EP2089508A1 - Vorrichtungen und verfahren für elektrophysiologische zelluntersuchungen - Google Patents

Vorrichtungen und verfahren für elektrophysiologische zelluntersuchungen

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Publication number
EP2089508A1
EP2089508A1 EP07819499A EP07819499A EP2089508A1 EP 2089508 A1 EP2089508 A1 EP 2089508A1 EP 07819499 A EP07819499 A EP 07819499A EP 07819499 A EP07819499 A EP 07819499A EP 2089508 A1 EP2089508 A1 EP 2089508A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
capillary
holding element
rod
liquid
patch
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07819499A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Steffen Hering
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Wien
Original Assignee
Universitaet Wien
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Wien filed Critical Universitaet Wien
Publication of EP2089508A1 publication Critical patent/EP2089508A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the invention relates to a liquid holder device for electrophysiological examinations of biological cells, in particular a liquid holder device having the features of the preamble of claim 1.
  • the invention further relates to an electrophysiological measuring device which is equipped with such a liquid holder device and in particular comprises a patch-clamp pipette.
  • the invention also relates to a method for the electrophysiological examination of a biological cell using such a liquid holder device.
  • the patch-clamp device contains a capillary-shaped pipette (patch-clamp pipette), at the tip of which a cell can be aspirated and measured.
  • the patch-clamp pipette contains a measuring electrode for deriving an electrophysiological potential from the cell or for measuring transmembrane ion currents.
  • the ion channels are important targets for drugs.
  • a variety of drugs act selectively on certain ion channels. so that a tool for pharmacological examinations is available with the patch-clamp technique.
  • Drop holder is surrounded.
  • the desired liquid environment of the capillary tip can be formed with a drop of liquid trapped by capillary forces in the drop holder.
  • a disadvantage of the conventional drop holder according to US 2005/0241940 A1 consists in the coaxial relative movement of pipette tip and drop holder, which have a small distance (capillary gap) in all relative positions. To avoid damage to the pipette or cell, therefore, a complex precision drive is required.
  • Another disadvantage is the obstruction of the perfusion of the cell in the altered drug solution, which is initially shielded by the drop holder on all sides of the cell becomes. This results in a relatively high expenditure of time for the perfusion, which is disadvantageous for the reproducibility and comparability of a plurality of patch-clamp measurements on a cell.
  • a further object of the invention is to provide an improved measuring device, in particular for patch-clamp examinations.
  • a generic liquid holder means for forming a liquid environment on a capillary tip of a patch-clamp pipette is arranged to provide a holding element for receiving a liquid drop, which is arranged separable from the capillary when used for liquid holding with a patch-clamp pipette.
  • the at least one rod for holding the retaining element is formed so that the retaining element is separable in particular from the capillary.
  • the holding element can be positioned with the rod on or next to the capillary tip (conditioning position) and can be separated from the capillary (release position) so that the capillary tip is free and a distance between the holding element and the capillary tip is greater the width of a capillary gap.
  • the retaining element In contrast to the conventional drop holder, the retaining element
  • a number of advantages can be achieved both in terms of the requirements and accuracy of movement of the retainer and with respect to the intended use of the patch-clamp pipette.
  • the rod to which the holding element is attached is adapted to be pivotably fixed to a capillary holder of the patch-clamp pipette.
  • the rod preferably has a pivot joint on an end opposite the retaining element.
  • the retaining element has a free surface on at least one side, which can be approximated laterally to the capillary tip, ie radially with respect to a longitudinal direction of the capillary.
  • the rod when the liquid holder device according to the invention is attached to a patch-clamp pipette, the rod is pivotable relative to the longitudinal direction of the capillary of the patch-clamp pipette.
  • the holding element can be pivoted by pivoting of the rod from an applied state (conditioning position), in which the holding element is separated from the capillary tip by a capillary gap or abutting the capillary tip, by a radial movement in a protruding state (release position), in which the holding element, the Kapil- larspitze, z. B. for further observations, measurements or
  • the axial movement of the conventional drop holder is replaced by a radial movement of the holding element according to the invention.
  • the retaining element for holding the liquid droplet for the formation of the liquid environment at the capillary tip is arranged under the action of the gravitational force, wherein the retaining element is releasably secured to the rod.
  • the holding element forms a support on which a quantity of liquid is carried.
  • larger amounts of liquid can be provided to condition the capillary tip with improved stability and reliability.
  • the holding element may have a unilaterally open, planar or curved shape. This results in a further important advantage improved perfusion in the transfer of a liquid-enclosed cell at the top of the capillary in a changed environment medium.
  • the cell is only partially shielded by the retaining element from the new surrounding medium, so that the droplet on the droplet holder dilutes rapidly due to liquid flow and diffusion.
  • the effect of the substance in the new surrounding medium e.g. B. a new drug solution to be examined after a time that is shorter compared to the time required for perfusion with a conventional drop holder.
  • the holding element may be a planar or curved component which, in the applied state of the liquid-holding device, is arranged adjacent to the capillary tip or partially surrounds it in an azimuthal manner.
  • the retaining element is sheet-shaped, z. B. formed in the form of a glass or plastic lamella.
  • the holding element is set up to receive (hold) a drop of liquid.
  • the liquid drop is stably captured in the first embodiment of the invention under the action of capillary forces. It can be provided that the drop is held by the capillary forces exerted in the applied state of the liquid holder device from the tip of the capillary and the holding element together capillary forces.
  • an embodiment of the Invention in which the holding element is adapted to hold the liquid drop alone without further solid interfaces under the action of capillary forces. In this case, even in the protruding state of the liquid holder device, a drop of liquid can be held securely on the holding element and thus avoided that gas bubbles settle on the holding element.
  • the holding element comprises a sheet-like component, advantageously a relatively large amount of liquid in the vicinity of the tip of the capillary can be obtained. This reduces the risk of inadvertent drying out of the cell during transfer into a changed surrounding medium.
  • the holding element is formed by a portion of a hollow line cut in the axial direction.
  • the wall of the hollow conduit forms the retaining element open on one side.
  • the hollow cylinder can, for. B. have a circular or elliptical base.
  • the drop holder is designed to surround the pipette tip in the applied state of the liquid holder device so that it is arranged in the center or focal point of the circular or elliptical base surface.
  • the profiled plate has z. B. a shape with several flat faces, which are angled towards the top of the capillary, or a profile, which is adapted to the shape of the capillary tip of the capillary.
  • the structure of the liquid holding means can be simplified.
  • the electrode can be used as a reference electrode for patch-clamp measurements.
  • the electrode on the holding element or a line connected to the electrode is preferably connected to the rod of the drop holder.
  • the rod with the holding element and the electrode form an integrated component.
  • the liquid holder device according to the invention can be easily used in automated processes.
  • adjusting movements for transferring the drop holder from the applied to the protruding state can be carried out without difficulty with a setting device which is connected to a patch clamp.
  • the liquid holder device is equipped with an independent drive device.
  • the drive device is z. B. for piezoelectric pivoting of the rod of the liquid holder device and preferably provided on the pivot joint to achieve a large travel.
  • an important advantage of the invention is the compatibility of the liquid holder device according to the invention with different capillary and in particular pipette forms.
  • the swivel joint of the liquid holder device is arranged for releasable connection to the capillary. tet.
  • existing patch-clamp pipettes can be retrofitted with the liquid holder device.
  • the liquid holder means for releasable connection with the capillary, z. B. the patch-clamp pipette is set up. Alternatively, a fixed connection may be provided.
  • the rod of the liquid holder means is preferably adapted for rigid attachment to the capillary or the capillary holder of the patch-clamp pipette, so that advantageously simplifies the structure of the liquid holder device and the patch-clamp pipette.
  • the retaining element has the shape of a cup, in the wall of which an insertion opening for receiving one end of the rod is provided. If the insertion opening and the interior of the cup are connected via a contact channel according to a further preferred variant of the second embodiment of the invention, there are advantages for the measurement with a reference electrode formed by the rod or connected to the rod.
  • the holding element of the liquid-holding device according to the invention is in accordance with the preferred applications of the invention in cell biological studies for receiving a small amount of liquid (volume in particular 0.05-
  • aqueous salt solution such as a physiological solution, an aqueous solution or suspension with biological macromolecules or with cells or a aqueous-oily emulsion.
  • the catching action of the holding element can be advantageously improved in both embodiments of the invention even if the holding element carries a hydrophilic or an oleophilic inner coating.
  • the inner coating is formed by hydrophilic or oleophilic substances, as z. B. of functionalized substrates in cell biology are known.
  • An electrophysiological measuring device which has a capillary with a capillary tip for receiving a biological cell and a liquid holder device according to the invention connected to the capillary constitutes an independent subject of the invention.
  • the capillary is preferably part of a patch-clamp pipette or a microelectrode device ,
  • the patch-clamp pipette preferably has a capillary holder on which the capillary can be detachably fixed.
  • the capillary as a gripper for further manipulations, for. B. be used in the manufacture of the capillary.
  • the capillary is connected via a conical plug connection with the capillary holder.
  • the meter is equipped with a drive mechanism designed to move and position the patch-clamp pipette and fluid holder, it can provide advantages for automated operation of the meter.
  • the measuring device can be equipped with a pipette pulling device, which is set up to produce the capillary.
  • the capillary can thus be used immediately before an electrophysiological measurement. be prepared and used free from damage or contamination.
  • the above-mentioned object is achieved by the general technical teaching to carry out a method for the electrophysiological examination of a biological cell using the liquid holder device according to the invention.
  • patch-clamp measurements can be performed during the transfer of a cell to and in a changed environment medium during perfusion.
  • Figures 1 to 4 variants of the first embodiment of the liquid holder device according to the invention
  • Figures 5 and 6 a schematic illustration of the transfer of a cell according to the invention into a changed surrounding medium using the liquid holder device according to the first embodiment of the invention
  • FIG. 7 shows a further variant of the first embodiment of the liquid holder device according to the invention.
  • FIG. 8 shows a preferred variant of the retaining element used in the second embodiment of the invention
  • Figure 9 variants of the second embodiment of the liquid holder device according to the invention
  • FIG. 10 shows a schematic illustration of the transfer of a cell according to the invention into a changed surrounding medium using the liquid holder device according to the second embodiment of the invention
  • FIG. 11 illustrations of additional parts of a measuring device for electrophysiological examinations
  • FIG. 12 shows a schematic illustration of a capillary holder of a preferably used patch-clamp pipette
  • FIG. 13 Illustrations of the filling of the capillary of a patch-clamp pipette with a filling device
  • FIG. 14 shows a schematic illustration of a capillary holder of a patch-clamp pipette.
  • the invention will be described below by way of example with reference to a preferred embodiment of the liquid holder device attached to a pipette tip of a patch-clamp device. Details of the patch-clamp technique are not described here as they are well known in the art (see, for example, OP Hamill et al., "Pflugers Arch.” Vol. 391 (2), 1981, p 85-100).
  • the liquid holder device can be used not only with a patch-clamp pipette, but also with other instruments for electrophysiological investigations combined, such.
  • FIG. 1A shows a liquid holder device 10 with the holding element 11.1, the rod 12.1 and the swivel joint 13 according to a variant of the first embodiment of the invention.
  • the liquid holder device 10 is shown in connection with a patch-clamp pipette 20 in the protruding state of the holding element 11.1.
  • the holding element 11.1 is separated in this state from the capillary tip of the patch-clamp pipette 20.
  • FIG. 1B shows an enlarged sectional view of the holding element 11.1, which is set up to receive a liquid drop (see FIG. 4).
  • the patch-clamp pipette 20 is constructed in a manner known per se with a capillary 21, which in particular has a free capillary tip 22 for aspirating a biological cell 2 and an integrated measuring electrode (not shown) and is fastened to a capillary holder 23.
  • the capillary tip 22 typically has a tip diameter in the ⁇ m range.
  • the capillary holder 23 is constructed, for example, as illustrated in FIG.
  • the composite of the liquid holder device 10 and the patch-clamp pipette 20 forms a measuring device 30 according to the invention (partially shown), which furthermore has line connections for connection to a control device and is optionally equipped with a drive device (see FIG. 7).
  • the holding element 11.1 has the shape of an axially truncated hollow cylinder with an elliptical base. With the holding element 11.1, a semi-tubular chamber (so-called half-tube chamber) is formed which is set up to receive the capillary 21 of the patch-clamp pipette 20 and a drop of liquid. On the inside of the holding element 11.1, the electrode 14 is arranged. That's on the outside Holding element 11.1 connected to the rod 12.1. The electrode 14 extends along the length of the rod 12.1.
