CA2078138A1 - Procede de stimulation artificielle de cellules et dispositif de culture d'ovocytes - Google Patents
Procede de stimulation artificielle de cellules et dispositif de culture d'ovocytesInfo
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Abstract
DE DIVULGATION La présente invention concerne un procédé de stimulation artificielle d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène. Elle concerne également un dispositif de culture d'ovocytes permettant la mise en oeuvre du procédé.
Description
~091/139'77 PCT/FR91/00200 PROCEDE DE STlMULATlON ARTIFlClELLE DE CELLULES ET
~5rrrF DE CUL~URE D'O~OCYTE~
__ __.__ La présente invention concerne un procédé de stimulation - artificielle des cellules en particulier d'ovocytes, ladite stimulation étant modulab~e dans le temps, et un dispositif de culture de cellules perme~tan~
la m Ise en oeuvre du procédé.
La présente invention se rapporte à la stimulation de cellules, en particulier d'ovocytes ou d'oeufs fécondés, par un mécanisme bio-chirnique régulé dans les conditions physiolo~iques par un oscillateur i nterne.
11 s'agit notamment d'une procédure de clonage des embrvons d'animaux et, en particulier d'obtention d'ovocytes receveurs cornpétents pour la greffe d'un noyau cellulaire dans un état homogène.
Le clonage d'embryons d'animaux domestiques est la voie perme~tant de remédier à la variabilité génétique induite par la fécondation et de standardiser les améliorations généIiques d'une race.
Lors de la fécondation, I'entrée du spermatozolde va avoir deux grandes fonctions:
- apport du génome haplolde mâle, - activation du développement qui restructure le noyau mâle par le cytoplasme de l'ovocyte et favorise les intéractions noyau-cytoplasme.
11 s'écoule en moyenne 12 à 20 heures entre la fécondation et la première division cellulaire, pendant lesquelles un ensemble de phénomènes ont lieu, les deux ~énomes paternel e~ maternel ayant des rôles complementaires pour un développement ultérieur de l'embryon (Surani et al. 1984, Nature 308, 54~-550), rnais on n'en connait pas le mécanisme exact.
e clonage d'un embryon est une mé~hode qui vise ~ obtenir le plus d'animaux vivants à la suite du transfert des noyaux cellulaires de cet embryon ~qui contient plusieurs cellules~ dans des ovocytes enuclées et activés. Les deux fonc~ions de la fécondation son~ dissociées. Afin d'obtenir un développement ulterieur de l'oeuf, il faut procéder à une activation de I'ovocyte receveur avant la greffe nucléaire. L'activation peut aussi s'appliquer aux premières heures du développement de l'oeuf fécondé.
On sait que les oeufs de mammifères peuvent être ac~ivés artificiellement par difforents stimulis physiques ou chimiques, qu'il s'a~isse .,;
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~5rrrF DE CUL~URE D'O~OCYTE~
__ __.__ La présente invention concerne un procédé de stimulation - artificielle des cellules en particulier d'ovocytes, ladite stimulation étant modulab~e dans le temps, et un dispositif de culture de cellules perme~tan~
la m Ise en oeuvre du procédé.
La présente invention se rapporte à la stimulation de cellules, en particulier d'ovocytes ou d'oeufs fécondés, par un mécanisme bio-chirnique régulé dans les conditions physiolo~iques par un oscillateur i nterne.
11 s'agit notamment d'une procédure de clonage des embrvons d'animaux et, en particulier d'obtention d'ovocytes receveurs cornpétents pour la greffe d'un noyau cellulaire dans un état homogène.
Le clonage d'embryons d'animaux domestiques est la voie perme~tant de remédier à la variabilité génétique induite par la fécondation et de standardiser les améliorations généIiques d'une race.
Lors de la fécondation, I'entrée du spermatozolde va avoir deux grandes fonctions:
- apport du génome haplolde mâle, - activation du développement qui restructure le noyau mâle par le cytoplasme de l'ovocyte et favorise les intéractions noyau-cytoplasme.
11 s'écoule en moyenne 12 à 20 heures entre la fécondation et la première division cellulaire, pendant lesquelles un ensemble de phénomènes ont lieu, les deux ~énomes paternel e~ maternel ayant des rôles complementaires pour un développement ultérieur de l'embryon (Surani et al. 1984, Nature 308, 54~-550), rnais on n'en connait pas le mécanisme exact.
e clonage d'un embryon est une mé~hode qui vise ~ obtenir le plus d'animaux vivants à la suite du transfert des noyaux cellulaires de cet embryon ~qui contient plusieurs cellules~ dans des ovocytes enuclées et activés. Les deux fonc~ions de la fécondation son~ dissociées. Afin d'obtenir un développement ulterieur de l'oeuf, il faut procéder à une activation de I'ovocyte receveur avant la greffe nucléaire. L'activation peut aussi s'appliquer aux premières heures du développement de l'oeuf fécondé.
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tlVO ~1/13977 PCI/FR91/00200 de chocs électriques, ~hermiques ou osmotiques, d'enzymes ou d'agen~s anesthésiques (Kaufman ~lH 1983 - Early mammalian development -parthenogene~ic studies - Cambridge University Press). Cependant, I'activation est toujours identifiée à un stimulus unique, limité dans le 5 temps, supposé mimer la pénétration du spermatozolde dans I'oeuf. Aucun de ces traitements ne reproduit la série de chan~ements physiolog~ques se produisant dans l'oeuf après la pénétration du spermatozolde.
On ne connait que quelques cas d'activation parthénogenéti~ue de l'ovocyte de vache (Menezo et al. 1976 - Commission of the European 10 Coimmuni~ies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. Eur 5491); aucune méthode vraiment fiable et précise d'activation des ovocytes de bovins n'est disponible. L'activation expérimentale par Iréthanol présente de nombreux inconvénients: grande variabilité des résultats en fonction de l'âge des ovocytes (Cuthbertson, 1983 ; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).
En ce qui concerne le clonage d'embryons, les premiers résultats incontestés ont été obtenus par S. Willadsen en 1986 chez la brebis. Ils ont été suivis par ceux de Prather et al en 1987 chez la vache, et en 1989 chez la truie. Chez la lapine, les premiers individus issus de 20 clonage ont été obtenus par Stice et Robl en 1988. Les ~aux de succès de ces expériences rapportés dans les publications ne dépassent généralemen~
pas 4 %. Toutefois, des sociétés américaines (Granada Genetics, Houston, Texas) ou Canadienne (Alta Genetics, Callgary, Alberta), semblent rnaîtriser la procéJure de clonage chez les bovins. Il est dit qu'une centaine 25 de veaux aurait déjà été obtenue sur le continent nord-américain. Cette prise en main industrielle reflète l'intérêt que susci~e le clonage d'embryon chez les bovins. kAais les techniques ont-elles vraiment progressé ?
Les procédures décrites dans les publications se ressemblent.
Les ovocytes utilisés ont subi une période de vieillissement de 6 à 10 30 heures. Ce veillissement es~ rendu nécessaire pour favoriser l'activation (aucune technique classique d'activation ne permet d'activer des ovocytes fraîchement ovulés même chez les bovins (Ware et al. 1989). Les chromosomes or~anisés sur 13 métaph.se 11 sont prélevés en "aveugle" dans ' ' , .~
-~ 2~ 138 ~0 91/13977 PCl`/FR91/00200 la region du premier globule polaire, mais des techniques de visualisation des chromosomes par fluorescence sont mises en oeuvre. Une cellule embryonnaire provenant d'une morula est introduite sous la zone pellucide et la fusion est obtenue par des impulsions de champs électriques.
L'activation de l'ovocyte est généralement provoquée par la procédure de fusion cellulaire; dans certains cas, elle n'est pas décrite. Deux chercheurs ont pu obtenir un agneau à la suite du transfert dans un ovocyte d'un noyau provenant d'une cellule du bouton embryonnaire (Smith a~ Wilmut, L989).
Toutefois, le niveau des resultats et la complexité des mécanismes en jeu tels que le stade de différenciation du noyau, la phase du cycle cellulaire, l'état de l'ovocyte receveur~ son âge! la procédure dIactivation ne permettent pas de comprendre pou~quoi certains embryons se développent et d'autres non. De nombreuses théories pour expliquer les échecs comme celle fondée sur l'ac~ivité de transcription du noyau l 5 transplanté ont été contredites par quelques résultats expérimentaux.
Des données nouvelles sont apparues sur les mécanismes physiologiques déclenchés par la fécondation et notamment en ce qui concerne les rythmes des variations de niveau du calcium libre et des seconds messagers comme l'lnositol (1,6,5)-tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. l981; Cuthbertson ~ Cobbold, 1985; Miyazaki et al.
1986; Miyazaki, 1988). L'activité périodique de ces seconds messagers pourrait régul~er les synthèses des acides nucléiques (ADN et ARNs) et des protéines (Basset et al. 1968; Rodan et al. 1978).
Le processus est déclenché par le spermatozolde dans les secondes qui suivent la fécondation~ La chaîne de réactions qui aboutit à la production d'lnsP3 semble dépendre d'un influx d'ions calcium. L'lnsP3 se lie à un récepteur spécifique qui contrôle l'activité d'un canal calcique situe sur la membrane intracellulaire d'un réservoir intracellulaire de calcium.
Le calcium ainsi libéré active des protéines spécifiques, qui elles-mêmes activent des processus spécifiques, par exemple la complexation calcium-` calmoduline, I'activation de kinase etc. Le calcium est considéré comme I'activateur principal du métabolisme. Ce cycle de réactions se reprodui~ à
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20rl~ 3~
r~O 91tl3977 PCI`/FR91/00200 une fréquence de l'ordre de la minute durant plusleurs heures ~1cCulloh et al. 1983; Igusa ~c Miyazaki, 1983-1986 ~ liyazaki et al. 1986; .~/liyazaki;
1 9~S).
Cette activité rythmique, due a un système de si~nau~
5 intracellulaires émis à une fréquence propre, semble dépendre de la presence de pronuclei male et femelle car elle n'a pu etre observée sur des oeufs parthénogénétiques activés par des méthodes classiques ~Cuthberston et al. 1981; Cuthbertson d( cobbold, 1985; Miyazaki, 1988). `
L'injection dans des ovocytes d'une protéine G ~guanosine 10 -5'-0-(3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induit plusieurs cycles de liberation decalcium, mais ne permet pas de maintenir cette activité au-delà du quatrième (Swann, Igusa ~c Miyazaki, 1989).
Les contributions génétiques respectives de l'ovocyte et du spermatozolde sont très documentées chez la souris. Ces études montrent 15 que le développement normal à terme d'un embryon dépend de la présence permanente durant tout le prernier cycle cellulaire des deux pronuclei parentaux (PN) ~Surani ~ Barton 1983; Mc(;rath ~ Solter, 1984; Surani et al. 1986; Mann ~ Lovell - Badge, 1986, 1988).
La production de jeunes par clona~e ne peut être réalisée dans 20 la pratique que si l'on dispose de procedés fiables et reproductibles. La qualité de l'activation de I'oeuf joue dans le développement un rôle important jusque là ignoré.
La maîtrise de l'activation comprise comme phénomène rythmique s'etendant sur tout le premier cycle cellulaire es~ essentielle, 25 non seulement pour produire en routine des ovocytes activés et synchrones mais aussi pour faire bénéficier des oeufs "clonés" de ce type d'activation imposee pour se développer normalement.
La présente invention concerne donc un procédé de stimula-tion artifieiel, notamment à long terme, d'un ensemble de cellules 30 reproduisant l'effet d'un mecanisme de régulation biochimique, contrôlé
dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suiv~ntes:
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~0 91/13977 PCT/FR91/00200 a) les cellules sont placées en culture in vitro, pendant un temps détermine, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, 5 c) on soumet les cellules a une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, `
e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, et f) on ob~ient les cellules dans un état activé homogène.
L'élimination du milieu de culture sera de préférence 10 complétée par un lavage des cellules par le milieu d'impulsion.
