JP4816111B2 - マイクロピペットおよびこれを利用した細胞測定システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞の薬剤に対する反応を測定するために用いられるマイクロピペットおよびこれを利用した細胞状態量を測定する装置であり、細胞電気生理測定装置、薬品スクリーニング装置などに用いられる。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、微細な先端を持つガラスマイクロピペットを用いて細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なガラスマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞状態量測定の一つである電気生理的測定を可能にする技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

一方、細胞と接触しうる細胞作用剤を含有する溶液を連続的または間欠的に流すのに適した微小流体室と、この微小流体室中に保持された生細胞とこの生細胞に生じる細胞媒介細胞外効果を測定する手段を用意することで、前記微小流体室中に流した細胞作用剤の効果を測定する技術について開示しており（例えば、特許文献２参照）、特に、この開示された技術を用いると細胞の極周辺に細胞作用剤を供給、または排出をすることができ、細胞周辺の溶液環境の切り替えを迅速に行いたいときに有効である。
特表２００２−５０８５１６号公報 特許第２９９３９８２号公報

しかしながら、前記従来に開示された構成では、微小流体室の高さは少なくとも２００μｍ以下、好ましくは１００μｍであることが必要であるとされている。しかしながら、細胞の形状、性質、あるいは培養液または薬液の流動性、拡散係数、濃度等の変化を観測したい場合において、前記のような固定された微小流体室では十分に対応できないという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、種々の細胞に対して、培養液または薬液の流動性、拡散係数、濃度等の変化などによる細胞の反応を高精度に観測したい場合においても容易に対応できるマイクロピペットおよびそれを用いた細胞測定システムを実現することを目的とするものである。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、微小なシャワー穴を設けた薄板とその周辺を保持する枠体板からなるカバーチップと、微小な内径を有する中空管を有する中空構造体の先端に前記カバーチップを接合した構成とするものである。

本発明のマイクロピペットおよびこれを利用した細胞測定システムは、細胞の周辺へ確実に薬剤供給を行えるマイクロピペットを実現できることに加えて、このマイクロピペットは細胞測定センサの上部より抜き差し可能とすることによって、細胞への距離を高精度に制御可能とし、種々の細胞に対して培養液または薬液の流動性、拡散係数、濃度等の変化による細胞の反応を高精度に観測したい場合においても容易に対応できる細胞測定システムを実現することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１におけるマイクロピペットおよびそれを用いた細胞測定システムについて図面を用いて説明する。

図１は本発明の実施の形態１におけるマイクロピペットの断面図であり、図２はカバーチップの上面図であり、図３は別の例のカバーチップの断面図である。

図１において、マイクロピペット１は、その内部に例えばチューブなどの中空管３を内包した中空構造体２と、この中空構造体２の先端にはカバーチップ４が嵌合あるいは接着などによって接合している。

そして、このカバーチップ４はシリコンよりなる薄板５と、これの周囲を保持するシリコンよりなる枠体板７から構成している。ここで、薄板５には第一のシャワー穴６を少なくとも一つ形成している。この第一のシャワー穴６を１個だけ設けることによって間欠的に精度良く薬液を滴下したり、細胞だけに直接連続的に噴射したりしながら、測定することができる。

ここで、種々の細胞に対して培養液または薬液の流動性、拡散係数、濃度等の変化を観測したい場合、細胞測定システムに用いるマイクロピペット１の形状は高精度な寸法形状を有していることと、細胞との距離を制御しながら、所定の位置に前記マイクロピペット１を配置することが必要である。これによって、少量の薬液であっても正確に細胞に薬液を接触させることができるとともに、細胞が薬液に接触した時間もほぼ正確に把握することが可能となることから、高精度な薬剤の評価システムに最適なマイクロピペット１を実現することができる。

また、膨大なテストが必要な細胞測定システムには、後で述べる細胞電気生理センサ８をマトリックス状に複数個配置した構成をとることが多い。これに対しても、前記マイクロピペット１の構成とすることによって、複数個配置された細胞電気生理センサ８の所定の場所に前記マイクロピペット１を精度良く配置したり、あるいはこれらを一体化した構造とすることも容易に実現できるという利点を有している。

