DE19742163A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Behandlung von Objekten in einem Flüssigkeitsbad - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Objektbehandlung in einem Flüssigkeitsbad, insbesondere eine Vorrichtung zur Perfusionsbehandlung in einem abgegrenzten Behandlungsbereich eines Flüssigkeitsbades, und Verfahren zur Anwendung der Vorrichtungen.

Aus DE-OS 43 05 405 ist eine Vorrichtung zur Untersuchung eines Objekts bekannt, das sich in einer ein Substrat bedecken­ den Perfusionsflüssigkeit befindet. Die Vorrichtung enthält eine Perfusionskammer, die zur Aufnahme einer Perfusions­ flüssigkeit über eine Einlaßwanne und zum Absaugen der Perfusionsflüssigkeit durch einen Auslaß eingerichtet ist. Der Einlaß der Einlaßwanne ist so gestaltet, daß zusätzlich zur Perfusionsflüssigkeit auch eine Untersuchungsvorrichtung in das Innere der Perfusionskammer geführt werden kann. Diese bekannte Vorrichtung besitzt den Nachteil, daß die Perfusions­ flüssigkeit über eine trichterförmige Einlaßöffnung in die Kammer appliziert wird und nur in eine Richtung abgesaugt wird. Die Kammer ist nicht zum Mehrfachspülen in zwei Richtungen (vor - zurück) und die anschließende Entnahme der Objekte geeignet. Ferner ist die Kammer wegen des umständ­ lichen Herstellungsverfahrens (Bohren, Fräsen) auch nicht als Artikel zum einmaligen Gebrauch für steriles Arbeiten z. B. mit Zellkulturen geeignet.

Eine Verbesserung gegenüber der bekannten Perfusionskammer ist in der DE-OS 43 21 062 beschrieben. Zur Perfusionsbehandlung insbesondere an biologischen Objekten werden diese einem gerichteten Flüssigkeitsstrom ausgesetzt, dessen Wirkungs­ bereich geometrisch begrenzt ist. Der Flüssigkeitsstrom wird durch zwei geeignet kombinierte Pipettenspitzenteile oder durch ein Applikatorteil gebildet, das den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt und zur Illustration in Fig. 7 abgebildet ist. Das Applikatorteil ist ein ringförmiges Bauteil 70 mit einem speziell gefertigten Pipettenspitzenteil 71, welches sich von herkömmlichen Pipettenspitzenteilen dadurch unterscheidet, daß es eine Krümmung aufweist und direkt mit der Wand des ringförmigen Bauteils verbunden ist und dadurch einen Perfusionsflüssigkeitseinlaß bildet. An das Pipettenspitzenteil 71 ist eine Flüssigkeitsfördereinrichtung 72 ansetzbar. Das Applikatorteil 70, 71 ist mit einem abdich­ tenden unteren Rand auf einem Substrat 73 aufsetzbar, um das zu behandelnde Objekt 74 einzuschließen. Die Perfusionsbe­ handlung umfaßt insbesondere ein wechselweises Ausstoßen und Ansaugen von Perfusionsflüssigkeit durch das Pipettenspitzen­ teil.

Die in DE-OS 43 21 062 beschriebenen Vorrichtungen haben den Nachteil, daß herkömmliche Pipettenspitzenteile, die sich zur Spitze ohne Krümmung verjüngen und breite Anwendung zum Abmessen und Dosieren von Flüssigkeiten gefunden haben sowie einfach in der Herstellung sind, entweder in Kombination von zwei Spitzen eingesetzt werden (d. h. zwei Pipettenspitzen miteinander angeordnet werden und von zwei Flüssigkeitsförder­ einrichtungen betrieben werden oder sogar miteinander ver­ bunden werden müssen) oder ein spezielles Applikatorteil gefertigt werden muß, bei dem das Pipettenspitzenteil mit einem ringförmigen Bauteil zu einem Teil verbunden ist.

Das aus DE-OS 43 21 062 bekannte Applikatorteil gemäß Fig. 7 besitzt die folgenden weiteren Nachteile. Das Applikatorteil besitzt eine asymmetrische Form mit Krümmungen, die eine Herstellung in einfacher Spritzgußtechnik nicht erlauben. Ferner ist das Pipettenspitzenteil 71 fest mit dem Bauteil 70 verbunden. Dadurch entsteht ein ggf. unerwünschtes Tot­ volumen. Außerdem ergeben sich Reinigungsprobleme.

Da keine herkömmlichen Pipettenspitzenteile, die an eine Flüssigkeitsfördervorrichtung aufsteckbar sind (siehe zum Beispiel Pipetten der Firma Costar: Pipette Tips oder Mini Microtips, Microtip, Micro Volume Tips, Mini Microtip (reg. Marken) sowie vergleichbare Produkte z. B. der Firmen Eppendorf, Deutschland, und Gilson, Frankreich, im weiteren bezeichnet als Costar-Pipetten, Gilson-Pipetten oder Eppendorf-Pipetten) verwendet werden können, muß das Applikatorteil an die jeweilige Flüssigkeitsfördereinrichtung 72 angepaßt werden. Dies betrifft insbesondere die Passung zwischen dem Pipetten­ spitzenteil und der Flüssigkeitsfördereinrichtung. Damit ist eine massenhafte Herstellung universell einsetzbarer Applikatorteile nicht möglich. Der Aufbau des bekannten Applikatorteils führt zu einer mechanischen Instabilität (Hebelwirkung des Pipettenspitzenteils 71, insbesondere an der Krümmung), was beschränkend für die Abdichtung des unteren Randes des Applikatorteils 70 in Bezug auf das Substrat 73 und für die Verwendung in automatisierten Systemen ist. Der asymmetrische Aufbau des Applikatorteils ist generell schlecht handhabbar, da eine Anbringung des Applikatorteils an der Flüssigkeitsfördereinrichtung immer auch eine gegenseitige Ausrichtung beider Teile erforderlich macht.

Aufgrund der genannten Nachteile ist der Einsatz des bekannten Applikatorteils bisher auf Laboranwendungen beschränkt. Im Rahmen der sich gegenwärtig rapid entwickelnden gentechnischen Untersuchungsmethoden besteht jedoch ein starkes Interesse an Perfusionseinrichtungen, die massenhaft einfach herstellbar sind, zuverlässig betrieben werden können und eine automati­ sierte Behandlung erlauben. Die genannten Nachteile bestehen nicht nur bei Perfusionseinrichtungen, sondern generell bei sämtlichen Vorrichtungen zur Behandlung von Objekten, bei denen das jeweilige Objekt innerhalb eines abgegrenzten Behandlungsbereiches in einem Flüssigkeitsbad behandelt (z. B. perfundiert, verdünnt, gespült, angelöst, gemischt, entnommen oder dergl.) werden soll oder bei Vorrichtungen zum Vermengen von Flüssigkeiten.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Behand­ lungsvorrichtung anzugeben, die eine Überwindung der genannten Nachteile erlaubt. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, neue Verfahrensweisen zur Objekt- oder Flüssigkeitsbehandlung unter Verwendung derartiger verbesserter Vorrichtungen anzugeben.

