JP2012021972A - 電荷測定による発電酵素を用いた迅速高感度分子検出定量法、および該方法に用いるための検出部並びに装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明により、支持体(好ましくは、磁気ビーズまたはプラスチックプレート)を用いた分子特異的な検出系に、発電酵素(グルコースオキシダーゼなど)を組み合わせ、そこで発生する電子を電流として検出することで、目的とする分子を定量的に検出する方法が提供される。さらには、その検出方法に適した電極セルならびに装置が提供される。
【選択図】図4
Description
本発明はまた、以下の通りである。
(1)試料中の標的分子の検出方法であって、
(i)以下の工程からなる標的分子および発電酵素を含む複合体を形成する工程、
(i−1)標的分子を支持体に保持させた後、支持体を回収することにより標的分子を回収する工程、
(i−2)標的分子と特異的に結合できかつ発電酵素(好ましくは、グルコースオキシダーゼ)を保持した結合性物質と、標的分子を反応させる工程、および
(i−3)支持体を回収することにより、標的分子と発電酵素を保持した結合性物質の複合体を回収する工程、および
(ii)以下の工程からなる発電酵素による電気化学的変化により生じる電流を測定する工程、
(ii−1)該複合体と、発電酵素の基質(例えば、グルコース)および電子メディエーターを含む溶液を混合し反応溶液を調製する工程、
(ii−2)反応溶液を、電子メディエーター(および任意に該基質)を含む参照溶液とセパレータを介して連絡させるとともに、該反応溶液に検出電極を、該参照溶液に参照電極を配置する工程、
ここで、セパレータは、ナフィオン、ポリ塩化ビニリデン、DEAEセルロース、およびリン酸セルロースからなる群より選ばれる物質からなる膜であり、電極は、金または非伝導性媒体に蒸着あるいはメッキした金である、
(ii−3)発電酵素反応により発生する電子を電流として検出する工程、
からなる標的分子の検出方法。
前記(i−1)の工程が、以下の工程、
(a)標的分子と特異的に結合できかつ支持体に保持された他の結合性物質を、試料中の標的分子と反応させる工程、および
(b)支持体を回収することにより、他の結合物質を介して支持体に保持された標的分子を回収する工程、
からなる前記(1)に記載の検出方法。
(3)試料中の標的分子の検出方法であって、
前記(ii−2)の工程が、
参照電極と検出電極のそれぞれを、内側および外側に配置した、電子メディエーター(および任意に該基質)を含む参照溶液を入れる容器を、反応溶液中に配置し、かつ該容器に参照溶液を入れることにより、該反応溶液中に該検出電極をおよび該参照溶液中に該参照電極を配置する工程、
ここで、参照溶液を入れる該容器は、下部に開口部を有し、該開口部はセパレータで覆われ、参照溶液は該セパレータを介して反応溶液と連絡する、
である、前記(1)または(2)に記載の検出方法。
(5)前記電子を電流として検出する工程において、検出のための測定開始後の所定時間後に検出された電流が、所定の値(iH)より大きい場合は、標的分子が存在するあるいはあらかじめ定めた規定値以上と評価し、所定の値(iL)より小さい場合は、標的分子が存在しないあるいはあらかじめ定めた規定値以下と評価し、iHとiLの間であった場合はさらに測定を続け追加の所定の時間後に再び検出された電流量を測定することにより標的分子の存在を評価する工程を含む、前記(1)から(4)のいずれかに記載の検出方法。
(6)前記所定時間が1〜3分である前記(5)に記載の検出方法。
(8)前記標的分子が、タンパク質、ウィルス、食中毒菌または核酸である前記(1)から(7)のいずれかに記載の検出方法。
下部開口部を覆っている、ナフィオン、ポリ塩化ビニリデン、DEAEセルロース、およびリン酸セルロースからなる群より選ばれる物質からなる膜、
該中空の容器の外側に沿って配置され、該中空容器の下部端の少なくとも一部より伸びている検出電極、および、
該中空容器の下部端の少なくとも一部を越えないように、該中空の容器の内側に沿って配置されているもう参照電極、
からなる、発電酵素による反応を用いて試料中の標的分子を検出するための検出用電極セル。
(10)前記中空の容器の外周が、略円形または略半円形であり、直径が0.3cm〜3.0cmである、前記(9)に記載の電極セル。