  • the holding element 11.1 consists of glass or plastic (eg PVC) with a wall thickness of approx. 200 microns to 1 mm and a length in the longitudinal direction of the rod 12.1 of approx. 3 mm to 10 mm.
  • the lateral opening of the holding element 11.1 has a width of approx. 1.5 mm to 3 mm.
  • the electrode 14 is formed by a metal layer or a metal wire on the side (in particular inside) of the holding element 11.1, which faces the capillary 21.
  • the electrode 14 is z. B. from silver / silver chloride (Ag / AgCl) or from another electrically conductive material, for. As carbon or platinum.
  • the inside of the holding element 11.1 may be hydrophilic coated.
  • the electrode may consist of agar-agar and an Ag / AgCl electrode part, the agar-agar being connected to the electrode part via a salt bridge.
  • the electrode may be partially coated or disposed on the outside of the holding member 11.1, so that a diffusion path z.
  • B. Ag / AgCl is formed to the cell.
  • the rod 12.1 serves to hold the retaining element 11.1.
  • the rod 12.1 is a straight, elongate member having a longitudinal direction, from which the holding element 11.1 projects radially.
  • the holding element 11.1 opens in the radial direction relative to the longitudinal direction of the rod 12.1.
  • the rod 12.1 is connected to the pivot joint 13. tied, while the holding element 11.1 is attached to the second, free (distal) end of the rod 12.1.
  • the rod 12.1 consists of an inert, electrically insulating material, such. As plastic (eg., PE) or a ceramic.
  • the electrode 14 or a line connection connected to it is integrated in the bar 12. 1 or fastened on its surface.
  • the electrode 14 and the rod 12.1 are not two different components, but the rod forms the electrode. If the rod 12.1 and possibly the holding element 11.1 are adapted to form the electrode, these consist at least partially of a conductive material, such as. From Ag / AgCl. When using agar-agar, the electrode 14 (or according to the
  • Bar 12.1 preferably a glass tube in which the jelly-like agar-agar is arranged, which then passes into a salt bridge.
  • the pivot joint 13 includes z. As a hinge or a
  • Thin-film joint which is connected on the one hand to the rod 12.1 and on the other hand to the patch-clamp pipette 20 or a corresponding clamping device.
  • FIG. 1A schematically illustrates a piezoelectric drive device 15, which is set up for pivoting the rod 12. 1 about an axis perpendicular to the longitudinal direction of the patch-clamp pipette 20.
  • the drive device 15 is z. B. between a surface of the patch-clamp pipette 20 and the rod 12.1.
  • a piezoelectric element of the drive device 15 expands, so that the rod 12.1 can be pivoted.
  • FIG. 1C shows a further variant of a holding element 11.1 with a curved shape, wherein the holding element 11.1 is provided for detachable connection to the bar 12 of the liquid holder device 10 (see FIG. 1A).
  • the holding element 11.1 z. B. formed by injection molding with an insertion 11.11 and a semi-tubular chamber for receiving the capillary.
  • the rod 12, which can simultaneously form the reference electrode, is inserted into the insertion opening 11.11.
  • the electrical contact with the chamber, which is filled with liquid in the state of approaching the capillary tip, is produced by a contact groove 11.12.
  • the variant of the holding element 11.1 shown in FIG. 1C can be modified so that the chamber is tubular and can completely surround the capillary tip (not shown).
  • the holding element 11.1 has the shape of a cup with an open bottom. Because of the detachable connection with the rod 12, the holding element 11.1 can be separated from the capillary tip.
  • the holding element 11.1 is dimensioned so that the liquid is held in the holding element 11.1 by the action of capillary forces.
  • a holding element 11.1 in the form of a flat plate, z. B. be provided from glass or plastic.
  • the planar holding element 11.1 carries on the side facing the capillary, the electrode 14. With a suitable design of the rod 12.1, the holding element 11.1 may be integrally connected to the end of the rod 12.1.
  • the flat plate of the holding element 11.1 can be removed in the axial direction of the capillary 21. be angled ( Figure 3).
  • the holding element 11.1 adapted to the shape of the capillary tip 22 of the capillary 21.
  • the liquid droplet 1 on the holding element 11.1 is smaller than in the variant according to FIGS. 1 and 2, and the dead volume around the cell 2 is correspondingly reduced.
  • a more complex shape according to the outer contour of the capillary tip 22 may be provided.
  • FIG. 3 furthermore illustrates that the holding element 11.1 and with it the electrode can abut the capillary 21 directly.
  • the rod 12.1 is adjusted with the drive device 15 (FIG. 1A) such that the electrode is arranged in the immediate vicinity of the capillary tip 22.
  • FIGS. 4A and 4B show the first embodiment according to FIG. 1 in the applied state of the liquid holder device 10 with a liquid drop 1 and a cell 2. Between the capillary tip 22 and the inside of the holding element 11.1 there is only one capillary gap, or the inside of the holding element 11.1 touches the capillary tip 22. By the capillary forces, the liquid drop 1 is held on the capillary 21, even if the patch-clamp pipette 20 is withdrawn from a liquid surrounding medium.
  • FIGS. 5 and 6 the sequence of a method according to the invention for the electrophysiological examination of a biological cell using the first embodiment of the invention is illustrated schematically with further details.
  • Cells of a cell culture 3 are located on the bottom of a first culture vessel 40, which is filled with a first surrounding medium 4.
  • the surrounding medium 4 comprises z.
  • a cell 2 is removed in a conventional manner from the cell culture 3.
  • the cell removal is preferably carried out while the liquid holder device 10 is in the protruding state and the capillary 21 of the patch-clamp pipette 20 is moved freely to the cell culture 3, manipulated and can be observed with the image recording device 60 shown schematically.
  • the movement of the liquid holder device 10 and the patch-clamp pipette 20 takes place with a schematically shown drive device 50.
  • the drop 1 at the tip 22 of the patch-clamp pipette 20 is rapidly diluted by the second surrounding medium 5.
  • the measurement of cell potentials or ion currents through the cell membrane can be continued during dilution in order to directly detect the effect of the second ambient medium 5.
  • the ongoing measurement with a rapid exchange of the ambient liquid of the cell 2 is particularly advantageous in the measurement of ligand-activated ion currents.
  • the steps of changing the ambient medium with a running or a repeated measurement of the cell potential according to FIGS. 5 and 6 can be repeated depending on the specific task.
  • the number of repetitions is advantageously virtually unlimited, so that the invention is particularly suitable for the investigation of a large number of test media, in particular in the context of high throughput methods.
  • Advantageously, can be dispensed with the conventional application of test media via hoses, which not only increases the accuracy of the measurement, but also the possible number of applicable test media and thus the measurement throughput can be increased.
  • FIG. 7 shows a further variant of the first embodiment of the liquid holder device 10 according to the invention with the components 11.1, 12.1 and 13 on a patch-clamp pipette 20.
  • the holding element 11.1 is shown in the protruding state as in FIG.
  • the liquid holder device 10 and the patch-clamp pipette 20 are connected to the drive device 50, which for example has a 3-axis Includes manipulator.
  • FIG. 7 shows the swivel joint 13 by way of example at the upper end of the capillary holder 23. Alternatively, the swivel joint 13 can be arranged laterally on the capillary holder 23.
  • the capillary 21 of the patch-clamp pipette 20 is detachably attached to the capillary holder 23.
  • the capillary holder 23 has a suction device 26 for generating a negative pressure, under the action of which the cell 2 can be held on the capillary tip 22.
  • the capillary 21 is inserted as shown in a seal 24, for.
  • the capillary holder 23 with the seal 24 forms a gripper which can be used when pulling the capillary 21 (see FIGS. 11, 12).
  • a conical plug connection can be provided with which the capillary 21 can be exchanged more easily (see FIG. 12).
  • capillaries 21 are used which have a conical shape at their rear end.
  • the holding member is adapted to the liquid for forming the liquid environment at the capillary tip under the action of gravitational force in a vessel, for. B. to provide a cup into which protrudes the capillary in the assembled state of the liquid holder means.
  • the retaining element can not be separated from the capillary tip by the above-described pivoting movement, since otherwise the edge of the vessel would damage the capillary tip. Accordingly, it is provided in the second embodiment of the invention that the holding element is releasably secured to the rod of the liquid holder means.
  • a favorite Buchte variant of the retaining element 11.2 used for the second embodiment of the invention is illustrated in Figures 8A and 8B.
  • the holding element 11.2 according to Figure 8A has the shape of a cup, in the wall of an insertion opening 11.21 is provided.
  • the cup further has a closed bottom 11.23 and a contact groove or a contact gap 11.22, through which an electrode disposed in the insertion opening 11.21 comes into electrical contact with the interior of the cup via the liquid in the cup and the contact channel 11.22.
  • the holding element 11.2 consists z. B. of a plastic that is molded by injection molding. It may be provided, for example, an elastomeric plastic.
  • the rod (not shown in Figure 8A) may be stuck in the insertion opening 11.21 under the action of an elastic tension.
  • a snap-in or latching connection (not shown) may be provided on the insertion opening 11.21.
  • the holding element 11.2 according to FIGS. 8A and 8B has, for example, the following dimensions: outer diameter: 3 mm to 10 mm, cup diameter: 0.3 mm to 3 mm, and axial height 2 mm to 10 mm.
  • Figure 8B illustrates the combination of the retaining element 11.2 with a hollow rod 12.2 (partially shown) which may be advantageously used for liquid transport into or out of the cup.
  • the rod 12.2 has the shape of a tube which is open at its free end on the holding element 11.2 and connected at the opposite end with a liquid reservoir.
  • the rod 12.2 solution can be supplied via the contact gap in the cup or sucked.
  • the provision of the contact gap or the contact channel has the particular advantage that in the tubular design of the rod 12.2 by a pressure change in the rod 12.2, the amount of liquid in the retaining element can be changed.
  • the holding element may be formed as a cup having an open bottom, so that the above-mentioned with reference to Figure IC variant of the first embodiment of the invention results.
  • the holding element 11.2 may have two insertion openings for receiving two bars of the liquid holder device.
  • FIGS. 9 and 10 Various variants of the holding element 11.2 with two insertion openings are illustrated in FIGS. 9 and 10.
  • the rods can be inserted into the insertion openings in a form-fitting or force-fitting manner.
  • the outside diameter of the bars and the inside diameter of the insertion openings are adjusted accordingly.
  • the inner diameter of the insertion openings are shown enlarged for illustration.
  • the liquid holder device 10 shown in FIG. 9A comprises the holding element 11.2 and the rods 12.2, 12.3.
  • the patch-clamp pipette 20 comprises the capillary 21 and the capillary holder 23. Inside the capillary 21 runs the measuring electrode 25, which is connected to a measuring head (not shown in FIG. 9).
  • the rods 12.2, 12.3 of the liquid holder device 10 are fixedly connected (eg, glued or screwed) to the capillary holder 23, so that they are arranged symmetrically on opposite sides of the capillary 21.
  • the rods 12.2, 12.3 extend parallel to the axial extent of the capillary 21.
  • the length of the rods 12.2, 12.3 is selected so that the capillary tip 22 protrudes into the cup of the attached holding element 11.2, without to touch the cup bottom.
  • One of the rods 12.2, 12.3 can be used as an electrode. Accordingly, a contact groove (contact gap) is provided at one of the insertion openings.
  • FIG. 9B shows a modification in which one of the rods (12.3) has a curvature at the end, which serves to fix the retaining element 11.2.
  • the rod 12.3 can be formed of a resilient material and engage in an oblique groove 11.24 on the side of the retaining element 11.2.
  • Figures 9C and 9D show further modifications in which the free ends of the rods 12.2, 12.3 have tips which engage in conically shaped insertion openings of the retaining element 11.2.
  • a lateral screw connection 12.4 of the rod 12.3 with the capillary holder 23 can be provided.
  • the screw 12.4 can be replaced by an annular holder. In this case, there is the advantage that the rods can be easily attached to different types of capillary holders.
  • the preparation of the patch-clamp pipette 20 is carried out.
  • the preparation of the capillary 21 is preferably provided immediately prior to the electrophysiological examination with a pipette pulling device, which will be described below with reference to FIG.
  • the capillary 21 is received by the capillary holder 23.
  • the measuring device 30 is moved with the drive device 50 to a suspension vessel 42. Suspended cells 2 are located in the suspension vessel 42.