Diese Aufgaben werden durch eine Vorrichtung bzw. ein Ver­ fahren mit den Merkmalen entsprechend den Patentansprüchen 1, 10, 11 bzw. 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Er­ findung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung enthält im Gegensatz zu bekannten Applikatorteilen insbesondere einen Ring (auch Abgrenzungsring, Klonierungsring, Perfusionsnapf oder Perfusionsring genannt) mit einem Halterungsbereich, der eine kraftschlüssige Aufnahme für ein im Betriebszustand von oben in das Innere des Ringes mündendes, spitzenförmiges Einlaßteil einer Flüssigkeitsfördereinrichtung bildet. Damit wird ein Abgrenzungsmittel für eine Objektbehandlung in einem Behand­ lungsbereich innerhalb eines Flüssigkeitsbades zum Beispiel auf einem Substrat geschaffen, wobei eine direkte Verbindung des Einlaßteils mit der Flüssigkeitsfördereinrichtung gegeben ist. Der Halterungsbereich ist erfindungsgemäß zum kraft­ schlüssigen Ein- oder Aufstecken beliebiger spitzenförmiger Einlaßteile vorgesehen. Spitzenförmige Einlaßteile sind alle Komponenten von Flüssigkeitsfördereinrichtungen, die eine rohr- oder kapillarförmige, ggf. konisch zulaufende Zuführ­ leitung mit einem charakteristischen Enddurchmesser bilden, der geringer (insbesondere geringer als die Hälfte) des oberen Randdurchmessers des vom Ring gebildeten Innenraumes ist. Der Halterungsbereich ist beispielweise zur Aufnahme einer Spritzen- oder Pipettenspitze ausgelegt, kann aber auch ein vortretender Ansatz sein, über den das Einlaßteil aufsteckbar ist.

Die Flüssigkeitsfördereinrichtung ist entweder zur Flüssig­ keitszufuhr bzw. -abfuhr oder zur Flüssigkeitsbewegung in einen Perfusionsring durch Druckausübung eingerichtet. Entsprechend einer ersten Ausführungsform der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung ist der Perfusionsring aus einem weich-elastischen Material (z. B. Silikon oder Gummi) gebildet, das in einem beliebigen Wandbereich von der Spitze des Einlaß­ teils von der Außenseite hin zum Innenraum des Ringes durch­ stoßen werden kann. In diesem Fall wird der Halterungsbereich an der Durchstoßstelle gebildet, an der sich eine kraft­ schlüssige Abdichtung zwischen dem Ringmaterial und dem Einlaß­ teil ausbildet.

Gemäß einer zweiten, alternativen Ausführungsform ist der Halterungsbereich im Inneren des Perfusionsringes ohne eine Durchführung durch dessen Außenwand vorgesehen. Der Halterungs­ bereich wird beispielsweise durch eine ringförmige Aufnahme gebildet, die ggf. über Brückenteile mit der Wandung des Perfusionsringes verbunden ist. Die ringförmige Aufnahme ist beispielsweise ein länglicher Einsteckabschnitt mit einem sich hin zur Unterseite des Perfusionsringes verjüngenden, zum Beispiel konischen, Querschnitt. Die ringförmige Aufnahme ist aus einem elastischen Material oder nicht-elastischen Material hergestellt. Im Fall einer elastischen Aufnahme ist der Innen­ durchmesser der elastischen Aufnahme geringfügig kleiner als die zur Verwendung vorgesehenen Pipettenspitzen. Wegen der Elastizität des Materials lassen sich jedoch beliebige Einlaß­ teile (insbesondere Pipettenspitzen) mit einer großen Durch­ messervariation kraftschlüssig einstecken. Wird das Material der Aufnahme wie bei der ersten Ausführungsform aus einem weich-elastischen Material gebildet, so kann der Innendurch­ messer der Aufnahme beliebig (bis hin zum vollständigen Verschluß) verringert werden. Im Fall einer nicht-elastischen Aufnahme ist die Aufnahme paßförmig zur Pipettenspitze (z. B. konisch).

In einer weiteren Ausführungsform ist der Halterungsbereich ein in die Wand eingelassener Einsteckabschnitt. Hierzu ist die Wand mit einer trichterförmigen Erweiterung an der Außen­ seite des Ringes, die gleichzeitig ein Profil an der Außen­ seite des Ringes bildet oder mit mindestens einer inneren Wandkammer versehen, die mit dem Innenraum des Ringes in Verbindung stehen.

Die Aufnahme des Perfusionsrings (Perfusionsnapfs) ist in einer weiteren Ausführungsform mit einem inneren Anschlag versehen, der gewährleistet, daß die Pipettenspitze nur bis zu einer definierten Länge in die Aufnahmevorrichtung einge­ schoben werden kann. Der Anschlag ist eine Begrenzung, die die Einstecktiefe für das Pipettenspitzenteil begrenzt.

Bei der zweiten Ausführungsform kann der Aufnahmebereich axialsymmetrisch in der Mitte des Perfusionsringes oder außermittig an der Wandung des Perfusionsringes vorgesehen sein. Im ersteren Fall sind zusätzliche Verbindungsteile (Brückenteile) zur Stabilisierung des Aufnahmebereiches gegenüber dem Perfusionsring vorgesehen.

Erfindungsgemäß ist es möglich, den Perfusionsring lösbar oder fest am Einlaßteil der Flüssigkeitsfördereinrichtung anzubringen. Entsprechend der ersten Variante wird in besonders vorteilhafter Weise die Aufnahme des Perfusions­ ringes mit dem Einlaßteil und ein nach erfolgter Objektbehand­ lung vorgesehenes Abstreifen des Perfusionsringes vom Einlaß­ teil ermöglicht. Entsprechend der zweiten Variante liegt auch eine Ausführungsform einer Objektbehandlungsvorrichtung im Bereich der Erfindung, die einen Pipettenspitzenbereich enthält, an dem fest ein Perfusionsring angebracht ist.