また、細胞３７の大きさは１０〜３０μｍ程度のサイズを有しており、この細胞３７の表面に正確に薬液を接触させることによって細胞３７の薬液に対する反応を高精度に観測することが必要であり、そのためにはシャワー穴の開口径は２０μｍ以下とすることが好ましい。そして、より好ましくは１〜１０μｍの範囲であり、このような構成とすることによって、測定条件を詳細に変更しながら細胞の反応を測定することができる細胞測定システムを実現することができる。

また、中空管３の内径が２０μｍ以下とすることが好ましい。２０μｍを超える内径を有するマイクロピペット１では外形が大きくなり、微小な細胞３７を扱う細胞電気生理センサ８には不適当であるとともに、薬液の微小レベルの液量制御が困難となる。

前記のような構成において、薄板５と第一のシャワー穴６を半導体プロセスによって極めて高精度に形成することができることから、非常に高精度に加工されたマイクロピペット１の先端部として機能することができる。このマイクロピペット１を用いて薬剤の投入などを行う場合には、非常に高精度な注入を可能にすることができる。

また、図２に示すようにカバーチップ４の薄板５に設けられた第一のシャワー穴６は複数とすることが可能であり、これによって、薬剤の投入時に複数の第一のシャワー穴６に均等に圧力がかかることから、より均一な薬剤注入を行うことができる。このとき、第一のシャワー穴６の大きさは２〜８μｍが好ましい。

さらに、図３に示すように、カバーチップ４を第一のシリコン層１０と二酸化シリコン層１２と第二のシリコン層１１からなる積層体より構成し、薄板５は第一のシリコン層１０および二酸化シリコン層１２より形成し、枠体板７は第二のシリコン層１１より形成することによって、薄板５の機械的強度を高くすることができるとともに、薄板５の厚みを高精度に形成することができるという製造上の利点を有する。

以上説明してきたようなマイクロピペット１は半導体プロセスを用いて作製することによって高精度な微小形状のマイクロピペットを効率よく作製することができる。

次に、本発明の細胞測定システムについて図面を用いて説明する。

図４は本発明の細胞測定システムの断面図であり、図５はこの細胞測定システムの構成要件の一つである細胞電気生理センサの断面図であり、図６は細胞測定システムの断面図である。また、図７（ａ）は他の例のカバーチップの上面図であり、図７（ｂ）は他の例のキャビティの上面図である。さらに、図８は別の例の細胞電気生理センサの要部拡大断面図であり、図９は他の例の細胞電気生理センサの要部拡大断面図である。

図４〜図６において、このシステムの構成要件の一つである細胞電気生理センサ８は、仕切り板９に貫通孔１３を少なくとも一つ備え、仕切り板９の周囲は支持板１４で支持されたセンサチップとしており、この支持板１４はさらにチップ保持板１５の貫通孔の内部に接着剤１６によって接合されており、前記仕切り板９を境界として電気的変化を検出するための第一の電極１７と第二の電極１８が対向して形成している。

さらに、前記保持板１５の上部には培養液などの溶液を貯留するための容器２１と、下部に流路封止板１９を備えることによって流路２０を形成している。

一方、細胞測定システムのもう一つの構成要件であるマイクロピペット１は細胞電気生理センサ８の上部からセンサチップに形成されたキャビティ３５の内部方向へ接近することができる。

ここで、仕切り板９は貫通孔１３を備えており、液体中の細胞３７を保持する手段として機能する。つまり、この貫通孔１３を境に圧力差を発生させることで、図５に示すように細胞３７が浮遊している培養液などの液体２５は貫通孔１３の内部に流れ込み、特に貫通孔１３の下部にある流路２０を吸引することで細胞３７は貫通孔１３を塞ぐようにして保持される。

一方、マイクロピペット１の先端部であるカバーチップ４の外形は細胞電気生理センサ８のキャビティ３５の内径部より若干小さくしていることから、図６に示すように、仕切り板９の近傍までカバーチップ４の先端である薄板５を近づけることができるようになっている。このため、仕切り板９の貫通孔１３を塞ぐように保持されている細胞３７に近接した状態で確実に薬剤をマイクロピペット１の第一のシャワー穴６から注入することができるようになる。特に、細胞３７の大きさが測定できているときには細胞３７までの距離を正確に制御することができる。

