AT505106A1 - Einrichtung, insbesondere bio-chip, zur identifizierung von mikro-organismen - Google Patents

Description

1 Hintergrund und Stand der Technik t· ···· ···· ···· • · · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • t «· · ·

Die Identifizierung von phänotypischen Merkmalen und die rasche Erkennung von morphologischen Veränderungen unter bestimmten Bedingungen stellt einen wesentlichen Bestandteil vieler zellbiologischer Charakterisierungen dar. Traditionell angewandte Methoden zur Identifizierung von Mikroorganismen bestehen meist aus Anreicherungsschritten gefolgt von einer Reihe von Untersuchungen, wie beispielsweise morphologisches Erscheinungsbild, biochemisches Screening,

Wachstumscharakterisierung oder serotypische und seriologische Bestätigungen.

Moderne mikrobielle Identifzierungsmethoden lassen sich entweder als genotypische oder als phänotypische Methoden klassifizieren.

Genotypische Methoden inkludieren alle Formen von DNA- und RNA-Analysen, die das genetische Material von Mikroorganismen nach spezifischen Sequenzen untersuchen, um die Anwesenheit von bestimmten Enzymen, Stress-Faktoren, Antibiotika-Resistenzmechanismen od. dgl. zu detektieren. Viele genotypische mikrobielle Identifizierungsmethoden sind in der Literatur beschrieben. (Lit.: 1-5)

Phänotypische Identifikationsmethoden beurteilen den Anteil des Genoms einer Zellkultur, das gerade exprimiert ist. Diese Methoden inkludieren die traditionellen Möglichkeiten, die das Wachstum einer Zellkultur unter unterschiedlichen Bedingungen untersuchen sowie biochemische Screening durchführen, um metabolische Fähigkeiten zu bestimmen. Es existiert schon eine Vielzahl an Erfindungen in Mikrotiterplatten-Format (Lit.: 6-31).

Weitere, ebenfalls schon beschriebene phänotypische Identifizierungsmethoden messen das Zellwandpotential mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen in Gegenwart bioaktiver Chemikalien (Lit.: 32). Dazu gehören auch Datenbank-basierte oder Fingerprint-Methoden unter der Verwendung von Pattern Recognition Analysen, die Signalmuster erkennen und jeweils bekannten Organismen zuordnen.

Es wurden hierfür schon verschiedenste Messmethoden vorgeschlagen und eingesetzt, wie insbesondere Pyrolyse-Massenspektrometrie, Magnetresonanzdaten, die ein spezifisches Muster erzeugen, oder das Anbinden von Mikroorganismen an modifizierte Oberflächen sind in der Literatur beschrieben (Lit.: 33-35).

Die bekannteste Methode zur phänotypischen Charakterisierung von Zellen ist die Durchflusszytometrie. Hier finden Zählung, Untersuchung und Sortierung von in Suspension gehaltenen Zellen in einem Flüssigkeitsstrom statt. Diese Methode erlaubt die Bestimmung der Eigenschaften von Einzelzellen, die durch eine Messkammer fließen.

Eine weitere etablierte Methode zur Zellcharakterisierung kommt im so genannten Coulter Counter zum Einsatz. Hierbei werden sich in einer schwachen Elektrolytlösung Lösung befindende Zellen durch eine kleine Öffnung zwischen zwei Elektroden geleitet und mittels Impedanzspektroskopie analysiert. Das Coulter Prinzip basiert darauf, dass 2 ·· ·· ···· ···· ··«· « • · · · · · ··· • · · · • · ♦ · · ♦ · ♦ ······· · · ·· #· ·· » · ···

Partikel oder Zellen die Messzone passieren und dabei den Elektrolyten verdrängen. Durch Analyse der Pulse kann dann auf die Größenverteilung der Zellen geschlossen werden.

Eine Vielzahl von Bioimpedanz-Methoden sind ebenfalls in der Literatur beschrieben. Hierbei wird die Zellcharakterisierung mittels Elektroden, die in Kontakt mit der Lösung stehen, durchgeführt. In den meisten Fällen wird die Veränderung der Lösungkonduktivität gemessen und auf diese Weise werden Informationen über die Zellzahl sowie über die metabolische Aktivität von Zellpopulationen gewonnen.

Weiters wurden Impedanzmethoden zur Bestimmung Membranrezeptoren, wie lonen-Kanäle, lonen-Pumpen, chemische Einflüsse oder Anbindung spezifischer Antikörper-Antigen-Liganden an Rezeptoren beschrieben (Lit.: 37-39).

Integrierte mikro-dielektrische Sensoren wurden beispielsweise bereits für die Detektion von DNA-Molekülen (Lit.: 36) oder unterschiedliche organische und anorganische Substanzen nach Auftrennung mittels Kapilarelektrophorese verwendet (I). Eine weitere Anwendung von dielektrischen Sensoren in der Durchflusszytometrie erfolgte zur Bestimmung des Zellzyklus einzelner Zellen, da so ein Anstieg im zellulären DNA-Gehalt an lebenden Zellen aufgezeigt werden kann (II).

Schnellmessungen sind besonders für die phänotypische Charakterisierung von Zellen und vor allem für die Beobachtung des dynamischen Verhaltens lebender Organismen von enormer Bedeutung (III). Als Methode zur markerfreien Identifizierung von lebenden Zellen wird in der vorliegenden Erfindung die dielektrische Spektroskopie verwendet. Diese Messmethode ist ideal für die nicht-invasive Charakterisierung von biologischen Systemen (IV).

Eine Reihe von dielektrischen Messapparaten für die Untersuchung von in Suspension gehaltenen Zellen, wie z.B. in Fermentoren, mittels alternierenden elektrischen Feldern wurde in den letzten Jahren entwickelt (V). Eine dafür wichtige Eigenschaft der dielektrischen Spektroskopie ist die Möglichkeit, quantitative Signale über ein breites Frequenzspektrum bei kleiner Amplitude zu erhalten. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, biologische Systeme nahezu störungsfrei zu untersuchen. Dielektrische Spektroskopie wurde deshalb bereits zur Untersuchung von Zellsedimentationen, Aggregierung, Zellteilung und Wachstum in flüssiger Umgebung eingesetzt (VI).

Die vorliegende Erfindung verwendet interdigitale Elektrodenstrukturen (pIDES) als mikro-dielektrische Sensoren. Diese Sensoren zeigen im Vergleich zu Standard-Zwei-Elektrodensystemen eine erhöhte Sensitivität (V, VII). Photolithographisch erzeugte, in den Biochip integrierte, interdigitale Elektrodenstrukturen bieten den Vorteil der genauen Dimensionierung der elektrischen Feldverteilung und somit letztendlich der Sensitivität (VIII).

