JP6547625B2 - 膜小胞回収デバイス、膜小胞回収方法、及び膜小胞分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学、生化学、生物工学、医学、及び医療分野における膜小胞体の分離及びその分析に係る器具及び方法に関する。
本願は、２０１３年１０月２５日に日本に出願された特願２０１３−２２２７５１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１３年１０月２５日に日本に出願された特願２０１３−２２２７５１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
従来、細胞、細胞小器官等の生体由来の膜小胞、人工の膜小胞など、脂質二重膜により覆われた構造体において、この構造体の内容物や、脂質二重膜上に保持された物質等に対する分析が行われている。
近年、細胞間情報伝達の方法として、脂質二重膜を有する小胞であるエキソソームによる方法が注目されている。
エキソソームは、蛋白質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡなどを内部に包含し、細胞間を移動することにより移動先の細胞に情報を伝達できることが知られた膜小胞である。例えば、がん細胞由来のマイクロＲＮＡを含むエキソソームを受容した細胞において、免疫機能が活性化したり、転移能を獲得したりすることが知られている。
エキソソームは、蛋白質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡなどを内部に包含し、細胞間を移動することにより移動先の細胞に情報を伝達できることが知られた膜小胞である。例えば、がん細胞由来のマイクロＲＮＡを含むエキソソームを受容した細胞において、免疫機能が活性化したり、転移能を獲得したりすることが知られている。
エキソソームには、エキソソームを放出した細胞が保持する遺伝情報その他のシグナル因子に加え、このエキソソームを受容した他の細胞の機能を制御し得る因子が含まれている。そのため、エキソソームは、疾患を診断するための新たなバイオマーカーソースとして活用できると考えられている。
たとえば、特許文献１、３には、エキソソーム内のｍｉＲＮＡを分析し、がん又は有害な妊娠転帰を診断することが開示されている。
特許文献２には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ治療薬による治療の効率を決定するために各ＲＮＡを測定することが開示されている。
特許文献４には、心血管系イベントを発症するリスクの指標となる蛋白質マーカーを検出することが開示されている。
特許文献５には、免疫反応性の自己抗体のレベルを測定し、がんや不妊症など自己抗体産生に関連する疾患を診断することが開示されている。
特許文献６には、尿中エキソソームのアクアポリン１を測定することにより小胞体ストレス応答および該応答に関連する腎疾患を検出することが開示されている。
たとえば、特許文献１、３には、エキソソーム内のｍｉＲＮＡを分析し、がん又は有害な妊娠転帰を診断することが開示されている。
特許文献２には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ治療薬による治療の効率を決定するために各ＲＮＡを測定することが開示されている。
特許文献４には、心血管系イベントを発症するリスクの指標となる蛋白質マーカーを検出することが開示されている。
特許文献５には、免疫反応性の自己抗体のレベルを測定し、がんや不妊症など自己抗体産生に関連する疾患を診断することが開示されている。
特許文献６には、尿中エキソソームのアクアポリン１を測定することにより小胞体ストレス応答および該応答に関連する腎疾患を検出することが開示されている。
エキソソームは、エキソソームを含み得る試料から、超遠心分離や密度勾配超遠心分離など、密度差による分離によって分離し、調製することができる。また、特許文献７や特許文献８に記載された方法によってもエキソソームの分離ができる。また、エキソソームを分離精製するキットが市販されている（たとえば、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＥｘｏＱｕｉｃｋ、Ｌｉｆｅ、あるいは、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎなど）。
たとえばエキソソームを遠心分離により分離する場合、分離されたエキソソームへのエキソソーム以外の夾雑物の混入が避けられず、分析精度及び再現性の向上には限界がある。
また、超遠心分離や密度勾配超遠心分離などは、エキソソームを分離するための作業手順が煩雑であり且つ分離精製に長時間を要する。
また、エキソソームを簡便に分離する従来の分離キットは、エキソソームの精製が不十分で分析の信頼性に劣る。
また、超遠心分離や密度勾配超遠心分離などは、エキソソームを分離するための作業手順が煩雑であり且つ分離精製に長時間を要する。
また、エキソソームを簡便に分離する従来の分離キットは、エキソソームの精製が不十分で分析の信頼性に劣る。
ところで、エキソソームの脂質二重膜に存在するテトラスパニンを利用してエキソソームを選択的に分離精製することも知られている。テトラスパニンは、たとえばヒトにおいては３３種類のメンバーが知られている膜４回貫通型膜タンパクファミリーである。特に、ＣＤ９，ＣＤ６３，ＣＤ８１は、エキソソームマーカーとして知られている。しかしながら、抗テトラスパニンモノクローナル抗体を用いてエキソソームを分離精製する場合、分離対象とする抗原の種類によって、最終的に分離精製されるエキソソームに偏りが生じることがある。
また、エキソソームを分析するためにエキソソームの膜構造を破壊することがあるが、この場合、エキソソームの内容物はエキソソームの破壊過程で希釈されてしまう。希釈された状態のエキソソームを破壊することによって得られる産物を濃縮しようとすると、濃縮過程で変性したり失われたりする成分があり得るので、濃縮は困難である。また、エキソソームの蛋白質を解析対象とする場合、核酸と異なり解析対象の蛋白質をin vitroで増幅することができないので、できるだけ希釈せずにエキソソームの分析をすることが求められている。
また、エキソソームを分析するためにエキソソームの膜構造を破壊することがあるが、この場合、エキソソームの内容物はエキソソームの破壊過程で希釈されてしまう。希釈された状態のエキソソームを破壊することによって得られる産物を濃縮しようとすると、濃縮過程で変性したり失われたりする成分があり得るので、濃縮は困難である。また、エキソソームの蛋白質を解析対象とする場合、核酸と異なり解析対象の蛋白質をin vitroで増幅することができないので、できるだけ希釈せずにエキソソームの分析をすることが求められている。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、膜小胞が破壊されず膜小胞の構成要素が希釈されにくく膜小胞を選択的に回収可能な膜小胞回収デバイス及び膜小胞回収方法、並びに簡便で精度及び再現性に優れる膜小胞分析方法の提供である。