そして、図６に示すように、好ましくはカバーチップ４の外形はキャビティ３５の内形よりわずかに小さい形状としており、キャビティ３５の内部にマイクロピペット１のカバーチップ４を挿入する際にガイドとなっている。

これによって、極めて高精度にカバーチップ４の先端をアライメントできるので、細胞３７が保持された必要な領域に向かって正確に薬剤をマイクロピペット１の第一のシャワー穴６から投与することができる。

また、図７（ａ）に示すように、好ましくはカバーチップ４の外形に凸部３３あるいは凹部を形成するとともに、図７（ｂ）に示すようにキャビティ３５の内形には凹部３４あるいは凸部を形成することによってカバーチップの凸部３３とキャビティの凹部３４が組み込まれるようになっている。これによって、カバーチップ４がキャビティ３５の内部に挿入される際には方向性までも高精度にアライメントすることができる。

また、図８に示すように細胞３７が保持される手段としては、貫通孔１３の上部に窪み３２を設けることがより効果的である。これによって細胞３７は下部に重力によって沈降する場合、より低い位置である窪み３２の内部へ保持されやすくなる。

さらに、図９に示すように細胞３７が保持される手段としては、貫通孔１３の内壁面、および窪み３２の表面に親水性の高い材料（図示せず）をパターニングして形成しており、その以外の領域では疎水性の高い材料３８をパターニングして形成している。これによってより細胞３７は貫通孔１３の付近に保持されやすくなる。

このようにして貫通孔１３の上部に保持された細胞３７は貫通孔１３を十分に高い密着性で仕切り板９によって上下の領域を電気的に絶縁することができるので、例えばイオンチャンネルを介したイオンの入出力などに代表される細胞３７の電気生理活動を第一の電極１７と第二の電極１８とによって測定することによって細胞状態量を測定できるシステムを構成することができる。

なお、実施の形態１では細胞状態量として、細胞膜電位、膜電流、膜容量、膜抵抗などの電気生理的物理量について説明したが、色、発光などの光学的物理量、大きさ、形、弾力性などの機械的物理量なども含む。この場合は、細胞電気生理センサの代わりに光センサ、機械量センサを設置することによって実現できる。

（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２におけるマイクロピペットおよびそれを用いた細胞測定システムについて図面を用いて説明する。

図１０は本発明の実施の形態２におけるマイクロピペットの断面図であり、図１１はカバーチップの上面図である。

図１０に示すように、マイクロピペット２２は中空構造体２３を有しており、この中空構造体２３は複数の中空管２４ａおよび中空管２４ｂを有しており、中空構造体２３の先端に薄板２６とこの周囲に枠体板２７からなるカバーチップ３６を当接させて接合している。この枠体板２７には第一の差し込み口２８と第二の差し込み口２９を設けており、それぞれが中空管２４ａ、中空管２４ｂに接続している。さらに、薄板２６の第一の差し込み口２８、第二の差し込み口２９にはそれぞれ第一のシャワー穴３０と第二のシャワー穴３１を設けている。これによって、図１２に示すように中空管２４ａおよび中空管２４ｂにはそれぞれ種類の異なる薬剤を投入することができることと中空構造体２３を形成していることから、第一のシャワー穴３０および第二のシャワー穴３１からそれぞれ独立して高精度に制御しながら種類の異なる薬剤の投入をしたり、薬剤の濃度を段階的に変化させるために薬剤と希釈剤とを同時に制御することによって細胞３７の近傍で細胞３７の薬剤の高度変化に対する反応を測定したりすることが可能となる。

さらに好ましくは、中空管２４ａ、第一のシャワー穴３０から薬剤を投入すると同時に、第二のシャワー穴３１、中空管２４ｂから液体を排出する手段を接続する。これによって図１３に示すように、保持された細胞３７の周辺に薬剤を注入すると同時に、周辺にある液体を排出することが可能となることから、細胞３７の周辺により迅速に薬剤を運ぶことができる。また、逆に細胞３７の周辺から薬剤を速やかに除去することも可能である。