(11)前記中空の容器の外周が、略正方形であり、一片の長さが0.3cm〜3.0cmである、前記(9)に記載の電極セル。
(12)前記検出電極および参照電極が、金または非伝導性媒体に蒸着あるいはメッキした金である、前記(9)から(11)のいずれかに記載の電極セル。
試料中の標的分子を回収しかつ発電酵素による反応を行うための反応セル、
該電極セルの2つの電極のそれぞれに接続された電流電圧変換回路を含む電荷測定回路部、
該電流電圧変換回路部に接続され、所定の電流値に応じて、標的分子の存在の評価を行う情報処理部、および
該評価に応じて表示を行う表示部、
からなる、発電酵素による反応を用いて試料中の標的分子を検出するための装置。
(14)前記電荷測定回路が、電極を短絡して電極間に蓄積された電荷を低減する、または電極と入力端子との間を切断することによって出力電圧をゼロにするためのスイッチを含む前記(13)に記載の装置。
また、本発明の方法では、この定量性を利用して、2種類の抗体を用いたサンドイッチ法によって検出対象分子の高感度検出を行うことができる。
また、発電酵素、例えばグルコースオキシダーゼは市販のものを用いることができるが、遺伝子組み換え技術を用いて、発電活性が改善されたグルコースオキシダーゼを用いることも可能である。
このように、本発明の方法によれば、標的分子としては抗原抗体反応を用いることでタンパク質や糖の検出が可能であるばかりでなく、核酸プローブを用いることでDNAやRNAなどを検出することが可能となり、従来の分子検出関連技術のほとんどすべてに応用することが可能である。
本発明においては、上記電極を、電流電圧変換回路を含む電荷測定回路部に接続して、発電酵素の反応を電流として検出する。電流電圧変換回路は、図1に示すようなオペアンプを利用した回路を用いることができる。
電源回路への電源の供給は、電池またはACアダプターの他、消費電力が少ないことから、PCのUSBからの給電でも可能である。
これにより、単一の方法または装置を用いて、迅速な検出が可能であると同時に精密な検出が可能となる。
Ts:酵素反応の開始時間
T0:電極あるいは電極セルを反応セルに挿入した時間
T1:初期変動の影響をうけない測定開始時間(好ましくは1分)
T2:迅速測定を判断する時間(好ましくはT1から1分)
T3:精密測定を判断する時間(好ましくはT1から10分)
Te:測定終了
また、本発明の方法においては、発電酵素の反応量に応じた電流を検出することが可能であるので、試料中に標的分子の存在が確認された場合はさらに、試料中の標的分子の量を、あらかじめ求めた検量線に従って決定できる。
(i)標的分子および発電酵素を含む複合体を形成する工程、および
(ii)発電酵素による電気化学的変化により生じる電流を測定する工程。
本発明の方法の(i)の工程においては、標的分子と結合性物質との特異的結合性を用いて、標的分子および発電酵素を含む複合体を形成する。具体的には、結合性物質を介して標的分子と発電酵素の複合体を形成する。標的分子と発電酵素の複合体は、標的分子と支持体の結合は、直接または標的分子に特異的に結合する他の結合性物質を介して行われ、それにより、標的分子と発言酵素の複合体が支持体に保持され、効率よく回収される。
具体的には、本発明の方法において、支持体−標的分子−結合性物質−発電酵素の複合体、または支持体−他の結合性物質−標的分子−結合性物質−発電酵素の複合体が形成される。
これらの複合体を形成する方法は、抗原抗体反応を初めとする特異的結合を用いた技術分野に公知の方法で行うことができる。
発電酵素の反応は、発電酵素を含む複合体が回収されている容器中に、発電酵素の基質および電気メディエーターを含む反応溶液を加えることにより起こる。
発電酵素の反応を電流として測定するためには、発電酵素による反応が起こっていない溶液(参照溶液)と反応溶液を、セパレータを介して連絡させ、かつそれぞれの溶液に電極(参照溶液に参照電極、反応溶液に検出電極)を配置することが必要である。好ましくは、容器の外側と内側にあらかじめ電極が配置され、容器の下部にセパレータを有する参照溶液を入れる容器を、反応溶液に挿入するとともに容器中に参照溶液を添加することにより、電極の配置とセパレータによる両溶液の連絡を同時に行う。さらには、あらかじめ参照容器中に参照溶液を入れた後、参照容器を反応溶液中に挿入することも可能である。
