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Die
Erfindung betrifft eine Flüssigkeitshaltereinrichtung
für elektrophysiologische
Untersuchungen biologischer Zellen, insbesondere eine Flüssigkeitshaltereinrichtung
mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1. Die Erfindung
betrifft des Weiteren ein elektrophysiologisches Messgerät, das mit
einer derartigen Flüssigkeitshaltereinrichtung ausgestattet
ist und insbesondere eine patch-clamp-Pipette umfasst. Die Erfindung
betrifft auch ein Verfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung
einer biologischen Zelle unter Verwendung einer derartigen Flüssigkeitshaltereinrichtung.
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Es
ist bekannt, Ströme
von Ionen durch Ionenkanäle
in der Zellmembran isolierter biologischer Zellen durch elektrophysiologische
Messungen zu erfassen. Diese Messungen werden auch als patch-clamp-Messung
und das hierzu verwendete Messgerät als patch-clamp-Vorrichtung
bezeichnet. Die patch-clamp-Vorrichtung
enthält
eine kapillarförmige
Pipette (patch-clamp-Pipette), an deren Spitze eine Zelle angesaugt
und gemessen werden kann. Die patch-clamp-Pipette enthält eine
Messelektrode zur Ableitung eines elektrophysiologischen Potentials
von der Zelle bzw. zur Messung transmembranaler Ionenströme.
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Die
Transporteigenschaften der Ionenkanäle sind in der Grundlagenforschung
zur Charakterisierung von zellbiologischen Vorgängen und insbesondere in der
Pharmakologie für
die Charakterisierung von Wirkstoffen von Interesse. So stellen
die Ionenkanäle
wichtige Targets für
Arzneimittel dar. Eine Vielzahl von Arzneimitteln wirken selektiv
an bestimmten Ionenka nälen,
so dass mit der patch-clamp-Technik ein Werkzeug für pharmakologische
Untersuchungen zur Verfügung
steht.
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In
der Praxis ist es bisher üblich, patch-clamp-Verfahren
manuell durchzuführen,
wobei ein Experimentator einen Mikromanipulator bedient, um eine
Zelle mit der Spitze der patch-clamp-Pipette
aufzunehmen und an dieser Zelle die elektrophysiologische Messung
durchzuführen. Die
manuelle Durchführung
von patch-clamp-Verfahren ist nachteilig, da der Verfahrensablauf
aufwendig ist und hohe Anforderungen an die manuellen Fähigkeiten
des Experimentators stellt. Des Weiteren steigt die Zahl der zu
untersuchenden Wirkstoffe und der Ionenkanäle laufend, so dass Hochdurchsatzuntersuchungen
manuell nur beschränkt
oder nicht realisierbar sind. Es ist bspw. bekannt, dass das humane Genom
für etwa
400 Ionenkanäle
kodiert, deren Transporteigenschaften durch mehr als 100 Kanalproteine
beeinflusst werden. Wenn eine spezifische Wechselwirkung einer Gruppe
von Wirkstoffen mit bestimmten Kanalproteinen untersucht werden
soll, wächst
die Zahl der zu untersuchenden Kombinationen leicht über eine
Grenze, oberhalb derer manuelle Verfahren nicht mehr anwendbar sind.
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Ein
weiterer Nachteil der manuellen Verfahren zeigt sich bei speziellen
Aufgabenstellungen, bei denen die Wirkung verschiedener Arzneimittel
auf eine bestimmte Zelle untersucht werden soll. Vor der elektrophysiologischen
Messung muss die Zelle mit einer Lösung des jeweils untersuchten
Arzneimittels perfundiert werden. Dabei kann eine Perfusionsvorrichtung
verwendet werden, die bspw. in
DE 43 05 405 C1 beschrieben ist. Durch die
Perfusion mit verschiedenen Arzneimittellösungen werden die herkömmlichen
manuellen Verfahren jedoch noch umständlicher und aufwendiger.
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Es
sind Versuche bekannt, automatisierte patch-clamp-Verfahren zu entwickeln,
die sich jedoch in der Praxis wegen einer hohen Fehlerquote und
einer geringen Reproduzierbarkeit der elektrophysiologischen Messung
nur als beschränkt
brauchbar erwiesen haben. Eine Einschränkung besteht insbesondere
bei der speziellen Untersuchungsaufgabe, verschiedene Arzneimittel
an einer einzigen Zelle wirken zu lassen und die Wirkung zu untersuchen.
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Aus
US 2005/0241940 A1 ist
bekannt, die Spitze der patch-clamp-Pipette
mit einer aufgesetzten Zelle zur Perfusion jeweils von einer ersten
Arzneimittellösung
in eine andere Arzneimittellösung
zu überführen, wobei
während
der Überführung an
der Pipettenspitze lokal eine flüssige
Umgebung erhalten wird. Für
diesen Zweck wird ein spiral- oder rohrförmiger Tropfenhalter verwendet,
der mit einem parallel zur Längsrichtung
der Pipettenspitze verlaufenden Stab von einer zurückgezogenen
Position, in der die Pipettenspitze mit der Zelle frei liegt, in
eine vorgeschobene Position axial verschiebbar ist, in der die Pipettenspitze
vom rohrförmigen
Tropfenhalter umgeben ist. Die gewünschte flüssige Umgebung der Kapillarspitze
kann mit einem Flüssigkeitstropfen
gebildet werden, der durch Kapillarkräfte im Tropfenhalter gefangen
ist.
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Ein
Nachteil des herkömmlichen
Tropfenhalters gemäß
US 2005/0241940 A1 besteht
in der koaxialen Relativbewegung von Pipettenspitze und Tropfenhalter,
die in allen Relativpositionen einen geringen Abstand (Kapillarspalt)
aufweisen. Zur Vermeidung von Schäden an der Pipette oder der
Zelle ist daher ein komplexer Präzisionsantrieb
erforderlich. Ein weiterer Nachteil besteht in der Behinderung der Perfusion
der Zelle in der veränderten
Arzneimittellösung,
die zunächst
durch den Tropfenhalter allseitig von der Zelle abgeschirmt wird.
Damit ergibt sich für die
Perfusion ein relativ hoher Zeitaufwand, der nachteilig für die Reproduzierbarkeit
und Vergleichbarkeit einer Vielzahl von patch-clamp-Messungen an
einer Zelle ist. Nachteilig kann auch sein, wenn die Stabilität des Tropfens
nicht ausreichend ist, so dass sich durch eine schnelle Bewegung
der patch-clamp-Pipette der Tropfen von der Spitze lösen kann
und die Zelle durch Luftkontakt geschädigt wird. Schließlich sind
patch-clamp-Pipetten, die für
die in
US 2005/0241940
A1 beschriebene Technik geeignet sind, wegen der Anbringung
des Tropfenhalters schwer automatisiert herstellbar und montierbar.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte
Flüssigkeitshaltereinrichtung
bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher patch-clamp-Vorrichtungen
und insbesondere von herkömmlichen
Tropfenhaltern überwunden
werden. Der Erfindung liegt des Weiteren die Aufgabe zugrunde, ein
verbessertes Messgerät,
insbesondere für patch-clamp-Untersuchungen bereitzustellen. Schließlich liegt
der Erfindung auch die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren
zur elektrophysiologischen Untersuchung biologischer Zellen bereitzustellen,
mit dem die Nachteile der herkömmlichen patch-clamp-Verfahren
vermindert oder überwunden werden.