Ce procédé de stimulation bien qu'il puisse être utilisé dans un grand nombre de procédés, a été mis au point dans le cadre de l'activation des ovocytes en vue du clonage d'embryons. Des études récentes ont en effet montré que dans les oeufs de mammifères, la fécondation est 15 accompagnée d'une augmentation transitoire de la concentralion intracel-lulaire de calcium libre ([Ca2 ]i]' suivie d'une série d'oscillations de cette concentration, qui dure au moins 4 heures.
On ignore encore par quel moyen le spermatozoïde déclenche ces variations de [Ca2 ]i~ ainsi que les fonc~ions biologiques exactes de ces 20 oscillations de Ca2 de longue durée. Cependant, elles semblent caracté-ristiques des oeufs fécondés et niont jamais été observées quand les ovocytes sont artiiiciellement activés (Miyazaki 1988 - J. Cell. Biol. 106, ; 345-353).
Le procédé développé dans la présente invention va donc 25 permettre de stimuler périodiquement les ovocytes par des influx de calcium au niveau de la membrane plasmique.
En effet, en introduisant dans le milieu d'impulsion des ions Ca2t, ceux-ci vont pouvoir péné~rer dans la cellule par l'électroporation, c'est-à-dire la création de "pores" générées par l'impulsion électrique.
Au-delà des phénomènes immédiats provoqués dans l'ovocyte comme l'expulsion du globule polaire, les effets de cette stimulation se ; ~manifesteront sur les stades ultérieurs du développement de i'embryon, alors meme que le ~raitement a cessé. C'est ainsi que les phénomènes de compaction et de cavitation poùrront être affectés.
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~-'0 91/13977 PCl/FR91/00200 Ce procédé peut s'appliquer au~ ovocytes fraich~ment ovulés, obtenus par stimulation hormonale de la femelle. L'activation des oYocy~es dans les condi~ions définies de fréquence, d'intensi~é et de durée provoque l'expulsion du deuxième globule polaire. On peut alors prélever les 5 chromosomes qui se ~rouvent en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. On dispose d'ovocytes dans le même état physiologique possédant un pronucleus.
On introduit alors un blastomère sous la zone pellucide et on procède à la fusion cellulaire par action d'un champ électrique.
Le procédé peut alors s'appliquer aux embryons clones ainsi obtenus, af in d'améliorer leur développement, c'est-à-dire de régulariser les divisions cellulaires et d'obtenir la compaction.
La stimulation par ce procédé peut s'appliquer à des ovocytes fraichement ovulés placés en présence d'un inhibiteur. de l'expulsion du 15 deuxième ~lobule polaire, comme la cytochalasine a, qui maintient un état diploîde. On obtient ainsi une population d'embryons parthenogénétiques, qui pourront être implantés dans des femelles receveuses et présenteront un développement synchrone du foetus et des annexes embryonnaires.
Ces expériences d'abord menées sur des ovocytes de lapine ont 20 été confirmées sur des ovocytes de souris, réputés réfractaires à l'activation juste après l'ovulation. Les performances du procédé sont donc reproduc-tibles d'une espèce à l'autre. La méthode d'activation pourra certainement s'appliquer à des ovocytes fraichemen~ ovulés de bovin ou d'ovin.
Si l'on soustrait les ovocytes en cours de traitement, ils 25 régressent et on obtient certains artefacts, comme des ovocytes en métaphase 111 reproductibles à volonté, et qui offrent de nouvelles possibilités d'études, notamment sur la dynamique du cytosquelette et I'activation du génome.
Le procédé a é~é conçu sur la base des effets des~champs 30 électriques sur les membranes plasmiques.
Il a été montré (Zimrnermann, 1982) que des impulsions de champs électriques de l'ordre de 1 à 3 kVcm-l et d'une durée de quelques ys peuvent créer des micropores dans la ~membrane plasmique et é~ablir une . , ... . . .
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2~7~1~g ~1VO 91/13977 PCl/FR91/00200 communication directe entre les milieux inlra et extra cellulaire. Il a été
ainsi possible par exemple de faire pénétrer du calcium dans des ovocytes d'oursin en les exposant à des impulsions de champs électriques en presence d'ions calcium (Rossignol et al 1983). L'amplitude de ces influx peut être S modulée par la durée de l'impulsion de ch~mp électriqu~.
I.e procédé implique la conlugaison d'une méthode de culture in vitro d'un lot d'ovocytes (ou ernbryons) par perfusion entre deux électrodes et d'une méthode de lavage avec une solution non conductrice, contenant du calcium 0 à 30 ~M, dans laquelle sont délivrées les impulsions.
10La présence d'une solution très faiblemenl conductrice, par exemple une ~-solution isotomique de glucose contenant les ions Ca, au moment d'une impulsion permet de faire apparaître un champ électrique en~re les électrodes. Une présence excessive d'ions diminue l'effet "champ élec-trique".
15De manière préférée, la concentration en ions Ca2~ est comprise entre 8 et 20 ~M. De bons résulta~s sont obtenus par exemple pour une concentration en ions Ca2~ valant 10 ~ ou bien 16 IIM.
L'alternance d'une période de culture et d'une période de lavage permet de soumettre fréquemment les ovocytes à des stimula~ions ~dans un milieu 20 ionique très bien déf ini.
Ce procédé peut s'étendre à la stimulation des cellules par tou~e une gamme de signaux simples ou complexes ioniques ou molécu-laires ~ des concentrations variables qui seront déterminés par la composition du milieu d'impulsion.
Ce procédé permet de moduler la fréquence du signal par la durée entre deux lavages, et son amplitude par la durée de l'impulsion électrique.
11 es~ impératif de rernplacer totalement le milieu de culture par Ia solution d'impulsion, car l'intensité du courant due à des excès d'ions 30 provenant du milieu de culture détruirait les ovocytes. Juste après I'impulsion, la solution d'impulsion est remplacée par le milieu de culture, les ovocytes ne pouvant pas survivre dans la solu~ion d'impulsion.
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n'O 91/13977 PC~/FP~91/00200 Ce procédé peut être piloté par l'intermédiaire d'un lo~iciel qui permettra de créer des traitement de stimulation selon des équationS
spécifiques. exporentielles, sinusoldales, suites de Fourier ou autres.
L'un des aspects de la présente invention est le trailement 5 simultané d'un ensemble d'ovocytes~ qui seront ainsi obtenus, activés dans le même état physiolo~ique. Les ~reffes de noyau pourront ainsi être réalisées sur des ovocytes physiologiquement identiques.
Lors du clonage, la séquence et les phases du cycle cellulaire durant lesquelles sont enchaînées les opérations ont des conséquences très 10 importantes sur le remodelage des noyaux et sur le développement ultér ieur.
Il est extrêmement intéressant de pouvoir s~andardiser les différentes phases du traitement des ovocytes~ afin d'obtenir une bonne reproductibilité du procédé.
La présente invention concerne donc un systeme dynamique, fonctionnant en continu et pouvant être automatisé, réalisé par un dispositif permettant la succession automatique des étapes de lavage, de stimulation et l'acquisition des paramètres de stimulation.
Ce disposi~if est caractérisé par le fait qu~il assure llimmobi-20 lisation des cellules pendant les différen~es phases du traitement.
Différents modes de réalisation de ce dispositif apparaissent . ~ .
sur les figures 1 et 3.
Il est constitué d'une enceinte comportant au moins unearrivée de fluide (10, Il) et une sortie de fluide (6) et, est caractérisé en 25 ce qu'à la partie inférieure de llenceinte se trouvent un ou plusieurs orifices (4) don~ la géométrie est telle qulelle sloppose au passage des cellules et en ce que le liquide entrant dans llenceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qulelle assure sensiblement le blocage des cellules sur le ou les orifices, 30 une partie du fluide étant évacuée par débordement.
Ce dispositif permet de retenir les cellules sans les abimer ni in~roduire une con~rain~e mécanique parasi~e. En ou~re, il perme~ à ~o~
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~0 91/13977 Pa~/FR91/00200 moment de replacer, prélever ou déplacer des cellules. Ce dispositif permet donc de placer successivement les cellules dans des milieux de composltion chimique de différentes natures, durant des périodes et selon une fréquence variables.
L'enceinte comporte sur ses parois internes deux élec~rodes, de préférence parallèles, et le ou les orifices sont alignés à égale distance des électrodes, baignant dans le milieu correspondant à la phase du trai ~ement en cours.
Grâce à ce dispositif, on peut à volonté cultiver les cellules ou bien dans le milieu d'impulsion faire pénétrer dans la cellule traitée7 un ion, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe.
Ce dispositif permet en particulier le traitement dans une même enceinte d'un ensemble d'ovocytes, en grand nombre, sans qu'il soit nécessaire de les placer dans des compartiments séparés.
En particulier, le dispositif comporte au moins deux arrivées de f luide, qui peuvent être superposées.
L'évacuation des fluides pourra egalement se faire latéra-lement.
A chaque milieu arrivant successivement dans la chambre, 20 correspond une tubulure d'injection distincte.
Au mornent de l'injection du milieu d'impulsion, un système d'aspiration adapté sur le dispositif d'arrivée du milieu de culture permet la succion d'une petite quantite du milieu d'impulsion qui pénètre dans la canalisation d'arrivée du milieu de culture; on évite ainsi que les ions du 25 milieu de culture pénètrent dans la chambre durant les lavages. La circulation des flux de milieu est représentée par des flèches sur la f i gure 3.
Ces milieux, aussi bien le milieu de culture que le milieu d'impulsion, sont en circulation continue, et c'est ce flux de liquide qui par 30 effet de succion assure le maintien des ovocytes entre les électrodes pendant les renouvellements du milieu.
Les compositions des m.lieux de culture sont connues et dépendent des cellules en culture. Le milieu d'impulsion est généralement -.
2~7~3~ ~
-'0 91~13977 PS:~/FR91/{)0200 cons~itue d'un milieu non ionique pour assurer un effet de champ. Il s'agira d'une solution isotonique par exemple de glucose.
La présence d'une grande quantité d'ions peut gravement nuire aux cellules lors de l'impulsion. Il est donc nécessaire de laver les cellules avec le milieu d'impulsion pour éliminer les ions contenus dans le milieu de cult lre.
Ce dispositif peut être conçu comme une chambre d'activation, dont la capacité peut être adaptée au nombre de cellules que l'on souhaite traiter simultanément.
Les caractéristiques du procédé mettant en oeuvre le dispositif, peuven~ varier largement et ne sont en général limitées que par ?
des conditions telles que les durées de lavage. Ainsi, la fréquence des irnpulsions est limitée par la durée de lavage rninimum par le milieu d'impulsion.
Les paramètres du procédé et du dispositif clest-à-dire les arrivées et les sorties de fluide, de même que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions électriques arrivant dans les électrodes sont gérées par un système électronique.
Les caractéristiques des impulsions électriques en elles-mêmes peuvent varier et dépendre des cellules et des buts recherchés.
En général, les champs électriques varient de 1 à 3 Kv. cm 1 et l'impulsion électrique aube durée de 10 lls à 2 000 ~s.
La fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de s~imulation.
L'organisation des tubulures qui débouchent dans la chambre permet d'injecter des milieux sans que les ovocytes soient décrochés par les bulles de gaz qui finissent par se former dans les canalisations. De plus, la structure de distribution des milieux permet de limiter considérablement la contamination ionique du milieu de stimula~ion par les ions du milieu de culture. ;`
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~0 91/t3977 PCl/FR91/00200 I l .
Les pompes d'injection des milieux peuven~ être commandées par un microordinateur qui déterminera les séquences de lavage répétables tout en maintenant les cellules entre les électrodes.
Ce dispositif pourra s'appliquer au traitement des cellules par toute substance que l'on souhaite faire pénétrer dans l'espace intracellu-laire. La composition du milieu d'impulsion determinera la pénétration de cette substance selon un gradient de concentration.
Lors d'une culture cellulaire, on pourra provoquer, à un moment déterminé, qui peut être unique, I'entrée dans l'ensemble des cellules de la substance souhaitée. Pour cela on remplacera le milieu de culture par le milieu d'impulsion et on déclenchera l'impulsion de champ - électrique, la durée de l'impulsion déterminant la quantité de substance qui pénètre. Ce milieu d'impulsion pourra alors etre évacué et les cellules remises en culture dans un milieu approprié. L'avantage de ce système est qu'il permet de traiter simultanément un ensemble de cellules qui sont ainsi synchronisées. Il fonctionne en continu e~ évite toute manipulation des cellules, assurznt ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande rapidité d'exécution. Ceci permet une standardisation des conditions et facilite le transfert de technologies.