Die bisher erwähnten bekannten Standard-Methoden sind meist langwierig und ·· ·· ···· ···· ···· · ···· · · ··· ····· · · · 3···· ·· · · ······· · · ·♦ ·· ·· ♦ ♦ »·· arbeitsintensiv. Sie benötigen im Allgemeinen Zeiträume von mehreren Tagen bis zu einigen Wochen. Oft muss eine Vielzahl von indirekten Tests durchgeführt werden. Die meisten phänotypischen Schnelltests basieren auf der Detektion bestimmter Oberflächenmoleküle, die optisch, elektrisch oder mit anderen Messmethoden gemessen werden können.

In fast allen Fällen wird ein Fluoreszenzmarker in die Zellkultur eingebracht, der unter Umständen das natürliche Verhalten der Zellen negativ beeinflusst. Oft ist hierbei die Größe der Markermoleküle, die die Größe der zu analysierenden Substanz, wie z.B. bei der Antigen-Antikörper Reaktion, übertrifft und daher einen wesentlichen Einfluss auf die Kinetik des Systems nimmt, entscheidend. Viele der Marker sind nicht langzeitstabil, wodurch es bei wiederholter Anregung zu einem Ausbleichen der Floureszenzmarker kommt. Aus diesem Grund sind Langzeittests mit derartigen Systemen kaum durchführbar.

Des Weiteren ist zurzeit nur eine limitierte Anzahl von Markern, die nur spezielle Ereignisse anzeigen können, verfügbar. Die Versuchsdurchführung ist somit stark vom ausgewählten Marker bestimmt. In vielen Fällen ist nur eine Endpunkt-Detektion möglich, da viele Prozesse, wie z.B. Hybridisierungsprozesse, nur unter definierten Prozessbedingungen, also bei bestimmter Temperatur, in C02-Athmosphäre od. dgl., in Brutschränken ablaufen.

Die Analyse ist entweder nur punktuell während des Prozesses oder erst nach dessen Beendigung möglich. Im Speziellen ist die Kinetik des Prozesses über eine kontinuierliche Messung, insbesondere Online-Monitoring, nicht zugänglich. Ein entscheidender Nachteil von im Handel erhältlichen Zellanalysensysteme ist folglich die fehlende Möglichkeit der dynamischen Beobachtung phänotypischer Veränderungen von Zellen, beispielsweise während der Zellalterung, Einbringung von externen Stimuli und anderer Einflüsse.

Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung, insbesondere einen Biochip, gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1, welche bzw. welcher die im Kennzeichen dieses Anspruches genannten Merkmale aufweist.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die berührungslose, in Echtzeit erfolgende und kontinuierliche sowie nicht-invasive Aufnahme von dielektrischen Daten einer adhärenten Zellkultur. Sie ist imstande, Auskunft über die Identität, Vitalität, Morphologie, Mobilität und die dielektrischen Eigenschaften der Organismen zu geben. Die gewonnen optischen bzw. spektroskopischen Daten können daher sowohl zur raschen Identifizierung von Organismen als auch zur Bestimmung relativer Veränderungen im phänotypischen Zellverhalten über längere Zeiträume herangezogen werden.

Eine mittels der neuen Einrichtung ermöglichte Verkürzung der erforderlichen Testzyklen bei der Entwicklung neuer Therapeutika sowie bei der Quantifizierung ihrer Wirkungseigenschaften unter physiologisch relevanten Bedingungen stellt eine enorme Bereicherung für die Datenqualität, beispielsweise bei Untersuchungen hinsichtlich Toxizität dar.

Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Einrichtung zur raschen und einfachen Bestimmung von zellulären Verdopplungsraten verwendet werden. Die kleinen Sensor-Dimensionen erlauben eine effektive Messung von 100 bis 1000 Zellen, die in die Messkammern eingeschleust oder mittels gravimetrischer Methoden auf die Sensor-Oberfläche aufgebracht werden. Zellverdoppelungsraten können mittels der vorliegenden Erfindung kontinuierlich und über kurze Zeitperioden gemessen werden. Einzigartig an der gegenständlichen Erfindung ist außerdem die Kombination dielektrischer Messspektren für die hochauflösende rasche Bestimmung morphologischer Unterschiede von lebenden Zellverbänden auf der Basis von in fluidische Mikrochips eingebetteten, kontaktlosen mikro-dielektrischen Sensoren. Nähere Beschreibung der Erfindung

Die Mikrochip-Technologie in der Biologie folgt dem Trend der Miniaturisierung von analytischen Messmethoden unter Verwendung der MEMS(micro-electromechanical-systems)-Technologie, da sie einerseits die Gesamtkosten von komplexen Analysen stark verringert und andererseits neue Möglichkeiten für analytische Systeme eröffnet (IX). Die Herstellung von Biochips basiert auf photolithographischen Prozessen, die ursprünglich für die Mikroelektronik entwickelt wurden.

Der größte Vorteil der Chip-Technologie liegt in der eigentlichen Miniaturisierung der Messmethode. Hier können zusätzliche physikalische Eigenschaften, die in großen Volumina nicht möglich sind, wie beispielsweise bei der diffusionsunterstützten Mischung, genützt werden. Weiters hat die erfolgreiche Etablierung der Genomik gezeigt, dass miniaturisierte Systeme effizientere, schnellere und genauere Analysenmethoden darstellen (X). Gerade diese Eigenschaften sind besonders bei Zellanalysen von Bedeutung, da eine hohe Sensitivität eine Grundvoraussetzung von bzw. für Echtzeitmessungen ist (XI). Die Etablierung von Zellkulturen auf Chips hat zu neuen und effizienteren Methoden für die Untersuchung von Einzelzellen und Zellverbände über längere Zeiträume geführt (XII). Für die kontrollierte on-chip-Manipulation von Zeilen wurde bereits eine Vielzahl von Zellchips in der Literatur beschrieben (XIII, XIV).

Die hier beschriebene Erfindung basiert auf der Messung von relativen Ablenkungen gegenüber einem Referenzzweig in einem alternierenden elektrischen Feld über einen weiten Frequenzbereich. Die zu untersuchenden biologischen Systeme werden in einem schwachen elektrischen Wechselfeld, z.B. mit ±15 mV, polarisiert und jede morphologische, biochemische oder biologische Veränderung, die die dielektrischen • · t · · · ··· • · · · « · · · 5···· ·· · ♦ ··♦···· · · ·· ·· ·· · « ···

Eigenschaften der Plasma-Membran, des Cytoplasmas, Nukleus und anderer Zellkomponenten beeinflusst, rasch und mit hoher Auflösung detektiert.

