DE2953265A1

DE2953265A1 - Miniatur-reaktions-behaelter und verfahren und vorrichtung zur einfuehrung eines mikrovolumens einer fluessigkeit in diesen behaelter

Info

Publication number: DE2953265A1
Application number: DE19792953265
Authority: DE
Inventors: David Herbert Leaback
Original assignee: Dynatech AG
Current assignee: Dynatech AG
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-05-25
Publication date: 1981-02-19
Also published as: SE8005625L; IT8086271A0; EP0005979A1; GB2077914A; FR2456551A1; NL7915045A; IT1148223B; BE81T1

Description

Anmelder: DYNATECH AG, Gartenstraße 2, 63oo Zug, Schweiz

Miniatur-Reaktions-Behälter und Verfahren und Vorrichtung zur Einführung eines Mikrovolumens einer Flüssigkeit in diesen Behälter

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Miniatur-Reaktions-Behälter und ein Verfahren und Vorrichtungen zum Einführen ' von Mikro-Volumina von Flüssigkeiten in diesen Behälter, und hat zum Ziel, Reaktionen mit den durchzuführenden Mikro-Volumina von flüssigen Reagenzien, Proben oder dergl. zu ermöglichen, insbesondere um Zwecke chemischer, bio-chemischer oder biologischer Versuche, welche eine Reihe von Schritten umfassen, die die Erzeugung eines Reaktionsgemisches von genauen Mikro-Volumina von Flüssigkeiten einschließen.

In Versuchsreihen zur Bestimmung der Menge einer besonderen Substanz in einem biologischen Fluid wird ein genaues Volumen einer Probe mit vorbestimmten Volumina von Reagenzien oder ähnlichem gemischt.

Solche Versuchsreihen erfordern eine Reihe von Schritten, in welchen akkurate Volumina von Flüssigkeiten ausgeteilt werden müssen.

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Es ist eine automatische Vorrichtung zur Durchführung solcher Versuchsreihen verfügbar, obgleich diese Vorrichtung im allgemeinenfür eifte große Zahl von Ver suchen konstruiert und oft hinsichtlich Aufwand an Zeit und Kosten nicht so gut geeignet ist, um einzelne oder eine kleine Zahl von Reaktionsversuchen durchzuführen. Darüber hinaus sind solche automatischen Vorrichtungen selten eingerichtet, um kleine Proben zu analysieren und benötigen oftmals relativ große Volumina von Reagenzien oder ähnlichem.

Manche Reagenzien, wie künstliche Enzym-Substrate, welche in den Versuchsreihen benötigt werden sind extrem kostspielig und die für den Versuch zur Verfügung stehende Menge einer Probe, wie beispielsweise Körperflüssigkeit, kann sehr begrenzt sein. Es besteht deshalb ein Bedarf an einer Technik, welche die Durchführung von Versuchsreihen oder anderen Reaktionen mit Klein oder Kleinstvolumina von Reagenzien und Proben ermöglicht. Es mangelt weiter an einer Technik, welche einzelne oder eine geringe Zahl von Reaktionen durchzuführen erlaubt und welche keine komplexen Vorrichtungen oder ein hohes Maß an Fachkundigkeit seitens des Bedienenden erfordert und gleichzeitig Wirtschaftlichkeit im Gebrauch der Reagenzien oder ähnlichem bietet.

Eine^-Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines,ileaktionsbehälters, welcher für die Herbeiführung von Reaktionen mit Mikro- Volumina von Reagenzien und/oder Proben geeignet ist, und welcher kostengünstig und dazu bestimmt ist, solche Mikro-Volumina genau und

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leicht zu handhaben. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Abgabe eines genauen MikroVolumens eines flüssigen Reagenz oder einer Probe an einen Reaktionsbehälter zum Zwecke der Herbeiführung einer Reaktion abzugeben, und insbesondere, um gleichzeitig genaue MikroVolumina von Flüssigkeiten an eine Vielzahl solcher Behälter abzugeben.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einem Miniatur-Reaktionsbehälter, welcher eine rohrförmige Reaktionskammer mit einem an einem Ende der Kammer und im wesentlichen koaxial zu dieser angeordneten Einlaßröhrchen umfaßt, welch letzterer einen kleinen Durchmesseraufweist als die Reaktionskammer und welches als Haarröhrchen aus nicht benetzbarem Werkstoff ausgebildet ist.

Der Durchmesser des Einlaßröhrchens ist derartig dimensioniert, daß eine Flüssigkeit durch diese als zusammenhängende Flüssigkeitssäule gesaugt werden kann, das heißt, daß diese nicht durch Gas- oder Luftblasen unterbrochen ist, wenn das freie Ende des Einlaßröhrchens gegenüber der Atmosphäre offen ist. Sie besteht aus einem durchscheinenden, nicht benetzbaren Werkstoff, wie beispielsweise Teflon, und die Bohrung des Röhrchens hat vorzugsweise genau parallel verlaufende Seitenflächen, so daß eine genaue Menge einer Flüssigkeit eingefüllt werden kann, ohne daß Tropfen an der Innenseite oder Außenseite des Röhrchens haften bleiben.

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Die rohrförmige Reaktionskammer kann aus einem gegenüber den Reagenzien oder dergleichen inerten Werkstoff gebildet sein. Vorzugsweise ist sie aus einem durchscheinenden, benetzbaren Polymer _{f W}i_e Weich- oder Hartpolythen oder Polyvinylchlorid hergestellt. Da die Reaktionskammer einen größeren Querschnitt als das Einlaßröhrchen aufweist, wird die Mischung von Reagenzien oder ähnlichem angeregt, wenn sie nach und nach aus dem Einlaßröhrchen in die Reaktionskammer eingesogen wird, wobei das Mischen infolge der Eigenart der Benetzbarkeit des Werkstoffes, aus welchem die Reaktionskammer hergestellt ist, unterstützt wird. Allerdings darf der Querschnitt der Reaktionskammer nicht so groß sein, daß sich die Mikrovolumina der verwendeten Flüssigkeiten in diskrete Tröpfchen innerhalb der Reaktionskammer aufteilt. Vorzugsweise ist der Durchmesser der Reaktionskammer so beschaffen, daß die Mikrovolumina der der Reaktionskammer zugeführten Flüssigkeit längs der Reaktionskammer in Richtung fort von dem Einlaßröhrchen als zusammenhängende^r Flüssigkeits faden eingesogen werden kann.

