TWI655288B - Method of detecting a target in a sample - Google Patents

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Abstract

本發明所係揭露一種檢測樣本中目標物之方法，其係透過檢測一複合體與一基質間之反應，而能得知一目標物於一樣本中之濃度，其中，該複合體係具有一第一組合物、一目標物及一第二組合物，並且，該第二組合物係具有多數之酵素，用以進行催化該基質之反應。

Description

檢測樣本中目標物之方法
本創作係有關於一種生醫檢測方法，特別係指一種檢測樣本中目標物之方法。
按，為能快速檢測樣本，大多利用待測物與抗體間之專一性免疫反應作為基礎而進行檢測，如酵素結合免疫吸附分析法，其中又以三明治法最常被使用。簡單來說，酵素結合免疫吸附分析法之原理係先使待測檢體中之目標物與一級抗體結合，除去多餘之一級抗體後，再加入帶有酵素之二級抗體，使目標物與帶有酵素之二級抗體結合，除去多餘之二級抗體後，加入可與該酵素反應之基質，透過酵素與基質之反應而達到檢測定量之目的。
惟，上述方法係將酵素直接標定於二級抗體上，而二級抗體之辨識區須避免被酵素遮蔽，導致二級抗體上能夠固定酵素之位置有限，使得能夠固定於二級抗體上之酵素量極少，倘若目標物濃度低時，被捕捉結合之標定酵素的二級抗體亦會隨之降低，使酵素催化反應產物下降，造成檢測結果之誤差或判讀困難。
為能獲得更多酵素鍵結量而得以放大訊號，目前三明治式之酵素結合免疫吸附分析法係利用經一級抗體標定之磁珠與待測物進行免疫反應，再以帶有二級抗體及酵素之非磁珠與待測物進行免疫反應，使之形成三明治結構後，透過酵素之催化反應而能進行定量分析。以蔗糖基質催化反應為例，將進行免疫反應後之標定蔗糖轉化酶(invertase)的三明治體滴於蔗糖溶液中，使蔗糖轉化酶能夠將蔗糖轉換為葡萄糖，經使用現有商業化血糖檢測試片與儀器檢測催化產物葡萄糖濃度訊號後，而能得知目標物之濃度。使用固定一級抗體磁珠及固定酵素與二級抗體之非磁珠雖然能夠放大訊號，但若無法準確地控制轉化酵素與蔗糖間之反應參數，如大量化檢測時，無法精準控制滴定蔗糖後之反應時間與取樣滴入葡萄糖檢測試片程序之時間的不一致，會導致酵素反應後之產物濃度的不同，使得測得之訊號產生過大誤差。
本發明之主要目的係在於提供一種檢測樣本中目標物之方法，其係能夠增加檢測靈敏度及準確度，避免人為操作之誤差產生。
本發明之另一目的係在於提供一種檢測樣本中目標物之方法，其係能夠簡化酵素反應及電化學量測程序，以能達到降低檢測成本之功效。
緣是，為能達成上述目的，本發明所揭檢測樣本中目標物之方法係透過檢測一複合體與一基質間之反應，而能得知一目標物於一樣本中之濃度，其中，該複合體係具有一第一組合物、一目標物及一第二組合物，並且，該第二組合物係具有多數之酵素，用以進行催化該基質之反應。
具體來說，本發明所揭檢測樣本中目標物之方法係包含下列步驟：
步驟a：使該樣本依序與該第一組合物及該第二組合物反應，使該第一組合物及該第二組合物得與該目標物相連接，以獲得該複合物。
步驟b：使該複合物接觸該基質，以使該些酵素與該基質進行催化反應一預定時間。
步驟c：檢測該基質或催化後產物之變化，分析得到該目標物之濃度。
其中，該基質係為能與該酵素進行催化反應之物質，舉例來說，該酵素為葡萄糖氧化酵素時，該基質係為葡萄糖。
為能達到以電化學法檢測目標物濃度之功效，該基質係更包含一電子傳遞物，舉例來說，該基質係由葡萄糖與鐵氰化鉀所組成，當該基質與葡萄糖氧化酵素接觸時，葡萄糖與鐵氰化鉀會被催化為亞鐵氰化鉀及過氧化氫，因此，透過電化學檢測方法係能快速地得知目標物之濃度。
更進一步來說，本發明所揭第一組合物係由下列步驟所製成：
步驟a’：取多數之磁性部，其表面具有多數之第一結合點；