参照溶液は、反応溶液と同じ濃度の同じ電子メディエーターを含む。好ましくは、さらに反応溶液と同じ濃度の基質を含む。
発電酵素の反応により発生した電子は、本明細書に記載の測定装置および測定原理を用いて測定される。
1.検査したい対象物を水溶液等に溶かし、一部を検体として固形物の無い状態で分取する、
2.抗体を結合させた反応セルに検体を入れて、発電酵素を結合させた抗体を含む溶液内において、サンドイッチ法1Step抗原抗体反応を起こさせる、
3.反応液をとりのぞき、洗浄液を加えて放置後、洗浄液を除去する、
4.発電酵素の基質とメディエーターを含む反応液を入れる、
5.電極を入れ、電流を測定する、
6.電流の発生パターンを分析アルゴリズムに従って解析し、陽性陰性の判定を行う。または、規定された一定時間の反応測定値による試料の定量化を行う。
本体部は、上部および下部が開口部であれば、その形は特に限定されないが、例えば、図3Aに示すように略円柱形または図3Bに示すように略正方形であるが、好ましくは、略円柱形である。また、本体部は、図3Cに示すように、下部が傾斜断面を有していても良く、また、半円形であっても良い。さらに、操作しやすいように、電極セルは、図3Cに示すように、つまみ部分を有していても良い。
本体部は、その外周が略正方形である場合は、その一片の長さは、通常の目的においては、0.3cm〜6.0cm、好ましくは、0.3cm〜3.0cm、さらに好ましくは、0.5cm〜2.0cmである。
本体部の長さは、特に限定はされないが、通常の目的においては、0.5cm〜10cm、好ましくは、1.0cm〜5.0cm、さらに好ましくは、1.0cm〜4.0cmである。
電極と容器を一体化し電極セルを構成して装置にアタッチすることで、検査結果が陰性である限りは再利用ができる。
本発明の装置は、試料中の標的分子を回収しかつ発電酵素による反応を行うための容器である反応セルを有する。測定においては、反応セルは電極セルと連結され、反応セル中での発電酵素による反応により生じる電子を、反応セル中の検出電極および電極セル中の参照電極を介して、電流として検出する。
測定感度は反応セル中の発電酵素濃度つまり反応液中の試料中に含まれる標的物質濃度に比例するので、反応セルは簡易操作が可能な範囲で小容量であることが好ましい。従って反応セルの外形は図8に示すような形状とすることで、内容量を小さく、液切れを良くし、かつ外形状を大きくすることで操作性を確保することができる。
本発明の装置に用いる表示部は、情報処理部からの情報に応じてその結果を表示できるものであれば特に制限がなく、液晶ディスプレーの他、特定の色を表示できるようにしたランプであっても良い。
本発明の装置においては、電源回路への電源の供給は、電池またはACアダプターの他、消費電力が少ないことから、PCのUSBからの給電でも可能である。
また、本発明の装置においては、例えば、図9に示すように、上記各構成を単一の装置内に配置し、持ち運びが可能な装置とすることもできる。また、USB端子を介してパソコンと接続することにより、データの管理や複雑な測定条件の検討、解析結果のネットワークを通じた転送、測定ソフトウェアのネットワークを通じたダウンロードなどが可能となる。
本発明の装置による測定においてはパソコンへの接続は必要ではなく、本体のみで判定結果をLED表示することが可能であり、検査結果をメモリーカードへ記録することが可能である。
もし、iHとiLの間の測定値を示した場合には、精密計測モードになり(例えば、黄色点滅→黄色点灯)T3時間まで測定を延長し、T2時点よりも増加した場合には陽性、減少した場合には陰性と判定することができる。iHまたはiLを超えた場合にはその時点で陽性または陰性判定することができる。
本発明の方法による判断の一例を図10に模式的に示す。これにより、迅速な判断が可能であるとともに、試料中に標的分子が微量に存在する場合等は、より精密な測定が可能となる。
本発明の電極付きセルを用いて、反応により発生する電流を測定した。内径の異なる2種類のポリスチレン製ストロー(大創産業)を3cm(直径4mmのもの)ないしは2cm(直径5mmのもの)にカットし、1cm平方程度のナフィオン膜(デュポン社)を一方の先端に挟み込むように2本ストローを重ね合わせた。金リボン(ニラコ)は4cmに2本カットし、ストロー内に挿入する一方、ストロー外側には絶縁テープにて固定した。ストロー容器内に反応緩衝液100μl(400mMフェリシアン化カリウム、2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を添加した。