本発明の第一態様に係る膜小胞回収デバイスは、液性の充填物と、前記充填物が接する状態で前記充填物を保持可能な複数の保持部が形成された表面を有する反応基体と、複数の前記保持部の各々において、前記充填物の外周を、前記充填物が前記保持部に接する部位を除いて覆う脂質二重膜を有する融合膜と、を備え、前記充填物は、複数の前記保持部の各々において、前記保持部および前記融合膜に覆われており、膜小胞と前記融合膜とが融合することにより前記膜小胞の内容物が前記充填物に混合される。
上記第一態様において、前記保持部は前記反応基体に形成された凹部であり、前記融合膜は、前記凹部において前記表面と前記凹部との境界を形成する開口端に接し、前記凹部を塞ぐように前記反応基体に設けられ、前記充填物は前記凹部内に充填されていてもよい。
上記第一態様において、前記融合膜は、前記凹部の内壁面のうち前記開口端に沿う部分に結合され前記複数の凹部の各々を個別に塞ぐように前記反応基体に複数設けられていてもよい。
上記第一態様において、前記反応基体は少なくとも前記内壁面が疎水性であり、前記融合膜の疎水部と前記内壁面とが結合していてもよい。
上記第一態様において、前記融合膜は、前記表面に沿う面状に形成され、前記複数の凹部を塞ぐ一続きの膜状に形成されていてもよい。
上記第一態様において、前記融合膜は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞と前記融合膜との膜融合を促進する膜電荷調整物質を含んでもよい。
上記第一態様において、前記膜電荷調整物質は、膜破壊性ペプチド、膜融合性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、及びウィルス由来膜融合蛋白質のうち少なくとも１つを含んでもよい。
上記第一態様において、前記充填物は、溶媒と、前記溶媒に含まれる生化学分析用反応試薬と、を含んでもよい。
上記第一態様において、前記生化学分析用反応試薬はｐＨ指示薬を含んでもよい。
上記第一態様において、前記充填物はゲルあるいはゾルであってもよい。
上記第一態様に係る膜小胞回収デバイスは、複数の親水部および前記親水部を囲む疎水部が形成された表面を有する反応基体をさらに備え、前記充填物は前記親水部に設けられ、前記融合膜は、前記親水部と前記疎水部との境界において前記疎水部に結合して前記充填物を包んでいてもよい。
本発明の第二態様に係る膜小胞回収方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞を上記第一態様に係る膜小胞回収デバイスに回収する膜小胞回収方法であって、前記膜小胞を含む試料を前記融合膜に接触させて前記融合膜と前記膜小胞とを膜融合させる。
上記第二態様において、前記試料を酸性にするｐＨ調整剤を前記試料に添加した後に酸性の前記試料を前記融合膜に接触させてもよい。
本発明の第三態様に係る膜小胞分析方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞の内容物、膜蛋白質、若しくは膜脂質を分析する膜小胞分析方法であって、上記第一態様に係る膜小胞回収デバイスの前記融合膜に前記膜小胞を融合させ、前記膜小胞上の前記膜蛋白質若しくは前記膜脂質を前記融合膜において保持する。
本発明の第四態様に係る膜小胞分析方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞の内容物、膜蛋白質、若しくは膜脂質を分析する膜小胞分析方法であって、上記第一態様に係る膜小胞回収デバイスの前記融合膜に前記膜小胞を融合させ、前記充填物内で前記膜小胞の内容物、膜蛋白質、若しくは膜脂質と前記生化学分析用反応試薬と反応させる。
上記第一態様に係る膜小胞回収デバイスを用いた膜小胞分析方法、若しくは上記第四態様に係る膜小胞分析方法において、前記生化学分析用反応試薬は、核酸分析試薬、インベーダー反応試薬、蛋白質分析試薬、脂質分析試薬、イムノアッセイ試薬、及びホモジニアス抗原抗体反応用試薬のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
本発明の上記各態様によれば、膜小胞の構成要素が希釈されにくく膜小胞を選択的に回収可能な膜小胞回収デバイス及び膜小胞回収方法、並びに簡便で精度及び再現性に優れる膜小胞分析方法を提供することができる。
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態について説明する。図１は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す斜視図である。図２は、図１に符号Ｘで示す部分の拡大図である。図３は、図２のＡ−Ａ線における模式的な断面図である。
本発明の第１実施形態について説明する。図１は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す斜視図である。図２は、図１に符号Ｘで示す部分の拡大図である。図３は、図２のＡ−Ａ線における模式的な断面図である。
図１から図３Ｂに示すように、本実施形態の膜小胞回収デバイス１は、反応基体２と、融合膜５と、充填物８とを備える。
反応基体２は、表面３に複数の凹部４が形成された板状部材である。反応基体２において、凹部４の開口端４ｂと表面３とは疎水性である。本実施形態では、反応基体２はガラスまたはシリコン製である。凹部４となる微細ウェルは、反応基体２の表面がジシラザン処理により疎水性処理された後に、反応基体２の表面に作製されている。本実施形態では、凹部４の内壁面４ａは親水性である。
反応基体２は、表面３に複数の凹部４が形成された板状部材である。反応基体２において、凹部４の開口端４ｂと表面３とは疎水性である。本実施形態では、反応基体２はガラスまたはシリコン製である。凹部４となる微細ウェルは、反応基体２の表面がジシラザン処理により疎水性処理された後に、反応基体２の表面に作製されている。本実施形態では、凹部４の内壁面４ａは親水性である。
融合膜５は、凹部４を塞ぐ脂質二重膜である。すなわち、融合膜５は、反応基体２に近い位置に位置する第一層６と、第一層６上に積層された第二層７とを有する。第一層６と第二層７とは、それぞれ、親水部６ａ，７ａと疎水部６ｂ、７ｂとを有している。融合膜５は、凹部４において反応基体２の表面３と凹部４との境界を形成する開口端４ｂに接している。本実施形態の融合膜５は、凹部４の内壁面４ａのうち凹部４の開口端４ｂに沿う部分に結合されている。また、本実施形態では、複数の凹部４の各々を個別に塞ぐように、複数の融合膜５が反応基体２の凹部４の各々に対して設けられている。
凹部４において、融合膜５の疎水部、凹部４の開口端４ｂ、及び疎水性の表面３が結合している。
凹部４において、融合膜５の疎水部、凹部４の開口端４ｂ、及び疎水性の表面３が結合している。
充填物８は、凹部４に充填された液体である。また、充填物８はゲルあるいはゾルであってもよい。充填物８は、回収対象の膜小胞に対して、変性や分解が起こらない組成を有していることが好ましい。また、充填物８は、回収対象の膜小胞において分析の妨げとなる物質を分解又は不活化するための物質を含んでいてもよい。また、本実施形態では、融合膜５の充填物８と対向する面とは反対の面に水系の溶媒（不図示）が存在する。
次に、本実施形態の膜小胞回収デバイス１の製造方法について説明する。図４から図１２は、膜小胞回収デバイス１の製造工程を説明するための図である。