  • the patch-clamp pipette 20 is introduced into the cell suspension with the drop-holding device 10.
  • the patch-clamp pipette 20 is aligned so that the capillary 21 extends vertically (perpendicular to the bottom of the suspension vessel 42).
  • the measuring device 30 with the drive device 50 is preferably moved up and down (FIG. 10B).
  • a liquid change takes place in the vicinity of the measured cell 2.
  • This measurement time is determined, for example, as a function of the value of the measured resistance across the cell (so-called "seal resistance") lifted out of the first suspension vessel 42 (FIG. 10C), wherein the holding element 11. stands still and at the capillary tip 22 a liquid environment of the cell 2 is formed.
  • the measuring device 30 is transferred into the further suspension vessel 43 (FIG. 10D), in which a test solution is located. In the test solution, there is a rapid fluid exchange with the liquid in the bowl of the holding element 11.2.
  • the measurement of cell potentials can be continuously continued in order to directly detect the effect of the test solution.
  • the measurement of the cell potential in different test media can be repeated.
  • the amount of liquid in the cup can be changed, which can be shortened by sucking a volume fraction, the dilution time of the solution in the cup.
  • the deposit of cell 2 in a cell culture e.g. be provided at the bottom of a culture vessel.
  • the holding element 11.2 is removed from the capillary 21 (transfer to the release position).
  • the removal of the holding element 11.2 from the rod 12.2 takes place, for example. using a bifurcated tool provided in the culture vessel or in the open air.
  • the measuring device 30 is equipped with a pipette pulling device 70, which is shown schematically in FIG. 11A.
  • a pipette pulling device 70 which is shown schematically in FIG. 11A. Since capillaries for patch-clamp pipettes are very sensitive, easily soiled and therefore hardly transportable, the pipette puller 70 can advantageously be used to fabricate the capillaries 21 of the patch-clamp pipettes 20 at the location of the patch-clamp Measuring device 30 can be used. In particular, an automated operation of the production and recording of the patch-clamp pipette 20 is possible.
  • the pipette pulling device 70 comprises a clamping block 71, a heating wire 72 and a heater 73.
  • a glass capillary with a measuring electrode wire is first inserted into the clamping block 71.
  • the capillary holder 23 is placed on the free end of the glass capillary.
  • the drive device 50, see, for example, FIGS. 5, 6, 10) is preferably used, which thus fulfills a dual function during the production of the capillary 21 and during its transport.
  • the capillary 21 can be withdrawn with the capillary holder 23, so that the desired shape of the capillary tip 22 results. Subsequently, the capillary 21 with the drive device 50 z. B. deposited in a magazine 80, as illustrated schematically in Figure IIB.
  • the magazine 80 includes z. B. a block 81 with holes can be used in the capillaries 21, so that their Kapillarspitzen 22 remain free. The settling takes place with a stripping device or by exerting a pressure pulse in the capillary holder 23.
  • FIG. 12 shows further details of the use of a capillary, in which a conical plug connection 24.1, 24.2 is provided.
  • a capillary 21 is used, at whose ends the plug connections 24.1, 24.2 are fixed by means of screw connections 24.3, 24.4.
  • the screw connections can be replaced by plug connections with at least one sealing ring (see FIG. 13B).
  • the capillary 21 is connected to the plug connections 24.1, 24.2 in the clamping block 71 (see Figure IIA) inserted and pulled out.
  • FIG. 12B shows the finished capillary 21 after removal.
  • FIG. 13 schematically shows a filling device 90 (FIG. 13A), which is provided for filling the capillary 21 of a patch-clamp pipette (FIG. 13B).
  • a working fluid e.g., physiological solution
  • FIG. 13A the filling device 90 illustrated in FIG. 13A is preferably used.
  • Filler 90 includes a fill capillary 91 (e.g., a quartz capillary) mounted in a retainer block 92. Attached to the support block 92 is a connecting tube 93 which provides fluid communication between the filling capillary 91 and a liquid delivery means 94 (e.g.
  • Syringe device forms. Between the liquid reservoir of the liquid conveyor 94 and the holding block 92, there is provided on the outside of the connecting tube 93 a spring means 95 (e.g., a coil spring).
  • the connecting tube 93 is made of a flexible material.
  • the connecting tube 93 and the spring device 95 are elastically deformable.
  • an elastic deformation forces that may arise unintentionally when operating the liquid conveyor 94, recorded, and thus an undesirable power transfer to the capillary of the patch-clamp pipette can be avoided.
  • FIG. 13B shows the combination of the filling device 90 with the capillary 21 of the patch-clamp pipette during the filling process.
  • the capillary 21 is inserted into a conical plug connection 24.5.
  • the plug connection 24.5 (or: receiving device) comprises a conical plug with an axial bore, on the inside of which at least one sealing ring, but preferably two sealing rings 24.6 for holding the capillary 21 are arranged.
  • the axial bore has a funnel-shaped opening 24.7 with a step projection 24.8, which serve the gentle introduction of the filling capillary 91 of the filling device 90 and the formation of a stop for the capillary 21.
  • the wall of the capillary 21 is covered by the projection 24.8, so that the filling capillary 91 is guided by the funnel-shaped opening 24.7 directly into the interior of the capillary 21.
  • connection tube 93 and the spring device 95 avoids excessive stress on the filling capillary 91 and the capillary 21.
  • the introduced filling capillary 91 (as shown in FIG. 13B) to abut the inner wall against the capillary 21 without forming excessive forces.
  • This advantage is achieved because of the defor- mability of the components 93, 95 regardless of the length of the capillary 21, so that the filling device 90 is particularly well suited for the filling of capillaries 21 of different lengths.
  • FIG. 14 shows, by way of example, further details of a capillary holder 23 of a patch-clamp pipette, which can be used to advantage in the implementation of the invention.
  • the capillary holder 23 comprises a capillary electrode 23.1, which is preferably formed by a quartz capillary.
  • the capillary electrode 23.1 is inserted in a carrier 23.2.
  • the carrier 23.2 has at one end a receptacle 23.3 for the capillary (not shown) of the patch-clamp pipette and at the opposite set an electrolyte reservoir 23.5 with an elec- rodenan gleich 23.6 (eg, an Ag-AgCl pellet).
  • the receptacle 23.3 is designed for the direct reception of the capillary 21 or the plug connection 24.1, 24.2, 24.5 (see FIGS. 12, 13) and is preferably equipped with at least one or two sealing rings 23.4.
  • the receptacle 23.3 preferably has a conical form.
  • the capillary electrode 23.1 is preferably a quartz capillary filled with an electrolyte, for example KCl, which opens into the electrolyte reservoir 23.5.
  • an electrolyte for example KCl
  • an Ag-AgCl wire electrode may be provided.
  • FIGS. 11 to 14 may represent independent subject matter, which may be realized with pipettes without the liquid holder device according to the invention described above.

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Abstract

Eine Flüssigkeitshaltereinrichtung (10), die zur Bildung einer flüssigen Umgebung an einer Kapillarspitze (22) einer patch-clamp-Pipette (20) eingerichtet ist, umfasst ein Halteelement (11.2), das zur Halterung eines Flüssigkeitstropfens (1) eingerichtet ist, und mindestens einen Stab (12.2, 12.3), der zur Positionierung des Halteelements (11.2) an der Kapillarspitze (22) eingerichtet ist, wobei der mindestens eine Stab (12.2, 12.3) so eingerichtet ist, dass in einem Zustand, in dem die Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) mit der patch- clamp-Pipette (20) zusammengesetzt ist, das Halteelement (11.2) von der Kapillare (21) trennbar ist. Es werden auch ein Messgerät, das mit der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) ausgestattet ist, und ein Verfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung einer biologischen Zelle unter Verwendung der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) beschrieben.

Description

Vorrichtungen und Verfahren für elektrophysiologische
Zelluntersuchungen
Die Erfindung betrifft eine Flüssigkeitshaltereinrichtung für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen, insbesondere eine Flüssigkeitshaltereinrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein elektrophysiologisches Messgerät, das mit einer derartigen Flüssigkeitshaltereinrichtung ausgestattet ist und insbesondere eine patch-clamp-Pipette umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur elektrophysiologi- schen Untersuchung einer biologischen Zelle unter Verwendung einer derartigen Flüssigkeitshaltereinrichtung.
Es ist bekannt, Ströme von Ionen durch Ionenkanäle in der Zellmembran isolierter biologischer Zellen durch elektrophysiologische Messungen zu erfassen. Diese Messungen werden auch als patch-clamp-Messung und das hierzu verwendete Messgerät als patch-clamp-Vorrichtung bezeichnet. Die patch- clamp-Vorrichtung enthält eine kapillarförmige Pipette (patch-clamp-Pipette) , an deren Spitze eine Zelle angesaugt und gemessen werden kann. Die patch-clamp-Pipette enthält ei- ne Messelektrode zur Ableitung eines elektrophysiologischen Potentials von der Zelle bzw. zur Messung transmembranaler Ionenströme .
Die Transporteigenschaften der Ionenkanäle sind in der Grund- lagenforschung zur Charakterisierung von zellbiologischen
Vorgängen und insbesondere in der Pharmakologie für die Charakterisierung von Wirkstoffen von Interesse. So stellen die Ionenkanäle wichtige Targets für Arzneimittel dar. Eine Vielzahl von Arzneimitteln wirken selektiv an bestimmten Ionenka- nälen, so dass mit der patch-clamp-Technik ein Werkzeug für pharmakologische Untersuchungen zur Verfügung steht.
In der Praxis ist es bisher üblich, patch-clamp-Verfahren ma- nuell durchzuführen, wobei ein Experimentator einen Mikroma- nipulator bedient, um eine Zelle mit der Spitze der patch- clamp-Pipette aufzunehmen und an dieser Zelle die elektrophy- siologische Messung durchzuführen. Die manuelle Durchführung von patch-clamp-Verfahren ist nachteilig, da der Verfahrens- ablauf aufwendig ist und hohe Anforderungen an die manuellen Fähigkeiten des Experimentators stellt. Des Weiteren steigt die Zahl der zu untersuchenden Wirkstoffe und der Ionenkanäle laufend, so dass Hochdurchsatzuntersuchungen manuell nur beschränkt oder nicht realisierbar sind. Es ist bspw. bekannt, dass das humane Genom für etwa 400 Ionenkanäle kodiert, deren Transporteigenschaften durch mehr als 100 Kanalproteine be- einflusst werden. Wenn eine spezifische Wechselwirkung einer Gruppe von Wirkstoffen mit bestimmten Kanalproteinen untersucht werden soll, wächst die Zahl der zu untersuchenden Kom- binationen leicht über eine Grenze, oberhalb derer manuelle Verfahren nicht mehr anwendbar sind.
Ein weiterer Nachteil der manuellen Verfahren zeigt sich bei speziellen Aufgabenstellungen, bei denen die Wirkung ver- schiedener Arzneimittel auf eine bestimmte Zelle untersucht werden soll. Vor der elektrophysiologischen Messung muss die Zelle mit einer Lösung des jeweils untersuchten Arzneimittels perfundiert werden. Dabei kann eine Perfusionsvorrichtung verwendet werden, die bspw. in DE 43 05 405 Cl beschrieben ist. Durch die Perfusion mit verschiedenen Arzneimittellösungen werden die herkömmlichen manuellen Verfahren jedoch noch umständlicher und aufwendiger. Es sind Versuche bekannt, automatisierte patch-clamp- Verfahren zu entwickeln, die sich jedoch in der Praxis wegen einer hohen Fehlerquote und einer geringen Reproduzierbarkeit der elektrophysiologischen Messung nur als beschränkt brauch- bar erwiesen haben. Eine Einschränkung besteht insbesondere bei der speziellen Untersuchungsaufgabe, verschiedene Arzneimittel an einer einzigen Zelle wirken zu lassen und die Wirkung zu untersuchen.
Aus US 2005/0241940 Al ist bekannt, die Spitze der patch- clamp-Pipette mit einer aufgesetzten Zelle zur Perfusion jeweils von einer ersten Arzneimittellösung in eine andere Arzneimittellösung zu überführen, wobei während der Überführung an der Pipettenspitze lokal eine flüssige Umgebung erhalten wird. Für diesen Zweck wird ein Spiral- oder rohrförmiger Tropfenhalter verwendet, der mit einem parallel zur Längsrichtung der Pipettenspitze verlaufenden Stab von einer zurückgezogenen Position, in der die Pipettenspitze mit der Zelle frei liegt, in eine vorgeschobene Position axial ver- schiebbar ist, in der die Pipettenspitze vom rohrförmigen
Tropfenhalter umgeben ist. Die gewünschte flüssige Umgebung der Kapillarspitze kann mit einem Flüssigkeitstropfen gebildet werden, der durch Kapillarkräfte im Tropfenhalter gefangen ist.