96ウェルセルプレートを用い、各ウェルにそれぞれ終濃度の異なるグルコースオキシターゼを加えた反応緩衝液90μl(400mMフェリシアン化カリウム、2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を加え、そこに試料10μl(200mMグルコース、2Mリン酸緩衝液(pH6.0を添加して40℃で30分酵素反応をさせながら発生電流を測定した。30分後の発生電流の差分を用いて検量線を作成した。それぞれの測定結果を図11に示す。
本発明の電極付きセルを用いて、反応により発生する電流を測定した。内径の異なる2ス種類のポリスチレン製ストロー(大創産業)を3cm(直径4mmのもの)ないしは2cm(直径5mmのもの)にカットし、1cm平方程度のナフィオン膜(デュポン社)を一方の先端に挟み込むように2本ストローを重ね合わせた。金リボン(ニラコ)は4cmに2本カットし、ストロー内に挿入する一方、ストロー外側には絶縁テープにて固定した。
96ウェルセルプレートを用い、各ウェルに終濃度150ng/mlになるようにグルコースオキシターゼを加えた反応緩衝液90μl(200mMフェリシアン化カリウム、2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を加え、そこに試料10μl(200mMグルコース、2Mリン酸緩衝液(pH6.0を添加して、室温にて反応を行った。
発生する電流の測定は、以下のようにして行った。反応緩衝液にあらかじめ電極付きセルを入れておき、そこに試料を添加して発生する電流を測定したものを参照例とし、一方、反応緩衝液に試料を加えた後、5〜30分間放置し、その後電極付きセルを反応液に挿入して発生する電流を測定したものを実施例とした。放置時間は、300秒、600秒、1200秒、1800秒とした。それぞれの測定結果を図13に示す。
50ml遠心管に、2Mリン酸緩衝液(pH6.0)および10mM2,6−ジクロロインドフェノールを97:3の比率にて混合した溶液8ml(緩衝液A)を用意した。100mMグルコース水溶液2mlを、15ml遠心管を約3cmにカットしてナフィオン膜を接着剤で接着したポリプロピレン製電極セルに加えた。その後、各電極素材(Au(ニラコ、AU−170264)、Au/Cu(栄電子工業、CuにAuをメッキしたもの)、Au/Pd/Cu(栄電子工業、CuにPdとAuを順位メッキしたもの)、ステンレス(ニラコ、751387)、インコネル(ニラコ、AU−525487)、Au/PPS(CP films、AuARE)および金蒸着したガラス(レクザム社製)、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を挿入し、セルに緩衝液Aを200μl添加した。次いで、金リボンを接続し、5μg/mlのグルコースオキシダーゼ/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を10μl添加して、室温で30分反応させ、発生電流を測定した。30分後の発生電流の差分を用いて、各電極の評価を行った。それぞれの電極について、反応および測定(実験数が3)を行いデータの平均値を用いた。
結果を図15に示す。
Auメッキ媒体においては、相対的に金属媒体にメッキ処理をするとS/N比に大きな影響を与えることが判った。これらの結果より、AuまたはAu蒸着非導電性媒体が、電極として適していることが判った。
メディエーターとして、2,6−ジクロロインドフェノールとフェリシアン化カリウムを検討した。
メディエーター溶液として300μM2,6−ジクロロインドフェノール/20mMグルコース/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)と200mMフェリシアン化カリウム/20mMグルコース/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を用意した。