まず、反応基体２を成形する。反応基体２は、図４に示すように、板状のガラス若しくは板状の樹脂部材からなる母材９に対して、エキソソーム１１等の膜小胞が収納可能な大きさを有する凹部４をアレイ状に配置することにより成形される。凹部４のアレイは、成形型を用いた母材９への転写や、母材９の切削等によって母材９に形成される。
凹部４は、例えば１μｍの直径、１μｍの深さを有する形状であってもよい。
また、母材９が親水性の材料から形成される場合には、凹部４が成形された後に母材９の外面に対して疎水化処理を行う。疎水化処理は、たとえば、母材９の外面に対するジシラザン処理などの表面改質である。
まず、反応基体２を成形する。反応基体２は、図４に示すように、板状のガラス若しくは板状の樹脂部材からなる母材９に対して、エキソソーム１１等の膜小胞が収納可能な大きさを有する凹部４をアレイ状に配置することにより成形される。凹部４のアレイは、成形型を用いた母材９への転写や、母材９の切削等によって母材９に形成される。
凹部４は、例えば１μｍの直径、１μｍの深さを有する形状であってもよい。
また、母材９が親水性の材料から形成される場合には、凹部４が成形された後に母材９の外面に対して疎水化処理を行う。疎水化処理は、たとえば、母材９の外面に対するジシラザン処理などの表面改質である。
次に、図４及び図５に示すように、反応基体２に形成された凹部４内に充填物８を充填する。充填物８は、融合膜５を凹部４に結合させる後述の工程における水槽１００内の液体でもよい。
次に、凹部４を塞ぐ融合膜５を各凹部４に結合させる。融合膜５は、アラキドン酸やステアリン酸などの両親媒性分子を有機溶媒に溶かして図６に示す水槽１００の水面上に展開し、バリアにより分子を圧縮することによって得られる２次元固体膜１０（図７参照）から形成される。この２次元固体膜１０は、脂質二重膜における第一層６及び第二層７を構成する単分子膜である。水面に２次元固体膜１０が形成された状態では、水面に親水部１０ａが接し、疎水部１０ｂは外気に露出される。
融合膜５を反応基体２に結合させるためには、まず、図７に示すように、反応基体２を水槽１００内に保持し、上記の２次元固体膜１０を水面上に形成する。続いて、図８に示すように、水面上の２次元固体膜１０を固体状態に保ったまま、水槽１００中の反応基体２を水槽１００から引き上げる。このとき、反応基体２において凹部４が形成された表面３が鉛直となるように反応基体２を引き上げることで、２次元固体膜１０が、反応基体２の表面３の凹部４を覆うように、反応基体２の表面３に付着する。このとき、図９に示すように、反応基体２に付着した２次元固体膜１０は、融合膜５の第一層６となる。
２次元固体膜１０が凹部４を覆って反応基体２の表面３に付着したあと、再び、図１０に示すように、反応基体２が水槽１００中に挿入される。このとき、水面には、上記の２次元固体膜１０が存在する。
図１１に示すように、反応基体２が水槽１００中に挿入されることにより、水面に形成された２次元固体膜１０の疎水部１０ｂと第一層６の疎水部６ｂとが接し、融合膜５の第二層７が反応基体２の表面３で凹部４を覆うように形成される。
融合膜５の第一層６及び第二層７が反応基体２の表面３に形成された後、図１２に示すように、２次元固体膜１０を水面から除去し、その後膜小胞回収デバイス１を水槽１００から引き上げる。このとき、反応基体２の表面３のうち凹部４でない部分では、融合膜５の第一層６における親水部６ａが疎水性処理をした表面３に対して結合力が弱いことにより、融合膜５の第一層６が表面３から外れる。すると、凹部４の開口端４ｂ近傍の部分と、融合膜５の疎水部６ｂとが結合（図３Ａ参照）する。このため、複数の凹部４は融合膜５によってそれぞれ個別に塞がれる。また、融合膜５の疎水部７ｂは表面３に結合（図３Ｂ参照）した状態となる場合もある。この場合でも、複数の凹部４は塞がれる。
融合膜５を反応基体２に結合させるためには、まず、図７に示すように、反応基体２を水槽１００内に保持し、上記の２次元固体膜１０を水面上に形成する。続いて、図８に示すように、水面上の２次元固体膜１０を固体状態に保ったまま、水槽１００中の反応基体２を水槽１００から引き上げる。このとき、反応基体２において凹部４が形成された表面３が鉛直となるように反応基体２を引き上げることで、２次元固体膜１０が、反応基体２の表面３の凹部４を覆うように、反応基体２の表面３に付着する。このとき、図９に示すように、反応基体２に付着した２次元固体膜１０は、融合膜５の第一層６となる。
２次元固体膜１０が凹部４を覆って反応基体２の表面３に付着したあと、再び、図１０に示すように、反応基体２が水槽１００中に挿入される。このとき、水面には、上記の２次元固体膜１０が存在する。
図１１に示すように、反応基体２が水槽１００中に挿入されることにより、水面に形成された２次元固体膜１０の疎水部１０ｂと第一層６の疎水部６ｂとが接し、融合膜５の第二層７が反応基体２の表面３で凹部４を覆うように形成される。
融合膜５の第一層６及び第二層７が反応基体２の表面３に形成された後、図１２に示すように、２次元固体膜１０を水面から除去し、その後膜小胞回収デバイス１を水槽１００から引き上げる。このとき、反応基体２の表面３のうち凹部４でない部分では、融合膜５の第一層６における親水部６ａが疎水性処理をした表面３に対して結合力が弱いことにより、融合膜５の第一層６が表面３から外れる。すると、凹部４の開口端４ｂ近傍の部分と、融合膜５の疎水部６ｂとが結合（図３Ａ参照）する。このため、複数の凹部４は融合膜５によってそれぞれ個別に塞がれる。また、融合膜５の疎水部７ｂは表面３に結合（図３Ｂ参照）した状態となる場合もある。この場合でも、複数の凹部４は塞がれる。
本実施形態における反応基体２が持つ凹部４は垂直方向でなくてもよい。たとえば図１３に示すように反応基体２の面方向に対して凹部４が水平方向に形成されていてもよい。
すなわち、反応基体２は、凹部４が形成された中間層２Ａと、中間層２Ａを間に挟む一対の外層２Ｂとを有し、中間層２Ａに形成された凹部４に融合膜５が形成されていてもよい。このとき、反応基体２に設ける脂質二重膜の形成方法としては、上記の方法によるほか、日本国特開２００９−１２８２０６号公報に記載される方法などが利用できる。
すなわち、反応基体２は、凹部４が形成された中間層２Ａと、中間層２Ａを間に挟む一対の外層２Ｂとを有し、中間層２Ａに形成された凹部４に融合膜５が形成されていてもよい。このとき、反応基体２に設ける脂質二重膜の形成方法としては、上記の方法によるほか、日本国特開２００９−１２８２０６号公報に記載される方法などが利用できる。
また、本実施形態における反応基体２は凹部４を持たなくてもよい。例えば、凹部４に代えて、たとえば図１４Ａあるいは図１４Ｂに示すように平面上に親水部４Ａと疎水部４Ｂとを持っていてもよい。この場合、親水部４Ａが上記の凹部４として機能する。すなわち、親水性の親水部４Ａには充填物８が留まり、充填物８を包むように融合膜５が設けられ、融合膜５は親水部４Ａと疎水部４Ｂとの境界近傍において疎水部４Ｂに結合している。
このような構成の器具は、たとえば、日本国特開２００９−１２８２０６号公報に記載の方法により平面上に設けられた液滴表面に脂質二重膜を形成することで製造し得る。具体的には、図１４Ａ及び図１４Ｂに示す外層２Ｂの間に充填物８を流し込んだあと、脂質溶液入りの有機溶媒を流し込み、最後に溶解物を含まない緩衝液を流し込む。これによって、充填物８の外面を覆う脂質二重膜から形成される融合膜５を形成できる。この際、融合膜５は、反応基体２の疎水部４Ｂの疎水度、溶質の種類により図１４Ａ若しくは図１４Ｂに示すいずれかの形状をとる。