步驟b’：取多數之第一連接部，其係用以與該目標物連接，將該些第一連接部與該些磁性部混合，使該些第一連接部透過該些第一結合點而設於各該磁性部之表面。
其中，該磁性部與該目標物之重量濃度比率係得為4.20:1.00, 8.30:1.00, 12.50:1.00 及16.60:1.00 ，又以12.50：1.00為佳。
本發明之一實施例中係採用葡萄糖氧化酵素模型作為測試該第一連接部與磁性部間之重量濃度比例，並藉此間接得知當該第一連接部為抗體時，該第一連接部與磁性部間之最佳重量濃度比。
具體來說，當磁性部為粒徑約100nm之磁性奈米粒子，且該第一連接部為分子量160kDa之蛋白質分子時，該磁性部與該第一連接部之重量濃度比為1.00：0.18～1.00：3.70；或當該第一連結部為52 kDa之重組蛋白時，如即為anti adalimumab Fab，該磁性部與該第一連接部之重量濃度比係為1.00：0.16、1.00：0.32、1.00：0.80、1.00：1.60或1.00：3.20。
為能獲得檢測效果較佳之第一組合物，於步驟b’後係更設有一步驟c’，其中，該步驟c’係取至少一第一阻斷物與該些磁性部混合，並使該第一阻斷物與未連接該第一連接部之該第一結合點相連接。
具體來說，於該步驟a’中之該第一結合點係具有胺基、羧基或羥基，並且，該步驟c’中之該第一阻斷物係為乙醇胺。
而本發明所揭該第二組合物係由下列步驟所製成：步驟a”：取多數之非磁性部，其表面具有多數之第二結合點；步驟b”：取多數之第二連接部及多數之該酵素，並以一預定比例混合形成一混合物，其中，該些第二連接部係用以連接該目標物。
步驟c”：將步驟b”之該混合物與該些非磁性部混合，使該些第二連接部與該些酵素透過該些第二結合點而設於各該非磁性部之表面，其中：本發明之一實施例中係採用葡萄糖氧化酵素模型作為測試該第二連接部與磁性部間之重量濃度比例，並藉此間接得知當該第二連接部為抗體時，該第二連接部與磁性部間之最佳重量濃度比。
舉例來說，當非磁性部為粒徑約為100nm之非磁性二氧化矽奈米粒子，且該第二連接部為分子量160kDa之蛋白質分子時，該非磁性部與該混合物之重量濃度比：1.00：0.10~1.00：2.00，並且，該酵素與第該第二連結部之重量濃度比為1.00：1.00~9.00：1.00，其中：該非磁性部與該混合物之重量濃度比係得為：1.00：0.10、1.00：0.20、1.00：0.50、1.00：1.00及1.00：2.00，而又以該非磁性部與該混合物之重量濃度比係為2：1為佳；酵素與該第二連接部之重量濃度比為1.00：1.00、 3.00：1.00及9.00：1.00，而當該酵素與該第二連接部之重量濃度比為3.00：1.00者時為佳。
而為能獲得檢測效果較佳之第二組合物，於步驟c”後係更設有一步驟d”，其中，該步驟d”係取至少一第二阻斷物與該些非磁性部混合，使該第二阻斷物與未連接該第二連接部之該第二結合點相連接。
具體來說，於該步驟a”中之該第二結合點係具有胺基、羧基或羥基，並且，該步驟d”中之該第二阻斷物係為乙醇胺。
本發明係揭露一種檢測樣本中目標物之方法，其係透過一複合體與一基質間進行反應後，再偵測該基質變化或反應後產物變化而達到檢測樣本中目標物之功效。而此所謂偵測基質變化或反應後產物變化之方法係為本發明所屬技術領域之周知技術，例如電化學法、酵素呈色法、螢光標定法等。
具體來說，該複合體係具有一第一組合物、一目標物及一第二組合物，並且該第二組合物係具有酵素，得與該基質進行催化反應。舉例來說，當該樣本中含有目標物時，透過該第一組合物及該第二組合物依序予該樣本進行反應後，該目標物得與該第一組合物與該第二組合物相連接，而能形成一複合體。
為能使本發明所揭檢測樣本中目標物之方法能夠便於推廣及使用，其係能搭配市售電極進行反應。一般來說，市售電極上係於基材上塗布基質及電子傳遞物，其中：