On peut envisager de faire pénétrer dans les cellules un ion ou une molécule simple. Ce disposi~if peu~ aussi s'appliquer à la stimulation des cellules par une molécule plus complexe, ou à la pénétration de ; fragments d'ADN, ou d'épisome.
Ce dispositif sera utilisé pour réaliser une stimulation cyclique des cellules, plusieurs séquences de base étant réalisées ~i successivement, l'intensité, la durée et la fréquence des impulsions pilotées par l'intermédiaire d'un microordinateur.
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~0 91/13977 PCr/lFR91/002~0 Ce disposi~if perme~ la réalisation du procédé d'activation et de svnchronisation d'ovocytes, par des stimulations répétees par Ca2, en vue du clonage d'embryons d'animaux domestiques.
5Un mode de réalisation de la chambre est représenté en figure 1.
Les ovocytes I sont placés sur une fente rectiligne 4, réalisée par la juxtaposition de deux plaques de verre 3 et 5, dont l'ecartement est inférieur au diamètre des ovocytes. Les milieux, milieu de culture et milieu 10d'impulsion, arrivent dans la parti~ supérieure de la chambre chacun par une tubulure distincte, respectivement 10 et 11, évitant une con~amination réci proque.
Le milieu 9 correspondant a la phase de traitement en cours arrive en c~ntinu et est évacué par une tubulure 6 située à un niveau plus 15bas que celui des ovocytes. Ce courant de liquide maintient par succion les ovocytes plaqués sur le fond de la chambre.
Sur les parois internes de la chambre se trouvent deux électrodes de platine 2 et 7, parallèles, de 1 cm de long.
L'enceinte 8 est thermostatée à 38C.
20Chaque milieu arrive dans la chambre après passage par un système retenant les bulles de gaz de taille importante.
Ce système est constitué d'un ballon de verre dans lequel le liquide arrive. De ce ballon part une tige d'or per~orée de trous de petit diamètre; après passage à travers cette tige, les bulles de gaz de taille 25importante sont retenues et le liquide arrive dans la chambre par une tubulure courte.
Des lapines ont été superovulées par injection de FSH et de LH, et les ovocytes prélevés dans les oviductes. Après traitement 5 mn par la hyaluronidase, les ovocytes sont placés dans la chambre d'activation, 30dans le milieu B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282, 1967-1970) à 38C, dans une atmosphère à 5 % de CO~
Les ovocytes peuvent immédiatement être soumis au traitement d'activation, au~une période de ~ viellissement n'es~ nécessaire.
1 . ~ ~ ' 2 ~ 7 ~
.. ..
~O 91~13977 PCr/FlR91/03)2û0 lls sont soumis pendant 90 minutes à une série d'impulsions de champ électrique. à un rythme d'une i~npulsion toutes les 4 minutes, soit 22 impulslons de durée decroissante dissipant une éner~ie totale 1250 ujoules, d~une duree totale de 14 868 ~Is, le champ électrique a une valeur de 1,8 Kv. cm~ 1.
Avant chaque impulsion, le milieu de culture est remplacé par un milieu d'impulsion constitué d'une solution isotonique de glucose contenant CaC12 1 0~M.
A la fin du traitement d'activation, tous les ovocytes ont deux globules polaires bien formés. On obtient donc au même moment, à
quelques minutes près, une population homogène d'ovocytes activés dans le meme état physiologique. Cela présen~e deux atouts: le premier est de pouvoir ~oujours réaliser les greffes de noyau dans des oeufs physiologi-quement identiques, le second, plus pratique, est de pouvoir opérer au moment où les chromosomes (haploldes) se trouvent tous en fin de télophase jus~e sous le deuxième globule polaire. Ce repérage naturel de I'endroit où se trouvent les chromosornes facilite leur retr~it en "aveugle"
et permet, sans avoir recours à des techniques de marquage fluorescent, d'enchaîner rapidement les étapes de manipulations.
On peut alors effectuer le prélèvement des chromosomes. On remarque que les deux globules polaires ne sont pas toujours accolés ~certains sont à l'opposé l'un de l'autre, c'est pourquoi le premier ~lobule polaire n'est pas un bon rnarqueur de l'endroit où se trouven~ les chromo-somes maternels). L'efficacité de cette opération, vérifiée par la présence ultérieure d'un pronucleus, est supérieure à 80 %. Un blastomère est ensuite introduit sous la zone pellucide. Quinze à 20 ovocytes peuvent être manipulés en 1 heure.
On procède ensuite à la fusion cellulaire. La méthode de fusion cellulaire dérive des travaux de Zimmerman sur les champs électriques. La procédure a été affinée. (Ozil et Modlinski 1986, J. Embryol.
Exp. Morph. 96, 211-228).
On obtient 100 % de fusion. Il sera possible ~e réaliser automatiquernent, sous le contrôle d'un logiciel, I'alignement et la fusion cellulaire dans la charnbre de stimulation. Cette procédure permettra de limiter la durée des manipulations e~ de standardiser les conditions expérimentales.
'-. ' ~ ~ ... ..
~/0 91/13977 PCT/FR91/00200 EXEMPLE I
MATERIELS ET METHODES
On a induit une superovulation chez les femelles de lapin sexuellement matures d'espèces variées par injection sous-cutanée d'hormone stimulant le follicule ~FSH) et d'hormone lutéinisante (LH) en accord avec la technique décrite par Kennely et Foote (1965) et modifée par Thibault (communication personnelle). Les femelles ont reçu 2 mg de FSH en cinq injections à 12 heures d'intervalle: 0,250, 0,250, 0.650, 0,650 et 0!250 mg. 12 heures plus tard? avant la saillie par un mâle vasectomisé, on leur a injecté 0,33 mg de LH.
Les ovocytes ont éte récupérés à partir des oviductes 12-l5 h après la saillie par lavage par une solution saline de phosphate tamponné
l 5 (PBS). Ils ont été incubés pendant 5 mimJtes dans l'hyaluronidase t300 i.u.rnl- I dans du PBS) pour éliminer les cellules folliculaires. Après le traitement, les ovocytes ont été cultivés à 38 dans du milieu B2 (Ménézo 1976) dans une atmosphère à 5 % de C02.
Méthode et proccdure expérimentaie La perméabilité membranaire des ovocytes de lapin fraiche-ment ovulées a été transitoirement augmentée par ouverture des pores par une impulsion induite par un champ électrique en présence de Ca2 10 IIM
contenu dans une solution de glucose 0,3 M - 1~ MOhm H20 ~milieu d'impulsion). Il est admis que, pendant que les pores sont ouverts, un fl-lx d'ions circule selon les gradients de concentration à travers la membrane cellulaire vers l'in~érieur du cytosol comme cela a déja été montré dans des ovc~cytes d'oursin (Rossignol et al, 1983). Ainsi, I'influx ioni~e peut être ajusté dans ces conditions soit par la différence de concentration ionique entre l'interieur et lIextérieur de la cellule soit par la durée des impulsions.
La procédure expérimentale pour un flux ionique induit électriquement était similaire à celle précédemment décrite pour la fusion par champ électrique d'embryons de lapin à deux cellules (Ozil et Modlinski 1986). Les ovocytes sont cultivés avec du milieu Ml6 (Whittingham, 1971) à
38C dans une charnbre spécialement conSue. Avant chaque impulsion, le , ~7~3~
~O 91/13977 PCr/FR91/0020û
milieu de culture est automatiquement remplacé par le milieu d'impulsion.
Les détails de la chambre sont décrits dans la figure 1. Chaque impulsion é~alt composée de deux impulsions alternatives afin d'éviter " une électrophorèse latérale " (~affe 1977) des protéines de membrane qui 5 pourrai~ intervenir après plusieurs impulsions de la meme polarité ~Poo, 1981). L'amplitude du signal ionique etait modulé à travers la durée de l'impulsion. Le processus en entier était contrôlé par un mlcro-ordinateur IBM PC-AT 286 par l'in~ermédiaire d'une interface Tektronix Ml 5010 avec un pro~ramme écrit en MS-BASIC. Le Yoltage réel et le courant entre les électrodes étaient mesurés par un oscilloscope Tektronix 77041 monté avec un convertisseur numérique programrnable 7D20 et un amplificateur 7A22.
Le rythme des impulsions électriques et la durée totale du traitement étaient les mêmes pour tous les traitements, c'est-à-dire appliquer une impulsion toutes les quatres minutes pendant 90 minutes.
15 Ces valeurs ont été choisies parce qu'elles s'accordent bien avec la fréquence et la durée moyenne de l'hyperpolarisation du potentiel de membrane des ovocytes de lapin pendant la fécondation (22 oscillations biphasiques du potentiel membranaire pendant les premières 90 minutes suivant la fusion sperme-oeuf, une impulsion toute les 4 minutes -McCulloh 20 et al., 1983). On sait que la variation du potentiel de membrane reflète le passa~e de 1< basé sur des canaux activés par le calcium et qu'elles corstituent donc un indicateur fiable de [Ca2~]i (Miyazaki et Igusa 1982).
L'amplitude de champs électriques tl.8 kVcm-l) etait constante pour tout les groupes expérimentaux.
Traitement des o~cytes Les effets des différents paramètres du traitement sur - liactivation des ovocytes ont été étudiés dans quatre groupes expérimen-30 taux.
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.~0 91/13977 PCT/FRgl/00200 Groupe A - Environnement expéFimental : .
Afin de tester l'effet des conditions expérimentales (perfusion continue. remplacement du milieu de culture et impulsions électriques), des 5 ovocytes fraichement ovules et des oeufs fecondés soumis à 22 doubles impulsions de 900 ~s dans le milieu d'impulsion dépourvu de Ca2 ~la première impulsion est donnée 13 à 15 heures après la saillie). Après le traitement, les oeufs fécondés ont été transférés dans des receveuses pour déterminer la survie à terme. Les ovocytes non fécondés ont été cultivés in 10 vitro et le taux d'activation parthenogénétique a été noté.
Groupe B - ions calcium et durée des impulsions _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ;
L'effet de la durée des impulsions a été ét~dié dans le milieu d'impulsion contenant du CaC12 10 ~M. Le traitemen~ pour lequel les ovocytes ne sont pas activés a été considéré comme étan~ la durée minimum et celui résulta nt dans la Iyse des ovocytes a été considéré
comrne étant la durée maximum. Un jeu de six traitements avec 22 doubles impulsions constantes a été choisi arbitrairement. Ces traitements on~ une durée d'impulsions égale à 200, 300, 600, 900, 1200 et 1500 lls respective-ment. L'effet de la présence d'ions Na+ et Mg2+ à une concentration de 10 M dans le milieu d'impulsion a été testé avec 22 doubles impulsions constantes d'une durée de 900 IJs Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-______________ ___ __ :
~énétique ____.__---- -- ~
Le traitement avec 22 doubles impulsions de durée constante révèle la valeur de la durée de l'impulsion pour laquelle les effets maximum et minimum sont enregistrés. Ces traitements constants ne produisent pas un taux élevé d'activation avec un type uniforme d'oeufs parthéno~énétiques. Afin de vérifier si une réduction progressive des ."~
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WO 91/13977 PC~/FR9ltO0200 stimuli calcium dans un trai~ement donné a un effet sur ie type de réac~ion parthénogénétique, les ovocytes ont été soumis à des trai~ements dans lesquels la durée des impulsions décroissait peu à peu selon une relation exponentielle négative. Quatre traitements ont été testés en accord avec la durée maximum de la première impulsion. La figure 2 donne la courbe des durées d'impulsions pour ces traitements.
Une relation exponen~ielle négative (D~u)-e (axutb)~c) en~re I'indice de l'impulsion (I à 22) et la durée d'impulsion (1500 ~s à 200 us) a été choisie arbitrairement pour trouver la valeur de chaque impulsion au cours du traitement.