Aus diesem Grund, bietet die Methode nicht nur die Möglichkeit, zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden, Zellwachstum zu verfolgen und strukturelle Eigenschaften zu unterscheiden, sondern auch, die Identifizierung unterschiedlicher Organismen vorzunehmen. Die Messeinrichtung, wie z.B. der Multichannel Potentiostat VMP3, Princeton Applied Research, ist kommerziell erhältlich, genau evaluiert und gut charakterisiert, während der mikrofluidische Biochip sowie die mikro-dielektrischen Sensoren mittels Standard-Halbleiter-Technologien hergestellt werden.

Es hat sich in der Praxis gezeigt, dass es besonders günstig ist, die Abschirmschicht mit mehreren speziellen Schichtlagen auszubilden, wie dem Anspruch 2 zu entnehmen. Über die vorteilhafterweise einzuhaltende Dicke der Abschirmschicht gibt der Anspruch 3 näher Auskunft, wobei dem Anspruch 4 die Dicken der dieselbe bildenden einzelnen Schichtlagen betrifft.

Dem Anspruch 5 sind die im Sinne der Wirksamkeit der zum Einsatz gelangenden Feldstärken günstigsten Gesamt-Schichtdicken von Abschirmschicht plus an denselben haftenden Organismen-Schicht zu entnehmen.

Der Anspruch 6 nennt im Rahmen der Erfindung bevorzugt einzusetzende Metalle bzw. Metalllegierungen für den Mikro-Sensor.

Der Anspruch 7 bezieht sich auf die dem neuen Bio-Chip zugrundeliegende Fluidik-Struktur.

Eine für die beschriebenen Unterlagen vorteilhaft geeignete Baustruktur des einzusetzenden Biochips ist im A n s p r u c h 8 geoffenbart.

Einen weiteren wesentlichen Gegenstand der Erfindung stellt das Untersuchungs-Verfahren gemäß Oberbegriff des Anspruches 9 dar, welches die dem Kennzeichen dieses Anspruches zu entnehmenden

Verfahrensmerkmale aufweist.

Die Ansprüche 11, 12 und 23 betreffen die für die Analyse günstige Konzentration der Organismen in der Suspension sowie vorteilhafter Weise der Bedeckung der Messfläche der Messkammer mit denselben.

Der Anspruch 14 enthält Angaben hinsichtlich der bevorzugten Spannungswerte für die Anspeisung der Kammstruktur des Mikro-Sensors.

Schließlich geben die Ansprüche 15 bis 19 günstigerweise zum Einsatz gelangende Arten der Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtung für verschiedene Untersuchungen an Organismen bzw. Mikroorganismen wieder.

Anhand der Fig. 1 bis 7 wird die Erfindung näher erläutert:

Die Fig. 1 zeigt das Grunddesign eines erfindungsgemäßen Biochips 100, der aus ·· »· ···· ···· ···· · • · · · · t · ·· ····· · · · 6···· · · · · ······« · · ·· ·· ·· · · ··· einem Glas-Substrat 1, das die Mikro-Sensoren 4 beinhaltet und einem Polymer-Teil 2, der die Mikrofluidik, im wesentlichen umfassend die Zuflüsse A und C mit den Bezugszeichen 6 und 9, die Mikrokanäle 7, den Injektor 10 sowie die eigentliche Messkammer 5 und der Referenzmesskammer 5', beherbergt, besteht. Der Biochip 100 birgt mehrere Sensoren und Kanalsysteme, die über entsprechenden Verbindungen an Reservoire und Pump- und Heizsysteme angeschlossen sind, wozu im Einzelnen auf die Fig. 1A(b) hinzuweisen ist. Das Schnittbild der Fig. 1A)b) zeigt anschaulich das Glas-Substrat 1, die interdigitale Kammstruktur des Mikro-Sensors 4 mit den "Kammzähnen" 42 und deren isolierender Abschirmschicht 40 mit der Dicke ds, z.B. mit einer Dicke von bis zu 500 nm, in welche der Mikro-Sensor 4 eingebettet ist. An diese mehrlagige Schicht 40 schließt sich nach oben hin die in das Polymer 2 eingearbeitete bzw. eingeätzte Messkammer 5, deren Messfläche 50 mit den zu untersuchenden (Mikro-)Organismen (8), bevorzugt deckend, beschichtet bzw. belegt ist und welche eine Dicke do aufweist, wobei es wichtig ist, dass die beiden Dicken ds plus do maximal 5,1 bzw. 5,51 pm betragen sollen.

Die Fig. 1 B)a) zeigt - bei sonst gleichbleibenden Bezugszeichen-Bedeutungen · eine Nahaufnahme der Messkammer 5 mit Fluidikkanälen 9 und 7, während die Fig. 1B)b) einen Ausschnitt aus der in Form einer Metallisierung 11 vorliegenden interdigitalen Kammstruktur 42 des Mikro-Sensors 4 zeigt.

Die Fig. 1C zeigt die Integration des in den Fig. 1A und 1B gezeigten Mikrochips bzw. Biochips in das Gesamt-System der Analyse mit Heizsystem 101 für Heizung bzw. Kühlung des Chips 100, mindestens einer Pumpe 102 für die Förderung von Nährmedien, Testmedien und Spülmedien, einem Injektionssystem 103 für die Einbringung des zu untersuchenden Organismen-Materials in die Messkammer 5 des Biochips 100 bzw. für die Beladung bzw. Belegung der elektrisch isolierten Sensoren mit den Organismen 8, alles Bestandteile des Fluidik-Systems.

Sie zeigt weiters das für die Messung und Ausgabe der gemessenen Daten zuständige Elektrik-System, mit dem die Hochfrequenzfelder generierenden und dieselben den Mikro-Sensoren des Biochips 100 zuführenden und die Impedanz messenden Potentiostaten 104 und dem Personalcomputer 105 für Aufzeichnung, Analyse und Abgleich der Impedanz-Daten mit Datenbanken und für die Klassifizierung und Quantifizierung der untersuchten (Mikro-)Organismen 8.

Weiters bietet der integrierte Referenzarm des in der Fig. 1A)a) gezeigten Biochips 100 mit der Referenz-Messkammer 5' die Möglichkeit für hintergrund- und interferenz-freie Messungen.