Bei einem erfindungsgemäßen Einsatz der erläuterten Vor­ richtung wird ein Perfusionsring auf eine pipettenartige Spitze der Flüssigkeitsfördereinrichtung gesteckt und mit dieser zu einem Flüssigkeitsbad mit mindestens einem zu behandelnden Objekt bewegt. Nach dichtendem Aufsetzen des Perfusionsringes mittels des Einlaßteils auf den Substratboden des Flüssigkeitsbades erfolgt die Behandlung durch Betätigung der Flüssigkeitsfördereinrichtung. Anschließend wird der Perfusionsring wiederum mit Hilfe des Einlaßteils zu einer Ablage bewegt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Behandlungsverfahren automatisiert derart durchgeführt, daß das Einlaßteil mit dem Perfusionsring von einer Manipulierungseinrichtung gesteuert wird. Die Mani­ pulierungseinrichtung ist mit einer Bildverarbeitungsein­ richtung verbunden, die es erlaubt, das Einlaßteil mit dem Perfusionsring an einen vorbestimmten Ort des Flüssigkeits­ bades zu bewegen.

Die erfindungsgemäß behandelten Objekte können beliebige synthetische oder biologische Objekte insbesondere biologische Zellen, der Gruppen, Zellbestandteile, Viren oder dergl., aber auch andere Teilchen wie Makromoleküle oder dergl. sein.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen be­ schrieben. Es zeigen:

Fig. 1 schematische Perspektivansichten erfindungsgemäßer Perfusionsringe;

Fig. 2 eine schematische Phantomansicht eines erfindungsge­ mäßen Perfusionsringes mit eingestecktem Einlaßteil;

Fig. 3 eine Illustration der Aufnahme eines erfindungsgemäßen Perfusionsringes mit dem Einlaßteil einer Flüssigkeits­ fördereinrichtung und eine schematische Perspektiv­ ansicht einer erfindungsgemäßen Pipettenspitze mit fest angebrachtem Perfusionsring;

Fig. 4 eine Schnittansicht zur Illustration des Einsatzes einer erfindungsgemäßen Behandlungsvorrichtung;

Fig. 5 eine weitere Schnittansicht zur Illustration des Einsatzes einer erfindungsgemäßen Behandlungsvor­ richtung;

Fig. 6 eine schematische Darstellung zur Illustration der erfindungsgemäßen Verfahrensweise; und

Fig. 7 eine Perspektivansicht eines herkömmlichen Applikatorteils (Stand der Technik).

Fig. 1 zeigt verschiedene Ausführungsformen erfindungsgemäßer Abgrenzungs- oder Perfusionsringe, wobei die Darstellungen a0 und a1 zwei bevorzugte Basisformen darstellen, die jeweils entsprechend den Varianten gemäß a2 bis a11 oder Fig. 2 gestaltet sein können. Gemäß Fig. 1a0 besitzt der Ring die Gestalt eines Hohlzylinder- oder Schlauchabschnittes. Die untere Fläche, die im Einsatz die Auflagefläche d bildet, ist eine ebene Schnittfläche. Die Auflagefläche d ist so beschaffen, daß bei festem Aufliegen auf einer Substratoberfläche ein flüssigkeitsdichter Kontaktbereich entsteht. Gemäß Fig. 1a1 ist ein sich verjüngender Perfusionsring vorgesehen, der die Gestalt eines hohlen Kegelstumpfes besitzt. Wiederum ist die Auflagefläche d zur dichten Berührung einer Substratoberfläche eingerichtet.

Bei allen Ausführungsformen ist die Auflegefläche dadurch abdichtend, daß der jeweilige Ring aus weich-elastischem Material besteht oder auf der Unterseite mit einer weich­ elastischen Abdichtung beschichtet ist.

Abweichend von den Fig. 1a0 und 1a1 kann die Auflagefläche d gegenüber der Symmetrieachse des Zylinders bzw. Kegelstumpfs einen Winkel ≠90° bilden. Bei der Gestaltung gemäß Fig. 1a1 kann die ebene Auflagefläche d auch am breiteren Ende des Kegelstumpfes vorgesehen sein. Falls der Perfusionsring symmetrisch in Bezug auf eine mittlere Achse aufgebaut ist, ergeben sich Vorteile bei der Ringherstellung und -handhabung. Das Einstecken einer Pipettenspitze in den Perfusionsring erfolgt bevorzugt vertikal oder von schräg oben in den Bereich des oberen Randes der Wand des Perfusionsringes. Ein Ein­ stecken schräg von oben bedeutet, daß die Pipettenspitze gegenüber der Vertikalen geneigt ist und in einen oberen Ringbereich derart eingeführt wird, daß eine Einführkraft im wesentlichen hin zur unteren Auflagefläche gerichtet ist, wobei ein Drehmoment in Bezug auf den unteren Rand gebildet wird, das die Stabilität des Aufsetzens der Auflagefläche gewährleistet.

Gemäß der oben genannten ersten Ausführungsform der Erfindung ist ein Halterungsbereich für ein Einlaßteil einer Flüssigkeits­ fördereinrichtung als Teil der Ringwandung aus weich­ elastischem Material vorgesehen. Diese Ausführungsform wird im einzelnen weiter unten in Bezug auf Fig. 2 erläutert.

Gemäß der oben genannten zweiten Ausführungsform ist im Inneren des Perfusionsringes eine ringförmige Aufnahme r vorgesehen, die ggf. über mindestens ein Verbindungsteil v, v1 mit der Ringwandung in Verbindung steht, wie dies in den Fig. 1a2, 1a4 und 1a6 dargestellt ist. Die ringförmige Aufnahme r kann abweichend von der hohlzylindrischen oder konusartigen Gestalt eine beliebige andere Querschnittsform (Quadrat, Vieleck oder dergl.) besitzen. Es ist erfindungs­ gemäß nicht erforderlich, daß zwischen der Aufnahme und dem im Betriebszustand aufgenommenen Einlaßteil eine flüssigkeits­ dichte Verbindung besteht.

Gemäß Fig. 1a2 ist die ringförmige Aufnahme r axialsymmetrisch angeordnet und so eingerichtet, daß die Spitze des Einlaßteils in Betriebsposition vertikal über einem Substrat ausgerichtet ist. Insbesondere für automatisierte Verfahrensweisen ist das vertikale Einstecken in die Mitte des symmetrischen Ringes wegen der erhöhten mechanischen Stabilität besonders vorteil­ haft. Gemäß Fig. 1a3 ist die ringförmige Aufnahme r direkt an der Wandung des Perfusionsringes angebracht. Die Fign. 1a4 und 1a6 zeigen Modifikationen der Auflagefläche d1 bzw. d2. Gemäß Fig. 1a4 ist der untere Rand des Perfusionsringes mit Ein­ schnitten versehen, die für eine zusätzliche Dichtung des Kontaktes mit einem Substrat und eine vereinfachte mechanische Ablösung des Ringes vom Substrat sorgen. Mit dem entsprechenden Ziel besitzt die Auflagefläche d2 entsprechend Fig. 1a6 eine geringere Ringbreite als die Wandstärke des Ringes (verjüngte Unterkante des Ringes). Es ist generell möglich, einen erfindungsgemäßen Perfusionsring aus mehreren Materialien zusammenzusetzen, wobei mindestens der jeweilige Aufnahme­ bereich und die Auflagefläche aus einem elastischen Material gebildet sind.