~vec D(u): durée d'impulsion du cycle (u).
Le coefficient a détermine la pente de décroissance de cette relation.
Le coefficient b détermine la durée de la première impulsion.
Le coefficient c détermine la durée de la dernière impulsion.
Les coefficients a et c sont constants et égaux respectivement à -0,4 et 200.
b = 5,9920 pour le traitement I
= 6,5 510 pour le traitement 11 6,9080 pour le traitement 111 = 7,1700 pour le traitement IV.
Groupe D - Modulation du champ électrique et développement in vitro _ _ __~_~_________._________ __ ________________ ______ __ ____ _ _ _ ___ ____ .
Les oeufs sont traités en présence de 8 ~gml- I de cytocha-lasine ~ dans le milieu de cùlture pour bloquer l'expulsion du second globule polaire et obtenir une population uniforme d'oeufs parthéno-génétiques diploides. Deux traitements ont é~é appliqués au groupe C, le traitement I qui est le traitement faible avec une durée totale d'impulsion égale à l l 228 ~JS et le traitement 111 qui est le traitement fort avec une durée de 14 868~s. Les oeufs parthénogéné~iques ont été cultivés in vitro jusqu'au stade blastocyste et l'influence des deux traitements a été évalué
par le taux de formation de blastocyste~
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~VO 91/13977 PCI/FR91/00200 1~ .
Viabili~é au delà de l'implantation des embryons parthénogénétiques d i plo i des Les embryons au stade 4-cellules ont été transplantés dans les oviductes de receveuses. Les oeufs fécondés ont également été transplantés dans la corne opposée de quelques receveus~es afin de comparer le développement parthénogénétique au développement normal. Les receveu-ses ont été autopsiées entre le Jour 8.5 et le jour 13 de la gestation et le nombre de sites d'implantation de foetus vivants a été noté.
RESULTATS
Groupe A - Effet de l'environnement expérimental (contrôles) 1 5 __ ____ __________ _____ __ .
Quant le milieu dlimpulsion ne contient pas d'électrolytes, aucun des ovocytes ~105) n'est activé. L'environnement expérimental et les conditions de cul~ure c'est-à-dire le remplacemen~ du milieu de culture avant chaque impulsion par un milieu d'impulsion ne contenant pas d'électrolytes et le traitement par des impulsions électriques relativement fortes (2 x 1.8 kVcm-lx900l1s x 22 fois, c'est-à-dire une durée totale d'impulsions de 30 600 lls) n'a pas d'effet visible sur les ovocytes fraîchement ovulés mais les condi~ions ne permettent pas de déclencher le développernent. Par contre 41 % t9/22j des oeufs fécondés traités de la 2 5 même manière se sont développés à terme démontrant ainsi que le traitement par des impulsions électriques de haut voltage n'a pas d'effet contraire sur la capacité de développement des ovocytes fécondés. Il n'était pas possible de remplacer totalement le milieu de culture par le milieu d'impulsion avant chaque impulsion. Le courant mesure pendant l'impulsion révèle que la conductivité du milieu d'irnpulsion est au moins de 15 %
supérieure à celle du milieu d'impulsions mesurée entre les électrodes avant expérience et avant la premiere injection de milieu de culture.
Pendant l'experimentation, des ions provenant du milieu de culture sont encore présents pendant les impulsions et ceci modifie le signal ionique.
Ces variations du micro-environnement n'apparaissent pas comme ayant un quelconque effet significatif sur l'activation ou le développement embryonnaire. Dans ce~te série d'expérimentations, les oeufs sont lavés par :, . . , :.
J ~
~0 91/13977 PCT/FR91/002ûO
le milieu d'impulsion pendant 45 secondes toutes les quatre minutes. Cette p~riode pendant laquelle les oeufs ne sont pas dans le milieu de culture n~a pas d'effe~ significatif sur l'activation ou sur la survie à terme.
5 Groupe ~ - ions calcium et durée de l'impulsion _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Le tableau I résume les résultats de l'expérimentation dans lequel le taux d'activation a été testé en relation avec la durée d'impulsion en présence de CaC12 lO ,uM.
I0 L'apparition de pronuclei après 3 ou 4 heures de culture sert de marqueur pour l'activation parthénogénétique. Ces résultats mon~rent clairement que l'activation parthénogénétique est déclenchée qaand le milieu d'impulsion contient Ca~ lO IIM.
De plus, le taux d'activation est directement relié à la durée 15 de l'impulsion qui contrôle indirectement la stimulation par le calcium. La durée des stimuli ioniques n'influence pas seulement le taux d'activation mais aussi la configuration nucléaire des ovocytes parthénogénétiquement activés d'age postovulatoire semblables.
Plus la durée d'impulsion est longue, plus la proportion d'oeufs 20 activés est élevée mais plus la proportion d'ovocytes contenant des micronuclei est importante.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-~; _ __ ______ _ __ __ ___ _ _ ,, génétique.
Les résultats sont résumés dans le tableau 11. La relation entre le type d'activation parthénogénétique et chaque traitement est égalernent montrée dans le tableau 111. Quand la durée de l'impulsion est réduite, tous les ovocytes sont activés et la majorité (91 %~ d'entre eux ont un 30 pronucleus unique et deux globules polaires quand la rnéiose est terminée.
Ainsi, la modulation des stimuli de calcium à travers la durée de l'impulsion semble être effective et influence les premières étapes du développement.
Dans cette étude, I'â~e des ovocytes était sirnilaire et ne peut donc pas affec~er les résultats.
.
.~0 91/13977 PCr/FR91/00200 2~
Groupe D - Effet de la modulation de champ électrique sur le ..
5 développement in vitro d'ovocytes activés par parthénogénèse.
_ _ _ _ _ _, _ _ _ _ _ , Les résulta~s sont résumés dans le tableau 111. Aucune différence visible dans le développemenl de chaque groupe n'a pu ê~re notée jusqu'à la Iroisièrne division.
Dans les embryons parthénagénétiques produits par le traitement 1, une proportion plus faible d'embryons présente une compaction et ceux qui se compactent sont irréguliers. Par eontre, la majorilé des embryons produits par le traitement 111 se compacte e~ se développe jusqu'au stade de blastocyste.
Ces résultats montrent que la forme du stimulus d'activation a un effet profond sur la capacité des embryons parthéno~énétiques à se développer jusqu'au stade de blastocyste in vitro.
Viabilité post-implantation des oeufs parthénogénetiques diploldes.
2~
13 receveuses sont devenues gravides et ont été autopsiées -entre le jour 8.5 et le jour 13. Les résultats sont résumés dans le tableau IV.
Bien que les embryons parthénogénétiques soient plus peti~s que les embryons de contrôle, ils appa!aissent morphologiquement normaux selon les critères définis pour le lapin. Le rapport entre la tail!e des annexes embryonnaires et celle du foetus est grossièrement équivalent pour les embryons obtenus par fécondation ou par parthéno~énèse.
Ainsi, il semble que le développement ~éneral des embryons parthénogénétiques, le foetus et ses tissus trophoblastiques soit ralenti.
Les foetus morts ont plusieurs anomalies et il n'était pas possible de les classifier.
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~ ~ 7 ~
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~O ~1/13977 P~/FR91/00200 Tableau I -Effet de la présence d'ions calcium et durée de l'impulsion électrique sur l'activation des ovocytes de lapin Durée Nomb-e Nombre % % d'ovocytes activés avec d'impulsion d'ovocytes Iyses (%) activés I PN+PBI 2PN 2PN#
(~s) ~PB2 ~PB I -PB I
200 ~s 47 0 (0) 13 83 17 0 300 ~s 99 0 (0) 62 68 25 7 60011s 85 0 (0) 98 71 19~ 10 900 ~s 63 0 (0) 100 62 14 24 1 200 lls 97 5 ~5) 100 57.29 14 l 5 1 500 ~s 50 3 ~6) 100 30 l ~ 53 Tableau 2 - Effet de la modulation du champ électrique sur l'activation TraitementNornbre % % ovocytes activés avec . i d'ovocvtesactivation I PN+PBl 2PN 2PN#
~PB2 ~ PBI -PBl : :
11 15l 99 89 9 111 l 18 lO0 91 9 0 IV 96 lO0 70 25 5 # Pronuclei anormaux, petits micronuclei i ~
,:
~VO 91/13977 2 a ~ /FR9l/002oo Tableau 3 -Effet de la modulation de champ électrique sur le développement d'oeufs parthénogénétiques in vitro Traitement Nombre ,6 Nombre Nombre Nombre d'ovocytes activa_on cultivés !norulae blastocystes compact (/0) (6) 98 91 69 25(36) 23 (33) 111 352 100 244 244(100) 216 (88) Tableau 4 -15 Developpement post-implantal:ion d'oeuis parthénogénétiques soumis au traitement 111.
Jour de l'autopsie J 8-9 J 9-10 J10-11 J 12-13 Total Nombre d'oeufs ~: transférés 21 26 50 68 165 ,~
, Nombre d'implan-tations 9 3 15 23 50 , % cumulé (42,8) ~21,2) (27,8) (30,3) .', Nombre de foetus - vivants 8 3 7 0 18 .
. ~ % cumulé (88,8) (91,6) (66,6) (36) ' : "
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tlVO ~1/13977 PCI/FR91/00200 de chocs électriques, ~hermiques ou osmotiques, d'enzymes ou d'agen~s anesthésiques (Kaufman ~lH 1983 - Early mammalian development -parthenogene~ic studies - Cambridge University Press). Cependant, I'activation est toujours identifiée à un stimulus unique, limité dans le 5 temps, supposé mimer la pénétration du spermatozolde dans I'oeuf. Aucun de ces traitements ne reproduit la série de chan~ements physiolog~ques se produisant dans l'oeuf après la pénétration du spermatozolde.
On ne connait que quelques cas d'activation parthénogenéti~ue de l'ovocyte de vache (Menezo et al. 1976 - Commission of the European 10 Coimmuni~ies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. Eur 5491); aucune méthode vraiment fiable et précise d'activation des ovocytes de bovins n'est disponible. L'activation expérimentale par Iréthanol présente de nombreux inconvénients: grande variabilité des résultats en fonction de l'âge des ovocytes (Cuthbertson, 1983 ; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).
En ce qui concerne le clonage d'embryons, les premiers résultats incontestés ont été obtenus par S. Willadsen en 1986 chez la brebis. Ils ont été suivis par ceux de Prather et al en 1987 chez la vache, et en 1989 chez la truie. Chez la lapine, les premiers individus issus de 20 clonage ont été obtenus par Stice et Robl en 1988. Les ~aux de succès de ces expériences rapportés dans les publications ne dépassent généralemen~
pas 4 %. Toutefois, des sociétés américaines (Granada Genetics, Houston, Texas) ou Canadienne (Alta Genetics, Callgary, Alberta), semblent rnaîtriser la procéJure de clonage chez les bovins. Il est dit qu'une centaine 25 de veaux aurait déjà été obtenue sur le continent nord-américain. Cette prise en main industrielle reflète l'intérêt que susci~e le clonage d'embryon chez les bovins. kAais les techniques ont-elles vraiment progressé ?
Les procédures décrites dans les publications se ressemblent.
Les ovocytes utilisés ont subi une période de vieillissement de 6 à 10 30 heures. Ce veillissement es~ rendu nécessaire pour favoriser l'activation (aucune technique classique d'activation ne permet d'activer des ovocytes fraîchement ovulés même chez les bovins (Ware et al. 1989). Les chromosomes or~anisés sur 13 métaph.se 11 sont prélevés en "aveugle" dans ' ' , .~
-~ 2~ 138 ~0 91/13977 PCl`/FR91/00200 la region du premier globule polaire, mais des techniques de visualisation des chromosomes par fluorescence sont mises en oeuvre. Une cellule embryonnaire provenant d'une morula est introduite sous la zone pellucide et la fusion est obtenue par des impulsions de champs électriques.
L'activation de l'ovocyte est généralement provoquée par la procédure de fusion cellulaire; dans certains cas, elle n'est pas décrite. Deux chercheurs ont pu obtenir un agneau à la suite du transfert dans un ovocyte d'un noyau provenant d'une cellule du bouton embryonnaire (Smith a~ Wilmut, L989).