このような構成の器具は、たとえば、日本国特開２００９−１２８２０６号公報に記載の方法により平面上に設けられた液滴表面に脂質二重膜を形成することで製造し得る。具体的には、図１４Ａ及び図１４Ｂに示す外層２Ｂの間に充填物８を流し込んだあと、脂質溶液入りの有機溶媒を流し込み、最後に溶解物を含まない緩衝液を流し込む。これによって、充填物８の外面を覆う脂質二重膜から形成される融合膜５を形成できる。この際、融合膜５は、反応基体２の疎水部４Ｂの疎水度、溶質の種類により図１４Ａ若しくは図１４Ｂに示すいずれかの形状をとる。
次に、本実施形態の膜小胞回収デバイス１を用いた膜小胞回収方法について説明する。
図１５から図１７は、膜小胞回収デバイス１を使用した膜小胞回収方法を説明するための図である。
本実施形態の膜小胞回収方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞を本実施形態の膜小胞回収デバイス１に回収する膜小胞回収方法である。
本実施形態においては、膜小胞の回収の例として、エキソソーム１１を回収する例を示す。
図１５から図１７は、膜小胞回収デバイス１を使用した膜小胞回収方法を説明するための図である。
本実施形態の膜小胞回収方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞を本実施形態の膜小胞回収デバイス１に回収する膜小胞回収方法である。
本実施形態においては、膜小胞の回収の例として、エキソソーム１１を回収する例を示す。
まず、エキソソーム１１を含み得る試料を調製する。エキソソーム１１を含み得る試料は、たとえば、体液や、培養細胞の培養上清であってよい。また、人工的に調製したリポソームを含む溶液を試料であってもよい。
続いて、図１５及び図１６に示すように、試料を融合膜５に接触させて融合膜５とエキソソーム１１とを膜融合させる。
凹部４がアレイ状に配置された反応基体２においては、各凹部４を塞ぐ脂質二重膜から形成される融合膜５が各凹部４の内壁面４ａ（図３Ａ及び図３Ｂ参照）に結合している。このため、エキソソーム１１などの膜小胞が融合膜５に近接すると、膜融合を経て、エキソソーム１１などの膜小胞の内容物が凹部４の内部へ移動する（図１７参照）。膜小胞の内容物が凹部４の内部へ移動する過程において、エキソソーム１１の内部と凹部４の内部が連通した状態で、エキソソーム１１の内部と外界とは脂質二重膜により仕切られている。このため、エキソソーム１１の内容物は外界へは拡散せず、エキソソーム１１の融合後、凹部４は、エキソソーム１１の内容物が収容されて脂質二重膜で塞がれ閉ざされた容器となる。
凹部４がアレイ状に配置された反応基体２においては、各凹部４を塞ぐ脂質二重膜から形成される融合膜５が各凹部４の内壁面４ａ（図３Ａ及び図３Ｂ参照）に結合している。このため、エキソソーム１１などの膜小胞が融合膜５に近接すると、膜融合を経て、エキソソーム１１などの膜小胞の内容物が凹部４の内部へ移動する（図１７参照）。膜小胞の内容物が凹部４の内部へ移動する過程において、エキソソーム１１の内部と凹部４の内部が連通した状態で、エキソソーム１１の内部と外界とは脂質二重膜により仕切られている。このため、エキソソーム１１の内容物は外界へは拡散せず、エキソソーム１１の融合後、凹部４は、エキソソーム１１の内容物が収容されて脂質二重膜で塞がれ閉ざされた容器となる。
脂質二重膜による膜融合は脂質二重膜の自発的な性質であるが、それをブロックするのは膜を構成するリン脂質のリン酸基の負電荷による斥力（反発力）である。エキソソーム１１等の膜小胞が融合膜５に頻度良く融合するためには、エキソソーム１１膜上の負電荷と融合膜５の負電荷とを合わせれば良い。しかしながら、エキソソーム１１上の負電荷はエキソソーム１１の膜蛋白質に依存するので、エキソソーム１１に合わせて融合膜５の負電荷を調整するのは煩雑となり得る。
膜小胞を融合膜５に対して高頻度に融合させるためには、膜小胞と融合膜５との間の物理的な距離を縮めることが重要である。エキソソーム１１を含む溶液の体積が少ない場合、エキソソーム１１と融合膜５との物理的距離が縮まり、エキソソーム１１が融合膜５に接触する頻度が高い。また、エキソソーム１１を含む溶液におけるエキソソーム１１の濃度が高い場合も、エキソソーム１１が融合膜５に接触する頻度が高い。また、単にエキソソーム１１の濃度を高めるだけであると、１つの凹部４に複数のエキソソーム１１が回収される可能性も上がってしまう。
試料を酸性にするｐＨ調整剤を試料に添加してから酸性となった試料を融合膜５に接触させることによっても、膜融合効率を上げることができる。
次に、本実施形態の膜小胞回収デバイス１を用いた膜小胞分析方法について説明する。
本実施形態の膜小胞回収デバイス１は、エキソソーム１１などの膜小胞を凹部４内にトラップし、エキソソーム１１の構成要素である分子を分析可能である。
本実施形態では、膜小胞回収デバイス１の融合膜５にエキソソーム１１などの膜小胞を融合させることで、エキソソーム１１の内容物は充填物８内に保持され、エキソソーム１１の膜蛋白質や膜脂質は融合膜５上に保持される。
このため、各凹部４においてエキソソーム１１の構成要素に対する分析ができる。たとえば、融合膜５上に保持された膜貫通蛋白質等に対する分析としては、イムノアッセイが挙げられる。具体的な分析方法の例としては、エキソソーム１１に多く発現していることが知られているＣＤ９，ＣＤ６３，及びＣＤ８１の定量が挙げられる。ＣＤ９，ＣＤ６３，及びＣＤ８１は、エキソソーム１１が融合膜５と融合することで融合膜５上に保持され、抗ＣＤ９抗体，抗ＣＤ６３抗体，及び抗ＣＤ８１抗体を用いてそれぞれ定量可能である。
本実施形態の膜小胞回収デバイス１は、エキソソーム１１などの膜小胞を凹部４内にトラップし、エキソソーム１１の構成要素である分子を分析可能である。
本実施形態では、膜小胞回収デバイス１の融合膜５にエキソソーム１１などの膜小胞を融合させることで、エキソソーム１１の内容物は充填物８内に保持され、エキソソーム１１の膜蛋白質や膜脂質は融合膜５上に保持される。
このため、各凹部４においてエキソソーム１１の構成要素に対する分析ができる。たとえば、融合膜５上に保持された膜貫通蛋白質等に対する分析としては、イムノアッセイが挙げられる。具体的な分析方法の例としては、エキソソーム１１に多く発現していることが知られているＣＤ９，ＣＤ６３，及びＣＤ８１の定量が挙げられる。ＣＤ９，ＣＤ６３，及びＣＤ８１は、エキソソーム１１が融合膜５と融合することで融合膜５上に保持され、抗ＣＤ９抗体，抗ＣＤ６３抗体，及び抗ＣＤ８１抗体を用いてそれぞれ定量可能である。
このように、本実施形態の膜小胞分析方法によれば、膜小胞由来の生体分子を凹部４において検出、定量可能である。これにより、膜小胞に含まれる構成要素に対して簡便且つ精度及び再現性が高い分析をすることができる。
（第２実施形態）
本発明の第２実施形態について説明する。図１８は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す模式的な断面図で、図２のＢ−Ｂ線と同様の線における断面図である。図１９は、図１８の模式的な拡大図である。
図１８及び図１９に示すように、本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ａは、第１実施形態で説明した反応基体２に代えて、反応基体２とは材質が異なる反応基体２Ａを備える。