Um möglichst stabile Signale zu erhalten, sind die interdigitalen Elektroden Strukturen (pIDES) 4 zur Isolation unterhalb eines die Abschirmschicht 40 bildenden Mehrschicht-Systems eingebettet. Mehrere harte oder weiche Passivierungsmaterialien, wie beispielsweise Siliciumnitrat, Siliziumoxid, Glas (SOG) und/oder Epoxy-Polymere eignen sich dafür. Sie werden großflächig mittels lithographischer Methoden auf dem Chip 100 aufgebracht. Die erfindungsgemäß wesentliche physikalische Separation der pIDES-Struktur von der flüssigen Umgebung eliminiert die direkte Interaktion von den in ihr enthaltenden elektroaktiven Substanzen und Ionen mit der Sensor-Elektroden-Oberfläche. Signal Einflüsse, die durch die Elektroden-Polarisation oder Luftblasenhaftung entstehen könnten, werden auf diese Weise verhindert.

Drift-Analysen mit salinen Puffern haben eine relative Standardabweichung von 1.5 % über eine Periode von 20 h ergeben. Es ist wichtig darauf zu achten, dass die mikro-dielektrischen Sensoren zur Gänze abgeschirmt sind, ohne dabei an Sensitivität zu verlieren.

Die Fig. 2A zeigt anhand eines Diagramms:Strom in Ampöre zu Spannung in Volt, die Ergebnisse einer elektrochemischen Analyse der Passivierungsqualität der erfindungsgemäß verwendeten Isolierungsschichten gegenüber nicht isolierten Sensoren in Gegenwart einer hoch elektroaktiven Substanz, im vorliegenden Fall 10 mM Kaliumhexacyanoferrat, Kurve 1. Es wurde jedoch kein detektierbarer Anteil eines faradayischen Stromes bei Verwendung einer 550 nm dicken Isolierung bzw. Abschirmschicht gemessen, Kurve 2. Weiters zeigen Berechnungen mittels "conformal mapping technique", dass durch Isolierschichtdicken, welche geringer als 500 nm sind, ein Sensitivitätsverlust unter 8 % zu halten ist.

Der berührungslose Sensor des pIDES des Mikro-Sensors weist beispielsweise 200 Finger mit Abständen 5 pm voneinander auf, welche 5pm Breite und 1000 pm Länge aufweisen. Das bedeutet, dass biologische Komponenten, die sich nahe zur Sensor-Oberfläche befinden, den größten Einfluss auf das Messsignal haben, da 95% der elektrischen Feldlinien und somit des effektiven Signalanteiles unterhalb von 5,51 pm liegen, wozu auf Fig. 2B, welche die Abhängigkeit des Signalanteils von der Schichtdicke zeigt, zu verweisen ist. Aus diesem Grund verhalten sich die neuen mikro-dielektrischen Sensoren unterschiedlich zu den bisher bekannten bzw. existierenden dielektrischen Sensoren, da sich bei diesen die biologischen Systeme in direktem oder engem Kontakt mit deren Oberfläche befinden müssen. Während kommerziell erhältliche Systeme besonders sensitiv auf Zellgröße und Zellzahl reagieren, zeigen die erfindungsgemäß abgeschirmten mikro-dielektrischen Sensoren die größten Ablenkungen als Folge von unterschiedlicher Zell-Zusammensetzung.

Die Fig. 3 zeigt anhand eines Diagramms:Impedanz (ΔΙΖΙ/Ohm) zu log Konzentration (cfu/pL) deutlich, dass die vielfach größeren Hefezellen, konkret Pichia pastoris, geringere Signale generieren, als die Bakterien Staphylococcus xylosus und Bazillus subtilis nach Sensorsättigung.

Die Tatsache, dass die Gram-positiven Bakterien, wie S. xylosus und B. subtilis, die eine unterschiedliche Membran-Zusammensetzung gegenüber Gram-negativen Bakterien, wie E. coli und Serratia forticola bei an sich ähnlichen Zellgrößen haben, weist weiters darauf hin, dass die erfindungsgemäß isolierten mikro-dielektrischen Sensoren besonders auf Unterschiede in der Zellmorphologie ansprechen. Die Unterscheidung zwischen Gram-positven und Gram-negativen Bakterien ist von großer Bedeutung in der klinischen Medizin, da gewisse Antibiotika nur bei Gram-positven oder eben Gramnegativen Krankheitserregern eingesetzt werden dürfen. Hierzu sei auf Fig. 3B verwiesen, mit dem Diagramm:lmpedanz (Ohm) zu log Konz. (cfu/pL).

Ein weiterer Beweis für das Vorliegen einer morphologie-abhängigen Messung liegt in der Erkennung und Unterscheidung von lebenden und toten Zellen.

Die Fig. 4A/4B zeigen anhand von Diagrammen Impedanz (Ohm) zu verschiedene Mikroorganismen und IZI(Ohm) zu Frequenz (Hz) Resultate von lebenden und toten Hefezellen, im konkreten Fall von Candida albicans. Auf Agarplatten durchgeführte Wachstumsversuche mit 2 h lang einem Ultraschallbad ausgesetzten Hefezellen bestätigte, dass auf diese Weise eine vollständige Abtötung der Hefekultur gewährleistet ist.

Die Fähigkeit der neuen Vorrichtung, zellmorphologische Merkmale mittels dielektrischer Spektroskopie von auf Oberflächen lebenden biologischen Systemen zu unterscheiden, kann folglich auch zu ihrer Identifizierung herangezogen werden. Voraussetzung ist jedoch, dass der Messbereich bzw. die Messfläche mit Zellen gesättigt ist. Für die vollständige Beladung der beschriebenen Sensorgeometrie mit biologischem Material reichen im Allgemeinen Zellzahlen von größer als 107 cfu/mL aus.

Die Fig. 5A und B zeigen, Pattern Recognition Plots von Zellen und Kulturmedien unter Anwendung einer chemometrischen Datenanalyse. Die Kultivierung von Hefe- und Bakterien-Stämmen erfolgte extern in Schüttelkolben unter standardisierten

Wachstumsbedingungen.

Anschließend wurde ein Minimum von vier Proben von jeder Zellkultur entnommen und in den Bio-Chip injiziert und mittels dielektrischer Spektroskopie charakterisiert. Jeder Punkt im Graph repräsentiert daher den gesamten Datensatz einer Messprobe. Die Generierung abstrakter Vektoren (Scores) mittels Principle Component Analysis (PCR) ist eine weit verbreitete Analysenmethode, um bestimmte Muster, wie Gruppierungen oder Verwandschaftsverhältnisse zu bestimmen. Nahe aneinander liegende Punkte repräsentieren somit Datensätze mit geringer Varianz und sind als identisch anzusehen.