以上のように、本発明にかかるマイクロピペットおよびそれを用いた細胞測定システムは、種々の細胞に対して、薬液の条件を変化させて細胞状態量の変化を測定したい場合においても容易に対応できることから、例えば高速で薬理判定を行う薬品スクリーニング等の測定器として有用である。

本発明の実施の形態１におけるマイクロピペットの断面図 同カバーチップの上面図 別の例のカバーチップの断面図 同細胞測定システムの断面図 同断面図 同断面図 （ａ）同他の例のカバーチップの上面図、（ｂ）同キャビティの上面図 同別の例の細胞測定システムの要部拡大断面図 同他の例の要部拡大断面図 本発明の実施の形態２におけるマイクロピペットの断面図 同カバーチップの上面図 同マイクロピペットの断面図 同断面図

符号の説明

１ マイクロピペット
２ 中空構造体
３ 中空管
４ カバーチップ
５ 薄板
６ 第一のシャワー穴
７ 枠体板
８ 細胞電気生理センサ
９ 仕切り板
１０ 第一のシリコン層
１１ 第二のシリコン層
１２ 二酸化シリコン層
１３ 貫通孔
１４ 支持板
１５ 保持板
１６ 接着剤
１７ 第一の電極
１８ 第二の電極
１９ 流路封止板
２０ 流路
２１ 容器
２２ マイクロピペット
２３ 中空構造体
２４ａ、２４ｂ 中空管
２５ 液体
２６ 薄板
２７ 枠体板
２８ 第一の差し込み口
２９ 第二の差し込み口
３０ 第一のシャワー穴
３１ 第二のシャワー穴
３２ 窪み
３３ カバーチップの凸部
３４ キャビティの凹部
３５ キャビティ
３６ カバーチップ
３７ 細胞
３８ 疎水性材料

Claims (10)

1. 開口径が２０μｍ以下のシャワー穴を設けた薄板とその周辺を保持する枠体板からなるカバーチップと、内径が２０μｍ以下の中空管を有する中空構造体とからなり、この中空構造体の先端に前記カバーチップを接合したマイクロピペット。
2. 中空構造体は複数の中空管を有し、それぞれの中空管には少なくとも一つのシャワー穴を接続し、それぞれの中空管に別々の流体を流すことができる請求項１に記載のマイクロピペット。
3. カバーチップは第一のシリコン層と酸化シリコン層と第二のシリコン層からなる積層体とし、薄板は第一のシリコン層および酸化シリコン層とし、枠体板は第二のシリコン層とした請求項１に記載のマイクロピペット。
4. 細胞を保持する手段を有した仕切り板とその周囲に当接された支持板とからなる細胞測定センサと、この細胞測定センサに保持された細胞周辺へ薬剤を正確に供給する手段とを備えた細胞測定システムであって、前記薬剤を正確に供給する手段が、開口径が２０μｍ以下のシャワー穴を設けた薄板とその周辺を保持する枠体板からなるカバーチップと、内径が２０μｍ以下の中空管を有する中空構造体の先端に前記カバーチップを接合したマイクロピペットを用いて行うとともに、前記支持板のキャビティの内部へ抜き差し可能とした細胞測定システム。
5. カバーチップの外形をキャビティの内形よりわずかに小さい形状とし、前記キャビティの内部に前記カバーチップを挿入するときの挿入ガイドとした請求項４に記載の細胞測定システム。
6. カバーチップの外形に凸部あるいは凹部を設けるとともに、この凸部あるいは凹部に一致するようにキャビティの内形に凹部あるいは凸部を設けた請求項５に記載の細胞測定システム。
7. 仕切り板に設けられた貫通孔と、この貫通孔を境にして圧力差を発生させて液体中の細胞を保持する請求項４に記載の細胞測定システム。
8. 仕切り板に設けられた半球形の窪みに液体中の細胞を保持する請求項４に記載の細胞測定システム。
9. 仕切り板に設けられた疎水性領域と親水性領域とからなるパターンを利用して液体中の細胞を保持する請求項４に記載の細胞測定システム。
10. 中空構造体は複数の中空管を有し、それぞれの中空管には少なくとも一つのシャワー穴を接続し、それぞれの中空管に別々の流体を流すことができるマイクロピペットを用いる請求項４に記載の細胞測定システム。

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