96ウェルマイクロプレートの、ウェル内に、メディエーター溶液を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、同じメディエーター溶液を100μl添加し、金リボンをセルの内側に挿入し、測定システムに金リボンをそれぞれ接続した。電流測定開始後、約5分後に、5μg/mlのグルコースオキシダーゼ/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)溶液をウェル側に10μl添加した。電流の測定結果を図16に示す。
20mMグルコース/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)中に、終濃度が0.32〜500mMフェリシアン化カリウムになるように調製した各濃度のメディエーター溶液を作成した。96ウェルマイクロプレートのウェル内に、各メディエーター溶液を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、同じメディエーター溶液を電極セル内に100μl添加し、さらに金リボンを挿入した。電流測定開始後、約5分に5μg/mlのグルコースオキシターゼ/2Mリン酸緩衝液をウェル側に10μl添加した。30分反応後に、発生電流を測定し、発生電流値の差分を用いて評価を行った。各条件の平均値はそれぞれ3つのデータの平均値を用いた。
結果を図17に示す。
96ウェルマイクロプレートのウェル内に、終濃度が1.7μg/mlとなるようにグルコオキシダーゼを添加した200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を電極セル内に100μl添加し、さらに金リボンを挿入した。電流測定開始後、約5分に200mMのグルコースオキシダーゼ/2Mリン酸緩衝液をウェル側に10μl添加した。30分反応後に、発生電流を測定し、発生電流値の差分を用いて評価を行った。各条件の平均値はそれぞれ3つのデータの平均値を用いた。
1.5mlエッペンチューブに、終濃度が50ないしは0ng/mlとなるようにグルコオキシダーゼを添加した200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を電極セル内に100μl添加し、さらに金リボンを挿入した。電流測定開始後、約5分に200mMのグルコースオキシダーゼ/2Mリン酸緩衝液をウェル側に10μl添加した。30分反応後に、発生電流を測定し、発生電流値の差分を用いて評価を行った。各条件の平均値はそれぞれ3つのデータの平均値を用いた。結果を図19に示す。
ウシ血清アルブミン(BSA)をコートしたマイクロプレートに、発電酵素標識した抗体を加えて、特異的反応に基づく電流発生を測定した。
BSA(Bethyl社製)が5μg/mlになるように調製したBSA/PBS緩衝液を、96ウェルマイクロプレートに100μlづつ分注し、2時間緩やかに撹拌しながらBSAをマイクロプレートに固定した。溶液を廃棄し、0.05%Tween20を含むPBS溶液を200μlづつ各ウェルに添加し廃棄する洗浄工程を3回繰り返した。その後、Blocking One(Nacalai Tesque社製)をメーカーのプロトコルに従い調製し、ブロッキング剤を各ウェルに200μl添加した。一晩放置した後、再度溶液を廃棄し、次いで、0.25%Tween20を含むPBS溶液(200μl)で3回洗浄を行った。
その後96ウェルマイクロプレートのウェル内に、200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を電極セル内に100μl添加し、さらに金リボンを挿入した。電流測定開始後、約3分に200mMのグルコース/2Mリン酸緩衝液をウェル側に10μl添加した。上記の操作は、すべて常温で行った。結果を図20に示す。
磁気ビーズ(DynaBeads MyOne Streptabdin T1、ベリタス社)50μlに対して、メーカー推奨のプロトコルに準じてboitylated ssDNA(5’ GGTAGCGATGG 3’)200pmolを、アジビンービオチン結合を介して固定した後、マグネットを用いて磁気ビーズのみを回収した。それを200μlのdistrilled H20に溶解した。
別途、磁気ビーズに固定したDNA配列に対して、完全一致配列のBiotylated ssDNA(5’ CCATCGCTACC 3’)および、1塩基ミスマッチ配列のBiotylated ssDNA(5’ CCATCCCTACC 3’)を準備し、それぞれを、1xSSC/0.1%SDSバッファーで、100nMになるように希釈した。