In einem typischen Beispiel weist das Röhrchen einen inneren Durchmesser von annähernd o,6mm und eine Länge von annähernd 25mm auf, während die Reaktionskammer einen inneren Durchmesser von annähernd 1,6mm und eine Länge von annähernd 25mm aufweist. Das Volumen der Reaktionskammer soll 5o n£ vorzugsweise 3o mI nicht überschreiten.

Die Reaktionskammer kann mit einem zu dieser koaxial angeordneten

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Auslaßröhrchen für den Anschluß des Behälters an eine Unterdruckquelle vie beispielsweise eine Spritze ausgestattet sein. Das Auslaßröhrchen kann den gleichen oder annähernd den gleichen Durchmesser wie das Einlaßröhrchen aufweisen und es kann entweder aus dem Werkstoff des Einlaßröhrchens oder der Kammer hergestellt sein. Alternativ kann das Auslaßröhrchen der Einfach heit halber als Hohlnadel einer an dem Behälter befestigten Spritze zur Erzeugung eines Unterdrucks in demselben ausgebildet sein, wobei die Hohlnadel in das dem Einlaßröhrchen gegenüberliegende Ende der Reaktionskammer eingesetzt ist.

Die Reaktionskammer kann mit dem Einlaßröhrchen aus einem Stück geformt sein oder das Einlaß- und/oder Auslaßröhrchen kann alternativ flüssigkeitsdicht mit der Reaktionskammer verbunden sein. Es ist von besonderer Bedeutung, daß jegliche Verbindung zwischen der Reaktionskammer und den Röhrchen flüssigkeitsdicht ist, da der Behälter für die Durchführung von Reaktionen mit bemessenen Mikrovolumina von Flüssigkeiten vorgesehen ist, welche in den Behälter durch Unterdruck eingesogen werden, und jede Undichtigkeit Ungenauigkeiten in den Flüssigkeitsmengen verursacht.

Die Reaktionskammer kann mit zwischen ihren Enden befindlichen Einschnürungen versehen sein, welche sie in zwei oder mehr Reaktionsräume aufteilen. Auf diese Weise kann eine Reaktion in einen ersten Bereich und dann das Reaktionsprodukt durch Unterdruck in den zweiten Bereich gebracht werden, welcher bereits ein zusätzliches Reagenz für die Durchführung einer zweiten Reaktion beinhalten kann, oder in welchen ein zusätzliches Reagenz für eine zweite Reaktion eingeführt werden kann. Eine solche Anordnung ist

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insbesondere vorteilhaft für solche Versuchsreihen, welche zwei oder mehrere Reaktionen erfordern, bevor das Stadium erreicht ist, bei welchem die Mischung genau überprüft werden kann.

In einer anderen Ausführung weist die Reaktionskammer eine zweite rohrförmige Reaktionskammer auf, welche gegenüber dem mit dem Einsatzröhrchen versehenen Ende der ersten Reaktionskammer und koaxial mit dieser verbunden ist und einen größeren Durchmesser als die erste hat.

Die erfindungsgemäßen Behälter können vom Hersteller vorbehandelt sein und Laboratorien zur Durchführung spezieller Reaktionen, Tests oder Versuchen angeboten werden. Zu diesem Zweck können ein oder mehrere Reagenzien über das Einlaßröhrchen durch den Hersteller in die Reaktionskammer eingebracht sein und dort mit der Innenfläche adhäsiv oder chemisch, beispielsweise durch kovalente Bindung, verbunden sein. Das Reagenz kann in den Reaktionsbehälter als Lösung oder Dispersion eingebracht und danach gefriergetrocknet werden,,um es an den Innenflächen der Kammer oder deren Werkstoff anhaften zu lassen. Das Reagenz kann dabei so ausgewählt werden, daß es mit den Innenflächen der Kammer chemisch, beispielsweise durch Kovalenz, verbindbar ist. Es können auch eine Vielzahl von Reagenzien oder ähnlichem mit den Innenseiten der Reaktionskammer bzw. den Reaktionskammern in verschiedenen Bereichen derselben adhäsiv oder chemisch verbunden sein, um nacheinander zwei oder mehrere in den Kammern herbeigeführte Reaktionen zu ermöglichen. Diese Bereiche können voneinander durch eine oder

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mehrere Einschnürungen getrennt sein oder entsprechend obiger Beschreibung aus einander folgenden Kammern bestehen, es können aber auch einfach verschiedene einzelne Bereiche längs der zylindrischen Innenfläche der Reaktionskammer sein.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Miniatur-Reaktions-Behälters besteht darin, daß er billig herzustellen ist, und er kann so beschaffen sein, daß nach dem Gebrauch eine kostspielige Reinigung vermeidbar ist, welche erforderlich wäre, falls der Behälter erneut gebraucht würde. Darüber hinaus können Reaktionsbehälter in Miniaturausführung, an dessen Innenflächen ein oder mehrere erforderliche Reagenzien für einen bestimmten Versuch anhaften, in Mengen präpariert und verkauft werden. Dies ermöglicht einem Labor, beispielsweise einem Krankenhauslabor, einen Vorrat an verfügbaren Reaktionsbehältern zu halten, welche einen weiten Bereich von verschiedenen Reaktionsproben abdecken ., welche sofort für den gewünschten Versuch zur Verfügung stehen, womit eine beträchtliche Zeitersparnis verbunden ist.