Um den Einfluss des Kulturmediums oder die durch das Wachstum des Organismus verursachte Veränderung des Mediums auf die Identifizierung zu bestimmen, wurde anfänglich das Kulturmedium von den Zellen entfernt und getrennt gemessen.

Die Fig. 5A und 5B zeigen im Rahmen eines Schemas:Faktor 1/Faktor 2 bzw. PC1/PC2 Pattern Recognition Plots von Organismen und deren Wachstumsmedien. Da die Gruppierungen nur mit den Zellen und nicht von den unterschiedlichen Wachstumsmedien erhalten wurde, ist anzunehmen, dass Veränderungen des Mediums durch den untersuchenden und zu bestimmenden Organismus die Identifizierung nicht maßgeblich beeinflussen.

Dies zeigt auch den entscheidenden Unterschied der neuen Methode gemäß der Erfindung gegenüber herkömmlichen Impedanz-Methoden, wo frei liegende und mit den Organismen direkt in Kontakt kommende Elektroden die Abbau- und Ausscheidungsprodukte von lebenden Systemen mit- detektieren. Weiters ermöglicht dies, einen Probenaufbereitungs-Schritt zu eliminieren, da die Zellkulturen erfindungsgemäß direkt gemessen werden können.

Zur Vorgangsweise im Rahmen der Faktoranalyse sei Folgendes erläuternd bemerkt: Bei der auf das gegenständliche System bezogenen Principle Component Analyse (PCA, Faktor Analyse) werden die Impedanz und Phasen-Daten von dielektrischen Spektra einzelner Mikroorganismen verwendet, um eine Daten Matrize zu generieren. Jede Säule der Matrize umfasst beispielsweise 501 Werte und jedes Experiment erhält eine eigene Reihe, z.B. 501 x 17 im Falle der Fig. 5B. Die Matrize wird in eine Lotus-Datei umgewandelt und in MATLAB, Version 7.01, geladen. Die Faktor-Analyse wird durchgeführt mittels der Chemometric Toolbox for MATLAB, Version 3.02, und beinhaltetet die Generierung von reduzierten Eigenvektoren, die Untersuchung der Normalverteilung und Eliminierung des Rauschanteiles sowie die Berechnung der unterschiedlichen Faktoren, nämlich von Faktor 1, Faktor 2 oder eben Principle Components (PC) 1 und 2 für jeden Datensatz. Die errechneten Principle Components PC1 und PC2 wurden für die graphische Abbildung des jeweils erhaltenen Musters verwendet.

Aus den beiden Diagrammen der Fig. 5A und 5B ist klar ersichtlich, dass die mittels erfindungsgemäßer Apparatur erhaltenen dielektrischen Signale eine Identifizierung von Mikroorganismen tatsächlich ermöglicht.

Ein weiters Anwendungsgebiet der neuen dielektrischen Identifizierungsmethode liegt in der Schnellerkennung morphologischer Veränderungen einer an sich bereits bekannten Zelllinie. Auf definierten Oberflächen wachsende Zellen werden einem externen Stimulus ausgesetzt und die phänotypischen Reaktion der Zellpopulation wird kontinuierlich gemessen. Als externe Umwelteinflüsse stehen eine weite Palette an Möglichkeiten, wie Temperaturschwankungen, Variationen in den Fließgeschwindigkeiten, unterschiedliche Medienzusammensetzungen oder Materialzugaben, wie z.B. Nanopartikel zur Verfügung.

Die Fig. 6A und 6B zeigen anhand von Diagrammen: IZI(Ohm) zu Zeit(h) das Verhalten einer Hefekultur in der Proliferationskammer des Bio-Chips bei Variation der

Durchflussgeschwindigkeit. Durch eine Erhöhung der Scherkräfte, verursacht durch einen Anstieg der Fließgeschwindigkeit, siehe durchgehender Pfeil, ist es möglich, die Zellpopulation der Hefe P. pastoris in der Wachstumskammer konstant zu halten, während niedere Flussraten einen dynamischen Wachstumsverlauf, erkennbar an periodischen Signalen, anzeigen. Ein zehnfacher Anstieg der Flussrate von 0.05 pL/min auf 0.5 pL/min führt anfänglich zu einem merklichen Verlust der Zellpopulation der C. albicans Kultur, also zu einer Auswaschung, gefolgt von einem stetigen Zuwachs und Etablierung eines Biofilms. Weiters sind im deutlich synchronen Wachstumsmuster "Perioden" des Biofilms zu beobachten, was darauf hin weist, dass ein Teil der neuen Zelten merkbar etwa alle 30 min aus dem Biofilm ausgeschieden werden.

Die Fig. 6A und 6B demonstrieren, dass der erfindungsgemäße Sensor auf Veränderungen in der Zelizusammensetzung sensitiv reagiert, im Unterschied zu existierenden Technologien, die hauptsächlich nur die Messung der Zu- oder Abnahme von Zellzahlen ermöglichen. Das heißt, selbst wenn die Organismen nicht sterben und deren Gesamt-Zellzahl somit konstant bleibt, können die Effekte auf zellulärer Ebene mitverfolgt werden, wobei gegebenenfalls das direkte Erfassen von sub-zelluläre Strukturen, wie z.B. der Zellwand od. dgl., innerhalb einer gesamten Zellpopulation möglich ist.

Von besonderem biologischem und medizinischem Interesse ist das Erfassen von sub-zellulären Veränderungen, z.B. der Zellwandzusammensetzung lebender Zellen. Das Schema: Z(Ohm) zu Zeit(h) der Fig. 7A zeigt das dynamische Verhalten eines Candida Biofilms vor und nach Zugabe von 0.5 pg/mL Amphotericin B (Pfeil). Kurz nach Zugabe des Fungizides steigt das Impedanz-Signal mit einer Rate von 30 Ohm/h in den ersten zwei Stunden, gefolgt von einer etwas geringeren Rate von 10 Ohm/h für die verbleibenden 10 Stunden. Da im Gegenzug, wie aus Fig. 7b ersichtlich, die Zeitzahl in diesem Zeitraum ständig weiter gestiegen ist, deuten die gemessen Signal-Veränderungen direkt auf Veränderungen von sub-zellulären Strukturen innerhalb der Zellpopulation hin und nicht auf eine Abnahme der Zellzahl.

Es ist bekannt, dass sich Amphotericin B besonders in der Plasmamebran von Pilzen anlagert und so das Wachstum von Pilzen hemmt. Die Hemmwirkung ist auch aus der Fig. 7B erkennbar, da die Zellpopulation nur geringfügig über einen Zeitraum von 10 h zunimmt, was auch Wachstumstests unter Standardbedingungen zeigten.

Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für Schnellanalysen, wie beispielsweise zur phänotypischen Unterscheidung und Identifizierung von unterschiedlichen Primär- und Standard-Zelltypen sowie insbesondere zur Differenzierung von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien.

Ebenso kann sie für Langzeitmessung an Zellkulturen und deren dynamische Analyse, zur Erfassung von toxischen Effekten, hervorgerufen durch verschiedenste

Chemikalien, Materialien und Umwelteinflüsse auf bestimmte Zelltypen mit bekannter Identität herangezogen werden.

Darüber hinaus sind die Charakterisierung von genmanipulierten und Standard-Zelllinien, die Erfassung elektrophysiologischer Daten von Zellkulturen und die Optimierung von biotechnologischen Prozessen im Kleinstmaßstab geeignete Einsatzgebiete. Für alle Anwendungen gilt, dass sich die zu untersuchenden Zellen, Organismen u. dgl. auf definierten Oberflächen befinden müssen, unterhalb derer sich die durch die isolierende Abschirmschicht abgeschirmten mikro-dielektrischen Sensoren befinden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung betrifft also eine nicht-invasive und markerfreie Methode, um Organismen, insbesondere Mikroorganismen zu identifizieren, und umfasst folgende Schritte:

Nach Erhalt einer Reinkultur eines unbekannten Mikroorganismus wird eine bestimmte Probenmenge auf die passivierte und von der Testlösung durch die Abschirmschicht isolierte Sensor-Oberfläche aufgetragen, um den Messbereich bzw. die Messfläche der Messkammer zur Gänze mit Zellen zu beladen. Eine einzelne aus Zellen bestehende Schichtlage ist hierbei ausreichend, da die Sensoren nur eine geringe Messtiefe, nämlich 95% Signalanteil bei Schichttiefen von weniger als 5,1 pm aufweisen.

Anschließend werden mittels Zellulär-Dielektrischer-Spektroskopie die dielektrischen Eigenschaften der biologischen Probe gemessen. Die über einen weiten Frequenzbereich erhaltenen Impedanz-Signale sind für die in der Probe enthaltenen Zelltypen spezifisch und eignen sich daher direkt zu deren Identifikation.

Weiters können jeweilige Veränderungen der dielektrischen Eigenschaften einer adhärenten Zellkultur dynamisch gemessen werden und zeigen somit relative Veränderungen von Zellpopulationen in Echtzeit.

Patent Literatur 1. US Patent Application 20020187490 (Tiedje et al.) 2. US Patent Application 20030049636 (Bergeron et al.) 3. US Patent Application 20030124545 (Rothman et al.) 4. US Patent Application 20030180733 (Bergeron et al.) 5. US Patent Application 20040023208 (Haydock et al.) 6. US Patent 3,957,586 (Babson et al.) 7. US Patent 4,118,280 (Charles et al.) 8. US Patent 4,129,483(Bochner) 9. US Patent 4,235,964 (Bochner) 10. US Patent 4,456,380 (Kondo et al.) 11. US Patent 4,603,108 (Bascomb) 12. US Patent, 4,604,351 (Amaral) 13. US Patent 4,724,215 (Färber) 14. US Patent 4,856,073 (Färber et al.) 15. US Patent 5,089,395 (Snyder et al.) 16. US Patent 5,164,301 (Thompson et al.) 17. US Patent 5,223,402 (Abbas et al.) 18. US Patent 5,340,747 (Eden) 19. US Patent 5,843,699 (Strenkoski et al.) 20. US Patent 5,888, 760 (Godsey et al.) 21. US Patent 6,372,485 (Clark et al.) 22. US Patent 6,387,651 (Bochner et al.) 23. US Patent 6,436,631 (Bochner et al.) 24. US Patent 6,555, 322 (James et al.) 25. US Patent 6,611,765 (Boeufgras et al.) 26. US Patent Application 20020064867 (Clark et al.) 27. US Patent Application 20030032171 (Gemmell et al.) 28. US Patent Application 20030162164 (Bochner et al.) 29. US Patent Application20040009572 (Felice et al.) 30. World Patent Application W02004050675 (Taintor) — 31 World Patent ApplinnfflffFfr 3Q1, 577(Mikkelsen et al.) 32. US Patent 4,343, 782 (Shapiro) 33. US Patent Application 20020138210 (Wilkes et al.) 34. US Patent Application 20030097059 (Sorrell et al.) 35. US Patent 6,780,602 (Lloyd et al.) 36. Eur. Pat. Appl. EP 1312683 A2 20030521 (2003) (Yoon, Dae-Sung et al.) i 37. US Patent Application 2001-13017 20011130 (Freeman etal. 2003) 38. US Patent Application 2006172279 A1 20060803 (Smela et al. 2006) \ 39. US Patent Application 2003-619820 20030714 (Liu et al. 2005)

Referenzen: I. Kubä, P.; Kubä, P.; Kuba, V., Rapid speciation of Se(IV) and Se(VI) by flow injection-capillary electrophoresis System with contactless conductivity detection Analytical and Bioanalytical Chemistry 2004, 378, (2), 378-382. II. Asami, K.; Takashashi, K.; Shirahige, K., Progression of cycle monitored by dielectric spectroscopy and flow-cytometry analysis of DNA content. Yeast 2000. III. Bochner, B. A., New Technologies to Assess Genotype-Phenotype Relationships. Nature Reviews Genetics 2003, 4, 309 - 314. IV. Asami, K., Characterization of Biological Cells by Dielectric Spectroscopy Journal of Non-Crystalline Solids 2002, 305, (1-3), 268-277. V. Ciambrone, G. J.; Liu, V. F.; Lin, D. C.; McGuinness, R. P.; Leung, G. K.; Pitchford, S., Cellular Dielectric Spectroscopy: A Powerful New Approach to Label-Free Cellulr Analysis. Journal Biomolecular Screening 2004, 9, (6), 467-480. VI. Markx, G. H.; Davey, C. L., The dielectric properties of biological cells at radiofrequencies: Applications in biotechnology. Enzyme Microbial Technol. 1999, 25, (3-4), 161-171. VII Gerwen, P. V.; Laureyn, W.; Laureys, W.; Huyberechts, G.; De Beeck, M. O.; Baert, K.; Suis, J.; Sansen, W.; Jacobs, P.; Hermans, L.; Mertens, R., Nanoscaled interdigitated electrode arrays for biochemical sensors. Sensors and Actuators B 1998, 49, 73-80. VIII. Igreja, R.; Dias, C. J., Analytical evaluation of the interdigital electrodes capacitance for a multi-layered structure. Sensors and Actuators A 2004,112,291-301. IX. Dittrich, P. S.; Tachikawa, K.; Manz, A., Micro Total Analysis Systems. Latest Advancements and Trends. Analytical Chemistry 2006, 78, 3387-3907 X. Deutsch, J.; Desai, T. A.; Motlagh, D.; Russell, B., Microfabricated in vitro cell culture Systems for investigating cellular interacitons. Proc. Soc. Photooptical Instrum. Eng. 2000, 3912, 105-113. XI. El-Ali, J.; Sorger, P. K.; Jensen, K. F., Cells on Chips. Nature 2006, 442, (27), 403-411 XII. Shackman, J. G.; Dahlgren, G.; Peters, J. L.; Kennedy, R. T., Perfusion and Chemical monitoring of living cells on a microfluidic Chip. Lab on a Chip 2005, 5, 56-63. XIII. Tourovskaia, A.; Figueroa-Masot, X.; Folch, A., Differentiation-on-a-chip: A microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab on a Chip 2005, 5, ΜΙ 9. XIV. Xing, W.-L.; Cheng, J., Biochips: Technology and Applications. Springer Verlag: New York, 2003. ·* ···· MM ···