基材係由導電材料所製成，如絲網印刷碳電極，氧化銥錫，碳，石墨，金或鉑。
該基質係與該複合體中之酵素對應，例如酵素為葡萄糖氧化酵素時，基質為葡萄糖；酵素為辣根過氧化物酶，基質為過氧化氫；酵素為鹼性磷酸酶時，基質為4-甲基繖形磷酸（4-Methylumbelliferyl phosphate）或對硝基苯（p-Nitrophenyl）；酵素為轉化酶時，基質為蔗糖。
該電子傳遞物係得為鐵氰化鉀（ferricyanide）、二茂鐵（ferrocene）、氫醌（hydroquinone）、硫堇（thionine）、亞甲基藍，1,1-二羧酸二茂鐵（1,1-dicarboxylic acid ferrocene）或Ru（bpy）3 3 + / 2 +。
舉例來說，當該市售電極係經葡萄糖及鐵氰化鉀修飾者時，本發明所揭複合體係藉由該第二組合物上之葡萄糖氧化酵素與葡萄糖及鐵氰化鉀進行催化反應，使葡萄糖及鐵氰化鉀催化為亞鐵氰化鉀及過氧化氫，而後透過安培法、庫倫法或伏安法測量反應前後之總氧化電流變化，進而得知樣本中目標物之濃度。
此外，本發明說明書中未另外加以定義之科學名詞，係以本發明所屬技術領域之通常知識解釋。
本發明所謂磁鐵係得為永久磁鐵或是電磁鐵。
本發明所謂純化係得以尺寸限制法或是磁力吸附法進行純化，其中，尺寸限制法係透過鍵結前後之尺寸改變搭配如濾膜等工具，達到獲得分離物質之功效；磁力吸附法係指透過磁力吸附具有磁性之物質，已達到分離不具磁性物質與具磁性物質之功效。
本發明所揭之第一結合點或第二結合點係指能透過化學活化之官能基，可藉由化學修飾與蛋白質形成共價鍵結者，例如胺基、羧基或羥基，以本發明來說，該第一結合點或第二結合點係經表面修飾技術設於磁性部或非磁性部表面。
以下，將茲舉本發明若干實例並搭配圖式做更進一步說明如後。
實例一：製備第一組合物
首先，請參閱第一圖，取磁珠溶液(去離子水)，各磁珠表面已修飾COOH官能基，與EDC/NHS混合液(於100mM MES，PH 4.6)，以同體積進行混合，靜置30分鐘後，加入濃度為50mM以上之氯化鈉，以磁鐵吸附磁珠，移除上清液後，加入10mM之磷酸鹽緩衝液並回溶磁珠，獲得100nm磁珠/PBS溶液。
於磁珠/PBS溶液中滴入第一連接部溶液，均勻混合並靜置，而後，加入濃度為50mM以上之氯化鈉，以磁鐵吸附磁珠，移除上清液、未鍵結之第一連接部，純化出磁珠，並加入磷酸鹽緩衝液，再加入50μL之乙醇胺(製備於去離子水)，以填補於磁珠表面未鍵結之已活化COOH官能基，完成後，以磁鐵進行吸附純化出第一組合物。
實例二：製備第二組合物
取非磁珠，其表面係修飾COOH官能基，與EDC/NHS以同體積進行混和，靜置30分鐘以上，再以離心方式移除溶液中之殘餘EDC/NHS，其中，離心轉速以6000rpm以上為佳。將100nm之所收集到經活化之非磁珠溶液加入到酵素(50μL)與第二連接部(50μL)混合液中，均勻混和後靜置一預定時間後，以離心機純化非磁珠，移除上清液與未鍵結之酵素與第二連接部，再加入50μL之乙醇胺(去離子水)，用以填補非磁珠之表面上未鍵結之COOH官能基，最後以離心方式，移除未被鍵結之的葡萄糖氧化酵素與第二連接部，以獲得第二組合物。
實例三：第一組合物及第二組合物之組成比例分析
滴5μL含有200 mM之葡萄糖與200 mM鐵氰化鉀之10 mM 磷酸鹽緩衝液至二極式網版印刷碳電極（以下簡稱SPCE電極），以循環安培法進行檢測之結果如第三圖，其中，適合經時安培法之檢測電位得設定為+0.05 V ~ +0.5 V，檢測時間為1～100秒。