Die Fig. 1a5 und 1a7 stellen Abwandlungen erfindungsgemäßer Perfusionsringe dar, die sich durch einen asymmetrischen Aufbau auszeichnen. Ungeachtet der Vorteile des oben beschriebenen symmetrischen Aufbaus sind auch asymmetrische Perfusionsringe für automatisierte Verfahrensweisen geeignet. Gemäß Fig. 1a5 ist die ringförmige Aufnahme r in die Wandung des Perfusionsringes eingelassen. Hierzu kann, wie es in Fig. 1a5 dargestellt ist, die Wandung eine über den Ringumfang variierende Dicke aufweisen, wobei sich die Aufnahme r im Bereich einer größeren Wanddicke befindet. Die Dicke der Ringwand variiert auch in axialer Richtung. Dies bedeutet, daß die Wanddicke im Bereich der in Betriebszustand unteren Auflagefläche d geringer als die Wanddicke auf der entgegenge­ setzten (oberen) Seite des Ringes ist. Der Übergang zwischen beiden Wanddicken ist, wie in Fig. 1a5 dargestellt, vorzugs­ weise stufenförmig ausgebildet, so daß sich an der Unterseite des Perfusionsringes eine Erweiterung des Ringinnenraumes ergibt, in die das von der Aufnahme r aufgenommene Einlaßteil hineinragt. In Fig. 1a5 ist diese Abstufung gestrichelt dar­ gestellt. Die Höhe der Abstufung gegenüber der Auflagefläche d ist derart gewählt, daß das durch die Aufnahme r ragende Ende des Einlaßteils nicht auf den Substratboden stößt.

Bei der Gestaltungsform gemäß Fig. 1a7 ist an der Außenwand des Perfusionsringes eine Verdickung pr vorgesehen, die für eine Positionierung des Perfusionsringes in einer Haltevor­ richtung zum Beispiel in der Präparationsstation 61 gemäß Fig. 6 (s. unten) eingerichtet ist. Anstelle der Verdickung pr kann auch eine andere, profilierte Außenform der Ringwand vorge­ sehen sein. Dies ist insbesondere für eine reproduzierbare Positionierung der Perfusionsringe an einem Perfusionsringzu­ führer 612 (s. Fig. 6) vorteilhaft.

Wie in Fig. 1 dargestellt, ist es möglich, das Einlaßteil (Pipettenspitze) senkrecht von oben (Fig. 1a2-1a6) oder mit einer Schrägstellung gegenüber der vertikalen Einführung (Fig. 1a5, 1a7) in den Perfusionsring einzuführen.

Bei den ebenfalls asymmetrischen Bauformen gemäß den Fig. 1a8, 1a81 ist die Aufnahme r und die seitliche Verdickung pr integral ausgeführt. Das heißt, daß die Aufnahme r in der Verdickung pr ausgebildet ist. Ein Pipettenspitzenteil oder dergl. kann von der Oberseite des Ringes her in die Aufnahme r eingesteckt werden, so daß es über einen inneren Kanal in den Innenraum des Perfusionsringes mündet. Der innere Kanal kann einen Anschlag bg aufweisen, der eine Begrenzung bei der Einführung des Pipettenspitzenteils bildet.

Die Bauform 1a9 ist eine besonders wichtige Ausführungsform erfindungsgemäßer Perfusionsringe, bei der die Aufnahme r seitlich in der Wand des Perfusionsringes zu einem Volumen Vol (Wandkammer) erweitert ist. Durch Verbinden von r mit einer Fluidfördereinrichtung kann zunächst durch einen Sog in dieses Volumen Vol eine Flüssigkeitsmenge (z. B. eine Reaktions­ komponente für eine chemische Reaktion oder eine Enzymlösung für die Behandlung von Zellen, die sich auf einer Oberfläche befinden) aufgenommen werden. Durch anschließendes Positionieren des Ringes auf einer Oberfläche (mit leichtem Druck), kann zur gewünschten Behandlung z. B. von Zellen auf der Oberfläche durch Ausstoßen und Einsaugen der Flüssigkeits­ menge durch eine Kanal- oder Düsenverbindung mit dem Innenraum eine pendelförmige Perfusion der durch den Perfusionsnapf abgegrenzten Oberfläche erreicht werden.

Die Bauformen 1a10, 1a11 sind weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Perfusionsringe, bei denen sich zwei Aufnahmen r1, r2 und zwei Volumina Vol1, Vol2 in der Wand des Ringes befinden. Die Perfusion erfolgt bei diesen Ausführungs­ formen wie bei der Bauform a9, wobei die Flüssigkeitsmenge hier zusätzlich in das zweite Volumen ausweichen kann. An der zweiten Aufnahme r2 (1a10) kann auch gleichzeitig (synchron zum angelegten Druck ein Unterdruck (Sog) angelegt werden und der Flüssigkeitsspiegel im Napf (durch synchrones Bedienen einer Sog- und Druck-Vorrichtung) konstant gehalten werden.

Bei den Perfusionsringen kann sich in der Mitte der Perfusions­ ringe eine durchgehende Öffnung befinden. In diese Öffnung kann eine Kamera, ein Lichtleitkabel oder eine andere optische Vorrichtung eingebracht werden. Wenn diese optische Vor­ richtung formschlüssig zur Wand des Ringes befestigt wird, schließt sich das Perfusionsvolumen.

Um Verunreinigungen der zu entnehmenden Zellen oder anderer Objekte durch die optische Vorrichtung auszuschließen und/oder um das Perfusionsvolumen im Innenraum zur Verstärkung der durch die Flüssigkeitsströmung perfundierenden Scherkräfte abzuflachen, kann die Öffnung in der Mitte auch durch eine Zwischenwand (Zw, siehe a10) abgegrenzt sein. Ein weiterer Vorteil dieser Gestaltung besteht darin, daß die Kräfte auf die Substratoberfläche durch Andruck des unteren Randes (d) auf der Oberfläche ausgeglichen werden können. Ferner läßt sich das weiche Material des Ringes komprimieren und das perfundierte Volumen auf der Oberfläche (Ob) verringern. Die Zwischenwand kann auch als optische Abbildungseinrichtung (z. B. in Form einer Linse) ausgebildet sein.