Des weiteren kann das in dem erfindungsgemäßen Miniatur-Rekationa-Behälter benötigte Reaktions- und'Probenvolumen sehr klein sein, beispielsweise o,1uj, für jedes Reagenz oder 2.AiI pro Teilmenge. Dies ist insbesondere bedeutsam, wenn nur kleine Volumina von Proben verfügbar sind und wenn teure Reagenzien, wie künstliche Enzymsubstrate, in einer Versuchsreihe erforderlich sind.

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Ein weiterer Vorteil des Reaktionsbehälters besteht darin, daß verschiedene Reagenzien oder Proben getrennt in dem Behälter gehalten werden können,bis sie gebraucht werden. Dadurch ist es möglich, durch geeignete Wahl von Länge und Fassungsvermögen des Einlaßröhrchens Flüssigkeitssäulen verschiedener Reagenzien oder Proben zu bilden, wobei diese durch ein Volumen eines Puffers aus Wasser oder Luft getrennt sind, und die Flüssigkeitssäulen in dem Einlaßröhrchen gehalten und nacheinander in die Reaktionskammer in einer in gewünschter Weise vorbestimmten Reihenfolge eingebracht werden können. Dadurch kann eine Bedienungsperson die Reagenzien oder Proben wie gewünscht einfach dadurch positionieren, daß sie dieselben in das Einlaßröhrchen in der erforderlichen Reihenfolge einbringt. ;

Bestimmte Versuchsreihen erfordern eine Bebrütung der Mischung der Reagenzien und/oder der Proben, bevor ein Stadium erreicht ι wird, bei welchem die Mischung probiert werden kann. Wenn eine j Probe mit Mikrovolumina von Reaktionsflüssigkeiten zusammenge- ι führt wird, können diese bereits verdunstet sein, was einen Versuch verbietet. Die bisher verfügbare Vorrichtung zur Durchführung ■ von Probenreaktionen ist nicht speziell dafür eingerichtet, Reaktionen mit Mikrovolumina von Flüssigkeiten herbeizuführen, und erlaubt eine übermäßige Verdunstung, was sie für eine solche Probenreaktion ungeeignet macht. Die vorliegende Erfindung beseitigt diese Mängel der bekannten Vorrichtung und erlaubt Probenreaktionen, welche eine Bebrütung erfordern, um mit Mikrovolumina von Flüssigkeiten zusammengeführt zu werden, ohne daß ein

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wesentlicher Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung auftritt. Mit der Erfindung kann daher, wenn eine eine Bebrütung erfordernde Mischung in der Reaktionskairaner vorbereitet wurde, das Einlaßröhrchen und das diesem gegenüberliegenden Ende der Kammer abgedichtet sein, beispielsweise mit Paraffinwachs, und der Reaktionsbehälter kann ohne Flüssigkeitsverlust bebrütet werden. Des weiteren kann die bebrütete Mischung nach Beendigung der Bebrütung aus dem Behälter zur Behandlung in weiteren Versuchsstadien ausgelassen werden, indem das Einlaßröhrchen und die Reaktionskammer an Punkten zwischen den Verschlüssen gekappt werden und die Mischung ausgedrückt wird.

Die vorliegende Erfindung besteht weiter in einem Verfahren zum Einführen eines Mikrovolumens eines flüssigen Reagenz oder einer Probe in einem Reaktionsbehälter der oben beschriebenen Ausführung, welches die folgenden Verfahrensschritte umfaßt: Eintauchen des Einlaßröhrchens des Reaktionsbehälters in die Flüssigkeit,

Erzeugen eines Unterdruckes an dem gegenüber dem mit dem Einlaßröhrchen verbundenen Ende der Reaktionskammer zwecks Einsaugen eines Mikrovolumens einer Flüssigkeit in das Einlaßröhrchen und Ausbildung einer zusammenhängenden Flüssigkeitssäule in diesem,

Herausnehmen des Einlaßröhrchens aus der Flüssigkeit und erneutes Erzeugen eines Unterdruckes zwecks Einsaugen der Flüssigkeit in die Reaktionskammer des Reaktionsbehälters.

Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur gleichzeitigen

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Einführung yon Mikrovolumina eines flüssigen Reagenz oder einer Probe in eine Vielzahl von Reaktionsbehältern der oben beschriebenen Ausführung und beinhaltet die Verfahrensschritte:

Bereitstellen der Reaktionsbehälter im wesentlichen aufrecht in einer vorbestimmten Ordnung, gleichzeitiges Eintauchen der Einlaßröhrchen der Reaktionsbehälter in die Flüssigkeit, gleichzeitiges Erzeugen eines Unterdruckes an den den Einlaßröhrchen gegenüberliegenden Enden der Reaktionskammern zwecks Einsaugen von Mikrovolumina der Flüssigkeit in die Einlaßröhrchen und Ausbildung von zusammenhängenden Flüssigkeitssäulen in diesen, gleichzeitiges Herausnehmen der Einlaßröhrchen aus der Flüssigkeit und gleichzeitiges erneutes Erzeugen eines Unterdruckes in den Reaktionskammern, um die Flüssigkeitssäulen in diese Reaktionskammern einzusaugen.

In einer beispielhaften Ausführung sind die Reaktionsbehälter in einer Reihe von acht Behältern mit Zwischenräumen angeordnet, so daß die Einlaßröhrchen der Reaktionsbehälter in die acht Behältnisse einer Reihe einer handelsüblichen Mikrotestplatte eingetaucht werden können. Alternativ können die Behälter in einer Anordnung von zwölf Reihen zu je acht Behältern vorgesehen sein, so daß die Einlaßröhrchen gleichzeitig in alle Behältnisse einer handelsüblichen Mikrotestplatte eingetaucht werden können.