依據實例一所示方法製備第一組合物，其中，第一連接部係為葡萄糖氧化酵素，其為分子量約為160kDa之蛋白質，並且，分別以磁珠與該第一連接部之重量濃度比（mg/mL:mg/mL）為1：0.18、1：0.37、1：0.92、1：1.84、1：3.7進行混合，以製備出以不同重量濃度比混合出之第一組合物溶液（0.13 mg/ml）。將各該第一組合物溶液5μL與5μL含有200 mM葡萄糖/鐵氰化鉀之10 mM 磷酸鹽緩衝液，混合後滴於SPCE電極上，以電化學法檢測之結果如第四圖所示，其中，施加電壓為+0.2V（vs. carbon）。由第四圖之結果可知，當於葡萄糖氧化酵素與磁珠之重量濃度比為0.92：1.00時趨於飽和，並且，本發明所屬技術領域且具通常知識者係能由上述結果推算出當第一連接部設為分子量為52 kDa重組蛋白時，磁珠與該第一連接部之重量濃度比（mg/mL:mg/mL）得為1.00:0.16、1.00:0.32、1.00:0.80、1.00:1.60及1.00:3.20。
依據實例二所示方法修飾材質為二氧化矽之非磁珠，取2.30 mg/mL之非磁珠溶液以不同濃度之葡萄糖氧化酵素修飾其表面，其中，葡萄糖氧化酵素與經活化之非磁珠溶液之重量濃度比（mg/mL:mg/mL）0.00：1.00、0.10：1.00、0.20:1.00、0.50:1.00、1.00:1.00及2.00:1.00，而後，將各該經修飾後之非磁珠與含有200 mM 葡萄糖/鐵氰化鉀之10 mM 磷酸鹽緩衝液，各取5 μL 混和後，滴於SPCE電極上，經電化學法分析後之結果如第五圖所示，其中，施加電壓為+0.2V（vs. carbon）。而由第五圖之結果可知，當葡萄糖氧化酵素與經活化之非磁珠溶液之重量濃度比（mg/mL:mg/mL）為0.5：1:00時已趨於飽和。
又，先將葡萄糖氧化酵素與第二連接部以下列重量濃度比(mg/mL：mg/mL)混和：1.00：1.00、3.00：1.00及9.00：1.00，再分別以混合後之葡萄糖氧化酵素/第二連接部溶液修飾非磁珠，以得到第二組合物，其中，第二連接部係為羊抗人抗體(160kDa)，酵素係為葡萄糖氧化酵素。將各該第二組合物與修飾有adalimumab/MPA/Au電極進行免疫反應後，在200mM鐵氰化鉀之10mM磷酸鹽緩衝液(30秒前)以及在200mM葡萄糖/鐵氰化鉀之10mM磷酸鹽緩衝液(30秒後)進行電化學分析(+0.45V vs.Ag/AgCl)，結果如第六圖所示。由第六圖之結果可知，於本發明所揭第二組合物中，葡萄糖氧化酵素與第二連接部間之最佳重量濃度比為3.00：1.00。
實例四：分析磁珠與非磁珠之比率
參照實例一之方法活化磁珠表面，並以adalimumab修飾磁珠，並且，參照實例二所示方法製備第二組合物，其中，第二連接部為羊抗人類抗體，酵素為葡萄糖氧化酵素。將第二組合物與經adalimumab修飾之磁珠以下列重量濃度比(mL：mg/mL)：0.00：1.00、9.20：1.00、18.40：1.00及36.80：1.00，進行比例反應，並純化後而獲得各複合體，取5μL之各該複合體與200mM葡萄糖/鐵氰化鉀之10mM磷酸鹽緩衝液(5μL)混和，滴到SPCE電極以電化學法進行分析，所使用之電壓為+0.2V(vs.carbon)，結果如第七圖所示。由第七圖之結果顯示非磁珠與磁珠之比例於18.40：1.00(mg/mL：mg/mL)時已趨於飽和，而此所指以非磁珠與磁珠係以未修飾時之重量進行計算。
實例五：分析第一組合物與目標物之比例
參照實例一所示方法製備第一組合物，其中，第一連接部為抗adalimumab之Fab重組蛋白(anti adalimumab Fab)，分子量約為52kDa之蛋白質。
將第一組合物與不同濃度之adalimumab進行免疫反應，分別獲得經adalimumab修飾之第一組合物，經純化後，各該經adalimumab修飾之第一組合物再與飽和量之標定葡萄糖氧化酵素的羊抗人類抗體進行免疫反應，形成一複合體，其中，第一組合物與adalimumab之重量濃度比（mg/mL:mg/mL）為0.00:1.00 、4.20:1.00、8.30:1.00、12.50:1.00及16.60:1.00。分別將純化後之各複合體取5 μL與200 mM 葡萄糖/鐵氰化鉀之10 mM 磷酸鹽緩衝液（5 μL）混和，經電化學分析後之結果如第八圖。