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Diese
Aufgaben werden durch eine Flüssigkeitshaltereinrichtung,
ein Messgerät
und ein Untersuchungsverfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte
Ausführungsformen
und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Gemäß einem
ersten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen
Lehre, eine gattungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung,
die zur Bildung einer flüssigen
Umgebung an einer Kapillarspitze einer patch-clamp-Pipette eingerichtet
ist, mit einem Halteelement zur Aufnahme eines Flüssigkeitstropfens
auszustatten, das bei Verwendung zur Flüssigkeitshalterung mit einer patch-clamp-Pipette
von der Kapillare trennbar angeordnet ist. Der mindestens eine Stab
zur Halterung des Halteelements ist so gebildet, dass das Halteelement
insbesondere von der Kapillarspitze trennbar ist.
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Es
ist insbesondere vorgesehen, dass das Halteelement mit dem Stab
an oder neben der Kapillarspitze positionierbar (Konditionierungsposition) und
von der Kapillare so weit trennbar ist (Freigabeposition), dass
die Kapillarspitze frei steht und ein Abstand zwischen dem Halteelement
und der Kapillarspitze größer ist
die Breite eines Kapillarspaltes. Im Gegensatz zum herkömmlichen
Tropfenhalter ist der Halteelement-Kapillarspitze-Abstand, wenn das Halteelement
von der Kapillarspitze getrennt ist, d. h. in der Freigabeposition
insbesondere größer als
in der Konditionierungsposition. Vorteilhafterweise können durch
die Vergrößerung des
Halteelement-Kapillarspitze-Abstandes
in der Freigabeposition eine Reihe von Vorteilen sowohl in Bezug
auf die Anforderungen and die Genauigkeit der Bewegung des Halteelements
als auch in Bezug auf die bestimmungsgemäße Verwendung der patch-clamp-Pipette
erzielt werden.
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Gemäß einer
ersten Ausführungsform
der Erfindung ist der Stab, an dem das Halteelement befestigt ist,
eingerichtet, verschwenkbar an einer Kapillarhalterung der patch-clamp-Pipette fixiert zu
werden. Der Stab weist vorzugsweise an einem zum Halteelement entgegengesetzten
Ende ein Schwenkgelenk auf. Das Halteelement hat auf zumindest einer Seite
eine freie Oberfläche,
die an die Kapillarspitze seitlich, d. h. radial in Bezug auf eine
Längsrichtung der
Kapillare angenähert
werden kann. Der Erfinder hat festgestellt, dass es zur zuverlässigen Erhaltung einer
flüssigen
Umgebung an der Spitze der Kapillare ausreichend ist, wenn der Tropfen
mit dem Halteelement gehalten wird, das allgemein ein gekrümmtes Bauteil
mit einer seitlichen Öffnung
oder ein ebenes Bauteil umfasst. Gleichzeitig ermöglicht die
seitlich freiliegende Oberfläche,
insbesondere die Öffnung, die
an einer Seite des Halteelements vorgesehen ist, einen vereinfachten
Bewegungsablauf des Stabs mit dem Halteelement.
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Gemäß der ersten
Ausführungsform
ist der Stab, wenn die erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung
an einer patch-clamp-Pipette
angebracht ist, relativ zur Längsrichtung
der Kapillare der patch-clamp-Pipette verschwenkbar. Das Halteelement
kann durch das Verschwenken des Stabes von einem angelegten Zustand
(Konditionierungsposition), in dem das Halteelement von der Kapillarspitze durch
einen Kapillarspalt getrennt ist oder an der Kapillarspitze anliegt,
durch eine radiale Bewegung in einen abstehenden Zustand verschwenkt
werden (Freigabeposition), in dem das Halteelement die Kapillarspitze,
z. B. für
weitere Beobachtungen, Messungen oder Zellmanipulationen freigibt.
Vorteilhafterweise wird die axiale Bewegung des herkömmlichen
Tropfenhalters durch eine radiale Bewegung des erfindungsgemäßen Halteelements
ersetzt.
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Gemäß einer
zweiten Ausführungsform
der Erfindung ist das Halteelement zur Halterung des Flüssigkeitstropfen
für die
Bildung der flüssigen
Umgebung an der Kapillarspitze unter der Wirkung der Gravitationskraft
eingerichtet, wobei das Halteelement am Stab lösbar befestigt ist. Vorteilhafterweise bildet
das Halteelement eine Auflage, auf der eine Flüssigkeitsmenge getragen wird.
In diesem Fall können
im Unterschied zum herkömmlichen
Tropfenhalter größere Flüssigkeitsmengen
zur Konditionierung der Kapillarspitze mit verbesserter Stabilität und Zuverlässigkeit
bereitgestellt werden.
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Sowohl
bei der ersten als auch bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung kann
das Halteelement eine einseitig offene, ebene oder gekrümmte Form
aufweisen. Dabei ergibt sich als weiterer wichtiger Vorteil eine
verbesserte Perfusion bei der Überführung einer
flüssig
umhüllten
Zelle an der Spitze der Kapillare in ein verändertes Umgebungsmedium. Die
Zelle wird nur teilweise durch das Halteelement von dem neuen Umgebungsmedium
abgeschirmt, so dass sich der Tropfen am Tropfenhalter schnell durch eine
Flüssigkeitsströmung und
Diffusion verdünnt.
Im Ergebnis kann die Wirkung der Substanz im neuen Umgebungsmedium,
z. B. einer neuen Arzneimittellösung
nach einer Zeit untersucht werden, die im Vergleich zu der für die Perfusion
mit einem herkömmlichen
Tropfenhalter erforderlichen Zeit verkürzt ist.
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Ein
weiterer Vorteil der Flüssigkeitshaltereinrichtung
der ersten Ausführungsform
der Erfindung besteht darin, dass an die Form des Halteelements keine
besonderen Anforderungen gestellt werden müssen. Allgemein kann das Halteelement
ein ebenes oder gekrümmtes
Bauteil sein, das im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung
zu der Kapillarspitze benachbart angeordnet ist oder diese azimutal
teilweise umgibt. Das Halteelement ist flächenförmig, z. B. in Form einer Glas-
oder Kunststofflamelle gebildet.
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Das
Halteelement ist zur Aufnahme (Halterung) eines Flüssigkeitstropfens
eingerichtet. Der Flüssigkeitstropfen
wird bei der ersten Ausführungsform
der Erfindung stabil unter der Wirkung von Kapillarkräften eingefangen.