Toutefois, le niveau des resultats et la complexité des mécanismes en jeu tels que le stade de différenciation du noyau, la phase du cycle cellulaire, l'état de l'ovocyte receveur~ son âge! la procédure dIactivation ne permettent pas de comprendre pou~quoi certains embryons se développent et d'autres non. De nombreuses théories pour expliquer les échecs comme celle fondée sur l'ac~ivité de transcription du noyau l 5 transplanté ont été contredites par quelques résultats expérimentaux.
Des données nouvelles sont apparues sur les mécanismes physiologiques déclenchés par la fécondation et notamment en ce qui concerne les rythmes des variations de niveau du calcium libre et des seconds messagers comme l'lnositol (1,6,5)-tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. l981; Cuthbertson ~ Cobbold, 1985; Miyazaki et al.
1986; Miyazaki, 1988). L'activité périodique de ces seconds messagers pourrait régul~er les synthèses des acides nucléiques (ADN et ARNs) et des protéines (Basset et al. 1968; Rodan et al. 1978).
Le processus est déclenché par le spermatozolde dans les secondes qui suivent la fécondation~ La chaîne de réactions qui aboutit à la production d'lnsP3 semble dépendre d'un influx d'ions calcium. L'lnsP3 se lie à un récepteur spécifique qui contrôle l'activité d'un canal calcique situe sur la membrane intracellulaire d'un réservoir intracellulaire de calcium.
Le calcium ainsi libéré active des protéines spécifiques, qui elles-mêmes activent des processus spécifiques, par exemple la complexation calcium-` calmoduline, I'activation de kinase etc. Le calcium est considéré comme I'activateur principal du métabolisme. Ce cycle de réactions se reprodui~ à
( :
20rl~ 3~
r~O 91tl3977 PCI`/FR91/00200 une fréquence de l'ordre de la minute durant plusleurs heures ~1cCulloh et al. 1983; Igusa ~c Miyazaki, 1983-1986 ~ liyazaki et al. 1986; .~/liyazaki;
1 9~S).
Cette activité rythmique, due a un système de si~nau~
5 intracellulaires émis à une fréquence propre, semble dépendre de la presence de pronuclei male et femelle car elle n'a pu etre observée sur des oeufs parthénogénétiques activés par des méthodes classiques ~Cuthberston et al. 1981; Cuthbertson d( cobbold, 1985; Miyazaki, 1988). `
L'injection dans des ovocytes d'une protéine G ~guanosine 10 -5'-0-(3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induit plusieurs cycles de liberation decalcium, mais ne permet pas de maintenir cette activité au-delà du quatrième (Swann, Igusa ~c Miyazaki, 1989).
Les contributions génétiques respectives de l'ovocyte et du spermatozolde sont très documentées chez la souris. Ces études montrent 15 que le développement normal à terme d'un embryon dépend de la présence permanente durant tout le prernier cycle cellulaire des deux pronuclei parentaux (PN) ~Surani ~ Barton 1983; Mc(;rath ~ Solter, 1984; Surani et al. 1986; Mann ~ Lovell - Badge, 1986, 1988).
La production de jeunes par clona~e ne peut être réalisée dans 20 la pratique que si l'on dispose de procedés fiables et reproductibles. La qualité de l'activation de I'oeuf joue dans le développement un rôle important jusque là ignoré.
La maîtrise de l'activation comprise comme phénomène rythmique s'etendant sur tout le premier cycle cellulaire es~ essentielle, 25 non seulement pour produire en routine des ovocytes activés et synchrones mais aussi pour faire bénéficier des oeufs "clonés" de ce type d'activation imposee pour se développer normalement.
La présente invention concerne donc un procédé de stimula-tion artifieiel, notamment à long terme, d'un ensemble de cellules 30 reproduisant l'effet d'un mecanisme de régulation biochimique, contrôlé
dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suiv~ntes:
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~"" .
. . - ,: :
2~7~
~0 91/13977 PCT/FR91/00200 a) les cellules sont placées en culture in vitro, pendant un temps détermine, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, 5 c) on soumet les cellules a une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, `
e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, et f) on ob~ient les cellules dans un état activé homogène.
L'élimination du milieu de culture sera de préférence 10 complétée par un lavage des cellules par le milieu d'impulsion.
Ce procédé de stimulation bien qu'il puisse être utilisé dans un grand nombre de procédés, a été mis au point dans le cadre de l'activation des ovocytes en vue du clonage d'embryons. Des études récentes ont en effet montré que dans les oeufs de mammifères, la fécondation est 15 accompagnée d'une augmentation transitoire de la concentralion intracel-lulaire de calcium libre ([Ca2 ]i]' suivie d'une série d'oscillations de cette concentration, qui dure au moins 4 heures.
On ignore encore par quel moyen le spermatozoïde déclenche ces variations de [Ca2 ]i~ ainsi que les fonc~ions biologiques exactes de ces 20 oscillations de Ca2 de longue durée. Cependant, elles semblent caracté-ristiques des oeufs fécondés et niont jamais été observées quand les ovocytes sont artiiiciellement activés (Miyazaki 1988 - J. Cell. Biol. 106, ; 345-353).
Le procédé développé dans la présente invention va donc 25 permettre de stimuler périodiquement les ovocytes par des influx de calcium au niveau de la membrane plasmique.
En effet, en introduisant dans le milieu d'impulsion des ions Ca2t, ceux-ci vont pouvoir péné~rer dans la cellule par l'électroporation, c'est-à-dire la création de "pores" générées par l'impulsion électrique.
Au-delà des phénomènes immédiats provoqués dans l'ovocyte comme l'expulsion du globule polaire, les effets de cette stimulation se ; ~manifesteront sur les stades ultérieurs du développement de i'embryon, alors meme que le ~raitement a cessé. C'est ainsi que les phénomènes de compaction et de cavitation poùrront être affectés.
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~-'0 91/13977 PCl/FR91/00200 Ce procédé peut s'appliquer au~ ovocytes fraich~ment ovulés, obtenus par stimulation hormonale de la femelle. L'activation des oYocy~es dans les condi~ions définies de fréquence, d'intensi~é et de durée provoque l'expulsion du deuxième globule polaire. On peut alors prélever les 5 chromosomes qui se ~rouvent en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. On dispose d'ovocytes dans le même état physiologique possédant un pronucleus.
On introduit alors un blastomère sous la zone pellucide et on procède à la fusion cellulaire par action d'un champ électrique.
Le procédé peut alors s'appliquer aux embryons clones ainsi obtenus, af in d'améliorer leur développement, c'est-à-dire de régulariser les divisions cellulaires et d'obtenir la compaction.
La stimulation par ce procédé peut s'appliquer à des ovocytes fraichement ovulés placés en présence d'un inhibiteur. de l'expulsion du 15 deuxième ~lobule polaire, comme la cytochalasine a, qui maintient un état diploîde. On obtient ainsi une population d'embryons parthenogénétiques, qui pourront être implantés dans des femelles receveuses et présenteront un développement synchrone du foetus et des annexes embryonnaires.
Ces expériences d'abord menées sur des ovocytes de lapine ont 20 été confirmées sur des ovocytes de souris, réputés réfractaires à l'activation juste après l'ovulation. Les performances du procédé sont donc reproduc-tibles d'une espèce à l'autre. La méthode d'activation pourra certainement s'appliquer à des ovocytes fraichemen~ ovulés de bovin ou d'ovin.
Si l'on soustrait les ovocytes en cours de traitement, ils 25 régressent et on obtient certains artefacts, comme des ovocytes en métaphase 111 reproductibles à volonté, et qui offrent de nouvelles possibilités d'études, notamment sur la dynamique du cytosquelette et I'activation du génome.
Le procédé a é~é conçu sur la base des effets des~champs 30 électriques sur les membranes plasmiques.
Il a été montré (Zimrnermann, 1982) que des impulsions de champs électriques de l'ordre de 1 à 3 kVcm-l et d'une durée de quelques ys peuvent créer des micropores dans la ~membrane plasmique et é~ablir une . , ... . . .
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2~7~1~g ~1VO 91/13977 PCl/FR91/00200 communication directe entre les milieux inlra et extra cellulaire. Il a été
ainsi possible par exemple de faire pénétrer du calcium dans des ovocytes d'oursin en les exposant à des impulsions de champs électriques en presence d'ions calcium (Rossignol et al 1983). L'amplitude de ces influx peut être S modulée par la durée de l'impulsion de ch~mp électriqu~.
I.e procédé implique la conlugaison d'une méthode de culture in vitro d'un lot d'ovocytes (ou ernbryons) par perfusion entre deux électrodes et d'une méthode de lavage avec une solution non conductrice, contenant du calcium 0 à 30 ~M, dans laquelle sont délivrées les impulsions.
10La présence d'une solution très faiblemenl conductrice, par exemple une ~-solution isotomique de glucose contenant les ions Ca, au moment d'une impulsion permet de faire apparaître un champ électrique en~re les électrodes. Une présence excessive d'ions diminue l'effet "champ élec-trique".
15De manière préférée, la concentration en ions Ca2~ est comprise entre 8 et 20 ~M. De bons résulta~s sont obtenus par exemple pour une concentration en ions Ca2~ valant 10 ~ ou bien 16 IIM.
L'alternance d'une période de culture et d'une période de lavage permet de soumettre fréquemment les ovocytes à des stimula~ions ~dans un milieu 20 ionique très bien déf ini.
Ce procédé peut s'étendre à la stimulation des cellules par tou~e une gamme de signaux simples ou complexes ioniques ou molécu-laires ~ des concentrations variables qui seront déterminés par la composition du milieu d'impulsion.
Ce procédé permet de moduler la fréquence du signal par la durée entre deux lavages, et son amplitude par la durée de l'impulsion électrique.
11 es~ impératif de rernplacer totalement le milieu de culture par Ia solution d'impulsion, car l'intensité du courant due à des excès d'ions 30 provenant du milieu de culture détruirait les ovocytes. Juste après I'impulsion, la solution d'impulsion est remplacée par le milieu de culture, les ovocytes ne pouvant pas survivre dans la solu~ion d'impulsion.
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n'O 91/13977 PC~/FP~91/00200 Ce procédé peut être piloté par l'intermédiaire d'un lo~iciel qui permettra de créer des traitement de stimulation selon des équationS
spécifiques. exporentielles, sinusoldales, suites de Fourier ou autres.
L'un des aspects de la présente invention est le trailement 5 simultané d'un ensemble d'ovocytes~ qui seront ainsi obtenus, activés dans le même état physiolo~ique. Les ~reffes de noyau pourront ainsi être réalisées sur des ovocytes physiologiquement identiques.
Lors du clonage, la séquence et les phases du cycle cellulaire durant lesquelles sont enchaînées les opérations ont des conséquences très 10 importantes sur le remodelage des noyaux et sur le développement ultér ieur.
Il est extrêmement intéressant de pouvoir s~andardiser les différentes phases du traitement des ovocytes~ afin d'obtenir une bonne reproductibilité du procédé.
La présente invention concerne donc un systeme dynamique, fonctionnant en continu et pouvant être automatisé, réalisé par un dispositif permettant la succession automatique des étapes de lavage, de stimulation et l'acquisition des paramètres de stimulation.
Ce disposi~if est caractérisé par le fait qu~il assure llimmobi-20 lisation des cellules pendant les différen~es phases du traitement.
Différents modes de réalisation de ce dispositif apparaissent . ~ .
sur les figures 1 et 3.
Il est constitué d'une enceinte comportant au moins unearrivée de fluide (10, Il) et une sortie de fluide (6) et, est caractérisé en 25 ce qu'à la partie inférieure de llenceinte se trouvent un ou plusieurs orifices (4) don~ la géométrie est telle qulelle sloppose au passage des cellules et en ce que le liquide entrant dans llenceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qulelle assure sensiblement le blocage des cellules sur le ou les orifices, 30 une partie du fluide étant évacuée par débordement.