本実施形態では、反応基体２Ａの表面３Ａは親水性である。たとえば、本実施形態の反応基体２Ａは親水性の材料により形成される。なお、反応基体２Ａの母材が疎水性の材料から形成される場合には、凹部４が成形された後に母材の外面に対して親水化処理を行う。親水化処理は、たとえば、母材の外面に対するプラズマ処理などの表面改質である。
本実施形態では、融合膜５の親水部が反応基体２Ａの表面３Ａに好適に結合する。このため、融合膜５は、反応基体２Ａの表面３Ａに沿う面状に形成され、複数の凹部４を塞ぐ一続きの膜状に形成される。
このような構成であっても上記第１実施形態と同様の効果を奏する。
本発明の第２実施形態について説明する。図１８は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す模式的な断面図で、図２のＢ−Ｂ線と同様の線における断面図である。図１９は、図１８の模式的な拡大図である。
図１８及び図１９に示すように、本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ａは、第１実施形態で説明した反応基体２に代えて、反応基体２とは材質が異なる反応基体２Ａを備える。
本実施形態では、反応基体２Ａの表面３Ａは親水性である。たとえば、本実施形態の反応基体２Ａは親水性の材料により形成される。なお、反応基体２Ａの母材が疎水性の材料から形成される場合には、凹部４が成形された後に母材の外面に対して親水化処理を行う。親水化処理は、たとえば、母材の外面に対するプラズマ処理などの表面改質である。
本実施形態では、融合膜５の親水部が反応基体２Ａの表面３Ａに好適に結合する。このため、融合膜５は、反応基体２Ａの表面３Ａに沿う面状に形成され、複数の凹部４を塞ぐ一続きの膜状に形成される。
このような構成であっても上記第１実施形態と同様の効果を奏する。
（第３実施形態）
本発明の第３実施形態について説明する。図２０は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す模式的な拡大断面図である。
図２０に示す本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｂは、融合膜５が、膜小胞と融合膜５との融合を促進する膜電荷調整物質１２を含む。
膜電荷調整物質１２は、膜破壊性ペプチド、膜融合性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、及びウィルス由来膜融合蛋白質のうち少なくとも１つを含む。
本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｂにおいては、エキソソームを含んだ溶液を融合膜５に接触するように添加したときに、融合膜５に組み込まれた膜電荷調整物質１２が融合膜５の膜電荷を調整し膜小胞に対する膜融合を促進する。
本実施形態では、上記第１，２実施形態と比較して、エキソソームなどの膜小胞の回収効率がさらに高い。
本発明の第３実施形態について説明する。図２０は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す模式的な拡大断面図である。
図２０に示す本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｂは、融合膜５が、膜小胞と融合膜５との融合を促進する膜電荷調整物質１２を含む。
膜電荷調整物質１２は、膜破壊性ペプチド、膜融合性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、及びウィルス由来膜融合蛋白質のうち少なくとも１つを含む。
本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｂにおいては、エキソソームを含んだ溶液を融合膜５に接触するように添加したときに、融合膜５に組み込まれた膜電荷調整物質１２が融合膜５の膜電荷を調整し膜小胞に対する膜融合を促進する。
本実施形態では、上記第１，２実施形態と比較して、エキソソームなどの膜小胞の回収効率がさらに高い。
（第４実施形態）
本発明の第４実施形態について説明する。図２１は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す模式的な拡大断面図である。
図２１に示す本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｃは、充填物８が、溶媒１３と、溶媒１３に含まれた生化学分析用反応試薬１４とを含む。生化学分析用反応試薬１４は、核酸分析試薬、インベーダー反応試薬、蛋白質分析試薬、脂質分析試薬、イムノアッセイ試薬、及びホモジニアス抗原抗体反応用試薬のうちの少なくとも１つを含む。
また、本実施形態では、生化学分析用反応試薬１４が、溶媒１３としての水系バッファーに溶解された状態で充填物８が形成されてもよいし、ゲルあるいはゾルに加工されて充填物８が形成されてもよい。充填物８がゲルあるいはゾルであると、膜小胞回収デバイス１Ｃの製造時に水槽１００（図７参照）内に反応基体２を入れたときに生化学分析用反応試薬１４が水槽１００内に拡散しにくい。
本発明の第４実施形態について説明する。図２１は、本実施形態の膜小胞回収デバイスを示す模式的な拡大断面図である。
図２１に示す本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｃは、充填物８が、溶媒１３と、溶媒１３に含まれた生化学分析用反応試薬１４とを含む。生化学分析用反応試薬１４は、核酸分析試薬、インベーダー反応試薬、蛋白質分析試薬、脂質分析試薬、イムノアッセイ試薬、及びホモジニアス抗原抗体反応用試薬のうちの少なくとも１つを含む。
また、本実施形態では、生化学分析用反応試薬１４が、溶媒１３としての水系バッファーに溶解された状態で充填物８が形成されてもよいし、ゲルあるいはゾルに加工されて充填物８が形成されてもよい。充填物８がゲルあるいはゾルであると、膜小胞回収デバイス１Ｃの製造時に水槽１００（図７参照）内に反応基体２を入れたときに生化学分析用反応試薬１４が水槽１００内に拡散しにくい。
次に、本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｃを用いた膜小胞分析方法について説明する。
本実施形態の膜小胞分析方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞の内容物若しくは膜蛋白質若しくは膜脂質を凹部４内で分析する方法である。
本実施形態では、上記第１実施形態で説明したのと同様に、エキソソーム等の膜小胞を融合膜５に融合させる。
本実施形態の膜小胞分析方法は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞の内容物若しくは膜蛋白質若しくは膜脂質を凹部４内で分析する方法である。
本実施形態では、上記第１実施形態で説明したのと同様に、エキソソーム等の膜小胞を融合膜５に融合させる。
本実施形態では、凹部４内に予め満たしておく充填物８に、分析対象物と反応する酵素、基質などの生化学分析用反応試薬１４が存在するので、生化学分析用反応試薬１４の種類に対応した反応を凹部４内で起こさせることができる。