これにより、DNAを標的分子とした場合でも、本発明に方法により測定できることが示された。
本発明の定量可能性を利用して、2種類の抗体と磁性粒子を用いたサンドイッチ法によって検出対象分子の高感度検出を行うことができた。1単位のヒトB型肝炎ウィルスの有る無しの場合について、磁性粒子を結合させたB型肝炎ウィルス抗体と、GOxを結合させた別のB型肝炎ウィルス抗体を用いて、ウィルスの検出を以下のようにして行った。
磁性粒子を結合させたB型肝炎ウィルス抗体を、Genway社から購入した抗体をビオチンラベルしたものと、アビジンが結合した磁性粒子とを混ぜて作成した。
また、グルコースオキシダーゼを結合させたB型肝炎ウィルス抗体を、Genway社から購入した別の抗体をInnovaBioscience社から購入したGOX結合キットを用いて作成した。1単位のヒトB型肝炎ウィルス抗原を含有する水溶液(溶液1)と、ウィルス抗原を含有しない水(溶液2)を用意し、各試料に磁性粒子を結合させたB型肝炎ウィルス抗体1と、グルコースオキシダーゼを結合させた別のB型肝炎ウィルス抗体2を良く混合し、磁石で吸着させながら残余物を除去し、試料処理液を得た。その後、実施例1で用いたのと同様にして、ナフィオン膜で隔てられたリン酸緩衝液の両側に電極を置き、陰極側に試料処理液、次いでグルコースを最終濃度が20mMになるように添加し、両電極間に流れる電流を同様にして測定した。測定結果を図22に示す。この結果より、1単位のヒトB型肝炎ウィルス抗原の検出が可能であることが判った。
サルモネラ免疫血清O9群(デンカ生研製)をプロテインAにより精製した抗体を5μg/mlになるようにPBSにより調製し溶液を、96ウェルマイクロプレートに100μlづつ分注し、2時間緩やかに撹拌しながら抗体をマイクロプレートに固定した。溶液を廃棄し、0.05%Tween20を含むPBS溶液を200μlづつ各ウェルに添加し廃棄する洗浄工程を3回繰り返した。その後、Blocking One(Nacalai Tesque社製)をメーカーのプロトコルに従い調製し、ブロッキング剤を各ウェルに200μl添加した。一晩放置した後、再度溶液を廃棄し、次いで、0.25%Tween20を含むPBS溶液(200μl)で3回洗浄を行った。
サルモネラ免疫血清O9群(デンカ生研製)をプロテインAにより精製し、更にグルコースオキシダーゼを修飾した抗体(TKクラフト受託製造)に12μg/mlになるように、Blocking Oneをメーカープロトコルに従い調製したELISA希釈液 50μlを先に分注し、その後、緩衝ペプトン水(日水製薬)により培養したサルモネラ培養液(東京都健康安全研究センター供与)および大腸菌培養液(NBRC3301株)をPBSを用いて、5.0x108 CFU/mlに調整し、それぞれウェルに50μlずつ分注し1時間緩やかに撹拌した。溶液を廃棄し、次いで、0.25%Tween20を含むPBS溶液(200μl)で3回洗浄を行った。
その後96ウェルマイクロプレートのウェル内に、200mMのグルコース/200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を100μl加えた。その後、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)の外側に沿うように金リボンを絶縁テープで固定し、内側に200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を電極セル内に100μl添加した電極セルを、上記酵素反応後約1分後に挿入した。上記の操作は、すべて常温で行った。結果を図23に示す。
2 セパレータ
3 参照電極
4 検出電極
5 連結部
6 反応セル
下部開口部を覆っている、ナフィオン、ポリ塩化ビニリデン、DEAEセルロース、およびリン酸セルロースからなる群より選ばれる物質からなる膜、
該中空の容器の外側に沿って配置され、該中空容器の下部端の少なくとも一部より伸びている検出電極、および、
該中空容器の下部端の少なくとも一部を越えないように、該中空の容器の内側に沿って配置されている参照電極、
からなる、発電酵素による反応を用いて試料中の標的分子を検出するための検出用電極セル。
(10)前記中空の容器の外周が、略円形または略半円形であり、直径が0.3cm〜3.0cmである、前記(9)に記載の電極セル。