Ce dispositif permet de retenir les cellules sans les abimer ni in~roduire une con~rain~e mécanique parasi~e. En ou~re, il perme~ à ~o~
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~0 91/13977 Pa~/FR91/00200 moment de replacer, prélever ou déplacer des cellules. Ce dispositif permet donc de placer successivement les cellules dans des milieux de composltion chimique de différentes natures, durant des périodes et selon une fréquence variables.
L'enceinte comporte sur ses parois internes deux élec~rodes, de préférence parallèles, et le ou les orifices sont alignés à égale distance des électrodes, baignant dans le milieu correspondant à la phase du trai ~ement en cours.
Grâce à ce dispositif, on peut à volonté cultiver les cellules ou bien dans le milieu d'impulsion faire pénétrer dans la cellule traitée7 un ion, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe.
Ce dispositif permet en particulier le traitement dans une même enceinte d'un ensemble d'ovocytes, en grand nombre, sans qu'il soit nécessaire de les placer dans des compartiments séparés.
En particulier, le dispositif comporte au moins deux arrivées de f luide, qui peuvent être superposées.
L'évacuation des fluides pourra egalement se faire latéra-lement.
A chaque milieu arrivant successivement dans la chambre, 20 correspond une tubulure d'injection distincte.
Au mornent de l'injection du milieu d'impulsion, un système d'aspiration adapté sur le dispositif d'arrivée du milieu de culture permet la succion d'une petite quantite du milieu d'impulsion qui pénètre dans la canalisation d'arrivée du milieu de culture; on évite ainsi que les ions du 25 milieu de culture pénètrent dans la chambre durant les lavages. La circulation des flux de milieu est représentée par des flèches sur la f i gure 3.
Ces milieux, aussi bien le milieu de culture que le milieu d'impulsion, sont en circulation continue, et c'est ce flux de liquide qui par 30 effet de succion assure le maintien des ovocytes entre les électrodes pendant les renouvellements du milieu.
Les compositions des m.lieux de culture sont connues et dépendent des cellules en culture. Le milieu d'impulsion est généralement -.
2~7~3~ ~
-'0 91~13977 PS:~/FR91/{)0200 cons~itue d'un milieu non ionique pour assurer un effet de champ. Il s'agira d'une solution isotonique par exemple de glucose.
La présence d'une grande quantité d'ions peut gravement nuire aux cellules lors de l'impulsion. Il est donc nécessaire de laver les cellules avec le milieu d'impulsion pour éliminer les ions contenus dans le milieu de cult lre.
Ce dispositif peut être conçu comme une chambre d'activation, dont la capacité peut être adaptée au nombre de cellules que l'on souhaite traiter simultanément.
Les caractéristiques du procédé mettant en oeuvre le dispositif, peuven~ varier largement et ne sont en général limitées que par ?
des conditions telles que les durées de lavage. Ainsi, la fréquence des irnpulsions est limitée par la durée de lavage rninimum par le milieu d'impulsion.
Les paramètres du procédé et du dispositif clest-à-dire les arrivées et les sorties de fluide, de même que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions électriques arrivant dans les électrodes sont gérées par un système électronique.
Les caractéristiques des impulsions électriques en elles-mêmes peuvent varier et dépendre des cellules et des buts recherchés.
En général, les champs électriques varient de 1 à 3 Kv. cm 1 et l'impulsion électrique aube durée de 10 lls à 2 000 ~s.
La fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de s~imulation.
L'organisation des tubulures qui débouchent dans la chambre permet d'injecter des milieux sans que les ovocytes soient décrochés par les bulles de gaz qui finissent par se former dans les canalisations. De plus, la structure de distribution des milieux permet de limiter considérablement la contamination ionique du milieu de stimula~ion par les ions du milieu de culture. ;`
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~0 91/t3977 PCl/FR91/00200 I l .
Les pompes d'injection des milieux peuven~ être commandées par un microordinateur qui déterminera les séquences de lavage répétables tout en maintenant les cellules entre les électrodes.
Ce dispositif pourra s'appliquer au traitement des cellules par toute substance que l'on souhaite faire pénétrer dans l'espace intracellu-laire. La composition du milieu d'impulsion determinera la pénétration de cette substance selon un gradient de concentration.
Lors d'une culture cellulaire, on pourra provoquer, à un moment déterminé, qui peut être unique, I'entrée dans l'ensemble des cellules de la substance souhaitée. Pour cela on remplacera le milieu de culture par le milieu d'impulsion et on déclenchera l'impulsion de champ - électrique, la durée de l'impulsion déterminant la quantité de substance qui pénètre. Ce milieu d'impulsion pourra alors etre évacué et les cellules remises en culture dans un milieu approprié. L'avantage de ce système est qu'il permet de traiter simultanément un ensemble de cellules qui sont ainsi synchronisées. Il fonctionne en continu e~ évite toute manipulation des cellules, assurznt ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande rapidité d'exécution. Ceci permet une standardisation des conditions et facilite le transfert de technologies.
On peut envisager de faire pénétrer dans les cellules un ion ou une molécule simple. Ce disposi~if peu~ aussi s'appliquer à la stimulation des cellules par une molécule plus complexe, ou à la pénétration de ; fragments d'ADN, ou d'épisome.
Ce dispositif sera utilisé pour réaliser une stimulation cyclique des cellules, plusieurs séquences de base étant réalisées ~i successivement, l'intensité, la durée et la fréquence des impulsions pilotées par l'intermédiaire d'un microordinateur.
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~0 91/13977 PCr/lFR91/002~0 Ce disposi~if perme~ la réalisation du procédé d'activation et de svnchronisation d'ovocytes, par des stimulations répétees par Ca2, en vue du clonage d'embryons d'animaux domestiques.
5Un mode de réalisation de la chambre est représenté en figure 1.
Les ovocytes I sont placés sur une fente rectiligne 4, réalisée par la juxtaposition de deux plaques de verre 3 et 5, dont l'ecartement est inférieur au diamètre des ovocytes. Les milieux, milieu de culture et milieu 10d'impulsion, arrivent dans la parti~ supérieure de la chambre chacun par une tubulure distincte, respectivement 10 et 11, évitant une con~amination réci proque.
Le milieu 9 correspondant a la phase de traitement en cours arrive en c~ntinu et est évacué par une tubulure 6 située à un niveau plus 15bas que celui des ovocytes. Ce courant de liquide maintient par succion les ovocytes plaqués sur le fond de la chambre.
Sur les parois internes de la chambre se trouvent deux électrodes de platine 2 et 7, parallèles, de 1 cm de long.
L'enceinte 8 est thermostatée à 38C.
20Chaque milieu arrive dans la chambre après passage par un système retenant les bulles de gaz de taille importante.
Ce système est constitué d'un ballon de verre dans lequel le liquide arrive. De ce ballon part une tige d'or per~orée de trous de petit diamètre; après passage à travers cette tige, les bulles de gaz de taille 25importante sont retenues et le liquide arrive dans la chambre par une tubulure courte.
Des lapines ont été superovulées par injection de FSH et de LH, et les ovocytes prélevés dans les oviductes. Après traitement 5 mn par la hyaluronidase, les ovocytes sont placés dans la chambre d'activation, 30dans le milieu B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282, 1967-1970) à 38C, dans une atmosphère à 5 % de CO~
Les ovocytes peuvent immédiatement être soumis au traitement d'activation, au~une période de ~ viellissement n'es~ nécessaire.
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~O 91~13977 PCr/FlR91/03)2û0 lls sont soumis pendant 90 minutes à une série d'impulsions de champ électrique. à un rythme d'une i~npulsion toutes les 4 minutes, soit 22 impulslons de durée decroissante dissipant une éner~ie totale 1250 ujoules, d~une duree totale de 14 868 ~Is, le champ électrique a une valeur de 1,8 Kv. cm~ 1.
Avant chaque impulsion, le milieu de culture est remplacé par un milieu d'impulsion constitué d'une solution isotonique de glucose contenant CaC12 1 0~M.
A la fin du traitement d'activation, tous les ovocytes ont deux globules polaires bien formés. On obtient donc au même moment, à
quelques minutes près, une population homogène d'ovocytes activés dans le meme état physiologique. Cela présen~e deux atouts: le premier est de pouvoir ~oujours réaliser les greffes de noyau dans des oeufs physiologi-quement identiques, le second, plus pratique, est de pouvoir opérer au moment où les chromosomes (haploldes) se trouvent tous en fin de télophase jus~e sous le deuxième globule polaire. Ce repérage naturel de I'endroit où se trouvent les chromosornes facilite leur retr~it en "aveugle"
et permet, sans avoir recours à des techniques de marquage fluorescent, d'enchaîner rapidement les étapes de manipulations.
On peut alors effectuer le prélèvement des chromosomes. On remarque que les deux globules polaires ne sont pas toujours accolés ~certains sont à l'opposé l'un de l'autre, c'est pourquoi le premier ~lobule polaire n'est pas un bon rnarqueur de l'endroit où se trouven~ les chromo-somes maternels). L'efficacité de cette opération, vérifiée par la présence ultérieure d'un pronucleus, est supérieure à 80 %. Un blastomère est ensuite introduit sous la zone pellucide. Quinze à 20 ovocytes peuvent être manipulés en 1 heure.
On procède ensuite à la fusion cellulaire. La méthode de fusion cellulaire dérive des travaux de Zimmerman sur les champs électriques. La procédure a été affinée. (Ozil et Modlinski 1986, J. Embryol.
Exp. Morph. 96, 211-228).
On obtient 100 % de fusion. Il sera possible ~e réaliser automatiquernent, sous le contrôle d'un logiciel, I'alignement et la fusion cellulaire dans la charnbre de stimulation. Cette procédure permettra de limiter la durée des manipulations e~ de standardiser les conditions expérimentales.
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~/0 91/13977 PCT/FR91/00200 EXEMPLE I
MATERIELS ET METHODES
On a induit une superovulation chez les femelles de lapin sexuellement matures d'espèces variées par injection sous-cutanée d'hormone stimulant le follicule ~FSH) et d'hormone lutéinisante (LH) en accord avec la technique décrite par Kennely et Foote (1965) et modifée par Thibault (communication personnelle). Les femelles ont reçu 2 mg de FSH en cinq injections à 12 heures d'intervalle: 0,250, 0,250, 0.650, 0,650 et 0!250 mg. 12 heures plus tard? avant la saillie par un mâle vasectomisé, on leur a injecté 0,33 mg de LH.
Les ovocytes ont éte récupérés à partir des oviductes 12-l5 h après la saillie par lavage par une solution saline de phosphate tamponné
l 5 (PBS). Ils ont été incubés pendant 5 mimJtes dans l'hyaluronidase t300 i.u.rnl- I dans du PBS) pour éliminer les cellules folliculaires. Après le traitement, les ovocytes ont été cultivés à 38 dans du milieu B2 (Ménézo 1976) dans une atmosphère à 5 % de C02.
Méthode et proccdure expérimentaie La perméabilité membranaire des ovocytes de lapin fraiche-ment ovulées a été transitoirement augmentée par ouverture des pores par une impulsion induite par un champ électrique en présence de Ca2 10 IIM
contenu dans une solution de glucose 0,3 M - 1~ MOhm H20 ~milieu d'impulsion). Il est admis que, pendant que les pores sont ouverts, un fl-lx d'ions circule selon les gradients de concentration à travers la membrane cellulaire vers l'in~érieur du cytosol comme cela a déja été montré dans des ovc~cytes d'oursin (Rossignol et al, 1983). Ainsi, I'influx ioni~e peut être ajusté dans ces conditions soit par la différence de concentration ionique entre l'interieur et lIextérieur de la cellule soit par la durée des impulsions.
La procédure expérimentale pour un flux ionique induit électriquement était similaire à celle précédemment décrite pour la fusion par champ électrique d'embryons de lapin à deux cellules (Ozil et Modlinski 1986). Les ovocytes sont cultivés avec du milieu Ml6 (Whittingham, 1971) à
38C dans une charnbre spécialement conSue. Avant chaque impulsion, le , ~7~3~
~O 91/13977 PCr/FR91/0020û
milieu de culture est automatiquement remplacé par le milieu d'impulsion.