Es kann vorgesehen sein, dass der Tropfen durch die im angelegten
Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung
von der Spitze der Kapillare und dem Halteelement gemeinsam ausgeübten Kapillarkräfte gehalten
wird. Bevorzugt ist jedoch eine Ausführungsform der Erfindung, bei
der das Halteelement dazu eingerichtet ist, den Flüssigkeitstropfen
allein ohne weitere feste Grenzflächen unter der Wirkung von
Kapillarkräften
zu halten. In diesem Fall kann auch im abstehenden Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung
ein Flüssigkeitstropfen sicher
am Halteelement gehalten und damit vermieden werden, dass sich am
Halteelement Gasblasen festsetzen.
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Wenn
gemäß einer
bevorzugten Variante der ersten Ausführungsform der Erfindung das
Halteelement ein flächenförmiges Bauteil
umfasst, kann vorteilhafterweise eine relativ große Flüssigkeitsmenge in
der Umgebung der Spitze der Kapillare erhalten werden. Damit wird
die Gefahr eines unbeabsichtigten Austrocknens der Zelle bei der Übertragung
in ein verändertes
Umgebungsmedium vermindert. Besonders bevorzugt ist eine Variante,
bei der das Halteelement durch einen Abschnitt einer in axialer
Richtung angeschnittenen Hohlleitung gebildet wird. Die Wand der
Hohlleitung bildet das einseitig offene Halteelement. Wenn das Halteelement
die Form eines in axialer Richtung angeschnittenen Hohlzylinders
aufweist, können
sich Vorteile für
die Bildung einer gleichmäßigen Flüssigkeitsumgebung
an der Kapillarspitze ergeben. Der Hohlzylinder kann z. B. eine kreisförmige oder
ellipsenförmige
Grundfläche
aufweisen. In diesem Fall ist der Tropfenhalter dazu eingerichtet,
im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung
die Pipettenspitze so zu umgeben, dass diese im Mittelpunkt oder
Brennpunkt der kreis- oder ellipsenförmigen Grundfläche angeordnet
ist.
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Alternativ
kann als Halteelement eine ebene oder eine profilierte Platte vorgesehen
sein. Die profilierte Platte hat z. B. eine Form mit mehreren ebenen
Teilflächen,
die zu der Spitze der Kapillare hin abgewinkelt sind, oder einem
Profil, das an die Form der Kapillarspitze der Kapillare angepasst
ist.
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Wenn
bei der ersten oder zweiten Ausführungsform
der Erfindung das Halteelement mit einer Elektrode ausgestattet
ist, kann der Aufbau der Flüssigkeitshaltereinrichtung
vereinfacht werden. Die Elektrode kann für patch-clamp-Messungen als
Referenzmesselektrode verwendet werden. Die Elektrode am Halteelement
oder eine mit der Elektrode verbundene Leitung ist vorzugsweise
mit dem Stab des Tropfenhalters verbunden. Besonders bevorzugt bilden
der Stab mit dem Halteelement und der Elektrode (ggf. mit der Leitung)
ein integriertes Bauteil.
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Vorteilhafterweise
kann die erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung
leicht bei automatisierten Verfahren verwendet werden. Bei der ersten Ausführungsform
der Erfindung können
Stellbewegungen zur Überführung des
Tropfenhalters vom angelegten zum abstehenden Zustand problemlos
mit einer Stelleinrichtung ausgeführt werden, die an einer patch-clamp-Vorrichtung vorgesehen
ist. Bevorzugt ist jedoch eine Variante der ersten Ausführungsform
der Erfindung, bei der die Flüssigkeitshaltereinrichtung
mit einer eigenständigen
Antriebseinrichtung ausgestattet ist. Die Antriebseinrichtung ist
z. B. zum piezoelektrischen Verschwenken des Stabes der Flüssigkeitshaltereinrichtung
eingerichtet und zur Erzielung eines großen Stellweges vorzugsweise
am Schwenkgelenk vorgesehen.
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Ein
wichtiger Vorteil der Erfindung ist die Kompatibilität der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung
mit verschiedenen Kapillar- und insbesondere Pipettenformen. Vorzugsweise
ist das Schwenkgelenk der Flüssigkeitshaltereinrichtung
zur lösbaren
Verbindung mit der Kapillare eingerich tet. Entsprechend können vorhandene
patch-clamp-Pipetten mit der Flüssigkeitshaltereinrichtung
nachgerüstet
werden. Besonders bevorzugt ist ein Anklemmen der Flüssigkeitshaltereinrichtung über eine
an dem Schwenkgelenk vorgesehene Clip-Verbindung (Klammer-Verbindung) an der
patch-clamp-Pipette, insbesondere einer Kapillarhalterung der patch-clamp-Pipette
vorgesehen. Es ist jedoch nicht zwingend erforderlich, dass die
Flüssigkeitshaltereinrichtung
zur lösbaren
Verbindung mit der Kapillare, z. B. der patch-clamp-Pipette eingerichtet
ist. Alternativ kann eine feste Verbindung vorgesehen sein.
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Bei
der zweiten Ausführungsform
der Erfindung ist der Stab der Flüssigkeitshaltereinrichtung vorzugsweise
zur starren Befestigung an der Kapillare oder der Kapillarhalterung
der patch-clamp-Pipette eingerichtet, so dass sich vorteilhafterweise
der Aufbau der Flüssigkeitshaltereinrichtung
und der patch-clamp-Pipette vereinfacht. Gemäß einer bevorzugten Variante
hat das Halteelement die Form eines Napfes, in dessen Wand eine
Einstecköffnung zur
Aufnahme eines Endes des Stabes vorgesehen ist. Wenn die Einstecköffnung und
das Innere des Napfes gemäß einer
weiteren bevorzugten Variante der zweiten Ausführungsform der Erfindung über eine
Kontaktrinne verbunden sind, ergeben sich Vorteile für die Messung
mit einer durch den Stab gebildeten oder mit dem Stab verbundenen
Referenzelektrode.
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Das
Halteelement der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung
ist entsprechend den bevorzugten Anwendungen der Erfindung bei zellbiologischen
Untersuchungen zur Aufnahme einer geringen Flüssigkeitsmenge (Volumen insbesondere 0.05–100 μl), z. B.
in Form eines Tropfens, einer Flüssigkeit
eingerichtet, die Wasser, eine wässrige
Salzlösung,
wie z. B. eine physiologische Lösung,
eine wässrige
Lösung
oder Suspension mit biologischen Makromolekülen oder mit Zellen oder ei ne
wässrig-ölige Emulsion
umfasst. Die Fangwirkung des Halteelements kann bei beiden Ausführungsformen der
Erfindung vorteilhafterweise noch verbessert werden, wenn das Halteelement
eine hydrophile oder eine oleophile Innenbeschichtung trägt. Die
Innenbeschichtung wird durch hydrophile oder oleophile Substanzen
gebildet, wie sie z. B. von funktionalisierten Substraten in der
Zellbiologie bekannt sind.