Der erfindungsgemäße Perfusionsnapf kann generell aus einem oder wie folgt auch aus zwei Teilen bestehen. Der untere Teil (T) des Napfes, der auf der Oberfläche (Ob) mit Objekten aufliegt (bzw. ein Reaktionsvolumen abgrenzt) ist so gestaltet, daß er eine Steckkappe aus einem weichen, abdichtenden Material oder auch flexiblen Material (z. B. Teflon) besteht. Im letzteren Fall wird die Abdichtung durch den Druck über einen sich ver­ jüngenden Rand (Sp) auf die Oberfläche (Ob) erreicht (Beispiel Schnittansicht a11). Die Steckkappe T ist von unten an eine entsprechende Aufnahme am Ring r ansteckbar und dazu einge­ richtet, das Perfusionsvolumen im Innenraum des Ringes und/oder den abgegrenzten Bereich auf der Oberfläche zu variieren. Es können mehrere Steckkappen T mit verschiedenen unteren Aufsatzdurchmessern vorgesehen sein, die im Rahmen des unten beschriebenen Verfahrens wahlweise an den Perfusionsring angesteckt werden.

Allen Ausführungsformen ist gemeinsam, daß der jeweilige Halterungsbereich zur kraftschlüssigen Aufnahme eines spitzenförmigen Einlaßteils am oberen Rand oder an diesen (mit Abstand vom unteren Rand) angrenzend oder mit diesem über Verbindungsstücke verbunden angeordnet ist. Diese Geometrie stellt zweierlei Vorteile der Erfindung sicher. Erstens ist ein Einlaßteil einer Flüssigkeitsfördereinrichtung stabil einsteckbar. Beim Einstecken wird ein Drehmoment gebildet, mit dem das Aufsetzen der Auflagefläche stabilisiert wird. Ein destabilisierendes, den Perfusionsring kippendes Drehmoment wird ausgeschlossen. Zweitens kann bei eingestecktem Einlaß­ teil die Behandlungsflüssigkeit mit einer Strömungsrichtung eingeführt werden, die im wesentlichen von oben auf das Substrat gerichtet ist, so daß sich die perfundierenden Scher­ kräfte erhöhen. Die senkrecht zur Substratoberfläche aus­ gerichtete Komponente der Strömungsgeschwindigkeit ist größer als die parallel zur Substratoberfläche ausgerichtete Komponente der Strömungsgeschwindigkeit.

Die Ausführungsformen mit den Wandkammern (a9, a10, a11) besitzen den zusätzlichen Vorteil, daß diese zur unmittelbaren, direkten Verbindung über ein Verbindungsteil mit der Flüssig­ keitsfördereinrichtung oder einer Druckvorrichtung geeignet sind. Es ist nicht notwendig, daß zusätzlich als Einlaßteil eine Pipettenspitze eingesetzt wird, da der Ring selbst als Flüssigkeitsaufnahme dient.

Fig. 2 zeigt ein Beispiel für die oben genannte erste Ausführungsform, bei der ein Perfusionsring durch einen einfachen zylindrischen oder konischen Ring a aus flexiblem, weich-elastischem Material gebildet wird. Das Einlaßteil der Flüssigkeitsfördereinrichtung wird durch ein Kanülen- oder Pipettenspitzenteil c gebildet. Das Material des Rings a ist so ausgebildet, daß die Spitze c unter Aufbringung einer in Bezug auf die Spitzenachse axialen Schubkraft an den oberen Rand angrenzend in die Ringwandung gesteckt werden kann. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Materialwahl besteht darin, daß die Auflagefläche d entsprechend weich-elastisch ist und so eine Selbstjustierung bzw. Selbstanpassung der Auflagefläche auf einer Substratoberfläche erzielt wird.

Fig. 3 zeigt das Zusammenwirken erfindungsgemäßer Perfusions­ ringe mit dem Einlaßteil einer Flüssigkeitsfördereinrichtung. Ein auf einer Auflage e liegender Perfusionsring gemäß Fig. 1a2 wird vom Einlaßteil durch eine Abwärtsbewegung der Flüssigkeitsfördereinrichtung aufgenommen. Die Flüssigkeits­ fördereinrichtung ist beispielweise ein Pipettenkolben oder eine andere Dosiereinrichtung g, h, die über ein Verbindungs­ stück f mit einer Pipettenspitze c verbunden ist, die das Einlaßteil bildet. Nach Abwärtsbewegung in Pfeilrichtung befindet sich die Pipettenspitze c im Perfusionsring in einem kraftschlüssig eingesteckten Zustand. In diesem Zustand kann der Perfusionsring mit der Pipettenspitze c bewegt oder zur erwünschten Objektbehandlung verwendet werden.

Der rechte Teil von Fig. 3 zeigt eine besondere Ausführungs­ form der Erfindung bei der eine Pipettenspitze c (Aufsetz­ spitze) fest mit einem Perfusionsring a verbunden ist. Diese Gestaltung ist gemäß den Ringformen der Fig. 1, 2 modifizier­ bar.

Ein Vorteil der symmetrischen Gestaltung mit vertikaler Pipettenspitze ist, daß ein Flüssigkeitsstrom mit der Pipettenspitze c derart in das Innenvolumen des Rings a geleitet werden kann, daß die Flüssigkeit unter einem Winkel von 90° oder, in den Ausführungsformen a3, a5, a7, a8 und a9 gemäß Fig. 1 kleiner als 90° auf eine Substratoberfläche trifft. Damit kann mit der zugeführten Perfusionsflüssigkeit ein zusätzlicher Spüldruck ausgeübt werden, der die Effektivität der Objektbehandlung gegenüber herkömmlichen Perfusionskammern erhöht. Dies wird zusätzlich verstärkt, falls die Pipettenspitze c düsenförmig gebildet ist.

Der Einsatz einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Fig. 2 ist in Fig. 4 dargestellt. In einem Behältnis (z. B. Schale für Zellkulturen) befindet sich ein Flüssigkeitsbad 1, in dem sich zu behandelnde Objekte i befinden. Der Boden des Behältnisses bildet ein Substrat e, auf das der Perfusionsring b aufgesetzt ist, wodurch die Objekte i vom übrigen Flüssig­ keitsbad 1 abgegrenzt werden. Die Auflagefläche d bildet einen flüssigkeitsdichten Kontaktbereich mit dem Substrat e. Mit der Flüssigkeitsfördereinrichtung c, f, g, h kann dem Innenraum des Perfusionsringes b eine Behandlungsflüssigkeit zugeführt werden. Es ist möglich, vorher aus dem abgegrenzten Volumen überschüssige Teile des Flüssigkeitsbades 1 abzunehmen, um ein Überlaufen des Flüssigkeitspegels k zu verhindern. Durch wechselweise Betätigung der Kolbenstange h des Kolbens g der Flüssigkeitsfördereinrichtung (gerader Doppelpfeil) können die Objekte mit der Behandlungsflüssigkeit und/oder Teilen des Flüssigkeitsbades einer perfundierenden Flüssigkeitsströmung (gebogener Doppelpfeil) ausgesetzt werden. Es ist auch möglich, Objekte in die Flüssigkeitsfördereinrichtung zur Behandlung im Kolben g einzusaugen und anschließend wieder in den Perfusionsring zu drücken.