由第八圖之結果顯示第一組合物與adalimumab之重量濃度比率為於12.50:1.00時已趨於飽和，其中，上述第一組合物重量僅以磁珠未修飾時之重量進行計算。
實例六：檢測adalimumab
參照實例一、二及三所示方法製備第一組合物及第二組合物，其中，第一連接部為抗adalimumab 之Fab重組蛋白（anti adalimumab Fab），第二連接部為羊抗人類抗體。
取濃度為0.00、0.10 µg/mL、0.50 µg/mL及1.00 µg/mL之 adalimumab溶液（溶於磷酸鹽緩衝液）與第一組合物進行免疫反應，透過該第一連接部捕捉adalimumab，以使該第一組合物與adalimumab連結，而後以磁鐵吸附該第一組合物，以移除未與第一組合物鍵結之adalimumab。再分別加入一預定量之第二組合物，使該第二連接部與adalimumab進行免疫反應。透過第二組合物上之抗體與adalimumab進行免疫反應，可使該第一組合物、adalimumab及該第二組合物形成一複合體，其中，該預定量係依據實例四中之非磁珠與磁珠之比例為18.40：1.00（mg/mL:mg/mL）推算。最後，藉由磁鐵吸附該複合體，以移除未進行鍵結之第二組合物。
取5 μL與不同濃度之adalimumab反應所形成之各該複合體與5 μL含有200 mM 葡萄糖/鐵氰化鉀之10 mM 磷酸鹽緩衝液混和，再滴到SPCE電極上，以電化學法進行分析，結果如第九圖所示，其中，所使用之電壓為+0.2V（vs. carbon）。由第九圖顯示本發明所揭方法確實可以利用第一組合物與第二組合物，依序分別與目標物連接，以形成複合體，並且，透過檢測複合體上之酵素催化反應，能夠改變產物之電流，以得到目標物之檢量線。
無
第一圖係為本發明製備第一組合物之流程示意圖。
第二圖係為本發明製備第二組合物之流程示意圖。
第三圖係為本發明實例中所使用電極以循環伏安法所測得之循環伏安圖。
第四圖A係為磁珠以不同濃度之第一連接部修飾後，分別溶與葡萄糖及鐵氰化鉀溶液中而滴於雙電極式網版印刷碳電極進行量測所得之經時安培圖(+0.2V vs.carbon)，其中，空白組為藍線、葡萄糖氧化酵素與磁珠之重量百分比為0.18：1.00者為橙線、0.37：1.00者為黑線、0.92：1.00者為綠線、1.84：1.00者為紅線以及3.70：1.00者為紫線。
第四圖B係為第四圖A於第2.5秒(黑)、5.0秒(綠)及10.0秒(紅)時所取樣之電流增幅()，其中，MB代表磁珠，GOX代表葡萄糖氧化酵素。
第五圖A係為非磁珠以不同濃度之葡萄糖氧化酵素進行修飾後，分別與葡萄糖及鐵氰化鉀進行催化反應後之經時安培圖(+0.2V vs.carbon)，其中，空白組為藍線、葡萄糖氧化酵素與非磁珠之重量百分比為0.10：1.00者為橙線、0.20:1.00者為黑線、0.50:1.00者為綠線、1.00：1.00者為紅線以及2.00：1.00者為紫線。 第五圖B係為第五圖A於第2.5秒（黑）、5.0秒（綠）及10.0秒（紅）時所取樣之電流增幅（ΔI = I GOx:NMB-Iblank），其中，NMB代表非磁珠，GOx代表葡萄糖氧化酵素。 第六圖係為以不同濃度比例之葡萄糖氧化酵素及第二連接部修飾非磁珠，分別與修飾adalimumab/MPA/Au電極進行免疫反應後，將該電極置於葡萄糖與鐵氰化鉀溶液中進行電化學分析所得之經時安培圖（+0.4 V vs. Ag/AgCl），其中，葡萄糖氧化酵素及第二連接部之重量濃度比為1.00:1.00者為藍線、3.00:1.00者為綠線、9.00：1.00者為紅線。