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Ein
elektrophysiologisches Messgerät,
das eine Kapillare mit einer Kapillarspitze zur Aufnahme einer biologischen
Zelle und eine mit der Kapillare verbundene, erfindungsgemäße Flüssigkeitshaltereinrichtung
aufweist, stellt einen unabhängigen
Gegenstand der Erfindung dar. Die Kapillare ist vorzugsweise Teil
einer patch-clamp-Pipette oder einer Mikroelektrodeneinrichtung.
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Die
patch-clamp-Pipette weist vorzugsweise eine Kapillarhalterung auf,
an der die Kapillare lösbar fixierbar
ist. Vorteilhafterweise kann die Kapillarhalterung als Greifer für weitere
Manipulationen, z. B. bei der Herstellung der Kapillare verwendet
werden. Besonders bevorzugt ist die Kapillare über eine konische Steckverbindung
mit der Kapillarhalterung verbunden.
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Wenn
das Messgerät
mit einer Antriebseinrichtung ausgestattet ist, die zur Bewegung
und Positionierung der patch-clamp-Pipette und der Flüssigkeitshaltereinrichtung
eingerichtet ist, können
Vorteile für
einen automatisierten Betrieb des Messgerätes erzielt werden. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Variante der Erfindung kann das Messgerät mit einer Pipettenzieheinrichtung
ausgestattet sein, die zur Herstellung der Kapillare eingerichtet
ist. Vorteilhafterweise kann damit die Kapillare unmittelbar vor
einer elektrophysiologischen Mes sung hergestellt und frei von Beschädigungen
oder Verschmutzungen verwendet werden.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die oben genannte Aufgabe
durch die allgemeine technische Lehre gelöst, ein Verfahren zur elektrophysiologischen
Untersuchung einer biologischen Zelle unter Verwendung der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung
auszuführen. Vorteilhafterweise
können
patch-clamp-Messungen während
der Überführung einer
Zelle in ein verändertes
Umgebungsmedium und während
einer Perfusion mit diesem durchgeführt werden.
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Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter
Bezug auf die beigefügten
Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
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1 bis 4:
Varianten der ersten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung;
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5 und 6:
eine schematische Illustration der erfindungsgemäßen Überführung einer Zelle in ein verändertes
Umgebungsmedium unter Verwendung der Flüssigkeitshaltereinrichtung
gemäß der ersten
Ausführungsform
der Erfindung;
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7 eine
weitere Variante der ersten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung;
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8 eine
bevorzugte Variante des bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung verwendeten
Halteelements;
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9 Varianten
der zweiten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung;
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10 eine
schematische Illustration der erfindungsgemäßen Überführung einer Zelle in ein verändertes
Umgebungsmedium unter Verwendung der Flüssigkeitshaltereinrichtung
gemäß der zweiten Ausführungsform
der Erfindung;
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11 Illustrationen
von Zusatzteilen eines Messgerätes
für elektrophysiologische
Untersuchungen; und
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12 eine
schematische Illustration einer Kapillarhalterung einer bevorzugt
verwendeten patch-clamp-Pipette.
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Die
Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf eine
bevorzugte Ausführungsform
der Flüssigkeitshaltereinrichtung
beschrieben, die an einer Pipettenspitze einer patch-clamp-Vorrichtung
angebracht ist. Einzelheiten der patch-clamp-Technik werden hier
nicht beschrieben, da sie aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind
(siehe z. B.:
O. P. Hamill et al. in "Pflugers Arch." Bd. 391(2), 1981, S. 85–100).
Die Flüssigkeitshaltereinrichtung
ist nicht nur mit einer patch-clamp-Pipette verwendbar, sondern
auch mit anderen Messgeräten für elektrophysiologische
Untersuchungen kombinierbar, wie z. B. mit Mikroelektrodeneinrichtungen, ionenselektiven
Mikroelektroden etc..
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1A zeigt eine Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 mit
dem Halteelement 11.1, dem Stab 12.1 und dem Schwenkgelenk 13 gemäß einer
Variante der ersten Ausführungsform
der Erfindung. Die Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 ist
in Verbindung mit einer patch-clamp-Pipette 20 im abstehenden
Zustand des Hal teelements 11.1 gezeigt. Das Halteelements 11.1 ist
in diesem Zustand von der Kapillarspitze der patch-clamp-Pipette 20 getrennt. 1B zeigt eine vergrößerte Schnittdarstellung des
Halteelements 11.1, das zur Aufnahme eines Flüssigkeitstropfens eingerichtet
ist (siehe 4). Die patch-clamp-Pipette 20 ist
in an sich bekannter Weise mit einer Kapillare 21 aufgebaut,
die insbesondere eine freie Kapillarspitze 22 zum Ansaugen
einer biologischen Zelle 2 und eine integrierte Messelektrode
(nicht dargestellt) aufweist und an einer Kapillarhalterung 23 befestigt ist.
Die Kapillarspitze 22 hat typischerweise einen Spitzendurchmesser
im μm-Bereich.
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Der
Verbund aus der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 und
der patch-clamp-Pipette 20 bildet ein erfindungsgemäßes Messgerät 30 (teilweise
dargestellt), das des weiteren Leitungsverbindungen zum Anschluss
an eine Steuereinrichtung aufweist und ggf. mit einer Antriebsvorrichtung
ausgestattet ist (siehe 7).
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Das
Halteelement 11.1 hat die Form eines axial angeschnittenen
Hohlzylinders mit einer elliptischen Grundfläche. Mit dem Halteelement 11.1 wird eine
halbrohrförmige
Kammer (sog. Halbrohrkammer) gebildet, die zur Aufnahme der Kapillare 21 der patch-clamp-Pipette 20 und
eines Flüssigkeitstropfens
eingerichtet ist. Auf der Innenseite des Halteelements 11.1 ist
die Elektrode 14 angeordnet. Auf der Außenseite ist das Halteelement 11.1 mit
dem Stab 12.1 verbunden. Die Elektrode 14 erstreckt
sich entlang der Länge
des Stabes 12.1.
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Das
Halteelement 11.1 besteht aus Glas oder Kunststoff (z.
B. PVC) mit einer Wanddicke von rd. 200 μm bis 1 mm und einer Länge in Längsrichtung
des Stabes 12.1 von rd. 3 mm bis 10 mm. Die seitliche Öffnung des
Halteelements 11.1 hat eine Breite von rd. 1.5 mm bis 3
mm.
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Die
Elektrode 14 wird durch eine Metallschicht oder einen Metalldraht
auf der Seite (insbesondere Innenseite) des Halteelements 11.1 gebildet,
die zur Kapillare 21 weist. Die Elektrode 14 besteht
z. B. aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) oder aus einem anderen
elektrisch leitfähigen
Material, z. B. Kohlenstoff oder Platin. Des Weiteren kann die Innenseite
des Halteelements 11.1 hydrophil beschichtet sein.