Nach dem ersten Schritt des Ansaugens können das bzw. die Einlaß-

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röhrchen nacheinander in eine oder mehrere weitere Flüssigkeiten eingetaucht und der bzw. die Behälter mit Unterdruck beaufschlagt werden, um ein Mikrovolumen der oder jeder weiteren Flüssigkeit in das bzw. die Einlaßröhrchen zwecks Beimischung in der bzw. den Reaktionskammern des bzw. der Behälter in der gewünschten Reihenfolge einzusaugen, um die erforderlichen Reaktionen herbeizuführen .. Alternativ kann die erste Flüssigkeit eine Lösung oder Dispersion eines ersten Reagenz oder dergleichen umfassen, welche an der Innenfläche der Reaktionskammer bzw. der Reaktionskammern der Behälter durch Gefriertrocknung oder chemische Bindung anhaften kann, wobei die weiteren Flüssigkeiten erst später hinzugefügt werden können, wenn eine Versuchsreaktion herbeiführt werden soll, welche das erste Reagenz oder dergleichen enthält.

Wenn das gewünschte Reaktionsgemisch in einem Reaktionsbehälter hergestellt worden ist, können das Einl"¹ ^röhrchen und das gegenüberliegende Ende der Reaktionskammer ; schlossen und das Reaktionsgemisch in der Reaktionskammer b brütet werden. Danach kann das Einlaßröhrchen derartig gekappt wt.den, daß der Verschluß geöffnet wird und die bebrütete Reaktionsmischung aus dem Behälter in ein Behältnis ausgedrückt und getestet werden kann.

Wenn ein Reaktionsbehälter zwei oder mehr Reaktionsbereiche oder Kammern aufweist, kann das zuerst hergestellte Reaktionsgemisch als zusammenhängende Flüssigkeitssäule aus dem ersten Bereich oder'der erstejri Kamrer in einen zweiten Bereich oder eine zweite Kammer gesaugt werden, ,,relcl ν n:it einem Reagenz zur Herbeiführung

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einer zweiten Reaktion vorbehandelt sein kann.Wenn der zweite Bereich oder die zweite Kammer nicht vorbehandelt ist, kann das Einlaßröhrchen des Behälters.nachdem das erste Reaktionsgemisch in den zweiten Bereich oder die zweite Kammer eingesaugt worden ist,in ein weiteres flüssiges Reagenz oder eine Probe eingetaucht werden, worauf der Behälter mit Unterdruck beaufschlagt wird, um ein Mikrovolumen einer weiteren Flüssigkeit in das Einlaßröhrchen einzuziehen, worauf das Einlaßröhrchen aus der Flüssigkeit herausgenommen wird und erneut ein Unterdruck erzeugt wird, um die weitere Flüssigkeit durch das Einlaßröhrchen und die erste Reaktionskammer oder den ersten Reaktionsbereich in die zweite Kammer oder den zweiten Bereich einzusaugen, wobei das Mischen der weiteren Flüssigkeit mit dem ersten Reaktionsgemisch bewirktrwird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Einführen von Mikrovolumina,von flüssigen Reagenzien oder Proben in eine Vielzahl von Reaktionsbehältern der oben beschriebenen Ausführung, welche in vorbestimmter Ordnung angeordnet sind und Haltemittel aufweisen für die Fixierung der Behälter in der vorbestimmten Ordnung mit ihren Einlaßröhrchen nach unten weisend, wobei die Haltemittel beweglich sind, um die Einlaßröhrchen der Behälter gleichzeitig in eine oder mehrere Flüssigkeit enthaltende, unter den Haltemitteln befindliche Behältnisse einzutauchen, und Mittel vorgesehen sind zur gleichzeitigen Beaufschlagung der.den Einlaßröhrchen der Behälter gegenüberliegenden Enden derselben mit Unterdruck, um jeweils ein vorbestimmtes Mikrovolumen einer Flüssigkeit aus dem bzw. den Behältnissen in das Einlaßröhrchen jedes Behälters einzusaugen.

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Die Mittel zur Erzeugung des Unterdruckes können Einrichtungen sein, welche für eine genaue Bemessung eines wiederholbaren Flüssigkeitsvolumens eingerichtet sind. In einer bevorzugten Ausführung bestehen die Mittel zum Erzeugen des Unterdrucks aus einer Vielzahl von Spritzen, welche Hohlnadeln aufweisen, die an dem dem Einlaßröhrchen gegenüberliegenden Ende der Reaktionsbehälter angeordnet sind. Die Spritzen können miteinander verbunden und ihre Kolben miteinander gekoppelt sein, so daß letztere gleichzeitig beweglich sind, um ein Mlkrovolumen einer Flüssigkeit in das Einlaßröhrchen jedes Behälters einzusaugen. Die miteinander gekoppelten Kolben können durch einen geeigneten Mechanismus betätigt werden, welcher während der Betätigung automatisch jeden Kolben um einen bestimmten Hub mitbewegt, wobei ein bestimmtes Mikrovolumen der Flüssigkeit in jedes Einlaßröhrchen eingesogen wird. Ein solcher Mechanismus kann aus einer Zahnstange und einem Ritzel ., einem Sperrgetriebe, einer Spindel oder anderen geeigneten Mechanismen für eine schrittweise Bewegung der Kolben um einen vorbestimmten Hub bestehen .

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht die gleichzeitige Herstellung von Probereaktionsgemischen mit genau bemessenen Mikrovolumina von flüssigen Reagenzien oder Proben.

Zum besseren Verständnis der Erfindung ist diese nun beispielsweise anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine vergrößerte Darstellung eines Axialschnittes durch

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eine erste Ausführung eines Miniatur-Reaktions-Behälters gemäß der Erfindung_;

und 3 vergrößerte Darstellungen von Axialschnitten durch zwei weitere Ausführungen des Behälters,

Fig.4 einen Längsschnitt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung für die gleichzeitige Einführung von Mikrovolumina einer Flüssigkeit in eine Vielzahl von Miniaturreaktionsbehältern, und

Fig.5 eine teilweise Draufsicht aufdi^e Vorrichtung.