而該內插圖係為本圖扣掉扣掉背景值所取樣之電流增幅(ΔI = I 40 s-I 20 s)，其中，GOx代表葡萄糖氧化酵素，2 ndAb代表第二連接部。 第七圖係為第一組合物（修飾adalimumab之磁珠）與第二組合物（共修飾葡萄糖氧化酵素和二級抗體之非磁珠）以不同濃度進行反應後，分別與葡萄糖及鐵氰化鉀進行催化反應後之經時安培圖（+0.2 V vs. carbon），其中，空白組為藍線、第二組合物與第一組合物之重量百分比為9.20:1.00者為紅線、18.4:1.00者為綠線、36.80：1.00者為黑線。而該內插圖係為本圖於第2.5秒（黑）、5.0秒（綠）及10.0秒（紅）時所取樣之電增幅（ΔI = I NMB:MB-I blank），其中，NMB代表非磁珠，MB代表磁珠。 第八圖係為經不同濃度之adalimumab免疫反應後之第一組合物，經純化後而分別與飽和量之標定葡萄糖氧化酵素之二抗進行免疫反應，形成一複合體，各該複合體分別與葡萄糖及鐵氰化鉀進行催化反應後之經時安培圖（+0.2 V vs. carbon），其中，空白組為藍線、第一組合物與目標物之重量百分比為4.20:1.00者為紅線、8.30:1.00者為綠線、12.50：1.00者為黑線、16.60:1.00者為橙線。而該內插圖係為本圖於第2.5秒（黑）、5.0秒（綠）及10.0秒（紅）時所取樣之電增幅（ΔI = I Fab@MB:Ada-I blank），其中，Fab@MB代表第一組合物，Ada代表adalimumab，Fab@MB:Ada代表經adalimumab修飾之第一組合物。 第九圖係以不同濃度之目標物分別與第一組合物反應後，並經電化學分析後之結果，其中，目標物濃度為0.00者為藍線、0.10 µg/mL 者為紅線、0.50 µg/mL者為綠線、1.00 µg/mL者為黑線。而該內插圖係為本圖於第2.5秒（黑）、5.0秒（綠）及10.0秒（紅）時所取樣之電增幅（ΔI = I Ada-I blank）。

Claims (17)

  1. 一種檢測樣本中目標物之方法，其係透過檢測一複合體與一基質間之反應，以得知一目標物於一樣本中之濃度，而包含有下列步驟；步驟a：該樣本依序與一第一組合物及一第二組合物反應，當該樣本中含有該目標物時，該第一組合物及該第二組合物係與該目標物相連接，得到一複合體；其中：該第二組合物係包含有一非水溶性之非磁性部，多數之酵素以及多數之第二連接部，而該些酵素係非共價連接地設於該磁性部之表面，用以進行催化該基質之反應，該些第二連接部，用以連接該目標物；步驟b：將反應後之物質接觸該基質，當該樣本中含有該目標物時，該基質會接觸該複合體而與該酵素反應，而當該樣本中不含有該目標物時，該基質會接觸該第一組合物而不與該酵素反應；步驟c：檢測該基質或其經催化後產物之變化，得分析得到該目標物之濃度。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該基質係為葡萄糖，該酵素係為葡萄糖氧化酵素。
  3. 依據申請專利範圍第1項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該基質係由葡萄糖及電子傳遞物所組成而設於一晶片上，該酵素係為葡萄糖氧化酵素。
  4. 依據申請專利範圍第1項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該第一組合物係由下列步驟所製成：步驟a’：取多數之磁性部，其表面具有多數之第一結合點； 步驟b’：取多數之第一連接部，其係用以與該目標物反應，將該些第一連接部與該些磁性部混合，使該些第一連接部透過該些第一結合點而設於各該磁性部之表面。
  5. 依據申請專利範圍第4項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該磁性部與該目標物之重量濃度比率係選自由下列比例所組成之群：4.20：1.00,8.30：1.00,12.50：1.00及16.60：1.00。