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Wenn
eine Berührung
der zu untersuchenden Zelle mit dem leitfähigen Material der Elektrode vermieden
werden soll (falls die Zelle z. B. durch Ag/AgCl beeinflusst werden
könnte),
ist eine der folgenden Maßnahmen
vorgesehen. Erstens kann die Elektrode aus Agar-Agar und einem Ag/AgCl-Elektrodenteil
bestehen, wobei das Agar-Agar über
eine Salzbrücke
mit dem Elektrodenteil verbunden ist. Zweitens kann die Elektrode
teilweise beschichtet oder an der Außenseite des Halteelements 11.1 angeordnet
sein, so dass ein Diffusionsweg z. B. von Ag/AgCl zur Zelle gebildet
wird.
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Der
Stab 12.1 dient der Halterung des Halteelements 11.1.
Der Stab 12.1 ist ein gerades, langgestrecktes Bauteil
mit einer Längsrichtung,
von der das Halteelement 11.1 radial absteht. Das Halteelement 11.1 öffnet sich
in radialer Richtung relativ zur Längsrichtung des Stabes 12.1.
An seinem ersten (proximalen) Ende ist der Stab 12.1 mit
dem Schwenkgelenk 13 verbunden, während das Halteelement 11.1 an
dem zweiten, freien (distalen) Ende des Stabes 12.1 befestigt
ist. Der Stab 12.1 besteht aus einem inerten, elektrisch
isolierenden Material, wie z. B. Kunststoff (z. B. PE) oder einer
Keramik. Die Elektrode 14 oder eine an diese angeschlossene
Leitungsverbindung ist in den Stab 12.1 integriert oder auf
dessen Oberfläche
befestigt.
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Gemäß einer
alternativen Variante sind die Elektrode 14 und der Stab 12.1 nicht
zwei verschiedene Komponenten, sondern der Stab bildet die Elektrode.
Wenn der Stab 12.1 und ggf. das Halteelement 11.1 dazu
eingerichtet sind, die Elektrode zu bilden, bestehen diese zumindest
teilweise aus einem leitfähigen
Material, wie z. B. aus Ag/AgCl. Bei Verwendung von Agar-Agar umfasst
die Elektrode 14 (oder entsprechend der Stab 12.1)
vorzugsweise ein Glasröhrchen,
in dem das geleeartige Agar-Agar angeordnet ist, das dann in eine
Salzbrücke übergeht.
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Das
Schwenkgelenk 13 umfasst z. B. ein Scharnier oder ein Dünnschichtgelenk,
das einerseits mit dem Stab 12.1 und andererseits mit der patch-clamp-Pipette 20 oder
einer entsprechenden Klemmeinrichtung verbunden ist.
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1A illustriert schematisch eine piezoelektrische
Antriebseinrichtung 15, die zum Verschwenken des Stabes 12.1 um
eine Achse senkrecht zur Längsrichtung
der patch-clamp-Pipette 20 eingerichtet
ist. Die Antriebseinrichtung 15 ist z. B. zwischen einer
Oberfläche
der patch-clamp-Pipette 20 und dem Stab 12.1 angeordnet.
Bei Beaufschlagung der Antriebseinrichtung 15 mit einer
Stellspannung dehnt sich ein piezoelektrisches Element der Antriebseinrichtung 15 aus,
so dass der Stab 12.1 verschwenkt werden kann.
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1C zeigt eine weitere Variante eines Halteelements 11.1 mit
einer gebogenen Form, wobei das Halteelement 11.1 zur lösbaren Verbindung am
Stab 12 der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 (siehe 1A) vorgesehen ist. Zu diesem Zweck ist
das Halteelement 11.1 z. B. im Spritzgussverfahren mit einer
Einstecköffnung 11.11 und
einer halbrohrförmigen
Kammer zur Aufnahme der Kapillarspitze gebildet. Der Stab 12,
der gleichzeitig die Referenzelektrode bilden kann, wird in die Einstecköffnung 11.11 gesteckt.
Der elektrische Kontakt mit der Kammer, die im Zustand der Annäherung an
die Kapillarspitze mit Flüssigkeit
gefüllt
ist, wird durch eine Kontaktrinne 11.12 hergestellt.
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Die
in 10 gezeigte Variante des Halteelements 11.1 kann
so abgewandelt sein, dass die Kammer rohrförmig gebildet ist und die Kapillarspitze (nicht
dargestellt) vollständig
umgeben kann. Das Halteelement 11.1 hat die Form eines
Napfes mit offenem Boden. Wegen der lösbaren Verbindung mit dem Stab 12 ist
das Halteelement 11.1 von der Kapillarspitze trennbar.
Das Halteelement 11.1 ist so dimensioniert, dass die Flüssigkeit
im Halteelement 11.1 durch die Wirkung von Kapillarkräften gehalten wird.
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Alternativ
zu dem gezeigten Halteelement 11.1 mit einer gebogenen
Form kann gemäß 2 am
distalen Ende des Stabes 12.1 ein Halteelement 11.1 in
Form einer ebenen Platte, z. B. aus Glas oder Kunststoff vorgesehen
sein. Das ebene Halteelement 11.1 trägt auf der zur Kapillare weisenden
Seite die Elektrode 14. Bei geeigneter Gestaltung des Stabs 12.1 kann
das Halteelement 11.1 mit dem Ende des Stabs 12.1 einstückig verbunden
sein.
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Gemäß einer
weiteren Alternative kann die ebene Platte des Halteelements 11.1 in
axialer Richtung der Kapillare 21 abgewinkelt sein (3).
Vorteilhafterweise ist in diesem Fall das Halteelement 11.1 an
die Form der Kapillarspitze 22 der Kapillare 21 angepasst.
Dadurch kann, wenn die Gefahr eines unbeabsichtigten Austrocknens
gering ist, der Flüssigkeitstropfen 1 am
Halteelement 11.1 kleiner als bei der Variante gemäß den 1 und 2 gebildet und
entsprechend das Totvolumen um die Zelle 2 verringert werden.
Alternativ zu der gezeigten Form der abgeknickten Platte kann eine
komplexere Form gemäß der Außenkontur
der Kapillarspitze 22 vorgesehen sein. 3 illustriert
des Weiteren, dass das Halteelement 11.1 und mit diesem
die Elektrode direkt an die Kapillare 21 anstoßen kann.
Alternativ ist es möglich,
dass der Stab 12.1 mit der Antriebseinrichtung 15 (1A) so eingestellt wird, dass die Elektrode
in unmittelbarer Nähe
der Kapillarspitze 22 angeordnet ist.