例えばマイクロＲＮＡその他の核酸検出であれば、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、及び検出用蛍光試薬を凹部４内に入れておけば良い。或いは蛋白質の検出であれば、蛍光標識した抗体のサンドイッチ反応でＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）が起こるようなホモジニアス系のイムノアッセイ試薬を凹部４内に入れておけばよい。
本実施形態では、凹部４内に外界の夾雑物が入り込まない状態で凹部４内の物質に対して分析をすることができるので、夾雑物を取り除くための洗浄が不要である。そのため、洗浄によって分析対象物が変性したり失われたりする可能性を排除できるので、エキソソーム１１の分離精製及び分析の過程において洗浄を要する方法と比較して、分析の精度及び再現性に優れる。
さらに、分析に必要となる試薬を予め凹部４内に含ませておくことにより、凹部４内に取り込まれた分析対象物に対する生化学的反応を速やかに実施することが可能である。このため、実験系において活性が失われるのが早い物質などに対する分析を簡便に行うことができる。
さらに、分析に必要となる試薬を予め凹部４内に含ませておくことにより、凹部４内に取り込まれた分析対象物に対する生化学的反応を速やかに実施することが可能である。このため、実験系において活性が失われるのが早い物質などに対する分析を簡便に行うことができる。
さらに、本実施形態の膜小胞回収デバイス１Ｃ、膜小胞回収方法、及び膜小胞分析方法によれば、凹部４内に生化学分析用反応試薬１４を含んでいるので、エキソソーム等の膜小胞の構成要素に対する分析を、膜小胞の分離にひき続いて簡便且つ迅速に行うことができる。
また、融合膜５上のテトラスパニンの検出と凹部４内での生化学分析とをあわせて行うことにより、反応基体２上の複数の凹部４のうち、エキソソームが入っている凹部４とエキソソームが入らなかった凹部４とを区別し、エキソソームが入っている凹部４のみを対象とした生化学分析結果を得ることができる。
なお、各凹部４におけるテトラスパニンを定量することによって、一つの凹部４に対して何個のエキソソームが入っているかを推定することもできる。
また、融合膜５上のテトラスパニンの検出と凹部４内での生化学分析とをあわせて行うことにより、反応基体２上の複数の凹部４のうち、エキソソームが入っている凹部４とエキソソームが入らなかった凹部４とを区別し、エキソソームが入っている凹部４のみを対象とした生化学分析結果を得ることができる。
なお、各凹部４におけるテトラスパニンを定量することによって、一つの凹部４に対して何個のエキソソームが入っているかを推定することもできる。
（変形例）
次に、上記実施形態の変形例について図２１を参照して説明する。
本変形例では、図２１に示す生化学分析用反応試薬１４は、上記の試薬に加えて、ｐＨ指示薬をさらに含む。本変形例では、反応基体２上の複数の凹部４のうち、エキソソーム１１が入っている凹部４とエキソソーム１１が入らなかった凹部４とをｐＨ指示薬を用いて区別することができる。
また、凹部４の容積及びｐＨ指示薬の量が各凹部４において一定になるように構成された膜小胞回収デバイス１を用いれば、一つの凹部４に対して何個のエキソソーム１１が入っているかをｐＨ指示薬を用いて推定することもできる。
次に、上記実施形態の変形例について図２１を参照して説明する。
本変形例では、図２１に示す生化学分析用反応試薬１４は、上記の試薬に加えて、ｐＨ指示薬をさらに含む。本変形例では、反応基体２上の複数の凹部４のうち、エキソソーム１１が入っている凹部４とエキソソーム１１が入らなかった凹部４とをｐＨ指示薬を用いて区別することができる。
また、凹部４の容積及びｐＨ指示薬の量が各凹部４において一定になるように構成された膜小胞回収デバイス１を用いれば、一つの凹部４に対して何個のエキソソーム１１が入っているかをｐＨ指示薬を用いて推定することもできる。
（第５実施形態）
本発明の第５実施形態について説明する。図２２は、本発明の第５実施形態に係る膜小胞体回収デバイス１Ｄの断面図である。本実施形態に係る膜小胞体回収デバイスは、凹部４を有する基材（反応基体）２Ｃと、平滑な基材（反応基体）２Ｄとで構成されている。また、本実施形態に係る膜小胞体回収デバイスは、２つの基材の間に設けられた流路１５を備えている。流路１５は液体を凹部４に送液可能である。流路１５を通じて充填物８が凹部４に充填され、脂質溶液を含む有機溶媒が凹部４に送液される。この後にさらに、水系の溶媒１７が凹部４に送液される。これによって、図２３に示すように、充填物８を覆い、凹部４を塞ぐ融合膜５を各凹部４に結合させることができる。この水系の溶媒１７は、図１４Ａ、１４Ｂに記載された緩衝液１６のように、融合膜５の親水部が水系の溶媒に向く構成を有すれば、特に溶媒の種類は問わない。例えば、血清、血液等のサンプル、試薬、バッファーなどの水溶液が挙げられる。また、水系の溶媒は、膜小胞体を含んでいても良い。
本発明の第５実施形態について説明する。図２２は、本発明の第５実施形態に係る膜小胞体回収デバイス１Ｄの断面図である。本実施形態に係る膜小胞体回収デバイスは、凹部４を有する基材（反応基体）２Ｃと、平滑な基材（反応基体）２Ｄとで構成されている。また、本実施形態に係る膜小胞体回収デバイスは、２つの基材の間に設けられた流路１５を備えている。流路１５は液体を凹部４に送液可能である。流路１５を通じて充填物８が凹部４に充填され、脂質溶液を含む有機溶媒が凹部４に送液される。この後にさらに、水系の溶媒１７が凹部４に送液される。これによって、図２３に示すように、充填物８を覆い、凹部４を塞ぐ融合膜５を各凹部４に結合させることができる。この水系の溶媒１７は、図１４Ａ、１４Ｂに記載された緩衝液１６のように、融合膜５の親水部が水系の溶媒に向く構成を有すれば、特に溶媒の種類は問わない。例えば、血清、血液等のサンプル、試薬、バッファーなどの水溶液が挙げられる。また、水系の溶媒は、膜小胞体を含んでいても良い。
本実施形態に係る膜小胞体回収デバイスにおいて、凹部は樹脂やガラス等で形成されていてもよく、基材と同じ材料で形成されていてもよい。また、凹部は樹脂成型加工などによって基材と一体化していてもよい。樹脂としては、シクロオレフィンポリマー、シリコン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニルなどから選ぶことができるが、これらに限られない。基材は剛性を持つ材料から形成されていればよく、樹脂やガラス等で形成されていれば良い。透過によって微小孔を観察する場合には、基材は透明であるほうが良い。また、フォトリソグラフィーで疎水部を形成してもよく、樹脂としてはＣＹＴＯＰ（旭硝子社製）などの疎水性の高い材料が選ばれる。
次に、以下に示す実施例に基づいて、本実施形態の膜小胞回収デバイス、膜小胞回収方法、及び膜小胞分析方法についてより詳細に説明する。
（１）脂質二重膜でコートしたインベーダー反応試薬充填ウェル平板の作製