Fig. 5 zeigt eine entsprechende Schnittansicht mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß der Ausführungsform, die in den Fig. 3 bzw. 1a2 gezeigt ist. Durch Bewegung des (nicht dargestellten Kolbens) der Flüssigkeitsfördereinrichtung wird ein Flüssigkeitsstrom in der Pipettenspitze c aufwärts und abwärts bewegt und durch die ringförmige Aufnahme in das Innenvolumen des Perfusionsringes a geleitet. Das Innenvolumen (Flüssigkeit j und Objekte i) werden durch das Andrücken des Ringes vom äußeren Flüssigkeitsbad 1 getrennt. Der Flüssig­ keitsstrom aus der Pipettenspitze c wird entsprechend den gebogenen Doppelpfeilen innerhalb des Ringes a nach außen seitlich umgelenkt, wobei sich der Flüssigkeitspegel k inner­ halb des Ringes a verändert.

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen eignen sich in besonders vorteilhafter Weise zur Realisierung der folgenden Verfahrens­ weisen zur Behandlung von Objekten in Flüssigkeitsbädern. Dies bezieht sich vorrangig auf die Manipulationsschritte zur Aufnahme, zur Bewegung, zum Einsatz und zur Ablage erfindungs­ gemäßer Perfusionsringe. Es ergeben sich jedoch auch Vorteile für die eigentlichen Behandlungsschritte (s. unten), wie sie in DE-OS-43 21 062 beschrieben sind. Die dort beschriebenen Behandlungsschritte werden hiermit ausdrücklich in die Beschreibung der vorliegenden Erfindung einbezogen und mit zum Gegenstand der Patentanmeldung gemacht.

Zur Manipulation von Perfusionsringen wird bei einem erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren ein spitzenförmiges Einlaßteil einer Flüssigkeitsfördereinrichtung kraftschlüssig in einen Halterungsbereich eines Perfusionsringe eingesteckt und der Perfusionsring wird mit Hilfe des Einlaßteiles zum Behandlungsort bewegt. Die kraftschlüssige Verbindung zwischen dem Einlaßteil und dem Perfusionsring ist so ausgelegt, daß der Perfusionsring zuverlässig transportierbar ist und zur Ausbildung einer abdichtenden Auflagefläche gegenüber dem Boden des Flüssigkeitsbades mit Hilfe des Einlaßteils der Flüssigkeitsfördereinrichtung gegen den Boden gedrückt werden kann. Nach dem Behandlungsvorgang erfolgt eine erneute Bewegung des Perfusionsringes mit Hilfe des Einlaßteils zu einer Abstreifvorrichtung, an der der Perfusionsring in eine Ablage geführt wird. Die genannten Manipulationsschritte können entweder manuell durch einen Bediener oder automati­ siert mit einem Manipulatorsystem erfolgen, das unter Bezug auf Fig. 6 am Beispiel eines Ringes mit Einlaßteil (Pipetten­ spitze) beschrieben wird.

Das Manipulatorsystem 60 gemäß Fig. 6 umfaßt eine Präpara­ tionsstation 61, mindestens eine Behandlungsstation 62 und eine Ablagestation 63. Die Flüssigkeitsfördereinrichtung 64 ist mit einem Manipulator 65 zwischen den Stationen beweglich. Der Manipulator 65 wird von einer x-y-z-Steuereinheit (nicht dargestellt) betätigt. Die Steuereinheit enthält vorzugsweise ein Bildverarbeitungssystem, das Eingangssignale von einer Bildaufnahmevorrichtung 66 (z. B. Video- oder CCD-Kamera) oder einem Mikroskop 69 erhält. Die Präparationsstation 61 enthält einen Pipettenspitzenzuführer 610, ein Reservoir 611 für Behandlungsflüssigkeiten und einen Perfusionsringzuführer 612. Die mindestens eine Behandlungsstation 62 enthält mindestens ein Flüssigkeitsbad entsprechend den oben angegebenen Er­ läuterungen. Die Behandlungsstation 62 enthält ferner eine Sockelhalterung, die Zusatzeinrichtungen (nicht dargestellt) zur Zuführung des Flüssigkeitsbades 1, zur Heizung und dergl. enthält und ggf. ein weiteres Bad 11 trägt, und mindestens ein Behältnis zur Aufnahme des Flüssigkeitsbades 1. Die Ablage­ station 63 umfaßt einen Flüssigkeitssammler 631 und eine Abstreifvorrichtung 632 für Perfusionsringe. Die Flüssig­ keitsfördereinrichtung ist beispielsweise aus einer Pipetten­ spitze 641 und einer Dosiereinrichtung 642 zusammengesetzt.

Bei einem ersten Verfahrensschritt wird die Flüssigkeitsförder­ einrichtung 64 zur Aufnahme der als Einlaßteil wirkenden Pipettenspitze 641 bei 610 zur Präparationsstation 61 geführt und beim Reservoir 611 mit einer Behandlungsflüssigkeit beschickt. Vor oder nach der Beschickung erfolgt die Aufnahme eines Perfusionsringes durch Einfahren bzw. Einstechen der Pipettenspitze 641 in einen Perfusionsring entsprechend einer der oben erläuterten Ausführungsformen. Das Beschicken mit einer Behandlungsflüssigkeit und die Perfusionsringaufnahme können erfindungsgemäß unter Verwendung einer geeigneten Sensortechnik (insbesondere der Bildaufnahmevorrichtung 66) vollständig automatisiert werden. Je nach Bauform des Ringes kann ein Schritt der Aufnahme einer Steckkappe T geeigneter Größe folgen. Anschließend erfolgen die Behandlungsschritte (s. unten) und nach abgeschlossener Behandlung eine Entleerung der Flüssigkeitsfördereinrichtung 64 an der Ablagestation 63 in den Flüssigkeitssammler 631 bzw. eine Ablage des Perfusions­ ringes und/oder der Pipettenspitze 641 durch ein mechanisches Abziehen mit Hilfe der Abstreifvorrichtung 632.