(11)前記中空の容器の外周が、略正方形であり、一片の長さが0.3cm〜3.0cmである、前記(9)に記載の電極セル。
(12)前記検出電極および参照電極が、金または非伝導性媒体に蒸着あるいはメッキした金である、前記(9)から(11)のいずれかに記載の電極セル。
本体部は、上部および下部が開口部であれば、その形は特に限定されないが、例えば、図3Aに示すように略円柱形または図3Bに示すように略正方形であるが、好ましくは、略円柱形である。また、本体部は、図3Cに示すように、下部が傾斜断面を有していても良く、また、半円形であっても良い。さらに、操作しやすいように、電極セルは、図3Cに示すように、つまみ部分を有していても良い。
本発明の電極付きセルを用いて、反応により発生する電流を測定した。内径の異なる2種類のポリスチレン製ストロー(大創産業)を3cm(直径4mmのもの)ないしは2cm(直径5mmのもの)にカットし、1cm平方程度のナフィオン膜(デュポン社)を一方の先端に挟み込むように2本ストローを重ね合わせた。金リボン(ニラコ)は4cmに2本カットし、ストロー内に挿入する一方、ストロー外側には絶縁テープにて固定した。
96ウェルセルプレートを用い、各ウェルに終濃度150ng/mlになるようにグルコースオキシターゼを加えた反応緩衝液90μl(200mMフェリシアン化カリウム、2Mリン酸緩衝液(pH6.0))を加え、そこに試料10μl(200mMグルコース、2Mリン酸緩衝液(pH6.0))を添加して、室温にて反応を行った。
発生する電流の測定は、以下のようにして行った。反応緩衝液にあらかじめ電極付きセルを入れておき、そこに試料を添加して発生する電流を測定したものを参照例とし、一方、反応緩衝液に試料を加えた後、5〜30分間放置し、その後電極付きセルを反応液に挿入して発生する電流を測定したものを実施例とした。放置時間は、300秒、600秒、1200秒、1800秒とした。それぞれの測定結果を図13に示す。
96ウェルマイクロプレートのウェル内に、終濃度が1.7μg/mlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加した200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を電極セル内に100μl添加し、さらに金リボンを挿入した。電流測定開始後、約5分に200mMのグルコース/2Mリン酸緩衝液をウェル側に10μl添加した。30分反応後に、発生電流を測定し、発生電流値の差分を用いて評価を行った。各条件の平均値はそれぞれ3つのデータの平均値を用いた。
1.5mlエッペンチューブに、終濃度が50ないしは0ng/mlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加した200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を100μl加えた。その後、金リボン、ポリプロピレン製電極セル(ナフィオン膜付き)を順に挿入した後、200mMフェリシアン化カリウム/2Mリン酸緩衝液(pH6.0)を電極セル内に100μl添加し、さらに金リボンを挿入した。電流測定開始後、約5分に200mMのグルコース/2Mリン酸緩衝液をウェル側に10μl添加した。30分反応後に、発生電流を測定し、発生電流値の差分を用いて評価を行った。各条件の平均値はそれぞれ3つのデータの平均値を用いた。結果を図19に示す。
2 セパレータ
3 検出電極
4 参照電極
5 連結部
6 反応セル
Claims (14)
- 試料中の標的分子の検出方法であって、
(i)以下の工程からなる標的分子および発電酵素を含む複合体を形成する工程、
(i−1)標的分子を支持体に保持させた後、支持体を回収することにより標的分子を回収する工程、
(i−2)標的分子と特異的に結合できかつ発電酵素を保持した結合性物質と、標的分子を反応させる工程、および
(i−3)支持体を回収することにより、標的分子と発電酵素を保持した結合性物質の複合体を回収する工程、および
(ii)以下の工程からなる発電酵素による電気化学的変化により生じる電流を測定する工程、
(ii−1)該複合体と、発電酵素の基質および電子メディエーターを含む溶液を混合し反応溶液を調製する工程、