Fig. 1 zeigt eine einfache Form eines Miniatur-Reaktions-Behälters gemäß der Erfindung. Er besteht aus einer durchscheinenden rohrförmigen Reaktionskammer 1 mit einem ebenfalls durchscheinenden Einlaßröhrchen 2, welches einen dem inneren Durchmesser der Kammer im wesentlichen entsprechenden äußeren Durchmesser aufweist und welches koaxial in ein Ende der Kammer eingesetzt und durch Klebung in dieser Lage befestigt ist. Das Einlaßröhrchen 2 ist aus einem nicht benetzbaren Werkstoff, wie beispielsweise Teflon, hergestellt, während die Kammer 1 aus einem benetzbaren Kunststoff, wie Polyvinylchlorid, besteht. Sowohl das Einlaßröhrchen als auch die Reaktionskammer können als Haarröhrchen ausgebildet sein. In einem repräsentativen Beispiel hat das Einlaßröhrchen einen Durchmesser von o,$mm und die Reaktionskammer einen solchen von 1,6mm, wobei beide-,Röhrchen annähernd 25mm lang sind. Das Fassungsvermögen der Reaktionskammer sollte nicht übersehreibten.

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Der in Fig. 2 gezeigte Behälter weist ein Elnlaßröhrchen 3 ähnlicher Dimension wie die des Einlaßröhrchens 2 aus Fig. 1 und eine rohrförraige Reaktionskainmer 4 von etwas größerem Durchmesser als dem der Reaktionskammer 1. Auch sein Fassungsvermögen ist nicht größer als 1,OACl. Das Einlaßröhrchen 3: ist mit der Reaktionskainmer 4 durch einen Ring 5 verbunden, welcher an dem Einlaßröhrchen und der Kammer anhaftet und eine flüssigkeitsdichte Verbindung zwischen diesen darstellt. Mit dem gegenüberliegenden Ende der Reaktionskainmer 4 ist ein Auslaßröhrchen 6 von ähnlichen Dimensionen wiedenendes Einlaßröhrchens 3 verbunden und in gleicher Weise durch einen Ring 7 an diesem Ende der Reaktionskainmer 4 befestigt. Das Einlaßröhrchen 3 besteht aus einem durchscheinenden, nicht benetzbaren Kunststoff, während die Kammer 4 und das Auslaßröhrchen 6 aus einem ebenfalls durchscheinenden ,aber benetzbaren Kunststoff hergestellt ist. Die Ringe 5 und 7 können aus einem geeigneten transparenten Kunststoff gefertigt sein, welcher dem des Einlaßröhrchens oder dem der Kammer entspricht.

Der Behälter gemäß Fig. 3 besteht aus einem durchscheinenden, nicht benetzbaren Einlaßröhrchen 8, ähnlich den Einlaßröhrchen 2 und 3, welches mit einem rohrförmigen Reaktionsbehälter 9 durch einen Ring 1o in ähnlicher Weise wie das Einlaßröhrchen 3 aus Fig. 2 flüssigkeitsdicht verbunden ist. Ähnlich der vorhergehenden Ausführung ist die rohrförmige Reaktionskainmer 9 aus einem transparenten, benetzbaren Kunststoff hergestellt und hat ein Fassungsvermögen von nicht mehr als 2om/, An ihrem oberen Ende ist die Kammer 9 in einer Längsbohrung eines transparenten Röhrchens

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befestigt, welche einen inneren Durchmesser aufweist, welcher im wesentlichen den äußeren Durchmesser der Kammer 9 entspricht, und welche als zweite rohrförmige Reaktionskammer dient. An ihrem oberen Ende ist die Kammer H durch einen Ring 12 eingeschnürt, welcher als Flüssigkeitsdichtung zwischen dem Behälter und der in die Bohrung des Ringes 12 einer Spritze eingesetzt ist. Die Kammer 11 und der Ring 12 können aus dem gleichen transparenten und benetzbaren Werkstoff wie die Kammer 9 hergestellt sein.

Die Eig. 4 und 5 zeigen eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Einführung abgemessener Volumina von flüssigen Reagenzien oder Proben in Mengen von Mikrolitern in eine Vielzahl von Miniatur-Reaktions-Behältern gemäß der Erfindung. Die Vorrichtung besteht aus einer Grundplatte 14 mit zueinander parallelen Führungsleisten 15, welche sich voneinander gegenüberliegenden Seiten der Grundplatte: erstrecken. Aus den Führungsleisten 15 ragen zwei Ständer 16 auf, welche mit auf diesen gleitenden Rohren 17 ausgestattet sind, an welchen drei horizontale Querträger 18,19,2o befestigt sind. Diese Querträger sind mit den Rohren 17 durch Klemmschrauben 21 einstellbar verbunden.

Der untere Querträger 18 weist eine Reihe von acht Bohrungen 22 auf, welche in einheitlichen Abständen entlang dem Mittelteil des Querträgers angeordnet sind und die Einlaßröhrchen 2 von acht Miniatur-Rekations-Behältern 23 aufnehmen, so daß der Querträger die Behälter aufrecht in einer Reihe und in einheitlichem Abstand zueinander festhält. Der Abstand der Behälter ist derartig, daß

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die Einlaßröhrchen der Behälter in die entsprechenden Behältnisse 24 einer Reihe solcher Behältnisse auf einer Mikrotestplatte 25 eingetaucht werden können, welche auf der Grundplatte 14 zwischen den Führungsleisten 15 verschieblich geführt ist. Zweckmäßigerweise ist die Mikrotestplatte in einer vorbestimmten Position auf einem nicht dargestellten Träger befestigt und zwischen den Führungsleisten 15 verschieblich geführt, wobei sie derartig schrittweise beweglich ist, daß die Reihen der Behältnisse in der Platte 25 nacheinander unter den Einlaßröhrchen 2 positioniert werden.