Ein Nachteil des herkömmlichen Tropfenhalters gemäß US 2005/ 0241940 Al besteht in der koaxialen Relativbewegung von Pipettenspitze und Tropfenhalter, die in allen Relativpositionen einen geringen Abstand (Kapillarspalt) aufweisen. Zur Vermeidung von Schäden an der Pipette oder der Zelle ist daher ein komplexer Präzisionsantrieb erforderlich. Ein weiterer Nachteil besteht in der Behinderung der Perfusion der Zelle in der veränderten Arzneimittellösung, die zunächst durch den Tropfenhalter allseitig von der Zelle abgeschirmt wird. Damit ergibt sich für die Perfusion ein relativ hoher Zeitaufwand, der nachteilig für die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit einer Vielzahl von patch-clamp-Messungen an einer Zelle ist. Nachteilig kann auch sein, wenn die Stabili- tat des Tropfens nicht ausreichend ist, so dass sich durch eine schnelle Bewegung der patch-clamp-Pipette der Tropfen von der Spitze lösen kann und die Zelle durch Luftkontakt geschädigt wird. Schließlich sind patch-clamp-Pipetten, die für die in US 2005/0241940 Al beschriebene Technik geeignet sind, wegen der Anbringung des Tropfenhalters schwer automatisiert herstellbar und montierbar.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Flüssigkeitshaltereinrichtung bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher patch-clamp-Vorrichtungen und insbesondere von herkömmlichen Tropfenhaltern überwunden werden. Der Erfindung liegt des Weiteren die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Messgerät, insbesondere für patch-clamp- Untersuchungen bereitzustellen. Schließlich liegt der Erfin- düng auch die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung biologischer Zellen bereitzustellen, mit dem die Nachteile der herkömmlichen patch-clamp-Verfahren vermindert oder überwunden werden.
Diese Aufgaben werden durch eine Flüssigkeitshaltereinrichtung, ein Messgerät und ein Untersuchungsverfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, eine gattungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung, die zur Bildung einer flüssigen Umgebung an einer Kapillarspitze einer patch-clamp-Pipette eingerichtet ist, mit einem Halteelement zur Aufnahme eines Flüssigkeitstropfens auszustatten, das bei Verwendung zur Flüssigkeitshalterung mit einer patch-clamp-Pipette von der Kapillare trennbar angeordnet ist. Der mindestens eine Stab zur Halterung des Halteelements ist so gebildet, dass das Halteelement insbesondere von der Kapillarspitze trennbar ist.
Es ist insbesondere vorgesehen, dass das Halteelement mit dem Stab an oder neben der Kapillarspitze positionierbar (Kondi- tionierungsposition) und von der Kapillare so weit trennbar ist (Freigabeposition) , dass die Kapillarspitze frei steht und ein Abstand zwischen dem Halteelement und der Kapillarspitze größer ist die Breite eines Kapillarspaltes. Im Gegen- satz zum herkömmlichen Tropfenhalter ist der Halteelement-
Kapillarspitze-Abstand, wenn das Halteelement von der Kapillarspitze getrennt ist, d. h. in der Freigabeposition insbesondere größer als in der Konditionierungsposition. Vorteilhafterweise können durch die Vergrößerung des Halteelement- Kapillarspitze-Abstandes in der Freigabeposition eine Reihe von Vorteilen sowohl in Bezug auf die Anforderungen and die Genauigkeit der Bewegung des Halteelements als auch in Bezug auf die bestimmungsgemäße Verwendung der patch-clamp-Pipette erzielt werden.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist der Stab, an dem das Halteelement befestigt ist, eingerichtet, verschwenkbar an einer Kapillarhalterung der patch-clamp- Pipette fixiert zu werden. Der Stab weist vorzugsweise an ei- nem zum Halteelement entgegengesetzten Ende ein Schwenkgelenk auf. Das Halteelement hat auf zumindest einer Seite eine freie Oberfläche, die an die Kapillarspitze seitlich, d. h. radial in Bezug auf eine Längsrichtung der Kapillare angenähert werden kann. Der Erfinder hat festgestellt, dass es zur zuverlässigen Erhaltung einer flüssigen Umgebung an der Spitze der Kapillare ausreichend ist, wenn der Tropfen mit dem Halteelement gehalten wird, das allgemein ein gekrümmtes Bauteil mit einer seitlichen Öffnung oder ein ebenes Bauteil ura- fasst. Gleichzeitig ermöglicht die seitlich freiliegende O- berfläche, insbesondere die Öffnung, die an einer Seite des Halteelements vorgesehen ist, einen vereinfachten Bewegungsablauf des Stabs mit dem Halteelement.
Gemäß der ersten Ausführungsform ist der Stab, wenn die erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung an einer patch- clamp-Pipette angebracht ist, relativ zur Längsrichtung der Kapillare der patch-clamp-Pipette verschwenkbar. Das Halteelement kann durch das Verschwenken des Stabes von einem an- gelegten Zustand (Konditionierungsposition) , in dem das Halteelement von der Kapillarspitze durch einen Kapillarspalt getrennt ist oder an der Kapillarspitze anliegt, durch eine radiale Bewegung in einen abstehenden Zustand verschwenkt werden (Freigabeposition) , in dem das Halteelement die Kapil- larspitze, z. B. für weitere Beobachtungen, Messungen oder
Zellmanipulationen freigibt. Vorteilhafterweise wird die axiale Bewegung des herkömmlichen Tropfenhalters durch eine radiale Bewegung des erfindungsgemäßen Halteelements ersetzt.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist das Halteelement zur Halterung des Flüssigkeitstropfen für die Bildung der flüssigen Umgebung an der Kapillarspitze unter der Wirkung der Gravitationskraft eingerichtet, wobei das Halteelement am Stab lösbar befestigt ist. Vorteilhafterweise bildet das Halteelement eine Auflage, auf der eine Flüssigkeitsmenge getragen wird. In diesem Fall können im Unterschied zum herkömmlichen Tropfenhalter größere Flüssigkeitsmengen zur Konditionierung der Kapillarspitze mit verbesserter Stabilität und Zuverlässigkeit bereitgestellt werden. Sowohl bei der ersten als auch bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung kann das Halteelement eine einseitig offene, ebene oder gekrümmte Form aufweisen. Dabei ergibt sich als weiterer wichtiger Vorteil eine verbesserte Perfusion bei der Überführung einer flüssig umhüllten Zelle an der Spitze der Kapillare in ein verändertes Umgebungsmedium. Die Zelle wird nur teilweise durch das Halteelement von dem neuen Umgebungsmedium abgeschirmt, so dass sich der Tropfen am Tropfen- halter schnell durch eine Flüssigkeitsströmung und Diffusion verdünnt. Im Ergebnis kann die Wirkung der Substanz im neuen Umgebungsmedium, z. B. einer neuen Arzneimittellösung nach einer Zeit untersucht werden, die im Vergleich zu der für die Perfusion mit einem herkömmlichen Tropfenhalter erforderli- chen Zeit verkürzt ist.
Ein weiterer Vorteil der Flüssigkeitshaltereinrichtung der ersten Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass an die Form des Halteelements keine besonderen Anforderungen ge- stellt werden müssen. Allgemein kann das Halteelement ein ebenes oder gekrümmtes Bauteil sein, das im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung zu der Kapillarspitze benachbart angeordnet ist oder diese azimutal teilweise umgibt. Das Halteelement ist flächenförmig, z. B. in Form einer Glas- oder Kunststofflamelle gebildet.
Das Halteelement ist zur Aufnahme (Halterung) eines Flüssigkeitstropfens eingerichtet. Der Flüssigkeitstropfen wird bei der ersten Ausführungsform der Erfindung stabil unter der Wirkung von Kapillarkräften eingefangen. Es kann vorgesehen sein, dass der Tropfen durch die im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung von der Spitze der Kapillare und dem Halteelement gemeinsam ausgeübten Kapillarkräfte gehalten wird. Bevorzugt ist jedoch eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das Halteelement dazu eingerichtet ist, den Flüssigkeitstropfen allein ohne weitere feste Grenzflächen unter der Wirkung von Kapillarkräften zu halten. In diesem Fall kann auch im abstehenden Zustand der Flüssigkeits- haltereinrichtung ein Flüssigkeitstropfen sicher am Halteelement gehalten und damit vermieden werden, dass sich am Halteelement Gasblasen festsetzen.
Wenn gemäß einer bevorzugten Variante der ersten Ausführungs- form der Erfindung das Halteelement ein flächenförmiges Bauteil umfasst, kann vorteilhafterweise eine relativ große Flüssigkeitsmenge in der Umgebung der Spitze der Kapillare erhalten werden. Damit wird die Gefahr eines unbeabsichtigten Austrocknens der Zelle bei der Übertragung in ein verändertes Umgebungsmedium vermindert. Besonders bevorzugt ist eine Variante, bei der das Halteelement durch einen Abschnitt einer in axialer Richtung angeschnittenen Hohlleitung gebildet wird. Die Wand der Hohlleitung bildet das einseitig offene Halteelement. Wenn das Halteelement die Form eines in axialer Richtung angeschnittenen Hohlzylinders aufweist, können sich Vorteile für die Bildung einer gleichmäßigen Flüssigkeitsumgebung an der Kapillarspitze ergeben. Der Hohlzylinder kann z. B. eine kreisförmige oder ellipsenförmige Grundfläche aufweisen. In diesem Fall ist der Tropfenhalter dazu eingerich- tet, im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung die Pipettenspitze so zu umgeben, dass diese im Mittelpunkt oder Brennpunkt der kreis- oder ellipsenförmigen Grundfläche angeordnet ist.
Alternativ kann als Halteelement eine ebene oder eine profilierte Platte vorgesehen sein. Die profilierte Platte hat z. B. eine Form mit mehreren ebenen Teilflächen, die zu der Spitze der Kapillare hin abgewinkelt sind, oder einem Profil, das an die Form der Kapillarspitze der Kapillare angepasst ist .
Wenn bei der ersten oder zweiten Ausführungsform der Erfin- düng das Halteelement mit einer Elektrode ausgestattet ist, kann der Aufbau der Flüssigkeitshaltereinrichtung vereinfacht werden. Die Elektrode kann für patch-clamp-Messungen als Referenzmesselektrode verwendet werden. Die Elektrode am Halteelement oder eine mit der Elektrode verbundene Leitung ist vorzugsweise mit dem Stab des Tropfenhalters verbunden. Besonders bevorzugt bilden der Stab mit dem Halteelement und der Elektrode (ggf. mit der Leitung) ein integriertes Bauteil.
Vorteilhafterweise kann die erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung leicht bei automatisierten Verfahren verwendet werden. Bei der ersten Ausführungsform der Erfindung können Stellbewegungen zur Überführung des Tropfenhalters vom angelegten zum abstehenden Zustand problemlos mit einer Stellein- richtung ausgeführt werden, die an einer patch-clamp-
Vorrichtung vorgesehen ist. Bevorzugt ist jedoch eine Variante der ersten Ausführungsform der Erfindung, bei der die Flüssigkeitshaltereinrichtung mit einer eigenständigen Antriebseinrichtung ausgestattet ist. Die Antriebseinrichtung ist z. B. zum piezoelektrischen Verschwenken des Stabes der Flüssigkeitshaltereinrichtung eingerichtet und zur Erzielung eines großen Stellweges vorzugsweise am Schwenkgelenk vorgesehen.
Ein wichtiger Vorteil der Erfindung ist die Kompatibilität der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung mit verschiedenen Kapillar- und insbesondere Pipettenformen. Vorzugsweise ist das Schwenkgelenk der Flüssigkeitshaltereinrichtung zur lösbaren Verbindung mit der Kapillare eingerich- tet. Entsprechend können vorhandene patch-clamp-Pipetten mit der Flüssigkeitshaltereinrichtung nachgerüstet werden. Besonders bevorzugt ist ein Anklemmen der Flüssigkeitshaltereinrichtung über eine an dem Schwenkgelenk vorgesehene Clip- Verbindung (Klammer-Verbindung) an der patch-clamp-Pipette, insbesondere einer Kapillarhalterung der patch-clamp-Pipette vorgesehen. Es ist jedoch nicht zwingend erforderlich, dass die Flüssigkeitshaltereinrichtung zur lösbaren Verbindung mit der Kapillare, z. B. der patch-clamp-Pipette eingerichtet ist. Alternativ kann eine feste Verbindung vorgesehen sein.
Bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung ist der Stab der Flüssigkeitshaltereinrichtung vorzugsweise zur starren Befestigung an der Kapillare oder der Kapillarhalterung der patch-clamp-Pipette eingerichtet, so dass sich vorteilhafterweise der Aufbau der Flüssigkeitshaltereinrichtung und der patch-clamp-Pipette vereinfacht. Gemäß einer bevorzugten Variante hat das Halteelement die Form eines Napfes, in dessen Wand eine Einstecköffnung zur Aufnahme eines Endes des Stabes vorgesehen ist. Wenn die Einstecköffnung und das Innere des Napfes gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der zweiten Ausführungsform der Erfindung über eine Kontaktrinne verbunden sind, ergeben sich Vorteile für die Messung mit einer durch den Stab gebildeten oder mit dem Stab verbundenen Refe- renzelektrode .
Das Halteelement der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung ist entsprechend den bevorzugten Anwendungen der Erfindung bei zellbiologischen Untersuchungen zur Aufnahme ei- ner geringen Flüssigkeitsmenge (Volumen insbesondere 0.05 -
100 μl), z. B. in Form eines Tropfens, einer Flüssigkeit eingerichtet, die Wasser, eine wässrige Salzlösung, wie z. B. eine physiologische Lösung, eine wässrige Lösung oder Suspension mit biologischen Makromolekülen oder mit Zellen oder ei- ne wässrig-ölige Emulsion umfasst. Die Fangwirkung des Halteelements kann bei beiden Ausführungsformen der Erfindung vorteilhafterweise noch verbessert werden, wenn das Halteelement eine hydrophile oder eine oleophile Innenbeschichtung trägt. Die Innenbeschichtung wird durch hydrophile oder oleophile Substanzen gebildet, wie sie z. B. von funktionalisierten Substraten in der Zellbiologie bekannt sind.
Ein elektrophysiologisches Messgerät, das eine Kapillare mit einer Kapillarspitze zur Aufnahme einer biologischen Zelle und eine mit der Kapillare verbundene, erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung aufweist, stellt einen unabhängigen Gegenstand der Erfindung dar. Die Kapillare ist vorzugsweise Teil einer patch-clamp-Pipette oder einer Mikroelektrodenein- richtung.
Die patch-clamp-Pipette weist vorzugsweise eine Kapillarhal- terung auf, an der die Kapillare lösbar fixierbar ist. Vorteilhafterweise kann die Kapillarhalterung als Greifer für weitere Manipulationen, z. B. bei der Herstellung der Kapillare verwendet werden. Besonders bevorzugt ist die Kapillare über eine konische Steckverbindung mit der Kapillarhalterung verbunden.
Wenn das Messgerät mit einer Antriebseinrichtung ausgestattet ist, die zur Bewegung und Positionierung der patch-clamp- Pipette und der Flüssigkeitshaltereinrichtung eingerichtet ist, können Vorteile für einen automatisierten Betrieb des Messgerätes erzielt werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung kann das Messgerät mit einer Pipetten- zieheinrichtung ausgestattet sein, die zur Herstellung der Kapillare eingerichtet ist. Vorteilhafterweise kann damit die Kapillare unmittelbar vor einer elektrophysiologischen Mes- sung hergestellt und frei von Beschädigungen oder Verschmutzungen verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die oben genannte Aufgabe durch die allgemeine technische Lehre gelöst, ein Verfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung einer biologischen Zelle unter Verwendung der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung auszuführen. Vorteilhafterweise können patch-clamp-Messungen während der Überführung einer Zelle in ein verändertes Umgebungsmedium und während einer Perfusion mit diesem durchgeführt werden.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen be- schrieben. Es zeigen:
Figuren 1 bis 4: Varianten der ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung;
Figuren 5 und 6: eine schematische Illustration der erfindungsgemäßen Überführung einer Zelle in ein verändertes Umgebungsmedium unter Verwendung der Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung;
Figur 7 eine weitere Variante der ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung;
Figur 8 eine bevorzugte Variante des bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung verwendeten Halteelements; Figur 9 Varianten der zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung;
Figur 10 eine schematische Illustration der erfindungsgemä- ßen Überführung einer Zelle in ein verändertes Umgebungsmedium unter Verwendung der Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung;
Figur 11 Illustrationen von Zusatzteilen eines Messgerätes für elektrophysiologische Untersuchungen;
Figur 12 eine schematische Illustration einer Kapillarhalte- rung einer bevorzugt verwendeten patch-clamp- Pipette;
Figur 13 Illustrationen der Befüllung der Kapillare einer patch-clamp-Pipette mit einer Fülleinrichtung; und
Figur 14 eine schematische Illustration einer Kapillarhalte- rung einer patch-clamp-Pipette.
Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf eine bevorzugte Ausführungsform der Flüssigkeitshaltereinrichtung beschrieben, die an einer Pipettenspitze einer patch-clamp-Vorrichtung angebracht ist. Einzelheiten der patch-clamp-Technik werden hier nicht beschrieben, da sie aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind (siehe z. B.: O. P. Hamill et al. in "Pflugers Arch . " Bd. 391(2), 1981, S. 85-100). Die Flüssigkeitshaltereinrichtung ist nicht nur mit einer patch-clamp-Pipette verwendbar, sondern auch mit anderen Messgeräten für elektrophysiologische Untersuchungen kombinierbar, wie z. B. mit Mikroelektrodeneinrichtungen, ionenselektiven Mikroelektroden etc.. Figur IA zeigt eine Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 mit dem Halteelement 11.1, dem Stab 12.1 und dem Schwenkgelenk 13 gemäß einer Variante der ersten Ausführungsform der Erfindung. Die Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 ist in Verbindung mit einer patch-clamp-Pipette 20 im abstehenden Zustand des Halteelements 11.1 gezeigt. Das Halteelements 11.1 ist in diesem Zustand von der Kapillarspitze der patch-clamp-Pipette 20 getrennt. Figur IB zeigt eine vergrößerte Schnittdarstellung des Halteelements 11.1, das zur Aufnahme eines Flüssigkeits- tropfens eingerichtet ist (siehe Figur 4). Die patch-clamp- Pipette 20 ist in an sich bekannter Weise mit einer Kapillare 21 aufgebaut, die insbesondere eine freie Kapillarspitze 22 zum Ansaugen einer biologischen Zelle 2 und eine integrierte Messelektrode (nicht dargestellt) aufweist und an einer Ka- pillarhalterung 23 befestigt ist. Die Kapillarspitze 22 hat typischerweise einen Spitzendurchmesser im μm-Bereich. Die Kapillarhalterung 23 ist beispielsweise aufgebaut, wie dies in Figur 14 illustriert ist.
Der Verbund aus der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 und der patch-clamp-Pipette 20 bildet ein erfindungsgemäßes Messgerät 30 (teilweise dargestellt) , das des weiteren Leitungsverbindungen zum Anschluss an eine Steuereinrichtung aufweist und ggf. mit einer Antriebsvorrichtung ausgestattet ist (siehe Figur 7) .
Das Halteelement 11.1 hat die Form eines axial angeschnittenen Hohlzylinders mit einer elliptischen Grundfläche. Mit dem Halteelement 11.1 wird eine halbrohrförmige Kammer (sog. Halbrohrkammer) gebildet, die zur Aufnahme der Kapillare 21 der patch-clamp-Pipette 20 und eines Flüssigkeitstropfens eingerichtet ist. Auf der Innenseite des Halteelements 11.1 ist die Elektrode 14 angeordnet. Auf der Außenseite ist das Halteelement 11.1 mit dem Stab 12.1 verbunden. Die Elektrode 14 erstreckt sich entlang der Länge des Stabes 12.1.
Das Halteelement 11.1 besteht aus Glas oder Kunststoff (z. B. PVC) mit einer Wanddicke von rd. 200 μm bis 1 mm und einer Länge in Längsrichtung des Stabes 12.1 von rd. 3 mm bis 10 mm. Die seitliche Öffnung des Halteelements 11.1 hat eine Breite von rd. 1.5 mm bis 3 mm.
Die Elektrode 14 wird durch eine Metallschicht oder einen Metalldraht auf der Seite (insbesondere Innenseite) des Halteelements 11.1 gebildet, die zur Kapillare 21 weist. Die Elektrode 14 besteht z. B. aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) oder aus einem anderen elektrisch leitfähigen Material, z. B. Kohlenstoff oder Platin. Des Weiteren kann die Innenseite des Halteelements 11.1 hydrophil beschichtet sein.
Wenn eine Berührung der zu untersuchenden Zelle mit dem leitfähigen Material der Elektrode vermieden werden soll (falls die Zelle z. B. durch Ag/AgCl beeinflusst werden könnte), ist eine der folgenden Maßnahmen vorgesehen. Erstens kann die Elektrode aus Agar-Agar und einem Ag/AgCl-Elektrodenteil bestehen, wobei das Agar-Agar über eine Salzbrücke mit dem E- lektrodenteil verbunden ist. Zweitens kann die Elektrode teilweise beschichtet oder an der Außenseite des Halteelements 11.1 angeordnet sein, so dass ein Diffusionsweg z. B. von Ag/AgCl zur Zelle gebildet wird.
Der Stab 12.1 dient der Halterung des Halteelements 11.1. Der Stab 12.1 ist ein gerades, langgestrecktes Bauteil mit einer Längsrichtung, von der das Halteelement 11.1 radial absteht. Das Halteelement 11.1 öffnet sich in radialer Richtung relativ zur Längsrichtung des Stabes 12.1. An seinem ersten (proximalen) Ende ist der Stab 12.1 mit dem Schwenkgelenk 13 ver- bunden, während das Halteelement 11.1 an dem zweiten, freien (distalen) Ende des Stabes 12.1 befestigt ist. Der Stab 12.1 besteht aus einem inerten, elektrisch isolierenden Material, wie z. B. Kunststoff (z. B. PE) oder einer Keramik. Die Elektrode 14 oder eine an diese angeschlossene Leitungsverbindung ist in den Stab 12.1 integriert oder auf dessen Oberfläche befestigt.
Gemäß einer alternativen Variante sind die Elektrode 14 und der Stab 12.1 nicht zwei verschiedene Komponenten, sondern der Stab bildet die Elektrode. Wenn der Stab 12.1 und ggf. das Halteelement 11.1 dazu eingerichtet sind, die Elektrode zu bilden, bestehen diese zumindest teilweise aus einem leitfähigen Material, wie z. B. aus Ag/AgCl. Bei Verwendung von Agar-Agar umfasst die Elektrode 14 (oder entsprechend der
Stab 12.1) vorzugsweise ein Glasröhrchen, in dem das geleeartige Agar-Agar angeordnet ist, das dann in eine Salzbrücke übergeht.
Das Schwenkgelenk 13 umfasst z. B. ein Scharnier oder ein
Dünnschichtgelenk, das einerseits mit dem Stab 12.1 und andererseits mit der patch-clamp-Pipette 20 oder einer entsprechenden Klemmeinrichtung verbunden ist.
Figur IA illustriert schematisch eine piezoelektrische Antriebseinrichtung 15, die zum Verschwenken des Stabes 12.1 um eine Achse senkrecht zur Längsrichtung der patch-clamp- Pipette 20 eingerichtet ist. Die Antriebseinrichtung 15 ist z. B. zwischen einer Oberfläche der patch-clamp-Pipette 20 und dem Stab 12.1 angeordnet. Bei Beaufschlagung der Antriebseinrichtung 15 mit einer Stellspannung dehnt sich ein piezoelektrisches Element der Antriebseinrichtung 15 aus, so dass der Stab 12.1 verschwenkt werden kann. Figur IC zeigt eine weitere Variante eines Halteelements 11.1 mit einer gebogenen Form, wobei das Halteelement 11.1 zur lösbaren Verbindung am Stab 12 der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 (siehe Figur IA) vorgesehen ist. Zu diesem Zweck ist das Halteelement 11.1 z. B. im Spritzgussverfahren mit einer Einstecköffnung 11.11 und einer halbrohrförmigen Kammer zur Aufnahme der Kapillarspitze gebildet. Der Stab 12, der gleichzeitig die Referenzelektrode bilden kann, wird in die Einstecköffnung 11.11 gesteckt. Der elektrische Kontakt mit der Kammer, die im Zustand der Annäherung an die Kapillarspitze mit Flüssigkeit gefüllt ist, wird durch eine Kontaktrinne 11.12 hergestellt.