Les détails de la chambre sont décrits dans la figure 1. Chaque impulsion é~alt composée de deux impulsions alternatives afin d'éviter " une électrophorèse latérale " (~affe 1977) des protéines de membrane qui 5 pourrai~ intervenir après plusieurs impulsions de la meme polarité ~Poo, 1981). L'amplitude du signal ionique etait modulé à travers la durée de l'impulsion. Le processus en entier était contrôlé par un mlcro-ordinateur IBM PC-AT 286 par l'in~ermédiaire d'une interface Tektronix Ml 5010 avec un pro~ramme écrit en MS-BASIC. Le Yoltage réel et le courant entre les électrodes étaient mesurés par un oscilloscope Tektronix 77041 monté avec un convertisseur numérique programrnable 7D20 et un amplificateur 7A22.
Le rythme des impulsions électriques et la durée totale du traitement étaient les mêmes pour tous les traitements, c'est-à-dire appliquer une impulsion toutes les quatres minutes pendant 90 minutes.
15 Ces valeurs ont été choisies parce qu'elles s'accordent bien avec la fréquence et la durée moyenne de l'hyperpolarisation du potentiel de membrane des ovocytes de lapin pendant la fécondation (22 oscillations biphasiques du potentiel membranaire pendant les premières 90 minutes suivant la fusion sperme-oeuf, une impulsion toute les 4 minutes -McCulloh 20 et al., 1983). On sait que la variation du potentiel de membrane reflète le passa~e de 1< basé sur des canaux activés par le calcium et qu'elles corstituent donc un indicateur fiable de [Ca2~]i (Miyazaki et Igusa 1982).
L'amplitude de champs électriques tl.8 kVcm-l) etait constante pour tout les groupes expérimentaux.
Traitement des o~cytes Les effets des différents paramètres du traitement sur - liactivation des ovocytes ont été étudiés dans quatre groupes expérimen-30 taux.
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.~0 91/13977 PCT/FRgl/00200 Groupe A - Environnement expéFimental : .
Afin de tester l'effet des conditions expérimentales (perfusion continue. remplacement du milieu de culture et impulsions électriques), des 5 ovocytes fraichement ovules et des oeufs fecondés soumis à 22 doubles impulsions de 900 ~s dans le milieu d'impulsion dépourvu de Ca2 ~la première impulsion est donnée 13 à 15 heures après la saillie). Après le traitement, les oeufs fécondés ont été transférés dans des receveuses pour déterminer la survie à terme. Les ovocytes non fécondés ont été cultivés in 10 vitro et le taux d'activation parthenogénétique a été noté.
Groupe B - ions calcium et durée des impulsions _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ;
L'effet de la durée des impulsions a été ét~dié dans le milieu d'impulsion contenant du CaC12 10 ~M. Le traitemen~ pour lequel les ovocytes ne sont pas activés a été considéré comme étan~ la durée minimum et celui résulta nt dans la Iyse des ovocytes a été considéré
comrne étant la durée maximum. Un jeu de six traitements avec 22 doubles impulsions constantes a été choisi arbitrairement. Ces traitements on~ une durée d'impulsions égale à 200, 300, 600, 900, 1200 et 1500 lls respective-ment. L'effet de la présence d'ions Na+ et Mg2+ à une concentration de 10 M dans le milieu d'impulsion a été testé avec 22 doubles impulsions constantes d'une durée de 900 IJs Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-______________ ___ __ :
~énétique ____.__---- -- ~
Le traitement avec 22 doubles impulsions de durée constante révèle la valeur de la durée de l'impulsion pour laquelle les effets maximum et minimum sont enregistrés. Ces traitements constants ne produisent pas un taux élevé d'activation avec un type uniforme d'oeufs parthéno~énétiques. Afin de vérifier si une réduction progressive des ."~
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WO 91/13977 PC~/FR9ltO0200 stimuli calcium dans un trai~ement donné a un effet sur ie type de réac~ion parthénogénétique, les ovocytes ont été soumis à des trai~ements dans lesquels la durée des impulsions décroissait peu à peu selon une relation exponentielle négative. Quatre traitements ont été testés en accord avec la durée maximum de la première impulsion. La figure 2 donne la courbe des durées d'impulsions pour ces traitements.
Une relation exponen~ielle négative (D~u)-e (axutb)~c) en~re I'indice de l'impulsion (I à 22) et la durée d'impulsion (1500 ~s à 200 us) a été choisie arbitrairement pour trouver la valeur de chaque impulsion au cours du traitement.
~vec D(u): durée d'impulsion du cycle (u).
Le coefficient a détermine la pente de décroissance de cette relation.
Le coefficient b détermine la durée de la première impulsion.
Le coefficient c détermine la durée de la dernière impulsion.
Les coefficients a et c sont constants et égaux respectivement à -0,4 et 200.
b = 5,9920 pour le traitement I
= 6,5 510 pour le traitement 11 6,9080 pour le traitement 111 = 7,1700 pour le traitement IV.
Groupe D - Modulation du champ électrique et développement in vitro _ _ __~_~_________._________ __ ________________ ______ __ ____ _ _ _ ___ ____ .
Les oeufs sont traités en présence de 8 ~gml- I de cytocha-lasine ~ dans le milieu de cùlture pour bloquer l'expulsion du second globule polaire et obtenir une population uniforme d'oeufs parthéno-génétiques diploides. Deux traitements ont é~é appliqués au groupe C, le traitement I qui est le traitement faible avec une durée totale d'impulsion égale à l l 228 ~JS et le traitement 111 qui est le traitement fort avec une durée de 14 868~s. Les oeufs parthénogéné~iques ont été cultivés in vitro jusqu'au stade blastocyste et l'influence des deux traitements a été évalué
par le taux de formation de blastocyste~
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Viabili~é au delà de l'implantation des embryons parthénogénétiques d i plo i des Les embryons au stade 4-cellules ont été transplantés dans les oviductes de receveuses. Les oeufs fécondés ont également été transplantés dans la corne opposée de quelques receveus~es afin de comparer le développement parthénogénétique au développement normal. Les receveu-ses ont été autopsiées entre le Jour 8.5 et le jour 13 de la gestation et le nombre de sites d'implantation de foetus vivants a été noté.
RESULTATS
Groupe A - Effet de l'environnement expérimental (contrôles) 1 5 __ ____ __________ _____ __ .
Quant le milieu dlimpulsion ne contient pas d'électrolytes, aucun des ovocytes ~105) n'est activé. L'environnement expérimental et les conditions de cul~ure c'est-à-dire le remplacemen~ du milieu de culture avant chaque impulsion par un milieu d'impulsion ne contenant pas d'électrolytes et le traitement par des impulsions électriques relativement fortes (2 x 1.8 kVcm-lx900l1s x 22 fois, c'est-à-dire une durée totale d'impulsions de 30 600 lls) n'a pas d'effet visible sur les ovocytes fraîchement ovulés mais les condi~ions ne permettent pas de déclencher le développernent. Par contre 41 % t9/22j des oeufs fécondés traités de la 2 5 même manière se sont développés à terme démontrant ainsi que le traitement par des impulsions électriques de haut voltage n'a pas d'effet contraire sur la capacité de développement des ovocytes fécondés. Il n'était pas possible de remplacer totalement le milieu de culture par le milieu d'impulsion avant chaque impulsion. Le courant mesure pendant l'impulsion révèle que la conductivité du milieu d'irnpulsion est au moins de 15 %
supérieure à celle du milieu d'impulsions mesurée entre les électrodes avant expérience et avant la premiere injection de milieu de culture.
Pendant l'experimentation, des ions provenant du milieu de culture sont encore présents pendant les impulsions et ceci modifie le signal ionique.
Ces variations du micro-environnement n'apparaissent pas comme ayant un quelconque effet significatif sur l'activation ou le développement embryonnaire. Dans ce~te série d'expérimentations, les oeufs sont lavés par :, . . , :.
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~0 91/13977 PCT/FR91/002ûO
le milieu d'impulsion pendant 45 secondes toutes les quatre minutes. Cette p~riode pendant laquelle les oeufs ne sont pas dans le milieu de culture n~a pas d'effe~ significatif sur l'activation ou sur la survie à terme.
5 Groupe ~ - ions calcium et durée de l'impulsion _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Le tableau I résume les résultats de l'expérimentation dans lequel le taux d'activation a été testé en relation avec la durée d'impulsion en présence de CaC12 lO ,uM.
I0 L'apparition de pronuclei après 3 ou 4 heures de culture sert de marqueur pour l'activation parthénogénétique. Ces résultats mon~rent clairement que l'activation parthénogénétique est déclenchée qaand le milieu d'impulsion contient Ca~ lO IIM.
De plus, le taux d'activation est directement relié à la durée 15 de l'impulsion qui contrôle indirectement la stimulation par le calcium. La durée des stimuli ioniques n'influence pas seulement le taux d'activation mais aussi la configuration nucléaire des ovocytes parthénogénétiquement activés d'age postovulatoire semblables.
Plus la durée d'impulsion est longue, plus la proportion d'oeufs 20 activés est élevée mais plus la proportion d'ovocytes contenant des micronuclei est importante.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-~; _ __ ______ _ __ __ ___ _ _ ,, génétique.
Les résultats sont résumés dans le tableau 11. La relation entre le type d'activation parthénogénétique et chaque traitement est égalernent montrée dans le tableau 111. Quand la durée de l'impulsion est réduite, tous les ovocytes sont activés et la majorité (91 %~ d'entre eux ont un 30 pronucleus unique et deux globules polaires quand la rnéiose est terminée.
Ainsi, la modulation des stimuli de calcium à travers la durée de l'impulsion semble être effective et influence les premières étapes du développement.
Dans cette étude, I'â~e des ovocytes était sirnilaire et ne peut donc pas affec~er les résultats.
.
.~0 91/13977 PCr/FR91/00200 2~
Groupe D - Effet de la modulation de champ électrique sur le ..
5 développement in vitro d'ovocytes activés par parthénogénèse.
_ _ _ _ _ _, _ _ _ _ _ , Les résulta~s sont résumés dans le tableau 111. Aucune différence visible dans le développemenl de chaque groupe n'a pu ê~re notée jusqu'à la Iroisièrne division.
Dans les embryons parthénagénétiques produits par le traitement 1, une proportion plus faible d'embryons présente une compaction et ceux qui se compactent sont irréguliers. Par eontre, la majorilé des embryons produits par le traitement 111 se compacte e~ se développe jusqu'au stade de blastocyste.
Ces résultats montrent que la forme du stimulus d'activation a un effet profond sur la capacité des embryons parthéno~énétiques à se développer jusqu'au stade de blastocyste in vitro.
Viabilité post-implantation des oeufs parthénogénetiques diploldes.
2~
13 receveuses sont devenues gravides et ont été autopsiées -entre le jour 8.5 et le jour 13. Les résultats sont résumés dans le tableau IV.
Bien que les embryons parthénogénétiques soient plus peti~s que les embryons de contrôle, ils appa!aissent morphologiquement normaux selon les critères définis pour le lapin. Le rapport entre la tail!e des annexes embryonnaires et celle du foetus est grossièrement équivalent pour les embryons obtenus par fécondation ou par parthéno~énèse.
Ainsi, il semble que le développement ~éneral des embryons parthénogénétiques, le foetus et ses tissus trophoblastiques soit ralenti.
Les foetus morts ont plusieurs anomalies et il n'était pas possible de les classifier.
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~O ~1/13977 P~/FR91/00200 Tableau I -Effet de la présence d'ions calcium et durée de l'impulsion électrique sur l'activation des ovocytes de lapin Durée Nomb-e Nombre % % d'ovocytes activés avec d'impulsion d'ovocytes Iyses (%) activés I PN+PBI 2PN 2PN#
(~s) ~PB2 ~PB I -PB I
200 ~s 47 0 (0) 13 83 17 0 300 ~s 99 0 (0) 62 68 25 7 60011s 85 0 (0) 98 71 19~ 10 900 ~s 63 0 (0) 100 62 14 24 1 200 lls 97 5 ~5) 100 57.29 14 l 5 1 500 ~s 50 3 ~6) 100 30 l ~ 53 Tableau 2 - Effet de la modulation du champ électrique sur l'activation TraitementNornbre % % ovocytes activés avec . i d'ovocvtesactivation I PN+PBl 2PN 2PN#
~PB2 ~ PBI -PBl : :
11 15l 99 89 9 111 l 18 lO0 91 9 0 IV 96 lO0 70 25 5 # Pronuclei anormaux, petits micronuclei i ~
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~VO 91/13977 2 a ~ /FR9l/002oo Tableau 3 -Effet de la modulation de champ électrique sur le développement d'oeufs parthénogénétiques in vitro Traitement Nombre ,6 Nombre Nombre Nombre d'ovocytes activa_on cultivés !norulae blastocystes compact (/0) (6) 98 91 69 25(36) 23 (33) 111 352 100 244 244(100) 216 (88) Tableau 4 -15 Developpement post-implantal:ion d'oeuis parthénogénétiques soumis au traitement 111.