Zwischen den Querträgern 19 und 2o sind mit Abständen entsprechend denen der Reaktionsbehälter 23 acht Spritzen 26 befestigt. Dafür ist der mittlere Querträger 19 mit einer Reihe von mit den Bohrungen 22 des unteren Querträgers 18 koaxial ausgerichteten Bohrungen 27 versehen, um die Hohlnadeln 28 der Spritzen 26 aufzunehmen, wobei die Hohlnadeln 28 durch den Querträger 19 hindurchragen und mit den oberen Enden der Reaktionsbehälter 23 verbunden sind. Die Bohrungen 27 sind bei 29 angesenkt, so daß sie Aufnahme-Sitze für die unteren Enden der Spritzen 26 bilden. An ihren oberen Enden ragen die Spritzen 26 durch Bohrungen 3o in den oberen Querträger 2o und sind an ihren oberen Enden mit zwischen der Oberfläche des Querträgers 2o und einer an diesem mit Schrauben befestigten Abschlußplatte 32 eingeklemmt. Die Kolben 33 der Sptitzen 26 ragen durch entsprechende Bohrungen 34 in die Abschlußplatte 32 und sind mit ihren an den oberen Enden befindlichen scheibenförmigen Köpfen 35 zwischen zwei Halteplatten 36 und 37 mit Schrauben befestigt. Die untere Halteplatte 37 hat

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einen herausragenden Halter 38, welcher an einer senkrechten Zahnstange 39 eines handbetätigten, an der Vorderseite des Querträgers 2o angebrachten Sperrgetriebes 4o angeordnet ist. Das Sperrgetriebe 4o wird mittels einer Drucktaste 41 betätigt, wobei jedes Niederdrücken derselben eine Aufwärtsbewegung des Sperrgetriebes 4o um einen Zahn oder Schritt und Herausziehen der Kolben 33 um einen bestimmten Hub und damit ein Einsaugen \ eines abgemessenen Volumens einer Flüssigkeit in jeden Reaktionsbehälter 23 bewirkt. In einem Beispiel zieht jedes Nieder- _;

drücken der Drucktaste 41 jeden Kolben 33 um einen Volumenbetrag von 1 /Ul zurück.

Die Reaktionsbehälter 23 können entsprechend jeder der in den !

Figuren .!..bis 3 gezeigten Konstruktionen ausgeführt sein. In !

Fig. 4 sind sie jedoch beispielsweise entsprechend der Fig. 1 ι ausgebildet. Die Hohlnadeln 28 der Spritzen 26 stecken flüssigkeitsdicht unmittelbar in den oberen offenen Enden der Reaktionskammern 1 dieser Reaktionsbehälter 23. Letztere können in der Weise vorbehandelt sein, daß sie ein adhäsiv mit den Innenflächen ihrer Reaktionskammern 1 verbundenes Reagenz, wie beispielsweise ein Enzymsubstrat, beinhalten.

Zwecks Herbeiführung einer Probenreaktion werden die Tragrohre 17 von Hand an den Ständern 16 auf und ab bewegt, um die Einlaßröhrchen 2 der Reaktionsbehälter 23 in verschiedene Reihen von das flüssige Reagenz oder die Probe enthaltenden Behältnissen 24 in der Mikrotestplatte 14 einzutauchen,wobei, wenn die Ein-

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laßröhrchen 2 in das Reagenz oder die Probe: eingetaucht sind, die Drucktaste 41 heruntergedrückt wird, um die Kolben 33 zu betätigen und ein genau bemessenes Volumen eines Reagenz oder einer Probe in einer Menge von einem oder mehreren Mikrolitern in die Einlaßröhrchen 2 der Reaktionsbehälter 23 einzusaugen. Auf diesem Wege können beispielsweise 2/iß Wasser und *\jU£ einer Pufferflüssigkeit in jedes Einlaßröhrchen 2 der Reaktionsbehälter 23 eingebracht werden. Wenn die Einlaßröhrchen 2 in die Behältnisse 24 eingetaucht sind, stoßen die unteren Enden der Tragrohre 17 an die Führungsleisten 15, um die Eintauchtiefe der Einlaßröhrchen 2 zu begrenzen. Die Tragrohre 17 haben gegenüber den Ständern 16 Schiebesitz.

Nach dem Einbringen der Probe in die Einlaßröhrchen 2 und Herausnehmen derselben aus der Probenflüssigkeit wird die Drucktaste 41 erneut mehrmals betätigt, um die Kolben 33 der Spritzen 26 weiter herauszuziehen und die Reagenzien nacheinander in die Reaktionsbehälter 23 einzusaugen, wo die Reagenzien miteinander gemischt werden. Durch eine geregelte Betätigung der Drucktaste 41 können die Reagenzien entweder in einer Etappe oder in bestimmten Intervallen in die Reaktionskammern 1 eingesogen werden. Um den Mischprozeß zu unterstützen, können die Kolben 33 durch manuelle Bewegung der Zahnstange 39 auf-und abgeschüttelt werden. Das Sperrgetriebe 4o kann automatisch entsperrt werden, wenn die Zahnstange 39 von Hand geschoben oder gezogen wird, wodurch das Schütteln der Kolben 33 ermöglicht wird. Danach werden die Einlaßröhrchen 2 durch Einsaugen von flüssigem Paraffinwachs in die unteren Enden der Röhrchen verschlossen, was in gleicher Weise wie das Einsaugen der Reagenzien geschieht, worauf die ganze

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Einrichtung aus Tragrohren 17, Querträgern 18,19 und 2o, Reaktionsbehältern 23 und Spritzen 26 von den Ständern 16 abgezogen und in einem Brutapparat verbracht wird, wo die Reaktionsbehälter 23 bei einer gewünschten Temperatur bebrütet werden. Nach der Bebrütung werden die Einlaßröhrchen 2 oberhalb des Verschlusses gekappt und die Inhalte mittels der Spritzen in eine Pufferflüssigkeit ausgedrückt, welche durch eine geeignete Technik, z.B. durch Fluorimetrie, geprüft wird. Die Reaktionsbehälter 23 werden darauf der Einrichtung entnommen, und diese kann, da keines der Reagenzien oder keine der Proben in die Spritzen 26 gelangt ist, ohne das Erfordernis einer Reinigung wieder verwendet werden.