(ii−2)反応溶液を、電子メディエーターを含む参照溶液とセパレータを介して連絡させるとともに、該反応溶液に検出電極を、該参照溶液に参照電極を配置する工程、
ここで、セパレータは、ナフィオン、ポリ塩化ビニリデン、DEAEセルロース、およびリン酸セルロースからなる群より選ばれる物質からなる膜であり、電極は、金または非伝導性媒体に蒸着あるいはメッキした金である、
(ii−3)発電酵素反応により発生する電子を電流として検出する工程、
からなる標的分子の検出方法。 - 試料中の標的分子の検出方法であって、
前記(i−1)の工程が、以下の工程、
(a)標的分子と特異的に結合できかつ支持体に保持された他の結合性物質を、試料中の標的分子と反応させる工程、および
(b)支持体を回収することにより、他の結合物質を介して支持体に保持された標的分子を回収する工程、
からなる請求項1に記載の検出方法。 - 試料中の標的分子の検出方法であって、
前記(ii−2)の工程が、
参照電極と検出電極のそれぞれを、内側および外側に配置した、電子メディエーターを含む参照溶液を入れる容器を、反応溶液中に配置し、かつ該容器に参照溶液を入れることにより、該反応溶液中に該検出電極をおよび該参照溶液中に該参照電極を配置する工程、
ここで、参照溶液を入れる該容器は、下部に開口部を有し、該開口部はセパレータで覆われ、参照溶液は該セパレータを介して反応溶液と連絡する、
である、請求項1または2に記載の検出方法。 - 前記発電酵素が、グルコースオキシダーゼであり、基質がグルコースである、請求項1から3のいずれかに記載の検出方法。
- 前記電子を電流として検出する工程において、検出のための測定開始後の所定時間後に検出された電流が、所定の値(iH)より大きい場合は、標的分子が存在するあるいはあらかじめ定めた規定値以上と評価し、所定の値(iL)より小さい場合は、標的分子が存在しないあるいはあらかじめ定めた規定値以下と評価し、iHとiLの間であった場合はさらに測定を続け追加の所定の時間後に再び検出された電流量を測定することにより標的分子の存在を評価する工程を含む、請求項1から4のいずれかに記載の検出方法。
- 前記所定時間が1〜3分である請求項5に記載の検出方法。
- 前記発電酵素反応により発生する電子を電流として検出する工程が、電流の測定開始前に電極を短絡して電極間に蓄積された電荷を低減する、または電極と入力端子との間を切断することによって出力電圧をゼロにすることを含む、請求項1から6のいずれかに記載の検出方法。
- 前記標的分子が、タンパク質、ウィルス、食中毒菌または核酸である請求項1から7のいずれかに記載の検出方法。
- 上部および下部が開口部となっている、中空の容器、
下部開口部を覆っている、ナフィオン、ポリ塩化ビニリデン、DEAEセルロース、およびリン酸セルロースからなる群より選ばれる物質からなる膜、
該中空の容器の外側に沿って配置され、該中空容器の下部端の少なくとも一部より伸びている検出電極、および、
該中空容器の下部端の少なくとも一部を越えないように、該中空の容器の内側に沿って配置されているもう参照電極、
からなる、発電酵素による反応を用いて試料中の標的分子を検出するための検出用電極セル。 - 前記中空の容器の外周が、略円形または略半円形であり、直径が0.3cm〜3.0cmである、請求項9に記載の電極セル。
- 前記中空の容器の外周が、略正方形であり、一片の長さが0.3cm〜3.0cmである、請求項9に記載の電極セル。
- 前記検出電極および参照電極が、金または非伝導性媒体に蒸着あるいはメッキした金である、請求項9から11のいずれかに記載の電極セル。
- 請求項9から12のいずれか一つに記載の電極セル、
試料中の標的分子を回収しかつ発電酵素による反応を行うための反応セル、
該電極セルの2つの電極のそれぞれに接続された電流電圧変換回路を含む電荷測定回路部、
該電流電圧変換回路部に接続され、所定の電流値に応じて、標的分子の存在の評価を行う情報処理部、および
該評価に応じて表示を行う表示部、
からなる、発電酵素による反応を用いて試料中の標的分子を検出するための装置。 - 前記電荷測定回路が、電極を短絡して電極間に蓄積された電荷を低減する、または電極と入力端子との間を切断することによって出力電圧をゼロにするためのスイッチを含む請求項13に記載の装置。
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