Die in Figur IC gezeigte Variante des Halteelements 11.1 kann so abgewandelt sein, dass die Kammer rohrförmig gebildet ist und die Kapillarspitze (nicht dargestellt) vollständig umgeben kann. Das Halteelement 11.1 hat die Form eines Napfes mit offenem Boden. Wegen der lösbaren Verbindung mit dem Stab 12 ist das Halteelement 11.1 von der Kapillarspitze trennbar. Das Halteelement 11.1 ist so dimensioniert, dass die Flüssigkeit im Halteelement 11.1 durch die Wirkung von Kapillarkräften gehalten wird.
Alternativ zu dem gezeigten Halteelement 11.1 mit einer gebo- genen Form kann gemäß Figur 2 am distalen Ende des Stabes
12.1 ein Halteelement 11.1 in Form einer ebenen Platte, z. B. aus Glas oder Kunststoff vorgesehen sein. Das ebene Halteelement 11.1 trägt auf der zur Kapillare weisenden Seite die Elektrode 14. Bei geeigneter Gestaltung des Stabs 12.1 kann das Halteelement 11.1 mit dem Ende des Stabs 12.1 einstückig verbunden sein.
Gemäß einer weiteren Alternative kann die ebene Platte des Halteelements 11.1 in axialer Richtung der Kapillare 21 abge- winkelt sein (Figur 3). Vorteilhafterweise ist in diesem Fall das Halteelement 11.1 an die Form der Kapillarspitze 22 der Kapillare 21 angepasst. Dadurch kann, wenn die Gefahr eines unbeabsichtigten Austrocknens gering ist, der Flüssigkeits- tropfen 1 am Halteelement 11.1 kleiner als bei der Variante gemäß den Figuren 1 und 2 gebildet und entsprechend das Totvolumen um die Zelle 2 verringert werden. Alternativ zu der gezeigten Form der abgeknickten Platte kann eine komplexere Form gemäß der Außenkontur der Kapillarspitze 22 vorgesehen sein. Figur 3 illustriert des Weiteren, dass das Halteelement 11.1 und mit diesem die Elektrode direkt an die Kapillare 21 anstoßen kann. Alternativ ist es möglich, dass der Stab 12.1 mit der Antriebseinrichtung 15 (Figur IA) so eingestellt wird, dass die Elektrode in unmittelbarer Nähe der Kapillar- spitze 22 angeordnet ist.
Die Figuren 4A und 4B zeigen die erste Ausführungsform gemäß Figur 1 entsprechend im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 mit einem Flüssigkeitstropfen 1 und ei- ner Zelle 2. Zwischen der Kapillarspitze 22 und der Innenseite des Halteelements 11.1 ist nur noch ein Kapillarspalt gegeben, oder die Innenseite des Halteelements 11.1 berührt die Kapillarspitze 22. Durch die Kapillarkräfte wird der Flüssigkeitstropfen 1 an der Kapillare 21 gehalten, auch wenn die patch-clamp-Pipette 20 aus einem flüssigen Umgebungsmedium zurückgezogen wird.
In den Figuren 5 und 6 ist der Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur elektrophysiologischen Untersuchung einer bio- logischen Zelle unter Verwendung der ersten Ausführungsform der Erfindung mit weiteren Einzelheiten schematisch illustriert . Zellen einer Zellkultur 3 befinden sich auf dem Boden eines ersten Kulturgefäßes 40, das mit einem ersten Umgebungsmedium 4 gefüllt ist. Das Umgebungsmedium 4 umfasst z. B. ein Kultivierungsmedium der Zellkultur 3. In einem ersten Verfahrens- schritt wird eine Zelle 2 in an sich bekannter Weise aus der Zellkultur 3 entnommen. Vorzugsweise erfolgt die Zellentnahme, während die Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 in dem abstehenden Zustand ist und die Kapillare 21 der patch-clamp- Pipette 20 frei an die Zellkultur 3 bewegt, manipuliert und dabei mit der schematisch gezeigten Bildaufnahmeeinrichtung 60 beobachtet werden kann. Die Bewegung der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 und der patch-clamp-Pipette 20 erfolgt mit einer schematisch gezeigten Antriebseinrichtung 50.
Anschließend folgt ein Verschwenken des Stabs 12.1 zur Überführung der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 in den angelegten Zustand. Diese Situation ist in Figur 5 illustriert. Das Halteelement 11.1 umgibt die Spitze 22 der Kapillare mit der Zelle 2. In dieser Situation kann eine erste patch-clamp- Messung an der Zelle 2 durchgeführt werden.
Anschließend erfolgt gemäß Figur 6 die Überführung der Zelle 2 in ein weiteres Kulturgefäß 41 mit einem veränderten Umgebungsmedium 5. Hierzu wird die Relativposition zwischen der patch-clamp-Pipette 20 und den Kulturgefäßen 40, 41 unter
Verwendung der schematisch illustrierten Antriebsvorrichtung 50 und einer Steuereinrichtung (nicht gezeigt) verändert, in dem bspw. die patch-clamp-Pipette 20 von dem ersten Kulturgefäß 40 zu dem zweiten Kulturgefäß 41 bewegt wird.
Durch die Wirkung der Kapillarkräfte kommt es beim Anheben der patch-clamp-Pipette 20 aus dem ersten Umgebungsmedium 4 zur Tropfenbildung am Halteelement 11.1. Der Kontakt zwischen der Zelle 2 und der Elektrode 14 bleibt erhalten, so dass die Messung nicht gestört wird, wenn die Zelle 2 aus dem ersten Umgebungsmedium 4 herausbewegt wird.
Beim Eintauchen der patch-clamp-Pipette 20 in das zweite Um- gebungsmedium 5 wird der Tropfen 1 an der Spitze 22 der patch-clamp-Pipette 20 schnell durch das zweite Umgebungsmedium 5 verdünnt. Vorteilhafterweise kann während der Verdünnung die Messung von Zellpotentialen oder Ionenströmen durch die Zellmembran fortgesetzt werden, um die Wirkung des zwei- ten Umgebungsmediums 5 unmittelbar zu erfassen. Die laufende Messung bei einem schnellen Austausch der Umgebungsflüssigkeit der Zelle 2 ist insbesondere bei der Messung von ligan- den-aktivierten Ionenströmen von Vorteil.
Die Schritte des Wechsels des Umgebungsmediums mit einer laufenden oder einer wiederholten Messung des Zellpotentials gemäß den Figuren 5 und 6 können in Abhängigkeit von der konkreten Aufgabenstellung wiederholt werden. Die Zahl der Wiederholungen ist vorteilhafterweise praktisch unbegrenzt, so dass sich die Erfindung insbesondere für die Untersuchung einer Vielzahl von Testmedien, insbesondere im Rahmen von Hochdurchsatzverfahren eignet. Vorteilhafterweise kann auf die herkömmliche Applikation von Testmedien über Schläuche verzichtet werden, wodurch nicht nur die Genauigkeit der Messung erhöht, sondern auch die mögliche Zahl der applizierbaren Testmedien und damit der Messdurchsatz vergrößert werden.
Figur 7 zeigt eine weitere Variante der ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 mit den Komponenten 11.1, 12.1 und 13 an einer patch-clamp- Pipette 20. Das Halteelement 11.1 ist wie in Figur IA im abstehenden Zustand gezeigt. Die Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 und die patch-clamp-Pipette 20 sind mit der Antriebseinrichtung 50 verbunden, die beispielsweise einen 3-Achsen- Manipulator umfasst. Figur 7 zeigt das Schwenkgelenk 13 beispielhaft am oberen Ende der Kapillarhalterung 23. Alternativ kann das Schwenkgelenk 13 seitlich an der Kapillarhalterung 23 angeordnet sein.
Die Kapillare 21 der patch-clamp-Pipette 20 ist an der Kapillarhalterung 23 lösbar befestigt. Die Kapillarhalterung 23 weist eine Saugeinrichtung 26 zur Erzeugung eines Unterdrucks auf, unter dessen Wirkung die Zelle 2 auf der Kapillarspitze 22 gehalten werden kann. Vorzugsweise steckt die Kapillare 21 wie dargestellt in einer Dichtung 24, z. B. aus Gummi, auf der Innenseite der Kapillarhalterung 23, wobei die Messelektrode 25, z. B. ein Silberdraht durch die Kapillarhalterung 23 zu weiteren Leitungsverbindungen (nicht dargestellt) ver- läuft. Vorteilhafterweise bildet die Kapillarhalterung 23 mit der Dichtung 24 einen Greifer, der beim Ziehen der Kapillare 21 verwendet werden kann (siehe Figuren 11, 12). Alternativ kann eine konische Steckverbindung vorgesehen sein, mit der die Kapillare 21 einfacher ausgewechselt werden kann (siehe Figur 12) . In diesem Fall werden Kapillaren 21 verwendet, die an ihrem rückseitigen Ende eine konische Form aufweisen.
Bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung ist das Halteelement dazu eingerichtet, die Flüssigkeit zur Bildung der flüssigen Umgebung an der Kapillarspitze unter der Wirkung der Gravitationskraft in einem Gefäß, z. B. einem Napf bereitzustellen, in das die Kapillarspitze im zusammengesetzten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung hinein ragt. In diesem Fall kann das Halteelement nicht durch die oben be- schriebene Schwenkbewegung von der Kapillarspitze getrennt werden, da sonst der Gefäßrand die Kapillarspitze beschädigen würde. Entsprechend ist bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, dass das Halteelement lösbar am Stab der Flüssigkeitshaltereinrichtung befestigt ist. Eine bevor- zugte Variante des für die zweite Ausführungsform der Erfindung verwendeten Halteelements 11.2 ist in den Figuren 8A und 8B illustriert.
Das Halteelement 11.2 gemäß Figur 8A hat die Form eines Napfes, in dessen Wand eine Einstecköffnung 11.21 vorgesehen ist. Der Napf hat des weiteren einen geschlossenen Boden 11.23 und eine Kontaktrinne oder einen Kontaktspalt 11.22, durch die eine in der Einstecköffnung 11.21 angeordnete Elektrode über die im Napf und der Kontaktrinne 11.22 befindliche Flüssigkeit mit dem Inneren des Napfes in elektrischen Kontakt gelangt.
Das Halteelement 11.2 besteht z. B. aus einem Kunststoff, der im Spritzgussverfahren geformt ist. Es kann beispielsweise ein Elastomer-Kunststoff vorgesehen sein. In diesem Fall kann der Stab (in Figur 8A nicht dargestellt) in der Einstecköffnung 11.21 unter der Wirkung einer elastischen Spannung festsitzen. Alternativ oder zusätzlich kann an der Einstecköff- nung 11.21 eine Schnapp- oder Rastverbindung (nicht dargestellt) vorgesehen sein. Das Halteelement 11.2 gemäß Figur 8A und 8B hat beispielsweise die folgenden Dimensionen: Außendurchmesser: 3 mm bis 10 mm, Napfdurchmesser : 0,3 mm bis 3 mm, und axiale Höhe 2 mm bis 10 mm.
Figur 8B illustriert die Kombination des Halteelement 11.2 mit einem hohlen Stab 12.2 (teilweise gezeigt), der vorteilhafterweise zum Flüssigkeitstransport in den oder aus dem Napf verwendet werden kann. Der Stab 12.2 hat die Form eines Rohres, das an seinem freien Ende am Halteelement 11.2 offen und am entgegengesetzten Ende mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Durch den Stab 12.2 kann über den Kontaktspalt Lösung in den Napf zugeführt oder abgesaugt werden kann. Die Bereitstellung des Kontaktspaltes bzw. der Kontaktrinne hat insbesondere den Vorteil, dass bei der rohrförmigen Ausführung des Stabes 12.2 durch eine Druckänderung im Stab 12.2 die Flüssigkeitsmenge im Halteelement verändert werden kann.
Gemäß einer Abwandlung kann das Halteelement als Napf mit einem offenen Boden gebildet sein, so dass sich die oben unter Bezug auf Figur IC genannte Variante der ersten Ausführungsform der Erfindung ergibt.