Die oben beschriebene Vorrichtung kann auch für eine Vorbehandlung der Reaktionsbehälter 23 benutzt werden, um ein Reagenz mit den Innenflächen der Reaktionskammer 1 adhäsiv oder chemisch zu verbinden. Das geschieht durch Befestigen der Reaktionsbehälter 23 mit ihren an den Hohlnadeln 28 der Spritzen 26 angebrachten oberen Enden an den Querträger 18 und Aufschieben der Einrichtung auf die Ständer 16, um die Einlaßröhrchen 2 in eine Lösung oder Dispersion des erforderlichen Reagenz einzutauchen, welches sich entweder in den Behältnissen 24 einer Mikrotestplatte 25 oder einem Behälter befindet. Das Sperrgetriebe 4o wird dann betätigt, damit die benötigten Mikrolitermengen des Reagenz in jedes Einlaßröhrchen 2 eingesogen wird, worauf letztere aus dem Reagenz herausgenommen werden und das Sperrgetriebe erneut betätigt wird, um abgemessene Volumina eines Reagenz in die Reaktionskammern 1 einzusaugen. Die Reaktionsbehälter 23 werden dann aus dem Querträger 18 herausgenommen und behandelt, wobei beispielsweise die Reagenzien gefrier-

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getrocknet und die Lösungen mit den Innenseiten der Reaktionsbehälter 23 adhäsiv verbunden werden. Alternativ kann das Reagenz durch Kovalenzbindung mit den Innenflächen der Reaktionskammern 1 verbunden werden, wenn diese aus einem geeigneten Werkstoff, beispielsweise Nylon, gefertigt sind. Auf diese Art und Weise können vorbehandelte Reaktionsbehälter für den Gebrauch in verschiedenen Probenreaktionen in Mengen hergestellt werden.

Im folgenden wird als Beispiel eine Untersuchung einer Enzymaktivität (fS-N-acetyl-D-glucosamina-dase^EC.3.21.3o)vorgenommen, welche unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Reaktionsbehälters 23 durchgeführt werden kann:

(i) Der Reaktionsbehälter 23 (dessen Reaktionskammer 1 mit ji^yj-Methylumbelliferyl 2-acetamido-2-deoxy-j3-D-glucoside gefüllt ist) wird an einer Spritze 26 befestigt.

(ii) Dreimal 2JHl Wasser und einmal 2*/U/> eines o,25M eines Zitronensäurepuffers, pH-Wert 4,3 sind (ohne Luftzwischenräume) in die Reaktionskammer 1 eingemessen und verbleiben dortfbis das Substrat aufgelöst ist.

(iii) Binmal 2Ml der Enymlösung werden in die Reaktionskammer ] eingemessen und die Mischung schnell in den Reaktionsbereich verbracht und durch geringe Auf- und Abwärtsbewegungen der Kolben 33 der Spitzen 26 gemischt.

(iv) Einmal 2jU£ flüssigen Paraffinwaches wird dem Einlaßröhr chen 2 zugeführt und der Reaktionsbehälter 23 bei 130008/0579

- 28 37° Celsius bebrütet.

(ν) Nach der Bebrütung wird das Einlaßröhrchen an einem Punkt oderhalb des erstarrten Paraffinwaches gekappt und der Inhalt der Reaktionskammer 1 in 2ooill eines o,2 H - Glycin-Puffers, pH-Wert 1o,3, entleert.

(vi) Die Glycinlösung wird auf _: Vorhandensein von 4-Methyllumbelliferen durch fluorimetrische Mittel getestet.

Während besondere Ausführungen beschrieben wurden, wird darauf hingewiesen, daß Modifikationen und Veränderungen vorgenommen werden können, ohne daß der Rahmen der in den Ansprüchen definierten Erfindung verlassen wird.

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Claims

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Dipl^ng. Thomas Wicken Mueterbehn 1-2400 Lübeck!

Anmelder: DYNATECH AG, Gartenstraße 2, 63oo Zug, Schweiz

Patentansprüche

1τ Miniatur-Reaktions-Behälter, gekennzeichnet durch eine rohrförmige Reaktionskamroer (1,4,9) mit einem an einem Ende der Kammer und im wesentlichen koaxial zu dieser angeordneten Einlaßröhrchen (2,3,8), welches einen kleineren Durchmesser aufweist als die Reaktionskammer (1,4,9) und welches als Haarröhrchen aus nicht benetzbarem Werkstoff ausgebildet ist.

2. Behälter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das

Volumen der Reaktionskammer (1,4,9) nicht größer als 3oa/ ist.

3. Behälter nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer (4) ein zu dieser koaxial angeordnetes Auslaßröhrchen (6) aufweist, welches sich von dem anderen Ende der Reaktionskammer (4) erstreckt.

4. Behälter nach den Ansprüchen 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer (4) mit zwischen ihren Enden befindlichen Einschnürungen versehen ist, welche sie in zwei oder mehr Reaktionsräume aufteilen.

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ORIGINAL INSPECTED

5. Behälter nach den Ansprüchen 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß dieser eine zweite Reaktionskammer (11) aufweist, welche gegenüber dem mit dem Einlaßröhrchen (8) versehenen Ende der ersten Reaktionskamraer (9) verbunden ist und einen größeren Durchmesser aufweist als die erste (9).

6. Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Einlaßröhrchen (8) sowie die Reaktionskammern (9 u. 11) aus einem durchscheinenden, nicht benetzenden Kunststoff wie Polythen oder Polyvinylchlorid besteht.

7. Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet, durch mindestens ein Reagenz, welches mit der Innenfläche mindestens einer Reaktionskammer (9 oder 11) adhäsiv oder chemisch verbunden ist.

8. Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von Reagenzien, welche mit der Innenfläche der bzw. mindestens einer Reaktionskammer (9 u./o. 11) in verschiedenen Bereichen ihrer Länge adhäsiv oder chemisch verbunden sind.