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Die 4A und 4B zeigen
die erste Ausführungsform
gemäß 1 entsprechend
im angelegten Zustand der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 mit einem
Flüssigkeitstropfen 1 und
einer Zelle 2. Zwischen der Kapillarspitze 22 und
der Innenseite des Halteelements 11.1 ist nur noch ein
Kapillarspalt gegeben, oder die Innenseite des Halteelements 11.1 berührt die
Kapillarspitze 22. Durch die Kapillarkräfte wird der Flüssigkeitstropfen 1 an
der Kapillare 21 gehalten, auch wenn die patch-clamp-Pipette 20 aus
einem flüssigen
Umgebungsmedium zurückgezogen wird.
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In
den 5 und 6 ist der Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur elektrophysiologischen Untersuchung einer biologischen Zelle
unter Verwendung der ersten Ausführungsform
der Erfindung mit weiteren Einzelheiten schematisch illustriert.
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Zellen
einer Zellkultur 3 befinden sich auf dem Boden eines ersten
Kulturgefäßes 40,
das mit einem ersten Umgebungsmedium 4 gefüllt ist.
Das Umgebungsmedium 4 umfasst z. B. ein Kultivierungsmedium
der Zellkultur 3. In einem ersten Verfahrensschritt wird
eine Zelle 2 in an sich bekannter Weise aus der Zellkultur 3 entnommen.
Vorzugsweise erfolgt die Zellentnahme, während die Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 in
dem abstehenden Zustand ist und die Kapillare 21 der patch-clamp-Pipette 20 frei
an die Zellkultur 3 bewegt, manipuliert und dabei mit der
schematisch gezeigten Bildaufnahmeeinrichtung 60 beobachtet
werden kann. Die Bewegung der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 und
der patch-clamp-Pipette 20 erfolgt mit einer schematisch gezeigten
Antriebseinrichtung 50.
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Anschließend folgt
ein Verschwenken des Stabs 12.1 zur Überführung der Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 in
den angelegten Zustand. Diese Situation ist in 5 illustriert.
Das Halteelement 11.1 umgibt die Spitze 22 der
Kapillare mit der Zelle 2. In dieser Situation kann eine
erste patch-clamp-Messung
an der Zelle 2 durchgeführt
werden.
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Anschließend erfolgt
gemäß 6 die Überführung der
Zelle 2 in ein weiteres Kulturgefäß 41 mit einem veränderten
Umgebungsmedium 5. Hierzu wird die Relativposition zwischen
der patch-clamp-Pipette 20 und den Kulturgefäßen 40, 41 unter
Verwendung der schematisch illustrierten Antriebsvorrichtung 50 und
einer Steuereinrichtung (nicht gezeigt) verändert, in dem bspw. die patch-clamp-Pipette 20 von
dem ersten Kulturgefäß 40 zu
dem zweiten Kulturgefäß 41 bewegt
wird.
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Durch
die Wirkung der Kapillarkräfte
kommt es beim Anheben der patch-clamp-Pipette 20 aus dem
ersten Umgebungsmedium 4 zur Tropfenbildung am Halteelement 11.1.
Der Kontakt zwischen der Zelle 2 und der Elektrode 14 bleibt
erhalten, so dass die Messung nicht gestört wird, wenn die Zelle 2 aus
dem ersten Umgebungsmedium 4 herausbewegt wird.
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Beim
Eintauchen der patch-clamp-Pipette 20 in das zweite Umgebungsmedium 5 wird
der Tropfen 1 an der Spitze 22 der patch-clamp-Pipette 20 schnell durch
das zweite Umgebungsmedium 5 verdünnt. Vorteilhafterweise kann
während
der Verdünnung
die Messung von Zellpotentialen oder Ionenströmen durch die Zellmembran fortgesetzt
werden, um die Wirkung des zwei ten Umgebungsmediums 5 unmittelbar
zu erfassen. Die laufende Messung bei einem schnellen Austausch
der Umgebungsflüssigkeit
der Zelle 2 ist insbesondere bei der Messung von liganden-aktivierten
Ionenströmen
von Vorteil.
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Die
Schritte des Wechsels des Umgebungsmediums mit einer laufenden oder
einer wiederholten Messung des Zellpotentials gemäß den 5 und 6 können in
Abhängigkeit
von der konkreten Aufgabenstellung wiederholt werden. Die Zahl der
Wiederholungen ist vorteilhafterweise praktisch unbegrenzt, so dass
sich die Erfindung insbesondere für die Untersuchung einer Vielzahl
von Testmedien, insbesondere im Rahmen von Hochdurchsatzverfahren eignet.
Vorteilhafterweise kann auf die herkömmliche Applikation von Testmedien über Schläuche verzichtet
werden, wodurch nicht nur die Genauigkeit der Messung erhöht, sondern
auch die mögliche
Zahl der applizierbaren Testmedien und damit der Messdurchsatz vergrößert werden.
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7 zeigt
eine weitere Variante der ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 mit
den Komponenten 11.1, 12.1 und 13 an
einer patch-clamp-Pipette 20.
Das Halteelement 11.1 ist wie in 1A im
abstehenden Zustand gezeigt. Die Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 und
die patch-clamp-Pipette 20 sind mit der Antriebseinrichtung 50 verbunden,
die beispielsweise einen 3-Achsen-Manipulator umfasst. 7 zeigt
das Schwenkgelenk 13 beispielhaft am oberen Ende der Kapillarhalterung 23.
Alternativ kann das Schwenkgelenk 13 seitlich an der Kapillarhalterung 23 angeordnet
sein.
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Die
Kapillare 21 der patch-clamp-Pipette 20 ist an
der Kapillarhalterung 23 lösbar befestigt. Die Kapillarhalterung 23 weist
eine Saugeinrichtung 26 zur Erzeugung eines Unterdrucks
auf, unter dessen Wirkung die Zelle 2 auf der Kapillarspitze 22 gehalten werden
kann. Vorzugsweise steckt die Kapillare 21 wie dargestellt
in einer Dichtung 24, z. B. aus Gummi, auf der Innenseite
der Kapillarhalterung 23, wobei die Messelektrode 25,
z. B. ein Silberdraht durch die Kapillarhalterung 23 zu
weiteren Leitungsverbindungen (nicht dargestellt) verläuft. Vorteilhafterweise
bildet die Kapillarhalterung 23 mit der Dichtung 24 einen Greifer,
der beim Ziehen der Kapillare 21 verwendet werden kann
(siehe 11, 12). Alternativ
kann eine konische Steckverbindung vorgesehen sein, mit der die
Kapillare 21 einfacher ausgewechselt werden kann (siehe 12).
In diesem Fall werden Kapillaren 21 verwendet, die an ihrem
rückseitigen
Ende eine konische Form aufweisen.
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Bei
der zweiten Ausführungsform
der Erfindung ist das Halteelement dazu eingerichtet, die Flüssigkeit
zur Bildung der flüssigen
Umgebung an der Kapillarspitze unter der Wirkung der Gravitationskraft
in einem Gefäß, z. B.
einem Napf bereitzustellen, in das die Kapillarspitze im zusammengesetzten Zustand
der Flüssigkeitshaltereinrichtung
hinein ragt. In diesem Fall kann das Halteelement nicht durch die oben
beschriebene Schwenkbewegung von der Kapillarspitze getrennt werden,
da sonst der Gefäßrand die
Kapillarspitze beschädigen
würde.