Gemäß einer weiteren Abwandlung kann das Halteelement 11.2 zwei Einstecköffnungen zur Aufnahme von zwei Stäben der Flüssigkeitshaltereinrichtung aufweisen. Verschiedene Varianten des Halteelements 11.2 mit zwei Einstecköffnungen sind in den Figuren 9 und 10 illustriert. Die Stäbe sind in die Einstecköffnungen formschlüssig oder kraftschlüssig einsteckbar. Die Außerdurchmesser der Stäbe und die Innendurchmesser der Einstecköffnungen sind entsprechend angepasst. In Figur 9 sind zur Illustration die Innendurchmesser der Einstecköffnungen vergrößert gezeigt.
Die in Figur 9A gezeigte Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 um- fasst das Halteelement 11.2 und die Stäbe 12.2, 12.3. Die patch-clamp-Pipette 20 umfasst die Kapillare 21 und die Ka- pillarhalterung 23. Im Innern der Kapillare 21 verläuft die Messelektrode 25, die mit einem Messkopf (in Figur 9 nicht gezeigt) verbunden ist. Die Stäbe 12.2, 12.3 der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 sind mit der Kapillarhalterung 23 fest verbunden (z. B. geklebt oder verschraubt), so dass sie auf entgegengesetzten Seiten der Kapillare 21 symmetrisch angeordnet sind. Die Stäbe 12.2, 12.3 erstrecken sich parallel zur axialen Ausdehnung der Kapillare 21. Die Länge der Stäbe 12.2, 12.3 ist so gewählt, dass die Kapillarspitze 22 in den Napf des aufgesteckten Halteelements 11.2 hineinragt, ohne den Napfboden zu berühren. Einer der Stäbe 12.2, 12.3 kann als Elektrode verwendet werden. Entsprechend ist an einer der Einstecköffnungen eine Kontaktrinne (Kontaktspalt) vorgesehen. Die Stäbe 12.2, 12.3, die rohrförmig sein können, bilden mit dem Halteelement 11.2 eine lösbare Steckverbindung.
Figur 9B zeigt eine Abwandlung, bei der einer der Stäbe (12.3) am Ende eine Krümmung aufweist, die der Fixierung des Halteelements 11.2 dient. Der Stab 12.3 kann aus einem fe- dernden Material gebildet sein und in eine schräge Rille 11.24 an der Seite des Halteelements 11.2 greifen.
Die Figuren 9C und 9D zeigen weitere Abwandlungen, bei denen die freien Enden der Stäbe 12.2, 12.3 Spitzen aufweisen, die in konisch geformte Einstecköffnungen des Halteelements 11.2 eingreifen. Gemäß Figuren 9D kann eine seitliche Verschrau- bung 12.4 des Stabs 12.3 mit der Kapillarhalterung 23 vorgesehen sein. Alternativ kann die Verschraubung 12.4 durch eine ringförmige Halterung ersetzt sein. In diesem Fall ergibt sich der Vorteil, dass die Stäbe leicht an verschiedene Typen von Kapillarhalterungen angesteckt werden können.
Bezug nehmend auf die Figuren 10A bis 10D wird der Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur elektrophysiologischen Untersuchung einer biologischen Zelle unter Verwendung der zweiten Ausführungsform der Erfindung mit weiteren Einzelheiten beschrieben.
Zunächst erfolgt die Vorbereitung der patch-clamp-Pipette 20. Hierbei ist vorzugsweise die Herstellung der Kapillare 21 unmittelbar vor der elektrophysiologischen Untersuchung mit einer Pipettenzieheinrichtung vorgesehen, die unten unter Bezug auf Figur 11 beschrieben wird. Die Kapillare 21 wird von der Kapillarhalterung 23 aufgenommen. Anschließend wird die patch-clamp-Pipette 20 mit der Antriebsvorrichtung 50 zu einem vorbereiteten Halteelement 11.2 gefahren, um dieses durch Einstecken des Stabes 12.2 in die Einstecköffnung 11.21 aufzunehmen.
Anschließend wird das Messgerät 30 mit der Antriebsvorrichtung 50 zu einem Suspensionsgefäß 42 bewegt. Im Suspensionsgefäß 42 befinden sich suspendierte Zellen 2. Die patch- clamp-Pipette 20 wird mit der Tropfenhalteeinrichtung 10 in die Zellsuspension eingeführt. Dabei ist die patch-clamp- Pipette 20 so ausgerichtet, dass die Kapillare 21 vertikal (senkrecht zum Boden des Suspensionsgefäßes 42) verläuft. Beim Eintauchen der Kapillare 21 mit dem Halteelement 11.2 in die Zellsuspension wird diese bewegt und durchmischt. Zu die- sem Zweck wird das Messgerät 30 mit der Antriebsvorrichtung 50 vorzugsweise auf- und ab bewegt (Figur 10B).
Im Ergebnis befinden sich im Napf des Haltelements 11.2 suspendierte Zellen. Anschließend wird das Messgerät 30 angehal- ten. Mit einer Saugeinrichtung (siehe Figur 7, in Figur 9 nicht dargestellt) wird in der Pipettenhalterung 23 und der Kapillare 21 ein Unterdruck erzeugt, unter dessen Wirkung nach kurzer Zeit eine Zelle an der Kapillarspitze 22 angesaugt wird. Es wird die für die patch-clamp-Messung erforder- liehe so genannte „Gigaseal"-Verbindung hergestellt und die an sich bekannte patch-clamp-Messung gestartet.
Nach einer vorbestimmten Messzeit erfolgt ein Flüssigkeitswechsel in der Umgebung der vermessenen Zelle 2. Diese Mess- zeit wird beispielsweise in Abhängigkeit von dem Wert des gemessenen Widerstands über der Zelle (so genannter „Seal- Widerstand") ermittelt. Zum Flüssigkeitswechsel wird das Messgerät 30 aus dem ersten Suspensionsgefäß 42 herausgehoben (Figur 10C) wobei das Halteelement 11.2 im angesteckten Zu- stand bleibt und an der Kapillarspitze 22 eine flüssige Umgebung der Zelle 2 gebildet ist. Mit der Antriebsvorrichtung 50 wird das Messgerät 30 in das weitere Suspensionsgefäß 43 überführt (Figur 10D), in dem sich eine Testlösung befindet. In der Testlösung kommt es zu einen schnellen Flüssigkeitsaustausch mit der Flüssigkeit im Napf des Halteelements 11.2. Während der Verdünnung des Umgebungsmediums der Zelle 2 mit der Testlösung kann laufend die Messung von Zellpotentialen fortgesetzt werden, um die Wirkung der Testlösung unmittelbar zu erfassen. Wie oben im Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform erwähnt, kann auch bei Verwendung des zweiten Ausführungsform die Messung des Zellpotentials in verschiedenen Testmedien wiederholt werden.
Bei Verwendung eines rohrförmigen Stabes 12.2 oder 12.3 kann die Flüssigkeitsmenge im Napf verändert werden, wodurch bei durch Absaugen eines Volumenanteils die Verdünnungszeit der Lösung im Napf verkürzt werden kann.
Nach der letzten Messung kann die Ablage der Zelle 2 in einer Zellkultur, z.B. am Boden eines Kulturgefäßes vorgesehen sein. Zu diesem Zweck wird das Halteelement 11.2 von der Kapillare 21 entfernt (Überführung in die Freigabeposition) . Die Abnahme des Haltelements 11.2 vom Stab 12.2 erfolgt z.B. unter Verwendung eines gabelförmigen Werkzeugs, das im Kulturgefäß oder an freier Luft bereitgestellt wird.
Gemäß einer bevorzugten Realisierung der Erfindung ist das Messgerät 30 mit einer Pipettenzieheinrichtung 70 ausgestat- tet, die schematisch in Figur IIA gezeigt ist. Da Kapillaren für patch-clamp-Pipetten sehr empfindlich sind, leicht verschmutzen und daher kaum transportierbar sind, kann die Pipettenzieheinrichtung 70 vorteilhafterweise zur Herstellung der Kapillaren 21 der patch-clamp-Pipetten 20 am Ort des Messgerätes 30 verwendet werden. Es ist insbesondere ein automatisierter Betrieb der Herstellung und Aufnahme der patch- clamp-Pipette 20 möglich.
Die Pipettenzieheinrichtung 70 umfasst einen Klemmblock 71, einen Heizdraht 72 und eine Heizung 73. Zum Ausziehen einer Kapillare 21 wird zuerst eine Glaskapillare mit einem Mess- elektrodendraht in den Klemmblock 71 eingesetzt. Anschließend wird auf das freie Ende der Glaskapillare die Kapillarhalte- rung 23 aufgesetzt. Hierzu wird vorzugsweise die Antriebseinrichtung (50, siehe z. B. Figuren 5, 6, 10) verwendet, die somit eine Doppelfunktion bei der Herstellung der Kapillare 21 und bei deren Transport erfüllt.
Während die Glaskapillare mit dem Heizdraht 72 erhitzt und geschmolzen wird, kann mit der Kapillarhalterung 23 die Kapillare 21 zurückgezogen werden, so dass sich die gewünschte Form der Kapillarspitze 22 ergibt. Anschließend wird die Kapillare 21 mit der Antriebseinrichtung 50 z. B. in einem Ma- gazin 80 abgesetzt, wie es schematisch in Figur IIB illustriert ist. Das Magazin 80 umfasst z. B. einen Block 81 mit Löchern, in die Kapillaren 21 einsetzbar sind, so dass ihre Kapillarspitzen 22 frei bleiben. Das Absetzen erfolgt mit einer Abstreifvorrichtung oder unter Ausübung eines Druckpulses in der Kapillarhalterung 23.
Figur 12 zeigt weitere Einzelheiten der Verwendung einer Kapillare, bei der eine konische Steckverbindung 24.1, 24.2 vorgesehen ist. Gemäß Figur 12A wird eine Kapillare 21 ver- wendet, an deren Enden die Steckverbindungen 24.1, 24.2 über Schraubverbindungen 24.3, 24.4 fixiert sind. Die Schraubverbindungen können durch Steckverbindungen mit mindestens einem Dichtungsring ersetzt werden (siehe Figur 13B) . Die Kapillare 21 wird mit den Steckverbindungen 24.1, 24.2 in den Klemm- block 71 (siehe Figur IIA) eingesetzt und ausgezogen. Figur 12B zeigt die fertige Kapillare 21 nach dem Ausziehen.
Figur 13 zeigt schematisch eine Fülleinrichtung 90 (Figur 13A) , die zur Befüllung der Kapillare 21 einer patch-clamp- Pipette vorgesehen ist (Figur 13B) . Die Befüllung der Kapillare einer patch-clamp-Pipette mit einer Betriebsflüssigkeit (z.B. physiologische Lösung) ist bisher mit dem Risiko einer Beschädigung der Kapillare verbunden. Dieses Problem tritt insbesondere dann auf, wenn patch-clamp-Pipetten mit Kapillaren verwendet werden, die in Abhängigkeit von der beabsichtigten Anwendung verschiedene Längen aufweisen. Zur Vermeidung einer Beschädigung der Kapillare wird vorzugsweise die in Figur 13A illustrierte Fülleinrichtung 90 verwendet.
Die Fülleinrichtung 90 umfasst eine Füllkapillare 91 (z.B. eine Quarzkapillare) , die in einem Halteblock 92 befestigt ist. Am Halteblock 92 ist ein Verbindungsschlauch 93 befestigt, der eine Flüssigkeitsverbindung zwischen der Füllkapil- lare 91 und einer Flüssigkeitsfördereinrichtung 94 (z.B.
Spritzeneinrichtung) bildet. Zwischen dem Flüssigkeitsreservoir der Flüssigkeitsfördereinrichtung 94 und dem Halteblock 92 ist auf der Außenseite des Verbindungsschlauchs 93 eine Federeinrichtung 95 (z.B. eine Spiralfeder) vorgesehen. Der Verbindungsschlauch 93 besteht aus einem biegsamen Material. Der Verbindungsschlauch 93 und die Federeinrichtung 95 sind elastisch deformierbar. Vorteilhafterweise können durch eine elastische Deformation Kräfte, die bei Betätigung der Flüssigkeitsfördereinrichtung 94 ggf. unbeabsichtigt entstehen, aufgenommen und somit eine unerwünschte Kraftübertragung auf die Kapillare der patch-clamp-Pipette vermieden werden.