  6. 依據申請專利範圍第4項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，當該第一連接部為分子量大小約為160kDa之蛋白質時，該磁性部與該第一連接部重量濃度比為1.00：0.18~1.00：3.70。
  7. 依據申請專利範圍第4項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，當該第一連接部為分子量大小約為52kDa之蛋白質時，該磁性部與該第一連接部之重量濃度比係選自由下列比例所組成之群：1.00：0.16、1.00：0.32、1.00：0.80、1.00：1.60及1.00：3.20。
  8. 依據申請專利範圍第4項所述檢測樣本中目標物之方法，其更包含一步驟c’，設於該步驟b’後，其中：該步驟c’係取至少一第一阻斷物與該些磁性部混合，並使該第一阻斷物與未連接該第一連接部之該第一結合點相連接。
  9. 依據申請專利範圍第4項所述檢測樣本中目標物之方法，其中：於該步驟a’中之該第一結合點係具有一具有胺基、羧基或羥基，並且，該步驟c’中之該第一阻斷物係為乙醇胺。
  10. 依據申請專利範圍第1項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該第二組合物係由下列步驟所製成：步驟a”：取多數之非磁性部，其表面具有多數之第二結合點； 步驟b”：取多數之第二連接部及多數之該酵素，形成一混合物，其中，該些第二連接部係用以連接該目標物；步驟c”：將步驟b”之該混合物與該些非磁性部混合，使該些第二連接部與該些酵素透過該些第二結合點而設於各該非磁性部之表面。
  11. 依據申請專利範圍第10項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，當該該第二連接部為分子量160kDa之蛋白質分子時，該非磁性部與該混合物之重量濃度比：1.00：0.10~1.00：2.00，並且，該酵素與該第二連結部之重量濃度比為1.00：1.00~9.00：1.00。
  12. 依據申請專利範圍第11項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該非磁性部與該混合物之重量濃度比係選自由下列比例所組成之群：1.00：0.10、1.00：0.20、1.00：0.50、1.00：1.00及1.00：2.00。
  13. 依據申請專利範圍第12項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該非磁性部與該混合物之重量濃度比係為2：1。
  14. 依據申請專利範圍第11項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該酵素與該第二連接部之重量濃度比係選自由下列比例所組成之群：1.00：1.00、3.00：1.00及9.00：1.00。
  15. 依據申請專利範圍第14項所述檢測樣本中目標物之方法，其中，該酵素與該第二連接部之重量濃度比為3.00：1.00。
  16. 依據申請專利範圍第10項所述檢測樣本中目標物之方法，其更包含一步驟d”，設於該步驟c”後，其中：該步驟d”係取至少一第二阻斷物與該些非磁性部混合，使該第二阻斷物與未連接該第二連接部之該第二結合點相連接。
  17. 依據申請專利範圍第16項所述檢測樣本中目標物之方法，其中：於該步驟a”中之該第二結合點係具有一具有胺基、羧基或羥基，並且，該步驟d”中之該第二阻斷物係為乙醇胺。
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