Figuren-Erläuterungen:

Fig. 1: A) Graphische Darstellung des Biochip-Layouts, B) Bildauschnitte der Messkammer und des mikro-dielectrischer Sensor, C) experimenteller Versuchsaufbau

Fig. 2: A) Zyklische Voltammetrie von (1) nicht isolierten und (2) isolierten pIDES

Sensoren; B) Berechnung der Gesamtkapazität in Abhängigkeit der Bedeckung

Fig. 3: A) Vergleich der Sensorsignale (Betrag der Impedanz bei 50 kHz) mit

Zellzahlkonzentration von sechs verschiedenen Organismen; B) Vergleich der Sensorsignale (Impedanz bei 50 kHz) zwischen Gram-negativen (E.coli) und Gram-positiven (B. subtilis) Bakterien

Fig. 4: A) Blockdiagram von lebenden, mit Amphoterizin B und Ultraschall behandelten

Hefen; B) Rohdaten von C. albicans vor und nach erfolgter Ultraschall-Behandlung

Fig. 5: Pattern recognition plot von Impedanzdaten von A) zellfreien Medium Extrakt von drei Microoganismen. E. coli K12 (0), B. subtilis (▼) und P. pastoris () wurden unter Standardbedingungen kultiviert, geerntet (exponentielle Phase), zentrifugiert und jeweils 1 pL des Überstandes in den Biochip injiziert und für 30 Minuten absitzen lassen vor jeder Messung. (B) Pattem recognition plot von Phasen Werten von B. subtilis (▼), S. xylosis (ο), E. coli K12 (0), P. pastoris (), and S. fonticola (·) Reinkulturen.

Fig. 6: Einfluss von Durchflussraten und Scherkräften auf den Wachstumsverlauf von A) Pichia pastoris und B) C. albicans Hefe-Kulturen

Fig. 7: (A) Dynamisches Verhalten eines Candida Biofilms nach Zugabe von 0.5 pg/mL Amphotericin B (Pfeil) wobei (a) Impedanzsignale und (b) Phasen Werte für 50 kHz gegen die Kultivierungszeit aufgetragen sind. (B) Fotos (vor und nach der Zugabe von Amphoterizin B) von der Wachstumskammer in der C. albicans unter 37oC and 0.5 pL/min Flussrate kultiviert wurde.

Claims (19)

15 ·«·· ·Μ· #···

Patentansprüche: 1. Einrichtung, insbesondere Bio-Chip, zur phänotypischen Untersuchung, vorzugsweise zur, gegebenenfalls kontinuierlichen, direkten berührungslosen Identifizierung und Charakterisierung von Organismen, insbesondere Mikroorganismen, mittels dielektrischer Spektroskopie ohne Zugabe von Markern unter Einsatz zumindest einer interdigitalen, metallischen Kammstruktur als dielektrischer Mikro-Sensor und zumindest einer oberhalb der- bzw. desselben angeordneten, für die Aufnahme der zu untersuchenden Organismen, insbesondere Mikroorganismen, vorgesehenen Messkammer, vorzugsweise mit Zu- und Abführkanälen für fluide Medien mit Anschlüssen für Leitungen, Reservoirs, Pumpen, Heizsysteme od. dgl., und mit mindestens einer mit dem Mikro-Sensor verbundenen, Einheit (Potentiostat) für die Einspeisung von hochfrequenten Wechselfeldern über einen weiten Frequenz-Bereich in den Mikro-Sensor sowie zur Impedanz- bzw. Impedanzveränderungs-Erfassung, dadurch gekennzeichnet, dass - für eine nicht-invasive Aufnahme von dielektrischen Kenngrößen, Daten, Signalen od. dgl. - die mit den Mikro-Organismen (8) zu beliefernde Messkammer (5) bzw. deren mit den (Mikro-)Organismen (8) zu belegende Boden- und Messfläche (50) und somit die (Mikro-)Organismen (8) selbst durch eine untere dünne, bioaffine, bevorzugt mehrlagige, für die vom Mikro-Sensor (4) abgegebnen elektrischen Felder sowie für die Antwortsignale von bzw. aus den Mikro-Organismen (8) in der Messkammer (5) zwar durchlässige, jedoch jeglichen Kontakt der zu untersuchenden (Mikro-)Organismen und des dieselben enthaltenden fluiden Mediums mit der metallischen Oberfläche der interdigitalen Kammstruktur des Mikro-Sensors absolut ausschließenden, aus mindestens einem elektrisch nicht leitenden, nicht magnetischen, nicht magnetisierbaren, nicht dielektrischen und für Moleküle jeder Art undurchlässigen Material bestehenden Abschirm- bzw. Isolierschicht (40), von der der Messkammer (5), insbesondere deren Messfläche (50), zugewandten, auf einem Substrat (1), vorzugsweise Glas-Substrat, aufgebrachten, Metallisierung (41) der interdigitalen Kammstruktur (42) des Mikro-Sensors (4) getrennt ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschirm-Schicht (40) mit zwei bis fünf, vorzugsweise mit voneinander verschiedenen, nicht-dielektrischen Materialien bzw. mit Materialien mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften, insbesondere Siliziumdioxid, Siliziumnitrid, Aluminiumoxid, Spin-on-Gläser (SOG) mit zumindest einem Additiv, wie z.B. Organosilikate, und/oder Photolacke, wie z.B. SU8, gebildeten auf der Mikro-Sensor-Oberfläche (4) und aneinander haftenden Einzel-Lagen gebildet ist.

3. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Abschirm-Schicht (40) insgesamt eine Dicke (ds) von 200 bis 500 nm aufweist.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Lagen der Abschirm-Schicht (40) jeweils eine Dicke (dl) von 50 bis 250 nm, vorzugsweise von maximal 100 nm, aufweisen.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Summe der Dicken der Abschirm-Schicht (41, ds) und Schichtdicke der zu untersuchenden (Mikro-)Organismen (8, do) maximal 10 pm, bevorzugt 5,5 pm, beträgt.

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikro-Sensor (4) bzw. die denselben bildende dielektrische Kammstruktur (42) aus einem Edelmetall bzw. aus einer Edelmetall-Legierung, insbesondere aus einer Titan-Gold- oder Titan-Platin-Legierung. gebildet ist, und die genannte Kammstruktur (42) mittels eines Haftmittels, wie z.B. Titan, auf dem Substrat (1) fixiert ist.

7. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammer (5) und die mit ihr verbundene Fluidik-Mikrostruktur (7) in eine auf das den Mikro-Sensor (4) und die Abschirm-Schicht (40) aufweisende Substrat (1) kovalent gebunden aufgebrachte Schicht (2) eingeprägt ist.

8. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der zum Einsatz gelangende Biochip zwei Messkammern (5, 5') mit unterhalb derselben angeordnetem, von deren Boden- bzw. Messfläche (50) durch eine Abschirmschicht (40) isoliertem Mikro-Sensor (4) aufweist, wobei eine (5) der Messkammem (5, 5') die mit den Mikro-Organismen (8) zu beschickende Identifizierungs-Kammer (5) und die andere eine, beispielsweise mit dem Suspensionsfluid beschickbare, Referenz- bzw. Kompensationskammer (5') ist.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieselbe bzw. der zum Einsatz gelangende Biochip (100) sterilisierbar und wiederverwendbar ist. ·· ··♦· ···· ··« 17

10. Verfahren zur phänotypischen Untersuchung, vorzugsweise zur, gegebenenfalls kontinuierlichen, Identifizierung und Charakterisierung von Organismen, insbesondere Mikroorganismen, mittels dielektrischer Spektroskopie ohne Zugabe von Markern unter Einsatz zumindest einer interdigitalen, metallischen Kammstruktur als dielektrischer Mikro-Sensor und zumindest einer oberhalb desselben angeordneten Messkammer, in welche die zu untersuchenden Organismen, insbesondere Mikroorganismen, vorzugsweise in Form einer Suspension, eingebracht bzw. auf deren Boden- bzw. Messfläche als, bevorzugt einlagige, Schicht aufgetragen werden, insbesondere unter Einsatz einer Einrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, - dass von dem dielektrischen Mikro-Sensor über einen weiten Frequenzbereich Hochfrequenz-Signale an die Organismen in der Messkammer bzw. auf deren Messfläche abgestrahlt werden, wobei die Hochfrequenz-Signale und die die Impedanz an der interdigitalen Kammstruktur ändernden Antwort-Signale aus der Messkammer bzw. von den sich dort befindenden Organismen eine für diese Signale durchlässige, dieselben und den HF-Signalfluss im wesentlichen nicht beeinflussende, dünne, die der Messkammer bzw. deren Messfläche zugewandte Oberfläche der interdigitalen Kammstruktur des Mikro-Sensors von der genannten Messkammer bzw. von den sich dort befindlichen Organismen trennende, bevorzugt mehrlagige, Abschirm- bzw. Isolierschicht aus mindestens einem elektrisch nicht leitenden, nicht magnetischen, nicht magnetisierbaren und nicht dielektrischen Material, durchqueren, und dass die auf diese Weise erhaltene Menge an Impedanz(-Änderungs)-Daten in der Recheneinheit (gemäß Funktionsdiagramm in Abbildung 1C) einer chemometrischen Datenanalyse unterworfen werden und durch Generierung abstrakter Vektoren, insbesondere mittels Principle Component Analysis (PCA) als voneinander getrennte, jeweils für einen phänotypisch einheitlichen Organismus charakteristische, insbesondere Faktor 1/Faktor 2-diagramm-lagespezifische, Plättern Recognition Plots bzw. -Plot-Muster dargestellt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Proben von (Mikro-)Organismen-Suspensionen in die Messkammer des Bio-Chips eingebracht werden, deren Individuen-Konzentration mehr als 107 cfu/ml beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine bevorzugt flächendeckende, Ein-Lagen-Beschichtung der Messfläche der Messkammer mit den (Mikro-)Organismen vorgenommen wird. ·· ···· ···· ···· 18

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bedeckung der Messkammern bzw. von deren Boden- bzw. Messfläche mit (Mikro-)Organismen 5 bis 95%, vorzugsweise auf 75 bis 95 %, eingestellt bzw. gehalten wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der mit der interdigitalen Kammstruktur gebildeten Mikro-Sensors mit einem HF-Wechselfeld mit einem Potential von ± 10 bis ± 30 mV, vorzugsweise von ± 10 bis ± 20 mV, angespeist wird.

15. Verwendung der Einrichtung bzw. des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur schnellen Identifizierung von Organismen, insbesondere Mikroorganismen, direkt aus Reinkulturen mittels Fingerprinting und Vergleich zu bzw. mit Impedanz-Spektren von Datenbanken.

16. Verwendung der Einrichtung bzw. des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur raschen Unterscheidung und Einteilung von Mikroorganismen in Gram positive und Gram negative Bakterien.

17. Verwendung der Einrichtung bzw. des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Langzeit-Charakterisierung von (Mikro-)Organismen- bzw. Zellpopulationen aus standardisierten Proben und Reinkulturen.

18. Verwendung der Einrichtung bzw. des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Beobachtung und Bestimmung der Vitalität und des Wachstums, insbesondere der Verdoppelungsraten, von (Mikro-)Organismen, insbesondere in Anwesenheit von dieselben beeinflussenden Medien.

19. Verwendung der Einrichtung bzw. des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 für Langzeit-Untersuchungen von (Mikro-)Organismen unter dem Einfluss von mit denselben in der Messkammer in Kontakt gebrachten Substanzen variabler chemischer Zusammensetzung und/oder toxischer Substanzen und/oder Strömungsbedingungen des die (Mikro-) Organismen enthaltenden bzw. umspülenden fluiden Mediums. Wien, am 27. März 2007