Figur 13B zeigt die Kombination der Fülleinrichtung 90 mit der Kapillare 21 der patch-clamp-Pipette während der Befül- lung. Die Kapillare 21 ist in eine konische Steckverbindung 24.5 eingesetzt. Die Steckverbindung 24.5 (oder: Aufnahmeeinrichtung) umfasst einen konischen Stopfen mit einer axialen Bohrung, auf deren Innenseite mindestens ein Dichtungsring, vorzugsweise jedoch zwei Dichtungsringe 24.6 zur Halterung der Kapillare 21 angeordnet sind. Die axiale Bohrung weist eine trichterförmige Öffnung 24.7 mit einem Stufenvorsprung 24.8 auf, die der schonenden Einführung der Füllkapillare 91 der Fülleinrichtung 90 und der Bildung eines Anschlags für die Kapillare 21 dienen. Vorteilhafterweise wird durch den Vorsprung 24.8 die Wand der Kapillare 21 abgedeckt, so dass die Füllkapillare 91 von der trichterförmigen Öffnung 24.7 unmittelbar in den Innenraum der Kapillare 21 geleitet wird.
Durch die Möglichkeit einer elastischen Deformation des Ver- bindungsschlauchs 93 und der Federeinrichtung 95 wird eine übermäßige Beanspruchung der Füllkapillare 91 und der Kapillare 21 vermieden. Es wird insbesondere ermöglicht, dass die eingeführte Füllkapillare 91 (wie in Figur 13B gezeigt) an die Innenwand an die Kapillare 21 anstoßen kann, ohne übermäßige Kräfte zu bilden. Dieser Vorteil wird wegen der Defor- mierbarkeit der Komponenten 93, 95 unabhängig von der Länge der Kapillare 21 erzielt, so dass die Fülleinrichtung 90 besonders gut für die Befüllung von Kapillaren 21 verschiedener Längen geeignet ist.
Figur 14 zeigt beispielhaft weitere Einzelheiten einer Kapil- larhalterung 23 einer patch-clamp-Pipette, die mit Vorteil bei der Realisierung der Erfindung verwendet werden kann. Die Kapillarhalterung 23 umfasst eine Kapillarelektrode 23.1, die vorzugsweise durch eine Quarzkapillare gebildet wird. Die Kapillarelektrode 23.1 steckt in einem Träger 23.2. Der Träger 23.2 weist an einem Ende eine Aufnahme 23.3 für die Kapillare (nicht dargestellt) der patch-clamp-Pipette und am entgegen- gesetzten Ende ein Elektrolytreservoir 23.5 mit einem Elekt- rodenanschluss 23.6 (z.B. einem Ag-AgCl-Pellet) auf.
Die Aufnahme 23.3 ist zur unmittelbaren Aufnahme der Kapilla- re 21 oder der Steckverbindung 24.1, 24.2, 24.5 (siehe Figuren 12, 13) eingerichtet und vorzugsweise mit mindestens einem oder zwei Dichtungsringen 23.4 ausgestattet. Zur Aufnahme der Steckverbindung (z.B. 24.1, 24.2 oder 24.5) weist die Aufnahme 23.3 vorzugsweise eine Konushohlform auf.
Die Kapillarelektrode 23.1 ist vorzugsweise eine mit einem Elektrolyt, zum Beispiel KCl, gefüllte Quarzkapillare, die in das Elektrolytreservoir 23.5 mündet. Alternativ kann eine Ag- AgCl-Drahtelektrode vorgesehen sein.
Die in den Figuren 11 bis 14 gezeigten Einrichtungen können unabhängige Erfindungsgegenstände darstellen, die mit Pipetten ohne die oben beschriebene, erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung realisiert sein können.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeu- tung sein.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Flüssigkeitshaltereinrichtung (10), die zur Bildung einer flüssigen Umgebung an einer Kapillarspitze (22) einer patch-clamp-Pipette (20) eingerichtet ist, umfassend:
- ein Halteelement (11.1, 11.2), das zur Halterung eines Flüssigkeitstropfens (1) eingerichtet ist, und - mindestens einen Stab (12.1, 12.2, 12.3), der zur Positionierung des Halteelements (11.1, 11.2) an der Kapillarspitze (22) eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, dass
- der mindestens eine Stab (12.1, 12.2, 12.3) so eingerichtet ist, dass in einem Zustand, in dem die Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) mit der patch-clamp-Pipette (20) zusammengesetzt ist, das Halteelement (11.1, 11.2) von der Kapillare (21) trennbar ist.
2. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 1, bei der
- das Halteelement (11.1) zur Halterung des Flüssigkeitstropfens (1) unter der Wirkung von Kapillarkräften eingerichtet ist, und
- das Halteelement (11.1) mit dem Stab (12.1) verschwenkbar ist.
3. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 2, bei der
- der Stab (12.1) ein Schwenkgelenk (13) aufweist, das zur Verbindung des Stabs (12.1) mit einer Kapillarhalterung (23) der patch-clamp-Pipette (20) eingerichtet ist.
4. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 3, bei der
- das Schwenkgelenk (13) mit einer Antriebseinrichtung (15) zum Verschwenken des Stabs (12.1) ausgestattet ist.
5. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 3 oder 4, bei der
- das Schwenkgelenk (13) zur lösbaren Verbindung des Stabs (12.1) mit der patch-clamp-Pipette (20) eingerichtet ist.
6. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 5, bei der
- das Schwenkgelenk (13) zum Anklemmen des Stabs (12.1) an der patch-clamp-Pipette (20) eingerichtet ist.
7. Flüssigkeitshaltereinrichtung mindestens einem der Ansprüche 2 bis 6, bei der
- das Halteelement (11.1) durch eine ebene Platte, eine profilierte Platte oder einen Abschnitt einer in axialer Rich- tung angeschnittenen Hohlleitung gebildet wird.
8. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 7, bei der
- das Halteelement (11.1) durch einen in axialer Richtung angeschnittenen Hohlzylinder gebildet wird.
9. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 8, bei der
- das Halteelement (11.1) am Stab (12.1) lösbar befestigt ist.
10. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 1, bei der
- das Halteelement (11.2) zur Halterung des Flüssigkeitstropfens (1) unter der Wirkung der Gravitationskraft eingerichtet ist, und - das Halteelement (11.2) an dem mindestens einen Stab (12.2, 12.3) lösbar befestigt ist.
11. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 10, bei der
- der mindestens eine Stab (12.2, 12.3) zur fixierten Befestigung an der Kapillare (21) oder einer Kapillarhalterung (23) der patch-clamp-Pipette (20) eingerichtet ist.
12. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, bei der
- das Halteelement einen Napf (11.2) umfasst, in dessen Wand ein Ende des mindestens einen Stabes (12.2, 12.3) einsteckbar ist.
13. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 12, bei der - eine Einstecköffnung (11.21) in der Wand und das Innere des Napfes (11.2) über eine Kontaktrinne (11.22) verbunden sind.
14. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 13, bei der - in der Wand des Napfes (11.2) mindestens eine konische Einstecköffnung (11.21, 11.24) vorgesehen ist, und
- der mindestens eine Stab (12.2, 12.3) ein sich verjüngendes Ende aufweist, das in die konische Einstecköffnung (11.21, 11.24) passt.
15. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 14, die
- zwei Stäbe (12.2, 12.3) aufweist, die zur Positionierung des Halteelements (11.2) an der Kapillarspitze (22) einge- richtet sind, wobei
- in der Wand des Napfes (11.2) zwei Einstecköffnungen (11.21, 11.24) vorgesehen sind, die zur Aufnahme von freien Enden der Stäbe (12.2, 12.3) eingerichtet sind.
16. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Halteelement (11.1, 11.2) mit einer Elektrode (14) ausgestattet ist.
17. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß Anspruch 16, bei der die Elektrode (14) mit dem Stab (12.1, 12.2, 12.3) verbunden ist oder durch den Stab (12.1, 12.2, 12.3) gebildet wird.
18. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Halteelement (11.1) eine hydrophile oder oleophile Beschichtung trägt.
19. Flüssigkeitshaltereinrichtung gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher der Stab (12.1,
12.2, 12.3) rohrförmig ist.
20. Messgerät (30), insbesondere für elektrophysiologische Untersuchungen, umfassend: - eine patch-clamp-Pipette (20) mit einer Kapillare (21) , deren Kapillarspitze (22) zur Aufnahme einer biologischen Zelle (2) eingerichtet ist, und mit einer Kapillarhalterung (23), die zur Aufnahme der Kapillare (21) eingerichtet ist, und - eine Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.
21. Messgerät gemäß Anspruch 20, bei dem der Stab (12.1) der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) von einer Konditionie- rungsposition, in der das Halteelement (11) die Kapillarspit- ze (22) berührt oder von dieser durch einen Kapillarspalt getrennt ist, in eine Freigabeposition verschwenkbar ist, in der die Kapillarspitze (22) frei steht.
22. Messgerät gemäß Anspruch 20, bei dem der mindestens eine Stab (12.2, 12.3) an der Kapillare (21) oder der Kapillar- halterung (23) fixiert und das Halteelement (11) mit dem mindestens einen Stab (12.2, 12.3) lösbar verbunden ist.
23. Messgerät gemäß mindestens einem der Ansprüche 20 bis
22, das eine Antriebseinrichtung (50) aufweist, die zur Bewegung und Positionierung der patch-clamp-Pipette (20) und der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) eingerichtet ist.
24. Messgerät gemäß mindestens einem der Ansprüche 20 bis
23, bei dem die Kapillare (21) über eine konische Steckverbindung (24.1) mit der Kapillarhalterung (23) verbunden ist.
25. Messgerät gemäß mindestens einem der Ansprüche 20 bis
24, das eine Pipettenzieheinrichtung (70) aufweist, die zur Herstellung der Kapillare (21) eingerichtet ist.
26. Verfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung einer biologischen Zelle (2) unter Verwendung einer Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) und eines Messgerätes (30) gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, mit den Schritten:
- Aufnahme der biologischen Zelle (2) an der Kapillarspitze (22) der patch-clamp-Pipette (20) in einem ersten Umgebungsmedium,
- Überführung der biologischen Zelle (2) mit der Kapillarspitze (22) in ein zweites Umgebungsmedium, wobei mit dem Halteelement (11.1, 11.2) der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) an der Kapillarspitze (22) der patch-clamp-Pipette (20) eine flüssige Umgebung gebildet ist, wobei während und/oder nach der Überführung der biologischen Zelle (2) eine - Messung eines elektrophysiologischen Potentials an der Zelle (2) oder von Ionenströmen durch die Zellmembran der Zelle (2) vorgesehen ist.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem nach der Aufnahme der biologischen Zelle (2) an der Kapillarspitze (22) der patch-clamp-Pipette (20) ein Verschwenken des Stabs (12.1) der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) derart vorgesehen ist, dass das Halteelement (11.1) an der Kapillarspitze (22) mit der biologischen Zelle (2) anliegt oder von dieser durch einen Kapillarspalt getrennt ist.
28. Verfahren gemäß Anspruch 26, bei dem vor der Aufnahme der biologischen Zelle (2) an der Kapillarspitze (22) der patch-clamp-Pipette (20) ein Anstecken des Halteelements
(11.2) am Stab (12.2, 12.3) der Flüssigkeitshaltereinrichtung (10) derart vorgesehen ist, dass die Kapillarspitze (22) in das Halteelement (11.2) ragt.
29. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 26 bis 28, mit den weiteren Schritten:
- Überführung der biologischen Zelle (2) in mindestens ein weiteres Umgebungsmedium, wobei während und/oder nach der Überführung der biologischen Zelle (2) eine weitere - Messung des elektrophysiologischen Potentials an der Zelle (2) oder von Ionenströmen durch die Zellmembran der Zelle (2) in dem weiteren Umgebungsmedium vorgesehen ist.
30. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 26 bis 29, bei dem die Aufnahme-, Verschwenk- und Überführungsschritte unter Verwendung einer Bildaufnahmeeinrichtung (60) und einer Steuereinrichtung automatisiert erfolgen.
31. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 26 bis
30, bei dem über den Stab und die Kontaktrinne Lösung in das Halteelement (12.2) zugeführt oder aus diesem abgesaugt wird.
32. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 26 bis
31, bei dem unmittelbar vor der Aufnahme der biologischen Zelle (2) eine
- Herstellung der Kapillare (21) der patch-clamp-Pipette (20) mit einer Pipettenzieheinrichtung (70) vorgesehen ist.
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