen am Beispiel eines Kultivierungskanals.
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In 1 ist ein Versorgungskanal 1 dargestellt, an den sich eine Ausbuchtung 2 anschließt, die in mehrere Kultivierungskanäle 3, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f....mündet. In einem Kultivierungskanal 3c sind Zellen 4, 4a, 4b, 4c dargestellt, von denen das Bezugszeichen 4 den Mutterorganismus darstellt. Die Bezugszeichen 4a, 4b, 4c bezeichnen durch Zellteilung entstandene neue Mikroorganismen. An den Kultivierungskanälen 3, 3a, 3b, 3c, ...befinden sich Verbindungskanäle 5, 5a, 5b, 5c, ..., die in einen Abflusskanal 6 münden. Das Bezugszeichen 7 zeigt an einem Kultivierungskanal 3 beispielhaft die Seite des Kultivierungskanals, die als Eingangsseite bezeichnet wird. Mit dem Bezugszeichen 8 wird beispielhaft die Ausgangsseite eines Kultivierungskanals 3 dargestellt.
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In 2a haben gleiche Vorrichtungsmerkmale dieselben Bezugszeichen wie in 1. In ihr ist eine Ausführungsform dargestellt, bei der der Abflusskanal 6 an der Seite, die sich vor dem ersten Kultivierungskanal 3 befindet durch eine Wand 9 abgeschlossen ist. Die Pfeile geben die Fließrichtung des Nährmediums an.
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In 2b haben gleiche Vorrichtungsmerkmale ebenfalls dieselben Bezugszeichen wie in 1. In ihr ist eine Ausführungsform dargestellt, bei der der Abflusskanal 6 an der Seite, die sich vor dem ersten Kultivierungskanal 3 befindet mit einer Flüssigkeitszufuhr 10 ausgestattet ist. Die Pfeile geben die Fließrichtung der Flüssigkeit an, die die Mikroorganismen enthält.
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In 3 haben gleiche Vorrichtungsmerkmale dieselben Bezugszeichen, wie in 1 und 2. In ihr sind Abmessungen für die Querschnitte und deren Bezeichnungen dargestellt. A bedeutet den Querschnitt durch den Kultivierungskanal 3. Daneben befindet sich eine Projektion des Querschnitts A mit den Kanten B für die Breite und H für die Höhe. L gibt die Länge des Kultivierungskanals 3 an.
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AA bezeichnet den Querschnitt durch den Versorgungskanal 1. In der Projektion des Querschnitts AA bedeuten HV die Höhe und BV die Breite des Versorgungskanals 1.
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AAA bezeichnet den Querschnitt des Abflusskanals 6 mit den Bezeichnungen HA für die Höhe und BA für die Breite des Abflusskanals 6.
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Die Breite des Verbindungskanals wird mit b bezeichnet.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Flüssigkeit, welche Mikroorganismen enthält in einen Kultivierungskanal oder in Kultivierungskanäle geleitet, welche so dimensioniert sind, dass sie bezogen auf den Querschnitt einen einzelnen Mikroorganismus aufnehmen können, so dass sich eine Zelllage als Monlayer ausbilden kann, und die an ihrem der Eingangsseite gegenüberliegenden Ende einen Verbindungskanal aufweisen, der gegenüber dem Querschnitt bzw. Durchmesser des Kultivierungskanals verjüngt ist, so dass die Flüssigkeit in der sich die Mikroorganismen befinden, austreten kann.
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Dabei werden die Mikroorganismen in einem Flüssigkeitsstrom geführt, der einen Mikroorganismus in einen Kultivierungskanal einführt, wobei der Mikroorganismus in dem Kultivierungskanal verbleibt und die Flüssigkeit durch einen Verbindungskanal herausfließt.
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Unter einem Mikroorganismus ist vorzugsweise ein einzelliger Mikroorganismus zu verstehen.