Bei Perfusionsringen mit Wandkammern (siehe Fig. 1, a9, a10) kann auf die Aufnahme einer Pipette verzichtet werden. Die Perfusionsringe werden direkt an die Flüssigkeitsförderein­ richtung angesteckt. In diesem Fall wird zuerst der Ring (z. B. a10) aufgenommen und bei 611 mit der Behandlungsflüssigkeit beschickt.

Die Abstreifvorrichtung 632 ist dazu eingerichtet, die Pipettenspitze 641 und den Perfusionsring a gleichzeitig oder aufeinanderfolgend von der Flüssigkeitsfördereinrichtung 64 abzustreifen. Hierzu besitzt die Abstreifvorrichtung 632 entsprechende mechanische Greifmittel wie zum Beispiel eine geeignet geformte Gabelkonstruktion, in die die Pipettenspitze 641 und/oder der Perfusionsring a einführbar und durch eine entsprechende Vertikalbewegung der Pipettenspitze 641 abziehbar sind.

Die Behandlungsschritte umfassen eine Bildaufnahme der Objekte i im Flüssigkeitsbad 1 mit der Bildaufnahmevorrichtung 66. Bei einem Analyseschritt werden Parameter der Objekte i wie zum Beispiel die Gesamtzahl der Objekte, die Zahl der auf der Oberfläche e haftenden Objekte, die Bildung von Objekthäu­ fungen oder dergl., ggf. in Abhängigkeit von der Temperatur des Flüssigkeitsbades 1, ermittelt. Gleichzeitig werden die Koordinaten der Objekte zur Steuerung des Manipulators 65 gespeichert. Nach den Manipulationsschritten (Aufnahme der Pipettenspitze 641, Beschickung mit der Behandlungsflüssigkeit und Aufnahme eines Perfusionsringes a) wird der Perfusionsring a abdichtend auf der Oberfläche e aufgesetzt und mindestens einer der folgenden Behandlungsschritte durchgeführt. Die Behandlung kann eine Einleitung der Behandlungsflüssigkeit für einen bestimmten Zeitbereich in den mit dem Perfusionsring a abgegrenzten Behandlungsbereich, die Ausbildung einer ge­ richteten Flüssigkeitsströmung (ggf. mit wechselnden Strömungs­ richtungen) im Behandlungsbereich oder ein Einsaugen der Objekte i in die Flüssigkeitsfördereinrichtung umfassen. Es kann auch vorgesehen sein, eingesaugte Objekte mit der Flüssig­ keitsfördereinrichtung 64 vom Flüssigkeitsbad 1 in mindestens ein weiteres Flüssigkeitsbad (nicht dargestellt) zu bewegen, um dort weitere Perfusionsschritte vorzunehmen. Die Ausbildung einer hin- und hergehenden Flüssigkeitsströmung im Behand­ lungsbereich dient insbesondere einem lokalen Spülen, Inkubieren, Ablösen, Mischen, Perfundieren, Verdünnen, Vereinzeln und/oder Entnehmen von Objekten.

Im rechten Teil von Fig. 6 ist schematisch eine Bedieneinheit 67 mit einer Anzeigevorrichtung 68 dargestellt, auf der ein Bild der zu behandelnden Objekte i (z. B. Zellen) angezeigt wird. Eine erfindungsgemäße Verfahrensweise umfaßt eine reproduzierbare Entnahme einer bestimmten Zahl von Objekten und Überführung in ein anderes Flüssigkeitsbad zur Ver­ ringerung der Objektdichte bzw. zum Beginn eines weiteren Wachstums in einem neuen Volumen. Ein derartiges Vorgehen läßt sich erfindungsgemäß besonders günstig realisieren, da die erfindungsgemäßen Perfusionsringe ein normierbares Innen­ volumen besitzen.

Die am automatisierten System gemäß Fig. 6 erläuterten Schritte sind analog auch manuell ausführbar. Es sind auch kombinierte Formen zwischen manueller und automatisierter Bearbeitung möglich, falls zum Beispiel bei biologischen Anwendungen bestimmte Zellhaufen mit besonderen Eigenschaften durch besondere Fluoreszenz- oder Wachstumseigenschaften oder andere Markierungen ermittelt worden sind und diese mit einem Bildverarbeitungssystem, zum Beispiel auf einem Bildschirm mit einem Zeiger (Cursor) markiert werden. Nach einer Koordinaten­ erfassung durch das System erfolgt eine Ansteuerung der Pipettenspitze mit dem Perfusionsring zum ermittelten Zellhaufen (Zellklonen) um diesen von übrigen Zellen zu separieren. Es ist beispielsweise auch möglich, Zellen von der Oberfläche einer Zellkulturschale wiederholt zu entnehmen, um in vorbestimmter Weise Verdünnungen durchzuführen.

Erfindungsgemäße Perfusionsringe haben den Vorteil eines erheblich vereinfachten Aufbaus. Sie sind insbesondere mit einem Herstellungsschritt (z. B. Spritzgießen, Pressen oder dergl.) herstellbar. Ferner wird die Zusammensetzung mit einer Flüssigkeitszuführeinrichtung wesentlich vereinfacht, da keine zusätzlichen Verbindungsstücke erforderlich sind. Ein Perfusionsvorgang kann unmittelbar im direkt an die Flüssig­ keitsfördereinrichtung gesteckten Ring erfolgen. Die Perfusions­ ringe sind mit beliebigen Pipettenarten (übliche Luftver­ drängungs-Pipetten, Spezialpipetten, wie zum Beispiel die sogenannten Eppendorf-Pipetten oder Gilson-Pipetten, oder dergl.) kombinierbar. Die mit einem Perfusionsring verbundene Pipettenspitze (s. Fig. 3, rechter Teil) ist adapterartig an beliebige Pipettenenden oder Kanülen oder dergl. ansetzbar.

Erfindungsgemäße Systeme eignen sich auch zum schnellen Mischen von Flüssigkeiten. Es ergeben sich Anwendungen beim Screening von chemischen Reaktionen. Wenn ein Volumen mit einer Lösung A in eine Pipette (oder die Wand des Perfusionsnapfes Fig. 1, a9, a10 aufgenommen wird und die Ringvorrichtung abdichtend auf einer Oberfläche in einem Volumen mit der Reaktionsflüssigkeit B aufgesetzt wird, kann durch das Entleeren der Lösung A in den Perfusionsnapf eine schnelle Mischung der beiden Flüssigkeiten erreicht werden. Mit optischen Auswerteverfahren z. B. das Beobachten einer Farbreaktion oder auch Verfahren wie Spektralanalyse etc.) kann ein Selektionieren von Reaktionskomponenten durchgeführt werden. Das sich im Napf befindliche Reaktionsgemisch wird anschließend vollständig entnommen, entleert und der Zyklus kann erneut beginnen. Durch das Ansaugen von Luft in den düsenförmigen Kanal an der Unterseite des Perfusionsnapfes, können die Reaktionskomponenten über ein Luftpolster voneinander getrennt werden.