インプリントにより直径１μｍ、深さ１μｍの微細孔（ウェル，凹部）をアレイ状に配置したＰＤＭＳ製の平板を作製し、プラズマ発生装置でプラズマ処理を行いウェル部だけを親水化処理した。平板は１辺１ｃｍ、厚さ５ｍｍとし、９×１０＾６ウェルを中央に配置した。ウェルへインベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、０．４μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース）を充填するために、平板上に試薬溶液５μＬを滴下しカバーグラスで覆い、減圧下でウェル内部に試薬溶液を注入後、カバーグラスを剥がして風乾した。
インプリントにより直径１μｍ、深さ１μｍの微細孔（ウェル，凹部）をアレイ状に配置したＰＤＭＳ製の平板を作製し、プラズマ発生装置でプラズマ処理を行いウェル部だけを親水化処理した。平板は１辺１ｃｍ、厚さ５ｍｍとし、９×１０＾６ウェルを中央に配置した。ウェルへインベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、０．４μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース）を充填するために、平板上に試薬溶液５μＬを滴下しカバーグラスで覆い、減圧下でウェル内部に試薬溶液を注入後、カバーグラスを剥がして風乾した。
０．００１３ｇのオキソチタニウムフタロシアニンを、０．１ｍｏｌ／Ｌのトリクロロ酢酸を含むジクロロメタン１０ｍＬに溶かして、ＬＢ膜用試料溶液を調製した。この試料溶液を水面上に滴下して単分子膜を形成し、市販のＬＢ膜作製装置を用いＬＢ膜を作製した。インベーダー反応試薬をウェルに充填した平板を予め水槽に沈めておき、引き上げることにより平板表面上に単分子膜を移し取り、再度水槽に沈めて二重膜を作製した。
（２）リポソームで封入したオリゴヌクレオチドの反応
エキソソームのモデルとして、基質となるオリゴヌクレオチドをリポソーム試薬（ライフテクノロジー社、リポフェクタミン）で封入後段階希釈し、試料溶液を得た。その後、上記（１）のインベーダー反応試薬充填ウェル平板上に試料溶液を滴下し、カバーグラスを載せ軽く押し付け、６２℃のオーブンにて１５分間インキュベートした。反応後のウェルを蛍光顕微鏡（ツァイス社、ＡＸ１０）、対物レンズ（ＥＣ Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ４０× ｏｉｌ ＮＡ１．３）、光源（ＬＥＪ社、ＦｌｕｏＡｒｃ００１．２６Ａ Ｕｓａｂｌｅ ｗｉｔｈ ＨＢＯ １０）、センサー（浜松ホトニクス社、ＥＭ−ＣＣＤ Ｃ９１００）、フィルター（オリンパス社、Ｕ−ＭＮＩＢＡ２）、解析ソフト（浜松ホトニクス社、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ ２．６：露光時間 ６４．３ｍｓ、ＥＭゲイン １８０、オフセット ０、ビニング ×１）にて蛍光量を測定（５ウェルを選び、２１ピクセルの蛍光量の平均値を求めた）すると共に、蛍光を発するウェル数を計測した。その結果、リポソーム量に応じて一定量の蛍光を発するウェル数が増加することが確認された。
エキソソームのモデルとして、基質となるオリゴヌクレオチドをリポソーム試薬（ライフテクノロジー社、リポフェクタミン）で封入後段階希釈し、試料溶液を得た。その後、上記（１）のインベーダー反応試薬充填ウェル平板上に試料溶液を滴下し、カバーグラスを載せ軽く押し付け、６２℃のオーブンにて１５分間インキュベートした。反応後のウェルを蛍光顕微鏡（ツァイス社、ＡＸ１０）、対物レンズ（ＥＣ Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ４０× ｏｉｌ ＮＡ１．３）、光源（ＬＥＪ社、ＦｌｕｏＡｒｃ００１．２６Ａ Ｕｓａｂｌｅ ｗｉｔｈ ＨＢＯ １０）、センサー（浜松ホトニクス社、ＥＭ−ＣＣＤ Ｃ９１００）、フィルター（オリンパス社、Ｕ−ＭＮＩＢＡ２）、解析ソフト（浜松ホトニクス社、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ ２．６：露光時間 ６４．３ｍｓ、ＥＭゲイン １８０、オフセット ０、ビニング ×１）にて蛍光量を測定（５ウェルを選び、２１ピクセルの蛍光量の平均値を求めた）すると共に、蛍光を発するウェル数を計測した。その結果、リポソーム量に応じて一定量の蛍光を発するウェル数が増加することが確認された。
（１）脂質二重膜を持つ膜小胞体回収デバイスの作製
０．５ｍｍ厚のガラス基材にＣＹＴＯＰ（旭硝子社製）をスピンコートし、１８０℃で３時間熱硬化させ、フォトリソグラフィー技術を使って直径５μｍの微小孔（ウェル，凹部）を１００万個持つ微小孔チップを作製した。微小孔チップとの隙間が１００μｍとなるように、微小孔チップの上部に送液ポート付きのガラス基材を設置した。これにより、２つの基材の間に設けられた流路を作製した。流路は微小孔に液体を送液可能である。インベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、０．４μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース）をサンプルポートより凹部に送液し、脱気することで微細な凹部に反応試薬を充填した。凹部に、ＤＯＰＥとＤＯＰＧとの混合脂質を４ｍｇ／ｍｌになるように溶解したヘキサデカンを ４０μＬ送液した。凹部にバッファー（２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を４０μＬ送液した。
０．５ｍｍ厚のガラス基材にＣＹＴＯＰ（旭硝子社製）をスピンコートし、１８０℃で３時間熱硬化させ、フォトリソグラフィー技術を使って直径５μｍの微小孔（ウェル，凹部）を１００万個持つ微小孔チップを作製した。微小孔チップとの隙間が１００μｍとなるように、微小孔チップの上部に送液ポート付きのガラス基材を設置した。これにより、２つの基材の間に設けられた流路を作製した。流路は微小孔に液体を送液可能である。インベーダー反応試薬（１μＭ アレルプローブ、０．４μＭ インベーダーオリゴ、１μＭ ＦＡＭ標識アーム、２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬ クリベース）をサンプルポートより凹部に送液し、脱気することで微細な凹部に反応試薬を充填した。凹部に、ＤＯＰＥとＤＯＰＧとの混合脂質を４ｍｇ／ｍｌになるように溶解したヘキサデカンを ４０μＬ送液した。凹部にバッファー（２０μＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を４０μＬ送液した。
（２）リポソームで封入したオリゴヌクレオチドの反応
エキソソームのモデルとして、基質となるオリゴヌクレオチドをリポソーム試薬（ライフテクノロジー社、リポフェクタミン）で封入し、試料溶液を得た。その後、上記のインベーダー反応試薬が充填されたウェル上に試料溶液を送液し、さらにオイルを送液することで試料溶液を液滴化した。その後、６２℃のオーブンにて１５分間インキュベートした。反応後のウェルを蛍光顕微鏡にて蛍光量を測定した。測定結果を図２３に示す。
エキソソームのモデルとして、基質となるオリゴヌクレオチドをリポソーム試薬（ライフテクノロジー社、リポフェクタミン）で封入し、試料溶液を得た。その後、上記のインベーダー反応試薬が充填されたウェル上に試料溶液を送液し、さらにオイルを送液することで試料溶液を液滴化した。その後、６２℃のオーブンにて１５分間インキュベートした。反応後のウェルを蛍光顕微鏡にて蛍光量を測定した。測定結果を図２３に示す。