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Es kann eine Strömung erzeugt werden, die bewirkt, dass der Mikroorganismus im Kultivierungskanal verbleibt. Die Strömung kann durch die Erzeugung einer Druckdifferenz zwischen dem Versorgungskanal und dem Abflusskanal hergestellt werden. Das kann dadurch erreicht werden, dass beispielsweise an der Ausgangsseite des Abflusskanals ein Unterdruck erzeugt wird. In den Abflusskanal kann alternativ oder ergänzend auch eingangsseitig eine Flüssigkeit eingeführt werden, die eine Strömung erzeugt, so dass in dem Verbindungskanal eine Strömung entsteht. Diese Strömung hat zur Folge, dass die Mikroorganismen beim Befüllen besser in die Kultivierungskanäle eingeführt werden. Die Druckdifferenz wirkt sich beim Befüllen der Kultivierungskanäle mit Mikroorganismen positiv aus.
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Die Flüssigkeit kann ein Nährmedium sein, welches den Mikroorganismus mit notwendigen Nährstoffen versorgt.
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Die Flüssigkeit kann durch einen Abflusskanal abgeführt werden.
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Die Flüssigkeit kann vorzugsweise orthogonal zur Fließrichtung im Kultivierungskanal abgeführt werden, es sind aber auch andere Winkel wie beispielsweise 35° bis 90° zur Fließrichtung im Kultivierungskanal möglich.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeit, die Mikroorganismen enthält, über einen Versorgungskanal zu den Kultivierungskanälen geführt. Die Strömungsrichtung im Versorgungskanal ist vorzugsweise orthogonal zur Strömungsrichtung in den Kultivierungskanälen. Das hat zur Folge, dass nicht zu viele Mikroorganismen in den Kultivierungskanal gedrängt werden und das Eintreten von Mikroorganismen in einen Kultivierungskanal erleichtert wird, da die die Mikroorganismen enthaltende Flüssigkeit gegenüber dem Versorgungskanal ein geringeren Volumenstrom besitzt. Die Strömungsrichtung im Versorgungskanal kann jedoch auch in einem anderen Winkel als 90° zum Kultivierungskanal verlaufen.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung werden die Mikroorganismen vor dem Eintritt in den Kultivierungskanal in eine Ausbuchtung geführt, in der ein geringerer Volumenstrom vorliegt. Dadurch wird der Eintritt eines Mikroorganismus in den Kultivierungskanal erleichtert.
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Es kann auch jeweils ein Mikroorganismus in mindestens einen von mehreren Kultivierungskanälen eingeführt werden.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das Verfahren ermöglichen, dass eine sehr hohe Anzahl von Kultivierungskanälen mit einem Mikroorganismus befüllt wird. Während bei den Vorrichtungen und den Verfahren nach dem Stand der Technik nur eine geringe Quote von Kultivierungskanälen mit einer Zelle besetzt wird, so kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine so gut wie vollständige Besetzung der Kultivierungskanäle mit einer Zelle erreicht werden.
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Zwischen dem Eingangsbereich des Kultivierungskanals, bzw. dem Versorgungskanal und dem Verbindungskanal bzw. dem Abflusskanal kann ein Druckgradient aufgebaut werden, der ein Eintreten eines Mikroorganismus in den Kultivierungskanal erleichtert. Dies kann beispielsweise durch eine Pumpe ermöglicht werden, die Flüssigkeit über den Abflusskanal absaugt.
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In dem Kultivierungskanal bzw. den Kultivierungskanälen können die Mikroorganismen visuell beobachtet werden. Dazu können beispielsweise Fluoreszenzmethoden und Mikroskopie herangezogen werden.
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Als Mikroorganismen können insbesondere Bakterien, Hefen oder Mikroalgen eingesetzt werden.
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Der in einem Kultivierungskanal eingefangene Mikroorganismus positioniert sich an dem Ende des Kultivierungskanals, an dem sich der Verbindungskanal, der als Verjüngung dient, befindet und kann sich teilen. Die abgeteilten Zellen können den Kultivierungskanal durch den Eingang, der in den Versorgungskanal oder die Ausbuchtung mündet, verlassen. Die Mutterzelle verbleibt in dem Kultivierungskanal und kann längere Zeit kultiviert und beobachtet werden.
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Für die Durchführung des Verfahrens kann die im Vorrichtungsteil der Beschreibung offenbarte Vorrichtung in jeder Unterkombination ihrer Merkmale verwendet werden.