Entsprechend ist bei der zweiten Ausführungsform der Erfindung vorgesehen,
dass das Halteelement lösbar
am Stab der Flüssigkeitshaltereinrichtung
befestigt ist. Eine bevorzugte Variante des für die zweite Ausführungsform
der Erfindung verwendeten Halteelements 11.2 ist in den 8A und 8B illustriert.
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Das
Halteelement 11.2 gemäß 8A hat die Form eines Napfes, in dessen
Wand eine Einstecköffnung 11.21 vorgesehen
ist. Der Napf hat des weiteren einen geschlossenen Boden 11.23 und
eine Kontaktrinne oder einen Kontaktspalt 11.22, durch die
eine in der Einstecköffnung 11.21 angeordnete Elektrode über die
im Napf und der Kontaktrinne 11.22 befindliche Flüssigkeit
mit dem Inneren des Napfes in elektrischen Kontakt gelangt.
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Das
Halteelement 11.2 besteht z. B. aus einem Kunststoff, der
im Spritzgussverfahren geformt ist. Es kann beispielsweise ein Elastomer-Kunststoff vorgesehen
sein. In diesem Fall kann der Stab (in 8A nicht
dargestellt) in der Einstecköffnung 11.21 unter
der Wirkung einer elastischen Spannung festsitzen. Alternativ oder
zusätzlich
kann an der Einstecköffnung 11.21 eine
Schnapp- oder Rastverbindung (nicht dargestellt) vorgesehen sein.
Das Halteelement 11.2 gemäß 8A und 8B hat beispielsweise die folgenden Dimensionen:
Außendurchmesser:
3 mm bis 10 mm, Napfdurchmesser: 0,3 mm bis 3 mm, und axiale Höhe 2 mm
bis 10 mm.
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8B illustriert die Kombination des Halteelement 11.2 mit
einem hohlen Stab 12.2 (teilweise gezeigt), der vorteilhafterweise
zum Flüssigkeitstransport
in den oder aus dem Napf verwendet werden kann. Der Stab 12.2 hat
die Form eines Rohres, das an seinem freien Ende am Halteelement 11.2 offen
und am entgegengesetzten Ende mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden
ist. Durch den Stab 12.2 kann über den Kontaktspalt Lösung in
den Napf zugeführt
oder abgesaugt werden kann.
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Die
Bereitstellung des Kontaktspaltes bzw. der Kontaktrinne hat insbesondere
den Vorteil, dass bei der rohrförmigen
Ausführung
des Stabes 12.2 durch eine Druckänderung im Stab 12.2 die
Flüssigkeitsmenge
im Halteelement verändert
werden kann.
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Gemäß einer
Abwandlung kann das Halteelement als Napf mit einem offenen Boden
gebildet sein, so dass sich die oben unter Bezug auf 10 genannte
Variante der ersten Ausführungsform
der Erfindung ergibt.
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Gemäß einer
weiteren Abwandlung kann das Halteelement 11.2 zwei Einstecköffnungen
zur Aufnahme von zwei Stäben
der Flüssigkeitshaltereinrichtung
aufweisen. Verschiedene Varianten des Halteelements 11.2 mit
zwei Einstecköffnungen
sind in den 9 und 10 illustriert.
Die Stäbe
sind in die Einstecköffnungen
formschlüssig
oder kraftschlüssig einsteckbar.
Die Außerdurchmesser
der Stäbe
und die Innendurchmesser der Einstecköffnungen sind entsprechend
angepasst. In 9 sind zur Illustration die
Innendurchmesser der Einstecköffnungen
vergrößert gezeigt.
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Die
in 9A gezeigte Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 umfasst
das Halteelement 11.2 und die Stäbe 12.2, 12.3.
Die patch-clamp-Pipette 20 umfasst die Kapillare 21 und
die Kapillarhalterung 23. Im Innern der Kapillare 21 verläuft die
Messelektrode 25, die mit einem Messkopf (in 9 nicht
gezeigt) verbunden ist. Die Stäbe 12.2, 12.3 der
Flüssigkeitshaltereinrichtung 10 sind
mit der Kapillarhalterung 23 fest verbunden (z. B. geklebt
oder verschraubt), so dass sie auf entgegengesetzten Seiten der
Kapillare 21 symmetrisch angeordnet sind. Die Stäbe 12.2, 12.3 erstrecken
sich parallel zur axialen Ausdehnung der Kapillare 21.
Die Länge
der Stäbe 12.2, 12.3 ist so
gewählt,
dass die Kapillarspitze 22 in den Napf des aufgesteckten
Halteelements 11.2 hineinragt, ohne den Napfboden zu berühren. Einer
der Stäbe 12.2, 12.3 kann
als Elektrode verwendet werden. Entsprechend ist an einer der Einstecköffnungen eine
Kontaktrinne (Kontaktspalt) vorgesehen. Die Stäbe 12.2, 12.3,
die rohrförmig
sein können,
bilden mit dem Halteelement 11.2 eine lösbare Steckverbindung.
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93 zeigt eine Abwandlung, bei der einer der
Stäbe (12.3)
am Ende eine Krümmung
aufweist, die der Fixierung des Halteelements 11.2 dient.
Der Stab 12.3 kann aus einem fe dernden Material gebildet
sein und in eine schräge
Rille 11.24 an der Seite des Halteelements 11.2 greifen.
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Die 9C und 9D zeigen
weitere Abwandlungen, bei denen die freien Enden der Stäbe 12.2, 12.3 Spitzen
aufweisen, die in konisch geformte Einstecköffnungen des Halteelements 11.2 eingreifen. Gemäß 9D kann eine seitliche Verschraubung 12.4 des
Stabs 12.3 mit der Kapillarhalterung 23 vorgesehen
sein. Alternativ kann die Verschraubung 12.4 durch eine
ringförmige
Halterung ersetzt sein. In diesem Fall ergibt sich der Vorteil,
dass die Stäbe leicht
an verschiedene Typen von Kapillarhalterungen angesteckt werden
können.
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Bezug
nehmend auf die 10A bis 10D wird der Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur elektrophysiologischen Untersuchung einer biologischen Zelle
unter Verwendung der zweiten Ausführungsform der Erfindung mit
weiteren Einzelheiten beschrieben.
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Zunächst erfolgt
die Vorbereitung der patch-clamp-Pipette 20. Hierbei ist
vorzugsweise die Herstellung der Kapillare 21 unmittelbar
vor der elektrophysiologischen Untersuchung mit einer Pipettenzieheinrichtung
vorgesehen, die unten unter Bezug auf 11 beschrieben
wird. Die Kapillare 21 wird von der Kapillarhalterung 23 aufgenommen.