以上、本発明の実施形態及び実施例について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られず、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
たとえば、上記実施形態３，４，及び５において、上記第１実施形態で説明したように融合膜５の疎水部７ｂが反応基体２の表面３に結合していてもよい。
また、上述の各実施形態において示した事項は適宜に組み合わせて構成することが可能である。
たとえば、上記実施形態３，４，及び５において、上記第１実施形態で説明したように融合膜５の疎水部７ｂが反応基体２の表面３に結合していてもよい。
また、上述の各実施形態において示した事項は適宜に組み合わせて構成することが可能である。
本発明は、エキソソームの分離、細胞小器官の分離その他膜小胞の分離に利用できる。
また、本発明は、膜小胞の構成要素の分析に利用できる。
また、本発明は、膜小胞の構成要素の分析に利用できる。
１，１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ 膜小胞回収デバイス
２ 反応基体
３ 表面
４ 凹部
５ 融合膜
６ 第一層
６ａ 親水部
６ｂ 疎水部
７ 第二層
７ａ 親水部
７ｂ 疎水部
８ 充填物
９ 母材
１０ ２次元固体膜
１０ａ 親水部
１０ｂ 疎水部
１１ エキソソーム
１２ 膜電荷調整物質
１３ 溶媒
１４ 生化学分析用反応試薬
２ 反応基体
３ 表面
４ 凹部
５ 融合膜
６ 第一層
６ａ 親水部
６ｂ 疎水部
７ 第二層
７ａ 親水部
７ｂ 疎水部
８ 充填物
９ 母材
１０ ２次元固体膜
１０ａ 親水部
１０ｂ 疎水部
１１ エキソソーム
１２ 膜電荷調整物質
１３ 溶媒
１４ 生化学分析用反応試薬
Claims (16)
- 液性の充填物と、
前記充填物が接する状態で前記充填物を保持可能な複数の保持部が形成された表面を有する反応基体と、
複数の前記保持部の各々において、前記充填物の外周を、前記充填物が前記保持部に接する部位を除いて覆う脂質二重膜を有する融合膜と、
を備え、
前記充填物は、複数の前記保持部の各々において、前記保持部および前記融合膜に覆われており、
膜小胞と前記融合膜とが融合することにより前記膜小胞の内容物が前記充填物に混合される、
膜小胞回収デバイス。 - 請求項１に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記保持部は前記反応基体に形成された凹部であり、
前記融合膜は、前記凹部において前記表面と前記凹部との境界を形成する開口端に接し、前記凹部を塞ぐように前記反応基体に設けられ、
前記充填物は前記凹部内に充填されている膜小胞回収デバイス。 - 請求項２に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記融合膜は、前記凹部の内壁面のうち前記開口端に沿う部分に結合され前記複数の凹部の各々を個別に塞ぐように前記反応基体に複数設けられている膜小胞回収デバイス。 - 請求項３に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記反応基体は少なくとも前記内壁面が疎水性であり、前記融合膜の疎水部と前記内壁面とが結合している膜小胞回収デバイス。 - 請求項２に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記融合膜は、前記表面に沿う面状に形成され、前記複数の凹部を塞ぐ一続きの膜状に形成される膜小胞回収デバイス。 - 請求項２に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記融合膜は、生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞と前記融合膜との膜融合を促進する膜電荷調整物質を含む膜小胞回収デバイス。 - 請求項６に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記膜電荷調整物質は、膜破壊性ペプチド、膜融合性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、及びウィルス由来膜融合蛋白質のうち少なくとも１つを含む膜小胞回収デバイス。 - 請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記充填物は、溶媒と、前記溶媒に含まれる生化学分析用反応試薬と、を含む膜小胞回収デバイス。 - 請求項８に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記生化学分析用反応試薬はｐＨ指示薬を含む膜小胞回収デバイス。 - 請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の膜小胞回収デバイスであって、
前記充填物はゲルあるいはゾルである膜小胞回収デバイス。 - 請求項１に記載の膜小胞回収デバイスであって、
複数の親水部および前記親水部を囲む疎水部が形成された表面を有する反応基体をさらに備え、
前記充填物は前記親水部に設けられ、前記融合膜は、前記親水部と前記疎水部との境界において前記疎水部に結合して前記充填物を包んでいる膜小胞回収デバイス。 - 生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞を請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の膜小胞回収デバイスに回収する膜小胞回収方法であって、
前記膜小胞を含む試料を前記融合膜に接触させて前記融合膜と前記膜小胞とを膜融合させる膜小胞回収方法。 - 請求項１２に記載の膜小胞回収方法であって、
前記試料を酸性にするｐＨ調整剤を前記試料に添加した後に酸性の前記試料を前記融合膜に接触させる膜小胞回収方法。 - 生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞の内容物、膜蛋白質、若しくは膜脂質を分析する膜小胞分析方法であって、
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の膜小胞回収デバイスの前記融合膜に前記膜小胞を融合させ、
前記膜小胞上の前記膜蛋白質若しくは前記膜脂質を前記融合膜において保持する膜小胞分析方法。 - 生体由来又は人工の小胞であって脂質二重膜に覆われた膜小胞の内容物、膜蛋白質、若しくは膜脂質を分析する膜小胞分析方法であって、
請求項８または請求項９に記載の膜小胞回収デバイスの前記融合膜に前記膜小胞を融合させ、
前記充填物内で前記膜小胞の内容物、膜蛋白質、若しくは膜脂質と前記生化学分析用反応試薬と反応させる膜小胞分析方法。 - 請求項８または請求項９に記載の膜小胞回収デバイスを用いた膜小胞分析方法若しくは請求項１５に記載の膜小胞分析方法であって、
前記生化学分析用反応試薬は、核酸分析試薬、インベーダー反応試薬、蛋白質分析試薬、脂質分析試薬、イムノアッセイ試薬、及びホモジニアス抗原抗体反応用試薬のうちの少なくとも１つを含む膜小胞分析方法。
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