Jour de l'autopsie J 8-9 J 9-10 J10-11 J 12-13 Total Nombre d'oeufs ~: transférés 21 26 50 68 165 ,~
, Nombre d'implan-tations 9 3 15 23 50 , % cumulé (42,8) ~21,2) (27,8) (30,3) .', Nombre de foetus - vivants 8 3 7 0 18 .
. ~ % cumulé (88,8) (91,6) (66,6) (36) ' : "
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3 8 , /0 91/13977 PCr/FR91/00200 DEVELOPPEMENT PARTHENOGETIQUE
Des ovocytes fraIchement collectés (13 h après la saillie avec un mâle vasectomisé) son; soumis à un traitement standard comprenant 22 impulsions tune tou~es les 4 minutes) et dont leur durée totale est égale à
22 47511s (référence de travail: lex 1370).
La concentration en calcium dans la solution dtimpulsion est I'unique variable. Cinq valeurs ont été choisies: 10, 12, 14, 16, 18, 25l1M de calcium. Le tableau ci-dessous récapitule les résultats. ;
' __ Nb d~ N~ N~ Nb de ~ T~ Nb Nb ~au!~ Nb T~us Ta~
c~ um tr~nstor~ o-uh oouf~ r-c~ d~ d'oeuh d'im~ d'im- ~o~ to~ h~
1 5 par vw~ ~ sur 10~ plan- pl~n~ v~v~n~
~ 9~ t~on r~c~u ta~ian~ t~on vau~o d~L$ s~
_ , _ _ __ q~d~ ~. .
1 011M 2 61 31 1 50~C 31 2 6% 1 3~/. 3Y.
1 2IJM 3 79 26 3 100~ 79 29 37Y~, 16 ~% 0%
1 4uM _ 4 90 23 4 1~% 90 28 31% 19 21% 7%
2 0 1 ~uM 7 89 13 ~ 86% 81 31 3~% 21 26YI, 23Yo . . 1 8L~M 4 85 21 1 25Yo 3C'7 3 1 OY9 3 1 0Q~O 1 0Y, 20~YM 3 80 20 2 67% 49 9 18% 5 t 0!-~ o~
totat 2:~ ~ 4% 381~ 102 29% 6S 64Y~ ~3-S -', Sur un total de 23 transplantation, le taux de gestation global, ;~ 30 tous traitements confondus, est de 74 %. Parmi les receveuses qui sont devenues gravides, le taux d'implantation enregistre au 1,5e jour de .-~
gestation (la durée de gestation chez la lapine est de 29 jours) est de 28 %.
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~0 91/13977 PCI /FIR91/00200 2l~
~; La présence de foetus a pu être observée dans 64 % des cas e~ 28 %
d'entre eux étaient encore vivants au moment cle l'autopsie. Ces résultats globau~ sont nettement au-dessus des résultats obtenus par les méthodes classiques: chez les souris, I'obtention de foetus à ~ll est très rare, 5Toutefois, le resultat le plus important réside dans l'effet de la concentra~ion en calcium au moment des impulsions sur le dévelop-~;~ pement post-implantatoire. La figure 2 montre clairement que les taux d'implantation et de survie à Jll dépendent directement de ce paramètre.
Le développement optimum a été obtenu avec une concentration de 1611M.
lODans ce cas, nous avons obtenu un taux d'implantation record de 38 % (31 implantations sur 81 oeufs transplantés), dont 26 % de foetus. La comparaison morphologique des différents foetus obtenus révèle que c'est avec 16~M de calcium que les foetus ont la taille la plus grande.
Par ailleurs, nous avons observé que la presence de milieu de ISculture résiduel dans la proportion de ItlOOOO en plus des 1611M de calcium est capable de modifier considérablement le développement car les annexes embryonnaires se développent mais les foe~us sont pratiquement inexis-tants.
Les paramètres de lavage doivent donc permettre de limiter la 20présence de milieu de culture résiduel au moment des impulsions. La présence de milieu résiduel augmente le nombre d'espèces ioniques susceptibles de pénétrer dans l'ovocyte au moment de l'électroperméabi-.Iisa~ion de la membrane.
''; ~' ACTIV~TION DE L'OVOCYTE DE~ SC)URIS FRAICHEMENT OVULE
: ~Des ovocytes de souris fraîchement ovulés (l2 h post HCG) 30 sont soumis à des traitements comprenant 33 impulsions, une toutes les 4 minutes durant 2 heures i2 minutes.
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`-j 2~78138 ,~Cl3 91~13977 25 PCr~FR91~00200 Les ~raitements sont menés pour des concen~ra~ions en calcium dans la solution d'impulsion valant successivement 4~3M, 8~3M, 12~3.~,t,et 1 6u~1 et pour des durées d'impulsions ~ariables.
Les dvnamiql.3es de formation du pronucleus peuvent ê~re 5 contrôlées en fonction de la concentra~ion en calcium dans la solution d'impulsion et la durée tota'3e des impulsions électriques (Vitullo, Ozil.
-: 1991) .
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d'entre eux étaient encore vivants au moment cle l'autopsie. Ces résultats globau~ sont nettement au-dessus des résultats obtenus par les méthodes classiques: chez les souris, I'obtention de foetus à ~ll est très rare, 5Toutefois, le resultat le plus important réside dans l'effet de la concentra~ion en calcium au moment des impulsions sur le dévelop-~;~ pement post-implantatoire. La figure 2 montre clairement que les taux d'implantation et de survie à Jll dépendent directement de ce paramètre.
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Par ailleurs, nous avons observé que la presence de milieu de ISculture résiduel dans la proportion de ItlOOOO en plus des 1611M de calcium est capable de modifier considérablement le développement car les annexes embryonnaires se développent mais les foe~us sont pratiquement inexis-tants.
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Claims (26)
1. Procédé de stimulation artificielle d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène.
a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'applique à des ovocytes animaux fraîchement ovulés.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérise en ce que l'impulsion provient d'un champ de 1 à 3 kV.cm-1.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'impulsion de champ électrique a une durée de 10 µs à 2000 µs.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fréquence des impulsions est modulée par la durée entre deux lavages.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de stimulation.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'un milieu sensiblement non ionique.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion contient un ion ou un mélange d'ions, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe, qui va pénétrer dans la cellule traitée.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé pénétrant dans la cellule a un rôle de messager.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé
en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'une solution isotonique de glucose et contient des ions Ca2+.
en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'une solution isotonique de glucose et contient des ions Ca2+.
Il. Procédé selon l'une des revendication 1 à 10, caractérisé
en ce que la concentration en ions Ca2+ est comprise entre 8 et 30 µM.
en ce que la concentration en ions Ca2+ est comprise entre 8 et 30 µM.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé
en ce que les ovocytes sont traités par un inhibiteur de l'expulsion du globule polaire et constitueront une population d'oeufs parthénogénétiques diploïdes.
en ce que les ovocytes sont traités par un inhibiteur de l'expulsion du globule polaire et constitueront une population d'oeufs parthénogénétiques diploïdes.
13. Procédé selon les revendications 1 et 3 à 11, caractérisé
en ce qu'après l'étape f) on prélève les chromosomes de l'ovocyte, sous le deuxième globule polaire, ces ovocytes servant ensuite de récepteur pour une greffe de noyau provenant d'embryons à cloner.
en ce qu'après l'étape f) on prélève les chromosomes de l'ovocyte, sous le deuxième globule polaire, ces ovocytes servant ensuite de récepteur pour une greffe de noyau provenant d'embryons à cloner.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé
en ce que les cellules traitées sont des oeufs greffés.
en ce que les cellules traitées sont des oeufs greffés.
15. Dispositif destiné notamment à la culture des ovocytes, permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à
14, du type comportant au moins une enceinte destinée à recevoir les ovocytes, ladite enceinte comportant au moins une arrivée de fluide et une sortie de fluide, caractérisé en ce que à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des ovocytes et en ce que le fluide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des ovocytes sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement, et en ce que l'enceinte comporte deux parois latérales sur lesquelles sont placées des électrodes.
14, du type comportant au moins une enceinte destinée à recevoir les ovocytes, ladite enceinte comportant au moins une arrivée de fluide et une sortie de fluide, caractérisé en ce que à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des ovocytes et en ce que le fluide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des ovocytes sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement, et en ce que l'enceinte comporte deux parois latérales sur lesquelles sont placées des électrodes.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que les électrodessont parallèles, et en ce que le ou les orifices sont alignés à
égale distance des électrodes.
égale distance des électrodes.
17. Dispositif selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux arrivées de fluide.
18. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que les deux arrivées de fluide sont superposées.
19. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 15, caractérisé en ce que l'orifice est un orifice unique constitué par une fente rectiligne dont la largeur est inférieure au diamètre des ovocytes et dont la longueur permet de traiter dans la même enceinte un grand nombre d'ovocytes.
20. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'enceinte peut être isolée et placée dans une atmosphère de composition définie et/ou stérile.
21. Dispositif selon l'une des revendication 15 à 20, caractérisé en ce que le fluide arrive dans l'enceinte par une tubulure courte, après passage par un système évitant l'arrivée de bulles de gaz de taille importante.
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que le système est constitué d'un ballon de verre dans lequel arrive le fluide et d'une tuyauterie d'évacuation qui comprend un tube perforé de trous de très petit diamètre qui débouchent au voisinage du centre du ballon, ladite tuyauterie se raccordant sur la tubulure.
23. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que l'arrivée supérieure permet l'injection de milieu d'impulsion et en ce que l'arrivée inférieure est munie d'un système d'aspiration permettant la succion d'une petite quantité du milieu d'impulsion, lors de l'injection dudit milieu d'impulsion.
24. Dispositif selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions arrivant dans les électrodes sont variables et gérées par un système électronique.
25. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il permet de réaliser l'alignement des ovocytes et la fusion cellulaire par action d'une impulsion calibrée, générée par un champ électrique.
26. Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que le traitement de fusion cellulaire est automatiquement géré par un système électronique.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR90/03109 | 1990-03-12 | ||
| FR9003109A FR2659348B1 (fr) | 1990-03-12 | 1990-03-12 | Procede de stimulation artificielle de cellules. |
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| FR9003108A FR2659347B1 (fr) | 1990-03-12 | 1990-03-12 | Dispositif de culture de cellules assurant leur immobilisation. |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2078138A1 true CA2078138A1 (fr) | 1991-09-13 |
Family
ID=26227924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA 2078138 Abandoned CA2078138A1 (fr) | 1990-03-12 | 1991-03-12 | Procede de stimulation artificielle de cellules et dispositif de culture d'ovocytes |
Country Status (5)
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| EP (1) | EP0521979A1 (fr) |
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| WO (1) | WO1991013977A1 (fr) |
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| CA2316966C (fr) | 1997-12-17 | 2008-04-08 | Horst Vogel | Positionnement et caracterisation electrophysiologique de cellules individuelles et de systemes membranaires reconstitues sur des supports microstructures |
| GB9812783D0 (en) | 1998-06-12 | 1998-08-12 | Cenes Ltd | High throuoghput screen |
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-
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- 1991-03-12 NZ NZ23741291A patent/NZ237412A/en unknown
- 1991-03-12 EP EP19910906851 patent/EP0521979A1/fr not_active Withdrawn
- 1991-03-12 WO PCT/FR1991/000200 patent/WO1991013977A1/fr not_active Application Discontinuation
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