Anschließend
wird die patch-clamp-Pipette 20 mit der Antriebsvorrichtung 50 zu
einem vorbereiteten Halteelement 11.2 gefahren, um dieses
durch Einstecken des Stabes 12.2 in die Einstecköffnung 11.21 aufzunehmen.
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Anschließend wird
das Messgerät 30 mit
der Antriebsvorrichtung 50 zu einem Suspensionsgefäß 42 bewegt.
Im Suspensionsgefäß 42 befinden
sich suspendierte Zellen 2. Die patch-clamp-Pipette 20 wird mit der
Tropfenhalteeinrichtung 10 in die Zellsuspension eingeführt. Dabei
ist die patch-clamp-Pipette 20 so
ausgerichtet, dass die Kapillare 21 vertikal (senkrecht
zum Boden des Suspensionsgefäßes 42)
verläuft.
Beim Eintauchen der Kapillare 21 mit dem Halteelement 11.2 in
die Zellsuspension wird diese bewegt und durchmischt. Zu diesem
Zweck wird das Messgerät 30 mit
der Antriebsvorrichtung 50 vorzugsweise auf- und ab bewegt
(10B).
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Im
Ergebnis befinden sich im Napf des Haltelements 11.2 suspendierte
Zellen. Anschließend wird
das Messgerät 30 angehalten.
Mit einer Saugeinrichtung (siehe 7, in 9 nicht
dargestellt) wird in der Pipettenhalterung 23 und der Kapillare 21 ein
Unterdruck erzeugt, unter dessen Wirkung nach kurzer Zeit eine Zelle
an der Kapillarspitze 22 angesaugt wird. Es wird die für die patch-clamp-Messung erforderliche
so genannte „Gigaseal"-Verbindung hergestellt
und die an sich bekannte patch-clamp-Messung gestartet.
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Nach
einer vorbestimmten Messzeit erfolgt ein Flüssigkeitswechsel in der Umgebung
der vermessenen Zelle 2. Diese Messzeit wird beispielsweise
in Abhängigkeit
von dem Wert des gemessenen Widerstands über der Zelle (so genannter „Seal-Widerstand") ermittelt. Zum
Flüssigkeitswechsel
wird das Messgerät 30 aus
dem ersten Suspensionsgefäß 42 herausgehoben
(10C) wobei das Halteelement 11.2 im
angesteckten Zustand bleibt und an der Kapillarspitze 22 eine
flüssige
Umgebung der Zelle 2 gebildet ist. Mit der Antriebsvorrichtung 50 wird
das Messgerät 30 in
das weitere Suspensionsgefäß 43 überführt (10D), in dem sich eine Testlösung befindet.
In der Testlösung
kommt es zu einen schnellen Flüssigkeitsaustausch
mit der Flüssigkeit im
Napf des Halteelements 11.2. Während der Verdünnung des
Umgebungsmediums der Zelle 2 mit der Testlösung kann
laufend die Messung von Zellpotentialen fortgesetzt werden, um die
Wirkung der Testlösung
unmittelbar zu erfassen. Wie oben im Zusammenhang mit der ersten
Ausführungsform
erwähnt,
kann auch bei Verwendung des zweiten Ausführungsform die Messung des
Zellpotentials in verschiedenen Testmedien wiederholt werden.
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Bei
Verwendung eines rohrförmigen
Stabes 12.2 oder 12.3 kann die Flüssigkeitsmenge
im Napf verändert
werden, wodurch bei durch Absaugen eines Volumenanteils die Verdünnungszeit
der Lösung im
Napf verkürzt
werden kann.
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Nach
der letzten Messung kann die Ablage der Zelle 2 in einer
Zellkultur, z.B. am Boden eines Kulturgefäßes vorgesehen sein. Zu diesem
Zweck wird das Halteelement 11.2 von der Kapillare 21 entfernt
(Überführung in
die Freigabeposition). Die Abnahme des Haltelements 11.2 vom
Stab 12.2 erfolgt z.B. unter Verwendung eines gabelförmigen Werkzeugs,
das im Kulturgefäß oder an
freier Luft bereitgestellt wird.
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Gemäß einer
bevorzugten Realisierung der Erfindung ist das Messgerät 30 mit
einer Pipettenzieheinrichtung 70 ausgestattet, die schematisch
in 11A gezeigt ist. Da Kapillaren
für patch-clamp-Pipetten
sehr empfindlich sind, leicht verschmutzen und daher kaum transportierbar
sind, kann die Pipettenzieheinrichtung 70 vorteilhafterweise
zur Herstellung der Kapillaren 21 der patch-clamp-Pipetten 20 am
Ort des Messgerätes 30 verwendet
werden. Es ist insbesondere ein automatisierter Betrieb der Herstellung
und Aufnahme der patch-clamp-Pipette 20 möglich.
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Die
Pipettenzieheinrichtung 70 umfasst einen Klemmblock 71,
einen Heizdraht 72 und eine Heizung 73. Zum Ausziehen
einer Kapillare 21 wird zuerst eine Glaskapillare mit einem
Messelektrodendraht in den Klemmblock 71 eingesetzt. Anschließend wird
auf das freie Ende der Glaskapillare die Kapillarhalte rung 23 aufgesetzt.
Hierzu wird vorzugsweise die Antriebseinrichtung (50, siehe
z. B. 5, 6, 10) verwendet,
die somit eine Doppelfunktion bei der Herstellung der Kapillare 21 und
bei deren Transport erfüllt.
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Während die
Glaskapillare mit dem Heizdraht 72 erhitzt und geschmolzen
wird, kann mit der Kapillarhalterung 23. die Kapillare 21 zurückgezogen werden,
so dass sich die gewünschte
Form der Kapillarspitze 22 ergibt. Anschließend wird
die Kapillare 21 mit der Antriebseinrichtung 50 z.
B. in einem Magazin 80 abgesetzt, wie es schematisch in 11B illustriert ist. Das Magazin 80 umfasst
z. B. einen Block 81 mit Löchern, in die Kapillaren 21 einsetzbar
sind, so dass ihre Kapillarspitzen 22 frei bleiben. Das
Absetzen erfolgt mit einer Abstreifvorrichtung oder unter Ausübung eines
Druckpulses in der Kapillarhalterung 23.
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12 zeigt
weitere Einzelheiten der Verwendung einer Kapillare, bei der eine
konische Steckverbindung 24.1, 24.2 vorgesehen
ist. Gemäß 12A wird eine Kapillare 21 verwendet,
an deren Enden die Steckverbindungen 24.1, 24.2 über Schraubverbindungen 24.3, 24.4 fixiert
sind. Die Kapillare 21 wird mit den Steckverbindungen 24.1, 24.2 in
den Klemmblock 71 (siehe 11A)
eingesetzt und ausgezogen. 12B zeigt
die fertige Kapillare 21 nach dem Ausziehen.
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung
in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.