Claims (20)

1. Vorrichtung zur Behandlung von Objekten in einem abgegrenzten Behandlungsbereich eines Flüssigkeitsbades, die einen Ring enthält, der einen abdichtend auf den Boden des Flüssigkeitsbades aufsetzbaren unteren Rand und einen oberen Rand hat und dessen Innenraum zur Verbindung mit einer Flüssigkeitsfördereinrichtung eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring am oberen Rand, an diesen angrenzend oder mit diesem verbunden einen Halterungsbereich aufweist, der zur kraft­ schlüssigen, lösbaren Aufnahme eines von oben zum Innenraum des Ringes gerichteten, spitzenförmigen Einlaßteils der Flüssigkeitsfördereinrichtung vorgesehen ist.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der Ring eine Wand aus weich-elastischem Material besitzt, die den Halterungsbereich bildet und vom Einlaßteil abgedichtet durchstoßen werden kann.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der Halterungsbereich im Innenraum des Ringes vorgesehen ist und eine ringförmige Aufnahme bildet, in die das Einlaßteil kraftschlüssig einsteck­ bar ist.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 3, bei der die ringförmige Aufnahme axialsymmetrisch in der Mitte des Innenraumes angeordnet und über Verbindungsteile mit der Wandung des Ringes verbunden ist.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der der Halterungsbereich als Aufnahme ausgebildet ist, die durch die Wand des Ringes führt.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 5, bei der die Wand des Ringes eine Verdickung aufweist, die eine Profilierung der Außenseite des Ringes bildet und die Aufnahme als Kanal enthält, der einen Winkel von 90° oder kleiner 90° gegenüber dem unteren Rand bildet.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 6, bei der der Kanal einen inneren Anschlag zur Begrenzung der Einstecktiefe des Einlaßteils besitzt.

8. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der untere Rand Einkerbungen, die sich beim Aufsetzen auf den Boden des Flüssigkeitsbades schließen, oder eine weich­ elastische Beschichtung aufweist.

9. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der untere Rand eine Aufnahme für eine Steckkappe (T) bildet, die zum abdichtenden Aufsetzen auf den Boden des Flüssigkeitsbades und zur Bestimmung der Größe des Behandlungsbereiches vorgesehen ist.

10. Vorrichtung zur Behandlung von Objekten in einem abgegrenzten Behandlungsbereich eines Flüssigkeitsbades, die einen Ring enthält, der einen abdichtend auf den Boden des Flüssigkeitsbades aufsetzbaren unteren Rand und einen oberen Rand hat und dessen Innenraum zur Verbindung mit einer Flüssigkeitsfördereinrichtung eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring eine Wand besitzt, in die mindestens eine Wandkammer eingelassen ist, die mit dem Innenraum verbunden ist, und der Ring am oberen Rand einen Halterungsbereich aufweist, der zur kraftschlüssigen, lösbaren Aufnahme eines von oben in die Wandkammer des Ringes mündenden spitzenförmigen Verbindungs­ teils der Flüssigkeitsfördereinrichtung vorgesehen ist.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 10, bei der der Ring aus weich-elastischem Material besteht und/oder der untere Rand Einkerbungen, die sich beim Aufsetzen auf den Boden des Flüssigkeitsbades schließen, oder eine weich-elastische Beschichtung aufweist.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, bei der der untere Rand eine Aufnahme für eine Steckkappe (T) bildet, die zum abdichtenden Aufsetzen auf den Boden des Flüssigkeitsbades und zur Bestimmung der Größe des Behandlungsbereiches vorgesehen ist.

13. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, bei der der Innenraum durch eine Zwischenwand in ein Perfusionsvolumen und eine Aufnahme für eine optische Beobachtungseinrichtung getrennt ist.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, bei der das Perfusions­ volumen mit einer oder zwei Wandkammern in Verbindung steht.

15. Aufsetzring für eine Pipette mit einem Ring, der im auf­ gesetzten Zustand das Ende der Pipettenspitze umgibt und einen vom Ende der Pipettenspitze wegweisenden Rand aufweist, der als ebene Auflagefläche zur flüssigkeitsdichten Abdichtung gegenüber einem Substrat eingerichtet ist.

16. Perfusionsapparatur mit einer Präparationsstation, einer Behandlungsstation, einer Ablagestation, mindestens einer Flüssigkeitsfördereinrichtung, einer Bildaufnahmevorrichtung und einer Steuervorrichtung, wobei die Flüssigkeitsförderein­ richtung zur Perfusionsbehandlung von biologischen Objekten in mindestens einem Flüssigkeitsbad der Behandlungsstation eingerichtet und zur Aufnahme einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder einem Aufsetzring gemäß Anspruch 15 an der Präparationsstation vorgesehen ist.

17. Verfahren zur Behandlung von Objekten in einem abgegrenzten Behandlungsbereich eines Flüssigkeitsbades mit einer per­ fundierenden Flüssigkeitsströmung aus einer Flüssigkeits­ fördereinrichtung mit einem spitzenförmigen Einlaß- oder Verbindungsteil, dadurch gekennzeichnet, daß das Einlaß- oder Verbindungsteil zur Herstellung einer kraft­ schlüssigen Verbindung in einen Halterungsbereich eines Ringes eingeführt wird und mit dem Ring zur Abgrenzung des Behand­ lungsbereichs in das Flüssigkeitsbad geführt wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem der Ring mit dem Einlaß- oder Verbindungsteil auf einen ebenen Boden des Flüssigkeitsbades gedrückt wird, so daß sich ein flüssigkeits­ dichter Kontaktbereich bildet.

19. Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, bei dem die Bewegung des Ringes mit dem Einlaßteil mit einem Manipulator erfolgt, der mit einer Bildverarbeitungsvorrichtung und einer Steuer­ vorrichtung verbunden ist, die zur Aufnahme von Koordinaten der zu behandelnden Objekte und zur Ansteuerung des Manipulators eingerichtet sind.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, bei dem die Behandlung der Objekte eine Entnahme einer vorbestimmten Anzahl von Objekten aus dem Flüssigkeitsbad in die Flüssigkeitsfördereinrichtung und eine Überführung in ein weiteres Flüssigkeitsbad umfaßt, wobei die Entnahme und Überführung durch den Manipulator ausgeführt werden.