9. Verfahren zum Einbringen eines Mikro-Volumens eines flüssigen Reagenz.oder ähnlichein in einen Reaktionsbehälter (23) entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte ;

lintauchen des Einlaßröhrchens (2,3,8) des Reaktionsbehälters in die Flüssigkeit^

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Erzeugen eines Unterdruckes an dem gegenüber dem mit dem Einlaßröhrchen (2,3,8) verbundenen Ende der Reaktionskarnmer (1,4,9) zwecks Einsaugen eines Mikro-Volumens einer Flüssigkeit in das Einlaßröhrchen (2,3,8) und Ausbildung einer zusammenhängenden Flüssigkeitssäule in diesen;

Herausnehmen des Einlaßröhrchens (2,3,8) aus der Flüssigkeit und

erneutes Erzeugen eines Unterdruckes zwecks Einsaugen der Flüssigkeit in die Reaktionskammer (1,4,9) des Reaktionsbehälters (23) .

1o. Verfahren zum gleichzeitigen Einbringen von Mikro-Volumina eines flüssigen Reagenz oder ähnlichem in eine Vielzahl von Reaktionsbehältern (23) entsprechend einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch die Verfahreneschritte:

Bereitstellung der Reaktionsbehälter (23) im wesentlichen aufrecht in einer vorbestimmten Ordnung;

gleichzeitiges Eintauchen der Einlaßröhrchen (2,3,8) der Reaktionsbehälter (23) in die Flüssigkeit/

gleichzeitiges Erzeugen eines Unterdruckes an den den Einlaßröhrchen (2,3,8) gegenüberliegenden Enden der Reak-

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tionskammern (1,4,9) zwecks Einsaugen von Mikro-Volumina der Flüssigkeit in die Einlaßröhrchen (2,3,8) und Ausbildung von zusammenhängenden Flüssigkeitssäulen in diesen.

Gleichzeitiges Herausnehmen der Einlaßröhrchen (2,3,8) aus der Flüssigkeit und

gleichzeitiges erneutes Erzeugen eines Unterdruckes in den Reaktionskammern (1,4,9), um die Flüssigkeitssäulen in diese Reaktionskammern einzusaugen.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 oder 1o, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit eine Lösung oder Dispersion eines ersten Reagenz enthält, welches mit der bzw. den Innenflächen des bzw. der Reaktionskammern (1,4,9) des bzw. der Behälter durch Gefriertrocknung oder chemische Bindung verbunden ist.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9,1 ο oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem ersten Verfahrensschritt - Einsaugen des ersten flüssigen- Reagenz oder ähnlichem in das bzw. die Einlaßröhrchen (2,3,8) - letztere nacheinander in eine oder mehrere weitere Flüssigkeiten eingetaucht werden, wobei bei jedem Eintauchen die Reaktionskammern (1,4,9) mit Unterdruck beaufschlagt werden, um ein Mikro-Volumen aus der bzw. den Flüssigkeiten in das bzw. die Einlaßröhrchen (2,3,8) einzusaugen, und danach dieser Vorgang wiederholt wird, um weitere Flüssigkeit bzw. Flüssigkeiten

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In die Reaktionskammer bzw. - kammern (1,4,9) zwecks Vermischung mit dem ersten Reagenz einzusaugen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der bzw. die Behälter zwei oder mehrere Reaktionsbereiche oder - kammern aufweisen, daß das in dem ersten Bereich oder ersten Kammer erzeugte Reaktionsgemisch als zusammenhängende Flüssigkeitssäule aus diesem ersten Bereich in einen zweiten gesaugt und eine zweite Reaktion .in diesem zweiten Bereich herbeigeführt wird.

14.Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Einlaßröhrchen (2,3,8), nachdem das bzw. die Reaktionsgemische in dem bzw. den Behältern erzeugt wurden, und auch ,das gegenüberliegende Ende des Behälters verschlossen werden, daß dasReaktionsgemisch in dem Behälter bebrütet und danach das Einlaßröhrchen (2,3,8) zwecks öffnen des Verschlusses gekappt wird und daß da.s bebrühtete Reaktionsgemisch aus dem Behälter in ein Behältnis (24) ausgedrückt und eine Probe genommen wird.

15.Vorrichtung zum gleichzeitigen Einbringen von Mikro-Voluminä eines flüssigen Reagenz oder ähnlichem in eine Vielzahl von in vorbestimmter Ordnung angeordneten Reaktionsbehältern (23) nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch Haltemittel (18) für die Fixierung der Behälter in der vorbestimmten Ordnung mit ihren Einlaßröhrchen (2) nach unten weisend, wobei die Haltemittel (18) beweglich

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sind, um die Einlaßröhrchen (2) der Behälter gleichzeitig in ein oder mehrere Flüssigkeit enthaltende, unter den Haltemitteln befindliche Behältnisse (24) einzutauchen, durch Mittel (26) zur gleichzeitigen Beaufschlagung der den mit den Einlaßröhrchen (2) versehenen Enden der Behälter gegenüberliegenden Behälterenden mit Unterdruck, um jeweils ein vorbestimmtes Mikro-Volumen einer Flüssigkeit aus dem bzw. den Behältnissen (24) in das Einlaßröhrchen (2) jedes Behälters einzusaugen.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß die Mittel (26) zum Erzeugen des Unterdruckes aus Spritzen bestehen, welche in einer bestimmten, der Ordnung der Behälter entsprechenden Ordnung aufgestellt sind, wobei die Spritzen flüssigkeitsdicht angeordnete Hohlnadeln (28) aufweisen, welche an dem dem Einlaßröhrchen (2) gegenüberliegenden Ende der Reaktionsbehälter angeordnet sind und miteinander gekoppelte Kolben (33) aufweisen, welche gleichzeitig beweglich sind, um ein Mikro-Volumen der Flüssigkeit in das Einlaßröhrchen (2) jedes Behälters einzusaugen.

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